MXPA06003977A - Metodo. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para promover una respuesta de celulas T contra un epitopo de celulas T en un sujeto mamifero hospedero, cuyo metodo comprende: (i) una primera inmunizacion que comprende al menos dos administraciones que son con 1 a 14 dias de separacion al sujeto, en donde cada administracion comprende administrar un nucleotido de interes (NOI) que codifica para el epitopo de celulas T, y opcionalmente (ii) una segunda inmunizacion que comprende al menos una administracion al sujeto de (a) un NOI que codifica para el epitopo de celulas T, o (b) una proteina que comprende el epitopo de celulas T, en donde el tiempo entre la primera administracion de la primera inmunizacion, y la primera administracion de la segunda inmunizacion es de 21 a 365 dias.

Description

Caso del Abogado No. 036481-0158 EN LA OFICINA INTERNACIONAL DE LA OMP1 Solicitantes : POWDERJECT VACCINES, INC., et al.

Solicitud Internacional No.: PCT/US2004/03391 Fecha de Presentación Internacional: 12 Octubre 2004 (12.10.04) Título de la Invención: MÉTODO PETICIÓN PARA REGISTRAR UN CAMBIO DE DOMICILIO PARA EL SOLICITANTE Y EL SOLICITANTE/INVENTOR BAJO LA REGLA 5>2bis DEL PCT Oficina Internacional de la OMPI Vía Fax 34, chemin des Colombettes 1211 Ginebra 20, Suiza Attn: Athina Nickitas-Etienne Estimada Señora: El abogado para el Solicitante por la presente, pide un cambio de domicilio en la Solicitud Internacional identificada al rubro, para el Solicitante: POWDERJECT VACCINES , INC . De: para: 585 Science Drive 2711 Centerville Road Madison, WI 53711 Suite 400, Wilmington, DE 19808 Estados Unidos de América Estados Unidos de América Para Solicitantes/Inventores: BRAUN, Ralph Patrick De: para: 8551 Research Way Blvd. 69 Jefferson Street Middleton, WI 53562 Highland Mills, NY 10930 United States of America United States of America DONG, Lichirn De: para: 8551 Research Way Blvd. 8321 NE 187th Way Middleton, WI 53562 Kenmore, WA 98028 United States of America United States of America 1 METODO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para promover una respuesta inmune . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los métodos de vacunación son descritos en la técnica, por ejemplo, ver Prayaga et al (1997) Vaccine 15(12-13); Kilpatrick et al (1997) Hybridoma 16:381-389; Kilpatrick et al (1998) Hybridoma 17:569-576, Pertmer et al (1995) Vaccine 13; 1427-1430 y Olsen et al (1997) Vaccine 15; 1149-1156. No obstante, sigue existiendo una necesidad para la optimización de esquemas de administración de ácidos nucleicos, incluyendo aquellos que inducen específicamente una respuesta inmune mediada por células (CMI, por sus siglas en inglés) mejorada. Esto podría ser benéfico para la prevención y tratamiento de una amplia gama de enfermedades y trastornos inmunes, inflamatorios e infecciosos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para promover (o mejorar) una respuesta CMI in vivo. En particular, el método promueve (o mejora) una respuesta de células T in vivo. En consecuencia, la invención proporciona un método para promover la respuesta inmune contra un epitopo de células REF".172165 2 T en un sujeto mamífero hospedero, cuyo método comprende: (i) una primera inmunización que comprende al menos dos administraciones que son de 1 a 4 días de separación al sujeto, en donde cada administración comprende la administración de un nucleótido de interés (NOI) que codifica para el epitopo de célula T, y opcionalmente (ii) una segunda inmunización que comprende al menos una administración al sujeto de (a) un NOI que codifica para el epitopo de células T, o (b) una proteína que comprende el epitopo de célula T, en donde el- tiempo entre la primera administración de la primera inmunización, y la primera administración de la segunda inmunización, es de 21 a 365 días. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción siguiente discute las secuencias, tales como un epitopo o antígeno, que son codificadas por el NOI que es administrado. Se entiende que en vez de tal NOI, en el caso de la segunda y subsecuente inmunizaciones, puede ser administrada una proteína que comprende el mismo epitopo o antígeno . La invención se refiere a un método para promover una respuesta de célula T contra un epitopo de célula T de interés (EOI, por sus siglas en inglés) . Como se mencionó anteriormente, el método comprende la administración de un NOI 3 que codifica para el EOI . En el método, al menos dos partes 2, 4, 6, 10 .ó 20 ó más (hasta e incluyendo, por ejemplo, 40) diferentes NOI's pueden ser administrados, en donde cada uno de los NOIs codifican para el mismo epitopo. Alternativamente, en cada administración de NOI puede ser administrado el mismo NOI. Similarmente, en modalidades en donde una proteína que comprende el EOI es administrada, se entiende que al menos 2, 4, 10 ó más (hasta e incluyendo, por ejemplo, 20) diferentes proteínas pueden ser administradas (las cuales comprenden el epitopo. Alternativamente, en cada administración de proteína puede ser administrada la misma proteína (que comprende el epitopo) . En un aspecto la presente invención proporciona un método para promover una respuesta inmune mediada por células, aumentadas (CMI) contra al menos un antígeno objetivo (TA, por sus siglas en inglés) en un sujeto mamífero hospedero; en donde el método comprende administrar una secuencia nucleotídica del (NOI) de interés que codifica para uno o más epitopos de (EOI) de interés de TA, a al menos dos veces al sujeto mamífero hospedero; en donde los intervalos entre cada una de las administraciones de NOI están en el intervalo de aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 144 horas; y en donde el método es efectivo para promover una respuesta CMI mejorada contra el o cada EOI expresado, en el sujeto mamífero hospedero . 4 La invención puede ser utilizada profiláctica y/o terapéuticamente para inmunomodular la respuesta de CMI a uno o más epitopos de interés (EOI) de un antígeno objetivo (TA) . El curso de tiempo de la respuesta inducida hace posible que sea desarrollada una estrategia efectiva para la inmunoterapia de los trastornos preexistentes mediados por células T, asi como facilitar la amplia protección contra antígenos subsecuentemente encontrados . Una ventaja adicional de este aspecto de la invención es la habilidad para mejorar la respuesta de CMI sin el uso de un modificador de la respuesta biológica asociado y/o un adyuvante. El método de la invención puede dar como resultado la producción de una célula T activada. Numerosos usos potenciales de las células T activadas son vislumbrados. Por ejemplo, en el caso de la terapia en humanos se contempla que las células T activadas pueden ser aisladas, cultivadas ex vivo y administradas a un sujeto hospedero para el tratamiento de los trastornos inmunes mediados por células T, y/o infecciones virales, o en pacientes con cáncer. Las células T pueden ser preparadas mediante la administración del NOI in vivo, y luego aislando las células T para expandirse in Vitro en presencia de modificadores de la respuesta biológica y/o inmunomuduladores y/o adyuvantes apropiados, tales como, pero no limitados a péptidos, citocinas, y células presentadoras de 5 antígeno . El NOI que es utilizado en el método de la invención incluye pero no está limitado a, una secuencia de ADN bajo el control de una secuencia reguladora que dirige la expresión de las secuencias de ADN en una célula hospedera de mamífero. El NOI codifica para el epitopo de células T, y de este modo codifica típicamente para una proteina que comprende el epitopo. De este modo, preferentemente el NOI es capaz de expresar el epitopo (incluyendo una proteína que comprende el epitopo) en una célula del sujeto. En modalidades preferidas, el epitopo de células T puede ser una célula T cooperadora y/o un epitopo de linfocito de CD8+T (células T CD8+) . De este modo, la respuesta de células T es promovida por el método de la invención puede ser una respuesta de célula T cooperadora y/o CD8+. Aún más preferentemente, la respuesta puede ser una respuesta de linfocito T CD8+ tal como una respuesta citotóxica. EL ESQUEMA DE ADMINISTRACIÓN El método de la invención comprende grupos de administración que son referidos en la presente como ""inmunizaciones" . De este modo, el método puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 ó más (por ejemplo hasta e incluyendo 10) de tales grupos de inmunizaciones que son denominados cómo la "primera inmunización", "segunda inmunización", etc., en la presente. Una o más, o todas, las administraciones de 6 cualquiera de las inmunizaciones (por ejemplo la primera y/o segunda o todas las inmunizaciones) pueden ocurrir de 2 a 14 días (por ejemplo, la primera y última administración de la inmunización está dentro de 2 a 14 días una de la otra) , tal como de 3 a 12 días ó 4 a 8 días. Preferentemente, la primera inmunización ocurre de 12 a 14 días, tal como de 3 a 12 días ó de 4 a 8 días . Una o más, o todas las inmunizaciones pueden comprender de 2 a 50, tal como de 5 a 40 ó de 10 a 30 administraciones. De este modo, típicamente en una o más, o todas las inmunizaciones al menos 2, tal como al menos 3, 5, 10, 30, 50 ó más (por ejemplo hasta e incluyendo 100 administraciones) administraciones pueden ser dadas. Preferentemente, la primera inmunización (y opcionalmente una o más inmunizaciones subsecuentes) comprenden de 3 a 20 administraciones. En una modalidad el método (por ejemplo, todas las inmunizaciones conjuntamente) comprende 3 a 50, tal como 5 a 40 6 de 10 a 30 administraciones. En una modalidad, se puede dar más de una administración (típicamente de 2 a 5 administraciones) al mismo punto de tiempo (tal como en el mismo día, o dentro de un día uno del otro, dentro de doce horas uno del otro, dentro de dos horas uno del otro o dentro de una hora uno del otro) . Como será discutido más adelante, tales administraciones que son dadas al mismo punto de tiempo, pueden ser dadas al mismo 7 o a diferentes sitios. Uno o más, o todas las inmunizaciones pueden comprender administraciones de 2 a 10, tales como de 3 a 5, diferentes puntos de tiempo, en donde tales puntos de tiempo son preferentemente en diferentes días. De este modo, una o más o todas las inmunizaciones pueden comprender administraciones de 2 a 10, tales como de 3 a 5, diferentes días. Preferentemente, en la primera y segunda inmunizaciones las administraciones ocurren en 3 ó 4 diferentes días . En el caso de una o más, o todas las inmunizaciones 2, 3, 4 6 más de las administraciones de esa inmunización pueden ser de 2 a 14 días de separación, tales como de 3 a 10 o de 4 a 8 días de separación. Preferentemente, para una o más, o todas las inmunizaciones, 2, 3, 4 ó más de las administraciones de esa inmunización son de 2 a 6 días de separación. El tiempo entre dos inmunizaciones es definida en la presente como el tiempo entre las primeras administraciones de las dos inmunizaciones. Típicamente, el tiempo entre la primera y segunda inmunización (y preferentemente el tiempo en que todas las inmunizaciones) es de 21 a 365 días, tal como de 28 a 300 días, 50 a 250 días ó 100 a 200 días. En una modalidad, todas las inmunizaciones del método son llevadas a cabo de 21 a 365 días, tal como 28 a 300 días, 50 a 250 días ó 100 a 200 días. 8 En una modalidad del método de la invención, el NOI es generalmente administrado de 2 a 5 veces (a 2 a 5 diferentes puntos de tiempo), tal como 2, 3 ó 4 veces (a 2, 3 ó 4 diferentes puntos de tiempo, respectivamente) . Típicamente, tales administraciones son sobre 2 a 14 días, por ejemplo, de 4 a 12, ó de S a 10 días. En una modalidad preferida, el NOI al menos 2, 3 ó 4 administraciones del NOI son llevadas a cabo, las cuales pueden estar separadas con 3 días o menos, tales como 2 días o menos. En una modalidad, el tiempo entre la primera y segunda adminis raciones es menor de 4 días, típicamente menos de 3.5 días, tal como 3 días o menos, o 2 días o menos . Preferentemente, el NOI no es administrado al sujeto entre las administraciones discutidas en la presente, y típicamente otros productos que pueden estimular una respuesta inmune (tal como un antígeno polipeptídico) , no son administrados entre dichas administraciones de NOI. En una modalidad de NOI, u otro producto que puede estimular una respuesta inmune (tal como un antígeno polipeptídico) , no se administra al sujeto al menos 7 días, tal- como al menos 14 o al menos 28 días antes de la primera administración del NOI en cualquiera de los regímenes de administración mencionados en la presente. En una modalidad, el NOI u otro producto que pueda estimular una respuesta inmune (tal como un antígeno polipeptídico) no es administrado al sujeto al menos 7 días, 9 tal como al menos 14 días o al menos 28 días después de la última administración del NOI en cualquiera de los regímenes de administración mencionados en la presente. Típicamente, aproximadamente 1 pg a aproximadamente 5 mg de NOI proporcionados al sujeto en cada administración en los cuales se administra el NOI (o en cada punto de tiempo) , preferentemente de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 µg, tal como 25 pg a 1 µg ó 50 pg a aproximadamente 500 pg. Como se mencionó anteriormente, en la segunda, y si es aplicable, las subsecuentes inmunizaciones de una proteína, pueden administradas. Típicamente, aproximadamente desde 0.1 a 20 mg de proteína se administran en cada administración (o en cada punto de tiempo) , preferentemente de 1 µg a 5 mg, tal como de 10 µg hasta 500 g. Como se mencionó anteriormente en el método de la invención, en NOI y opcionalmente también una proteína son administrados. Para algunas modalidades, el NOI o la proteína son co-administrados con un adyuvante o un NOI que codifica para la misma. En esta modalidad, el adyuvante es preferentemente la forma no tóxica de la enterotoxina lábil al calor (LT, por sus siglas en inglés) E. coli o la toxina del cólera (CT) de Vibrio cholerae. El adyuvante puede comprender la subunidad A y B de la enterotoxina LT (LTB) o la subunidad B de la toxina del Cólera CT (CTB) . 10 La inclusión de un adyuvante y en particular, un adyuvante genético, es útil en el mejoramiento o modulación adicional de las respuestas de CMI . De este modo, el método de la presente invención para mejorar una respuesta de CMI puede ser refinada, mediante la adición de adyuvantes del NOI o la proteína (o las composiciones que comprenden el NOI o la proteína, que conducen .a composiciones y métodos particularmente efectivos para promover una respuesta de CMI de larga vida y sostenida y mejorada. El NOI o la proteína es preferentemente administrado como una partícula. En una modalidad preferida del método de la presente invención, el NOI o la proteína es administrada transdérmicamente . En una modalidad aún más preferida, la partícula es administrada al sujeto mamífero hospedero en un dispositivo de aceleración de partículas. En una modalidad después de que ha sido llevada a cabo el régimen de administración, se evalúa si el régimen ha conducido o no a la estimulación de una CMI (tal como una respuesta de CTL) . Este puede ser realizado por ejemplo, mediante la medición de la presencia de, o el nivel de las células T (tal como CTL) en una muestra del sujeto. Las células T son detectadas son generalmente específicas para un epitopo codificado por el NOI . Otros aspectos de la presente invención son presentados en las reivindicaciones anexas y en la descripción 11 y figuras siguientes. Estos aspectos son presentados bajo encabezados de sección separados. No obstante, se debe entender que las enseñanzas bajo cada sección no están necesariamente limitadas a ese encabezado de sección particular. DEFINICIONES Se debe entender que esta invención no está limitada a moléculas particularmente ejemplificadas o parámetros de proceso ya que tales, por supuesto pueden variar. Se debe entender también que la terminología utilizada en la presente es para fines de describir modalidades particulares de la invención únicamente, y no se pretende que sean limitantes. Además, la práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas de ADN recombinante e inmunología, todos los cuales están dentro de la experiencia ordinaria en la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 a Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1 y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed. , 1984) ; a Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; y Fundamental Virology, 2a Edición, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds . ) . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de 12 patentes citadas en la presente, ya sea supra o infra, son incorporadas por referencia en la presente, en su totalidad. Se debe notar, que como se utiliza en la especificación de las reivindicaciones anexas, las formas singulares ¾un" , "uno, una" y "el, la" incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. Todos los términos científicos y técnicos utilizados en esta solicitud tienen los significados comunes utilizados en la técnica, a no ser que se especifique de otro modo. Como se utiliza en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados . RESPUESTA INMUNE El mecanismo mediante el cual el sistema inmune controla la enfermedad, incluye la inducción de anticuerpos neutralizadores por medio de la inmunidad humoral y la generación de respuestas de células T vía la inmunidad celular. Como se utiliza en la presente, el término "respuesta inmune" contra un antígeno objetivo (TA) (incluyendo EOI) se refiere al desarrollo, en un sujeto mamífero hospedero de una respuesta inmune humoral y/o celular contra ese TA. Como se utiliza en la presente, el término "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo. Los anticuerpos generados por la inmunidad humoral son principalmente efectivos contra agentes infecciosos extracelulares . 13 Como se utiliza en la presente, el término ^respuesta inmune mediada por célula (CMI)" es una mediada por linfocitos T y/o otras células sanguíneas blancas. Los mecanismos inmunes de CMI son en general más efectivos contra las infecciones intracelulares y la enfermedad, debida a que los mecanismos de CMI aprestan a las células T de una manera que, cuando aparece un TA en una fecha posterior, las células T de memoria son activadas para dar como resultado una respuesta de CMI que destruye las células diana que tienen el TA correspondiente o una porción del mismo sobre sus superficies celulares, y con esto el patógeno infeccioso. La respuesta de CMI es enfocada a la destrucción de la fuente de infección mediada ya sea por las células efectoras que destruyen las células infectadas del hospedero, mediante contacto directo célula a la célula y/o de la liberación de moléculas, tales como citocinas, que poseen actividad antiviral. De este modo, la respuesta de CMI es caracterizada por una respuesta celular de linfocitos T específicos, es crucial para producir resistencia hacia enfermedades provocadas por cáncer, virus, patógenos y otros microorganismos intracelulares. CÉLULAS T IMPLICADAS EN LA RESPUESTA DE CMI Son requeridos al menos dos tipos especiales de células para iniciar y/o aumentar la CMI y las respuestas humorales . Los receptores antigénicos sobre un subgrupo 14 particular de células T que expresan un co-receptor de CD4 , pueden ser las células T cooperadoras (Th) o las células T CD4 (de aquí en adelante llamadas células T cooperadoras) y éstos reconocen los péptidos antigénicos enlazadas a las moléculas MHC de la clase II. En contraste, los receptores antigénicos sobre un subgrupo particular de células T que expresan un co-receptor de CD8, son llamados linfocitos T citotóxicos (CTLs) o células T CD8+ (de aquí en adelante llamadas células T CD8+ y éstas reaccionan con los antígenos desplegados sobre las moléculas MHC de la clase I . CÉLULAS T COOPERADORAS Las células T cooperadoras o células CD4+ pueden ser además divididas entre otros grupos funcionalmente distintos : Thl y Th2 que difieren su función efectora y de citocina. La respuesta de Thl y Th2 son reguladas no solamente de una manera positiva sino también de una manera negativa, tal que la respuesta celular de Thl son aumentadas por las citocinas de Thl tales como IL-2, IL-12 e IFN-gamma y disminuidas por las citocinas Th2 tales como IL-4 e IL-10. En contraste, las respuestas de anticuerpo son aumentadas por la citosina de Th2 tales como IL-4 e IL-10, pero son subreguladas por las citocinas de Thl tales como IFN-gamma y otras citosina IL-12 que aumenta e IFN-gamma y es producida por los monocitos . De este modo, las citocinas de Thl clásicas tales como IFN-gamma, IL-2 e IL-12 pueden ser consideradas como cofactores inmunes 15 que inducen una respuesta inflamatoria. En contraste, la citocinas de Th2 clásicas, tales como IL-4 y IL-10 pueden ser consideradas como citocinas que suprimirán una respuesta inflamatoria severa en algunas situaciones . CÉLULAS T CD8+ Las células T CD8+ pueden funcionar en más de una forma. La mejor función conocida de las células T CD8+ es la muerte o lisis de las células diana que poseen el antígeno peptídico en el contexto de una molécula MHC de la clase I . De aqui la razón por la que éstas células son a menudo denominadas como linfocitos T citotóxicos (CTL) . No obstante, otra función más, quizás de mayor relevancia protectora en ciertas funciones es la habilidad de las células T CD8+ para secretar interferón gamma (IFN-gamma) . De este modo, los ensayos de actividad lítica y de liberación de IFN-gamma son ambos de valor en la medición de la respuesta inmune de las células T CD8+ (por ejemplo, en un ensayo ELISPOT como se describe más adelante) . En enfermedades infecciosas existe evidencia que sugiere que las células T CD8+ puedan proteger al matar a un agente infeccioso que comprende un antígeno infeccioso, en las etapas tempranas de una enfermedad antes de que sean producidos cualesquiera síntomas de la enfermedad. RESPUESTA DE CMI MEJORADA La presente invención se refiere a un método capaz de aumentar y/o modular la respuesta de CMI en un sujeto 16 hospedero, contra un antígeno objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "aumento" abarca los mejoramientos en todos los aspectos de la respuesta de CMI , que incluye pero no están limitadas a una estimulación y/o aumento y/o poteneiamiento y/o suprarregulación de la magnitud y/o duración y/o calidad de la respuesta de CMI hacia un NOI repetidamente administrado, que codifica para un EOI de un TA. A manera de ejemplo, la respuesta de CMI puede ser aumentada ya sea por (i) el aumento de la activación y/o producción y/o proliferación de células T CD8+ que reconocen un antígeno objetivo y/o (ii) el desplazamiento de la célula de CMI de una respuesta tipo Th2 a una Thl. Este mejoramiento de las respuestas asociadas a Thl es de valor particular en responder a las infecciones intracelulares debido a que, como se explicó anteriormente, la respuesta de CMI es aumentada por las células Thl (tales como, por ejemplo, inductoras de IFN-gamma) . Tal respuesta inmune aumentada puede ser en general caracterizada por títulos incrementados de linfocitos T CD4+ y/o CD8+, que producen interferón, actividad incrementada de las células T CD8+ específicas del antígeno, y una respuesta inmune similar a la célula T cooperadora 1 (Thl) contra el antígeno de interés (caracterizado por títulos incrementados del anticuerpo específico del antígeno, de las subclases típicamente asociadas con la inmunidad celular (tales como. 17 por ejemplo, lgG2a) , usualmente, con una reducción concomitante de los títulos de anticuerpo de las subclases típicamente asociadas con la inmunidad humoral (tal como, por ejemplo, IgGl) ) en vez de una respuesta inmune similar a las células T cooperadoras 2 (Th2) . La respuesta que es promovida por el método de la invención (por ejemplo, el aumento de una respuesta de CMI) puede ser determinada por un número de ensayos bien conocidos, tales como ensayos de linfo proliferación (activación de linfocitos) , ensayos de células T CD8+ o mediante la evaluación de los linfocitos T específicos para la epitopo con un sujeto sensibilizado (ver por ejemplo, Erickson et al. (1993) J Immunol. 151:4189-4199; y Doe et al (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376) o ensayos ELISPOT de células T CD8+ para medir la producción de Interferón gamma (Miyahara et al PNAS(EUA) (1998)95:3954-3959). En una modalidad, el método promueve una respuesta de células T reguladoras o supresoras . La promoción de tal respuesta puede ser utilizada, por ejemplo, para prevenir o tratar una enfermedad autoinmune. RESPUESTA AUMENTADA DE CÉLULAS T En la descripción de la presente, la promoción de respuesta es a menudo discutida en términos de la promoción de una respuesta de CMI . La promoción de una respuesta de CMI se entiende que incluye la promoción de una respuesta de células 18 T. La respuesta que es promovida por el método de la invención puede ser una respuesta "aumentada" o "mejorada". Una respuesta "aumentada" puede decirse que ocurre si la respuesta promovida por el método de la invención es más que la respuesta que es promovida . en un método control, donde en el método control ha sido administrada la misma cantidad de NOI (y si es aplicable también la misma cantidad de proteína) que fue administrada en el método de la invención. Tal método de control puede por ejemplo consistir de la administración del NOI (y si es aplicable también la proteína) en una administración simple. Alterna vamente, el método de control puede consistir de la administración del NOI (y si es aplicable también la proteína) en dos administraciones separadas que tienen 28 días de separación. Como sé ilustra en la presente, el término "aumento de una respuesta de célula T" abarca los mejoramientos en todos los aspectos de la respuesta de células T que incluyen pero no están limitadas a una estimulación y/o aumento y/o poteneiamiento y/o suprarregulación de la magnitud y/o duración y/o calidad de la respuesta de células T hacia un NOI repetidamente administrado, que codifica para un EOI de un antígeno objetivo. A manera de ejemplo, la respuesta de células T puede ser aumentada ya sea al aumentar la activación y/o producción y/o distribución y/o proliferación de las células T inducidas, y/o la longevidad de la respuesta de 19 células T a los WOls inductores/moduladores de células T que codifican para EOIs a partir de un TA. El aumento de las respuestas de células T en un sujeto hospedero puede estar asociada con el aumento y/o modulación de la respuesta inmune de Thl en un sujeto hospedero. El aumento de la respuesta de células T puede ser determinado por un número de ensayos bien conocidos, tales como los ensayos de linfo-proliferación (activación de linfocitos) , ensayos de células citotóxicas o CD8+ o mediante la evaluación de los linfocitos T específicos para el epitopo en un sujeto sensibilizado (ver por ejemplo, Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199; y Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376) o los ensayos ELISPOT de células T CD8+, para la medición de la producción de Interferón gamma (Miyahara et al PNAS (EÜA) (1998) 95:3954-3959). ANTÍGENO Cada enfermedad que provoca que agente del estado de enfermedad tenga asociado con éste un antígeno o epitopo inmunodominante sobre el antígeno que es crucial en el reconocimiento inmune y en la eliminación o control final de un agente promotor de enfermedad o estado de enfermedad en un hospedero. Con el fin de montar una respuesta inmune humoral y/o celular contra una enfermedad particular, el sistema inmune del hospedero debe entrar en contacto con un antígeno o un epitopo inmunodominante sobre un antígeno asociado con ese 20 estado de enfermedad. Como se utiliza en la presente, el término "antigeno" se refiere a cualquier agente, en general una macromolécula, que puede proveer una respuesta inmunologica en un individuo. La respuesta inmunologica de células linfocíticas puede ser de B- y/o T- . El término puede ser. utilizado para referirse a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoléculas antigénicas. Como se utiliza en la presente, "antígeno" se utiliza para referirse a una molécula de proteína o porción de la misma, que contiene uno o más determinantes de epitopos antigénicos . · ANTÍGENO OBJETIVO Como se utiliza en la presente, el término "antígeno objetivo (TA)" significa un péptido o proteína inmunogénico de interés que comprende uno o más epitopos capaces de inducir una respuesta de CMI hacia un patógeno infeccioso tal como, pero no limitado a bacterias, virus, hongos, levaduras, parásitos y otros microorganismos capaces de infectar especies de mamíferos. El antígeno objetivo puede incluir pero no está limitado a un auto-antígeno, un antígeno propio, un antígeno de reacción cruzada, un haloantígeno, un tolerógeno, un alérgeno, un hapteno, un inmunógeno o partes del mismo, así como cualesquiera combinaciones de los mismos. De este modo, el EOI puede ser prevenido de cualquiera de los tipos de 21 antigenos o proteínas mencionados en la presente, o de cualquiera de los antígenos o proteínas específicos mencionados en la presente. EPITOPO Como se utiliza en la presente, el término "epitopo" se refiere en general al sitio sobre un antígeno objetivo que es reconocido por un receptor en células T y/o un anticuerpo. Preferentemente, éste es un péptido corto derivado de o como parte de un antígeno proteico. No obstante, el término está también destinado a incluir los péptidos con epitopo de glucopéptidos y carbohidratos. Una molécula antigénica simple puede comprender varios epitopos diferentes . El término "epitopo" también incluye las secuencias modificadas de aminoácidos o carbohidratos que estimulan las respuestas que reconocen el organismo entero. Es ventajoso si el epitopo seleccionado es un epitopo de un agente infeccioso (tal como una bacteria o virus) que provoca la enfermedad infecciosa. Como se utiliza en la presente, el término epitopo de interés (EOI) se refiere a uno o más EOIs que pueden ser utilizados en el método de la invención. El método de la invención puede ser utilizado para promover una respuesta de células T hacia 1, 2, 3, 4, 5 a 10 o más diferentes epitopos. De este modo, el método puede comprender la administración de uno o más NOIs que conjuntamente codifican para 1, 2, 3, 4, 5 a 10 ó más epitopos diferentes, y/o la administración de una o 22 más proteínas que conjuntamente comprenden 1, 2, 3, 4, 5 a 10 o más epitopos diferentes. En una modalidad, el método de la invención es llevado a cabo para promover una respuesta de células T hacia un epitopo predeterminado (o predefinido) y/o conocido, que es típicamente proveniente de una proteína predeterminada y/o conocida . FUENTE DE EPITOPOS El EOI puede ser generado a partir del conocimiento del aminoácido y de las secuencias de ADN correspondientes al péptido o polipéptido, asi como de la naturaleza de los aminoácidos particulares (por ejemplo, tamaño, carga, etc.) y el diccionario de codones, sin experimentación indebida. Ver por ejemplo, Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988; endrew, supra; Janis Kuby, Immunology, 1992, por ejemplo, páginas 79-81 Algunos lineamientos en la determinación de si una proteína o un epitopo de interés estimulará o no una respuesta, incluye: la longitud del péptido - el péptido debe ser al menos de 8 ó 9 aminoácidos de longitud para ajustarse al complejo MHC de la clase I y al menos 8-25, tal como al menos de 13-25 aminoácidos de longitud para ajustarse a un complejo MHC de la clase II. Esta longitud es un mínimo para que el péptido se enlace al complejo de MHC. Se prefiere que los péptidos sean más largos que estas longitudes, debido a que las células deben cortar los péptidos. El péptido debe 23 contener una porción de anclaje apropiada que hará posible que se enlace a las diversas moléculas de la clase I ó de la clase II con especificidad suficientemente alta para generar una respuesta inmune (Ver Bocchia, M. et al, Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusión Protein Pentides to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684; Englehard, VH, Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol . 12:181 (1994)). Esto puede ser realizado, sin experimentación indebida, al comparar la secuencia de la proteína de interés con estructuras publicadas de los péptidos asociados con las moléculas MHC. De este modo, la persona experta puede averiguar un epitopo de interés al comparar la secuencia proteica con las secuencias listadas en la base de datos de proteínas . El método de la presente invención es en general aplicable al mejoramiento de la respuesta de CMI contra NOIs que codifican contra NOIs provenientes de cualquier fuente (por ejemplo, de un patógeno) , incluyendo a aquellos de una amplia variedad de agentes infecciosos tales como virus o parásitos. A manera de ejemplo, el EOI puede ser derivado de agentes patógenos derivados de células tumorales que se multiplican sin restricción en un organismo y pueden de este modo conducir a crecimientos patológicos. Los ejemplos de tales agentes patógenos son descritos en Davis, B.D. et al (Microbiology, 3a ed. , Harper Internacional Edition) . 24 El epitopo puede ser proveniente de una proteína no de mamífero, no de ratón, o no humana. El epitopo puede ser proveniente de una proteína intracelular o una proteína extracelular. En una modalidad, el epitopo es proveniente de una proteina secretada, tal como una proteína secretada por un patógeno. El epitopo puede o no ser proveniente de una proteína del sujeto en quien está siendo promovida la respuesta de células T. El epitopo puede ser proveniente de un patógeno que es capaz de infectar al sujeto. El epitopo puede ser un epitopo de origen natural o un epitopo artificial que no es encontrado en la naturaleza. No obstante, en modalidades preferidas, la invención es ejemplificada al aumentar la respuesta de CMI contra los componentes de la familia viral del VIH. Las respuestas aumentadas de CMI pueden ser generadas contra EOIs localizados dentro de los productos de cualquier gen viral, tales como por ejemplo, los genes gag, pol, nef y env, con los productos de los genes de env que son los objetivos preferidos. De este modo, en una modalidad el método de la invención promueve una respuesta inmune contra antígenos particulares para el tratamiento y/o prevención de la infección por el VIH y/o cualquier condición que sea provocada por o exacerbada por la infección por el VIH, tal como el SIDA. 25 EPITOPOS DE CÉLULAS T En los métodos o procesos de la presente invención, el EOI del TA puede contener uno o más epitopos de células T. Como se utiliza en la presente, el término "epitopo de células T" se refiere en general a aquellas características de una estructura peptidica que son capaces de inducir una respuesta de células T. A este respecto, se acepta en la técnica que los epitopos de células T comprenden determinantes peptídicos lineales que asumen conformaciones extendidas dentro de la grieta de enlace al péptido de las moléculas de MHC (Unanue et al. (1987) Science 236: 551-557). Como se utiliza en la presente, un epitopo de células T es en general un péptido que tiene al menos aproximadamente 3 a 5 residuos de aminoácidos, y preferentemente al menos 5 a 10 o más residuos de aminoácidos, tal como 8 a 25 residuos de aminoácidos. No obstante, como se utiliza en la presente, el término "epitopo de células T" abarca cualquier péptido restringido de MHC Clase I o MHC Clase II. La habilidad de un epitopo de células T particular para estimular/mejorar una respuesta de CMI, puede ser determinada por un número de ensayos bien conocidos, tales como mediante ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos) , ensayos de células T citotóxicas CD8+, o mediante la evaluación para los linfocitos T específicos del epitopo en un sujeto sensibilizado. Ver, por ejemplo, Erickson et al. (1993) J. Immunol . 151: 4189-4199; y Doe et al. (1994) 26 Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376 o CD8+ T-cell BLISPOT assays for measuring interferon gamma production (Miyahara et al PNAS(USA) (1998) 95: 3954-3959). EPITOPOS DE CÉLULAS T CD8+ Preferentemente, el EOI es un EOI de células T CD8+.

Un EOI inductor de células T CD8+ es un epitopo capaz de estimular la formación, o incrementar la actividad, de células T CD8+ específicas después de su administración a un sujeto hospedero. Los epitopos de células T CD8+ pueden ser proporcionados en una variedad de diferentes formas, tales como una sarta recombinante de uno o más epitopos . Los epitopos de células T CD8+ han sido identificados y pueden ser encontrados en la literatura, para muchas enfermedades diferentes . Es posible diseñar las sartas de epitopos para generar la respuesta de células T CD8+ contra cualquier TA elegido, que contenga tales EOIs de células T CD8+ . Ventajosamente, en el NOI los EOIs de células T CD8+ pueden ser proporcionados en una sarta de múltiples EOIs que están enlazados entre sí sin secuencias de intervención, de modo que es evitado el material de ácido nucleico no necesario. En una modalidad, el NOI codifica también para la secuencia que puede actuar como sitios de escisión de proteasa para permitir la escisión de los epitopos a partir de la proteína expresada. EPITOPOS DE CÉLULAS T COOPERADORAS Preferentemente, el EOI es un EOI de linfocito T 27 cooperador. Son disponibles diversos métodos para identificar los EOIs de células T cooperadoras, adecuados para el uso de acuerdo con la presente. Por ejemplo, la anfipaticidad de una secuencia peptídica se sabe que afecta su habilidad para funcionar como un inductor de células T cooperadora. Una discusión completa de los epitopos inductores de células T cooperadoras se da en la Patente de los Estados Unidos No. 5,128,319 incorporada por referencia en la presente. EPITOPOS DE CÉLULAS B Preferentemente, el EOI es una mezcla de EOIs de células T GD8+ y EOIs de células B. Como se utiliza en la presente, el término "epitopo de células B" se refiere en general al sitio sobre un TA al cual se enlaza una molécula específica de anticuerpo. La identificación de los epitopos que son capaces de promover una respuesta al anticuerpo es fácilmente lograda utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Geysen et al. (1984) Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 81: 3998-4002 (método general para sintetizar rápidamente péptidos, para determinar la posición de los epitopos inmunogénicos en un antigeno dado) ; Patente de los Estados Unidos No. 4,708,871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epitopos de antígenos) ; y Geysen et al. (1986) Molecular Immunology 23: 709-715 (técnica para identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo dado) . 28 COMBINACIÓN DE EPITOPOS En una modalidad preferida de la presente invención, el EOI es una mezcla de un EOI inductor de células T CD8+ y un EOI inductor de células T cooperadoras. Como es bien conocido en la técnica, los epitopos inductores de células T y B son frecuentemente distintos uno del otro y pueden comprender diferentes secuencias peptídicas. Por lo tanto, ciertas regiones de una cadena peptídica de una proteína pueden poseer ya sea epitopos de células T o de células B. Por lo tanto, además de los epitopos de células T CD8+ puede ser preferible incluir uno o más epitopos reconocidos por las células T cooperadoras, para aumentar la respuesta inmune generada por los epitopos de células T CD8+. El mecanismo de mejoramiento de una respuesta inducida por células T CD8+ in vivo por agentes inductores de células T cooperadoras, no es completamente caro. Sin embargo, sin estar comprometido por alguna teoría, es probable que el agente de aumento, en virtud de su habilidad para inducir células T cooperadoras, dará como resultado niveles incrementaos de citocina necesaria que ayudan en la expansión clonal y en la diseminación de las células T CD8+ específicas. No obstante del mecanismo subyacente, se considera que el uso de mezclas de EOI inductores de células T cooperadoras y de células T CD8+ en los métodos de la presente invención, ayudarán en el mejoramiento de la respuesta de CMI . Los 29 epitopos de células T cooperadoras particularmente adecuados, son aquellos que son activos en individuos de diferentes tipos de HLA, por ejemplo epitopos de células T cooperadoras provenientes del tétanos (contra los cuales la mayoría de los individuos estarán ya preparados) . Puede ser también útil incluir EOIs de células B para estimular las respuestas de células B y la producción de anticuerpos. Los NOIs sintéticos pueden también ser construidos para producir dos tipos de respuestas inmunes: células T únicamente y células T combinadas con una respuesta de células B. EPITOPO INMUNODO INAN E Cuando un individuo es inmunizado con un NOI que codifica para múltiples EOIs de un TA, en muchos casos la mayoría de los linfocitos T respondedores serán específicos para uno o más EOIs lineales provenientes de ese TA, y/o una mayoría de los linfocitos B respondedores serán específicos para uno o más EOIs lineales o conformacionales provenientes de ese TA. Para los fines de la presente invención, entonces, tales EOIs son denominados como "epitopos inmunodominantes" . En un antígeno que tiene varios EOIs inmunodominantes, un EOI simple puede ser el más dominante en términos de comandar una respuesta específica de células T o B. Preferentemente, el método o proceso de la presente invención es efectivo en el mejoramiento de una respuesta de C I contra uno o más epitopos de HSV-2. Preferentemente, el 30 método o proceso de la presente invención es efectivo en mejorar una respuesta de CMI contra uno o más epitopos de HSV-2 inmunodominante . Preferentemente, el método de la presente invención es efectivo en la generación/aumento de una respuesta de CMI contra uno o más epitopos de HbsAg . Preferentemente, el método de la presente invención es efectivo en general/mej orar una respuesta de CMI contra uno o más epitopos de HbsAg inmunodominante. Como lo muestran los Ejemplos, la respuesta aumentada o mejorada de CMI, obtenida contra los EOIs de HSV-2 y HbsAg, indica que el método de la presente invención es en general efectivo contra EOI proveniente de diversos patógenos infecciosos. Además, el efecto protector contra el reto viral indica que la generación de una fuerte respuesta de células T CD8+ es de valor en el desarrollo de estrategias de vacunación preventivas y terapéuticas. Preferentemente, los métodos o procesos de la presente invención son efectivos para promover una respuesta de CMI mejorada, contra uno o más EOIs asociados con un antígeno asociado al tumor (TAA por sus siglas en ingles) . Ventajosamente, los EOIs derivados de los antígenos asociados al tumor (TAA) pueden servir como objetivos para el sistema inmune del hospedero y para promover respuestas que dan como resultado la destrucción del tumor. Los ejemplos de tales TAAs incluyen pero no están limitados a antígeno de melanoma 31 reconocido por células T 1 (MART-1 por sus siglas en ingles) , MAGE-l, MA.GE-3 , 5T4, gplOO, antígeno carcinoembrionario (CEA por sus siglas en ingles) , antígeno específico de la próstata (PSA por sus siglas en ingles) , MUCINA (MUC-1) , tirosinasa. Otros TAAs pueden ser identificados, aislados y clonados mediante métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,514,506. En una modalidad preferida el NOI codifica para al menos dos antígenos del VIH. El NOI puede comprender una secuencia que codifica para la proteína gag del VIH, o el fragmento de la misma que contiene un epitopo, y uno o más antígenos adicionales del VIH o fragmentos del mismo que contienen un epitopo. Los antígenos pueden derivarse de cualesquiera aislados disponibles del VIH (típicamente VIH-1) , tales como HXB2. Los antígenos pueden incluir antígenos gag (o fragmentos de los mismos que contienen un epitopo)' tales como p24gag y p55gag, así como proteínas derivadas de pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu y regiones LTR del VIH (o fragmentos de los mismos que contienen un epitopo) . En una modalidad más preferida, el NOI codifica para al menos tres antígenos del VIH, preferentemente Gag, nef y RT (o en vez de la proteína completa un fragmento de cualquiera de estas proteínas que contiene un epitopo) . Estas secuencias de codificación pueden estar en cualquier orden, pero están preferentemente en el orden de Nef-RT-Gag, RT-Nef, Gag o RT- 32 Gag-Nef . En una modalidad, los epitopos/proteína del VIH que son expresados, son proteínas de fusión, tales como una proteína de fusión que contiene la secuencia proveniente de (incluyendo los fragmentos anteriormente mencionados) Nef, RT y Gag. En una modalidad preferida, el gen Gag no codifica para el péptido p6 de gag. Preferentemente, el gen nef en el NOI es truncado para eliminar la secuencia que codifica para los 71 aminoácidos N-terminales . Los fragmentos de gag, o cualquier otro antígeno del VIH (tales como Nef o RT) que son codificados por el NOI comprenden en general un epitopo; Las proteínas (incluyendo dichos fragmentos) codificadas por el NOI son ' en general de al menos 8 aminoácidos de longitud, por ejemplo de 8 a 10 aminoácidos o hasta 20, 50, 60, 70, 80, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. Cualquier proteína tal puede ser optimizada en codón, por ejemplo tal que el fragmento tiene un patrón de uso de codón que se asemeja a aquel de un gen de mamífero altamente expresado . En una modalidad, el NOI codifica para una de las siguientes combinaciones de polipéptidos : I pl7, p24 fusionado al NEF truncado (desprovisto de los nucleótidos que codifican para los aminoácidos terminales 1-85) 33 II pl7, p24, RT, Nef truncado (desprovisto de los nucleótidos que codifican para los aminoácidos terminales 1-85) III pl7, p24 (gag optimizado) NEF truncado (desprovisto de los nucleótidos que codifican para los aminoácidos terminales 1-85) IV pl7, p24 (gag optimizado) RT optimizado, NEF truncado (desprovisto de los nucleótidos que codifican para los aminoácidos terminales 1-85) V pl7, p24, RT (optimizado) NEF truncado (desprovisto de los nucleótidos que codifican para los aminoácidos terminales 1-85) En una modalidad preferida, el NOI comprende el RT optimizado de codón inactivado, Nef truncado y la porción pl7/p24 del gen gag optimizado por codón (por ejemplo como se describe en el documento WO 03/025003) , opcionalmente operativamente enlazado corriente abajo de un promotor del HCMV de longitud Aiowa + el exon 1 y/o en dirección 5 ' de una señal de poli-adenilaci n de globina de conejo. La señal de poli-adenilación puede ser del gen de la beta-globina de conejo . En una modalidad preferida el NOI comprende una o más de las secuencias polinucleotldicas mostradas en las Figuras 18 a 22 o un fragmento de tal secuencia, que codifica para al menos un epitopo (preferentemente epitopo de células 34 T) ; o un homólogo de cualquiera de las secuencias de las Figuras 18 a 22 o un homólogo de dicho fragmento. Tal fragmento u homólogo es típicamente de al menos 50 nucleótidos, tal como de al menos 100, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de longitud. En una modalidad, el NOI está en la forma de un plásmido como es mostrado en cualquiera de las Figuras 17 ó 20 a 22 o un fragmento o derivado (incluyendo un homólogo) de tal plásmido. La construcción de los plásmidos es descrita en el documento WO03/080112 (incorporado por referencia en la presente) . CODONES OPTIMIZADOS En una modalidad preferida de la invención, la secuencia de codificación del NOI es optimizada para asemejarse al uso del cod n de los genes altamente expresados en células de mamífero. El código del ADN tiene cuatro letras (A, T, C y G) y utiliza éstas para deletrear "codones" de tres letras que representan los aminoácidos de las proteínas codificadas en los genes de un organismo. La secuencia lineal de los codones a lo largo de la molécula de ADN es traducida en la secuencia lineal de los aminoácidos en la o las proteínas codificadas por esos genes . El código está altamente degenerado, con 61 codones que codifican para los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan señales de "detención". De este modo, la mayoría de los aminoácidos son codificados por más de un codón -de hecho varios son 35 codificados por cuatro o más diferentes codones . Donde está disponible más de un codón para codificar un aminoácido dado, se ha observado que los patrones de uso de codón de los organismos son altamente no aleatorios . Diferentes especies muestran una desviación diferente en su selección de codones y, además, la utilización de los codones puede ser marcadamente diferente en una especie simple entre genes que son expresados a niveles altos y bajos. Esta desviación es diferente en virus, plantas, bacterias y células de mamífero, y algunas especies muestran una desviación más fuerte lejos de una selección de codón aleatorio, que otros. Por ejemplo, los humanos y otros mamíferos están menos fuertemente desviados que ciertas bacterias o virus. Por estas razones, existe una probabilidad significativa de que un gen de mamífero expresado en E. coli o un gen viral expresado en células de mamífero tendrá una distribución inapropiada de codones para la expresión eficiente. Se cree que la presencia en una secuencia de ADN heterólogo de grupos de codones que son raramente observados en el hospedero en el cual va a ocurrir la expresión, es predictivo de bajos niveles de expresión heteróloga en ese hospedero. En el NOI , el patrón de uso de codón puede ser alterado de aquel encontrado de manera natural, para representar mas estrechamente la desviación de codón del organismo objetivo, por ejemplo, un mamífero, especialmente un 36 humano. El "coeficiente de uso de codón" es una medida de qué tan estrechamente el patrón de codón de una secuencia polinucleotidica dada se asemeja a aquella de una especie objetivo. Las frecuencias de codones pueden ser derivadas de fuentes de la literatura para genes altamente expresados de muchas especies (ver, por ejemplo, Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24: 214-215). Las frecuencias de codón para cada uno de los 61 codones (expresados como el número de ocurrencias por 1000 codones de la clase seleccionada de genes) son normalizados para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, de modo que el valor para el codón más frecuentemente utilizado para cada aminoácido es establecido a 1, y las frecuencias para los codones menos comunes son escaladas para quedar entre cero y 1. De este modo, cada uno de los 61 codones es asignado con un valor de 1 o menor para los genes altamente expresados de la especie objetivo. Con el fin de calcular un coeficiente de uso de codón para un polinucleótido específico, con relación a los genes altamente expresados de esa especie, el valor escalado para cada codón del polinucleótido específico es anotado, y se toma la media geométrica de todos estos valores (al dividir la suma de los logs naturales de estos valores entre el número total de codones, y tomar el anti-log) . El coeficiente tendrá un valore entre cero y 1 y entre más alto sea el coeficiente más codones en el polinucleótido son codones frecuentemente utilizados. Si 37 una secuencia polinucleotidica tiene un coeficiente de uso de codón de 1, todos los codones son los codones "más frecuentes" para los genes altamente expresados de las especies objetivo. De acuerdo a la presente invención, el patrón de uso de codón del NOI excluirá preferentemente los codones con un valor de RSCU menor de 0.2 en los genes altamente expresados del organismo objetivo. Un valor de uso de codón sinónimo relativo (RSCU por sus siglas en ingles) es el número observado de codones dividido entre el número esperado si todos los codones para ese aminoácido fueran utilizados de manera igualmente f ecuente . El NOI tendrá en general un coeficiente de uso de codón para genes humanos altamente expresados de mayor de 0.3, preferentemente mayor de 0.4, lo más preferentemente mayor de 0.5. Las tablas de uso de codones para humanos pueden ser también encontradas en GenBank. En comparación, un gen de acción beta altamente expresado tiene un RSCU o 0.747. La tabla de uso de codones para un Homo sapiens es descrito enseguida: Homo sapiens [gbpri] : 27143 CDS's (12816923 codones) campos: [triplete] [frecuencia: por mil] ([número]) UUU 17.0(217684) UCU 14.8(189419) UAU 12.1(155645) UGU 10.0 (127719) UUC 20.5(262753) UCC 17.5(224470) UAC 15.8(202481) UGC 12.3 (157257) UUA 7.3 ( 93924) UCA 11.9(152074) UAA 0.7 ( 9195) UGA 1.3 ( 38 16025) UÜG 12.5(159611) ÜCG 4.5 ( 57572) UAG 0.5 ( 6789) UGG 12.9(165930) CUU 12.8(163707) CCU 17.3(222146) CAU 10.5(134186) CGU 4.6( 59454) CUC 19.3 (247391) CCC 20.0(256235) CAC 14.9(190928) CGC 10.8 (137865) CUA 7.0 ( 89078) CCA 16.7(214583) CAA 12.0(153590) CGA 6.3( 80709) CUG 39.7 (509096) CCG 7.0 ( 89619) CAG 34.5(441727) CGG 11.6 (148666) AUU 15.8(202844) ACU 12.9(165392) AAU 17.0(218508) AGU 12.0 (154442) AUC 21.6(277066) ACC 19.3(247805) AAC 19.8(253475) AGC 19.3 (247583) AUA 7.2 ( 92133) ACA 14.9(191518) ??? 24.0(308123) AGA 11.5 (147264) AUG 22.3(285776) ACG 6.3 ( 80369) AAG 32.6(418141) AGG 11.3 (145276) GUU 10.9(139611) GCU 18.5(236639) GAU 22.4(286742) GGU 10.8 (138606) GUC 14.6(187333) GCC 28.3(362086) GAC 26.1(334158) GGC 22.7 (290904) GUA 7.0 ( 89644) GCA 15.9(203310) GAA 29.1 (373151) GGA 16.4(210643) 39 GUG 28.8(369006) GCG 7.5 ( 96455) GAG 40.2(515485) GGG 16.4 (209907) Codificación GC 52.51% la letra GC 56.04%, 2a letra GC 42.35%, 3a letra GC 59.13% ADYUVANTES El método o proceso de la presente invención no requiere la presencia de una adyuvante para demostrar una respuesta de CMI aumentada. No obstante, la inclusión de un adyuvante y en particular un adyuvante genético puede ser útil en mejorar o modular adicionalmente la respuesta de CMI. Un adyuvante puede aumentar o mejorar la respuesta de CMI al aumentar la inmunogenicidad de un antigeno co-administrado en un sujeto inmunizado, induciendo también una respuesta inmune similar a Thl contra el antigeno co-administrado, que es benéfico en un producto de vacuna. De este modo, los métodos o procesos de la presente ¦invención para mejorar una respuesta de CMI pueden ser refinados, por la adición de adyuvantes al NOI o la proteina o las composiciones que comprenden el NOI o la proteína que conducen a las composiciones particularmente efectivas y los métodos para promover una respuesta de CMI de larga vida, mejorada y sostenida. Como se utiliza en la presente, el término "adyuvante" se refiere a cualquier material o composición capaz de alterar específica o no específicamente, mejorar, 40 dirigir, redirigir, potenciar o iniciar una respuesta inmune específica del antigeno. El término "adyuvante" incluye pero no está limitado a una exotoxina de ribosilación de ADP bacteriano, un factor biológicamente activo, una molécula inmunomoduladora, un modificador de la respuesta biológica o molécula inmunoestimuladora tal como una citocina, una interleucina, una quimiocina o un ligando o un epitopo (tal como un epitopo de célula T cooperadora) y óptimamente combinaciones de los mismos los cuales, cuando son administrados con el NOI aumenta o potencia o modula la respuesta de CMI con relación a la respuesta de CMI generada después de la administración del NOI solo o de la proteína sola. El adyuvante puede ser cualquier adyuvante conocido en la técnica que sea apropiado para el uso en humanos o en animales. Las moléculas inmunomoduladoras tales como las citocinas (TNF-alfa, IL-6, GM-CSF e IL-2) , y las moléculas co-estimuladoras y accesorias (B7-1, B7-2) pueden ser utilizadas como adyuvantes en una variedad de combinaciones . En una modalidad, GM-CSF no es administrado al sujeto antes, en o después del régimen de administración. La producción simultánea de la molécula inmunomoduladora y un EOI en el sitio de expresión del EOI, pueden aumentar la generación de efectores específicos los cuales pueden ayudar a mejorar la respuesta de CMI. El grado de aumento o mejoramiento de la 41 respuesta de CMI puede ser dependiente de las moléculas inmunoestimuladoras específicas y/o los adyuvantes utilizados, debido a que diferentes moléculas inmunoestimuladoras pueden promover diferentes mecanismos para mejorar y/o modular la respuesta de CMI. A manera de ejemplo, diferentes mecanismos efectores/moléculas inmunomodul doras incluyen, pero no están limitados al aumento de la señal de auxilio (IL-2) , reclutamiento de APC profesional (GM-CSF) , incremento en la frecuencia de células T (IL-2) , efecto sobre la vía de procesamiento de antígenos y expresión de MHC (IFN-gamma y TNF-alfa) y desviación de la respuesta inmune lejos de la respuesta de Thl, y hacia una respuesta de Th2 (LTB) (ver WO97/02045) . Los oligonucleótidos que contienen CpG no metilado (ver ¥1096/02555) son también inductores preferentes de una respuesta de Thl y son adecuados para el uso en la presente invención. Sin estar comprometido por alguna teoría, la inclusión de un adyuvante es ventajosa debido a que el adyuvante puede ayudar a mejorar la respuesta de CMI al NOI expresado o la proteína al desviar la respuesta de Th2 hacia una respuesta de Thl y/o los mecanismos específicos asociados al efector, hacia un EOI expresado con la generación y mantenimiento consecuentes de una respuesta de CMI aumentada (ver, por ejemplo, las enseñanzas en WO97/02045) . La inclusión de un adyuvante con el NOI o la 42 protelna es también ventajoso debido a que puede dar como resultado una menor dosis o menos dosis de NOI o de la proteína, que las que son necesarias para alcanzar la respuesta de CMI deseada en el sujeto al cual se administra el NOI o la proteína, o puede dar como resultado una respuesta inmune cualitativo y/o cuantitativamente diferente en el sujeto. La efectividad de un adyuvante puede ser determinada por la administración del adyuvante con el NOI o la proteína en paralelo con el NOI o la proteína solos, a animales y comparando la inmunidad por anticuerpo y/o mediado por células, en los dos grupos utilizando ensayos estándares tales como radioinmunoensayo, ELISAs, ensayos de células T CD8+, y similares, todos bien conocidos en la técnica. Típicamente, el adyuvante es una porción separada del antígeno, aunque una molécula simple puede tener propiedades de adyuvante y antígeno . Como se utiliza en la presente, el término "adyuvante genético" se refiere a un adyuvante codificado por un NOI, y el cual, cuando es administrado con el NOI que codifica para el EOI o la proteína (que comprende un epitopo) aumenta la respuesta de CMI con relación a la respuesta de CMI generada después de la administración del NOI o la proteína solos . En una modalidad preferida, el adyuvante genético es una exotoxina bacteriana de ribosilación del ADP. Las toxinas 43 bacterianas de ribosilacion del ADP son una familia de exotoxinas bacterianas relacionadas e incluyen la toxina de la difteria (DT) , toxina pertussis (PT) , toxina del cólera (CT) , las toxinas de E. coli lábiles al calor (LT1 y LT2) , endotoxina A de Pseudomonas, exotoxina S de Pseudomonas, exoenzyma B. cereus, toxina de JE?, sphaericus, toxinas C2 y C3 de C. botulinum, exoenzima de C. limosu , así como toxinas provenientes de C. perfringens, C. spiriforma y C. difficile, EDIN de Staphylococc s aureus, y mutantes de toxinas bacterianas de ribosilacion de ADP, tales como CRMi97, un mutante de toxina de difteria no tóxica (ver, por ejemplo, Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251: 175; y Constantino et al. (1992) Vaccine) . La mayoría de las toxinas bacterianas de ribosilacion del ADP están organizadas como un multímero A:B, en donde la subunidad A contiene la actividad de ADP-ribosiltransferasa, y la subunidad B actúa como la porción de enlace. Las toxinas bacterianas de ribosilacion de ADP, preferidas para el uso en las composición de la presente invención, incluyen toxina del cólera y las toxinas lábiles al calor de E. coli. La toxina del cólera (CT) y las enterotoxinas lábiles al calor (LT) de E. coli relacionadas, son productos de secreción de sus cepas bacterianas enterotóxicas respectivas, que son potentes inmunógenos y muestran fuerte toxicidad cuando son administrados sistémicamente, oralmente o 44 mucosalmente . CT y LT se sabe que proporcionan efectos adyuvantes para el antígeno, cuando son administrados vía las rutas intramuscular- u oral. Estos efectos adyuvantes han sido observados a dosis por debajo de aquella requerida para la toxicidad. Las dos toxinas son moléculas extremadamente similares, y son al menos aproximadamente 70-80% homologas al nivel de aminoácidos . Preferentemente, el adyuvante genético es toxina del cólera (CT) , toxina lábil al calor de E. coli, enterotoxigénica (LT) , o un derivado, subunidad, o fragmento de GT o LT que conserva la adyuvanticidad. En una modalidad aún más preferida, el adyuvante genético es LT. En otra modalidad preferida, el adyuvante genético puede ser CTB o LTB. Preferentemente, la enterotoxina es una enterotoxina no tóxica. A manera de ejemplo, al menos una de las regiones de codificación de la subunidad de enterotoxina puede ser genéticamente modificada para destoxificar el péptido subunitario codificado por ésta, por ejemplo en donde la región de codificación de la subunidad A truncada, ha sido genéticamente modificada para perturbar o inactivar la actividad de ADP-ribosiltransferasa en el producto de expresión de péptido subunitario (ver WO03/004055) . En los ejemplos descritos más adelante, la holotoxina LT que comprende las subunidades A y B nativas 45 expresadas por un vector plásmido, se utilizó como un adyuvante genético que se co-administró con el NOI que expresa el HSV-2/antígeno HbsAg para obtener una respuesta de CMI mejorada. Los resultados demuestran que la inclusión de un adyuvante mejora en gran medida la capacidad de promover una respuesta de CMI , en términos de generación de una respuesta de células T sistémica comparada a la administración de un NOI o la proteína sin el adyuvante. De este modo, estos resultados demuestran que este adyuvante genético es particularmente deseable donde es deseada una respuesta de CMI aún más aumentada. Otros adyuvantes genéticos deseables incluyen pero no están limitados a NOI que codifica para IL-10, IL-12, IL-13, los interferones (IFNs) (por ejemplo IFN-alfa, IFN-ss e IFN-gamma) , y combinaciones preferidas de los mismos. Otros factores biológicamente activos de este tipo que aumentan la respuesta de CMI pueden ser fácilmente seleccionados por una persona de experiencia en la técnica, y un vector plásmido adecuado que contiene los mismos, construidos mediante técnicas conocidas . NOI Los EOIs de la presente invención pueden ser administrados como secuencias nucleotídicas que codifican para el EOI . Como se utiliza en la presente, el término secuencia nucleotídica de interés (NOI) se refiere a uno o más NOI que 46 codifican para uno o más EOIs que son utilizados en el método de la presente invención. El término "secuencia nucleotídica de interés (NOI)" es un sinónimo con el término "polinucleótido" . El NOI puede ser ADN o ARN de origen genómico o sistémico, o de origen recombinante . El NOI puede ser de doble hebra o de una sola hebra, que representa ya sea la hebra en sentido o antisentido o combinaciones de las mismas. Para algunas aplicaciones, preferentemente, el NOI es ADN. Para algunas aplicaciones, preferentemente, el NOI es preparado mediante el uso de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, ADN recombinante) . Para algunas aplicaciones, pre erentemente, el NOI es ADNc. Para algunas aplicaciones, preferentemente, el NOI puede ser el mismo que la forma de origen natural. El NOI puede estar en forma aislada o purificada, tal como la forma no celular. VECTOR En una modalidad de la presente invención, el NOI es administrado directamente a un sujeto hospedero. En otra modalidad más de la presente invención, un vector que comprende un NOI es administrado a un sujeto hospedero. Preferentemente, el NOI es preparado y/o administrado utilizando un vector genético. Como es bien conocido en la técnica, un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un ambiente a otro. De acuerdo con la presente invención, y a manera de ejemplo, 47 algunos vectores utilizados en las técnicas de ADN recombinante permiten que las entidades, tales como un segmento de ADN (tal como un segmento de ADN heterólogo, tal como (un segmento de ADNc heterólogo) , sean transferidas a un hospedero y/o una célula objetivo para fines de replicación de los vectores que comprenden el NOI de la presente invención y/o que expresan los EOIs de la presente invención codificados por el NOI. Los ejemplos de vectores utilizados en las técnicas de ADN recombinante incluyen, pero no están limitados a plásmidos, cromosomas, cromosomas artificiales o virus. El término "vector" incluye los vectores de expresión y/o los vectores de transformación. El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de realizar la expresión in vivo o in vitro/ex vivo. El término "vector de transformación" significa una construcción capaz de ser transferida de una especie a otra. En una modalidad, es utilizado un promotor viral para impulsar la expresión del NOI. El promotor puede ser un promotor del Citomegalovirus (CMV) . Un elemento promotor preferido (particularmente en el caso donde el NOI codifica para un antigeno del VIH) es el promotor temprano inmediato (IE) del CMV, desprovisto del intrón A, pero que incluye el exon 1. De este modo, la expresión desde el NOI puede estar bajo el control del promotor temprano IE del HCMV. 48 ADN DESNUDO Los vectores que comprenden el NOI de la presente invención pueden ser administrados directamente como "una construcción de ácido nucleico desnudo" , que comprende además preferentemente las secuencias flanqueantes homologas al genoma de la célula hospedera. Como se utiliza en la presente, el término "ADN desnudo" se refiere a un plásmido que comprende el NOI de la presente invención junto con una región promotora corta para controlar su producción. Éste es llamado ADN "desnudo" debido a que los plásmidos no son llevados en ningún vehículo de administración. Cuando tal plásmido de ADN entra a una célula hospedera, tal como una célula eucariótica, las proteínas que éste codifica son transcritas y traducidas dentro de la célula. VECTORES VIRALES Alternativamente, los vectores que comprenden el NOI de la presente invención pueden ser introducidos en células hospederas adecuadas utilÍ2ando una variedad de técnicas virales que son conocidas en la materia, tales como por ejemplo la infección con vectores virales recombinantes tales como el retrovirus, virus del herpes simple y el adenovirus . El vector puede ser un vector viral recombinante . Los vectores virales recombinantes, adecuados, incluyen pero no están limitados a vectores adenovirales , vectores virales adenoasociados (AAV) , vectores del virus del herpes, un vector 49 retroviral, vectores lentivirales, vectores baculovirales, vectores virales de la viruela o vectores del parvovirus (ver Kestler et al. 1999 Human Gene Ther 10(10): 1619-32). En el caso de vectores virales, la administración del NOI es mediada por infección viral de una célula objetivo. VECTOR DIRIGIDO El término "vector dirigido" se refiere a un vector cuya habilidad para insertar o transfectar o transducir una célula o para ser expresada en un hospedero y/o célula objetivo, está restringido a ciertos tipos celulares dentro del sujeto hospedero, usualmente en las células que tienen un fenotipo común o similar. VECTOR DE EXPRESIÓN Preferentemente, el NOI de la presente invención que es insertado dentro de un vector está operablemente enlazado a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión del EOI, por la célula hospedera, por ejemplo, el vector es un vector de expresión. El agente producido por la célula hospedera puede ser secretado o puede ser contenido intracelularmente dependiendo del NOI y/o del vector utilizado. Como será comprendido por aquellos expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen el NOI pueden ser diseñados con secuencias de señal que dirigen la secreción del EOI a través de la membrana celular procariótica o eucariótica particular. 50 PROTEÍNAS DE FUSIÓN El NOI de la presente invención puede ser expresado como una proteína de fusión que comprende un adyuvante y/o modificador de la respuesta biológica y/o inmunomodulador fusionado al EOI para mejorar y/o aumentar adicionalmente la respuesta de CMI obtenida. El modificador de la respuesta biológica puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada de la respuesta de CMI . El EOI puede ser enlazado ya sea al extremo amino o al extremo carboxilo del modificador de la respuesta biológica. PROTEÍNA QUE COMPRENDE EL EPITOPO La secuencia proteica puede ser la misma que la secuencia de epitopo (por ejemplo, sin ninguna secuencia de adición al extremo N o C) . La proteína está típicamente en forma aislada o purificada, tal como la forma no celular. La proteína tiene típicamente una longitud de 8 a 400 aminoácidos, tal como 10 a 300 ó 15 a 150 aminoácidos. ADMINISTRACIÓN DE NOI Y DE PROTEÍNA El NOI o la proteína pueden ser administrados, ya sea solos o como parte de una composición, por medio de una variedad de diferentes rutas. Ciertas rutas pueden ser favorecidas para ciertas composiciones, que da como resultado en la generación de una respuesta de CMI más efectiva, o que es menos probable que induzca efectos colaterales, o que es más fácil para la administración. La ruta de administración 51 para una composición de vacuna puede variar dependiendo de la identidad del patógeno o de la infección que va a ser prevenida o tratada. El NOI o la proteina pueden ser administrados vía una ruta sistémicamente o una ruta mucosal o una ruta transdérmica o puede ser administrada directamente a un tejido específico tal como el hígado, la médula ósea o dentro del tumor, en el caso de terapia para el cáncer. Como se utiliza en la presente, el término "administración sistémica" incluye, pero no está limitada a cualesquiera rutas parenterales de administración. En particular, la administración parenteral incluye pero no está limitada a las técnicas de infusión subcutánea, intraperítoneal , intravenosa, intraarterial, intramuscular o inyección intrasternal , intravenosa, intraarterial o infusión dialítica del riñon. Preferentemente la administración parenteral sistémica es la inyección intramuscular es la inyección intramuscular. En una modalidad preferida del método, el NOI o la proteína se administran vía la piel, por ejemplo por medio de una ruta transdérmica. Mientras se cree que cualquier modo y ruta de administración afectada pueden ser empleados y no obstante logran algunas ventajas de acuerdo con la presente, los ejemplos siguientes demuestran ventajas particulares con la administración transdérmica de NOI. A este respecto, y sin estar comprometido por alguna teoría, se cree que la 52 administració transdérmica es preferida, debido a que ésta activa más eficientemente el brazo del sistema inmune mediado por las células. El término distribución o administración "transdérmica" abarca la administración intradérmica (por ejemplo, dentro de la dermis o epidermis) , transdérmica (por ejemplo, "percutánea" ) y transmucosal , por ejemplo, la distribución por el paso de un agente hacia o a través de la piel o el te ido mucosal . Ver, por ejemplo, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundament is and Applications, Robinson y Lee (eds.) Marcel Dekker Inc., (1987); y Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonxeus y Berner (eds.), CRC Press, (1987). De este modo, el término abarca la distribución de un agente utilizando un dispositivo de distribución de partículas (por ejemplo, una jeringa sin aguja) tales como aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 5,630,796, así como la distribución utilizando dispositivos de distribución mediados por partículas, tales como aquellos descritos en la Patente de los, Estados Unidos No. 5,865,796. Como se utiliza en la presente, el término "administración mucosal" incluye pero no está limitado a la administración oral, intranasal, intravaginal , intrarrectal , 53 intratraqueal , intestinal y oftálmica. Las rutas mucosales, particularmente intranasal, intratraqueal y oftálmica son preferidas para la protección contra la exposición natural a patógenos ambientales tales como RSV, virus de la influenza y virus del resfriado o alérgenos tales como los pólenes de pastos y de ambrosia, y ácaros del polvo doméstico. El aumento de la respuesta de CMI aumentará el efecto protector contra un antígeno objetivo subsecuentemente encontrado, tal como un alérgeno o agente microbiano . En una modalidad del método de la invención, todas las administraciones de la primera y/o segunda y/o una subsecuente inmunización son a sitios que drenan hacia el mismo nodo linfático. En otra modalidad preferida de la presente invención, el NOI o la proteína pueden ser administrados a células que han sido aisladas del sujeto hospedero. En esta modalidad preferida, preferentemente el NOI que codifica para un EOI proveniente de un antígeno asociado al tumor (TAA) es administrado a las células profesionales presentadoras de antígeno (APCs) , tales como las células dendríticas. Los APCs pueden ser derivados de un sujeto hospedero y modificadas in vivo para expresar EOI y luego transferirlos nuevamente al sujeto hospedero para inducir una respuesta de CMI mejorada, contra TAA con el fin de promover una respuesta 54 antitumoral . Se cree que las celdas dendríticas son las APCs más potentes para estimular las -respuestas de CMI mejoradas, debido a que los EOIs expresados deben ser adquiridos, procesados y presentados por las APCs profesionales a las células T (células cooperadoras Thl y Th2 así como las células T CD8+) con el fin de inducir una respuesta de CMI mejorada. En una modalidad alternativa, las células cancerosas provenientes de un sujeto hospedero pueden ser modificadas in situ o in vitro. ADMINISTRACIÓN DE PARTÍCULAS DE NOI Los métodos mediados por partículas para la distribución de NOI o preparaciones de proteínas, son conocidos en la técnica. De este modo, una vez preparados y adecuadamente purificados, los NOIs anteriormente descritos pueden ser recubiertos sobre partículas portadoras de núcleo, utilizando una variedad de técnicas conocidas en la materia. Las partículas portadoras son seleccionadas de los materiales que tienen una densidad adecuada en el intervalo de tamaños de partícula típicamente utilizados para la distribución intracelular de un dispositivo de pistola de genes. El tamaño de partícula portadora óptima, por supuesto dependerá del diámetro de las células diana. Por "portador de núcleo" se entiende un portador en el cual un ácido nucleico huésped (por ejemplo, ADN, ARN) es recubierto con el fin de impartir un tamaño de partícula 55 definido, así como una densidad suficientemente alta para lograr el momento requerido para la penetración de la membrana celular, tal que la molécula huésped puede ser distribuida utilizando técnicas mediadas por partículas (ver por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,100,792). Los portadores del núcleo típicamente incluyen materiales tales como tungsteno, platino, ferrita, poliestireno y látex. Ver por ejemplo, Partide Bombardent Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed. , Oxford University Press, New York, NY páginas 10-11. Las partículas de tungsteno y de oro son preferidas . Las partículas de tungsteno son fácilmente disponibles en tamaños promedio de 0.5 a 2.0 micrómetros de diámetro . Las partículas de oro o el oro microcristalino (por ejemplo, polvo de oro ?1570, disponible de Engerlhard Corp. East Newark, NJ) encontrarán también uso con la presente invención. Las partículas de oro proporcionan uniformidad en tamaño (disponibles de Alpha Chemicals en tamaños de partículas de 1-3 micrómetros o disponibles de Degussa, South Plainfield, NJ en un intervalo de tamaños de partículas que incluyen 0.95 micrómetros). El oro microcristalino proporciona una distribución de tamaño de partícula diversa, típicamente en el intervalo de 0.5-5 micrómetros. Sin embargo, el área superficial irregular del oro microcristalino proporciona recubrimiento altamente eficiente con ácidos nucleicos . Son conocidos un número de métodos, y han sido 56 descritos para recubrir o precipitar NOIs o proteínas sobre partículas de oro o tungsteno. La mayoría de tales métodos combinan en general una cantidad predeterminada de oro o tungsteno con el ADN del plásmido, CaCl2 y espermidina. La solución resultante es agitada en torbellino continuamente durante el procedimiento de recubrimiento, para asegurar la uniformidad de la mezcla de reacción. Después de la precipitación del NOI, las partículas recubiertas pueden ser transferidas a membranas adecuadas y se dejan secar antes del uso, se recubren sobres superficies de un número de muestra o cásete, o se cargan en un cásete de distribución para el uso en un instrumento particulado de fisura de genes. Por "dispositivo de administración de partículas" se entiende un instrumento que distribuye una composición particulada transdérmicamente sin la ayuda de una aguja convencional para perforar la piel . El dispositivo de distribución de partículas con el uso con la presente invención son discutidos a todo lo largo de este documento. Los diversos dispositivos de aceleración de partículas, adecuadas para la distribución mediada por partículas, son conocidas en la técnica, y son todos adecuados para el uso en la práctica de la invención. Los diseños actuales de dispositivos emplean una descarga explosiva, eléctrica o gaseosa para propulsar las partículas portadoras recubiertas hacia las células diana. Las partículas portadoras recubiertas 57 pueden por si mismas ser librablemente acopladas a una hoja portadora movible, o removiblemente acopladas a una superficie a lo largo de la cual pasa una corriente de gas, elevando las partículas de la superficie hacia adelante y acelerándolas hacia el objetivo. Un ejemplo de un dispositivo de descarga gaseosa se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,204,253. Un dispositivo tipo explosivo es descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,945,050. Un ejemplo de un aparato de aceleración de partículas tipo descarga de helio, es el instrumento PowderJect XR (PowderJect Vaccines, Inc., Madison) , WI, cuyo instrumento es descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,120,657. Un aparato de descarga eléctrica, adecuado para el uso en la presente, se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,149,655. La descripción de todas estas patentes es incorporada por referencia en la presente . Alternativamente, las composiciones particuladas de NOI o de proteínas pueden ser administradas transdérmicamente utilizando un dispositivo de jeringas sin aguja. Por ejemplo, una composición particulada que comprende los NOIs de la presente invención puede ser obtenido utilizando métodos farmacéuticos generales, tales como evaporación simple (cristalización) , secado a vacio, secado por rocío o liofilización. Si se desea, las partículas pueden ser además densificadas utilizando las técnicas descritas en la 58 Publicación Internacional de pertenencia común No. WO 97/48485, incorporada por referencia en la presente. Estas composiciones particuladas son luego distribuidas desde un sistema de jeringa sin aguja, tales como aquellos descritos en la Publicaciones Internacionales Nos. WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 y WO 96/20022, todas las cuales se incorporan por referencia en la presente. La distribución de partículas que comprenden antígenos o alérgenos desde los sistemas de jeringas sin aguja, anteriormente referidos, es practicado con partículas que tienen un tamaño aproximado en general en el intervalo de 0.1 a 250 micrómetros, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 10-70 micrómetros. Partículas más grandes de aproximadamente 250 micrómetros pueden ser también distribuidas desde los dispositivos, con el límite superior que es el punto en el cual el tamaño de las partículas podría provocar el daño indirecto a las células de la piel. La distancia efectiva que las partículas distribuidas penetrarán una superficie objetivo, depende del tamaño de partículas (por ejemplo, un diámetro de partícula nominal que asume una geometría de partícula aproximadamente esférica) , densidad de partícula, la velocidad inicial a la cual la partícula impacta la superficie, y la densidad y la viscosidad cinemática del te ido de la piel objetivo. A este respecto, las densidades de partícula óptimas para el uso en una inyección sin aguja, en 59 general en están en el intervalo entre aproximadamente 0.1 y 25 g/cm3, preferentemente entre aproximadamente 0.9 y 1.5 g/cm3, y las velocidades de inyección en general en el intervalo de entre aproximadamente 100 y 3,000 m/segundo. Con presión de gas apropiado, las partículas que tienen un diámetro promedio de 10-70 m pueden ser aceleradas a través de la boquilla a velocidades que se aproximan a las velocidades supersónicas de un flujo de gas de impulsión. Las composiciones de partículas recubiertas son administras al inhibir de una manera compatible con la formulación de dosis, y una cantidad que será efectiva para los fines de la invención. La cantidad de la composición que va a ser distribuida (por ejemplo, aproximadamente 0.1 mg a 1 mg, más preferentemente 1 a 50 g del antígeno o alérgeno, depende del individuo que se pruebe) . La cantidad exacta necesaria variará dependiendo de la edad y de la condición general del individuo que se trate, y una cantidad efectiva apropiada puede ser fácilmente determinada por una persona de experiencia en al técnica después de la lectura de la presente especificación. Las micropartículas de oro o tungsteno pueden ser utilizadas también como agentes de transportación, como se describe en el documento WO 93/17706, y Tang petal . , Nature (1992)356:152. En este caso particular, el NOI es precipitado sobre las micropartículas en presencia de cloruro de calcio y 60 espermidina, y luego la totalidad es administrada por un chorro de alta velocidad hacia la dermis o hacia la epidermis utilizando un aparato sin agujas, tales como aquellas descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,945,050 y 5,015,580 y el documento WO 94/24243. La cantidad de NOI que puede ser utilizado para vacunar a un sujeto hospedero depende de un número de factores tales como, por ejemplo, la fuerza del promotor utilizado para expresar el antígeno, la inmunogenicidad del producto expresado, la condición del mamífero para quienes está destinada la administración (por ejemplo, el peso, la edad, y el estado general de salud) , el modo de administración, y el tipo de formulación. En general, una dosis apropiada para el uso profiláctico o terapéutico en un adulto de la especie humana es de aproximadamente 1 pg hasta aproximadamente 5 mg, preferentemente de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg, lo más preferentemente de aproximadamente 25 pg a aproximadamente 500 pg. Las técnicas de distribución mediadas por partículas han sido comparadas a otros tipos de administración de NOI y se encontró que son notablemente superiores. Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17:79-83, Fynan et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:11478-11482, y Raz et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:9519-9523. Tales estudios han investigado la distribución mediada por partículas de vacunas basadas en ácido nucleico a la piel superficial y al tejido mucosal. Una 61 posible razón para los resultados notablemente mejores logrados con la pistola de genes, es que el NOI es distribuido intracelularmente en oposición a la distribución extracelular por inyección intramuscular. Preferentemente, el intervalo entre la administración del antígeno objetivo (TA) está en el intervalo de aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 192 horas. Más preferentemente, el intervalo entre la administración del antígeno objetivo (TA) va de aproximadamente 72 horas hasta aproximadamente 168 horas. Aún más preferentemente, los intervalos entre la administración del antígeno objetivo (TA) va de aproximadamente 72 horas hasta aproximadamente 144 horas . SUJETO MAMÍFERO HOSPEDERO Como se utiliza en la presente, el término "sujeto mamífero hospedero" significa cualquier miembro de subfilum cordata, que incluye sin limitación, humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos, tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; animales domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio tales como roedores, incluyendo ratones, ratas y cobayos; aves, incluyendo domésticas, silvestres, y aves de juego tales como' pollos, pavos y otras aves gallináceas, gatos, gansos y similares . Los animales preferidos incluyen aquellos utilizados en deportes, tales como caballos de carreras o 62 caballos para salto. Los términos no denotan una edad particular. De este modo, los individuos adultos y neonatos están destinados a ser cubiertos . El método descrito en la presente está destinado para el uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriormente mencionadas, ya que los sistemas inmunes de todos estos vertebrados operan similarmente . Si es un mamífero, el su eto será preferentemente un humano, pero puede ser también un ganado doméstico, sujeto de laboratorio o animal de mascota. PREVENCIÓN Y/O TRATAMIENTO Este método o proceso de la presente invención es ampliamente aplicable a los métodos de vacunación y es relevante para el desarrollo de vacunas profilácticas y/o terapéuticas (incluyendo vacunas inmunoterapéuticas) . Se debe apreciar que todas las referencias en el presente tratamiento incluyan el tratamiento curativo, paliativo y profiláctico. En el método de la presente invención, el NOI o la proteína descrita en la presente, puede ser empleado solo o como parte de una composición, tal como pero no limitada a una composición farmacéutica o una composición de vacuna, o una composición inmunoterapéutica para prevenir y/o tratar un trastorno inmune mediado por células T. La administración del NOI o de la proteína o de una composición que comprende el NOI o la proteína, puede ser ya sea para fines "profilácticos" o 63 "terapéuticos". Como se utiliza en la presente, el término "terapéutico" o "tratamiento" incluye cualquiera de los siguientes : la prevención de la infección o reinfección; la reducción o eliminación de los síntomas; y la reducción o eliminación completa de un patógeno. El tratamiento puede ser profilácticamente efectuado (antes de la infección) o terapéuticamente (después de la infección) . La profilaxis o terapia incluye, pero no está limitada a promover una respuesta inmune efectiva de CMI hacia un NOI y/o aliviar, reducir, curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o las complicaciones que resultan de un trastorno inmune mediado por células T. Cuando se proporciona profilácticamente, la composición de la presente invención es típicamente proporcionada antes de cualquier síntoma. La administración profiláctica del NOI o la composición de la presente invención es prevenir o mejorar cualquier infección o enfermedad subsecuente. Cuando se proporciona terapéuticamente, el NOI o la composición de la presente invención es típicamente proporcionado en (o poco después del) inicio de un síntoma de la infección o la enfermedad. De este modo, la composición de la presente invención puede ser proporcionada ya sea antes de la exposición anticipada a un agente promotor de enfermedad, o estado de enfermedad, o después del inicio de una infección o enfermedad . 64 Si la administración profiláctica terapéutica del NOI o de la proteína (ya sea solo o como parte de una composición) es o no la más apropiada, esto usualmente dependerá de la naturaleza de la enfermedad. A manera de ejemplo, la composición inmunoterapéutica de la presente invención podría ser utilizada en protocolos de inmunoterapia para inducir activamente la inmunidad tumoral por vacunación con una célula tumoral o sus componentes antigénicos. Esta última forma de tratamiento es ventajosa, debido a que la inmunidad es prolongada y debido a que existe una creencia general de que una de las mejores formas de eliminar los tumores podría ser inducir una fuerte respuesta de CTL específica, antitumoral. Por una parte, una composición de, vacuna preferentemente, aunque no necesariamente, será utilizada profilácticamente para inducir una respuesta de CMI efectiva, contra antígenos subsecuentemente encontrados o porciones de los mismos (tales como epitopos) relacionados al antígeno objetivo. CANTIDAD PROFILÁCTICA 0 TERAPÉUTICAMENTE EFECTIVA La dosis del NOI o de la proteína administrada a un sujeto hospedero, en el contexto de la presente invención, puede ser suficiente para efectuar una respuesta de CMI profiláctica terapéutica benéfica en el sujeto, sobre el tiempo . Como se utiliza en la presente, el término "dosis 65 profiláctica o terapéuticamente efectiva" significa una dosis en una cantidad suficiente para promover una respuesta de CMI mejorada, a una o más EOIs de un antigeno objetivo específico y/o para aliviar, reducir, curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o complicaciones de una enfermedad tal como un trastorno inmune mediado por célula T. DOSIS La profilaxis o terapia puede ser llevada a cabo mediante una administración directa simple en un punto de tiempo simple o múltiples puntos de tiempo. La administración puede ser también distribuida a un solo sitio o a sitios múltiples. Algunas rutas de administración, tales como la administración mucosal, vía las rutas oftálmicas, puede requerir una mayor dosis . Aquellos expertos en la técnica pueden ajusfar la dosis y la concentración para adecuarse a la ruta particular de administración. Ventajosamente, los ejemplos demuestran que una dosis simple del NOI o la composición que comprende el NOI es usualmente suficiente para lograr una respuesta CMI mejorada. CONDICIONES Y ENFERMEDADES Debido a que el método de la invención promueve una respuesta de CMI mejorada, el método puede ser utilizado para proteger contra la infección subsecuente por un patógeno tal como un agente viral, bacteriano, parasitario u otro agente infeccioso. Preferentemente, el antígeno objetivo es un 66 patógeno o un antígeno asociado con una enfermedad infecciosa, un alérgeno o un cáncer. Los ejemplos de enfermedad infecciosa incluyen, pero no están limitados a, la enfermedad viral, bacteriana, microbacteriana, y parasitaria. Los ejemplos de alérgenos incluyen, pero no están limitados a, pólenes de plantas, proteínas de ácaros del polvo, pelo de animales, salida y espora de hongos. Los ejemplos de antígenos asociados al tumor (TAAs) incluyen, pero no están limitados a, células tumorales vivas o irradiadas, extractos de células tumorales y subunidades proteicas de antígenos tumorales. El antígeno puede también ser una proteína esperma para el uso en la anticoncepción. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno ambiental. Los ejemplos de antígenos ambientales incluyen, pero no están limitados a, virus sincitial respiratorio (n SV") , virus de la influenza y virus del resfriado. Los patógenos que invaden vía la mucosa, también incluyen aquellos que provocan el virus sincitial respiratorio, influenza, otras condiciones del tracto respiratorio superior, así como agentes que provocan infecciones intestinales. Entre varios . ejemplos conocidos de otras enfermedades contra las cuales una respuesta de CMI mejorada es importante, están los siguientes: infección y enfermedad causada por virus tales, pero no limitados al VIH, herpes simple, herpes zoster, hepatitis C, hepatitis B, influenza, 67 virus de Epstein-Barr, sarampión, dengue, HTLV-1 y virus del papiloma humano (HPV) (por ejemplo HPV 16); enfermedades provocadas por bacterias tales como, pero no limitadas a, tuberculosis de Mycojacterium y histeria sp, Chlamydia, Mycobacteria, Plasmodium Falciparum, Legioniella y enfermedades enteropatógenas, enterotoxigénicas, enteroinvasoras, enterohemorrágicas y enteroagregativas por e coli y enfermedades provocadas por protozoarios patógenos que incluyen, pero que no están limitadas a, malaria, Babesia, Schistosoma, Toxiplasma y Toxocara canis o por los parásitos protozoarios Toxoplasma y Tripanosoma. Además, el régimen de administración descrito en la presente, se espera que sea de valor en la inmunización contra formas de cáncer donde la respuesta de células T juegan un papel protector. Los ejemplos de cánceres de mamíferos que pueden ser tratados utilizando el método y las composiciones de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a melanoma, metástasis, adenocarcinoma, timona, linfoma, sarcoma, cáncer pulmonar, cáncer de hígado, cáncer de colon, linfoma no Hodking, linfoma de Hodking, leucemias, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer pancreático y similares. En una modalidad, el cáncer es uno el cual está vinculado a, por ejemplo, provocado por HPV (por ejemplo, HPV 16) . Tal cáncer puede ser un cáncer cervical. 68 CÁNCER En una modalidad preferida, el uso de un NOI que codifica para un EOI (o una proteina que comprende un epitope) a partir de un antígeno objetivo asociado al tumor (TAA) en el método de la presente invención, permite el desarrollo de vacunas o específicas de antígeno dirigidas, para terapia contra el cáncer. La administración de un NOI que codifica para un EOI a partir de un TAA y opcionalmente un NOI que codifica para una molécula inmunomoduladora, proporciona un sistema poderoso para promover una respuesta de CMI específicamente mejorada, en términos de la prevención en un sujeto hospedero, con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer (inmunización preventiva) , prevención de la recurrencia de la enfermedad después de la cirugía primaria (vacunas anti-metastática) , o como una herramienta para expandir el número de células T in vivo, mejorando de este modo su efectividad en la erradicación de tumores difusos (tratamiento de la enfermedad establecida) . Además, el método de la presente invención puede ser utilizado para promover una respuesta de CMI mejorada, en un sujeto hospedero mediante el tratamiento de la célula ex vivo antes de ser transferidas nuevamente al portador del tumor (también conocida como inmunoterapia adoptiva) . El método o proceso de la presente invención puede ser utilizado para administrar el NOI dentro del sujeto hospedero, ya sea antes de cualquier evidencia de cánceres 69 tales como, melanoma (= vacunación preventiva) o para mediar la regresión de la enfermedad en un mamífero afectado con un cáncer tal como melanoma (vacunación terapéutica o inmunoterapéutica) . En una modalidad, el NOI codifica para un antígeno proveniente del HPV (por ejemplo, HPV 16), tal como E6 ó E7. CÉLULAS T ACTIVADAS En otros aspectos, la presente invención se refiere a un método para preparar células T activadas. En su sentido más general, este método incluye la administración, preferentemente transdérmicamente, de un NOI que codifica para un EOI preseleccionado, de un antigeno objetivo capaz de mejorar una respuesta de CMI en términos de una respuesta mejorada de células T, a un sujeto hospedero. De acuerdo con este aspecto de la invención, las células T son recuperadas de los nodulos linfáticos del hospedero, para el uso posterior. Numerosos usos potenciales de las células T específicamente activadas, son considerados. Por ejemplo, en el caso de la terapia en humanos, se contempla que las células T específicamente activadas pueden ser cultivadas ex vivo y administradas a humanos para el tratamiento de infecciones virales o de pacientes con cáncer. De acuerdo con este aspecto de la invención, las células T son preparadas mediante la administración del NOI in vivo, y luego aislando las células T para expandirse in Vitro en presencia de modificadores de la 70 respuesta biológica y/o inmunomoduladores o adyuvantes, apropiados, tales como, pero no limitados a, péptidos, citocinas, y células presentadoras de antígeno. HOMÓLOGOS Las proteínas (incluyendo antígenos proteicos) , tales como Gag, nef y/o RT, como se utilizan en la invención (como son codificadas por el NOI) pueden tener homología y/o identidad secuencial con las formas de origen natural . Similarmente, las secuencias de codificación de NOI capaces de expresar tales proteínas en general tendrán homología y/o identidad secuencial con las secuencias de origen natural. Las técnicas para determinar la "identidad secuencial" de ácidos nucleicos y de aminoácidos, son también conocidas en la materia. Típicamente, tales técnicas incluyen la determinación de la secuencia nucleotídica del ARNm para un gen y/o determinando la secuencia de aminoácidos codificada por éste, y comparando estas secuencias a una secuencia nucleotídica o de aminoácidos . En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido-nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, respectivamente. Dos o más secuencias (polinucleótido o aminoácido) pueden ser comparadas para determinar su "identidad porcentual" . La identidad porcentual de dos secuencias, ya sea secuencias de ácido nucleico o de 71 aminoácidos es el número de concordancias exactas entre dos secuencias alineadas, dividido entre la longitud de las secuencias más cortas, y multiplicado por 100. Una alineación aproximada para las secuencias de ácidos nucleicos es proporcionada por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo puede ser aplicado a secuencias de aminoácidos mediante el uso de una matriz de calificación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed. , 5 suppl . 3:353-358, Nacional Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EUA, y normalizada por Gribskov, Nucí. AcidsRes. 14 (6) : 6745-6763 (1986). Una implantación particular de este algoritmo para determinar la identidad porcentual de la secuencia es proporcionada por Genetics Computer Group (Madison, WI) en la solicitud de utilidad MBesftFit" . Los parámetros por omisión para este método son descritos en el Manual del Programa del Paquete de Análisis Secuencial Wisconsin, Versión 8 (1995) (disponible de Genetics Computer, Group, Madison WI) . Un método preferido para establecer la identidad porcentual en el contexto de la presente invención es utilizar el paquete MPSRCH de programas registrados en derechos de autor por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . 72 A partir de este grupo de paquetes el algoritmo de Smit-Waterman puede ser empleado, donde los parámetros por omisión son utilizados para la tabla de calificaciones (por ejemplo, penalidad por espacio abierto de 12, penalidad por extensión de espacio vacio de uno, y un espacio vacío de seis) . A partir de los datos generados, el valor de "concordancia" refleja la "identidad secuencial" . Otros programas adecuados para calcular la identidad porcentual o la similitud entre secuencias son en general conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, utilizado con los parámetros por omisión. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP pueden ser utilizados utilizando los siguientes parámetros por omisión: código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra: 60; expectativa = 10; matriz = BL0SUM62; descripciones = 50 secuencias; clasificación por = ALTA CALIFICACIÓN; bases de datos = no redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS traducciones + proteína Swiss + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas pueden ser encontrados en la siguiente dirección de Internet : htpp : // ww.ncbi .nim.gov/cgi-bin/BLAS . Alternativamente, la homología puede ser determinada mediante la hibridación de los polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre las regiones homologas, seguido por la digestión con una o más nucleasas específicas de la hebra simple, y la determinación del tamaño 73 de fragmentos digeridos. Dos ADNs, o dos secuencias polipeptídicas son "sustancialmente homologas" una a la otra cuando las secuencias muestran al menos aproximadamente 80%-85%, preferentemente al menos aproximadamente 90%, y lo más preferentemente al menos aproximadamente 95%-98% de identidad secuencial sobre una longitud definida de las moléculas como es determinado utilizando los métodos anteriores. Como se utiliza en la presente, sustancialmente homólogo u homólogo también se refiere al secuenciamiento que muestra identidad completa al ADN especificado o a la secuencia de polipéptidos . Las secuencias de ADN que son sustancialmente homologas u homologas, pueden ser identificadas en un experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, bajo condiciones estrictas, como es definido para ese sistema particular. Por ejemplo, las condiciones de hibridación estrictas pueden utilizar 50% de formamida, 5x de Solución de Denhardt, 5x de SSC, 0.1% de SDS y 100 pg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón y las condiciones de lavado pueden incluir 2x de SSC, 0.1% de SDS a 37°C, seguido por lx de SSC, 0.1% de SDS a 68 °C. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica. MÉTODOS DE ENSAYO La efectividad del método de la invención puede ser probada por los pasos de (i) administrar un NOI como se 74 describe en la presente, a un sujeto hospedero tal como un sujeto humano o un animal experimental, tal como un ratón, una rata, conejo, cobayo, cabra, mono rhesus, o chimpancé; (ii) después de esto se recolectan las células de la sangre, el bazo, u otro tejido linfoide del sujeto hospedero; y (iii) se prueba el tejido para la presencia de las células T activadas, tales como las células T que son aprestadas para matar o para lisar las células que producen un componente de un agente infeccioso . Una vez que ha sido efectuada la administración de NOI, las células T provenientes del tejido linfoide del sujeto hospedero, son recuperadas. El tejido linfoide preferido será el tejido de nodo linfático, y lo más preferentemente tejido proveniente del drenado de nodulos linfáticos próximos al sitio de la administración del NOI. Como se utiliza en la presente, la palabra "nodulo próximo o proximal" está destinada a referirse al nodulo o nodulos que están localizados próximos al sitio de la administración del NOI. Tales nodulos están físicamente localizados en la proximidad del sitio de la administración del NOI o en el área que drena el sitio de administración, y también se incluyen aquellos nodulos de drenado que están físicamente a una mayor distancia del sitio de la administración. El paso final del método de ensayo involucra la determinación de si las células T han sido activadas . 75 Típicamente, el nivel de activación de células T puede ser medido por ensayos que incluyen pero no están limitados a, ensayos de liberación de cromo radioactivo y otros ensayos con radioisótopos o ensayos de células simples. Además, los ensayos de células T simples utilizando cepas vitales y/o clasificadores celulares , pueden ser empleados . Un método preferido para la medición de la activación del células T involucra poner en contacto una cantidad efectiva de muerte de las células T con las células objetiva de concordancia con MHC que muestran el EOI candidato sobre sus superficies celulares; manteniendo el contacto por un periodo de tiempo suficiente para que las células T lisen las células diana; y determinando el grado de lisis mediada por células T de las células diana. No obstante, cualquier método capaz de detectar una respuesta de célula T específica puede ser empleado, incluyendo pero no limitado a los ensayos de liberación de cromo, ensayos de células simples e incluso determinación de los conjugados célula-célula . En una- modalidad, la invención proporciona un ensayo para probar la efectividad de un método una respuesta de células T, en donde el método de promover una respuesta de células T es el mismo que cualquier método tal descrito en la presente. De este modo, el método puede comprender (i) una primera inmunización que comprende al menos dos administraciones que están de 1 a 4 días de separación al 76 sujeto, en donde cada administración comprende administrar un nucleó ido de interés (NOI) que codifica para un epitopo de células T, y opcionalmente : (ii) una segunda inmunización que comprende al menos una administración al sujeto de (a) un NOI que codifica para el epitopo de la célula T, o (b) una proteína que comprende el epitopo de la célula T, en donde el tiempo entre: la primera administración de la primera inmunización, y la primera administración de la segunda inmunización, es de 21 a 365 días, en donde el ensayo comprende llevar a cabo el método sobre un sujeto mamífero y luego determinar el nivel de células T activadas o de memoria específico para el epitopo en el sujeto. Se cree que un más alto nivel de respuesta de células T es logrado si (i) todas las administraciones de la primera inmunización ocurren antes que el nivel de las células T activadas que son generadas por la o las administraciones iniciales, regresen a un nivel basal, y (b) la segunda inmunización ocurre después del retorno de las células T a un nivel basal . El ensayo descrito anteriormente puede por lo tanto ser utilizado para determinar si un método dado de promover una respuesta de célula T, tiene o no una primera y una segunda inmunización, que son a tiempos apropiados con relación a los niveles de células T activadas. En una 77 modalidad, el ensayo comprende determinar si (i) las administraciones de la primera inmunización caen dentro del periodo de tiempo entre la primera administración de la primera inmunización, y la declinación en el nivel de las células T activadas al nivel basal, y/o (ii) la primera administración de la segunda inmunización ocurre después de la declinación en el nivel de las células T activadas al nivel basal . OTROS ASPECTOS En un aspecto adicional, se proporciona un método para promover selectivamente una respuesta humoral aumentada, sin promover necesariamente un aumento asociado de la respuesta de CMI, en donde el método comprende la administración de un NOI que codifica para uno o más EOIs de un TA, al menos tres veces al sujeto hospedero, en donde el intervalo de tiempo entre cada administración de NOI es de aproximadamente 48 horas, y en donde el método es efectivo para proporcionar una respuesta inmune humoral mejorada, contra el o cada EOI expresado, en el sujeto mamífero hospedero . En otro aspecto más, se proporciona un método para promover una respuesta humoral mejorada, en donde el método comprende la administración de un NOI que codifica para uno o más EOIs de un TA, al menos tres veces al sujeto hospedero, en donde el intervalo de tiempo entre cada administración de NOI 78 es de aproximadamente 28 días y donde el método es efectivo para proporcionar una respuesta de CMI mejorada, que ayuda a aumentar la respuesta humoral contra el o cada ??? expresado en el sujeto mamífero hospedero. COMPOSICIONES La presente invención proporciona composiciones que son útiles para prevenir y/o tratar trastornos inmunes mediados por células T. En una modalidad, la composición es una composición farmacéutica. En otra modalidad preferida, la composición es una composición inmunoterapeútica. En una modalidad aún más preferida, la composición es una composición de vacuna. La composición puede comprender una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un NOI que codifica para un EOI de un TA de la invención, como se describió anteriormente . La composición puede también comprender un portador tal como un portador farmacéutica o inmunológicamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables o portadores inmunológicamente aceptables son determinados en parte por la composición particular que se administre, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas o composiciones de vacuna, o composiciones inmunoterapéuticas de la presente invención. 79 FORMULACIONES El NOI o la protelna pueden ser formulados en una composición farmacéutica o una composición inmunoterapéutica o una composición de vacuna. Tales formulaciones comprenden el NOI de la proteína combinada con un portador farm céuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Tales formulaciones pueden ser preparadas, envasadas, o vendidas en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las formulaciones inyectables pueden ser preparadas, envasadas, o vendidas en forma de dosis unitaria, tales como en ampolletas, o en recipientes de múltiples dosis que contienen un conservador. Las formulaciones incluyen, pero no están limitadas a, suspensiones, soluciones, emulsiones, en vehículos aceitosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables . Tales formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no están limitados a agentes suspensores, estabilizadores o dispersantes. En una modalidad de una formulación para la administración parenteral, el ingrediente activo es proporcionado en forma seca (por ejemplo, un polvo o granulos) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas, envasadas o 80 vendidas bajo la forma de una solución o suspensión acuosa o aceitosa, inyectable, estéril. Esta suspensión o solución puede ser formulada de acuerdo a la técnica conocida, y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes, o agentes suspensores descritos en la presente. Tales formulaciones inyectables estériles pueden ser preparadas utilizando un diluyente o solvente no tóxico, parenteralmente aceptable, tal como agua o 1, 3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y solventes aceptables incluyen, pero no están limitados a solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, y aceites fijos, tales como mono- o di-glicéridos sintéticos. Otras formulaciones parenteralmente administrables que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal, o como un componente de sistemas poliméricos biodegradables . Las composiciones para la liberación sostenible o la implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrofóbicos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble, o una sal escasamente soluble. También incluido en la invención está un equipo para mejorar una respuesta de CMI hacia un EOI de un antigeno objetivo. Tal equipo comprende un MOI que codifica para un EOI 81 de un TA y/o una proteína que comprende el epitopo. El equipo puede también incluir un adyuvante, preferentemente un adyuvante genético es administrado con o como parte del NOI o la proteína y las instrucciones para administrar el NOI o la proteína . Otros componentes preferidos del equipo incluyen un aplicador para la administración del NOI o la proteína. Como se utiliza en la presente, el término "aplicador" se refiere a cualquier dispositivo que incluye pero no está limitado a una jeringa hipodérmica, pistolas de geles, dispositivo de aceleración de partículas, nebulizadores , gpteador, broncoscopio, supositorio, material vaginalmente insertable impregnado o recubierto tal como un tampón, preparación de ducha, solución para la irrigación vaginal, preparación de enemas de retención, supositorios, o solución para la irrigación rectal o colónica para la aplicación del NOI ya sea sistémica o mucosal o transdérmicamente al sujeto hospedero. EJEMPLOS La siguiente mención será ahora descrita adicionalmente únicamente a manera de ejemplo en el cual se hace referencia a las siguientes figuras. Los siguientes ejemplos son presentados únicamente para ilustrar la presente invención y para ayudar a una persona de experiencia ordinaria a elaborar y utilizar la misma. Los ejemplos no están destinados de ninguna manera a limitar de otro modo el alcance de la invención. Han sido realizados esfuerzos para asegurar 82 la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero por supuesto será permitido cierto error experimental y desviación. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A-1B proporcionan las respuestas (células T CD8+) después de 1, 2 ó 4 administraciones de NOI a ratones durante una semana en el día 7 (D 7) , día 0 y 7 (D O, 7) o días 0, 2, 4 y 7 (D O, 2, 4, 7) respectivamente. Ya sea uno o dos disparos por administración de NOI fueron dados, y en un grupo el adyuvante de LT fue administrado con el NOI . La figura 1A muestra la respuesta de células T CD8+ después de la administración del plásmido del gen simple ICP27. La figura IB muestra la respuesta de células T CD8+ después de la administración del plásmido de genes múltiples PJV7630. Las figuras 2A-2C demuestran la protección de ratones a partir del reto infeccioso utilizando la administración de NOI en grupos. La figura 3A demuestra los intervalos de tiempo óptimos entre las administraciones agrupadas del plásmido del gen simple ICP27. La figura 3B demuestra la respuesta celular obtenida después de la administración de NOI agrupado del plásmido del gen simple HbsAg. 83 La figura 3C demuestra el título del anticuerpo obtenido después de la administración de NOI agrupado del plásmido del gen simple HbsAg. La figura 4A demuestra las mediciones de ELISPOT 1 después de las administraciones de NOI agrupados de un plásmido de genes múltiples (PJV7630) a intervalos de 0, 1, 2, 4 y 6 dias entre administraciones . La Figura 4B demuestra las mediciones de ELISPOT de 3 semanas después de la administración de las administraciones de NOI en grupo de un plásmido multigénico (PJV7630) a intervalos de 0, 1 , 2 , 4 y 6 días entre administraciones . La Figura 5A es un diagrama esquemático que muestra que cada "administración" está constituida de 1 a 4 administraciones de X I y el periodo de descanso entre cada administración. La Figura 5B muestra la respuesta de CMI en términos de la liberación de IFN-gamma, obtenido a partir de una combinación del adyuvante genético LT y un esquema de administración de NOI en grupos. La Figura 5C muestra la respuesta de anticuerpo obtenida a partir de una combinación del adyuvante genético LT y un esquema de administración de NOI en grupos . La Figura 6A muestra los datos de ELISPOT de IFN-? obtenidos a partir de cerdos domésticos después de la primera inmunización en grupos. 84 La Figura 6B muestra el área promedio de eritema presente en el sitio de la administración del antígeno en cerdos (4 animales) inmunizados con pPJV7630. La Figura 7 muestra una respuesta de anticuerpo anti-?? en cerdos domésticos. La Figura 8 muestra el plásmido pPJV1671 que es un vector de vacuna de ADN humano que codifica para el antígeno de hemaglutinina (HA) de la influenza A/Panama/2007/99 (H3N2) .* La Figura 9 muestra una comparación de la Secuencia Natural HA Panamá H3 con un H3 Panamá HA codificado por pPJV1671 y una secuencia de Consenso. La Figura 10 muestra un mapa plasmídico de pPJV2012. La Figura 11 muestra un mapa plasmídico para pPJV7563. La Figura 12 proporciona una secuencia de nucleótidos para el plásmido pPJV7563. La Figura 13 proporciona un diagrama de flujo que delinea la construcción de PJV7563. Las Figuras 14A a 14F proporciona los Mapas de Características de los Plásmidos Clave en la Construcción de pPJV7563. La Figura 15 proporcionan una Derivación del Diagrama de Flujo de los Plásmidos WRG7074 y WRG7128. Las Figuras 16A a 16E proporcionan los Mapas de Características de Plásmidos Clave Adicionales. 85 Las Figuras 17 a 22 se refieren a construcciones que expresan antígenos de VIH y a las secuencias que codifican para los antígenos de VIH. Las Figuras 23 a 28 se refieren a la inmunización con los antígenos E6 y #7 del HPV. Las Figuras 29 a 38 muestran los resultados provenientes de experimentos adicionales que investigan la respuesta obtenida mediante el uso del método de la invención. TÉCNICAS GENERALES A no ser que se indique de otro modo, las técnicas de ADN recombinantes utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas son descritas y explicadas a todo lo largo de la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984); J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) T.A. Bro n (editor) , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991); D.M. Glover y B.D. Hames (editors) , DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, ILR Press (1995 y 1996); y F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, GreenePub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora) y son incorporadas por referencia en la presente. El método de la 86 presente invención involucra la introducción directa in vivo de un NOI que codifica para al menos uno o más EOI de un TA dentro de tejidos de un sujeto, para la expresión del EOI por las células del tejido del sujeto. Las construcciones de NOI de la presente invención pueden ser preparadas mediante métodos convencionales conocidos por una persona de experiencia en la técnica. Los métodos para construir el plásmido de ADN o los vectores recombinantes , son descritos en los textos convencionales, tales como Burger et al., J. Gen. Virol, 72: 357-367 (1991), y son bien conocidos en la técnica ver también Sambrook et al . , 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; y Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York. A manera de ejemplo, los NOIs que codifican para uno o más EOIs del TA o las secuencias suficientemente homologas a los EOIs conocidos de TA, para inducir respuestas de CMI pueden ser obtenidos al seguir los procedimientos bien conocidos descritos en la técnica para el aislamiento de los NOIs a partir de una variedad de fuentes de microorganismos. Alternativamente, los NOIs que codifican para los EOIs de la TA pueden ser sintetizados en un sintetizador de ácido nucleico. De este modo, la invención incluye las formas sintéticas de los NOIs que codifican para los EOIs del TA. 87 Otros plásmidos bacterianos recombinantes o vectores virales que contienen tales NOIs aislados y que son preferentemente capaces de dirigir la expresión del EOI del TA codificado por el NOI en una célula hospedera; y las células que contienen tales vectores, ya sea células eucarióticas o procarióticas, preferentemente células eucarióticas, son también preparados mediante técnicas conocidas . Para asegurar la expresión del EOI del TA por el NOI en el plasmido o el vector viral, el NOI es operablemente enlazado a una región promotora/reguladora capaz de impulsar altos niveles de expresión del antígeno en las células hospederas . Muchas de tales secuencias promotoras/reguladoras son disponibles en la técnica, incluyendo, pero no limitadas a, por ejemplo, la secuencia promotora/aumentadora temprana inmediata del citomegalovirus humano, el promotor temprano del SV40, el promotor del virus del sarcoma de Rous, y otras secuencias promotoras/aumentadoras de mamífero. Como se utiliza en la presente, el término ¾secuencia promotora/reguladora" se refiere a una secuencia de ADN que es requerida para la expresión de un NOI operablemente enlazado a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, la secuencia promotora/reguladora puede funcionar de una manera específica de tejido en que, la secuencia promotora/reguladora es únicamente capaz de impulsar la expresión en una célula de un tipo de tej ido particular . A no ser que se indique de otro 88 modo, la selección de cualquier vector plásmido particular u otro vector de ADN o vector viral no es un factor limitante en esta invención, y otros vectores de ADN o virales pueden ser sustituidos por aquellos descritos en la presente después de una lectura de la presente descripción. Está muy por dentro de la experiencia del experto el elegir las secuencias promotoras/reguladoras particulares, y enlazar operablemente esas secuencias promotoras/reguladoras a una secuencia de ADN que codifica para un antígeno deseado. Tal tecnología es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook (íJbid) , y Ausubel (i id) . Los siguientes métodos generales fueron utilizados para llevar a cabo los estudios descritos en los Ejemplos 1-5 siguientes. En cada estudio, los NOIs que comprende los EOIs fueron recubiertos sobre partículas de oro con el fin de proporcionar composiciones ejemplares de acuerdo con la presente invención. Las partículas recubiertas fueron administradas a sujetos animales, y la habilidad de las composiciones para promover respuestas de células T y/o de anticuerpos específicos del antígeno, fue también evaluada. RECUBRIMIENTO DE PARTÍCULAS PORTADORAS DE NÚCLEO Los pesos apropiados de las partículas de oro fueron calculados directamente en tubos de Eppendorf de 1.5 mi. Aproximadamente 300 µ? de una solución de espermidina 0.05 fueron luego agregados para suspender el oro, utilizando un 89 sonicador para dispersar el oro. Una solución (aproximadamente 50 µ?) que contiene el plásmido de ADN relevante, fue luego agregado a la solución de oro/espermidina a una concentración de 2 µg de ADN/mg de oro. La solución de ADN puede contener un tipo de plásmido, o para ciertos experimentos dos o más plásmidos (un adyuvante genético por ejemplo) pueden ser mezclados entre sí antes de mezclarse con la solución de oro. La mezcla de ADN/oro fue agitada en torbellino a una velocidad suave y se agregaron 300 µ? de una solución de cloruro de calcio al 10%, gota a gota mientras que se agitaba en torbellino. Las partículas de ADN/oro se dejaron precipitar a temperatura ambiente y luego se centrifugaron brevemente (10 a 15 segundos) para concentrar en un botón el oro. El botón fue lavado tres veces con aproximadamente 800 µ? de EtOH. Las partículas de ADN/oro fueron luego suspendidas en una solución de polivinilpirrolidona (PVP) a 0.03 mg/ml, constituida en etanol aproximadamente a 1 mg de ADN/oro en 3 mi de solución de PVP. Esta solución fue luego recubierta sobre la tubería Tefzel como se describió previamente. Ver por ejemplo, la solicitud de patente del PCT, PCT/US95/00780 y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,733,600; 5,780,100; 5,865,796 y 5,584,807, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente. 90 ANTÍGENO SUPERFICIAL DE LA HEPATITIS B (HBSAG) CONSTRUCCIÓN DEL PLASMIDO (CONSTRUCCIÓN PWRG7128) Un plásmido vector del antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg) fue construido como sigue. Para generar la región de codificación de HBsAg, la construcción de pA 6 (obtenida a partir de la American Type Culture Collection UATCC") fue cortada con JVcoI y tratada con una nucleasa de frijol mung para eliminar el codón inicial del antígeno X. El ADN resultante fue luego cortado con- BairíHI y tratado con la ADN-polimerasa T4 para enromar el extremo del ADN y crear un cásete de expresión de HBsAg. El cásete de expresión de HBsAg está presente en el fragmento de 1.2 kB . La construcción plasmídica pPJV7077 (Schmaljohn et al. (1997) J. Virol. 71: 9563-9569) que contiene el promotor temprano inmediato del CMV humano de longitud completa (cepa Towne) (con el aumentador) fue cortado con HindIII y Bgll , y luego tratado con la ADN-polimerasa T4 y fosfatasa alcalina de ternera para crear el ADN con extremo romo, y el cásete de expresión de HBsAg fue ligado dentro del plásmido para producir la construcción p RG7128. INMUNOENSAYOS IN VITRO Muestras de suero de ratones individuales fueron probadas para los anticuerpos específicos para HBsAg utilizando un ensayo de ELISA. Para el ELISA, las placas de microtitulación Falcon Pro Bind fueron recubiertas toda la 91 noche a 4°C con HBsAg (BioDesign) a 0.1 µg por pozo en PBS (solución amortiguada con fosfato, Bio hittaker) . Las placas fueron bloqueadas por 1 hora a temperatura ambiente (TA) con 5% de leche en polvo/PBS y luego se lavaron 3 veces con el amortiguador de lavado (solución salina amortiguador con Tris 10 mM, 0.1% de Brij-35), y las muestras de suero fueron diluidas en el amortiguador de dilución (2% de leche en polvo/PBS/0.05% de Tween 20) se agregaron a la placa y se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas 3 veces y se agregó un anticuerpo anti-ratón de cabra, biotinilado (Southern Biotechnology) diluido 1:8000 en el amortiguador de dilución, a la placa y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas fueron lavadas 3 veces, después de lo cual se agregó un conjugado de Estreptavidina-Peroxidasa de rábano (Southern Biotechnology) diluido 1:8000 en PBS y la placa se incubó 1 hora adicional a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales, las placas se lavaron 3 veces, luego se agregó una solución del sustrato T V (BioRad) y la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 1N después de 30 minutos. La densidad óptica fue leída a 450 nm. Los títulos de punto final fueron calculados por comparación de las muestras con un estándar de titulo conocido. Para los ensayos inmunes celulares, las suspensiones de células simples de los esplenocitos provenientes de los 92 bazos de los animales inmunizados, se cultivaron in vitro en presencia de un péptido correspondiente a un epitopo CD8 conocido en ratones Balb/c. El péptido fue disuelto en D SO (10 mg/ml) y diluido a 10 µg/ml en cultivo. La secuencia del péptido fue IPQSLDSWWTSL (SEQ ID NO: 20) . Para los ensayos ELISPOT de IFN-?, las placas de filtración de membrana Millipore Multiscreen fueron recubiertas con 50 µ? de antisuero anti-IFN-? a 15 g/ml (Pharmingen) en amortiguador de carbonato 0.1 M estéril (pH 9.6) toda la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas 6 veces con PBS estéril y luego bloqueadas con el medio de cultivo de tejido que contenia 10% de suero fetal bovino (FBS) por 1 a 2 horas a temperatura ambiente. El medio fue retirado y las células del bazo surtidas dentro de los pozos con un total de 1x10s células por pozo. Para los pozos en los cuales fueron agregadas menos de 1x10s células provenientes de los animales inmunizados, las células provenientes de animales intactos fueron utilizadas para llevar el total de 1x10s. Las células fueron incubadas toda la noche en una incubadora de cultivo de tejidos en presencia del péptido como se describe anteriormente. Las placas fueron lavadas 2 veces con PBS y 1 vez con agua destilada. Esto fue seguido por 3 lavados con PBS. Un anticuerpo monoclonal anti-IFN-?, biotinilado (Pharmingen) fue agregado a la placa (50 µ? de una solución de 93 1 µg/ml en PBS) y se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas 6 veces con PBS después de lo cual se agregaron 50 µ? de un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (1:1000 en PBS, Pharmingen) y se incubó por 2 horas a temperatura ambiente . Las placas fueron lavadas 6 veces con PBS y se agregó un sustrato de color de fosfatasa alcalina (BioRad) y la reacción se dejó proceder hasta que aparecieron puntos oscuros. La reacción fue detenida mediante lavado con agua 3 veces. Las placas fueron secadas al aire y los puntos contados bajo un microscopio. ANTÍGENO GP120 DEL VIH-1 CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO QUE CODIFICA PARA EL ANTÍGENO GP120 VIH-1 Un vector plásmido que codifica para gpl20 del VIH-1 fue construido como sigue. El vector fue construido comenzando con una cadena principal plásmido Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) , el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (hCMV) (Fuller et al. (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10: 1433) y el sitio de poliadenilación tardío del virus SV40. El promotor hCMV está contenido dentro de un fragmento AccII de 619 pares de bases (pb) que se extiende 522 pb en dirección 5' y 96 pb corriente abajo (3') desde el sitio de inicio de la traducción temprana inmediata. Las secuencias de poliadenilación tardía del virus SV40 está contenida dentro de un fragmento Bairiñl-BglII de aproximadamente 800 pares de 94 bases, derivado de pSV2dh.fr (antiguamente disponible de Bethesda Research Laboratories, catálogo #5369 SS) . Inicialmente, un plásmido que codifica para gpl60 del VIH-1, denominado "pcEnv" fue construido. Este plásmido contiene un fragmento Kpni.-Xh.dl de 2565 pares de bases desde el LVA-1BRU (ATCC Acceso No. 53069, GenBank Acceso No. 02013) , que comienza en la secuencia que codifica para la posición de aminoácidos #4 del extremo amino gpl60 maduro. El fragmento de la secuencia que codifica para env fue colocado inmediatamente corriente abajo (3') de, y fusionado intraestructuralmente con un fragmento sintético de 160 pares de bases que codifica para el péptido de señal de glucoproteína D (gD) del virus del herpes simple, y ninguno de los aminoácidos del extremo amino de gD maduro como se describió previamente (Fuller et al . (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10: 1433) . El plásmido que codifica para gpl20 del VIH-1, denominado en la presente "pCIA-Env/T" , fue luego construido como sigue. El plásmido pCIA-Env/T codifica para una forma truncada de gpl60 del VIH-1, y es idéntico a la construcción de pC-Env excepto que las secuencias que codifican para env están truncadas en el sitio Hindlll en la posición del. nucleótido 8188. Esto da como resultado un producto de traducción truncada gpl60 con el punto de truncamiento que yace 128 residuos de aminoácidos corriente abajo (3') del sitio de procesamiento gpl20/gp41. 95 INMUNOENSAYOS IN VITRO Las respuestas de anticuerpo en suero para el antígeno gpl20 del VIH fueron probadas utilizando un ensayo de ELISA sobre especímenes recolectados en la semana 5 y la semana 6.5 (post-aprestamiento y post-refuerzo, respectivamente) . Para el ELISA, las placas EIA de alto enlace Costar fueron recubiertas con 0.3 µg/ ozo del gpl20 del VIH recombinante (Intracel) en 50 µ? de PBS mediante incubación toda la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas tres veces y bloqueadas con 2% de BSA en PBS por 2 horas a temperatura ambiente . Diluciones en serie del suero fueron agregadas a las placas recubiertas, e incubadas a 37°C por una hora. Después del lavado, las placas fueron incubadas con una dilución 1:1500 de IgG de cabra anti-ratón conjugada a fosfatasa alcalina (BioRAd) , (H+L) seguido por el desarrollo de color con p-nitrofenilfosfato (PNPP) (BioRad) y lectura de densidad óptica (DO) a 405 nm. La cantidad de IFN-? específico del antígeno, secretado por los esplenocitos fue determinada utilizando un ensayo de esferas citométricas . 1x10s esplenocitos fueron agregados a cada pozo de una placa de 96 pozos, y se estimularon en el medio solo (control negativo) , o en el medio con 1 g/ml de un péptido gpl20 del VIH que tenía la siguiente secuencia: RIQRGPGRAFVITG (SEQ ID NO: 21) . Después de una incubación de 48 horas a 37°C en 5% de C02, los sobrenadantes 96 fueron retirados y se midieron los niveles de IFN-gamma mediante un ensayo de esferas citométricas (BD Biosciences) . ANTÍGENOS HSV-2 CONSTRUCCIÓN DEL PLASMIDO QUE CODIFICA ICP27 DEL HSV-2 Una vacuna de ADN que codifica para ICP27 fue construida y luego combinada con diversas combinaciones de los presentes vectores plásmidos adyuvantes, para proporcionar composiciones de vacuna. Después de la inmunización, los animales inmunizados fueron retados con el virus HSV-2, y el efecto protector de las diversas composiciones de vacuna fue determinado . Con respecto a la construcción del plásmido del antigeno de ADN, se utilizaron técnicas de PCR estándares para construir el plásmido. Las condiciones de PCR estándares que fueron utilizadas para la construcción del vector fueron como sigue: lx del amortiguador de núcleo de PCR con cloruro de magnesio 1.5 mM (Promega Corp., Madison, WI) ; 0.400 µ? de cada cebador; 200 µ? de cada dNTP (USB Inc., Cleveland, OH); 2.5 µg de polimerasa Taq (Promega Corp., Madison, WI) ; 1.0 ng de ADN plantilla; agua hasta 100 µ?; y una capa de aceite mineral (Aldrich Chemical Inc., Milwaukee WI) . Un termociclador PTC-200 (MJ Research Inc., Waltham, MA) fue programado para correr la siguiente rutina: 4 minutos a 95°C; 30 ciclos de (1 minuto a 95°C/l minutos, 15 segundos a 55°C/l minuto a 72°C) ; 10 minutos a 72 °C; retención de 4°C. Los productos de 97 amplificación fueron retirados de la reacción de PCR utilizando un Equipo de Purificación de PCR QIAquick7 (Qiagen Inc., Valencia CA) antes de cortar con enzimas de restricción (New England Biolabs, Beverly, MA) . Más específicamente, un vector plásmido de vacunas de ADN que codifica par el antígeno ICP27 temprano del HSV-2 fue construido como sigue. El HSV es un virus de ADN de doble hebra que tiene un genoma de aproximadamente 150-160 kpb. El genoma viral es empaquetado dentro de una nucleocápside icosahédrica la cual está envuelta en una membrana. La membrana (o envoltura) incluye al menos 10 glucoproteínas codificadas por el virus, las más abundantes de las cuales son gB, gC, gD y gE . El genoma viral también codifica para más de otras 70 proteínas, incluyendo un grupo de aproximadamente cinco antígenos tempranos inmediatos . Estas proteínas tempranas son sintetizadas tempranamente en el ciclo de replicación viral, en contraste a las glucoproteínas de envoltura que son únicamente elaboradas tardíamente en el ciclo de vida del virus. Para una revisión de la estructura molecular y de la organización del HSV, ver, por ejemplo, Roizman y Sears " (1996) "Herpes simplex viruses and their replication" en Fields Virology, 3a ed. , Fields et al., eds . , Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, PA. El antígeno ICP27 del HSV-2 puede ser fácilmente obtenido a partir del genoma del HSV-2, por ejemplo la región genómica que abarca desde 98 aproximadamente el nucleótido 114589 hasta 134980 del genoma HSV-2, o un fragmento EcoRI que abarca los nucleotidos 110931 al 139697 del genoma del HSV-2. La secuencia del genoma del HSV-2 es disponible de las fuentes publicadas, por ejemplo la secuencia depositada con GenBank bajo el Número de Acceso NC_001798. Con el fin de construir el vector ICP27 utilizado en el presente estudio, la región de codificación de ICP27 fue sometida a PCR a partir del genoma del HSV-2 utilizando los siguientes cebadores: 5'CGCC ACT CTC TTC CGA CACC3 ' (SEQ ID NO: 25) y 5'CCAA GAA CAT GAC ACG GAA CC3 ' (SEQ ID NO: 26) para obtener un fragmento nucleotídico que contiene las secuencias nucleotídicas 114523-116179 (GenBank) del HSV-2, que corresponden a la región de codificación de ICP27. El fragmento de ICP27 fue luego clonado dentro de la región de clonación múltiple del vector pTarget (Promega Corp., Madison, WI) . CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PJV7630 Los orígenes de los genes de antigeno para pPJV7630 son un fragmento genómico de la cepa MS del HSV-2 que habla sido clonado dentro de un vector cósmido llamado cósmido 23. El cósmido 23 estuvo compuesto de 3 fragmentos EcoRI proveniente del HSV-2, que abarcaban desde los nucleotidos 110,931 hasta 147,530, con base en la secuencia publicada (cepa HG52) . El cósmido 23 fue parcialmente digerido con EcoRI 99 y re-ligado, y se seleccionó una construcción que tenía únicamente el fragmento aproximado de 28,000 pares de bases (110,931-139,697). Esta molécula fue designada OP23. A partir de esta molécula fueron realizadas 6 modificaciones para alterar las secuencias dentro del OP23. Éstas fueron diseñadas para remover los genes tempranos no inmediatos de las secuencias del HSV-2 y también las secuencias de ADN de cadena principal . Una modificación final f e reemplazar las secuencias de cadena principal con un gen apropiado de resistencia a antibióticos, para el uso clínico. Los pasos son descritos más adelante. 1. Digestión con Bstll07I y Seal y re-ligadura (elimina el gen de resistencia a la ampicilina) . Crea OP23-1. 2. Digestión con Nsil y re-ligadura para eliminar el origen SV40 de replicación. Crea OP23-2. 3. Digestión parcial con BstXI y re-ligadura para eliminar las regiones entre ICP27 e ICP0 para elaborar OP23-3. 4. Digestión completa con BspHI, seguido por digestión parcial con BsiWI y luego re-ligadura para eliminar las secuencias siguientes al gen ICP22 y algunas secuencias de cadena principal. Crea OP23-4. 5. Digestión con Srfl y re-ligadura para crear 0P23-5. Elimina las secuencias entre ICP4 e ICP0. 6. Digestión total con BstXI y re-ligadura para crear OP23-6. El fragmento pequeño eliminado de entre ICP27 e ICPO. 100 7. Reemplazo de las secuencias de cadena principal que codifican para el gen de resistencia de antibióticos, con un fragmento que contiene un gen de resistencia a la kanamicina para crear pPJV7630. La construcción pPJV7630 es grande (19517 bases) y contiene los genes que codifican para los antigenos tempranos inmediatos ICPO, ICP4, ICP22 e ICP27. INMÜNOENSAYOS IN VITRO RATONES Suspensiones celulares simples fueron obtenidas a partir de bazos de ratón. Los bazos fueron triturados a través de una malla para producir una suspensión celular simple y las células fueron luego sedimentadas, y tratadas con amortiguador ACK (Bio Whittaker, Walkersville MD) para lisar las células sanguínea rojas. Las células fueron luego lavadas dos veces en medio RP I 1540 suplementado con HEPES , 1% de glutamina (Bio Whittaker) , y suero fetal de ternera inactivado por calor al 5% (FCS, Harían, Indianápolis IN) . Las células fueron contadas, resuspendidas a una concentración apropiada en el medio "total" que consiste de RPMI 1640 con HEPES y 1% de glutamina, suplementado con 5% de FCS inactivado por calor, mercaptoetanol 50 µ? (Gibco-RBL, Long Island Y) , gentamicina (Gibco-BRL) , MEM piruvato de sodio (Gibco-BRL) y aminoácidos no esenciales MEM (Sigma, St . Louis, MO) . Para los ensayos específicos de CD8, las células fueron cultivadas in vitro en 101 presencia de un péptido correspondiente a un epitopo CD8 conocido. Para ICP27 en ratones BALB/C, la secuencia del péptido fue HGPSLYRTF (QCB Inc.). Los péptidos fueron constituidos en DMSO (10 mg/ml) y diluidos a 10 µg/ml en el medio de cultivo. Para los ensayos ELISPOT de IFN-?, las placas de filtración en membrana Millipore Multiscreen fueron recubiertas con 50 µ? de una solución de 15 9/t?1 de antisuero anti-IFN-? (Pharmingen) en amortiguador de carbonato estéril 0.1 M pH 9.6, toda la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas 6 veces con PBS estéril y luego bloqueadas con el medio de tejido de cultivo que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS) por 1 a 2 horas a temperatura ambiente. El medio fue retirado y las células del bazo repartidas dentro de pozos con un total de IxlO6 células por pozo. Para los pozos en los cuales se agregaron menos de IxlO6 células provenientes de los animales inmunizados, las células provenientes de animales intactos fueron utilizadas para llevar el total hasta IxlO6. Las células fueron incubadas toda la noche en una incubadora de cultivo de tejidos en presencia del péptido como se describe anteriormente. Las placas fueron lavadas 2 veces con PBS y 1 vez con agua destilada. Esto fue seguido con 3 lavados con PBS. El anticuerpo monoclonal anti-IFN-?, biotinilado (Pharmingen) fue agregado a la placa (50 µ? de una solución de 102 1 µ9/t?1 en PBS) e incubados por 2 horas a temperatura ambiente . Las placas fueron lavadas 6 veces con PBS y luego se agregaron 50 µ? de un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (1:1000 en PBS Pharmingen) y se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas 6 veces con PBS y el sustrato de color (BioRad) fue agregado y la reacción se dejó proceder hasta que aparecieron puntos oscuros. La reacción fue detenida mediante lavado con agua 3 veces. Las placas fueron secadas al aire y los puntos contados bajo un microscopio. ENSAYO IN VIVO RATONES Un modelo de reto infeccioso fue utilizado para probar la habilidad de diferentes esquemas de inmunización para proteger á ratones de un reto letal con HSV-2. Los ratones fueron inmunizados antes del reto, y para la infección fueron anestesiados y administrados con una dosis letal de HSV-2 intranasalmente en 30 µ? de PBS. Los ratones fueron seguidos por 20 días después de la infección y fueron calificados para la enfermedad y la mortalidad. INMUNOENSAYOS IN VITRO CERDOS DOMÉSTICOS Para aislar las celdas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) sangre completa fue centrifugada a través 103 de un cojín Histopaque-1077 (3000 rpm por 30 minutos) a temperatura ambiente y las PBMCs fueron recuperadas como una banda a partir del gradiente. Las PBMCs fueron lavadas 3 veces en medio total y resuspendidas en 25 mi de medio total para el conteo y fueron resuspendidas a 1 x 107 células/ml en el medio total. El ensayo ELISPOT fue llevado a cabo como se describe para ratones con la excepción de que los antígenos fueron combinados de péptidos derivados de bibliotecas peptídicas de traslape de los antígenos del HSV-2, y un par de anticuerpos anti-IFN específico para IFN-? de cerdo doméstico (R&D Systems) fue utilizado para la detección. ENSAYO IN VIVO CERDOS DOMÉSTICOS Otro ensayo más utilizado para examinar las respuestas inmunes en cerdos domésticos, fue un ensayo de hipersensibilidad tipo retrasada (DTH) . Este ensayo utilizó plásmidos de ADN y extractos de proteína como fuentes de antígeno que fueron administrados a la piel de los cerdos utilizando el dispositivo XR1 e inyecciones con agujas respectivamente. El área de enrojecimiento (eritema) que rodea el sitio de administración de los antígenos, fue medido a las 48 horas después de la administración como un indicador de una reacción DTH. La distribución del antígeno hacia la piel fue realizada 7 días después de que la inmunización fue completada. 104 EJEMPLO 1 Se utilizaron dos diferentes plásmidos que comprendían NOIs para inmunizar ratones. Éstos fueron: el plásmido de genes múltiples de la vacuna clínica del HSV-2 (PJV7630) y un plásmido de gen simple que comprende el NOI de ICP27 operablemente enlazado al promotor HCMV. El NOI de ICP27 que codifica para el epitopo dominante encontrado en PJV7630 y las gráficas representan las respuestas de CD8 específicas para esta proteína. Esquema de Administración de NOI El NOI fue administrado 1, 2 o 4 veces durante 1 semana ya sea en el día 7 (D 7) , días 0 y 7 (D 0,7) o los días 0, 2, 4 y 7 (D 0,2,4,7) respectivamente. Se administraron ya sea 1 ó 2 disparos por administración de NOI, y en un grupo el adyuvante LT fue co-administrado con el NOI . Resultados El gen de ICP27 es el antígeno dominante encontrado en PJV7630 y las Figuras la y IB representan las respuestas de CD8 específicas para este antígeno objetivo. Típicamente, ambos plásmidos PJV7630 (Figura IB) e ICP27 (Figura 1A) generan 500 ELISPOTs/millón de células después de únicamente una administración de NOI y 1500 ELISPOTs/millón de células después de dos administraciones de NOI . Cuando dos administraciones de NOI son seguidas con el adyuvante genético LT, se encuentran aproximadamente 3600 105 ELISPOTs. Más de 3500 ELISPOTs/millón de células fueron obtenidos después de cuatro administraciones de NOI incluso en ausencia del adyuvante LT, pero el adyuvante genético LT aumentará las respuestas también. En la Figura 1A, la respuesta proveniente de LT co-administrado con el NOI no se midió ya que los resultados estuvieron fuera de escala. Se había encontrado que las administraciones de NOI en grupos generan respuestas inmunes celulares aumentadas con base en los ELISPOTs de INF-gamma CD8 específicos de ICP27, medidos en ratones e inmunizados con PJV7S30. EJEMPLO 2 El propósito de los siguientes tres experimentos fue evaluar una respuesta de CMI aumentada resultante de las administraciones de NOI en grupos y un plásmido de gen simple correlacionado con la protección aumentada a partir del reto letal. Metodología El plásmido PJV7630 fue administrado a ratones en un periodo de una semana. Ya sea uno (día 7) , dos (días 0 y 7) ó 4 (días 0, 2, 4 y 7) administraciones de NOI fueron dadas en el periodo de una semana. Un grupo recibió 2 dosis en cada inmunización, pero la mayoría de los ratones recibieron una dosis simple de PJV7630 en cada inmunización. Resultados En las gráficas el etiquetado es "número de 106 administraciones por número de dosis por administración" de modo que 4 1 son animales a los que se les dieron 4 administraciones de NOI con una dosis simple en cada administración. Después de una semana de administración de NOI, los animales se dejaron descansar ya sea 1 semana ó 2 semanas antes de ser infectados con el virus . La dosis del virus fue aproximadamente 5 veces la LD50. La Figura 2A muestra los resultados de los ratones C57B1/6 después de 2 semanas de descanso. Los resultados demuestran claramente que un esquema 4 x 1 (por ejemplo 4 administraciones por 1 dosis por administración) fue más protector. Este resultado no parece resultar de la dosis incrementada, ya que 2x2 (por ejemplo 2 administraciones de NOI x 2 dosis) también tiene 4 dosis en total. La Figura 2B muestra los resultados de los ratones C57B1/S después de 1 semana de descanso. Es claro a partir de la Figura 2B que virtualmente fueron obtenidos los mismos resultados que para el descanso de dos semanas mostrado en la Figura 2A. No obstante, en la Figura 2B existe un grupo adicional solo con una administración de NOI . La Figura 2C muestra los resultados de los ratones Babl/c después de 1 semana de descanso. Es claro a partir de los resultados que la dosis de reto no fue lo suficientemente alta como para obtener una diferencia clara en la mortalidad, pero existieron diferencias en la enfermedad. Los números en 107 corchetes son las calificaciones de la enfermedad con el número más alto que representa los animales más enfermos. Los resultados están en linea con aquellos de las Figuras 2A y 2B que muestran que 4x1 (por ejemplo 4 administraciones x una dosis) confieren la mejor protección. El agrupamiento de 4 administraciones x una dosis por administración en 1 semana, genera rápidamente una fuerte respuesta protectora de CMI que es más fuerte que las administraciones simples o el uso de más dosis por administración. EJEMPLO 3 El propósito de este experimento fue variar el intervalo de tiempo entre las administraciones de ADN de un plásmido de gen simple. Metodología A todos los ratones se les dio un total de 4 administraciones con diferencias entre la fecha de recepción de cada administración y el intervalo de tiempo entre administraciones. Los ratones tuvieron intervalos de 6, 4, 2 1 ó 0 días entre las administraciones (por ejemplo 0 tuvo 4 disparos en un día) . La administración final de cada esquema fue dada en el mismo día del calendario, y luego todos los animales fueron sacrificados 7 días después de la administración final . 108 Resultados La Figura 3A proporciona los resultados de ELISPOTs de CD8 para los intervalos de tiempo de 0 , 1 , 2 , 4 y 6 días entre las administraciones agrupadas de un plásmido de gen simple ICP27. Los resultados muestran que el incremento del intervalo de tiempo entre las administraciones mejora los resultados de ELISPOT de CD8 con un resultado máximo obtenido cuando existió un intervalo de 4 días (por ejemplo 96 horas) entre las administraciones de NOI . La Figura 3B proporciona los resultados de ELISPOTs de CD8 para los intervalos de tiempo de 0, 1, 2, 4 y 6 días entre las administraciones agrupadas de un plásmido de gen simple HbsAg. Los resultados muestran que el incremento en el intervalo de tiempo entre las administraciones mejora los resultados de ELISPOT de CD8 con resultados máximos obtenidos cuando existió un intervalo de 4 a 6 días entre las administraciones de NOI . El examen de los intervalos de tiempo entre las administraciones de NOI agrupadas en ratones demostró que cuando se dan 4 administraciones de NOI, las respuestas óptimas en términos de una respuesta de células T CD8+ son obtenidas cuando las administraciones de NOI son espaciadas con 4 o 6 días de separación. La Figura 3C proporciona los resultados del anticuerpo a partir de la administración agrupada del plásmido 109 de gen simple HbsAg. Los títulos de anticuerpo obtenidos son muy débiles. Estos resultados sugieren que las administraciones de NOI agrupadas con los intervalos de 0, 1, 2, 4 ó 6 días entre las administraciones no parece aumentar significativamente el título del anticuerpo, aún cuando la respuesta de células T CD8+ es mejorada. EJEMPLO 4 El propósito de este experimento fue evaluar la respuesta de CMI en términos de la respuesta de células T CD8+ para la administración de MOI agrupada de un plásmido de genes múltiples (PJV7630) . Metodología A los animales se les dieron 4 administraciones de NOI en total, pero el intervalo de tiempo entre las administraciones de NOI varió. La administración final para cada grupo fue en el mismo día (el inicio de las administraciones de NOI varió) y las respuestas fueron medidas una semana y 3 semanas después de la terminación de las administraciones . El muestreo de 3 semanas fue agregado para reducir al mínimo el efecto que tuvieron los diferentes esquemas sobre la sincronización de las administraciones. Por ejemplo, los animales que obtienen 4 administraciones de NOI con un intervalo de 6 días entre administraciones, tuvieron un intervalo de tiempo de 18 días entre la primera y cuarta administraciones, mientras que los animales con el intervalo 110 de tiempo 0 entre las administraciones podrían haber tenido todos los disparos en el día 18. Resultados Los resultados en las figuras 4? y 4B muestran las respuestas celulares medidas mediante un ELISPOT de IFN-gamma de CD8 , específico de ICP27. El tiempo entre las administraciones de NOI es marcado sobre la gráfica. Todos los animales recibieron 4 disparos en total . Es claro que los resultados a partir del plásmido de múltiples genes (PJV7630) estuvieron en paralelo con los resultados de los experimentos iniciales utilizando el plásmido de gen simple (IGP27) a este respecto, los intervalos de tiempo de 4 y 6 días entre las administraciones de una respuesta óptima en términos de mediciones de ELISPOT (ver figura 3C) y esto se mantuvo a las 3 semanas pero las respuestas habían caído aproximadamente 3 veces en ese tiempo (ver figura 3D) . EJEMPLO 5 El propósito de este experimento fue determinar si existe alguna sinergia entre el uso de adyuvantes genéticos y el esquema de administración de NOI en grupos en el mejoramiento de las respuestas inmunes humoral y medida por las células (CMI) hacia un antígeno relativamente débil tal como gpl20 del VIH-1. Método Este experimento involucra la administración de al 111 menos dos administraciones del antigeno gpl20 en ratones en los cuales cada "administración" está constituida de un grupo de 1 a 4 administraciones de XR1. Ver diagrama esquemático siguiente en la figura 5?. Además, el periodo de descanso entre las administraciones es de una semana. Se utilizó el adyuvante genético LT A+B (pPJV2012) . Se proporciona un mapa del plásmido pPJV2012 en la figura 10. El plásmido pPJV2012 fue preparado mediante la clonación de los genes LT que codifican para las proteínas subunitarias LTA y LTB dentro de los plásmidos pPJV-2004 y pPJV-2005 respectivamente, como se. describe en O 03/004055. Los genes que codifican para las proteínas subunitarias de LTA y LTB fueron luego cortados a partir de los plásmidos originales e insertados dentro de un plásmido simple para elaborar el plásmido pPJV2012. Resultados La figura 5B muestra los datos obtenidos de los grupos de animales con un intervalo de tiempo de 7 días entre las administraciones de NOI . El número de administraciones de XR1 en cada grupo fue variado como lo fue la presencia o ausencia del adyuvante genético LT A+B (pPJV2012) . Los resultados obtenidos indican la presencia o ausencia del adyuvante genético tuvo la más fuerte influencia sobre las respuestas celulares (producción de IFN-gamma) . La figura 5B demuestra claramente que las respuestas aumentadas de LT fueron más fuertes cuando el esquema de administración de NOI 112 fue agrupado en dos administraciones . Estos resultados demuestran que el esquema de administración agrupada realiza una contribución significativa a la respuesta celular completa obtenida con el adyuvante LT genético. La figura 5C demuestra que, en contraste a la respuesta de CMI , las administraciones acumuladas mostraron que tienen mayor impacto sobre la fuerza de las respuestas de anticuerpo totales. Como se ilustra en la figura 5C, los títulos específicos de gp!20 muy fuertes (5-10 veces mayores que los previamente encontrados) fueron promovidos utilizando 4 administraciones por grupo con y sin el vector adyuvante genético. De manera importante, la presencia del adyuvante genético influenció el balance en las subclases de IgGl a IgG2a, pero no fue requerido para promover fuertes títulos de anticuerpo (no mostrado) . Los resultados demuestran que cuando un NOI que codifica para un antígeno débil es co-administrado con un NOI que codifica para un adyuvante, entonces la respuesta de CMI máxima en términos de la liberación de interferón gamma, es obtenida después de dos administraciones de NOI. En contraste, una fuerte respuesta inmune humoral es obtenida con o sin adyuvante con un grupo de 4 administraciones de NOI con un grado de tiempo de aproximadamente 48 horas entre administraciones . 113 EJEMPLO 6 El propósito de este experimento fue determinar si la inmunización de cerdos domésticos con pPJV7630 podría generar respuestas inmunes celulares como fue juzgado por los ELISPOTs de IFN-? y las respuestas de DTH. Método En este experimento, los cerdos domésticos fueron administrados ya sea con pPJV7630 o un placebo (oro sólo) por el dispositivo XR1. Los cerdos fueron administrados con dos dosis para cada administración y tuvieron un esquema grupal de 4 inmunizaciones en un periodo de una semana. De este modo, a cada cerdo se le administró un total de 8 dosis de vacuna en un grupo. Una segunda inmunización grupal fue iniciada 28 dias después del final del primer grupo . Resultados La figura 6A muestra los datos de ELISPOT IFN-? obtenidos a partir de animales después de la primera inmunización grupal. Los valores son las medias de 8 animales inmunizados y de 8 animales control. Los datos muestran que el esquema de inmunización grupal fue capaz de elevar las respuestas inmunes celulares en cerdos domésticos que son considerados como un modelo difícil para medir la inmunogenicidad. Los cerdos control mostraron todos los niveles antecedentes de ELISPOTs . La figura 6B muestra el área promedio del eritema 114 presente en el sitio de la administración de antígeno en cerdos (4 animales) inmunizados con pPJV7630 (los animales control no son incluidos en la gráfica) . Los antígenos son administrados 7 días después de las inmunizaciones y fueron completos, y los cerdos habían recibido dos inmunizaciones grupales . La presencia del eritema a 48 después de la administración del antígeno, indica que ésta es una reacción de DTH. Los resultados muestran que la respuesta de DTH es específica del antígeno como el plásmido nulo (N) o un antígeno irrelevante (sAg) el plásmido del antígeno superficial de la hepatitis B no induce la reacción de DTH, mientras que los plásmidos que expresan los antígenos de vacuna (0, 4, 22, 27) muestran buena respuesta DTH. En cerdos administrados con placebo únicamente (datos no mostrados) , no se encontraron reacciones de DTH para ninguno de los antígenos, verificando que las respuestas en 6B son el resultado de la inmunización con pPJV630. En los sitios donde los extractos proteicos fueron inyectados, existieron varias buenas medidas de DTH para las proteínas ICP22 e ICP4 pero ninguna para la solución PBS control y las proteínas ICPO e ICP27. Debido a que únicamente 5 µg del extracto proteico fueron disponibles para la inyección, y hasta 100 µg fueron utilizados para promover una respuesta de DTH, la menor respuesta puede estar relacionada a la dosis administrada. En el modelo de cerdo doméstico se encontró que una 115 inmunización grupal era capaz de inducir respuestas inmunes celulares contra los antígenos de vacuna. El cerdo doméstico no es considerado como un buen modelo para elevar las respuestas inmunes, pero la inmunización grupal tuvo la habilidad para elevar las respuestas inmunes celulares . EJEMPLO 7 Un estudio con cerdo doméstico fue llevado a cabo para examinar el efecto de la dosificación y el dispositivo sobre las respuestas del anticuerpo hacia la proteína ha expresada a partir de pPJV1671 como se detalla en la Tabla 1 siguiente. (El dispositivo de aceleración de partículas XR es descrito anteriormente). Tabla 1 Grupo Vacuna Número de disparos (números de animales) 1 pPJV1671 Pistola # 49 2 (1-8) 0.5 mg Au/disparo 2 pPJV1671 XR-211/16 2 (9-16) 1.5 mg Au/disparo 3 PPJV 671 XR-211/16 1 (17-24) 1.5 mg Au/disparo 4 pPJV1671 XR-211/16 1 (25-32) 1.0 mg Au/disparo 5 pPJV1671 XR-211/16 2 X 4 (38-40) inmunización grupal* 1.5 mg Au/disparo 6 pPJV1671 XR-211/16 8 (41-48) 1.5 mg Au/disparo 7 Control negativo (49-56) 116 * 2 disparos en días alternados (Días 1, 3, 5 y 8) Los animales fueron aprestados y reforzados con las vacunas a las 4 semanas . Se tomó sangre de diversos puntos de tiempo y las gráficas inferiores son los títulos de anticuerpo 2 semanas después del refuerzo. Dos grupos son administrados con un total de 8 dosis en cada inmunización, ya sea por grupo o todo a la vez. Los animales inmunizados con el grupo tuvieron más alto nivel de anticuerpo en suero . Títulos de anticuerpo Los títulos de anticuerpo fueron medidos por un ensayo de ELISA siguiendo procedimientos estándares utilizando 200 unidades de hemaglutinación/pozo de virus Sw/IN purificado, desintegrado con Sarkosyl, diluido en solución salina amortiguada con fosfato. Los anticuerpos de cerdo fueron medidos directamente mediante el uso de un conjugado de fosfatasa alcalina con inmunoglobulina G, de cabra, anticerdo . Plásmido pPJV1671 El plásmido pPJV1671, como se muestra en la figura 8, es un vector de vacuna de ADN humano que codifica para el antígeno de la hemaglutinina (HA) de influenza A/Panama/2007/99 (H3N2) . La secuencia que codifica para HA fue obtenida mediante una técnica de clonación de transcriptasa inversa estándar/reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) utilizando una muestra del virus A/Panama/2007/99 obtenido de 117 CDC como una fuente de ARN. Los siguientes pasos fueron empleados en el desarrollo del vector de vacuna de ADN de HA de pPJV1571 final. • la producción de RT-PCR del fragmento de dsADN del segmento #4 de ARN de A/Panama/2007/99 (H3N2) . • Propagación del clon de ADN del segmento #4 de ARN en un vector estándar basado en pUC-19 en E. coli . • Análisis secuencial de la secuencia de codificación de H3 Panamá HA dentro del clon del segmento 4 de ARN. · Una segunda reacción de PCR para generar un segmento de ADN que contiene la secuencia que codifica para H3 Panamá (sin su codón de ATG) con extremos compatibles con el vector de vacuna pPJV7563 ADN (Nhe I y Bsp 1201) . La inserción de la secuencia de codificación de H3 Panamá HA dentro del pPVJ7563 que produce el vector de vacuna de ADN pPJV1671 Panam HA que se conforma al consenso de Kozak. El uso del codón ATG suministrado por el vector (vía la inserción en el sitio Nhe I) da como resultado una inserción menor de 2 aminoácidos en el extremo amino de la secuencia de codificación del gen HA como se describe en la figura 9. Este estudio demuestra que la inmunización grupal mejoró significativamente la respuesta de anticuerpo en el modelo de cerdo doméstico. 118 Plásmido pPJV7563 Construcción de pPJV7563 Un mapa del plásmido pPJV7563 es proporcionado en la figura 11. La composición base para el plásmido pPJV75S3 es proporcionada en la figura 12. Los componentes y su posición en el plásmido pPJV7563 son como sigue: 1-44 secuencias del Transposon 903 45-860 secuencia que codifica para la resistencia a la kanamicina del Transposon 903 861-896 secuencias del Transposon 903 897-902 sitio Salí 903-1587 promotor de CMV 1588-1718 secuencia guía no traducida proveniente del gen temprano inmediato del CMV 1719-1724 fusión de las enzimas de restricción de BamHl y BglII 1725-1857 intrón A de insulina de rata 1858-1863 sitio BamHI 1864-1984 guía 5' -no traducida del antígeno superficial del HBV 1985-1993 codón de inicio sintético/sitio de clonación de Nhel 1994-2011 sitios de clonación sintético 2012-2544 mej orador de HBV 2545-2555 secuencia de vector vieja. No hay aciertos contra bases de datos de NCBI 119 2556-2686 región de poliadenilacion de beta-globina de conejo 2687-3759 secuencia vector de pUC19 El plásmido pPJV7563 fue preparado como sigue: Descripción de la figura 13, diagrama de flujo que describe la construcción de pPJV7563 : La señal de poliadenilacion de la hormona de crecimiento (BGHpA) en pWRG7074 fue reemplazada por la señal de poliadenilacion beta-globulina de conejo (RBGpA) , dando como resultado pWRG7284. El intrón A de CMV fue retirado de pWRG7284 mediante el reemplazo de todas las secuencias de CMV con un fragmento de PCR derivado de p RC 128 que contenía el promotor de CMV y la fusión de exón 1/2. Esto dio como resultado pWRC7293. Las secuencias de CMV y HBV son removidas del p RG7284 y remplazadas con las secuencias del CMV y 5' -HBV provenientes de p RG7293 y las secuencias de 3 ' -HBV provenientes de pWRG7128. La secuencia del gen nef de SIV fue removida en este paso, dando como resultado pPJV7382. pPJV7382 fue además manipulado por ingeniería genética por adición del intrón A de insulina de rata (RIA) para crear pPJV7389. El gen de resistencia de kanamicina (KanR) en pPJV7389 fue reemplazado con una versión acortada para eliminar las secuencias no necesarias provenientes de ambos extremos de este gen, dando como resultado pPJV7496. El sitio Nhe 1 en la RIA fue curado a partir de pPJV7496, produciendo pPJV7530. 120 La secuencia de HBV a través de la región 5' del 3'-UTR en pPJV7530 fueron removidas y reemplazadas por 5' -UTR de HBV, el gen flu M2 y la región 5'- del 3' -UTR de pPJV7468, provenientes de pPJV7468, produciendo pPJV7549. PJV ha determinado que la retención de las regiones 5'UTR de Venh y HBV provenientes de WRG7128 en los vectores que codifican para una variedad de antígenos pueden mejorar reproduciblemente la expresión del antígeno y la inmunogenicidad. Estos son elementos ahora comunes en los vectores de vacuna de ADN de PJV. El gen 2 es luego suprimido de pPJV7549 y reemplazado por oligonucleótidos que formaron un poliligador. Esta manipulación produjo pPJV75S3, un vector de expresión que es capaz de aceptar otras secuencias de codificación. Construcción del plásmido WRG7074, Vector Progenitor de PJV7563 Una cadena principal de plásmido estándar, pWRG7074 fue desarrollada. Esta cadena principal fue utilizada como el plásmido precursor a partir del cual manipular por ingeniería pWRG7128 el vector de expresión de HBsAg utilizado en varias pruebas clínicas. En esta sección, la derivación de esta cadena principal es descrita en narrativa y mostrada en las figuras 15 y 16, "Derivatización del Diagrama de Flujo de los Plásmidos PJV7074 y PJV7128" y "Mapas de Características de Plásmidos Clave", respectivamente. En resumen, p RG7074 fue derivado por inserción de un fragmento simple que contenía el 121 promotor temprano de datos CMV humano y la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento dentro del vector plásmido bacteriano pUC19 bien caracterizado, estándar. Varias manipulaciones subsecuentes fueron empleadas para reemplazar la ampicilina con un marcador de resistencia a la kanamicina ( anR) , y para alterar algunos sitios de restricción. El fragmento de ADN fue la fuente del promotor de CMV y la región poly A de bGH fue obtenida a partir del plásmido pJW4303, una variación de Jim Mullins quien estuvo luego en la Universidad de Stanford. Las narrativas detallas concernientes a la construcción de los plásmidos WRG7074 y WRG7128 son dadas más adelante. A no ser que se indique de otro modo, toda la clonación fue realizada en PowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI (y antiguamente conocida como Agracetus, Inc., Auragen, Inc., o Geneva, Inc. Middleton, WI) . Los pasos de construcción están en cursivas. Los puntos de bala suministran la información efectiva concerniente a las secuencias específicas . Paso 1: El fragmento pequeño HindIII-BamHI de pJW4303 (mapa, figura 10) que contiene la secuencia de codificación del péptido TPA es suprimido mediante digestión con HindIII-BamHI . Este fragmento pequeño fue reemplazado con un ligador HindIII-Notl-BamHI para generar JW4303-Notl . El fragmento que contiene el promotor del CMV y la 122 región poly A de bGH proveniente de pJW4303 es un fragmento Sal I- Xho I que PJV tiene desde que determinó que eran 2131 pares de bases de longitud. La secuencia nucleotídica para el fragmento Salí-XhoI derivada de pJW4303 ha sido deducida. Los siguientes incisos son identificados en la figura 10 : • el sitio Salí en la posición 1 del fragmento. • Inicio del fragmento promotor CMVIE en la posición 7. Esto corresponde en la posición del nucleotido 451 proveniente de la secuencia de GenBank número de acceso #M60321 (extremo 5' del gen de la proteina temprana inmediata del citomegalovirus humano) . • Extremo del fragmento promotor de CMVIE en la posición del nucleotido 1648. Este corresponde a la posición del nucleotido 2097 de la secuencia de GenBank número de acceso #M60321 (extremo 5' del gen de la proteína temprana inmediata del citomegalovirus humano) . Se debe notar que fueron observadas unas pocas diferencias de nucleótidos entre la región promotora de CMVIE producida, y la secuencia de GenBank anteriormente mencionada. Es probable que esto sea debido a los polimorfismos naturales entre diferentes aislados del virus de CMV. • Codón de inicio de la producción de ATG en la posición del nucleotido 1661 para la secuencia de codificación del péptido de señal del activador del plasminógeno tisular humano. La secuencia de codificación del péptido de señal TPA 123 fue derivada del ADN sintético como se describe por Lu et al . (J. Virol. 70:3978, 1996)). La publicación de Lu et al., describe brevemente la construcción de pJW4303, pero esta descripción contiene algunos errores que no son consistentes con la secuencia deducida. • Los sitios de inserción de la secuencia de codificación, HindIII y Nhel en las posiciones de los nucleótidos 1649 y 1724, respectivamente. Nótese que la región de homología de nef de SIV es mostrada como parte de la' región de bGHpA. · El sitio de restricción BamHI en la posición del nucleótido 1741 que comienza con la región de homología a nef de SIV. Esto corresponde a la posición del nucleótido 9444 de la secuencia de GenBank número de acceso #M33262 (virus de inmunodeficiencia de simio, aislado de 239, genoma proviral completa y secuencia flanqueante) . • El sitio de restricción BglII en la posición del nucleótido 1849 que termina con la región de homología a nef de SIV. Esto corresponde a la posición del nucleótido 9552 de la secuencia de GenBank número de acceso #M33262 (virus de inmunodeficiencia de simio, aislado de 239, genoma proviral completa y secuencia flanqueante) . • En 1999 se descubrió que una secuencia que representa 109 pares de bases homologas como una secuencia del gen nef del virus de inmunodeficiencia de simio, estuvo presente en este vector. Como se muestra en la figura 10.1, esta secuencia ha 124 sido removida al tiempo en que se construyó pWRG7128. No obstante, ésta permaneció en pWRG7074. Esta secuencia estuvo presente en pWG4303 y los derivados a través de p RG7077 Y pWRG7074. La homología de SIV es encontrada entre las posiciones de los nucleótidos 77 y 184. De este modo, la inserción del fragmento de nef de SIV adyacente a la región poly A de bHG fue un artefacto de construcción aparente que ocurrió antes de la recepción de PJV del ADN de la fuente. • Inicio de la homología de región poly A de la hormona bovina del crecimiento, en la posición de nucleótido 1873.

Esto corresponde a la posición de nucleótido 2326 de la secuencia de GenBank acceso número #M57764 (gen de la hormona bovina del crecimiento, secuencia de codificación completa) .

• Extremo de la homología de la región poly A de la hormona bovina de crecimiento en la posición del nucleótido 2096 del acoplamiento 4. Esto corresponde a la posición del nucleótido 2550 de la secuencia de GenBank acceso número #M57764 (gen de la hormona bovina del crecimiento, secuencia de codificación completa) . · Sitio de restricción Xhol en el extremo del fragmento (posición del nucleótido 2131) . Paso 2 : Inserción del promotor de CMV y de fragmento poly A de bGH proveniente de pJW4303-NotI (fragmento Salí-Xhol) dentro del sitio Salí del plásmido productor de pUC19 pWRG7012. 125 pWRG7012 contiene dos sitios BamHI y dos sitios HindIII . Uno de cada uno de estos sitios fue removido en pasos subsecuentes (ver más adelante) . Paso 3: Suprimir la región EcoRI-Xbal de pWRG7012, para eliminar una sección grande del sitio de clonación múltiple de pUC19 para generar pWRG7013 (figura 10) . pWRG7013 conserva dos sitios HindIII pero tiene únicamente un sito BamHI . Paso 4: Eliminar el sitio HindIII, localizado 5' del promotor del CMV, de pWRG7012 para permitir la utilización fácil del sitio HindIII entre el intrón y los insertos corriente abajo 3' . Esto generó p RG7014 (figura 10) . pWRG7014 conserva dos sitios BamHI pero tiene únicamente un sito HindIII. Paso 5 : Para producir un plásmido que contiene únicamente un sitio HindIII y un sitio BamHI, el fragmento HindIII-EcoRI proveniente de p RG7013 fue colocado dentro de p RG7014 suprimido en HindIII-EcoRI para generar p RG7020, la versión resistente de ampicilina de RG7077 (figura 10) . Paso 6 : Suprimió el gen de resistencia a la ampicilina flanqueado por Eamll05 1-PstI en pUC19. Hizo el extremo romo del fragmento que contenia el origen de replicación mediante tratamiento con polimerasa. Aisló el gen de resistencia a la kanamicina flanqueada con PstI en PUC4K. Este fragmento fue de extremo romo mediante el tratamiento con 126 la polimerasa y ligado al origen del fragmento de replicación. Esto generó pWRG7072, el vector Kano que pudo aceptar el cásete CMV-HBsAg-bGH-pA proveniente de pWRG7031 (Paso 8) . Paso 7 : Suprimió las secuencias Hd3 -BamHl del poliligador en pWRG7020 e hizo romo el extremo del vector con polimerasa. Aisló el fragmento que contiene HBsAg de 1.4KB flanqueado con BamHI en pAM6. Este fragmento fue enromado en el extremo mediante tratamiento con polimerasa y ligado dentro del vector. Esto produjo p RG7031, un plásmido de expresión de HBsAg resistente a la ampicilina. Paso 8: Suprimió las secuencias Pvu2-Sphl de pWRG7072. pWRG7031 cortado con EcoRI , hizo el extremo romo con polimerasa, y cortó además el plásmido con Sphl y aisló el fragmento que contiene el CMV, HBV y secuencias bovinas. Este fragmento fue ligado dentro del pWRG7072 preparado para producir pWRG7074. Paso 9: Cortó p RG7074 con Bgl2 , hizo el extremo romo con polimerasa, y cortó además con BstXl para elaborar un fragmento vector. pWRG7074 fue cortado con Ncol, enromado en el extremo con la nucleasa de frijol mung, y cortado además con BstXl para elaborar un fragmento del inserto que contenía el 3 ' -aumentador. La ligadura de estos dos fragmentos dio como resultado pWRG7128, un plásmido de expresión de HBsAg desprovisto de la región de 5' -codificación de HbxAg y la frecuencia NEF del SIV encontrada en pWRG7074. 127 Paso 10: Construcción de pWRG7077: pWRG7072 cortado con SapI, enromado en el extremo con polimerasa, y cortado además con Sphl para generar un fragmento que contenía el origen de replicación y el gen de resistencia a la kanamicina. Cortó y enromó el extremo del sito EcoRI en RG7020, cortó luego parcialmente con Sphl para generar un fragmento que contenía el promotor de CMV, el intrón A y la región de poliadenilación de BGH. Estos fragmentos fueron ligados conjuntamente para generar pWRG7077. El vector final pWRG7077 contiene la región A-bGH-pA del intrón del CMV original, derivada del plásmido fuente pJW4303 excepto con la alteración descrita en el paso 1, en la cual el péptido de señal TPA que codifica para la secuencia fue reemplazado con un ligador que contiene un sitio de restricción Notl . EJEMPLO 8 Se prepararon copias de E6 y E7 mediante PCR a partir de un clon genómico HPV 16 obtenido de la ATCC. El plásmido de longitud completa es mantenido bajo condiciones de BSL-2 ya que éste contiene un genoma viral completo. Se destoxificó E6 y E7 al suprimir las regiones de enlace para p53 y Rb respectivamente (Slebos et al., Virol . 1995, 208, 111-120; y Smahel et al., Virol. 2001, 281, 231-238). Los fragmentos de PCR fueron clonados dentro de PJV7563 colocando los genes bajo el control del promotor del CMV sin el intrón A. 128 Los plásmidos fueron preparados mediante equipos Mega libres de endotoxina de Qiagen y recubiertos sobre partículas de oro a 2 µg de ADN por mg de oro, utilizando el método estándar de espermidina-cloruro de calcio. Los cartuchos fueron preparados utilizando 0.05 mg/ml de PVP. Ratones B6 fueron inmunizados con administraciones simples sobre el abdomen afeitado utilizando un dispositivo de investigación XR a 335.15 kg/cm2 (500 psi) . Las células TC-1 fueron obtenidas de la Escuela de Medicina Johns Hopkins. Las células fueron expandidas en cultivo por un número mínimo de pases y los frascos fueron luego congelados y almacenados en nitrógeno líquido hasta el uso. Las células fueron preparadas para inyección en PBS . Los ratones anestesiados fueron inyectados subcutáneamente con entre 2 x 104 a 2 x 105 células en 50 a 100 µ? sobre el flanco derecho afectado . Los tumores fueron medidos el Lunes , Miércoles y Viernes, comenzando en el día 7. Dos mediciones de diámetro a ángulos rectos fueron tomadas y multiplicadas para producir un área cuadrada. La salud de los animales fue también monitorizada. Los ratones fueron sacrificados si los tumores se desarrollaban a más de 120 mm2, si los tumores parecían necróticos, o si los ratones parecían moribundos. Para los ensayos ELISPOT, los ratones fueron sacrificados una semana después de la última inmunización. Los bazos fueron retirados asépticamente y se prepararon 129 suspensiones de células simples. Las células fueron sembradas en placa a l x lOs ó 5 x l05 células por pozo en BD equipos ?-IFN de ELISPOT de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los péptidos específicos para CD4 y CD8 de E7 y CD 8 de E6 fueron agregados a una concentración final de 10 µ?. Los pozos con medio contenían cantidades equivalentes de DMSO así como también contenían el péptido. Puntos específicos fueron calculados al sustraer los puntos medios de aquellos inducidos en presencia del péptido. Resultados La inmunización de ratones B6 ya sea con ADN de E6 o E7 conduce a la inducción de números significativos de células secretoras de ?-IFN (Figura 23) . En el caso de E6, únicamente es conocido un epitopo específico de CD8. En el caso de E7, ambos epitopos específicos de CD4 y CD8 han sido identificados, y las respuestas fuertes para ambos son observadas después de la inmunización con PMED. La adición ya sea del ADN de la toxina lábil al calor (LT) de E. coli o la toxina del cólera (CT) a las vacunas E6 ó E7, fue probada. Mientras que LT incrementó las respuestas de ?-IF ELISPOT a los péptidos E7 aproximadamente dos veces (Figura 23) , no se observó ningún incrementó en la protección tumoral con cualquier toxina. De manera interesante, la inyección de las células 130 TC-l solas induce respuestas de ?-IFN a E6 y E7 (Figura 24) . Éstas son menores que aquella observada con la inmunización con PMED de tres dosis administradas en un grupo con tres días de separación. Al combinar la inyección de TC-l con la inmunización de PMED se conduce a un resultado intermedio. La inyección de 5 x 104 células TC-l conduce a un desarrollo consistente y rápido de los tumores en ratones B6 no tratados . El tratamiento profiláctico con tan poco como una dosis ya sea de 7ADN de E6 o E7 proporciona protección sustancial contra el desarrollo del tumor (Figura 25) . La inmunización terapéutica con E6 o E7 es también efectiva si se distribuye como un grupo de tres dosis comenzando en el día 3 después de la inyección de tumor (Figura 26) . La distribución de dosis más baj s es menos efectiva (datos no mostrados) . La co-administración de los plásmidos E6 y E7 no fue más efectiva que cualquiera de ellos solo, aunque esto ha sido únicamente probado una sola vez. En un estudio, los animales que fueron protegidos contra un reto inicial con TC-l por la vacunación con E6 (Figura 26) fueron retados nuevamente 50 dias después sin tratamiento adicional. Como se muestra en la Figura 27, todos los animales fueron completamente protegidos contra este segundo reto, mientras que todos los controles no tratados de iguales edades, desarrollaron tumores y fueron sacrificados. Se intentó el tratamiento de tumores más grandes con 131 grados variantes de éxito. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 28, el tratamiento con un grupo de tres dosis del ADN de E6 comenzando a 20 mm2, condujo a la regresión en 5 de 5 ratones, mientras que el tratamiento comenzando a 35 mm2 provocó únicamente un retraso ligero en el crecimiento del tumor, seguido por una progresión rápida. Los datos presentados anteriormente indican que el ADN de E6 y E7 destoxificado promueve una fuerte respuesta de células T, contra los epitopos peptídicos respectivos cuando se administran a ratones B6. Además, estas respuestas correlacionan en gran medida con la habilidad de las vacunas para inhibir el crecimiento de las células tumorales TC-1. Tal tratamiento es efectivo ya sea para profilaxis o terapia. EJEMPLO 9 A los ratones se les administraron de 1 a 8 disparos utilizando el plásmido de gen simple ICP27 y un intervalo de 2 días, tal que la administración final para cada grupo ocurrió en el mismo día. Dos semanas después de la administración final se midieron los ELISPOTs de CD8. Los resultados son mostrados en la Figura 29, e indican que ' al menos 3 administraciones son necesarias para ganar efectos casi máximo con administraciones adicionales, dando poco o ningún mejoramiento. Para examinar los efectos acumulativos de la dosis grupal sobre los nodulos linfáticos, los ratones fueron 132 administrados con 1, 2, 3 ó 4 disparos de pPJV7630 (utilizando intervalos de 4 días entre disparos) y luego las células provenientes de los nodulos linfáticos se examinaron 8 días después. Los resultados se muestran en la Figura 30. Con el número cada vez mayor de disparos, fueron aparentes los incrementos en tamaño de los nodulos . Los pesos y números de células en los nodulos linfáticos, medidos 8 días después de la terminación de la administración de la vacuna, fueron incrementados sobre los ratones intactos cuando más de 1 disparo fue administrado, con 3 disparos que dan los valores más altos . EJEMPLO 10 Fueron realizados experimentos para investigar el efecto de una vacunación de refuerzo. Los ratones a los que se les dio la administración de aprestamiento fueron comparados a los ratones a los que se les dieron administraciones de aprestamiento y de refuerzo. Ambos grupos de ratones fueron aprestados al mismo tiempo, y las mismas vacunas fueron utilizadas para la vacunación. El segundo grupo fue reforzado 28 días después del aprestamiento. La Figura 31 muestra los resultados a partir del ensayo ELISPOT de INF-? realizado sobre animales administrados con pPJV7630 en un grupo simple (P) o dos grupos separados por 28 días (P/B) . Los esplenocitos fueron probados utilizando bibliotecas de péptidos de cada uno de los 4 antígenos 133 tempranos inmediatos expresados a partir de la construcción pPJV7630. Los ensayos fueron realizados 2 semanas después de las administraciones finales de las vacunas. Como se puede observar con la realización de una administración reforzadora provoca un incremento sustancial en la respuesta que es estimulada . EJEMPLO 11 Cerdos domésticos fueron administrados con PJV7630 mediante el dispositivo XR1. Los cerdos fueron administrados con dos dosis para cada inmunización y tuvieron un esquema grupal de 4 inmunizaciones en un periodo de una semana. De este modo, a cada cerdo se le dio un total de 8 dosis de la vacuna en un grupo. Dos refuerzos de inmunización grupal fueron iniciados 21 días después del final del grupo previo. Se tomaron muestras de sangre antes del inicio de la dosificación (PB) y también 7 a 10 días después de cada refuerzo (Bl y B2) . Los ensayos ELISPOT de IFN-? fueron llevados a cabo como se describe, y los valores son el promedio ± SEM para 10 animales. La Figura 32 muestra los resultados que fueron obtenidos, y el efecto de la vacunación de refuerzo. EJEMPLO 12 Muestras de piel tomadas a los 2 , 3 y 4 días después de PMED de un disparo simple de pPJV7630 con XR-1 fueron congeladas, trituradas y se probaron los niveles de citocina 134 en el sobrenadante. Utilizando un equipo CBA para evaluar las citocinas inflamatorias, se encontraron fuertes incrementos en IL-6, TNF-oc y MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocitos) . Éstas fueron las más altas en el día 2 y disminuyeron con el tiempo. No se encontraron incrementos de IL-10, IL-12 o INF-? a cualquier punto de tiempo. Las citocinas aumentadas son comúnmente encontradas en el sanado de heridas. Para examinar los efectos acumulativos de la dosificación grupal sobre la piel y los nodulos linfáticos, a los ratones se les dieron 1, 2, 3 ó 4 disparos de pPJV7630 (utilizando intervalos de 4 días entre disparos) y luego las células provenientes de los nodulos linfáticos fueron examinadas 4 y 8 días después . Con el número cada vez mayor de disparos, incrementos en el tamaño de los nodos fueron aparentes . Los pesos y los números celulares en los nódulos linfáticos medidos 8 días después de la terminación de la administración de la vacuna, fueron incrementados sobre los ratones intactos cuando se administró más de 1 disparo (ver Figura 30) . Células de nódulos linfáticos fueron también teñidas para MCH-II positivo (células presentadoras de antígeno) , CD80 positivo (marcador de activación) y células positivas dobles, y se analizaron mediante citometría de Flujo (en las Tablas siguientes) . En general, el número de células positivas simples y dobles se incrementó con el número de disparos . 135 Día 4 - poblaciones de los nodulos (% de células totales) Día 8 - poblaciones de los nodulos (% de células totales) El análisis de las poblaciones de nodulos linfáticos indica un incremento aproximado de 5 a 10 veces en el número de células presentadoras de antígeno en el nodulo linfático, como resultado de las inmunizaciones de agrupamiento . En suma, son encontrados cambios físicos radicales en diferentes regiones del sitio de disparos en los días después de PMED. Se han encontrado citocinas inflamatorias pico en la piel en el día 2 después de PMED. También, durante una dosificación grupal una acumulación de células, específicamente células activadas presentadoras de antígeno, es encontrada en los nodulos linfáticos, sugiriendo una capacidad de respuesta incrementada de la piel. 136 EJEMPLO 13 Los ratones Balb/c fueron utilizados para los experimentos descritos . Un área del abdomen fue afeitada y una inmunización primaria de ADN fue administrada utilizando distribución inmunoterapéutica mediada por partículas (PMID) . Cada animal recibió un total de 3 µg de ADN. Éste fue administrado ya sea mediante inmunización de "pulso" convencional (3 x 1 µg de ADN) en el día 0 o en el día 4 o por una inmunización "grupal" con 1 µg de ADN administrado en cada día alternado (0, 2 y 4) . Los ratones fueron seleccionados 10 días después de la primera administración de ADN y los bazos fueron recolectados. Los esplenocitos fueron cosechados mediante desmenuzamiento de las células el bazo y los eritrocitos fueron lisados. Los esplenocitos fueron lavados y contados. Las placas de ELISPOT especializadas (recubiertas con el anticuerpo de captura de interferón-gamma y bloqueadas) fueron utilizadas . Los esplenocitos fueron transferidos a estas placas e incubados toda la noche a 37°C/5% de C02 en presencia de péptidos específicos. Los esplenocitos fueron lisados y la placa revelada utilizando procedimientos estándares para demostrar el número de células secretoras de interferón-gamma, presentes. Resultados Los resultados (mostrados en la Figura 33) indicaron 137 que se hicieron números significativamente más altos de células formadoras de puntos de IFN-gamma, asiladas de los animales que habían recibido la inmunización "grupal" en comparación con aquellos que hablan recibido la misma cantidad de ADM utilizando el método de "pulso" convencional. (*denota las diferencias significativas) . La respuesta inmune celular de ratones inmunizados con una construcción que expresa los antígenos Gag y RT del HIV por el método "grupal" fue significativamente más alta que la inmunización de animales con la misma cantidad de ADN utilizando el método de "pulso" convencional. EJEMPLO 14 Ratones Balb/c fueron utilizados para los experimentos descritos . Un área del abdomen fue afeitada y se administró una inmunización primaria de ADN utilizando la distribución inmunoterapéutica mediada por partículas (PMID) . Cada animal recibió un total de 1 µg de ADM. Éste fue administrado ya sea mediante inmunización de "pulso" convencional (2 x 0.5 µg de ADN) en el día 0 o por una inmunización de "grupo modificado" con 0.5 µg de ADN administrado en cada día 0 y 7. Todos los ratones fueron reforzados utilizando un "pulso" de 1.0 µg de ADN, 83 días después de la inmunización primaria. Los ratones fueron clasificados 7 días después de la inmunización de refuerzo 138 (día 90) y los bazos fueron recolectados. Los esplenocítos fueron cosechados mediante desmenuzamiento de las células del bazo y los eritrocitos fueron lisados. Los esplenocítos fueron lavados y contados. Se utilizaron placas de ELISPOT especializadas (recubiertas con el anticuerpo de captura interferón-gamma y bloqueadas) . Los esplenocítos fueron transferidos a estas placas e incubados toda la noche a 37°C/5% de C02 en presencia de péptidos específicos. Los esplenocítos fueron lisados y la placa revelada utilizando procedimientos estándares para demostrar el número de células secretoras de interferón-gamma presentes. Resultados Los resultados (mostrados en la Figura 34) indicaron que existieron más altos números de células formadoras de puntos de IFN-gamma aisladas de los animales, que los que habían sido inmunizados utilizando un "grupo modificado" en comparación a aquellos que habían recibido la misma cantidad de ADN utilizando el método de "pulso" convencional. De este modo, la respuesta inmune celular de los ratones inmunizados con una construcción que expresa los antígenos Gag y RT a partir del VIH por el método del "grupo modificado" fue más alta en comparación con aquella de animales inmunizados con la misma cantidad de ADN utilizando el método de "pulso" convencional . 139 EJEMPLO 5 El plásmido utilizado expresó los antígeno RT, Nef y Gag del VIH. La preparación de los cartuchos para PMID fue como se describió previamente (Eisenbraun et al . DNA and Cell Biology, 1993 Vol 12 No. 9, pp. 791-797; Pertner et al.). En resumen, el ADN plásmido fue recubierto sobre partículas de oro de 2 µt? (DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., EUA) y cargadas dentro de tubería Tefzel, que fue subsecuentemente cortada en longitudes de 1.27 cm para servir como cartuchos y se almacenaron desecadas a 4°C hasta el uso. En una vacunación típica, cada cartucho contenía 0.5 mg de oro recubierto con aproximadamente 1 µg de ADN. Los grupos de 4 minicerdos recibieron inmunización primaria por PMID (INICIADA EN EL DÍA 1) seguido por inmunización de refuerzo por PMID (iniciada en el día 47) en el abdomen ventral . Los animales control no fueron inmunizados. La inmunización fue ya sea mediante la utilización de pulsos (por ejemplo 4 cartuchos distribuidos en una ocasión) o por dosificación por grupo (por ejemplo 2 cartuchos distribuidos en cada una de 3 ocasiones con 48 horas de separación) . Catorce días después del inicio de la inmunización primaria o de refuerzo, se recolectaron muestras de sangre periférica para la preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . Se recolectó sangre porcina en heparina, se diluyó 140 2:1 en PBS y se colocó en capas sobre Histopaque (Sigma) en tubos Falcon de 50 mi. Los tubos fueron centrifugados a 1200 g por 30 minutos y los linfocitos porcinos fueron cosechados de la interfaz. Las células sanguíneas rojas residuales fueron lisadas utilizando amortiguador de lisis de cloruro de amonio. Las células fueron contadas y resuspendidas en medio RPMI completo a 2 x 106/ml. Con el fin de llevar a cabo el ensayo de ELISPOT, las placas fueron recubiertas con 8 µg/ml (en PBS) (anticuerpo de ratón anti-IFN-? de cerdo, purificado, Biosource ASC4934) . Las placas fueron recubiertas toda la noche a 4°C. Antes el uso las placas fueron lavadas tres veces con PBS y bloqueadas por 2 horas con medio RPMI completo. Las PBMC fueron agregadas a las placas a 2 x 105 células/pozo. El volumen total en cada pozo fue de 200 µ? . La proteína Gag, Nef o RT recombinante (preparada domésticamente) fue agregada a una concentración final de 5 µg/ml. Las placas fueron incubadas por 16 horas en una incubadora humidificada a 37°C. Las células fueron retiradas de las placas mediante lavado una vez con agua (con remojo de 1 minuto para asegurar la lisis de la célula) y tres veces con PBS. El anticuerpo anti-IFN-? porcino, conjugado a la biotina, fue agregado a 0.5 g/ml en PBS . Las placas fueron incubadas con agitación por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron luego lavadas tres veces con PBS antes de la adición de estreptavidina- 141 fosfatasa alcalina (Caltag) a una dilución de 1/1000. Después de tres lavados en PBS, los puntos fueron revelados mediante incubación con el sustrato BCICP (Biorad) por 15 a 45 minutos. El sustrato fue lavado utilizando agua y las placas se dejaron secar. Los puntos fueron enumerados utilizando el lector AID ELISPOT (Cadama Biomedical, Reino Unido) . Resultados Los resultados son mostrados en la Figura 35. Después de una inmunización primaria, el número de puntos productores de IFN-? en PBMC provenientes de minicerdos aprestados por la inmunización grupal, fue significativamente mayor en comparación con aquellos que recibieron la inmunización por pulsos (311 ± 96 y 45 ± 31 media + SE , respectivamente; p<0.05 prueba t de Student) . Además, el número de puntos productores de IFN-? después de un refuerzo por pulso, fue significativamente mayor en animales que recibieron un aprestamiento grupal en comparación con un aprestamiento por pulsos 431 ± 60 y 186 + 66 media + SEM, respectivamente; p<0.05 prueba t de Student) . En resumen, estos resultados muestran que el aprestamiento grupal proporciona una ventaja sobre el aprestamiento por pulso convencional, y que esta ventaja es obtenida en la fase de refuerzo subsecuente de la respuesta inmune . En la Figura el Grupo 1 es el control no inmunizado; el Grupo 2 es el grupo de refuerzo por pulso, de aprestamiento 142 por pulsos; el Grupo 3 es el grupo de refuerzo por grupos, de aprestamiento por pulsos. EJEMPLO 16 Ratones C57BL/6 fueron utilizados para los experimentos descritos. Un área del abdomen fue afeitada y una inmunización primaria del ADN fue administrada utilizando administración inmunoterapéutica mediada por partículas (PMID) . Cada animal recibió una inmunización de "pulso" convencional (1 µg de ADN de ovoalbúmina) ya sea en el día 0 o mediante una inmunización "grupal" con 1 µg de ADN administrado en cada uno de días alternados (0, 2) -grupo 2X o los días 0,2 y 4-grupo 3X. Los ratones fueron sacrificados 10 días después de la primera administración de ADN y los bazos fueron recolectados. Los esplenocitos fueron cosechados mediante desmenuzamiento de las células del bazo y los eritrocitos fueron lisados . Los esplenocitos fueron lavados y contados. Se utilizaron placas ELISPOT especializadas (recubiertas con inteferón-gamma o el anticuerpo de captura IL2 y bloqueadas) . Los esplenocitos fueron transferidos a estas placas e incubados toda la noche a 37°C/5% de C02, en presencia de péptidos específicos. Los péptidos CD4 y CD8 específicos de ovoalbúmina, definidos previamente, fueron utilizados'. Los esplenocitos fueron lisados y la placa revelada utilizando procedimientos estándares para demostrar el número de células secretoras de interferón-gamma o de IL2, 143 presentes . Resultados Los resultados (mostrados en las Figuras 36 y 37) indicaron que existieron números significativamente más altos de células formadoras de puntos de IFN-gamma e IL2, aisladas de los animales que habían recibido la inmunización "grupal" en comparación con aquellos que hablan recibido la misma cantidad de ADN utilizando el método de "pulso" convencional. En la Figura 36 cada barra representa la respuesta proveniente de un ratón individual. La respuesta inmune celular de los ratones inmunizados con una construcción que expresa ovoalbúmina mediante el método "grupal" fue significativamente más alta que la inmunización de los animales con la misma cantidad de ADN utilizando el método ' de "pulso" convencional. EJEMPLO 17 Ratones C57BL/6 fueron utilizados para los experimentos descritos . Un área del abdomen fue afeitada y se administró una inmunización primaria de ADN utilizando administración inmunoterapéutica mediada por partículas (PMID) . Cada animal recibió un total de 3 g de ADN. Éste fue administrado ya sea mediante inmunización de- "pulso" convencional (3 x 1 µg de ADN) ya sea en el día 0 o mediante una inmunización "grupal" con 1 µg de ADN administrado en cada 144 uno de los días alternados (0, 2 y 4) . Los animales que han sido aprestados ya sea con una inmunización por pulsos o grupal fueron luego reforzados 29 días después con una inmunización de pulso simple de 1 µg de ADN. Los bazos fueron retirados 9 días después del refuerzo (día 38) como se describe anteriormente, y la frecuencia de las células específicas del antígeno determinada mediante ELISPOT. Además, la habilidad de las células T CD8 para matar los objetivos específicos del antígeno fue determinada mediante un ensayo de CTL basado en Europio, después de 5 días de expansión in vitro con el péptido o IL2. Resultados Los resultados mostrados en la Figura 38 indican que los animales aprestados con una inmunización grupal mostraron una respuesta de remembranza más fuerte que los ratones inmunizados con la misma dosis de ADN, pero como inmunización pulsada. Estos fue mostrado por el incremento en la frecuencia de las células productoras de IFNg e IL2 por ELISPOT. Los animales aprestados por inmunización grupal también mostraron una respuesta de CTL más fuerte en comparación con los animales inmunizados con la inmunización por pulsos después de un refuerzo de ADN por pulsos. La respuesta inmune de memoria de los ratones inmunizados con una construcción que expresa ovoalbúmina mediante el método "grupal" fue significativamente más alta 145 que la inmunización de animales con la misma cantidad de ADN utilizando el método de "pulso" convencional. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior son incorporadas por referencia en la presente . Diversas modificaciones y variaciones de los métodos descritos y del sistema de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con las modalidades preferidas especificas, se debe entender que la invención como se reclama no debe ser indebidamente limitada a tales modalidades específicas. Más bien, las diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvios para aquellos expertos en la biología molecular o los campos relacionados, están destinadas a ser cubiertas por la presente invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

146 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para promover una respuesta de células T contra un epitopo de células T en un sujeto mamífero hospedero, caracterizado porque comprende: (i) una primera inmunización que comprende al menos dos administraciones que son de 1 a 14 días de separación, al sujeto, en donde cada administración comprende administrar un nucleótido de interés (NOI) que codifica para el epitopo de células T, y opcionalmente (ii) una segunda inmunización que comprende al menos una administración al sujeto de (a) un NOI que codifica para el epitopo de células T, o (b) una proteína que comprende el epitopo de células T, en donde el tiempo entre la primera administración de la primera administración, y - la primera administración de la segunda inmunización, es de 21 a 365 días. 2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las administraciones de la primera, y/o la segunda inmunización ocurren de 2 a 12 días. 3. Un método de conformidad con la reivindicación 147 1 ó 2, caracterizado porque la primera y/o segunda inmunización del nucleótidos de interés o la proteína es administrada de 2 a 10 veces. 4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque 2, 3, 4 o más de las administraciones de la primera y/o segunda inmunización son con 2 a 6 días de separación. 5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tiempo entre la primera administración de la primera inmunización y la primera administración de la segunda inmunización es de 50 a 250 días. 6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además una tercera inmunización que comprende al menos una administración al sujeto de (a) un nucleótido de interés que codifica para el epitopo de células T, o (b) una proteína que comprende el epitopo de células T, en donde el tiempo entre - la primera administración de la segunda inmunización, y la primera administración de la tercera inmunización, es de 10 a 365 días. 7. Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque en la tercera inmunización: - el nucleótido de interés o la proteína es administrado 2 148 a 5 veces, y/o las administraciones son con 2 a 6 días de separación, y/o el tiempo entre la primera administración de la segunda inmunización y la primera administración de la tercera inmunización es de 50 a 250 días. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el nucleótido de interés comprende una secuencia de ADN bajo el control de una secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de la secuencia de ADM en una célula del sujeto. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el epitopo de células T es un epitopo de célula linfocito T cooperador CD4+ y/o un epitopo de linfocito T CD8+ (CTL) . 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una o más de las administraciones del nucleótido de interés comprenden la administración de 0.1 a 2 del nucleótido de interés. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una o más de las administraciones comprende la administración a la piel . 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos una de las administraciones del nucleótido de interés o la 149 proteína, el nucleótido de interés o la proteína está recubierta sobre, o incorporada en una partícula. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la partícula es administrada al sujeto mediante un dispositivo de aceleración de partículas. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos una de las administraciones del nucleótido de interés o la proteína, el nucleótido de interés o la proteína es administrado como : (i) una composición farmacéutica que comprende un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable; o (ii) una composición de vacuna que comprende un portador, excipiente o diluyente inmunológicamente aceptable; o (iii) una composición inmunoterapéutica que comprende un portador, excipiente o diluyente inmunológicamente aceptable. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque nucleótido de interés o la proteína es co-administrado con un adyuvante o un polinucleótido que es capaz de expresar un adyuvante en una célula del sujeto; o un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la composición comprende además un 150 adyuvante o un polinucleótido que es capaz de expresar un adyuvante en una célula del sujeto. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el adyuvante es una forma no tóxica de la enterotoxina de E. coli lábil al calor (LT) o la toxina de cólera de Vibrio cholerae (CT) . 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el adyuvante es la subunidad B (LTB) de la enterotoxina LT o la subunidad B (CTB) de la toxina del cólera CT. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el epitopo de células T es de un patógeno o de una célula cancerosa. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el epitopo de células T es de HSV, VIH o HPV. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es llevado a cabo para prevenir o tratar una enfermedad en el sujeto. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el nucleótido de interés codifica para al menos dos antígenos de HSV, de VIH o de HPV. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque nucleótido de interés codifica para 151 una proteína gag del VIH-1, o el fragmento que contiene un epitopo gag del mismo, y un segundo antígeno del VIH o un fragmento que codifica para un epitopo del segundo antigeno del VIH. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste de: Nef, T o un fragmento que contiene un epitopo de Nef o RT. 2 . El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porgue el nucleótido de interés codifica para una combinación de los antígenos seleccionados del grupo que consiste de: Gag (pl7,p24) , Nef truncado Gag (pl7,p24) , (codón optimizado) , Nef truncado} - Gag (pl7,p24) , RT, Nef truncado Gag (pl7,p24) , RT codón optimizado, Nef truncado Gag (pl7,p24) , RT codón optimizado, codón optimizado, Nef truncado; y/o RT optimizado de codón inactivado, Nef truncado y la porción pl7/p24 del gen gag de codón optimizado, opcionalmente operativamente enlazado corriente abajo (3') de un promotor HCMV de longitud Iowa + el exón 1, y en dirección 5' de una señal de poliadenilacion de globina de conejo. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos 152 dos diferentes nucleótidos de interés son administrados, los cuales cada uno codifica para el mismo epitopo y/o al menos dos diferentes proteínas son administradas, las cuales comprenden el mismo epitopo. "26. Un ensayo para probar la efectividad de un método para promover una respuesta de células T, caracterizado porque comprende : (i) una primera inmunización que comprende al menos dos administraciones que son de 1 a 14 días de separación, al sujeto, en donde cada administración comprende administrar un nucleótido de interés (NOI) que codifica para el epitopo de células T, y opcionalmente (ii) una segunda inmunización que comprende al menos una administración al sujeto de (a) un NOI que codifica para el epitopo de células T, o (b) una proteína que comprende el epitopo de células T, en donde el tiempo entre la primera administración de la primera administración, y la primera administración de la segunda inmunización, es de 21 a 365 días. en donde el ensayo comprende llevar a cabo el método sobre un sujeto mamífero y luego determinar el nivel de células T activadas o de memoria específicas para el epitopo en el suj eto . 27. Un ensayo de conformidad con la reivindicación 153 26, caracterizado porque comprende determinar si: (i) las administraciones de la primera inmunización caen todas dentro del periodo de tiempo entre la primera administración de la primera inmunización, y la declinación en el nivel de células T activadas al nivel basal, y/o (ii) la primera administración de la segunda inmunización ocurre después de la declinación en el nivel de las células T activadas al nivel basal . 28. Un equipo para llevar a cabo el método o el ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende: (i) un nucleótido de interés como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o una composición de conformidad con la reivindicación 14 ; y (ii) las instrucciones para la administración del nucleótido de interés o la composición de acuerdo con el método o ensayo como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .