MXPA05006492A - Agentes aglutinantes que reconocen un objetivo. - Google Patents

Abstract

La invencion esta dirigida a agentes aglutinantes que tienen circuitos aglutinantes y una conformacion de barril beta estable. Los circuitos aglutinantes de estos agentes pueden facilmente ser alterados de manera que el agente aglutinante pueda aglutinar cualquier molecula de objetivo seleccionada. Tambien son proporcionados una variedad de metodos para generar agentes aglutinantes con diferentes circuitos aglutinantes.

Description

AGENTES AGLUTINANTES QUE RECONOCEN UN OBJETIVO Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente al campo de agentes aglutinantes de tipo de anticuerpo que pueden específicamente reconocer y aglutinarse a un objetivo.

Antecedentes de la Invención Un anticuerpo estándar en es una estructura tetramérica que consiste de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina idénticas y de dos cadenas ligeras idénticas . Las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo consisten de diferentes dominios. Cada cadena ligera tiene un dominio variable y un dominio constante, mientras que cada cadena pesada tiene un dominio variable y tres o cuatro dominios constantes. Alzari P.N., Lamscombe, M.-B. & Poljak, R. . (1988) . Estructura Tridimensional de los anticuerpos, Anuario de Revisión de Inmunología 6,55-580. Cada dominio consiste de alrededor de 110 residuos aminoácidos. Cada dominio está también doblado en una estructura de ß~ emparedado característica formada de dos hojas-ß empacadas una en contra de otra (el doblez de inmunoglobulina) . Los dominios ligeros variables y pesados variables cada uno tienen tres regiones determinantes y complementarias (CDR1-3) que conectan los hilos ß en un extremo de los dominios. Las regiones variables de ambas cadenas ligera y pesada generalmente contribuyen a especificar el antígeno, aún cuando la contribución de las cadenas individuales para la especificación no es siempre igual. Por tanto, las moléculas anticuerpos son grandes y complejas.

Las moléculas anticuerpo que han evolucionado para aglutinar un número grande de moléculas mediante el uso de seis circuitos al azar (CDRs) . Sin embargo, el tamaño y la existencia de seis diferentes circuitos sobre péptido separado constituye un problema para las manipulaciones moleculares que pueden de otra manera ser usadas para mejorar la estructura, la estabilidad y las propiedades de unión de los anticuerpos. Además, aún cuando los anticuerpos son ampliamente usados en la investigación médica, procesos industriales y en los diagnósticos, éstos son costosos y difíciles de obtener. También estos carecen de una estabilidad adecuada para una vida de anaquel prolongada.

Lo que sería útil es un agente aglutinante más estable y más pequeño que pueda fácilmente ser manipulado por procedimiento de clonación estándar y que pudiera ser producido en células anfitrionas cultivadas, más bien que en animales. Tales tipos nuevos de agentes aglutinantes idealmente tendrían las características positivas de los anticuerpos (por ejemplo, una especificidad alta y una afinidad para el aglutinamiento a un objetivo distinto) pero pocos de los aspectos negativos de los anticuerpos (por ejemplo inestabilidad y dificultad para la producción) . Además, los nuevos procedimientos son también necesarios para la preparación a gran escala de los agentes aglutinantes en las células cultivadas que pudieran evitar el tiempo y el costo de usar animales .

Síntesis de la Invención La invención se refiere a polipéptidos y métodos para hacer agentes aglutinantes que pueden específicamente reconocer cualquier molécula de objetivo deseada (proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, etc.). Los agentes aglutinantes superan muchas de las limitaciones inherentes de los anticuerpos monoclonales o policlonales . Por ejemplo, ningún animal se requiere usar para hacer los agentes aglutinantes. En vez de esto, tales agentes aglutinantes pueden ser fácilmente producidos en una variedad de células anfitrionas, incluyendo bacterias. Estos nuevos agentes aglutinantes pueden ser purificados, estudiados, modificados y usados en ensayos, dispositivos de diagnósticos comerciales o como agentes terapéuticos en lugar de los anticuerpos.

Por tanto la invención está dirigida a un agente aglutinante aislado que incluye un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2 Ó SEQ ID NO : O SEQ ID NO: 37. El polipéptido puede tener un número de circuitos aglutinantes (por ejemplo cinco) en donde cada circuito comprende aminoácidos Xaa. Tales aminoácidos Xaa pueden ser L-aminoácidos codificados genéticamente, L-aminoácidos no codificados genéticamente y que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiomeros de los mismos . Cada aminoácido Xaa de tal agente aglutinante aislado puede ser intercambiado por un aminoácido específico de manera que el polipéptido pueda aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada.

La invención también estará dirigida a los ácidos nucleicos aislados para codificar un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID : 4. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos aislados comprenden ácidos nucleicos que tienen la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID N0.:3. El ácido nucleico puede estar dentro de un vector duplicable o dentro de un plásmido duplicable.

La invención también está dirigida a oligonucleótidos que comprenden secuencias de circuito al azar, por ejemplo, tal como un oligonucleótido puede tener SEQ ID N0.:25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28 O SEQ ID NO: 29.

La invención está además dirigida a un vector de expresión que comprende un promotor y un ácido nucleico que codifica un agente aglutinante de la invención. Por ejemplo, el vector de expresión puede codificar un polipéptido de agente aglutinante que comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 37. El ácido nucleico puede, por ejemplo, comprender SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 3.

La invención también está dirigida a una biblioteca de agentes aglutinantes, cada agente aglutinante en la biblioteca comprende un polipéptido que comprende SEQ ID NO : 2 O SEQ ID NO : 37.

La invención también se refiere a los métodos para hacer los agentes aglutinantes. En un método, los ácidos nucleicos y vectores que codifican un agente aglutinante parental son proporcionados en donde los circuitos aglutinantes del agente aglutinante parental pueden ser fácilmente modificados para generar una biblioteca de agentes aglutinantes. Tal biblioteca puede entonces ser analizada respecto de agentes que aglutinan a un objetivo particular. En otra incorporación, la invención está dirigida a un método ayudado por computadora para ajustar secuencialmente las coordinadas estructurales de una molécula de objetivo sobre los agentes aglutinantes diferentes y para determinar la secuencia de los circuitos aglutinantes que tienen un buen ajuste.

Por tanto, la invención está dirigida a un método para hacer una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante que comprenden: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprender una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituyendo cada oligonucleótido al azar en una ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:l para generar una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante. Por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar puede comprender SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29. El método puede además comprender el colocar la biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante en una publicación de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas.

La invención también está dirigida a un método para hacer una biblioteca de vectores duplicables que codifican polipéptidos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprender una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituir cada oligonucleótido al azar en un vector que puede ser duplicado que comprender SEQ ID N0:1 para generar una biblioteca de vectores que pueden ser duplicados que codifican los polipéptidos de agente aglutinante. Por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar puede comprender SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 29. El método puede además comprender el colocar la biblioteca de vectores de agente aglutinante en una publicación de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas .

La invención está además dirigida a un método para hacer una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante que comprende : generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprender una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; sustituir cada oligonucleótido al azar en un vector de expresión que comprende SEQ ID N0:1 para generar una biblioteca de vectores de expresión que codifican los polipéptidos de agente aglutinante; y colocar la biblioteca de vectores de expresión en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas que expresa una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante. Por lo menos una de la colección de oligonucleótidos al azar puede comprender SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 29.

La invención también está dirigida a un método para hacer una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituyendo cada oligonucleótido al azar en una ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 37 para generar una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante. Por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar puede comprender SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

La invención está además dirigida a un método para hacer una biblioteca de vectores que pueden ser duplicados los cuales codifican los polipéptidos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituir cada oligonucleótido al azar en un vector que puede ser duplicado que comprende SEQ ID NO: 37 para generar una biblioteca de vectores que pueden ser duplicados los cuales codifican los polipéptidos de agente aglutinante. Por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar puede comprender SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 29. El método puede además comprender el colocar la biblioteca de vectores de agente aglutinante en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas .

La invención también está dirigida a un método para hacer una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante que comprende : generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituyendo cada oligonucleótido al azar en un vector de expresión que comprende SEQ ID NO: 37 para generar una biblioteca de vectores de expresión que codifica polipéptidos de agente aglutinante; y colocar la biblioteca de vectores de expresión en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas que expresan una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante. Por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar puede comprender SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

La invención está además dirigida a un método implementado por computadora para hacer una biblioteca de agentes aglutinantes que comprende : definir una zona de búsqueda que comprende un sitio de interacción sobre una molécula de objetivo a la cual un agente aglutinante con por lo menos un circuito aglutinante puede interactuar; definir el número de circuitos aglutinantes que se deben buscar y medir cada circuito aglutinante; definir una clase de aminoácidos para cada posición en cada secuencia de aminoácido de circuito aglutinante; sustituir los miembros de circuito aglutinante; sustituir los miembros de una clase definida de aminoácidos en posiciones de cada secuencia de aminoácido de circuito aglutinante para generar una pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida; ajustar cada una de la pluralidad de secuencias de circuito aglutinantes de salida a la zona de búsqueda y para crear una anotación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo y calificar la pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida por la calificación de ajuste de secuencia de circuito-aglutinante de objetivo; en donde el agente aglutinante comprende SEQP ID NO: 2 o SEQ ID NO: 37. La zona de búsqueda puede comprender las coordinadas x- , y- y z-de cada átomo sin hidrógeno en la molécula de objetivo. El método puede además comprender meter las coordinadas x- y- y z- de cada átomo de no hidrógeno en el agente aglutinante que comprende la SEQ ID NO: O la SEQ ID: 37.

El método puede además comprender el recibir una selección del porcentaje de entrada para limitar las secuencias de circuito aglutinante de salida a un cierto porcentaje; en donde la selección del porcentaje de entrada es capaz de limitar el tamaño de expediente de biblioteca de salida y la complejidad de la biblioteca. En general, las secuencias de circuito aglutinante de salida con una secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo superior pueden aglutinar con una afinidad superior a la molécula de objetivo. La molécula de objetivo, puede, por ejemplo ser tripsina, bobina y uno de la secuencia de circuito aglutinante de salida puede, por ejemplo SEP ID NO: 35.

La invención también está dirigida a un sistema para generar secuencias de péptido, que comprende: un procesador; una memoria acoplada al procesador; un exhibidor acoplado al procesador; un componente de secuencia de péptido de circuito capaz de ejecutar sobre el procesador para generar las secuencias de péptido de circuito de salida; un componente de clasificación molecular capaz de dotar una pluralidad de secuencias de péptido de circuito de salida a una zona de búsqueda sobre una molécula de objetivo y generar una anotación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; un componente de secuencia de circuito de salida capaz de ejecutar sobre el procesador para exhibir las secuencias de péptido de circuito y un componente de secuencia de agente aglutinante de salida capaz de ejecutar sobre el procesador para exhibir las secuencias del agente aglutinante.

La invención está además dirigida a un medio accesible por máquina que tiene un contenido asociado capaz de dirigir la máquina para llevar a cabo un método, el método comprende: definir una zona de búsqueda que comprende un sitio de interacción sobre una molécula de objetivo a la cual un agente aglutinante con por lo menos un circuito aglutinante puede interactuar; definir el número de circuitos aglutinantes que se deben buscar y un tamaño para cada circuito aglutinante; definir una clase de aminoácidos para cada posición en cada secuencia de aminoácido de circuito aglutinante; sustituir los miembros de una clase definida de aminoácidos en posiciones de cada secuencia de aminoácidos de circuito aglutinante para generar una pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida; ajustar cada una de la pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida a la zona de búsqueda y para crear una anotación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; y calificar la pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida por la anotación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; en donde el agente aglutinante comprende la SEQP ID NO: 2 o SEQ ID NO: 37. El medio accesible por la máquina puede además comprender un expediente de las coordinadas x- , y- y z-de cada átomo de no hidrógeno en el agente aglutinante que comprende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38. Por ejemplo, las coordinadas x- y- y z- de las SEZ ID N0:2, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO : 38 pueden usarse por el programa de archivo molecular para alinear cada secuencia de circuito aglutinante con la molécula de objetivo.

Descripción de las Figuras La figura 1? es un diagrama esquemático de un ácido nucleico que codifica un agente aglutinante de la invención. Los sitios de restricción únicos que fueron diseñados en la secuencia están mostrados: Nd, Nde I; Nh, Nhe J; FS, Fsp I; As, Ase I; Sp, Spe I; Mf, Mfe I, Ac, Acl I; Ms , Msc I; Pm, Pml I; Se, Sea I, Nc, Neo I; y Ec, Eco RV. Los números se refieren a la posición de los sitios de restricción y para la longitud de gen, todo en nucleótidos. Las posiciones de las cinco regiones de circuito correspondientes (i a v) también se conocen.

La figura IB es un diagrama esquemático de un polipéptido de agente aglutinante de la invención. La ubicación de las cinco regiones de circuito (i a v) dentro del agente aglutinante se muestra con respecto a su posición de aminoácido. Los números arriba de los circuitos muestran el número de aminoácidos en el circuito.

La figura 2 proporciona la secuencia ADN de un reactivo aglutinante de la invención (SEQ ID N0:1) . La secuencia subrayadas denotan la 5' N de I sitio y la secuencia 3 ' Eco RV que se han incorporando dentro de la secuencia ADN a fin facilitar el clonado. El n's denota las posiciones de los nucleótidos al azar (por ejemplo A, C, G o T) que corresponden a las partes de circuito del reactivo aglutinante. La iniciación y la terminación de los codones están negrillas.

La figura 3 muestra una secuencia aminoácido de un agente aglutinante parental de la invención (SEQ ID NO.: 2) . Una nomenclatura de aminoácido de letra es empleada y las X's son aminoácidos al azar que corresponden a las cinco regiones de circuito (i a v) .

La figura 4 muestra una secuencia ADN de un reactivo aglutinante genérico (SEQ ID NO: 3) . Las secuencias subrayadas denotan el sitio N' Nde I y un la secuencia 3' Eco RV que se han incorporan en la secuencia ADN a fin de facilitar el clonado. Las partes de circuito de la secuencia ADN del reactivo aglutinante en la figura 1 se han reemplazado mediante codificar codones por alanita y glicina. En esta manera, el reactivo aglutinante genérico puede ser purificado y estabilizado y estudiado antes de construir la biblioteca combinatorial . Los codones de iniciación y terminación están en negrillas .

La figura 5 proporciona la secuencia de aminoácidos de un reactivo aglutinante genérico (SEQ ID N0:4) . Una nomenclatura de aminoácido de letra es empleada. Las regiones de circuitos (i a v) se han reemplazado con alanita y glicina .

La figura 6 ilustra la estructura tridimensional del reactivo aglutinante parental . La estructura es definida por cinco circuitos (mostrados por hilos tubulares delgados) los cuales son los elementos de reconocimiento de objetivo primarios . La topología global es un emparedado beta (mostrado por flechas) estabilizado por una unión disulfido central (no mostrada) . Los extremos de la secuencia de proteína con una cola que puede ser usada para anclar la molécula sobre la superficie de una cuenta a otra superficie para usarse en los dispositivos de diagnósticos. La región de contacto de objetivo es solamente definida por la orientación espacial de estos circuitos.

La figura 7 es una gráfica que ilustra la desnaturalización química del reactivo aglutinante parental . La fracción de la proteína desdoblada es dibujada como una función de la concentración desnaturalizante. La reacción desdobladota muestra un punto medio de transición a 2.7 M GdnHCl, que corresponde a una energía libre AG de 42.7 kJ mol"1, (m=16.8 kJ M"1 mol"1) .

La figura 8 es un esquema de flujo que muestra un programa para descubrir automáticamente nuevos reactivos aglutinantes en contra de moléculas de objetivos específicas.

La figura 9 es una gráfica que ilustra el aglutinamiento entre la variante de circuito i generada por computadora y la tripsina pancreática bovina como se analizó por el análisis ITC. Los reactivos aglutinantes y la tripsina fueron dializados en 20 m de cacodilato de sodio (pH 6.9), 40 m de Nac . El reactivo aglutinante estuvo a una concentración de 1 mM y la tripsina fue usada en la célula de calorímetro a una concentración de 20 a.m. La temperatura fue mantenida a 20°C. Fueron empleadas 40 inyecciones de 5 Al cada una con un tiempo de re-equilibro de 240 segundos entre las inyecciones.

La figura 10 es un esquema de flujo que muestra un programa para descubrir automáticamente nuevos reactivos aglutinantes en contra de las moléculas de objetivo específicas .

La figura 11 es un diagrama esquemático de un sistema para crear agentes aglutinantes con diferentes secuencias de péptido de circuito.

La figura 12A-12Q es un listado de las coordinadas estructurales para un polipéptido genérico que tiene la SEQ ID NO: 38. Esta secuencia ID NO: 38 polipéptido es un agente de aglutinamiento genérico como la secuencia ID NO: , excepto por la SEQ ID NO: 38 no tiene los ácidos N-terminales Met-Asp amino encontrados en la secuencia ID NO: 4.

Descripción Detallada de la Invención La invención está dirigida a agentes aglutinantes que comprenden un polipéptido que tiene aminoácidos eterminadores de estructura" y "controladores de función" en donde los aminoácidos determinadores de estructura promueven la formación de una conformación beta barril, anti-paralela y estable y los aminoácidos "controladores de función" promueven específicamente el aglutinamiento a una entidad molecular distinta tal como una proteína distinta, polisacárido, péptido o una molécula similar. Los ejemplos de los agentes aglutinantes de la invención incluyen polipéptidos que tienen SEQ ID N0:2, SEQ ID NO : 4 , o SEQ ID NO: 28.

Propiedades de Agente Aglutinante Un polipéptido de agente aglutinante estable de la invención tiene varias propiedades deseables . Algunas de estas propiedades deseables están descritas abajo.

Primero, los residuos que controlan la estabilidad y la conformación global de los polipéptidos de agente aglutinante deseables son distintos y pueden distinguirse de aquellos de control de función. Después de la identificación, los residuos de aminoácido de control de función pueden ser manipulados sin alertar la estabilidad y la conformación global de los polipéptidos de agentes aglutinante deseables. La invención por tanto está dirigida a un polipéptido de columna parental, en el cual todos los residuos de aminoácidos de control de función se han identificado, y se han manejado de manera que estos pueden ser fácilmente modificados. La función que es de interés en este caso, es aglutinante a un objetivo seleccionado.

Segundo, el número de residuos de aminoácido controladores de función permitidos en el polipéptido de agente aglutinante es suficiente para permitir la generación de una población diversa de polipéptidos con grados variables de funcionalidad. No requieren incorporarse un número exacto de aminoácidos controladores de función adentro de los polipéptidos de agente aglutinante de la invención. Sin embargo, usando muy pocos aminoácidos de control de función no generará una población diversa de agentes aglutinantes, mientras que el uso de un número grande aminoácidos de control de función significa que un número grande de sitios puede requerirse para que sea manipulado para generar un agente aglutinante óptimo. Por ejemplo, si solo dos residuos fueron usados para controlar la función, entonces la sustitución sistemática de los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente en ambos sitios generará solo un arreglo muy pequeño de agentes aglutinantes con solo 202 miembros. Sin embargo, si son usados 40 residuos para controlar la función, entonces puede ser generado un arreglo con 2O40 miembros .

El número de aminoácidos controladores de función de los presentes agentes aglutinantes puede variar generalmente entre alrededor de 15 a alrededor de 50 aminoácidos, o de desde alrededor de 20 a alrededor de 40 aminoácidos. En algunas incorporaciones, el polipéptido de agente aglutinante fue diseñado para tener alrededor de 30 aminoácidos (por ejemplo de control de función) de reconocimiento de objetivo dispersados en cinco circuitos diferentes. Cuando los residuos 30 son usados para controlar la función, entonces un arreglo con 2O30 (1039) diferentes agentes aglutinantes puede ser generado.

Tercero, los residuos de control de función están localizados dentro de la estructura tridimensional del agente aglutinante como para formar por lo menos una superficie aglutinante muy definida. Por tanto, los aminoácidos de control de función no están todos apiñonados dentro de una región única de la secuencia de aminoácidos del polipéptido. En vez de esto, los aminoácidos de control de función están dispersados a través de varias regiones del agente aglutinante de manera que, con el doblado, los polipéptidos presenten o proporcionen un dominio funcional que está ef ctivamente alineado con los aminoácidos de control de función. Una incorporación de ejemplo de la invención es un polipéptido con cinco circuitos (i-v) que forman una superficie aglutinante de objetivo. En ciertas incorporaciones, la superficie aglutinante de objetivo de los presentes polipéptidos está predominante compuesta de los circuitos (i) y (iv) , aún cuando los otros tres circuitos agregan diversidad (y por tanto cualidad) al agente aglutinante.

Cuarto, los aminoácidos de control de función están en racimo dentro de regiones distintas del agente aglutinante que pueden ser fácilmente intercambiadas de manera que puedan ser colocadas en esas regiones diferentes aminoácidos de control de función.

Quinto, los agentes de aglutinamiento deseables están hechos de una sub-unidad única que está formado por un polipéptido único y la cadena de polipéptido es capaz de doblar adecuadamente en una célula anfitriona seleccionada tal como una célula anfitriona E. coli . Además, el polipéptido es altamente estable, de manera que éste es resistente a la desnaturalización de calor y química y tiene una vida en el anaquel m s larga .

Varios de los factores anteriores pueden ser aplicados a los anticuerpos naturales, y varios no. Por ejemplo, el sitio de unión de antígeno de un fragmento Fab está compuesto de las regiones hipervariables de ambas cadenas pesada y ligera. Tradicionalmente , los anticuerpos son difíciles de producir usando técnicas recombinados y estos tienen una estabilidad limitada.

Estructuras de Agente Aglutinante La invención está dirigida a agentes aglutinantes que comprenden un polipéptido que tiene aminoácidos "determinates de estructura" y "de control de función" , en donde la formación promueve aminoácidos de determinación de estructura de una conformación de barril beta, anti-paralela y estable y los aminoácidos de "control de función" promueven el aglutinamiento específico a entidades moleculares distintas tal como proteínas distintas, polisacáridos , péptidos y similares.

Los inhibidores de polipéptido deseables de la invención tienen una conformación de barril beta anti-paralela. Como se usó aquí, una conformación de barril beta significa que el núcleo de los polipéptidos comprende unas estructuras secundarias de cepa beta que doblan en una estructura terciaria de tipo de barril. Las estructuras de cepa beta pueden ser arregladas en una manera anti-paralela . Además, el barril beta es estabilizado por la unión de hidrógeno intra-hilo y las interacciones de empaque hidrofóbicas internas . En la presente invención, la confirmación de barril beta fundamental es además estabilizada por lo menos por un enlace de disulfido que ayuda a mantener la topología global del doblez. Un barril beta es una estructura terciaria reconocida por aquellos con una habilidad en el arte de la función y estructura de la proteína.

Los aminoácidos involucrados en el aglutinamiento de las moléculas de objetivo (aminoácidos de determinación de función) son exhibidos sobre la superficie de estructura de tipo de barril.

El diseño y el uso de los agentes anti aglutinantes de la invención supera varios obstáculos importantes para el uso extendido y amplio de los anticuerpos convencionales en diagnósticos avanzados, por ejemplo su tamaño grande, su falta de vida en el anaquel, su potencial de ingeniería pobre, su composición de cadena múltiple, su solubilidad pobre y su costo.

El punto de inicio para el diseño de los agentes aglutinantes de la invención fue la estructura de anticuerpos encontrada en la serie de Camelidae . Los camellos así como un número de especies relacionadas (por ejemplo lamas) tienen moléculas de anticuerpo tipo IgG que están solo compuestas de dlmeros de cadena pesada. Vea Hamers-Casterman y otros, Anticuerpos que Nacen Naturalmente Desprovistos de Cadenas Ligeras. Naturaleza 363 (Junio 3 de 1993) 446-448; WO 97/49805. Aún cuando estos anticuerpos de "cadena pesada" están desprovistos de cadena de luz pero no obstante tienen propiedades aglutinantes de antígeno.

Un ejemplo de un agente aglutinante de la invención tiene la SEQ ID NO: 2, proporcionada abajo. >w. 1 Met Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly II Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg 21 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 31 Xaa Xaa Xaa Cys Ala Gly Trp Phe Arg Asn 41 Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 51 Ala lie Asn Xaa Xaa Xaa- Xaa- aa Tyr Ser 61 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 71 lie Ser Gln Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Val 81 Tyr Leu Leu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu 91 Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly 1Q1 His Xaa. Xaa Xaa . Xaa. Xaa Xa Xaa Xaa Cys III Gly His Gly Leu Ser Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 121 Xaa Xaa Pro Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vál 131 Thr Val Ser Ser en donde Xaa es un aminoácido sintético o natural disponible de uno con una habilidad ordinaria en el arte.

El agente de aglutinamiento (SEQ ID NO: 2) es llamado el agente aglutinante parental debido a que mientras los aminoácidos determinadores de estructura están grandemente determinados, no lo están los aminoácidos determinadores de función (residuos Xaa) . Los aminoácidos determinadores de función pueden ser fácilmente alterados o modificados como se desee por un experto en el arte, por ejemplo, mediante el uso de los métodos de la invención. Los aminoácidos determinantes de función dentro de los polipéptidos secuencia ID NO: 2 son puestos en racimo dentro de cinco circuitos separados (i a v) . El primer circuito (i) de un polipép ido de la secuencia ID N0:2 está en las posiciones 27 a 33; el segundo circuito (ii) está en las posiciones 54 a 58; el tercer circuito (iii) está en las posiciones 75 a 78; el cuarto circuito (iv) está en posiciones 102 a 109; y el quinto circuito (v) está en las posiciones 117 a 122.

Los agentes aglutinantes genéricos se han hecho los cuales tienen los mismos aminoácidos determinadores de estructura que el agente aglutinante parental pero con solo residuos de glicina y alanina en los dominios de circuito. Estos agentes aglutinantes genéricos fueron hechos para permitir el análisis de las propiedades físico-químicas (por ejemplo la estabilidad) de un construir genérico antes de hacer una biblioteca de agentes aglutinantes con diferente secuencias de circuito. Además, los agentes aglutinantes genéricos pueden ser usados para comparación con construcciones de agente aglutinante específicas que están aisladas por los métodos de la invención, ün ejemplo de una secuencia de aminoácido para un agente aglutinante genérico se proporciona abajo (SEQ ID NO: ) . 1 MDVQLQASGG GSVQAGGSLR LSCAASAGAA GAACAGWFRQ 41 APGKSREGVA AINAGAAGTS YADSV GRFT ISQLAGAA V 81 YLLMNSLEPE DTAIYYCAAG HAGAAGAATC GHGLSTAGAA 121 GAPWGQGTQV TVSS El polipéptido SEQ ID NO: 38 es un agente aglutinante genérico como el SEQ ID NO: 4, excepto porque el SEP ID NO: 38 no tiene los aminoácidos N-terminal Met-Asp encontrados en la SEA ID NO: 4. La secuencia del SEQ ID NO: 38 de agente aglutinante genérico se proporciona abajo. 1 VQLQASGG GSVQAGGSLR LSCAASAGAA GAACAGWFRQ 41 APGKEREGVA AINAGAAGTS YADSVKGRFT ISQLAGAANV 81 YLLMNSLEPE DTAIYYCAAG HAGAAGAATC GHGLSTAGAA 121 GAPWGQGTQV TVSS Los residuos aminoácidos dentro de los agentes aglutinantes de la invención pueden ser L-aminoácidos , genéticamente codificados, L-aminoácidos genéticamente no codificados que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiomeros de cualquiera de los anteriores. Las anotaciones de aminoácidos usadas aquí para los veinte L-aminoácidos codificados genéticamente y los aminoácidos no codificados comunes son convencionales y están mostradas en la tabla 1.

Tabla 1 Amino Acido Símbolo de Abreviación común una- letra Alaniña A Ala Arginina R Arg Aspargina N Asn Ácido aspártico D Asp Cisterna C Cys Glutamina Q Gln Acido glutámico E Glu Glicina G Gly Histidina H His Isoleucina I lie Leucina L Leu Lisina K Lys Metionina M Met fenilalanina P Phe Prolina P Pro Serina S Ser Threonina T Thr Triptofan W Trp Tirosina Y Tyr Valina V Val B-alanina Bala 2,3-ácido diaminopropiónico Dpr A-ácido aminoisobutírico Aib N-metilglicina (sarcosina) MeGly Ornitina Orn Citrulina Cit t-butilalanina t-BuA t-butilglicina t-buG N-metilisoleucina Melle Fenigliciña Phg Ciclohexilalanina Cha Norleucina Nle Naftilalanina Nal piridilalanina 3-benzotieriil alanina 4-clorofenilalanina Phe (4-C1) 2-fluorefenilalanina Phe(2-f) 3-fluorefenilalanina Phe (3-F 4-fluorefenilalanina Phe (4-F) Penicilamina Pen 1,2,3,4- Tic tetrahidroisoquinolina-3-ácido carboxílico ?-2-tienilalnina Thi Sulfóxido de metionina MSO Homoarginina Harg N-acetil lisina Cáliz 2,4-ácido diamino butírico Dbu p-aminofenilalanina Phe (PNH2) N-metilvalina Metal Homocisteína Hcys Hornoserina Hser Ácido e-amino hexanóico Aha Acido d-amino valérico Ava 2 , 3-ácidoaminobutírico Dab Cualquiera de tal aminoácido, o cualquier otro aminoácido conocido por un experto en el arte, puede ser utilizado como un aminoácido de control de función (Xaa) en los agentes aglutinantes de la invención.

Además, los agentes aglutinantes que son abarcados dentro del alcance de la invención pueden tener uno o más aminoácidos determinadores de estructura sustituidos con un aminoácido de propiedades químicas y/o físicas similares, siempre que éstos polipéptidos de agente aglutinante variantes o derivados puedan retener una conformación de barril beta, anti-paralela y estable, .

Los aminoácidos que son sustituibles para cada otro residuo generalmente dentro de las clases o subclases similares. Como se conoce por un experto en el arte, los aminoácidos pueden ser colocados dentro de tres clases principales: aminoácidos hidrofílicos , aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos de tipo cisteína, dependiendo primariamente de las características de la cadena lateral de aminoácido. Estas clases principales pueden ser además divididas en sub-clases. Los aminoácidos hidrofílicos incluyen los aminoácidos que tienen cadenas laterales acídica, básica o polar y aminoácidos hidrofóbicos que incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales aromática o apolar. Los aminoácidos apolares pueden ser además subdivididos para incluir, entre otros, los aminoácidos alifáticos . Las definiciones de las clases de aminoácidos como se usan aquí son como sigue: El "Aminoácido hidrofóbico" se refiere a un aminoácido que tiene una lateral que no está cargada en el pH fisiológico y que es repelida por la solución acuosa. Los ejemplos de los aminoácidos hidrofóbicos genéticamente codificados incluyen lie, Leu y Val. Los ejemplos de los aminoácidos hidrofóbicos genéticamente no codificados incluyen t-BuA.

"Aminoácido aromático" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que se refiere a un aminoácido hidrofóbico que tiene una cadena lateral que contiene por lo menos un anillo que tiene un sistema ?-electrón conjugado (grupo aromático) . El grupo aromático puede ser además sustituido con grupos sustituyentes tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, idroxilo, sulfonilo, nitro y grupos amino, así como otros. Los ejemplos de los aminoácidos aromáticos genéticamente codificados incluyen fenil ananina, tirosina y triptofán. Los aminoácidos aromáticos no genéticamente codificados encontrados comúnmente incluyen fenil glicina, 2-naftilalanina, ß-2-tienilalanina, 1,2,3, 4-tetrahidroisoquinolina-3 -ácido carboxílico, 4-clorofenilalanina, 2-fluorefenilalanina, 3-fluorefenilalanina y 4-fluorefenilalanina .

"Aminoácido Apolar" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que tiene una cadena lateral que está generalmente no cargada en pH fisiológico y que no es polar. Los ejemplos de los aminoácidos apolares genéticamente codificados incluyen glicina, prolina y metionina. Los ejemplos de los aminoácidos apolares no codificados incluyen Cha.

"Aminoácido alifático" se refiere a un aminoácido apolar que tiene una cadena recta saturada o no saturada, una cadena lateral de hidrocarburo ramificada o cíclica. Los ejemplos de los aminoácidos alifáticos genéticamente codificados incluyen Ala, Leu, Val e lie. Los ejemplos de los aminoácidos alifáticos no codificados incluyen Nle.

"Aminoácido hidrofílico" se refiere a un aminoácido que tiene una cadena lateral que es atraída por la solución acuosa. Los ejemplos de los aminoácidos hidrofílicos genéticamente codificados incluyen Ser y Lys . Los ejemplos de los aminoácidos hidrofílicos no codificados incluyen Cit y hCys .

"Aminoácido acídico" se refiere a un aminoácido hidrofílico que tiene un valor p de cadena lateral de menos de 7. Los aminoácidos acídicos típicamente tienen cadenas laterales cargadas negativamente en el pH fisiológico debido a la pérdida de un ion de hidrógeno. Los ejemplos de los aminoácidos acídicos genéticamente codificados incluyen ácido aspártico (aspartato) y ácido glutámico (glutamato) .

"Aminoácido básico" se refiere a un aminoácido hidrofílico que tiene un valor pK de cadena lateral de más de 7. Los aminoácidos básicos típicamente tienen las cadenas laterales cargadas positivamente en el pH fisiológico debido a la asociación con el ion de hidronio. Los ejemplos de los aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen arginina, lisina e histidina. Los ejemplos de los aminoácidos básicos no codificados genéticamente incluyen los aminoácidos no cíclicos ornitina, 2,3-ácido diaminopropiónico, 2,4-ácido diaminobutírico y homoarginina .

"Aminoácido polar" se refiere a un aminoácido hidrofílico que tiene una cadena lateral que no está cargada en pH fisiológico pero la cual tiene una unión en la cual el par de electrones compartidos en común por dos átomos es más unida más cercanamente por uno de los átomos . Los ej emplos de los aminoácidos polares genéticamente codificados incluyen aspargina y glutamina. Los ejemplos de los aminoácidos polares no genéticamente codificados incluyen citrulina, N-acetil lisina y sulfóxido de metionina.

"Aminoácido de tipo Cisteína" se refiere a un aminoácido que tiene una cadena lateral capaz de formar un enlace covalente con una cadena lateral de otro residuo aminoácido, tal como un enlace de disulfido. Típicamente, los aminoácidos de tipo cisteína generalmente tienen una cadena lateral que contiene por lo menos un grupo tiol (SH) . Los ejemplos de los aminoácidos de tipo cisteína genéticamente codificados incluyendo cisteína. Los ejemplos de los aminoácidos de tipo cisteína no genéticamente codificados incluyen homocisteína y penicilamina .

Como se apreciará por aquellos expertos en el arte, las clasificaciones anteriores no son absolutas. Varios aminoácidos exhiben más de una propiedad característica, y pueden por tanto, ser incluidos en más de una categoría. Por ejemplo, la tirosina tiene un anillo aromático y un grupo hidroxilo polar. Por tanto, la tirosina tiene propiedades duales y pueden ser incluidas en ambas categorías aromática y polar. Similarmente, en adición a ser capaz de formar enlaces de disulfuro, la cisteína también tiene un carácter apolar. Por tanto, aún cuando no se clasifica estrictamente como un aminoácido hidrofóbico o apolar, en muchos casos la cisteína puede ser usada para conferir hidrofobicidad a un polipéptido.

Ciertos aminoácidos comúnmente encontrados que no son genéticamente codificados y que pueden estar presentes o sustituidos por un aminoácido, en los polipéptidos y análogos de polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, ß-alanina (b-Ala) y otros aminoácidos-omega tal como 3-ácido aminopropiónico (Dap) , 2, 3-ácido diaminopropiónico (Dpr) , 4-ácido aminobutírico y otros; a-ácido aminoisobutírico (Aib) ; e-ácido aminohexanóico (Ana) ; d-ácido aminovalérico (Ava) ; metilglicina ( eGly) ; ornitina (Orn) ; citrulina (Cit) ; t-butilalanina (t-BuA) ; t-butiglicina (t-BuG) ; N-metilisoleucina (Melle) ; feniglicina (Phg) ; ciclohexalalanina (Cha) ; norleucina (Nle) ; 2-naftilalanina (2-Nal) ; 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)); 2-fluorefenilalanina (Phe(2-F)); 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen) ; 1, 2, 3, 4- tetrahidroisoquinolina-3 -ácido carboxxlico (Tic) ; ß-2-tienilalanina (Thi) ; metionina sulfóxido (MSO) ; homoarginina (hArg) ; N-acetil lisina (AcLys) ; 2, 3-ácido diaminobutírico (Dab) ; 2, 3-ácido diaminobutírico (Dbu) ; p-aminofenilalanina ( he (PN¾) ) ; N-metilo valina ( eVal) ; homocisteína (hCys) y homoserina (hSer) . Estos aminoácidos todos caen en las categorías definidas arriba.

Las clasificaciones de los aminoácidos codificados y no codificados genéticamente descritos anteriormente están resumidos en la tabla 2 dada abajo. Se entiende que la tabla 2 es para propósitos ilustrativos y que no quieren ser una lista exhaustiva de los residuos aminoácidos que pueden comprender los polipéptidos de agente aglutinante descritos aquí. Otros residuos de aminoácidos que son útiles para hacer los polipéptidos de agente aglutinante de la invención pueden encontrarse por ejemplo, en Fasman, 1989, Texto Práctico CRC de Bioquímico y Biología Molecular, CRC Press Inc . , las referencias citadas ahí . Los aminoácidos no mencionados específicamente aquí pueden ser clasificados convenientemente en las categorías antes descritas sobre la base de un comportamiento conocido y/o de sus características químicas y/o sus propiedades físicas en comparación con los aminoácidos identificados específicamente .

Tabla 2 Los polipéptidos de agente aglutinante de la invención pueden tener cualquier estructura que determine el aminoácido sustituido por cualquier aminoácido similarmente clasificado para crear un polipéptido de agente aglutinante variante o derivado, siempre que la variante o derivado de polipéptido de agente aglutinante retenga una capacidad para formar una conformación de barril beta, anti-paralela y estable .

Los agentes aglutinantes de la invención pueden por tanto hacerse aún más estables por la modulación de los aminoácidos determinadores de estructura a través de la sustitución de uno o más aminoácidos dentro de la secuencia ID N0:2. Los procedimientos de selección de diseño o de mejora de estabilidad que están disponibles para uno con una habilidad en el arte pueden utilizarse para este propósito. Por ejemplo, un experto en el arte puede sistemáticamente cambiar cada uno de los aminoácidos determinadores de estructura en la secuencia ID NO: 2 a cualquier aminoácido natural o sintético disponible, observar si la estructura de polipéptido modificada es además resistencia a la desnaturalización térmica o química y utilizar solo aquellas sustituciones de aminoácidos que mejoran la estabilidad del polipéptido.

Además, las propiedades aglutinantes de los agentes aglutinantes de la invención pueden ser moduladas mediante alterar sistemáticamente cada uno de los aminoácidos de control de función (Xaa) de un agente aglutinante tal como SEQ ID NO : 2.

En una incorporación, por lo menos uno de los aminoácidos que determinan la estructura del agente aglutinante parental (SEQ ID NO: 2) es cambiado a un aminoácido de la misma clase. En otras incorporaciones, varios de los aminoácidos determinadores de estructura del agente de aglutinamiento parental (SEQ ID NO: 2) son cambiados a aminoácidos de la misma clase. Por tanto, la invención está dirigida a un agente aglutinante parental variante con la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 37) : 1 Xaat aa2 Xaa3 Xas» Xaa$ Xaag Xaa7 Xaag Xaaj aaio 11 Xaan ai2 aa^ Xaa34 Xaais Xaa^ aan Xaais Xa&\s Xaa2o 21 Xaa2i Xaa22 Xaa23 Xaa24 aaís Xaazfi Xaa Xaa Xaa Xaa 31 Xaa Xaa Xaa aa34 Xaa3s Xaa¾ Xaa37 Xaa38 aa3g Xaato 41 Xaa4i Xaa« Xaa43 Xaa44 a+s Xaa46 Xaatf Xaa48 Xaa49 Xaaso 51 Xaaí! Xaa52 Xaas3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa59 Xaaso 61 Xaaei aae2 as3 a^ aags Xaaeé Xa¾7 Xaaes aag9 Xaa7o 71 Xaa7i Xaa72 Xaa73 Xaa74 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa7g Xaaso 81 aag! Xaag2 aaa3 Xaag4 Xaa¾5 Xaag6 Xaa¾ Xaage Xaagg Xaago 91 Xaagj Xaa¾2 Xaa93 Xaa^ Xa^s Xaa¾ Xa^ Xaass a aatoo 101 Xaaioj Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaauo 111 XaainXaii2Xaaii3Xaan4Xau5 aa Xaa Xaa Xaa 121 Xaa Xaa aai26 Xaai2 X ai28 Xaai2 Xaai3o 131 aani Xaai32 aai33 Xaai3 en donde : Xaa es cualquier aminoácido natural o sintético disponible para uno de una habilidad en el arte; Xaa is any natural or synthetic amino acid available to one of skiE in Üie art; Xaaj, Xaa?, Xaaio, Xaau, aie, Xaa17, Xaa36, aa42, Xaa43, Xaa4& Xa67, Xa^, Xaag¾ Xaa7> Xaaioo, Xaam, aan3, Xaai23, Xaa^s, and Xaa^ son separadamente cada uno aminoácidos apolares; Xaa2, aa5s Xaa7, Xa¾3, Xaass» aao5 and Xaa91 son separadamente cada uno aminoácidos acídicos Xaa3, Xaaj, Xaa7, Xa ^, aais, Xaai¾ Xaaai, Xaa^, Xaa25, aa35, Xaa», aa^, Xaaso, Xasi, Xa¾52, aae2, Xaaes, Xaa71) Xaa74, Xaago, aa82, Xaag3, Xaag7, aas3, Xaa94, aajj, ags, Xaan4, aai3o, and Xaai32 son separadamente cada uno aminoácidos alifáticos; Xaa4, aac.Xaas, Xaai2, Xaan, Xaaig, Xaa22, Xaa26, Xaa4o, Xaas3, aas¾ Xaaeo, Xaasi, Xaaw, Xaao, Xaa72, Xa73, Xaa7¾ Xaas Xaags, Xaags, Xaa92, Xaags, aage, Xaans, Xaaus, aai26, Xaai28, Xa^, Xaam, aa^, and Xam son separadamente cada uno aminoácidos polares; aa23, ¾£i3 , Xaa97, and Xaano son separadamente aminoácidos-cisteína.

Xaa37, Xaa38, aae9, and ai24 son separadamente cada uno aminoácidos aromáticos .

Xaa.20, Xaa39j aa4, Xaa6, X aeg, Xaa$8, Xaaioi, and Xau2 son separadamente cada uno aminoácidos básicos .

Cualquier procedimiento disponible para un experto en el arte puede ser usado para alterar los aminoácidos de control de función o de determinación de estructura de los presentes agentes aglutinantes. Por ejemplo, por lo menos dos métodos generales pueden ser usados para modificar los agentes aglutinantes de la invención.

El primer método es por diseño; un experto en el arte puede examinar los dominios estructurales y de aglutinamiento de los complejos de anticuerpo-antígeno naturales (especialmente aquellos que se han resuelto por cristalografía de rayos x) para identificar las interacciones estructurales específicas que pueden estabilizar la conformación del agente aglutinante. Similarmente , un experto en el arte puede examinar las estructuras de los complejos inhibidores-de enzima o de anticuerpo-antígeno para identificar las interacciones aglutinantes específicas que pueden aumentar la afinidad del agente aglutinante para su objetivo.

El segundo método más general, es de el de generar un arreglo amplio de agentes aglutinantes ("anticuerpos artificiales"). Una molécula de objetivo seleccionada ("antígeno") puede ser usada para seleccionar los agentes aglutinantes del arreglo que tiene las propiedades aglutinantes deseadas . Este acercamiento de combinación de fuerza bruta (pero efectivo) se hace posible mediante una estructura fácilmente manipulada y simple de los agentes aglutinantes, los cuales pueden ser codificados por un ácido nucleico comparativamente pequeño y único.

Uno de tal ácido nucleico, el cual codifica un polipéptido que tiene la SEQ ID NO : 2 , es un ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO : 1 proporcionada abaj o . 1 ACACACCATA TGGACGTTCA GCTGCAGGCT TCTGGTGGTG 41 GTTCTGTTCA GGCTGGTGGT TCTC GCGTC TGTCTTGCGC 81 TGCTAGCnnn nrmnrmrtnnn nimnnnnnTG CGCAGGTTGG 121 TTCCGTCAGG CTCCGGGTAA AGAACGTGAA GGTGTTGCTG 161 CTATTAATrui nmrmnnnrin. nnnACTAGTT ACGCTGACTC 201 TGTIAAAGGT CGTTTCACCA TCTCTCAATT Onnimnnnnn 241 nrüiAACGTTT ACCTGCTGAT GAACTCTCTG GAACCGGAAG 281 ACACCGCTAT CTACTACTGC GCTGCTGGCC ACnnimnnim 321 nrmnnnnnnn nnCACGTGCG GTCACGGTCT GAGTACTnm 3SI rinnnnnimrin nnrmnCCATG GGGTCAGGGT ACCCAGGTTA 01 CCGTTTCTTC TTAGATATCA CAC En donde n puede ser cualquier nucleótido (por ejemplo A, C, G o T) .

De acuerdo a la invención, la SEQ ID NO:l tiene secuencias de nucleótido que pueden ser fácil y rápidamente reemplazadas por procedimientos biológicos moleculares estándar para generar un número grande de agentes aglutinantes cada uno con diferentes propiedades aglutinantes. Por tanto, una biblioteca combinatoria puede ser construida fácilmente con dominios de circuito de contacto aglutinantes al azar. Tal biblioteca de agentes aglutinantes puede ser analizada para identificar los agentes aglutinantes específicos que reconocen distintas moléculas de objetivo, por ejemplo, mediante procedimientos de biopanning o de exhibición de fag.

Bibliotecas Combinatorias La presente invención también se refiere a bibliotecas de agente aglutinante y a los métodos para generar y analizar esas bibliotecas para identificar los agentes aglutinantes que aglutinan a moléculas de objetivo de interés. Los polipéptidos de agente aglutinante son producidos de bibliotecas de vectores de expresión que codifican un polipéptido que tiene las SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 37, en donde los aminoácidos Xaa son cualquier aminoácido. La biblioteca de los agentes aglutinantes de polipéptido es analizada usando una molécula de objetivo seleccionada para identificar los polipéptidos que pueden aglutinar a la molécula de objetivo seleccionada. El agente aglutinante puede entonces ser sinterizado en volumen por medios convencionales.

Los métodos de análisis de ejemplo de la invención comprenden los pasos de (a) generar oligonucleótidos con secuencias al azar que son de la longitud aproximada de las regiones de circuito de un agente aglutinante SEQ ID NO : 2 o SEQ ID NO: 37; (b) insertar los oligonucleótidos al azar en un vector de expresión (por ejemplo, que comprende el ácido nucleico SEQ ID NO:l) para generar una biblioteca de agentes aglutinantes en donde los aminoácidos determinadores de función (por ejemplo los n nucleótidos de SEQ ID NO:l) que corresponden a los circuitos i-v son reemplazados por oligonucleótidos al azar; (c) expresando la biblioteca de agentes aglutinantes; y (d) identificando cuáles agentes aglutinantes aglutinan una molécula de objetivo seleccionada.

Por tanto, la construcción de una biblioteca combinatoria de agentes aglutinantes de polipéptido empieza con un vector que codifica un agente parental o genérico, por ejemplo, un vector que codifica SEQ ID N0:1 .

Un ácido nucleico que tiene SEQ ID NO : 1 se proporciona abajo 1 ACACACCATA TGGACGTTCA GCTGCAGGCT TCTGGTGGTG 41 GTTCTGTTCA GGCTGGTGGX TCTCTGCGTC TGTCTTGCGC 81 TGCTAGCnnn ??????????? iiniinrmnnTG CGCAGGT GG 121 TTCCGTCAGG CTCCGGGTAA AGAACGTGAA GGTGTTGCTG 161 CTATTAATnn ?t????a?????? nnnACTAGTT ACGCTGACTC 201 TGTTAAAGGT CGTTTCACCA TCTCTCAAT GnimiiriiinrLn 241 nnnAACGTTT ACCTGCTGAT GAACTCTCTG GAACCGGAAG 281 ACACCGCTAT CTACTACTGC GCTGCTGGCG ACnnnnnniin 321 imnnnnnnnn nnCACGTGCG GTCACGGTCT GAGTACTnnn 361 nnnnnnnnnn nnnnnCCATG GGGTCAGGGT ACCCAGGTTA 401 CCGTTTCTTC TTAGATATCA CAC En donde n puede ser cualquier nucleótido (por ejemplo A, C, G o T) .

Las posiciones de nucleótido teniendo n nucleótidos no definidos corresponden a regiones que son circuitos en el polipéptido codificado. Por tanto, en una incorporación, el circuito i corresponde a las posiciones de nucleótido 88-108 de SEQ ID NO:l; el circuito ii corresponde a las posiciones de nucleótido 169-183 de SEP ID NO:l; el circuito iii corresponde a las posiciones de nucleótido 323-243 de SEQ ID NOl; el circuito iv corresponde a las posiciones de nucleótido 313-332 de la SEQ ID NO:l; y el circuito v corresponde a las posiciones de nucleótido 358-375 de SEQ ID N0:1. Deberá notarse que la longitud de los circuitos, y el ácido nucleico correspondiente que codifica esos circuitos, puede variar. Por tanto, aún cuando los ácidos nucleicos codifican los circuitos que tienen longitudes definidas en la secuencia ID N0:1, esas regiones de codificación de circuito pueden fácilmente ser removidas y reemplazas con oligonucleótidos de longitudes diferentes.

Un vector es usado para facilitar la manipulación, duplicación y expresión de un agente aglutinante parental o genérico (por ejemplo la SEQ ID N0:1 ácido nucleico) . El vector puede ser cualquier vector conveniente que exprese un agente aglutinante que comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 37 de un ácido nucleico codificando tal agente aglutinante. Una vez que un vector es construido para codificar el agente aglutinante genérico SEQ ID NO: 2 o 37, un experto en el arte solo requiere clonar las secuencias de codificación de péptido de circuito en cuadro con la SEQ ID NO: 2 o 37 codificando la secuencia para obtener una biblioteca de polipéptido de agente aglutinante al azar de la invención.

Los oligonucleótidos al azar que corresponden a las regiones de circuito de los agentes aglutinantes pueden sintetizarse usando la química de fase sólida estándar. Aún cuando los oligonucleótidos al azar pueden tener cualesquier secuencias de flanqueo convenientes, las secuencias flanqueadoras agregadas que proporcionan sitios de restricción pueden usarse para facilitar la inserción de los oligonucleótidos al azar adentro del ácido nucleico que codifica los aminoácidos determinadores de estructura del agente aglutinante .

Por ejemplo, las secuencias de los oligonucleótidos al azar pueden ser proporcionados en la tabla 3 dada abajo.

Tabla 3: Secuencias de oligonucléotido de circuito al azar Las regiones de circuito (i a v) corresponden a las regiones de circuito de las presentes regiones aglutinantes . La tabla 3 por tanto proporciona la secuencia de los oligonucleótidos que pueden usarse para generar bibliotecas combinatorias de agentes aglutinantes, así como el incorporar sitios de restricción única que flanquean los nucleótidos al azar (n) y facilitan la clonación. La posición y número de los nucleótidos al azar (n) están indicados. Por tanto, el circuito i tiene 21 nucleótidos al azar, el circuito ii tiene 15 nucleótidos al azar, el circuito iii tiene 12 nucleótidos al azar, el circuito iv tiene 21 nucleótidos al azar y el circuito v tiene 18 nucleótidos al azar. Por ejemplo, el oligonucléotido para el circuito i es una secuencia de 33 nucleótidos con 21 bases al azar centrales con un sitio Nhe I en el extremo 5' y un sitio Fsp I en el extremo 3 ' .

Las secuencias de circuito variables proporcionadas por el oligonucleótido al azar proporcionan una característica clave de la biblioteca: los dominios aglutinantes de los agentes aglutinantes de la invención. El tamaño de la biblioteca variará de acuerdo al número de codones variables, y por tanto el tamaño de los circuitos, que son deseados. Generalmente, la biblioteca será de por lo menos de 106 a 108 o más miembros, aún cuando las bibliotecas más pequeñas pueden ser bastante útiles en algunas circunstancias .

La colección de oligonucleótidos al azar que codifica las secuencias de circuito requiere no ser completamente al azar. Por ejemplo, el uso de codón puede ser optimizado para la expresión en un organismo particular. Sin embargo, este puede ser más simple y menos expansivo para utilizar oligonucleótidos al azar y después optimizar el uso de codón para la expresión posterior. La expresión de los péptidos de mezclas generadas al azar de oligonucleótidos en vectores recombinantes es discutida en Oliphant y otros, 1986, Gene 44:177-183, incorporada aquí por referencia.

Por ejemplo, para preparar los oligonucleótidos para la inserción en el vector que codifica el agente aglutínate parental, cada uno de los oligonucleótidos al azar (por ejemplo SEQ ID NO: 25-29) puede ser hibridizado con sus socios aglutinantes complementarios . El vector es entonces digerido con pares seleccionadas de enzimas, de restricción, por ejemplo, Nhe I y Fsp I si los oligonucleótidos al azar i van a ser ligados en el vector. El plásmido lineal es aislado. Los oligonucleótidos de circuito i son digeridos con las mismas enzimas de restricción. Los oligonucleótidos digeridos y los plásmidos son mezclados y ligados juntos, por ejemplo mediante el usar ligasa ADN T4. Los oligonucleótidos al azar que corresponden a las regiones de circuito ii a v son insertados similarmente en el vector.

El producto de vector ligado finalmente puede entonces ser introducido en un tipo de célula anfitriona apropiada, por ejemplo, un tipo de célula bacterial, un tipo de célula de levadura, un tipo de célula de insecto, o un tipo de célula de mamífero. Las células pueden entonces ser cubiertas y analizadas para la expresión de un polipéptido de agente aglutinante que puede aglutinar una molécula de objetivo seleccionada.

Cualquier vector que puede duplicarse en una célula anfitriona seleccionada puede ser utilizado en la invención. En general, el vector es un vector de expresión que proporciona los segmentos de ácido nucleico necesarios para la expresión de los polipéptidos de agente aglutinante. Varios vectores están públicamente disponibles. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral, o fag. Los componentes de vector generalmente incluyen pero no se limitan a uno o más de una secuencia de señal, un origen de duplicación, uno o más genes marcadores, un elemento mej orador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción .

El agente aglutinante y las secuencias de ácido nucleico de circuito oligonucleótido al azar pueden insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, el ADN es insertado en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiada usando técnicas conocidas en el arte. Vea generalmente, la obra de Sambrook y otros, 1989, Clonación Molecular, un Manual de Laboratorio, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, de Cold Spring Harbor, Nueva York; Sambrook y Russel1, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Tercera Edición (15 de enero de 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765; Ausubel y otros, Protocolos Actuales en Biología Molecular, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, Nueva York (1989) ) . La construcción de los vectores de expresión adecuados que contienen un agente aglutinante genérico y uno o más oligonucleótidos de circuito al azar emplean técnicas de ligado estándar que son conocidos aquellos expertos en el arte .

La invención por tanto proporciona un cásete de expresión capaz de dirigir la expresión de un polipéptido de agente aglutinante. Tal cásete de expresión puede ser colocado dentro de un vector para generar un vector de expresión.

El cásete de expresión de la invención incluye un promotor. Cualquier promotor capaz de una trascripción directa de un cásete de expresión puede ser usado. Por tanto, muchos promotores pueden ser incluidos dentro del cásete de expresión de la invención. Algunos promotores útiles incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores regulados, promotores específicos de célula, promotores virales y promotores sintéticos. Un promotor es una secuencia de nucleótido que controla la expresión de una secuencia de ácido nucleico enlazada operablemente mediante el proporcionar un sitio de reconocimiento para polimeriza AKN, y posiblemente otros factores, requeridos para una trascripción adecuada. Un promotor incluye un promotor mínimo, que consiste solo de todos los elementos básicos necesarios para la iniciación de trascripción, tal como TATA-caja y/u otras secuencias que sirven para especificar el sitio de iniciación de trascripción. Un promotor puede ser obtenido de una variedad de fuentes diferentes. Por ejemplo, un promotor puede ser derivado completamente de un gen nativo, puede estar compuesto de elementos diferentes derivados de promotores diferentes encontrados en la naturaleza, o puede estar compuesto de secuencias de ácido nucleico que son enteramente sintéticas. Un promotor puede ser derivado de muchos tipos diferentes de organismos y confeccionado para usarse dentro de una celda dada .

Para la expresión de un polipéptido en una bacteria, es usado un cásete de expresión que tiene un promotor bacterial. Un promotor bacterial es cualquier secuencia ADN capaz de aglutinar polimeriza ARN bacterial e iniciar las transcripciones corriente abajo (3') de una secuencia de codificación en mARN. Un promotor tendrá una región de iniciación de trascripción que es usualmente colocada próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de trascripción usualmente incluye un sitio aglutinante de polimeriza ARN y un sitio de iniciación de trascripción. Un segundo dominio llamado un operador puede estar presente y traslapar un sitio de aglutinamiento de polimeriza ARN en el cual comienza la síntesis de ARN. El operador permite la trascripción negativamente regulada (inducible) , ya que una proteína depresora de gen puede aglutinar al operador y por tanto inhibir la trascripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en la ausencia de elementos reguladores negativos, tal como el operador. Además, la regulación positiva puede ser lograda por una secuencia aglutinante activadora de gen, la cual si está presente es usualmente próxima (5') a la secuencia aglutinante de polimeriza ARN. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es una proteína activadora de catabolito (CAP) la cual ayuda a iniciar la trascripción del operón lac en E. coli (Raibaud y otros, Ann. Rev. Genet . , 18:173 (1984)). La expresión regulada puede por tanto ser positiva o negativa, ya sea mejorando o reduciendo la trascripción.

Las secuencias codificadores de enzimas de trayectoria metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizantes de azúcar tal como galactosa, lactosa (lac) (Chang y otros, Nature, 198:1056 (1977)), y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen las secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como Triptofan (trp) (Goeddel y otros, N.A.R. 8: 4057 (1980); Yelverton y toros, N.A.R. 9:731 (1981); la patente de los Estados Unidos de América número 4,738,921; y EPO publicación No. 036 776 y 121 775). El sistema promotor ß-lactamasa (bla) (Weissmann, "La Clonación de Interferón y otros Errores" y n: Interferón 3 (editor I. Gresser) , 1981), y bacteriófago lamba PL (Shimitake y otros, Naturaleza, 292:128 (1981)) y T5 (patente de los Estados Unidos de América número 4,689,406) sistemas promotores que también proporcionan secuencias promotoras útiles . Otro promotor es el promotor de virus Clorella (patente de los Estados Unidos de América número 6, 316, 224) .

Los promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza también funcionan como promotores bacteriales . Por ejemplo, las secuencias de activación de trascripción de un promotor bacterial o bacteriófago pueden ser unidas con las secuencias de operón de otro promotor de bacteriófago o bacteria, creando un promotor híbrido sintético (patente de los estados Unidos de América número 4,551,4339. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lactosa híbrido que es regulado por el represor lactosa y que está compuesto de ambos el promotor trp y las secuencias de operón lactosa (Amann y otros, Gene 25:167 (1983)); de Boer y otros, Proc. Nati, Acad. Sci, EUA 80:21 (1983)). Además, un promotor bacterial puede incluir promotores que ocurren naturalmente de origen no bacterial que tiene la capacidad de aglutinar la polimeriza ARN bacterial e iniciar la trascripción. Un promotor que ocurre naturalmente de origen no bacterial también puede ser acoplado con la polimeriza ARN compatible para producir los altos niveles de expresión de algunos genes en procairotes. El sistema promotor/polimeriza bacteriófago T7 ARN es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier y otros, J. Mol. Biol . 189:113 (1986); Tabor y otros, Proc Nati Acad. Sci, EUA 82:1074 (1985)). Además, un promotor híbrido también puede estar compuesto de un promotor bacteriófago y una región de operador E. Coli (Publicación EP No. 267 851) .

Un cásete de expresión que tiene un promotor de insecto tal como un promotor baculovirus puede ser usado para la expresión de un polipéptido en una celda de insecto. Un promotor baculovirus es cualquier secuencia ADN capaz de aglutinar una polimeriza ARN baculovirus e iniciar la transcripción de una secuencia codificante en mARN. Un promotor tendrá una región de iniciación de trascripción que es usualmente colocada cerca del extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de trascripción usualmente incluye un sitio de aglutinamiento polimeriza ARN y un sitio de iniciación de trascripción, un segundo dominio llamado un mej orador puede estar presente y es usualmente distante del gen estructural . Un promotor baculovirus puede ser un promotor regulado o un promotor constitutivo. Las secuencias de promotor útiles pueden ser obtenidas de genes estructurales que son transcritos a veces tarde en un ciclo de infección viral. Los ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de polihedrón Baculoviral (Friesen y otros, "La Regulación de la Expresión de Gen Baculovirus", en: La Biología Molecular de Baculovirus (editor Walter Doerfler) , 1986; y EPO publicaciones números 127 839 y 155 476) y la codificación de gen de la proteína baculoviral pío (Vlak y otros, J. Gen. Virol . , 69:765 476 (1988)).

Los promotores que son funcionales en la levadura son conocidos por aquellos con una habilidad ordinaria en el arte. Además de un sitio de aglutinamiento de polimeriza ARN y un sitio de iniciación de trascripción, un promotor de levadura también puede tener una segunda región llamada una secuencia de activador corriente arriba. La secuencia de activador de corriente arriba permite la expresión regulada que puede ser inducida. La expresión constitutiva ocurre en la ausencia de una secuencia de activador corriente arriba. La expresión regulada puede ser ya sea positiva o negativa, mejorando ya sea por tanto o reduciendo la trascripción.

Los promotores para usarse en la levadura pueden ser obtenidos de genes de levadura que codifican enzimas activas en trayectorias metabólicas . Los ejemplos de tales genes incluyen dehidrogenasa de alcohol (ADH) (EPO publicación No'. 284 044) , enolasa, glucocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfatodehidrogenasa (GAP o GAPDH) , hexocinasa, fosfofructocinasa, 3-fosfogliceratemutasa, y piruvato cinasa (Py ) . (EPO publicación No. 329 203) . El gen PH05 de levadura, codificando la fosfatasa, ácido, también proporciona secuencias de promotor útiles. (Myanohara y otros. Proc. Nati, Acad. Sci . EUA 80:1 (1983)).

Los promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza pueden ser útiles para la expresión en la levadura. Por ejemplo, las secuencias de activador hacia arriba de un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de trascripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora ADH enlazada a la región de activación de trascripción GAP (patentes de los Estados Unidos de América números 4,876,197 y 4,880,734). Otros ejemplos de los promotores híbridos incluyen promotores que consisten de secuencias reguladores de ya sea los genes ADH2 , GAL4, GALIO o PH05, combinados con la región de activación de transcripción del gen de enzima glicolítico tal como GAP o PyK (EPO Publicación No. 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir los promotores que ocurren naturalmente de origen de no levadura que tienen la capacidad de aglutinar la polimeriza AR de levadura y además iniciar la trascripción. Los ejemplos de tales promotores son conocidos en el arte. (Cohén y otros, Proc Nati. Acad. Sci. EÜA 77:1078 (1980)); Henikoff y otros, Naturaleza 283:835 (1981); Hollenber y otros, Curr, Topics Microbiol. Immunol . , 95: 119 (1981); Hollenber y otros "La Expresión de Genes de Resistencia Antibiótica Bacterial en Sacharomyces Cervisiae de Levadura" en Plásmidos de Importancia Médica, Ambiental y Comercial (Editores .N. Timmis y A. Puhler) , 1979; Mercerau-Puigalon y otros, Gene 11:163 (1980); Panthier y otros, Curr. Gent, 2:109 (1980)).

Muchos promotores mamíferos son conocidos en el arte los cuales pueden ser usados en conjunción con el cásete de expresión de la invención. Los promotores mamíferos frecuentemente tienen una región de iniciación de trascripción la cual es usualmente colocada cerca del extremo 5' de la secuencia de codificación, y una caja TATA, usualmente localizada a 25-30 pares bases (bp) hacia arriba del sitio de iniciación de trascripción. La caja TATA es pensada que se dirige la polimeriza ANR II para comenzar la síntesis ARN en el sitio correcto.- Un promotor mamífero también puede contener un elemento promotor hacia arriba, usualmente localizado dentro de 100 a 200 pares base hacia arriba de la caja TATA. Un elemento promotor corriente arriba determina la taza la cual la trascripción es iniciada y puede actuar en cualquier orientación (Sambrook y otros, "Expresión de Genes Clonados en Células de Mamífero", en: Clonación Molecular, un Manual de Laboratorio, Segunda Edición, 1989) .

Los genes virales de mamífero son frecuentemente altamente expresados y tienen un rango anfitrión amplio; por tanto las secuencias codificando genes virales mamíferos frecuentemente proporcionan secuencias promotoras útiles. Los ejemplos incluyen el promotor inicial SV40, el promotor LTR de virus de tumor de mamífero ratón, el promotor tardío principal adenovirus (Ad MLP) , y el promotor de virus simple de herpes. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tal como el gel de metalotioneina de ratón, también proporciona secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser cualquier constitutiva o regulada.

Un promotor de mamífero también puede ser asociado con un mej orador. La presencia de un mej orador usualmente aumentará la trascripción de un promotor asociado. Un mej orador es una secuencia ADN reguladora que puede estimular la trascripción hasta 1000 veces cuando se enlaza a homólogos o promotores heterólogos, con la síntesis comenzando en el sitio de inicio ARN. Los mejoradotes son activos cuando estos son colocados hacia arriba o hacia abajo del sitio de iniciación de trascripción en una orientación normal o volteada, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos del promotor. (Maniatis y otros, Ciencia 236:1237 (1987); Alberts y otros, Biología Molecular de la Célula, Segunda Edición 1989) ) . Los elementos mejoradotes derivados de virases son frecuentemente algunas veces útiles, debido a que éstos usualmente tienen un rango anfitrión amplio. Los ejemplos incluyen el me orador de gen inicial SV40 (Dijkema y otros, EMBO J., 4:761 (1985) y los promotores/mejoradores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del Virus de Sarcoma Rous (Gorman y otros. Proc . Nati, Acad. Sci, EUA 79:6777 (1982b)) y del Citomegalovirus humano (Boshart y otros, Cell, 41:521 (1985)) . Adicionalmente , algunos mejoradores son regulados y se hacen activos solo en la presencia de un inductor tal como una hormona o ión de metal (Sassone-Corsi y Borelli, Trenes Genet, 2:215 (1986); Maniatis y otros, Ciencia 236:1237 (1987)).

Se entiende que muchos promotores y elementos reguladores asociados pueden ser usados dentro del cásete de expresión de la invención para transcribir un polipéptido codificado. Los promotores descritos anteriormente son proporcionados meramente como ejemplos y no deben ser considerados como una lista completa de promotores que son incluidos dentro del alcance de la invención.

El cásete de expresión de la invención puede contener una secuencia de ácido nucleico para aumentar la eficiencia de traslación de un mARN que codifica un agente de aglutinamiento de la invención. Tal traslación incrementada sirve para aumentar la producción del agente aglutinante. La presencia de un sitio aglutinante ribosoma eficiente es útil para la expresión de gen en procariotes . En el mARN bacterial un estiramiento conservado de seis nucleótidos, la secuencia Shine-Dalgarno, se encuentra esencialmente hacia arriba del codón AUG de inicio. (Shine y otros, Naturaleza 254:34 (19875) ) . Esta secuencia se piensa que promueve el aglutinamiento de ribosoma mARN por el emparejado de base entre el sitio de aglutinamiento de ribosoma y de extremo 3' de Escherichia coli 16S rARN. (Steitz y otros, "Señales Genéticas y Secuencias de Nucleótido en el Mensajero ARN" en la obra Regulación y Desarrollo Biológico: Expresión de Gen (editores R.F. Goldberger) , 1979)). Tal sitio de aglutinamiento de ribosoma o un derivado operable del mismo, es incluido dentro del cásete de expresión de la invención.

Una secuencia de iniciación de traslación puede ser derivada de cualquier gen de Escherichia coli expresado y puede usarse dentro de un cásete de expresión de la invención. Preferiblemente el gen es un gen altamente expresado. Una secuencia de iniciación de traslación puede ser obtenida a través de método recombinantes estándar, técnicas sintéticas, técnicas de purificación, o combinaciones de las mismas las cuales todas son muy conocidas. (Ausubel y otros, Protocolos Actuales en Biología Molecular, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, Nueva York [1989) ; Becaucage and Caruthers, Tetra. Letts., 22:1859 (1981); VanDevanter y otros Ácidos Nucleicos Res. 12:6159 (1984). Alternativamente, las secuencias de inicio de traslación pueden ser obtenidas de numerosos vendedores comerciales. (Operan Technologies; Life Technologies, Inc. de Gaithersburg Maryland) . En una incorporación preferida, es usada la secuencia líder T7. La secuencia líder T7tag es derivada de un T7 gen 10 cistrón altamente expresado. Otros ejemplos de secuencias de iniciación de traslación incluyen, pero no se limitan a la secuencia de inicio de proteína Mal E gene aglutinante maltosa (Guan y otros, Gene, 67:21 (1977)) presente en el vector de expresión pMalc2 (New England Biolabs, Beverly, Massachussets) y la secuencia de iniciación de traslación para los siguientes genes: gen tioredoxin (Novagen, Madison, iscosin) , gen Glutatione-S-transferasa (Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey) , gen ß-galactosidasa, gen cloramfenicol acetiltransferasa y gen E. coli Trp E (Ausubel y otros, 1989, Protocolos Actuales en Biología Molecular, Capítulo 16, Green Publishing Associates y Wiley Interscxence Nueva York) .

El mARN eucariótico mARN no contiene una secuencia Shine-Dalgarno . En vez de esto, la sección del codón de inicio de traslación es usualmente determinada por su proximidad a la tapa en el extremo 5' de un mARN. Los nucleótidos inmediatamente circundantes en el codón de inicio en el mARN eucariótico influencian la eficiencia de la traslación. Por tanto, un experto en el arte puede determinar qué secuencias de ácido nucleico aumentarán la traslación de un polipéptido codificado por el cásete de expresión de la invención. Tales secuencias de ácido nucleico están dentro del alcance de la invención.

Las secuencias de terminación también pueden ser incluidas en los vectores de la invención. Usualmente, las secuencias de terminación de trascripción reconocidas por la bacteria son regiones reguladoras localizadas 3' al codón de tope de traslación, y por tanto junto con el promotor flanquean la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la trascripción de mARN que pueden trasladarse adentro del polipéptido codificado por ADN. Las secuencias de terminación de trascripción frecuentemente incluyen secuencias ADN de alrededor de 50 nucleótidos capaces de formar las estructuras de circuito de vastago que ayudan a terminar la trascripción. Los ejemplos incluyen las secuencias de terminación de trascripción derivadas de genes que promotores fuertes, tal como el gen trp en E. coli asi como otros genes biosintéticos .

Usualmente, la terminación de trascripción y las secuencias de poliadenilación reconocidas por las células mamiferas son regiones reguladoras localizadas 3 ' al codón de tope de traslación y por tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia de codificación. El término 3' de mARN se forma por el desdoblamiento post-de trascripción de sitio específico y poliadenilación (Birnstiel y otros, Célula, 41:349 (1985); Proudfoot y itelaw, "Terminación y Procesamiento de Extremo 3' de ARN eucariótico" , en: Transcripción y División (Editores B.D. Hames y D . M. Glover) 1988; Proudfoot, Trenes Biochem. Sci . , 14:105 (1989)). Estas secuencias dirigen la transcripción de un mARN que puede ser trasladado al polipéptido codificado por ADN. Los ejemplos de las señales de terminador/poliadenilación de trascripción incluyen aquellas derivadas de SV40 (Sambrook y otros, "Expresión de Genes Clonados en Células de Mamífero Cultivadas", en: Clonación Molecular: un Manual de Laboratorio, 1989) .

Las secuencias de terminación de trascripción reconocidas para levadura son regiones reguladores que están usualmente localizadas a 3' al codón de tope de traslación. Los ejemplos de las secuencias de terminador de trascripción que pueden ser usadas como secuencias de terminación en los sistemas de expresión de insectos y levaduras son muy conocidos. (Lopez-Ferber y otros, Métodos Mol. Biología 39:25 (1995); ing y Possee, El sistema de Expresión de baculovirus. Una guía de laboratorio. Chapman y Hall, London, Inglaterra (1992); Gregor y Proudfoot, EMBO J., 17:4771 (1998); O'Reilly y otros, vectores de expresión de Baculovirus: Un Manual de Laboratorio. W.H. Freeman & Company, de Nueva York, (1992) ; Richardson, Crit . Rev. Biochem. Mol. Biol . 28:1 (1993); Zhao y otros, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:405 (1999)).

Como se indicó anteriormente, cualquier vector puede ser utilizado para hacer las bibliotecas de la invención. Los vectores que pueden ser usados incluyen pero no se limitan a aquellos capaces de duplicarse en procariotes y eucariotes . Por ejemplo, los vectores pueden ser usados los cuales son duplicados en bacterias, levaduras, células de insectos y células de mamíferos. Los ejemplos de los vectores incluyen plásmidos, fagémidos, bacteriófagos, virus, cósmicos y factores-F.

La invención incluye cualquier vector en el cual el ácido nucleico construye y bibliotecas de la invención pueden ser insertadas y duplicadas en Vitro o en vivo. Los vectores específicos pueden ser usados para tipos de células específicos. Adicionalmente, los vectores de transporte pueden ser usados para clonar y duplicar en más de un tipo de célula. Tales vectores son conocidos en el arte. Las bibliotecas o construcciones de ácido nucleico pueden ser llevadas extracromosomaliamente dentro de una célula anfitriona o pueden integrarse en un cromosoma de célula anfitriona. Numerosos ejemplos de. vectores son conocidos en el arte y están comercialmente disponibles. (Shambrook y Russell, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Tercera Edición (enero 15 del 2001) , Cold Spring Harbor Laboratory Pres, ISBN: 0879695765; Biolaboratorio de Nueva Inglaterra, Beverly Massachussets ; .Stratagene, La Jolla, California; Promega, Madison, Wisconsin; ATCC, Rockville, Maryland; CLONTECH, Palo Alto, California; Invitrogen, Carlabad, California; Origene, Rockville, Maryland; Sigma, St . Louis, Missouri, Pharmacia, Peapack, Nueva Jersey; USB, Cleveland Ohio) . Estos vectores también proporcionaron muchos promotores y otros elementos reguladores que aquellos expertos en el arte pueden incluir dentro de las construcciones de ácido nucleico de la invención a través del uso de técnicas recombinantes reconocidas .

Un vector para usarse en un anfitrión procariote, tal como una célula bacterial, incluye un sistema de duplicación que le permite el ser mantenido en el anfitrión para la expresión o para la clonación y amplificación. Además, un vector puede estar presente en la célula en ya sea un número de copia alto o bajo. Generalmente, alrededor de 5 a alrededor de 200, y usualmente alrededor de 10 a alrededor de 150 copias de un vector de número de copias alto están presentes dentro de una célula anfitriona. Una célula anfitriona que contiene un vector de número de copia alto preferiblemente contendrá por lo menos alrededor de 10, y más preferiblemente por lo menos alrededor de 20 vectores plásmido. Generalmente, alrededor de 1 a 10 y usualmente alrededor de 1 a 4 copias de un vector de número de copias bajo está presente en una célula anfitriona. El número de copia de un vector puede ser controlado por la sección de diferentes orígenes de duplicación de acuerdo a los métodos conocidos en el arte. Sambrook y Russell, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Tercera Edición, (enero 15 del 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765.

Una construcción de ácido nucleico que contiene un cásete de expresión puede ser integrada en el genoma de una célula anfitriona bacterial a través del uso de un vector integrante. Los vectores integrantes usualmente contienen por lo menos una secuencia que es homologa al cromosoma bacterial que permite al vector el integrar. Las integraciones se piensa que resultan de eventos de recombinación entre homólogos ADN en el vector y en el cromosoma bacterial. Por ejemplo, los vectores integrantes construidos con ADN de varias cepas Bacillus se integran dentro del cromosoma Bacillus (EPO publicación No. 183 328). Los vectores integrantes también pueden contener secuencias de bacteriófago o de trasposón.

Los vectores integrantes y electrocromosomales pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacteriales que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden ser expresados en el anfitrión bacterial y pueden incluir genes que hacen a la bacteria resistente a las drogas, tal como ampicilina, cloroanfenicol , eritromicina, kanamicina (neomicina) , y tetraciclina (Davis y otros, Ann. ev. icrobiol . , 32:469 (1978)). Los marcadores seleccionables pueden también incluir genes biosintéticos, tal como aquellos en las trayectorias de histidina, triptofan, y leucina biosintética .

Numerosos vectores, ya sea vectores extra-cromosomales o integrantes se han desarrollado para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, los vectores se han desarrollado para las siguientes bacterias: B. subtilis (Palva y otros; Proc . Nati, Acad. Sci EUA. , 79:5582 (1982); EPO Publicaciones Nos. 036 259 y 063 953; PCT Publicación No. O 84/04541), E. Coli (Schimatake y otros, Naturaleza, 292:128 (1981); Amann y otros, Gene, 40:183 (1985): Studier y otros J. Mol. Biol. 189:113 (1986); EPO publicaciones No.s 036 776, 136 829 y 136 907)), Streptococcus cremoris (Powell y otros, Ap l . Eriviron. Microbiol, 54:665 (1988)); Streptococcus lividans (Powell y otros Appln. Environ. Microbio, 54:655 (1988)), y Streptomyces Lividans (patente de los Estados Unidos de América número 4,745,056). Numerosos vectores también están comercialmente disponibles (New England Biolabs, Beverly, Massachussets ; Stratagene, La Jolla, California) .

Muchos vectores pueden ser usados para los vectores o bibliotecas de expresión de la invención que proporcionan la selección de expresión de agentes aglutinantes en levadura. Tales vectores incluyen, pero no se limitan, a plásmidos y cromosomas artificiales de levadura. Preferiblemente, el vector tiene dos sistemas de duplicación, permitiéndole el mantener por ejemplo en la levadura la expresión y en un anfitrión procariótico para la clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores de lanzadera de bacteria-levadura incluyen YEp24 (Botsein y otros, Gene 8:17 (1979)9, Pci/1 (Brake y otros, Proc . Nati, Acad. Sci EUA 81:4642 (1984)), y YRpl7 (Stinchcomb y otros, J. Mol. Biol . 158 : 157 (1982) ) .

Un vector de expresión también puede ser integrado en el genoma de levador con un vector integrante. Los vectores integrantes usualmente contienen por lo menos un homólogo de secuencia para un cromosoma de levadura que permite al vector el integrarse y preferiblemente contiene dos secuencias de homólogos que flanquean un cásete de expresión de la invención. Las integraciones aparecen que resultan de eventos de recombinación entre los homólogos ADN en el vector y en el cromosoma de la herradura. (Orr-Weaver y otros, Métodos en Enzimol . 101:228 (1983)). Un vector integrante puede ser dirigido a un lugar específico a la levadura mediante el seleccionar la secuencia de homólogo apropiada para la inclusión en el vector, uno o más casetes expresión pueden integrarse, los cuales pueden afectar el nivel de proteína recombinante producida (Riñe y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80:6750 (1983)). Las secuencias cromosomales incluidas en el vector pueden ocurrir ya sea con un segmento único en el vector, lo cual resulta en la integración del vector completo o dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y flanquear un cásete de expresión incluido en el vector el cual puede resultar en la integración estable de solo el cásete de expresión.

Los vectores de expresión extracromosomales e integrantes pueden contener marcadores selecciónateles que permiten la selección de cepas de levadura que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir, pero no se limitan a genes biosintéticos que pueden ser expresados en el anfitrión de levadura, tal como ADE2 , HIS4 , LEU2 , TRPl y ALG7 y el gen de resistencia G418 el cual confiere resistencia en la células de levadura a tunicamicina y G418, respectivamente. Además, un marcador que puede ser seleccionado también puede proporcionar a la levadura con la habilidad de crecer en la presencia de compuestos tóxicos tal como metal. Por ejemplo la presencia de CUP1 permite a la levadura el crecer en la presencia de iones de cobre (Butt y otros Microbiol. Rev. 51:351 (1987)).

Se han desarrollado muchos vectores para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, se han desarrollado los vectores para las siguientes levaduras : Candida albicans (Kurtz y otros. Mol. Cell. Biol . 6:142 (1986)), Candida maltose (Kunze y otros, J. Basic Microbiol. 25:141 (1985)), Hansenula Polymorpha (Hleeson y otros, J. Gen. Microbiol, 132:3459 (1986); Roggenkamp y otros, Mol. Gen. Genet. 202:302 (1986), kluyveromyces fragilis (Das y otros, J. Bacterial, 158: 1165 (1984)), kluyveromyces lactis (De Louvencourt y otros, J. Bacterial, 154:737 (1983); van den Berg y otros, Bio/technology, 8:135 (1990)), Píchia guillerimondii (Kunze y otros, J. Basic Microbio!.. 25:141 (1985)), Pichia pastoris (Cregg y otros, Mol. Cell. Biol . 5:3376, 1985; Patente de los Estados Unidos de América números 4,837,184 y 4,929,555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen y otros. Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 75:1929 (1978): Ito y otros, J. Bacteriol . 153:163 (1983)), Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Naturaleza, 300:706 (1981)), y Yarrowia lipolytica (Davidow y otros, Curr. Genet . 10:39 (1985); Gaillardin y otros, Curr . Genet . 10 :49 (1985) ) .

Los vectores de baculovirus se han desarrollado para la infección en varias células de insectos y pueden usarse para producir construcciones de ácido nucleico que codifican un polipéptido de agente aglutinante de la invención. Por ejemplo, los baculovirus recombinantes se han desarrollado para Aedes aegypti, Autographa Californica, Bombyx mori, Drosophila melanograster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (PCT Publicación No. WO 89/046699; Carbonell y otros, J. Virol, 56:153 (1985); Wright, Naturaleza, 321:718 (1986); Smith y otros, Mol. Cell. Biol. 3:2156 (1983); y ver generalmente, Fraser y otros, In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225 (1989)). Tal vector de baculovirus puede ser usado para introducir un cásete de expresión en un insecto y proporcionar la expresión de un polipéptido de agente aglutinante dentro de la célula de insecto.

Los métodos para formar un cásete de expresión de la invención insertado en un vector de baculovirus están disponibles en el arte. Brevemente, un cásete de expresión de la invención es insertado en un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacterial que contiene un fragmento del genoma de baculovirus, a través del uso de métodos recombinantes comunes. El plásmido también puede contener una señal de poliadenilación de polihedrina (Millar y otros, Ann. Rev. Microbiol. 42:177 (1988)) y un marcador de selección procariótico, tal como resistencia de ampicilina, y un origina de duplicación para la selección y propagación de Escherichia coli. Un vector de transferencia conveniente para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. Muchos otros vectores conocidos por aquellos expertos en el arte se han diseñado. Tal vector es Pvl985 (Luckow y Summers, Virología, 17:31 (1989)).

Un genoma baculoviral de tipo salvaje y el vector de transferencia teniendo una construcción de ácido nucleico de la invención son transfectados adentro de la célula anfitriona de insecto en donde el vector y el genoma viral de tipo salvaje recombinan. Los método para introducir una construcción de ácido nucleico en un sitio deseado en un virus baculovirus están disponibles en el arte (Summers y Smith, Boletín de la Estación Experimental Agrícola de Texas No. 1555, 1987. Smith y otros Mol. Cell. Biol . 3:2156 (1983); y Luckow y Summers, Virología, 17:31 (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser adentro de un gen tal como un gel de polihedrina mediante recombinación de cruce doble de homólogo; la inserción también puede ser en un sitio de enzima de restricción diseñado en el gen de baculovirus deseado (Millar y otros, Bioessays, 4:91(1989) ) .

El virus recombinante empacado es expresado y las placas recombinantes son identificadas y purificadas . Los materiales y métodos para los baculovirus y los sistemas de expresión de célula de insecto están comercialmente disponibles en forma de estuche (Invitrogen, San Diego, California, E.U.A. ("Estuche MaxBac")). Estas técnicas son generalmente conocidas por los expertos en el arte y están completamente descritas en Summers y Smith, Boletín de la Estación Experimental Agrícola de Texas, número 1555, 1987.

Los sistemas de expresión a base de plásmidos se han desarrollado los cuales pueden ser usados para introducir una construcción de ácido nucleico de la invención en una célula de insecto y producir un polipéptido de agente aglutinante. (McCarroll y King, Cur. Opin. Biotechnol. 8:590 (1997) ) . Estos plásmidos ofrecen una alternativa a la producción de un virus recombinante para la producción de polipéptidos de agente aglutinante .

Una construcción de ácido nucleico, un vector de expresión o una biblioteca de la invención pueden insertarse en cualquier vector de mamífero que son conocidos en el arte o que están comercialmente disponibles. (CLONTECH, Carlsbad, California; Promega, Madison, Wisconsin; Invitrogen, Carlsbad, California) . Tales vectores pueden contener elementos adicionales tales como mej oradores y los intrones que tienen sitios de donante y aceptador de división funcional . Las construcciones de ácido nucleico pueden ser mantenidas extra cromosornalmente o pueden integrarse en el ADN cromosomal de una célula anfitriona. Los vectores de mamíferos incluyen aquellos derivados de virus animales, los cuales requieren vectores de trans-actuación para duplicar. Por ejemplo, los vectores que contienen los sistemas de duplicación de papovavirus, tal como SV40 (Gluzman, Célula, 23:175 (1981)) o polimaviruses , duplican a un número de copia extremadamente alto en la presencia del antígeno T viral apropiado. Los ejemplos adicionales de los vectores de mamífero incluyen aquellos derivados de papilomavirus bovino y de virus Epstein-Barr . Adicionalmente, el vector puede tener dos sistemas de duplicación, permitiendo por tanto que sea mantenido, por ejemplo, en células de mamífero para la expresión y en anfitrión procariótico para clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores de lanzadera de bacteria-mamífero incluyen pMT2 (Kaufman y otros Mol. Célula. Bíol . 9:946 (1989)) y Phebo (Shimizu y otros, Mol. Célula Biol. 6:1074 (1986)).

La invención está también dirigida a células que contienen una biblioteca de la invención, un vector de expresión o un ácido nucleico de la invención. Tales células pueden ser usadas para la expresión de un polipéptido de agente aglutinante. Tales células también pueden ser usadas para la amplificación de las construcciones de ácido nucleico. Muchas células son adecuadas para la amplificación de construcciones de ácido nucleico y para la expresión de polipéptidos de agente aglutinante. Estas células pueden ser células procarióticas o eucarióticas .

En muchas incorporaciones, las bacterias son usadas como células anfitrionas. Los ejemplos de las bacterias incluyen, pero no se limitan a organismos Gram-negativo y Gram-positivo. El Escherichia col! es un organismo deseable para analizar bibliotecas, expresar polipéptidos de agentes aglutinante y amplificar las construcciones de ácido nucleico. Muchas cepas E. coli actualmente disponibles incluyen cepas tales como MM294 (ATCC 31, 466); X1776 (ATCC 31, 537); KS 772 (ATCC 53, 635); JM109; MC1061; HMS174; y el B-Strain BL21. Las cepas menos recombinación pueden usarse para la amplificación de construcción de ácido nucleico para evitar eventos de recombinación. Tales eventos de recombinación pueden remover con catámeros de cuadros de lectura abiertos así como provocar la inactivación de una construcción de ácido nucleico. Además, las cepas bacteriales que no expresan una proteasa seleccionada también pueden ser útiles para la expresión de los polipéptidos de agente aglutinante para reducir el procesamiento proteolítico de los polipéptidos expresados. Un ejemplo de tal tensión es Y1090hsdR que es deficiente en la proteasa Ion.

Las células eucarióticas también pueden ser usadas para producir un polipéptido de agente aglutinante y para amplificar una construcción de ácido nucleico. Las células eucarióticas son útiles para producir un polipéptido de agente aglutinante cuando se desea un procesamiento celular adicional . Por ejemplo, un agente de polipéptido aglutinante puede ser expresado en una célula eucariotica cuando la glicosilacion del polipéptido es deseada. Los ejemplos de las líneas de células eucarióticas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a: AS52, H187, células L de ratón, NIH-3T3, HeLa, Jurkat, CH0-K1, COS-7, BHK-21, A-431, HEK-293, L6 , CV-1, HepG2 , HC11, MDCK, células de gusano de seda, células de mosquito y levadura.

Los métodos para introducir ADN exógeno en las bacterias están disponibles en el arte, y usualmente incluyen ya sea la transformación de las bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tal como cationes divalentes y DMSO. El ADN también puede ser introducido en las células bacteriales por electroporación, el uso de un bacteriófago o transformación balística. Los procesos de transformación usualmente varían con las especies bacteriales que van a ser transformadas (Masson y otros, FEMS icrobiol. Lett . , 60:273 (1989); Palva y otros Proc. Nati, Acad. Sci, EUA 79:5582 (1982); EPO publicaciones números 036 259 y 063 953 ; PCT publicación No. WO 84/04541 [Bacillus] , Millar y otros, Proc. Nati,. Acad. Sci. EUA 8:856 (1988); Wang y otros, J. bacterial. 172: 494 (1990) [Campylohacter , Cohén y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 69:2110 (1973); Dower y otros Nuc . Acids Res. 6:6127 (1988); Rushmer, "ün método mejorado para la transformación de Escherichia coli con plásmidos derivados de ColEl", en: Ingeniería Genética: Procedimientos del Simposio Internacional sobre Ingeniería Genética (Editores H.W. Boyer y S. Nicosia) , 1978; andel y otros J. Mol. Biol . 53:159 (1970=; Tekaeto, Biochim. Biphys. Acta, 949:318 (1988); [Escherichia], Chassy y otros, FEMS Microbiol . Lett . 44:173 (1987); [LactOjbacillus] , Fiedler y otros. Anal. Biochem, 170:38 (1988) [Pseudomonas] , Augustin y otros FEMS Microbio. Lett. 66:203 (1990] [Staphylococcus] , Barany y otros. J. Bacterial. 144:698 (1980), Harlander, "Transformación de Lactis de Streptococcus por electroporación" , en: Genéticas Estreptococales (editores J. Ferreti y R. Curtiss III), 1987; Perry y otros, Infec. Immun. 32:1295 (1981); Po ell y otros. Appl . Environ. Microbiol. 54:655 (1988); Somkuti y otros, Proc . 4th Eur. Cong. Biotechnology 1:412 (1987) [Steptococcus] .

Los métodos para introducir ADN exógeno en los anfitriones de levadura también están disponibles en el arte,, y usualmente incluyen ya sea la transformación de esferoplastos o de células de levadura intactas tratadas con cationes álcali . Los procedimientos de transformación usualmente varían con las especies de levadura que van a ser transformadas ( Kurtz y otros Mol. Célula Biol. 6:142 (1986); Kunze y otros. J. Basic Microbiol 25:141 (1985) [Candida], Gleeson y otros J. Gen Microbiol. 132:3459 (1986); Roggenkamp y otros, Mol. Gen Genet . 202:302 (1986) [Hansenula] , Das y otros J. Bacterial 158:1165 (1984) ; De Louvencourt y otros J. Bacterial. 754:737 (1983); Van de Berg y otros Bio/Technology 8:135 (1990) [Kluyveromyces] , Cregg y otros Mol. Cell Biol. 5:3376 (1985) Kunze y otros, J. Basic Microbiol. 25:141 (1985); patente de los Estados' Unidos de América números 4,837,148 y 4,929,555 [Pichia] Hinnen y otros Proc . Nati. Acad. Sci EÜA 75:1929 (1978); Ito y otros J. Bacterial. 153163 (1983) [Saccharomyces] , Beach y Nurse, Naturaleza 300:706 (1981) [Schizosaccharomyces] , y Davidow y otros Curr. Genet. 10:39- (1985) ; Gaillardin y otros., Curr. Genet. 10:49 (1985 lYarrowia] ) .

Los ADN exógenos son convenientemente introducidos en las células de insecto a través del uso de virus recombinantes , tal como baculovirus descritos aquí.

Los métodos para la introducción de los polinucleótidos heterólogos en las células de mamíferos se conocen en el arte e incluyen la transfección mediada con lípido, la transfección mediada con dextran, la precipitación de fosfato de calcio, la transfección mediada con polibreno, la fusión de protoplast, la electroporación, la encapsulación de-el (los) polinucleótido en liposomas, biollísticos y microinyeccion directa del ADN en los núcleos. La elección del método depende de la célula que está siendo transformada ya que ciertos métodos de transformación son más eficientes con un tipo de célula que otros. (Felgner y otros, Proc . Nati. Acad. Sci, 84:7413 (1987); Felgner y otros J. Biol . Chem 269:2550 (1994); Granham y van der Eb, Virología, 52:456 (1973); Vaheri y Pagano, Virología 27:434 (1965); Neuman y otros EMBO J. 1:841 (1982); Zimmerman Biochem. Biophys . Acta., 694:227 (1982); Sanford y otros Métodos de Enzimol. 217:483 (1993); Hawai y Nishizawa, Mol. Cell. Biol. 4:1172 (1984); Chaney y otros, Somat. Célula Mol. Genet. 12:237 (1986); Aubin y otros Métodos Mol. Biol. 62:319 (1997)). Además, muchos estuches comerciales y reactivos para transacción de células eucarióticas están disponibles .

Después de la transformación o de la transfección del ácido nucleico a una célula, la célula puede ser seleccionada por la presencia del ácido nucleico a través del uso de un marcador seleccionable . Un marcador que puede ser seleccionado es generalmente codificado sobre el ácido nucleico que está siendo introducido en la célula recipiente . Sin embargo, la co-transfección de un marcador que puede ser seleccionado también puede ser usada durante la introducción del ácido nucleico en una célula anfitriona. Los marcadores que pueden ser seleccionados y que pueden ser expresados en la célula anfitriona recipiente pueden incluir, pero no se limitan a genes que hacen a la célula anfitriona recipiente resistente a las drogas tal como actinomicina Cx, actinomicina D, anfotericina, ampicilina, bleomicina, carbenicilina, cloramfenicol , geniticin, gentamicin, higromicina B, monolsulfato de kanamicina, metotrexato, mitomicina C, sulfato de neomicina B, sal sódica de novobiocina, sal sódica G de penicilina, dicloroforuro de puromicina, rifampcina, estreptomicina sulfato, hidrocloruro de tetraciclina y eritromicina (Davies y otros Ann. Rev. Microbiol . 32:469 (1978) ) . Los marcadores que pueden ser seleccionados también pueden incluir genes biosintéticos tal como aquellos en las trayectorias de histidina, triptofan y leucina biosintética . Con la transfección o transformación de una célula anfitriona, la célula es puesta en contacto con un agente de selección apropiado .

Por ejemplo, si una bacteria es transformada con una construcción de ácido nucleico que codifica resistencia a ampicilina, la bacteria transformada puede ser colocada sobre una placa agar que contiene ampicilina. Después, las células en las cuales la construcción de ácido nucleico no fue introducida serán prohibidas de crecer para producir una colonia mientras que las colonias serán formadas por aquellas bacterias que fueron transformadas exitosamente, ün sistema análogo puede ser usado para seleccionar otros tipos de células, incluyendo ambas las células procarióticas y eucarióticas .

Por tanto, la invención está dirigida a métodos para generar y analizar una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante a través de sustitución y manipulación molecular de los vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de agente aglutinante genérico.

Diseño de Computadora de Agentes Aglutinantes La invención también proporciona métodos para identificar polipéptidos de agente aglutinante mediante el escaneo de una biblioteca (virtual) de agentes de aglutinamiento al azar. El método de escaneo de computadora desarrollado es una ruta alterna (o paralela) a los procedimientos de análisis y de construcción y de biblioteca actuales descritos anteriormente.

El método de análisis por computadora generalmente involucra el usar la estructura tridimensional conocida del objetivo (o "antígeno") como un punto de inicio, y ajustar la estructura de objetivo, primero, en un agente aglutinante parental o genérico, y después optimizar progresivamente las secuencias de contacto de circuito, (por ejemplo los aminoácidos funcionales) en el agente aglutinante a fin de maximizar las reacciones de aglutinamiento favorables.

Las bibliotecas de los polipéptidos de agente aglutinante pueden entonces ser generadas por los presentes métodos de análisis por computadora para proporcionar una multitud de agentes aglutinantes que pueden interactuar con una molécula de objetivo que puede ser seleccionada. Los sitios o secuencias específicas dentro de la molécula de objetivo (por ejemplo una zona de búsqueda) pueden ser especificados para la interacción con los polipéptidos de agente aglutinante proporcionados por las bibliotecas.

Un diagrama generalizado del método de análisis por computadora de la invención se proporciona en la figura 10. Un primer paso en el método es el de definir un objetivo molecular 1302. Tal objetivo molecular es una molécula de objetivo con la cual puede interactuar un polipéptido de agente aglutinante. Los circuitos interactivos del aglutinante aglutinarán o interactuarán con la molécula de objetivo. La definición de la molécula de objetivo involucra el meter datos sobre la estructura tridimensional del objetivo, por ejemplo, la organización de espacio y las coordinadas atómicas de cada átomo dentro de la molécula de objetivo que se espera que interactúen con el agente aglutinante.

Un experto en el arte puede seleccionar cualquier proteína de objetivo, carbohidratos o ácido nucleico de interés. Por ejemplo, la proteína de objetivo puede ser un antígeno, un anticuerpo, una enzima, una hormona, un receptor, un ligando, una proteína de aglutinamiento de ADN, una proteína asociada con membrana, o cualquier proteína estructural. Los ejemplos de los sitios de ácido nucleico de objetivo o de entrada a los cuales los polipéptidos de agente aglutinante de la biblioteca pueden aglutinar incluyen promotores, mej oradores, sitios de poliadelinación, intrones, señales de división, señales de terminación, y secuencias líder de translación.

Más bien que definir la estructura completa del objetivo, una zona de búsqueda de objetivo sobre la molécula de objetivo puede ser definida. Tal zona de búsqueda define las propiedades físicas y químicas del sitio con el cual interactuará o se aglutinará el agente aglutinante. Por ejemplo, la zona de búsqueda puede contener las coordinadas x, y y z de todos los átomos en el sitio de interacción seleccionado sobre la molécula de objetivo. Otros parámetros que pueden ser considerados para definir la zona de búsqueda incluyen la carga, la hidroficilidad, la hidrofobicidad, la distancia y orientación de los átomos dentro de la molécula de entrada o de objetivo.

Otro paso en los métodos computarizados de la invención incluyen definir un tamaño para la secuencia de péptido de circuito 1304. Como se describió aquí, los circuitos de péptido pueden tener una variedad de longitudes . Por ejemplo, los péptidos de circuito deseables en la biblioteca pueden ser de una longitud de alrededor de 1 a 40 aminoácidos. En algunas incorporaciones, los péptidos de circuito en la biblioteca pueden ser de alrededor de 2 a alrededor de 30 aminoácidos en longitud. En otras incorporaciones, los péptidos de circuito en la biblioteca pueden ser de alrededor de 2 a alrededor de 20 aminoácidos de longitud. Algunos péptidos de circuito en la biblioteca pueden ser de alrededor de 2 a alrededor de 15 aminoácidos de longitud. Los circuitos de péptido deseables en la biblioteca pueden también ser de desde alrededor de 2 a alrededor de 10 aminoácidos de longitud o alrededor de 2 a alrededor de 9 aminoácidos de longitud. Estos aminoácidos codifican por lo menos un dominio interactivo de circuito que tendrá una afinidad aglutinante y lo específico para una molécula de objetivo. Por tanto, aún cuando una variedad de longitudes de circuito pueden ser usadas, el tamaño seleccionado no debe afectar adversamente la estabilidad de la estructura de núcleo de barril beta, por ejemplo, como se analizó por los estudios de modelado, o las simulaciones de dinámicas moleculares de rango largo. En una incorporación, la longitud de péptido es de alrededor de la longitud de las secuencias de circuito (i) a (v) , esto es, alrededor de 4 a alrededor de 7 aminoácidos .

Un número de diferentes secuencias de péptido de circuito pueden ser analizadas para la interacción con las regiones ligeramente diferentes sobre la molécula de objetivo. Tal análisis puede hacerse simultáneamente o secuencialmente . En algunas incorporaciones el análisis de diferentes secuencias de circuito se hacen secuencialmente mediante el definir una secuencia optimizada para la primera secuencia de circuito, orientando la molécula de objetivo y el agente aglutinante para permitir una interacción óptima entre la secuencia de circuito definida y la molécula de objetivo y después definiendo la secuencia de aminoácido por otro circuito. En esta manera, la interacción de objetivo y el agente aglutinante se definen más progresivamente y se necesitan llevar a cabo quizás menos interacciones de clasificación.

Cuando se considera la zona de búsqueda de objetivo, un experto en el arte, tomará la estructura tridimensional del agente aglutinante genérico en consideración. Esto se debe a que la colocación de la secuencias de péptido de circuito sobre el objetivo se determinó en una gran extensión por la posición de aquellos circuitos en el agente aglutinante genérico o parental (vea, por ejemplo SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y FIG. 6) . El agente aglutinante genérico parental tiene 134 aminoácidos, con un peso molecular total de 12.8 kDa. La figura 6 ilustra la estructura tridimensional del agente aglutinante parental. La topología global del agente aglutinante es aquella de un emparedado beta (mostrado por las flechas) estabilizado por un enlace de disulfido central (no mostrado) . Los cinco circuitos que proporcionan el sitio aglutinante de estos agentes están mostrados como hilos delgados que conectan las flechas .

Un modelo tridimensional del polipéptido de agente aglutinante genérico fue preparado mediante el tratar la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 38) sobre la columna de carbón alfa tridimensional de un anticuerpo de camélido (estructura ljtt.ent en un Banco de Datos de proteína) usando el programa Swiss odel . El resultado de hilo óptimo fue convertido en una estructura tridimensional que incluyó las posiciones de cadena lateral de aminoácidos usando el programa Pro od. Este modelo inicial fue sometido a una ronda de templado simulado a fin de minimizar los choques de cadena laterales. Varias rondas de optimización de geometría de nivel SYBYL pusieron todos los ángulos dihedrales y las torsiones en una geometría adecuada. Una ronda final de minimización de energía usando un juego de parámetro GROMOS96, sin un campo de reacción, fue empleada. Por tanto, la secuencia de aminoácido que proporciona el agente de aglutinamiento genérico se ha optimizado para proporcionar una conformación de barril beta altamente adecuada.

Un paso adicional que puede ser incluido en el método es para definir una clase de aminoácidos para cada posición en la secuencia de aminoácidos del péptido de circuito 1306. En muchas incorporaciones, un experto en el arte puede seleccionar todos los aminoácidos para por ejemplo, veinte aminoácidos que ocurren naturalmente . Todos los residuos de aminoácido que pueden ser colocados dentro del espacio Ramachandran permisible para examinar el ajuste para las interacciones estérica y química óptimas .

Sin embargo, un experto en el arte también puede escoger el utilizar distintas clases químicas y físicas de aminoácidos de diferentes posiciones dentro de los péptidos de circuito. Por tanto, los aminoácidos que tienen estructuras físicas relacionadas, o que tienen propiedades químicas específicas o que tienen propiedades de solubilidad específicas pueden formar la clase de aminoácidos que es usada en las posiciones especificadas dentro de la secuencia de circuito. Un experto en el arte puede seleccionar cuántas sustituciones de aminoácidos pueden ocurrir en cada posición de los péptidos de circuito. Similarmente, el usuario puede seleccionar cualquier combinación de aminoácidos para colocar una posición dada dentro del péptido o péptidos de circuito.

Por ejemplo, el artesano experto puede seleccionar cualquier clase o tipo de aminoácido que pueda ser colocado en una posición dada. Tal clase de aminoácidos, puede por ejemplo, ser una clase de L-aminoácidos genéticamente codificados, L-aminoácidos no genéticamente codificados que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos, D-enantiómeros de aminoácidos genéticamente codificados, D-enantiómeros de aminoácidos no genéticamente codificados que ocurren naturalmente, o D-aminoácidos sintéticos. Otra clase de aminoácidos incluyen los aminoácidos hidrofílieos , los aminoácidos hidrofóbicos , los aminoácidos de tipo cisteína, los aminoácidos acídicos, los aminoácidos básicos, los aminoácidos polares, los aminoácidos aromáticos, los aminoácidos apolares o los aminoácidos alifáticos. Los ejemplos de tipos y clases de aminoácidos adicionales se proporcionan de aquí en adelante.

En otro paso, cada miembro de la clase de aminoácidos puede ser interactivamente sustituido o colocado en la posición prescrita del péptido de circuito para generar un expediente de biblioteca de salida 1308. Tal expediente de biblioteca de salida contiene una pluralidad de secuencias de péptido de circuito de salida, cada una con una secuencia de péptido distinta. ün paso adicional que puede ser incluido en el método es el de comunicar el expediente de biblioteca de salida a un programa de clasificación molecular 1310. Por tanto, el expediente de biblioteca de salida es usado como una entrada en un programa de clasificación que ajusta cada péptido de circuito a la zona buscada sobre la molécula de objetivo. Los aminoácidos dentro de cada circuito del agente aglutinante genérico son entonces dotados a la estructura molecular de la molécula de objetivo.

El programa de clasificación molecular puede ajustar cada una de la pluralidad de secuencias de péptido de circuito de salida a la zona de objetivo y después crear una calificación de ajuste de molécula de objetivo-circuito aglutinante. Tal calificación de ajuste de molécula de objetivo-circuito aglutinante es una medida de que también interactuará una secuencia de péptido de circuito dada con, aglutinará o ajustará dentro de la zona de búsqueda de una molécula de objetivo. Los circuitos de péptido que tienen una calificación de ajuste de molécula de objetivo-circuito aglutinante generalmente interactuarán, aglutinarán o ajustarán bien, con el sitio escogido en la molécula de objetivo.

En otro paso del método, la pluralidad de secuencias de péptido de circuito de salida puede ser puesta en rangos por la calificación de ajuste de molécula de objetivo-circuito aglutinante 1312. Tal puesta en rango permite una evaluación rápida de cuales péptidos de circuito interactuarán más efectivamente, aglutinaran o ajustarán el sitio escogido en la molécula de objetivo.

Un paso adicional que puede ser incluido en el método es el de exhibir cada una de pluralidad de secuencias de péptido de circuito de salida y la calificación de ajuste de molécula de objetivo-circuito aglutinante asociado 1314. Por lo menos una parte de la pluralidad de las secuencias de péptido de circuito de salida puede interactuar establemente con la molécula de objetivo. Por tanto, un experto en el arte puede escoger listar todas las secuencias de péptido de circuito de salida .

Alternativamente, más bien que listar todas las secuencias de péptido de circuito posibles con sus calificaciones de ajuste asociadas, solo un porcentaje de los péptidos de circuito de calificación superior pueden ser exhibidos. Tal porcentaje es metido antes o durante el análisis. Alternativamente, el programa puede recoger al azar un cierto porcentaje de todas las secuencias de péptido de circuito posible para escribir al expediente de estructura final. La selección de tal porcentaje puede limitar el tamaño del expediente de biblioteca de salida y/o la complejidad de las secuencias de circuito final.

En una incorporación, un programa llamado MKBIND, fue escrito en FORTRAN 77 que puede ser usado para identificar automáticamente las secuencias de aminoácido de circuito que aglutinan a moléculas de objetivo específicas. El código fue compilado para correr bajo LINUX, un racimo de computación de Rocketcalc, LLC Beowulf . La paralización del código resulta en un tiempo de investigación de velocidad significante.

Un esquema de flujo para el flujo de programa general de MKBIND está mostrado en la figura 8. El programa MKBIND comienza a fluir con una definición del agente aglutinante parental 1502 y del objetivo 1512. La información relativa a las estructuras tridimensionales del agente aglutinante parental y de la molécula de objetivo se mete como dos expedientes de datos diferentes . Tal información incluye las coordinadas atómicas de todos los átomos en el agente aglutinante genérico parental ( por ejemplo SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: o SEQ ID NO: 38) y en la molécula de objetivo.

Una zona de investigación específica sobre el objetivo puede ser seleccionada y definida 1514. Tal zona de búsqueda puede ser usada como por ejemplo, cuando un sitio específico o "epitope" es seleccionado para el aglutinamiento, o cuando el objetivo es muy grande de manera que las interacciones aglutinantes son examinadas en solo áreas seleccionadas de objetivo. La zona de búsqueda para la búsqueda de objetivo puede ser manualmente definida por un experto en el arte. En algunas incorporaciones, una parte de la molécula de objetivo es seleccionada mediante el recoger un centro de gravedad que puede ser identificado (o un área estructural identificable tal como una caja o triángulo o coordinada) que puede centrarse sobre una coordinada atómica seleccionada dentro de la molécula de objetivo. En algunas incorporaciones, la profundidad del centro identificable (caja o triángulo) se proyecta alrededor de 1Á a alrededor de 5Á (o alrededor de 3Á) de la superficie promedio en el centro a alrededor de la misma distancia abajo del nivel (para obtener las ranuras más profundas) . Un área de búsqueda típica puede ser por ejemplo de alrededor de 20Á x 20Á x 6Á.

Los parámetros de clasificación u otros criterios 1516 son entonces metidos, incluyendo tales variables como la elección del campo de fuerza, las restricciones electrostáticas, claudicación de rejilla, el espaciamiento de rejilla, los criterios de cortes energéticos y similares. Los parámetros de clasificación con la definición de objetivo y/o la zona de búsqueda constituyen un expediente de objetivo de salida.

Las estructuras de circuito en el agente aglutinante son inicialmente indefinidas. El usuario también meterá el número de circuitos para poner al azar simultáneamente 1504, esto es, un usuario puede recoger cualquiera o todos los circuitos para la búsqueda. Las clases de aminoácidos u otras restricciones de aminoácidos 1506 son recolectadas por los circuitos que van a ser buscados. Todos los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente pueden ser buscados en cada posición, o un subjuego de aminoácidos (por ejemplo aminoácidos hidrofóbicos) pueden ser buscados en posiciones seleccionadas.

Una vez que los aminoácidos de circuitos son definidos, el programa crea un expediente de coordinado atómica de ese circuito. El programa genera todos los expedientes coordinados para todos los circuitos del tamaño y del tipo de aminoácidos definidos por el usuario 1508. Por ejemplo, si son escogidos los circuitos degenerados, el programa genera circuitos degenerados que contienen todas las combinaciones de aminoácidos a lo largo de la longitud completa del circuito o circuitos. El programa también puede aplicar una transformación de coordinada simple para anclar el nuevo circuito en la estructura de agente aglutinante. El programa también define en donde los extremos de los circuitos requieren estar en la estructura parental . Por tanto, cada miembro de las clases definidas de aminoácidos es substituido en cada posición de cada circuito 1508 para generar un expediente de salida de agente aglutinante el cual comprende una serie de expedientes que contienen coordinadas estructurales para todos los agentes aglutinantes posibles con todas las secuencias de circuito posibles .

El expediente de salida de agente aglutinante y el expediente de objetivo de salidas son entonces comunicados al programa de clasificación 1510, 1518. El expediente de salida de agente aglutinante 1510 puede ser un expediente de coordinada atómico regular. El expediente de objetivo de salida 1518 puede ser un expediente que define las coordinadas atómicas de los residuos de aminoácido en el área de rejilla, así como las coordinadas xyz de la rejilla misma. Todas las estructuras tridimensionales son usadas por MKBIND como expedientes de coordinada atómica. Tales estructuras tridimensionales miden las distancias de unión y energías entre los circuitos (i a v) y las cadenas laterales de aminoácido en la región de rejilla definida.

El programa de clasificación molecular clasifica cada agente aglutinante con el objetivo usando un algoritmo de clasificación flexible 1520. El programa hace girar y traslada las coordinadas del agente aglutinante con respecto a las coordinadas fijas de la molécula de objetivo, cambiando por tanto las coordinadas tridimensionales del agente aglutinante al ser este girado alrededor del centro de la masa del agente de objetivo y traslada estas coordinadas a lo largo de un eje en un tiempo.

Por tanto, después de que son generados los circuitos aglutinantes, la estructura resultante es colocada en el centro geométrico de la rejilla de búsqueda. Funcionalmente esto significa que la superficie aglutinante-circuito del agente aglutinante esta centrada dentro del volumen de la rejilla coordinada de la molécula de objetivo. El agente aglutinante es entonces movido hacia la superficie de objetivo (aún dentro de la rejilla) a lo largo de un eje en intervalos 0.1A y es calculada una calificación de ajuste. La estructura es entonces movida por otro 0.1A. Si la calificación de ajuste ha mejorado por tal movimiento, el agente aglutinante es movido adicionalmente hasta que la calificación se hace peor. En este punto esta es movida afuera por 0.1A (a la última calificación mejor) y entonces se mueve hacia arriba en la misma manera, después hacia abajo, y después a la izquierda y a la derecha. Todos esos movimientos y recolocaciones de posiciones, resultan en la "localización óptima para el ajuste" .

Una calificación de clasificación o calificación de ajuste para cada variante de agente aglutinante es entonces computada en 1522. La calificación es el valor negativo de la energía intermolecular no unida entre el aglutinante y el objetivo. Por ejemplo, la calificación de ajuste puede ser calculada como se describe abajo: Calificación de ajuste= [Eeiect+EVdw+EHB] en donde Eeiect es la energía electrostática, Eváw es el término Van der Waals y EHB es la energía de unión de hidrógeno. Esta función de energía empírica es un resumen de estos tres términos de energía individuales .

Una buena calificación de ajuste es un número no cero positivo y puede, por ejemplo, ser la calificación de ajuste más alta. Si el ajuste es una calificación alta o superior 1524, las secuencias de circuito y el expediente de coordinada variante de agente aglutinante son guardados 1528. Si el ajuste es pobre, las secuencias de circuito y el expediente de coordinada variante de agente aglutinante son descartados 1526. Las secuencias N superiores constituyen una salida que puede además ser analizada si el usuario así lo escoge . Esta secuencia de operaciones ?µ??e por tanto ser repetida hasta que todas las acciones al azar solicitadas son completadas o un número definido de usuario de ajustes es alcanzado 1530.

Una vez que el mejor ajuste es encontrado se escribe el expediente de coordinada aglutinante. Las coordinadas son transformadas para reflejar las coordinadas atómicas de objetivo de manera que el usuario pueda jalar el objetivo y el aglutinante sobre la pantalla y ver. (e inspeccionar) el ajuste. Sin más de un circuito es buscado, un segundo expediente es listado el cual proporciona la secuencia de aminoácidos de los diferentes circuitos y de la calificación de ajuste asociada. Esto permite a un experto en el arte el hacer un análisis de secuencia primario para ver que tipo de aminoácidos son favorecidos en ciertas posiciones. Esta información puede ser usada para ayudar a constreñir la cantidad de búsqueda de fuerza bruta llevada a cabo. Por tanto, por ejemplo, si una cisterna es encontrada frecuentemente en la posición tres del circuito (i) un experto en el arte puede fijar la cisteína en la posición tres al inicio del programa KBIND .

A fin de ahorrar el espacio de disco, las secuencias de circuito óptimas pueden ser generadas una a la vez de manera que las secuencias de circuito optimizadas sean insertadas en el agente aglutinante parental antes del archivo de las secuencias del circuito no optimizadas. Una función de calificación que mide la robustez del ajuste puede ser implementada . Los expedientes coordinados pueden ser guardados si estos fueran el ajuste de calificación superior o el ajuste de calificación alta. Todas las secuencias de circuito de calificación alta pueden ser proporcionadas como salida para el análisis fuera de línea (por ejemplo alineación) .

Las funciones o algoritmos descritos aguí son implementados en el software o, en una incorporación, en una combinación de software y procedimientos implementados por el humano. El software comprende instrucciones que pueden ejecutarse por computadora almacenada sobre unos medios leíbles por computadora tal como una memoria u otros tipos de dispositivos de almacenamiento. El término "medios que pueden ser leídos por computadora" también se usa para representar ondas portadoras sobre las cuales el software es transmitido . Además, tales funciones corresponden a módulos, los cuales son software, hardware, firmware o cualquier otra combinación de los mismos. Las funciones múltiples son llevadas a cabo en uno o más módulos como se desee, y las incorporaciones descritas son meramente ejemplos. El software es ejecutado sobre un procesador de señal digital, ASIC, un microprocesador, u otro tipo de procesador que opera sobre un sistema de computadora, tal como una computadora personal, un servidor u otro sistema de computadora .

En otra incorporación, la invención también se refiere a un sistema para crear un agente aglutinante con diferentes secuencias de péptido de circuito (vea la figura 11). Tal sistema puede incluir el procesador 1104. Una memoria 1102 y/o un exhibidor 1106 pueden estar acoplados al procesador. El sistema también puede incluir una realización de componente de secuencia de péptido de circuito 1108 capaz de ejecutar sobre el procesador para generar las secuencias de péptido. El sistema también puede incluir un componente de archivo molecular 1110 capaz de ejecutar sobre el procesador para ajustar el agente aglutinante o las estructuras de circuito juntas con las estructuras de objetivo. El sistema también puede incluir un componente de secuencia de péptido de circuito de salida 1112 capaz de ejecutar sobre el procesador para exhibir las secuencias de péptido de circuito. Otros componentes también pueden ser incluidos tal como el componente de agente aglutinante de salida 1114 capaz de ejecutar sobre el procesador para exhibir las secuencias de agente aglutinante, particularmente las secuencias de agente aglutinante de calificación superior.

Un procesador tal como un microprocesador en una computadora personal (PC) es el circuito lógico que responde y procesa las instrucciones básicas que impulsan un dispositivo de computación. Los dispositivos de computación incluyen las computadoras personales, las laptops, las computadoras de propósitos generales y similares . Una memoria es el lugar de retención electrónica para las instrucciones y datos accesibles a un dispositivo de computación. Durante la operación normal, la memoria usualmente contiene un sistema de operación, programas de aplicación y datos . Las clases de memoria incluyen la memoria de acceso al azar (RAM) memoria de solo leer (ROM) memoria programable (PROM) y memoria de solo leer programable y que puede ser borrada (EPROM) así como todos los dispositivos de almacenamiento tal como discos duros y suaves, ün exhibidor es un mecanismo de salida de computadora que muestra el texto y frecuentemente imágenes gráficas al usuario de la computadora. Los ejemplos de los exhibidores incluyen impresoras, monitores y similares.

En otra incorporación la invención está dirigida a un medio accesible por máquina, que tiene un contenido asociado capaz de dirigir la máquina para llevar a cabo un método. El método puede ser uno de los métodos descritos arriba, por ejemplo, uno de los métodos ilustrados en la figura 8 o en la figura 10 que son además descritos anteriormente.

El programa MKBIND descrito anteriormente se ha usado para construir un agente aglutinante novedoso que es capaz de aglutinar a la tripsina bovina. Las estructuras tridimensionales de inicio de un agente de aglutinamiento parental genérico (secuencia ID No . 38, vea la figura 12) y la tripsina bovina (código PDB 1 auj.ent) fueron usados como entrada. El método de análisis por computadora identifico un agente aglutinante de variante de circuito de calificación superior que tiene una secuencia de circuito i de ITAVCHK (secuencia ID No. 35). ün polipéptido de agente aglutinante actual fue construido mediante el insertar esta secuencia i en el agente aglutinante parental . El agente aglutinante variante fue entonces expresado y purificado. Este agente aglutinante modificado fue probado y se encontró que tuvo afinidad para la molécula de objetivo (tripsina bovina) .

Por tanto el fragmento de anticuerpo de dominio único de camello se a modulado y mejorado usando la muta génesis dirigida de sitio para crear un agente aglutinante genérico que puede ser fácilmente además adaptado para generar el agente aglutinante con una afinidad alta para las moléculas de objetivo específicas. Los métodos de análisis de la invención permiten a los trabajadores el aumentar la afinidad, para alterar lo específico, o para modificar las características biofísicas de los agentes aglutinantes que son producidas a través de las técnicas ADN recombinantes modernas . Los métodos de análisis de la invención también permiten un análisis rápido y eficiente de objetivo ("antígeno") para encontrar el mejor agente aglutinante para una variedad de objetivos, incluyendo tales objetivos tóxicos como ántrax, botulismo, toxina, ricina y otros agentes que son peligrosos de manej ar .

El comportamiento de los agentes aglutinantes obtenido por la manipulación molecular y los métodos mediados por computadora pueden además ser evaluados por métodos disponibles para un experto en el arte. Por ejemplo, los agentes aglutinantes obtenidos por los métodos de la invención pueden ser evaluados respecto de la estabilidad, afinidad y aglutinamiento y otras propiedades. La habilidad de los agentes aglutinantes para aglutinar a uno o más objetivos seleccionados, o para no aglutinar a componentes puede estar presente en el ensayo de aglutinamiento, puede evaluarse por pruebas estándar para interacciones de aglutinamiento. Por ejemplo, las interacciones de aglutinamiento pueden ser detectadas y evaluadas por cromatografía de gel de no-desnaturalización; mediante electroforesis de gel de poliacrilamida no desnaturalizante, mediante calorimetría de desdoblamiento isotérmico (ITC) o mediante adaptación de cualquier procedimiento de inmunoensayo disponible. Tales procedimientos de inmunoensayo están además descritos abajo.

Métodos de uso La presente invención también se refiere a métodos y ensayos de diagnóstico, ambos cuantitativos y cualitativos para usar los agentes aglutinantes descritos aquí. De acuerdo a la invención, los agentes aglutinantes pueden ser usados en un procedimiento o ensayo que es llevado actualmente usando anticuerpos mediante el emplear los presentes agentes aglutinantes en vez de los anticuerpos. Los agentes aglutinantes también pueden ser modificados para incluir una molécula reportero u otra molécula que puede facilitar el empleo de los agentes aglutinantes en tales procedimientos o ensayos .

Los agentes aglutinantes de la invención pueden ser usados para aglutinar, detectar o identificar cualquier objetivo. Tal objetivo es una molécula que puede ser caracterizada como un antígeno o un epitope antigénico. Por tanto, los objetivos pueden ser proteínas, péptidos, carbohidratos, lipoproteínas , proteoglicans, enzimas, hormonas, antígenos de mamífero, antígenos bacteriales, antígenos fungoideos o antígenos virales. Los objetivos bacteriales, fungoideos o virales incluyen esencialmente cualquier parásito u organismo de célula única esto es de interés para un experto en el arte. Tales organismos incluyen bacterias, hongos, cepas de levadura u otros organismos de célula única tal como, por ejemplo, los antígenos de virus de inmunodeficiencia humana (SIDA) , antígenos de virus de hepatitis (HCV, HBV, HAV) , antígenos del virus de Ébola, antígenos de virus de influenza, antxgenos de Toxoplasmosis gondii, antígenos de Cytomegalovirus, antígenos de Helicobacter pylori, antígenos de rubéola y similares.

Los objetivos están generalmente en solución o pueden ser colocados en solución antes del uso con los agentes aglutinantes presentes. Cuando es usada una preparación específica de agentes aglutinantes, el objetivo no quiere estar en la forma de solución pura. En vez de esto, el objetivo puede ser impuro y el agente aglutinante puede ser usado para detectar o aislar el objetivo.

Los agentes aglutinantes de la invención pueden ser usados para detectar o aislar un objetivo en cualquier muestra conveniente que se sospecha de contener el objetivo. Tales muestras incluyen las muestras clínicas, fluidos biológicos, muestras de tejido (que son, por ejemplo homogenizadas) y similares. Las muestran pueden incluir aceite, agua, aire, y otros materiales obtenidos del ambiente. Las proteínas bacteriales, proteínas virales, los tejidos de plantas, los tejidos animales, los fluidos animales y similares también pueden ser utilizados como muestras que ' van a ser aprobadas o usadas con los agentes aglutinantes de la invención. Las muestras también incluyen muestras biológicas tales como células, sangre, plasma, suero, orina, moco, tejido, homogenatos de tejido o celular y similares.

En algunas incorporaciones, la muestra puede ser diluida antes de la prueba o exposición al agente aglutinante. La dilución puede proceder por la adición de cualquier fluido compatible con cada una de las muestras que va a ser probada y los agentes aglutinantes que van a ser usados. El suero, cuando se usa como la muestra, puede, por ejemplo, ser diluido con uno o más fluidos seleccionados del grupo que consiste de agua salada amortiguada con fosfato, pH de 7.0-7.4 (de aquí en adelante "PBS"), PBS- que contiene TWEEN 20™ (de aquí en adelante "PBS T") ; PBS T con timerosal (de aquí en adelante "PBS TT"), PBS TT o gelatina (de aquí en adelante "PBS TTG" ) y PBS TTG con globulina gama bovina (de aquí en adelante "PBS TTGG" ) · Las diluciones pueden variar como sea necesario, por ejemplo, de desde alrededor de 1:10 a alrededor de 1:10,000.

Los agentes aglutinantes de la invención pueden ser usados en cualquier procedimiento de inmunoensayo conocido por un experto en el arte. Por ejemplo, tales inmunoensayos pueden incluir uno, dos o aún tres de los presentes agentes aglutinantes . Los inmunoensayos pueden ser llevados a cabo en solución o sobre un sustrato, por ejemplo, en donde el agente aglutinante o el objetivo está unido a una superficie sólida. Los ejemplos de los inmunoensayos que pueden ser adaptados para usarse con los presentes agentes aglutinantes incluyen los ensayos ELISA, los ensayos de resonancia de plásmido de superficie, los radio inmunoensayos, los ensayos inmunohistoquímicos y similares .

Los pares apropiados de agentes aglutinantes para ensayos de emparedado pueden ser seleccionados de entre las varias preparaciones de agente aglutinante de la invención. Tales pares de agente aglutinante comprenden un primer agente aglutinante de alta afinidad y un segundo agente aglutinante de alta afinidad. En los ensayos de emparedado "en secuencia", un agente aglutinante inmovilizado puede ser usado para aglutinar el objetivo, las partes no unidas de la muestra de prueba son removidas, el objetivo unido es usado para adsorber un segundo agente aglutinante, y el material unido y no unido es entonces separado. La cantidad del segundo agente aglutinante unido es directamente proporcional a la cantidad del objetivo en la muestra de prueba. Los agentes aglutinantes de la invención no requieren ser usados solo "en ensayos de emparedado de secuencia", - estos pueden ser usados ventajosamente en ensayos de emparedados simultáneos que requieren pocos pasos y poco o ningún lavado durante el procedimiento de detección. En un ensayo de emparedado "simultaneo" la muestra de prueba no es removida antes de agregar el segundo agente aglutinante .

En una incorporación, es usado un sistema sensor de base de resonancia (SPR) plasmón de superficie. El SPR es una herramienta útil para medir las interacciones entre dos o más moléculas en tiempo real sin el uso de ningunas etiquetas de detección. Vea McDonnell, J.M. (2001) "resonancia de plasmón de superficie hacia un entendimiento de los mecanismos de reconocimiento molecular biológico" Curr. Opin. Chem. Biol . , 5,572-577.

La tecnología SPR está basada sobre un fenómeno óptico, en donde la respuesta depende de un cambio en el índice refractivo en la vecindad cercana de la superficie del chip sensor empleado y la respuesta es proporcional a la masa de analito unido a la superficie. El SPR es capaz de analizar continuamente cada paso de interacción mientras que otros métodos pueden no solo permitir el análisis de los resultados hasta que se ha completado el paso final . La tecnología de flujo continuo puede por tanto ser utilizada con un sistema de vigilancia continua ofrecido por el SPR.

En general, el SPR es usado como sigue. Una preparación de agente aglutinante seleccionada es inmovilizada sobre la superficie del sensor (sustrato) y entonces el agente aglutinante inmovilizado es puesto en contacto con una solución de prueba que puede contener un objetivo al cual el agente aglutinante puede aglutinar. Esta solución de prueba fluye continuamente sobre la superficie del sensor. La reacción aglutinante entre el agente aglutinante inmovilizado y el objetivo puede ser detectada sin la adición de ningunos reactivos adicionales . Un segundo agente aglutinante que es reactivo con el objetivo puede usarse para la detección de un primer complejo formado entre el agente aglutinante inmovilizado y cualquier objetivo en la solución de prueba. La respuesta o señal SPR aumenta al aglutinar más complejos de agente aglutinante-obj etíyo o de agente aglutinante, de objetivo de la solución aglutinan al agente aglutinante inmovilizado sobre la superficie del sensor. La reacción aglutinante puede ser detectada, por e emplo con un instrumento SPR de Biacore .

El ángulo SPR es sensible a la composición de la capa en la superficie de oro del chip biosensor. Una respuesta SPR de línea de base es por tanto determinada primero mediante el correr un amortiguador sobre la superficie del chip de agente inmovilizado y aglutinante. El aglutinamiento del objetivo a uno de los dos agentes aglutinantes provoca un aumento en el Indice refractivo en la superficie, cambiando por tanto el ángulo SPR debido a que este es directamente proporcional a la cantidad de material unido. Las afinidades de interés son usualmente muy fuertes en sistemas biológicos, los objetivos con pesos moleculares mayores de 200 daltons pueden ser usados para detectar muy exactamente. Generalmente, el SPR es una técnica sensible que requiere tamaños de muestra más pequeños y menos tiempo de corrida que muchas otras técnicas.

El SPR también permite la vigilancia de ambas fases de asociación de de disasociación durante las interacciones de objetivo-agente aglutinante ( yszka, 1997; Ohlson y otros 1997) . ün sensograma típico consiste de una señal de línea de base (sin cambio en las unidades de respuesta (RU) con el tiempo) y una fase de asociación después de la inyección de muestra, la cual produce un aumento en las unidades de respuesta con el tiempo. Si las tasas de reacción son suficientemente rápidas, es posible alcanzar un nivel de estado estable, en donde las tasas de asociación y de disasociación son iguales. El flujo de amortiguador resumido hace que el complejo disasocie, y las cinéticas de disasociación pueden ser registradas. Por tanto, ambas cinéticas de asociación y de disasociación pueden ser medidas. En un momento deseado, una solución de regeneración puede ser inyectada para remover las moléculas y objetivo que se encuentran en la superficie, y el valor de unidad de respuesta original es reestablecido .

Varias preparaciones de agente aglutinante candidato con una afinidad buena a excelente o alta para el objetivo son por tanto seleccionadas para usarse con los inmúnoensayos SPR. De entre el grupo de estas preparaciones de agente aglutinante de alta afinidad, por lo menos una preparación de agente aglutinante de alta afinidad es seleccionada para la inmovilización a un sustrato adecuado.

Las preparaciones de agente aglutinante seleccionadas son inmovilizadas sobre un sustrato adecuado por cualquier método disponible para un experto en el arte. El agente aglutinante puede ser enlazado directamente a un grupo funcional seleccionado sobre el sustrato. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser enlazados indirectamente al substrato a través de un enlazador o espaciador.

Por ejemplo, el agente aglutinante seleccionado puede ser inmovilizado a través del enlace a estreptavidina (o biotina) y después sujetarse al sustrato con una biotina (o estreptavidina) que es covalentemente enlazada al sustrato. Alternativamente, .unas capas múltiples de películas delgadas de estreptavidina-biotina pueden usarse con un sustrato SPR apropiado. Una película delgada de oro puede ser evaporada sobre el sustrato, y una capa de biotina puede ser inmovilizada sobre la película. Una monocapa de estreptavidina es entonces inmovilizada sobre la superficie de oro biotinilatada . La estreptavidina es una proteína tetravalente obtenida de Streptomyces avidinii que posee cuatro sitios de aglutinamiento-biotina arreglados en pares sobre caras opuestas de la molécula. Una vez que la película de estreptavidina aglutina a la superficie de oro biotinilatada, esta puede ser usada como una molécula enlazable para aglutinar a un agente de aglutinamiento biotinilatado . Vea Morgan H. y D.M. Taylor, "Un inmunosensor de resonancia de plasmón de superficie basado sobre complejo de estreptavidina-biotina" Biosens y Biolelect, 7, (1992), páginas 405-410; Taylor, D.M. y otros "Caracterización de monocapas Quimoabsorbidas por las mediciones potenciales de superficie" J. Phys, D:Appl. Phys . , 124, (1991), páginas 443-450.

Alternativamente, un silano thiol-terminal es usado para recubrir la superficie del sustrato, y un entrecruzador heterobifuncional , N-gama-maleimidobutiriloxi succinamida éster (GMBS) es usado para la sujeción de proteína. El silano thiol-terminal puede ser mercaptopropil trimetoxisilano (MTS) . El GMBS reacciona al final con los grupos thiol presentes en el recubrimiento silano, y el otro extremo con los grupos amino terminales del agente aglutinante . Vea la patente de los Estados Unidos de América Nos. 5,077.210. Con este método, los agentes aglutinantes pueden ser inmovilizados a una densidad alta (por ejemplo 2 ng/mm2) . La cantidad de aglutinamiento no específico al sustrato puede ser reducida a 2 a 5 % del aglutinante total por la adición de agentes de bloqueo (BSA, ovalbumina, azucares, dextran, etc.) Con este antecedente bajo, el aglutinante de objetivo puede ser medido o a niveles tan bajos como de 150 femtomoles cuando una concentración de objetivo de tres picomoles/ml es aplicada. Los agentes aglutinantes inmovilizados por este método pueden contener su bioactividad por periodos de tiempo significantes.

Después de la inmovilización del agente aglutinante seleccionado sobre un sustrato adecuado, la reactividad del agente aglutinante inmovilizado con el objetivo puede probarse para asegurar que la afinidad del objetivo-agente aglutinante no se ha afectado adversamente por la inmovilización del agente aglutinante sobre el chip sensor. El SPR requiere pequeñas cantidades de materiales y un chip sensor con un agente aglutinante inmovilizado puede típicamente ser usado por más de 100 ciclos de análisis. La superficie de chip puede ser regenerada con soluciones acídicas o básicas suaves. Varias soluciones de cocktail suaves están disponibles para la regeneración (Anderson 1999) .

Por tanto, la invención está dirigida a agentes aglutinantes que pueden ser usados en ensayos para un objetivo seleccionado. Los agentes aglutinantes pueden ser usados en cualquier tipo de inmunoensayo en donde son empleados comúnmente los anticuerpos .

Estuches La presente invención está dirigida a estuches para generar agentes aglutinantes, los cuales son aplicables para practicar los métodos de la presente invención. El estuche comprende un ácido nucleico que codifica un agente aglutinante parental o un genérico, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un agente aglutinante SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 37, o variantes y derivados de los mismos. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos que comprenden la SEQ ID No : 1 o la SEQ ID NO : 3. En otra incorporación, el estuche puede incluir un vector de expresión que puede codificar los agentes aglutinantes SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4 o SEQ ID NO: 37 o variantes y derivados de los mismos. En otras incorporaciones, el estuche puede incluir una biblioteca de vectores o de oligonucleótidos (por lo menos uno de los oligonucleótidos de la secuencia ID NO. 25-29) que tiene secuencias de circuito al azar. El estuche puede además comprender un juego de instrucciones para generar una biblioteca de agentes aglutinantes que usan los ácidos nucleicos, oligonucleótidos o vectores proporcionados.

En otra incorporación, un estuche de la invención puede contener un medio accesible con máquina que tiene un contenido asociado capaz de dirigir a la máquina para llevar a cabo un método. Tal medio accesible por máquina puede ser un diskette, un disco compacto u otro medio que proporciona un programa de computadora de la invención. El programa proporcionado puede incluir uno de los métodos descritos arriba como por ejemplo, el programa KBIND o uno de los métodos ilustrados en las figuras 8 o 10 que son además descritos arriba. Tal estuche puede además incluir un recipiente con un ácido nucleico un vector de expresión que codifica un agente aglutinante genérico o parental, por ejemplo, un ácido nucleico o vector que codifica las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 0 SEQ ID NO:37; o variantes y derivados de los mismos. El estuche puede incluir oligonucleótidos útiles (por ejemplo 1 o más de los oligonucleótidos de la SEQ ID NO: 25-29) que tienen secuencias de circuito al azar. El estuche puede además incluir instrucciones para correr el programa de computadora o generar una biblioteca.

La invención se describirá en mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, deberá entenderse que la invención no esta limitada a los detalles específicos establecidos en los ejemplos.

EJEMPLO 1: Construcción de agente aglutinante. Modelado molecular: Los estudios de modelado molecular llevados a cabo utilizaron dos programas de visualización, el observador Swiss PDB (de Guex y Peitsch, 1997) y Rasmol (Sayle y Milner-White, 1995) . El trabajo modelo fue llevado a cabo sobre una computadora personal corriendo un Windows 2000, así como una estación de trabajo Octane UNIX de Silicon Grafics Inc. Adicionalmente , el paquete de modelado molecular Cerius2 de Molecular Simulations, Inc., fue utilizado sobre el Octano. Tres expedientes de estructura dimensional fueron bajados de los bancos de datos de proteína como sigue: lbzq.ent, lf2x.ent, lg6v.ent, i3v.ent, ljto.ent, ljtt.ent, ljtp.ent, lkxq.ent, 1 amk.ent, laml.ent, lb9b.ent y lhti.ent.

Estos expedientes fueron usados para analizar la estructura tridimensional de las proteínas, y la naturaleza química y la identificación de aminoácidos conservados y variantes en las regiones de contacto de objetivo y los aminoácidos involucrados en el mantenimiento de estructura secundaria. Esta estructura fue utilizada para diseñar un agente aglutinante de consenso parental que puede ser fácilmente manipulado usando técnicas de ingeniería genética y que servirá (al nivel ADN) como la base de la biblioteca combinatori .

El primer paso fue el comenzar con una secuencia de aminoácidos de longitud completa que fue diseñada de secuencias de camélido conocidas . Una alineación en pares robusta de estas secuencias de aminoácido fue calculada usando el programa CLUSTAL (Higgins y otros 1992) . Una secuencia de consenso fue entonces construida basada sobre esta alineación. Además la información de la estructura de barril beta de triosa isomerasa fue incorporada en la alineación afín de agregar características de esta habilidad al diseño.

El motivo de barril beta es una de las características estructurales secundarias súper más estables conocidas en la estructura de proteína. Este es estabilizado por una serie de uniones de hidrogeno ínter-cepa regulares y de interacciones de paquete de barril internas. Un barril beta es por tanto un punto de inicio ideal para la construcción de agentes aglutinantes monoméricos pequeños .

El tercer paso involucra la construcción de un modelo de homología del nuevo polipéptido. La secuencia de aminoácidos final del agente aglutinante parental fue hilada sobre el indicio de carbón alfa de lj tt . ent usando los programas Pro od y Swiss (Peitsch, 1996; Peitsch y otros 1996) . Este modelo fue entonces sometido a minimización de energía usando un campo de fuerza GROMOS 96 y varias rondas de optimización geométrica de mecánica molecular usando el campo de fuerza SYBYL (Clark y otros 1989) . El modelo minimizado/optimizado final fue entonces analizado para las interacciones de cadena lateral mala y la geometría torsional. Las correcciones al modelo estructural se hicieron, fue apropiado. Los experimentos de minimización de energía adicionales fueron conducidos sobre una computadora de racimo Beowulf de Rocketcalc, LLC.

Las secuencias de aminoácidos de un agente aglutinante genérico se proporciona en la figura 5 con cinco regiones de circuito (i a v) indicadas y también recitadas abajo (SEQ ID NO: 4) . 1 MDVQLQASGG GSVQAGGSLR LSCAASAGAA GAACAGWFRQ 41 APGKEREGVA AINAGAAGTS YADSV GRFT ISQLAGAANV 81 YLLMNSLEPE DTAIYYCAAG HAGAAGAATC GHGLSTAGAA 121 GAPWGQGTQV TVSS Las partes de circuito del agente aglutinante parental (SEQ ID NO: ) tienen residuos de alanina y glicina. En esta manera un agente aglutinante genérico puede ser purificado y estabilizado antes de aglutinar la biblioteca combinatorial .

Diseño, construcción y clonación de ácido nucleico: Para generar un ácido nucleico que codifica el agente aglutinante parental la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 fue trasladada de regreso usando el código genético estándar. La elección de codón estuvo basada sobre el desvió de codón E. coli , significando que el codón final seleccionado para un aminoácido particular fue el codón más frecuentemente usado para el aminoácido en E. coli. Las secuencias flanqueadoras fueron agregadas a fin de facilitar la clonación que llevó la secuencia completa a 423 pp. El gen de estructura de longitud completa para el agente aglutinante parental fue de 405 bp (SEQ ID NO : 3 ) . La secuencia SEQ ID NO : 3 está mostrada en la figura 4 y se proporciona abajo. 1 ACACACCATA TGGACGTCA GCTGCAGGCT TCTGGTGGTG 41 GTTCTGTTCA GGCTGGTGGT TCTCTGCGTC TGTCTTGCGC 81 TGCTAGCGCT GGTGCTGCTG GTGCTGCTTG CGCAGGTTGG 121 TTCCGTCAGG CTCCGGGTAA AGAACGTGAA GGTGTTGCTG 161 CTATTAATGC TGGTGCTGCT GGTACTAGTT ACGCTGACTC 201 TGTTAAAGGT CGTTTCACCA TCTCTCAATT GGCTGGTGCT 241 GCTAACGTTT ACCTGCTGAT GAACTCTCTG GAACCGGAAG 281 ACACCGCTAT CTACTACTGC GCTGCTGGCC ACGCTGGTGC 321 TGCTGGTGCT GCCACGTGCG GTCACGGTCT GAGTACTGCT 361 GGTGCTGCTG GTGCTCCATG GGGTCAGGGT ACCCAGGTTA 401 CCGTTTCTTC TTAGATATCA CAC La secuencia subrayadas en SEQ ID NO:3, arriba denotan el sitio 5'Nde I y la secuencia 3 'Eco RV que se han incorporado en la secuencia ADN a fin de facilitar la clonación. Los codones de iniciación y terminación están en negrillas. Las partes de circuito del ácido nucleico de agente aglutinante SEQ ID NO: 3 se han reemplazado por codones que codifican la alanina y glicina. En esta manera el agente aglutinante progenitor puede ser purificado y la estabilidad estudiada antes de la construcción de la biblioteca combinatorial .

A fin de construir un ácido nucleico que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3, 18 oligonucleotidos entrenzados únicos que se extienden a la región de purificación de SEQ ID NO: completa fueron sintetizados. Los oligonucleotidos fueron usualmente 50 nucleótidos en longitud. Cada oligonucleótido fue complementario a otro oligonucleótido de manera que cuando hibridizó con el socio aglutinante, el segmento resultante contuvo una región dúplex central de treinta pares base y fue flanqueado sobre capa extremo por una región de sepa única de 10 nucleótidos. Las secuencias de oligonucleótido están mostradas en la Tabla 4. Fueron empleados oligonucleotidos más cortos para los extremos (oligonucleotidos 1 y 18 en la Tabla 4) .

Tabla . Oligonucleotidos ADN usados para el Agente Aglutinante Genérico Oligo No. Secuencia SEQ ?> NO: 1 ACACACCATATGGACGTTCAGCTGG 5 · AGGCTTCTGGTGGTG 2 . TGAACAGAACCACCACCAGAAGCC 6 TGCAGCTGAACGTCCATATGGTGTGT Oligo No. Secuencia SEQ ID NO: 3 GTTCTGTTCÁGGCTGGTGGTTCTCTG 7 CGTCTGTCTTGCGCTGCTAGCGCT 4 CAGCAGCACCAGCGCTAGCAGCGCA 8 AGACAGACGCAGAGAACCACCAGCC 5 GGTGGTGCTGCTGGTGCTTGCGCAGG 9 TTGGTTCCGTCAGGCTCCGGGTAA 6 TTCACGTTCTITACCCGGAGCCTGAC 10 GGAACCAACCTGCGCAAGCAGCAC 7 AGAACGTGAAGGTGTTGCTGCTATTA 11 ÁTGCTGGTGCTGCTGGTACTAGTT 8 · GAGTCAGCGTAACTAGTACCAGCAGC 12 ACGAGCATTAATAGCAGCAACACC 9 ACGCTGACTCTGTTAAAGGTCGTTTC 13 ACCATCTCTCAATTGGCTGGTGCT 10 AAACGTAAGAAGCACCAGCCAATTGA 14 GAGATGGTGAAACGACCTTTAACA 11 GCTAACGTTTACCTGCTGATGAACTC 15 TCTGGAACCGGAAGACACCGCTAT 12 GCAGTAGTAGATAGCGGTGTCTTCC 16 GGTTCCAGAGAGTTGATCAGCAGGT 13 CTACTACTGCGCTGCTGGCCACGCT 17 GGTGCTGCTGGTGCTGCCACGTGCG 14 AGACCGTTACCGCACGTGGCAGCAC 18 CAGCAGCACCAGCGTGGCCAGCAGC 15 GTCACGGTCTGAGTACTGGCTGGTGC 19 TGCTGGTGCTCATG 16 ACCCTGACCCCATGAGCACCAGCAGC 20 ACCAGCCAGTACTC 17 GGGTCAGGGTACCCAGGTTACCGTT 21 TCTTCTTAGATATCACAC 18 GTGYGATATCTAAGAAGAAACGGTA 22 Oligo No, Secuencia SEQ ID NO: ACCT-GGGI 19 ACACACCATATGGACGTTCAGC 23 20 GTGTGATATCTAAGAAACGGT 24 La construcción del gen abarcó tres pasos separados .

Primero, 5 µg de cada oligonucleótido y su socio aglutinante complementario fueron mezclados juntos en 10 mM Tris-HCl (pH 7.2), 10 mM NaCl en un volumen final de 10 µ?,. Nueve reacciones de hibridización separadas fueron por tanto colocadas usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos : Oligonucleótidos 1 y 2 (SEQ ID NO: 5 y 6) ; Oligonucleótidos 3 y 4 (SEQ ID NO: 7 y 8); Oligonucleótidos 5 y 6 (SEQ ID NO:9 y 10); Oligonucleótidos 7 y 8 (SEQ ID NO:ll y 12); Oligonucleótidos 9 y 10 (SEQ ID NO:13 y 14); Oligonucleótidos 11 y 12 (SEQ ID N0:15 y 16); Oligonucleótidos 13 y 14 (SEQ ID N0:17 y 18); Oligonucleótidos 15 y 16 (SEQ ID NO : 19 y 20) ; y Oligonucleótidos 17 y 18 (SEQ ID NO: 21 y 22) .

Las mezclas fueron cada una calentadas en un baño de agua a 95° C por 10 minutos. El calor fue apagado, y el baño completo de agua se dejó enfriar a la temperatura ambiente por un período de cinco horas .

Segundo, las partes alícuotas (10 µ]1?) de cada uno de las nueve diferentes reacciones de hibridización de "enfriado lento) fueron mezcladas juntas (volumen final 50 µ]_?) . El tubo fue calentado a 45° C por 10 minutos y después se colocó en un baño de hielo. La ligasa T4 7ADN y al amortiguador (New England Biolabs) fueron agregados al tubo y la reacción (volumen final 60 µ? fue incubada a 16° C por 20 horas.

En tercer lugar, el gen estructural de la longitud completa fue seleccionado de la mezcla de fragmentos usando dos imprimadores PC (Tabla 3, oligonucleótidos 19 y 20 (SEQ ID NO:23 y 24)) que fueron complementarios a los extremos 5' y 3' del gen estructural. Esto aseguró que sólo el producto de gen de longitud completa fuera amplificado. Además, el imprimador de amplificación 3' contuvo un sitio Eco RV a fin de facilitar el clonado. El imprimador de amplificación 5' contuvo un sitio .Nde I . La reacción PCR fue llevada a cabo usando 1 µ?_ de la mezcla de ligación como sigue: 95° C, 1 minuto; 49° C, 1 minuto; 72° C, 30 segundos. Treinta ciclos de éste programa se llevaron a cabo en un dispositivo Techne Progenie PCR. Una incubación de extensión de 10 minutos a 72° C se llevó a cabo después de por lo menos del último ciclo PCR. El producto de reacción PCR fue verificado por electroforesis de gel de agarosa ADN.

El producto de reacción PCR fue entonces purificado con un estuche de limpieza PCR Wizard ADN Promega y fue preparado para clonación. Primero, el fragmento ADN fue tratado con polimerasa T4 ADN en la presencia de ATP a fin de asegurar extremos dúplex completos. Esta reacción se llevó a cabo de acuerdo a las instrucciones de New England Biolabs, Inc. El ADN fue purificado de nuevo usando el estuche de limpieza PCR Wizard ADN Promega. El segundo ADN fue digerido con Nde I y Eco RV y fue purificado por precipitación de etanol . El ADN f e resuspendido en un volumen pequeño de 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA.

El vector de clonación, una forma modificada de pET29a (Invitrogen) en el cual los sitios de vector Fsp I, Ase I, y Acl I fueron removidos, fue digerido con el Nde I y Sma I, y se purificó usando el estuche de limpieza ADN Promega. El digerido produjo un vector lineal que fue compatible con el inserto del fragmento ADN. Esta combinación aseguró una clonación en cuadro direccional del fragmento. El vector y el inserto fueron mezclados en aproximadamente una proporción molar de 1:10 y fueron ligados juntos en la presencia de ligasa T4 ADN a 16° C por 20 horas (volumen de reacción total fue de 20 µ?_) . La bacteria JM109 competente fue transformada con 5 µ?. de la reacción de ligación. Después del crecimiento sobre placas de agarre de ampicilina de LB/60 µg/mL, fueron seleccionadas colonias únicas, y el pl smido fue purificado de las colonias mediante el procedimiento miniprep usando un estuche de aislamiento ADN miniprep Promega. Los plásmidos aislados fueron evaluados mediante electroforesis de gel agarosa ADN, la digestión de endonucleasa de restricción, y finalmente mediante el poner en secuencia ADN. La construcción de plásmido fue designada pBA T2. Esta construcción codificó la base, o parental, agente aglutinante (SEQ ID NO:3).

Los oligonucleótidos al azar que corresponden a las reacciones de circuito fueron sintetizados usando la química de fase sólida estándar. La secuencia de estos oligonucleótidos está mostrada en la Tabla 5.

Tabla 5. Secuencia de oligonucleotidos de circuito degenerado que fueron usados para producir bibliotecas al azar de agentes aglutinantes Las regiones de circuito (i a v) corresponden a las regiones de circuito de las presentes regiones aglutinantes . La Tabla 5 proporcionó la secuencia de los oligonucleotidos usados para generar bibliotecas combinatoriales de agentes aglutinantes, así como sitios de restricción únicos incorporados que flanquean los nucleótidos (n) al azar y facilitan la clonación. La posición y el número de nucleótidos (n) al azar están indicados. Por tanto, el circuito i tiene 21 nucleótidos al azar, el circuito ii tiene 15 nucleótidos al azar, el circuito iii tiene 12 nucleótidos al azar, el circuito iv tiene 21 nucleótidos al azar y el circuito v tiene 18 nucleótidos al azar. Por ejemplo, los oligonucleotidos para el circuito i es una secuencia de 33 nucleótidos con 21 bases al azar central con un sitio Nhe I y el extremo 5' y un sitio Fsp I en el extremo 3' .

Para preparar los oligonucleótidos para inserción en el lector que codifica el agente aglutinante parental, cada uno de los oligonucleótidos SEQ ID NO: 25-29 con sus socios aglutinantes complementarios fueron calentados separadamente en un baño de agua a 95° C por 10 minutos. El calor fue apagado y el baño de agua completo fue dejado enfriar a la temperatura ambiente sobre un período de 3 horas .

Para generar la biblioteca combinatorial al azar, el vector pBART2 fue primero digerido con Nhe I y Fsp I . Este plasmido lineal fue aislado por cromatografía sobre Sephadex G-25 que fue corrido, en 10 m Tris-HCl (pH 7.8). Las fracciones que contienen plásmido fueron estancadas y fueron concentradas a través de Centricon (Amicon, Inc.) . Los oligonucleótidos del circuito i fueron similarmente digeridos y fueron purificados a través de PAGE nativo. Los oligonucleótidos dirigidos y el plásmido fueron mezclados en una proporción molar de 10:1 y fueron ligados durante la noche a 16° C en la presencia de ligasa T4 ADN. La reacción de ligación fue diluida (para bajar la concentración de glicerol de amortiguador ligasa T4 ADN) con 10 mM de Tris-HCl (pH 7.8) . Los oligonucleótidos al azar que corresponden a las regiones de los circuitos ii a v fueron insertados en la pBART2 en secuencias siguiendo el mismo procedimiento. El producto de ligación final fue usado para transformar las células JM109.

Análisis de Biblioteca: La biblioteca combinatorial generada fue amable al análisis robótico. Para preparar para la reacción de análisis de ensayo, las colonias individuales fueron puestas en grupos de 10 y las partes alícuotas en placas de 387 pozos que contuvieron LB que fue complementado con ampicilina (60 µg/mL) . Las células fueron incubadas a 37° C por 10 horas seguido por la inducción de la expresión de polipéptido por 3 horas. Las células fueron Usadas por la adición de agente de extracción BPER, seguido por la neutralización del supernadante . Una parte alícuota de 5 µL de cada pozo fue transferida a una placa fresca. El contenido de proteína de la parte alícuota fue adsorbido en los lados del pozo por evaporación de la solución de pozo con una corriente de aire tibia.

Como una prueba inicial, la tripsina de proteína fue usada como el objetivo al cual el agente aglutinante pudo aglutinar. La tripsina bovina marcada Oregon Green (Molecular Probes, Inc.) en agua salada amortiguada de fosfato (PBS) fue agregada a los pozos y las placas fueron incubadas a 37° C por 1 hora. Los pozos fueron lavados tres veces con PBS. La fluorescencia fue cuantificada usando el lector de placa de microdosificación fluorescente Dynex-MFX. Las longitudes de onda de excitación y de emisión fueron de 485 y 500 nm respectivamente. Un total de 38,700 clones fueron analizados en la corrida inicial .

Los clones estancados que corresponden a los pozos positivos en el primer análisis fueron analizados de nuevo separadamente a fin de identificar la colonia positiva en forma pura. El análisis fue como se describió anteriormente. El ADN de clones positivos fue puesto en secuencia. El polipéptido de los clones positivos fue expresado y purificado como se describió arriba.

Resultados : Los diagramas esquemáticos del clon ADN de agente aglutinante parental y de proteína están mostrados en la figura 1. La secuencia ADN del agente aglutinante parental generalizado está mostrado en la figura 2 y la secuencia de aminoácido generalizado está mostrada en la figura 3. El término generalizado significa que las regiones de circuito no están definidas y pueden ser alteradas para tener cualquier secuencia, como se denota por los nucleótidos "n" en la SEQ ID NO : 3 , y los aminoácidos "Xaa" en la SEQ ID NO: 4.

Para la construcción actual del agente aglutinante parental, los codones alternantes para alanita y glicina fueron insertados en las áreas denotadas con las n's. Esta adición está mostrada en la figura 4 para la secuencia ADN y en la figura 5 para la secuencia de aminoácidos. La lección de las repeticiones Ala-Gly (GCTGGT) fue arbitraria y meramente sirvió como un soporte de lugar. El uso de las repeticiones Ala-Gly (GCTGGT) también permitieron una expresión de ensayo, purificación y prueba de un agente aglutinante parental . Uno de los beneficios del agente aglutinante parental y de los ácidos nucleicos que codifican el agente aglutinante parental, es que la estructura que determina aminoácidos (las áreas sin circuito) se han identificado y pueden optimizarse continuamente.

La traslación de regreso de la secuencia de aminoácido de agente aglutinante parental fue llevada a cabo para producir un clon ADN que puede usarse para la construcción de la biblioteca combinatorial . La presión de codón hacia E. colí se hizo para asegurar una producción de proteína máxima. Los sitios de restricción únicos fueron incorporados en la secuencia ADN que flanqueo todas las cinco regiones de circuito . Esto facilitó grandemente la formación de la biblioteca combinatorial . Los sitios de restricción de flanqueo fueron también incorporados en la secuencia ADN de agente aglutinante parental a fin de facilitar la clonación en vectores de expresión de proteína. Aún cuando éste sistema fue optimizado para la producción bacterial, uno puede producir los polipéptidos de agente aglutinante en cualquier sistema de expresión simplemente mediante el succionar el gen estructural en otro vector.

La construcción de la secuencia SEQ ID NO: 3 de 423 nucleótidos requirió una serie de oliglonucleótidos cortos, debido a que está más allá de la metodología sintética actual el construir secuencias ADN sobre 100 bases en longitud. Además, puede ser difícil el hibridizar eficientemente moléculas de ADN más largas . Por tanto la construcción se llevó a cabo usando una serie de pasos de hibridización. Los oligonucleótidos individuales, cuando se mezclaron juntos en cantidades equimolares, fueron convertidos eficientemente en moléculas dúplex por un paso de hibridización "de enfriado lento" . La reducción lenta de la temperatura de 95° C sobre un período de horas favoreció a la formación de duplexes cortos. Los fragmentos resultantes que contuvieron una región de sepa doble central de 30 pares de base, y fueron flanqueadas por terminales de sepa única de 10 nucleótidos (excepto por los oligonucleótidos de terminal extrema, los cuales fueron más cortos) . Estos "extremos pegajosos" fueron usados para impulsar el ensamble de la secuencia SEQ ID NO: 3 de longitud completa, de nuevo mediante hibridización.

La formación de la secuencia SEQ ID NO: 3 final en ésta fase se llevó a cabo por el calentamiento de una mezcla equimolar de moléculas dúplex a 45° C por 10 minutos. Este paso interrumpió cualquier estructuras dúplex formadas parcialmente y formadas por la asociación de las terminales, pero no interrumpió las regiones dúplex centrales completamente formadas . El material calentado fue "rápidamente enfriado" mediante el colocar el tubo de reacción en hielo. Este paso de hibridización favoreció la hibridización de regiones cortas de ADN (por ejemplo los extremos pegajosos de 10 bases) . La columna de fosfodiéster de un fragmento de ADN de 423 bp fue entonces formado por la enzima ligasa T4 ADN.

La secuencia de gen de longitud completa fue seleccionada de la mezcla resultante de fragmentos usando amplificación PCR. Este paso fue más eficiente que purificar el fragmento de geles agaros . Este paso también resultó en una gran cantidad material para pasos de clonación subsecuentes . Los extremos del gen fueron preparados para clonación mediante terminación despuntada con polxmerasa T4 ADN y digestión con Nde I y Eco RV. Estos resultó en una molécula ADN que puede ser clonada eficiente y direccionalmente en vectores de expresión de proteína. La validez del inserto final fue confirmada por la secuencia ADN después de llevar a cabo minipreps de plásmido ADN de varias colonias bacteriales transformadas (datos no mostrados) .

Además, los procedimientos de clonación empleados permitieron a los dominios de circuito el ser fácilmente reemplazados por juegos combinatoriales de secuencias de circuito al azar. Los oligonucleótidos usados para producir las variantes de circuitos están mostradas en la Tabla 4 (sólo la sepa de codificación está mostrada) .

Mientras el método presentado aquí fue muy directo, éste fue uno de las muchas rutas de biología molecular diferentes que pueden haberse usado para construir la biblioteca. Por tanto, aún cuando la biblioteca fue clonada en pET29a, ésta sería directa al subclón de la biblioteca completa (mediante digestión de endonucleasa de restricción tradicional o por vía PC ) en un sistema de biolavado más adecuado, por ejemplo, un sistema fago en donde el agente aglutinante fuera exhibido sobre el costo fago. La biblioteca completa puede ser recreada mediante amplificación de los insertos como un todo y clonarlos de regreso en otro vector de elección.

La construcción de la biblioteca combinatorial resultó en una biblioteca de aproximadamente de 6 x 1012 clones independientes . Esta biblioteca bacterial inicial tuvo una diversidad suficiente para analizar efectivamente para los agentes aglutinantes que pueden aglutinar a una molécula de ob etivo .

El análisis de la biblioteca fue grandemente facilitado por el uso de un sistema robótico. Las bibliotecas futuras muy factiblemente estarán en un sistema de análisis que es aún más amable a una producción más rápida. Aún así, sobre 38,000 clones fueron analizados más o menos automáticamente en cuatro días. De éste primer análisis de ensayo fue identificado un clon positivo. Este clon fue aglutinado a la tripsina bovina (véase abajo) . De manera que la posibilidad de usar la biblioteca construida para analizar variantes de circuito novedosas que pueden aglutinar objetivos novedosos se prueba. El clon aislado tuvo una secuencia ADN de circuito i de CGTTACCTGCGTTACCCGTCT (SEQ ID NO: 30), que correspondió a la secuencia de aminoácido de RYLRYPS (SEQ ID NO: 31) . En contraste, el agente aglutinante parental de la secuencia de aminoácido fue AGAAGAA (SEQ ID NO: 32) .

EJEMPLO 2 : Estudios Bioquímico y Biofxsico de Agentes Aglutinantes Este ejemplo ilustra algunas de las propiedades químicas, bioquímicas y físicas de los agentes aglutinantes producidos por los métodos de la invención.

Purificación del agente aglutinante: La estrategia de expresión utilizó un sistema de expresión sobre polimerasa T7 ARN típico. El vector construido agregó un apéndice hexa- istidina de terminal-C al polipéptido de agente aglutinante a fin de facilitar la purificación. Las células BL21 (DE3) contuvieron las construcciones de plásmido de expresión fueron cultivadas a 37° C en caldo Luria complementado con 1% de glucosa y 60 µg/mL de ampicilina de 1% de inoculación. El IPTG fue agregado a una concentración final de 0.5 mM cuando las células habían alcanzado un valor A595 de 0.8 (en aproximadamente 3 horas después de la inoculación) . El crecimiento de célula continuó por cinco horas adicionales antes de la cosecha. Típicamente, 5 g de células fueron obtenidas por litro .

Las células fueron paletizadas por centrifugación a 10,000 x g por diez minutos y se volvieron a suspender en un volumen de 10 mM de Tris-HCl, pH de 8.0. Las células fueron giradas de nuevo como se indicó arriba y fueron congeladas por lo menos por dos horas a -70° C. La pelotilla congelada fue suspendida de nuevo en dos volúmenes de amortiguador de extracción de proteína BPER E. coli (de Pierce Scientific) . La mezcla fue incubada a 30° C por 20 minutos con un mezclado ocasional. El extracto resultante fue clarificado por centrifugación a 12,000 x g por 20 minutos, y el supernadante fue dializado en contra de 2 L de amortiguador de carga His-Tag (todo los amortiguadores His-Tag y las resinas son de Novagen, Inc.). El material dializado fue diluido a una concentración final de 2.5 mg/mL con un amortiguador de carga, y se aplicó a una columna de resina de His-Tag de 5 centímetros por 3.97 ce2 que se había previamente cargado con níquel . Todos los pasos de cromatografía fueron llevados a cabo a la temperatura ambiente. La columna fue lavada con cinco volúmenes de columna de amortiguador de lavado His-Tag. La proteína fue elutada de la columna con 100 mM a 500 mM de gradiente imidazol-HCl . Las fracciones fueron recolectadas a través del gradiente y aquellas fracciones contienen proteína (como se ensayó por SDS PAGE) fueron puestas en un estanque y se concentraron a 5 mg/mL a través de Centricon (Amicon, Inc.). Este material fue dializado extensivamente en contra de 10 m de Tris-HCl (pH de 8. ) , 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCl y constituyó a la Fracción I.

El agente aglutinante homogéneo fue preparado del la Fracción I a través de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) . El sulfato de amonio (de una solución de suministro de 4M) fue agregado al estanque de la Fracción I a una concentración final de 1.5 M. Este material fue aplicado a una columna de cartucho BioRad Econo-Pac t-Butil HIC (un volumen de columna total de uno mL) . Un gradiente cóncavo de reversa de 100 mL de 1.5 M de (NH4) 2S0 /3.0 M KC1/Amortiguador I a Amortiguador I sólo se aplicó directamente después de la carga de la muestra. El polipéptido homogéneo elutado de la columna durante el último tercio del gradiente. El 95% central del pico (como se midió por absorbencia) fue estancado. El material fue concentrado a un volumen final de 2 mL por filtración de presión a través de una membrana semipermeable (Amicon ??-3) y se dializó en contra de 2 L de 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 25 mM NaCl. El material concentrado/dializado fue usado para · todos los análisis subsecuentes.

Desnaturalización química: Las mediciones de estabilidad del agente aglutinante parental se llevaron a cabo mediante el medir el desdoblado de proteína en la presencia de urea a través de fluorescencia triptofan intrínsico (Lakowicz, 1983) en un fluorómetro Shimadzu RF5301. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 295 nm y de 340 nm respectivamente . Ambas hendiduras de excitación y de emisión de monocrómetro fueron puestas a 1.5 nm. El agente aglutinante (20 µ?) fue mezclado con cantidades en aumento de hidrocloruro de guanidinio (GdnHCl, en un rango de concentración de cero a 6.0 ) , y las muestras fueron incubadas a la temperatura ambiente por diez horas para asegurar que el equilibrio de desdoblado se había logrado. La fluorescencia relativa fue convertida en valores de energía libre de acuerdo a la relación (Pace y otros, 1989) : en donde yf e yu son los valores de fluorescencia relativa para el agente aglutinante parental completamente doblado y completamente desdoblado respectivamente, y± es la fluorescencia relativa de los intermedios desdoblantes, T es la temperatura absoluta y R es una constante de gas . La regresión lineal y la extrapolación de la relación ?T en contra de [GdnHCl] fue empleada para determinar el valor de energía libre en la ausencia de desnaturalizante (?<¾2?) · Similarmente, el polipéptido desdoblado de fracción (Fu) fue calculado de los datos de fluorescencia de acuerdo a la relación (Pace y otros, 1989) : y¡-y» Calorimetría, de titulación isotérmica: La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se llevó a cabo con un instrumento VP-ITC de MicroCal, Inc. Las titulaciones fueron llevadas a cabo por inyección de 5DL de un agente aglutinante (a rangos de concentración de desde 0.5 mM a 1.0 mM) en una célula de reacción agitada de 1.4 mL. La tripsina bovina (Sigma Chemical Company) varió en una concentración de desde 10 a 30 µ? en la célula. Ambos el inhibidor y la enzima estuvieron en 20 mM de cacodilato de sodio (pH de 6.9), 40 mM de NaCl . Las titulaciones se llevaron a cabo a 20° C. Las condiciones experimentales típicas para las titulaciones fueron a un período de inyección de 10 segundos seguido por un retraso de 240 segundos entre las inyecciones para un total de 40 inyecciones. Las titulaciones en blanco del agente aglutinante en amortiguador se llevaron a cabo en orden para corregir los calores de dilución y el mezclado.

El juego independiente de sitios de aglutinamiento múltiple es el modelo más común para las evaluaciones de experimento aglutinante. La solución analítica para el calor total es determinada por (Freiré y otros, 1990) : en donde Q es el calor total, V es el volumen de célula, ?? es la entalpia, M es la concentración macromolécula (el socio aglutinante en la célula) , n es la estoiquiometría aglutinante, L es la concentración de ligando (el socio aglutinante en la jeringa), y K es la constante de asociación. Los datos fueron ajustados a éste modelo usando la versión 5 Origin ( icroCal, Inc.).

El régimen de purificación tomó aproximadamente dos dias para completarse . La purificación del polipéptido aglutinante parental de E. coli resultó en aproximadamente 15 mg de polipéptido por litro de cultivo inducido. El polipéptido fue sobre producido aproximadamente 36-veces en E. coli. El esquema de purificación fue auxiliado por el hecho de que el polipéptido fue aislado de la bacteria como una fusión C-terminal His-Tag. Por tanto, esto fue directo para expresar y después purificar el polipéptido. La preparación del extracto bacterial crudo fue logrado eficientemente por lisis química de la bacteria seguido por la limpieza del lisado a través de centrifugación. También fue posible interrumpir la bacteria después de la expresión a través de sonicacion o a través de una prensa Francesa. El polipéptido fue por tanto purificado a homogeneidad en dos pasos. A través del curso del ensayo de purificación, el agente de aglutinamiento parental fue visualizado solamente por el análisis SDS PAGE.

El polipéptido de agente aglutinante parental se desdobla en una manera altamente cooperativa. El desdoblado a equilibrio vigilado por la fluorescencia de triptofan intrinsico exhibe una disminución de 70% global en la emisión de intensidad de fluorescencia y un cambio de 12 nm en la emisión de máximo pico a longitudes de onda más grandes (datos no mostrados) . El espectro de emisión de intensidad de fluorescencia fue convertido en la fracción de polipéptido desdoblado como se describió anteriormente .

La figura 7 muestra el punto medio de la curva de desdoblado para el agente aglutinante parental que ocurrió a una concentración de 2.7 M de GdnHCl . La transición de desdoblado comenzó a 2.4 M de GdnHCl y se completó a una concentración de desnaturalizante de 3.1 M de GdnHCl. La existencia de un pico único en el primer esquema derivado de estos datos (no mostrados) soporta la hipótesis de que el polipéptido se desnaturaliza como un proceso de dos estados altamente cooperativo. La conversión de la curva de desdoblado en una energía libre en contra de la concentración del esquema GdnHCl con extrapolación a través de regresión lineal a la energía libre en la ausencia de urea indicó que el polipéptido tiene una energía libre nativa de 42.7 kJ mol"1.

El comportamiento cromatográfico del agente aglutinante parental sobre la columna de exclusión de gel de BioSelect 125 fue consistente con el polipéptido monomérico esperado. El experimento de filtración de gel analítico (datos no mostrados) indicaron que el polipéptido elutó desde la columna ligeramente más temprano que una mioglobina estándar (12 kDa) . El perfil de elusión fue consistente con el polipéptido siendo un monómero con un peso molecular de aproximadamente 13.8 kDa (esto incluyó el His-Tag) .

El radio Stokes calculado fue de 26 Á. Este valor estuvo en buena concordancia con las dimensiones del modelo atómico. El perfil de elusión también indicó que el polipéptido fue aproximadamente simétrico en naturaleza, debido a que el coeficiente de fricción fue de 1.27. El coeficiente de fricción sin embargo, indicó que el polipéptido tuvo un grado ligero de carácter esferoide oblongo, el cual puede indicar que la región de circuito juega una parte en la determinación de las propiedades hidrodinámicas del polipéptido.

EJEMPLO 3 : Secuencias de Agente Aglutinante Generadas por Computadora Este ejemplo ilustra como los agentes aglutinantes que pueden aglutinar moléculas de objetivo específicas pueden ser generados usando un programa de computadora proporcionado por la invención.

Modelado por Computadora del Agentéis) de Aglutinamiento El polipéptido de agente aglutinante parental fue 134 aminoácidos en longitud y tuvo un peso molecular total de 12.8 kDa. La figura 6 ilustra la estructura tridimensional del agente aglutinante genérico. La topología global de los agentes aglutinantes es aquella de un emparedado beta (mostrado por las flechas) estabilizado por un enlace de disulfido central (no mostrado) . Los agentes aglutinantes de la invención también tienen cinco circuitos (mostrados como sepas delgadas que conectan las flechas) , los cuales son los elementos de reconocimiento de objetivo primarios. Los extremos de secuencia de polipéptido con una cola que puede ser usada para anclar la molécula sobre la superficie de una cuenta u otra superficie para usarse en dispositivos de diagnóstico. La región de contacto de objetivo es definida por la orientación espacial de éstos circuitos. ün modelo tridimensional del polipéptido fue preparado mediante el hilar la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 38) sobre la columna de carbón alfa tridimensional de un anticuerpo camélido (estructura Ijtt.ent en el banco de datos de proteína) usando el programa SwissModel . El resultado óptimo fue convertido en una estructura tridimensional que incluyó las posiciones de cadena de aminoácido lateral usando el programa Pro od. Este modelo inicial sometido a una ronda de templado simulado a fin de minimizar las interacciones de cadena lateral negativas . Varias rondas de optimización de geometría de nivel SYBYL pusieron todos los ángulos dihedrales y torsiones en una geometría adecuada. Una primera ronda de minimización de energía usando un juego de parámetro GROMOS96, sin un campo de reacción, fue empleada. Estos resultados están mostrados en la Tabla 6. El modelo final tuvo una energía global de -3581 kJ/mol y se muestra en la figura 6. Todos los residuos de aminoácido está dentro del espacio Ramachandran disponible (datos no mostrados) y no hay interacciones estericas negativas.

Tabla 6. Resultados de minimización de energía GROMOS 96 para el modelo de homología (sólo los parámetros principales del campo de fuerza están mostrados) Programa de Computadora: Un programa, MKBIND, fue escrito en FORTRAN 77 que puede ser usado para identificar automáticamente las secuencias de aminoácido de circuito que unen a moléculas de objetivo específicas. El código fue compilado para correr bajo LINUX sobre un Rocketcalc, racimo de computación LLC Beowulf. El paralelismo del código resultó en una aceleración significante del tiempo de búsqueda.

Un esquema de flujo para el flujo de programa general de MKBIND está mostrado en la figura 8. Para comenzar, la información relativa a las estructuras tridimensionales del agente aglutinante parental y de la molécula de objetivo se metieron como dos expedientes de datos diferentes el agente aglutinante parental 1502 y el objetivo 1512. Esta información incluyó las coordinadas atómicas de todos los átomos en el agente aglutinante genérico (SEQ ID NO: 38, vea la figura 12) y la molécula de objetivo.

Una zona de búsqueda específica sobre el objetivo (tripsina) fue seleccionada mediante el tomar un centro de gravedad identificable (o un área estructural identificable tal como una caja o triángulo o coordinada) que pueda centrarse sobre una coordinada atómica seleccionada dentro de la molécula de objetivo. En algunos experimentos, la profundidad del centro identificable (caja o triángulo) proyectó alrededor de 3A desde la superficie promedio en el centro a alrededor de la misma distancia abajo del nivel (para obtener las ranuras más profundas) . El área de búsqueda seleccionado fue de alrededor de 20Á x 20? x 6Á.

La longitud de circuito (i) fue definida para ser de siete aminoácidos. Todos los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente fueron definidos como la clase de aminoácidos para sustituir en cada posición del circuito (i) . El programa generó todos los expedientes coordinados para el circuito (i) aplicó una transformación coordinada simple para anclar los nuevos circuitos en la estructura de agente aglutinante y generó un expediente de salida de agente aglutinante el cual comprende una serie de expedientes que comprenden coordinadas estructurales para todos los agentes aglutinantes posibles con todas las secuencias de circuito posibles.

El expediente de salida de agente aglutinante y el expediente de objetivo de salida fueron entonces comunicados al programa de archivo 1510, 1518. El expediente de salida de agente aglutinante 1510 fue un expediente coordinado atómico regular. El expediente de objetivo de salida 1518 fue un expediente que definió las coordinadas atómicas de los residuos aminoácidos en el área de rejilla de objetivo, así como las coordinadas xyz de la rejilla misma. Sin embargo, todas las estructuras tridimensionales son usadas por M BIND como expedientes coordinados atómicos . El programa de archivo molecular entonces archivó cada agente aglutinante con el objetivo usando un algoritmo de archivo flexible 1520. Por tanto, la superficie aglutinante-circuito del agente aglutinante fue centrada por el programa MKBIND dentro del volumen de la rejilla de coordinada de la molécula de objetivo. El programa entonces movió al agente aglutinante hacia la superficie de objetivo (aún dentro de la rejilla) a lo largo de un eje en intervalos de 0.1 A y una calificación fue calculada (vea abajo) . La estructura fue entonces movida otro 0.1 A. Sí la calificación mejoró el agente aglutinante fue movido además hasta que la calificación se hace peor. En éste punto se movió fuera por 0.1 A (a la última mejor calificación) y es entonces movido arriba en la misma manera, y después abajo y después a la izquierda y a la derecha. Todos los movimientos y recolocaciones de posición, resultaron en el "local óptimo para el ajuste" .

La calificación de archivo o la calificación de ajuste para cada variante de agente aglutinante fue entonces computada como se describió abajo.

Calificación de Ajuste = [Eeieot + E dw + EHB. en donde Eeiect es la energía electrostática, Ev¿„ es el término Van der aals y EHB es la energía de unión de hidrógeno. Esta función de energía empírica es una suma de estos tres términos de energía- individuales : Sí el ajuste fue pobre, las secuencias de circuito y el expediente de coordinada variante de agente aglutinante fueron descartados 1526. Una calificación superior 1524 fue obtenida y las secuencias de circuito y el expediente de coordinada variante de agente aglutinante fueron guardados 1528.

Una vez que el mejor ajuste fue encontrado el expediente coordinado aglutinante fue escrito. El objetivo y las imágenes estructurales de agente aglutinante optimizadas fueron examinados sobre la pantalla para inspeccionar el ajuste. Todas las secuencias de circuito de calificación alta fueron sacadas para análisis fuera de línea (por ejemplo alineación) . MKBIND fueron entonces por tanto usados para construir un agente aglutinante novedoso que fue capaz de aglutinar a tripsina bovina .

Resultados : El programa de computadora, MKBIND, exitosa automáticamente identificó una variante de circuito de agente aglutinante parental que puede aglutinar a la tripsina bovina. A fin de acortar el tiempo de computación para el primer ensayo, sólo fueron buscadas las variantes de circuito i. Los circuitos restantes fueron constreñidos a sus secuencias de repetición inicial Ala-Gly. El circuito i fue completamente buscado, esto es todos los 20 aminoácidos se dejaron ocupar cada secuencia. Por tanto fueron buscadas las' secuencias 207 (1.28 x 109) .

El programa tomó aproximadamente 0.01 segundos para completar una búsqueda novedosa (por ejemplo para hacer la estructura variante de circuito al azar, fijarla en la rejilla de búsqueda de tripsina, calcular la calificación de ajuste, y sacar los expedientes de secuencia de circuito y coordinada) .

Por tanto, la corrida completa consumió 1.28 x 107 segundos (148 retrasos para correr) . La velocidad de computación fue mejorada mediante el correr el sistema sobre el racimo Rocketcalc, LLC. La aceleración lineal sobre el sistema de 20 procesador es de 18.9. Sin embargo, no se requiere un racimo para correr el programa . La velocidad de búsqueda puede ser grandemente acelerada mediante el optimizar los parámetros de archivo (por ejemplo, haciendo menos búsquedas estringentes y no haciendo el espaciamiento de rejilla muy fino) . Debido a que éste está escrito en FORTRAN 77 estándar, el programa puede correr sobre cualquier sistema de computadora.

La búsqueda resultó en la identificación de un agente aglutinante variante de circuito de calificación superior que puede aglutinar a tripsina bovina. La secuencia de circuito-i identificada fue ITAVCHK (SEQ ID NO: 35) . Una proteína de reactivo aglutinante actual fue construida (vea la Tabla 6) con ésta secuencia insertada en el circuito i de reactivo aglutinante parental .

La secuencia de circuito i obtenida por computadora fue diferente de la secuencia de circuito i obtenida por procedimientos de biología molecular. Las secuencias para los circuitos generados por computadora y generados biológicamente son comparados en la Tabla 7.

Tabla 7. Los resultados de la búsqueda de computadora de circuito i y de pantalla biológica usando tripsina como el objetivo Las secuencias de circuito i incorporan los sitios de restricción Nhe I y Fsp I de flanqueo (caso inferior) .

Los agentes aglutinantes que tienen la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 35 fueron expresados y purificados como se describió anteriormente. Las propiedades bioquímicas y biofísicas de éstos agentes aglutinantes se proporcionan en la Tabla 8.

Tabla 8. Propiedades misceláneas de los Agentes Aglutinantes La capacidad de los tres agentes aglutinantes (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 33 y 35) fue probada para determinar sí éstos podían efectivamente aglutinar tripsina bovina. El aglutinamiento fue medido por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) .

El agente aglutinante parental no tuvo una afinidad aglutinante natural para la tripsina (datos no mostrados) . Bajo todas las condiciones experimentales no hubo aglutinamiento detectable. Sin embargo, se mostró en la figura 9, las dos variantes de circuito tuvieron una afinidad aglutinante notable para la tripsina.

La Tabla 9 proporciona un resumen de algunos parámetros termodinámicos observados por los varios agentes aglutinantes .

Tabla 9. Parámetros termodinámicos misceláneas de interacción de tripsina bovina-Agente Aglutinante Nbd = ningún aglutinamiento detectado .

Estos resultados de calorimetría de titulación isotérmica indicaron que la interacción entre la tripsina y los agentes de aglutinamiento SEQ ID N:33 y 35 fue impulsada entálpicamente, esto es ?? fue negativo. La reacción no fue favorecida entrópicamente como se evidencia por el valor negativo de AS. Sin embargo, el término entálpico es más grande en magnitud que el término, TAS, por tanto la energía libre global (AG) es negativo. Aún cuando solo el circuito i fue optimizado en la pantalla de computadora, los procedimientos empleados aquí generaron el agente aglutinante con excelentes propiedades de aglutinamiento . üna búsqueda de todos los cinco circuitos resultará por lo tanto en la identificación de agentes aglutinantes variantes de circuito con una muy alta afinidad.

Este trabajo ha mostrado que es posible el diseñar un agente aglutinante monomérico estable con base en la topología de barril beta como para producir un agente aglutinante que puede ser usado en inmunoensayos como un reemplazo de anticuerpo potencial . Los cambios de aminoácidos fueron incorporados en una estructura de agente aglutinante parental básico para aumentar la estabilidad de la molécula y para proporcionar una funcionalidad adicional. Los cinco circuitos de contacto de objetivo seleccionados para las interacciones aglutinantes proporcionan un potencial grande para descubrir agentes de aglutinamiento novedosos. Teóricamente pueden ser producidas 2O30 diferentes moléculas. Esto significa esencialmente que éste sistema puede ser usado para generar agentes aglutinantes en contra de cualquier epítope o molécula de objetivo.

Un ácido nucleico para éste nuevo agente aglutinante fue diseñado, sintetizado y fue usado para producir el agente aglutinante en un sistema de expresión E. coli. El ácido nucleico incorporó nuevos sitios de endonucleasa de restricción para generar una biblioteca combinatorial de circuito . Dos variantes del agente aglutinante fueron producidas . La primera variante fue aislada de la biblioteca combinatorial y se encintró que tuvo una secuencia de circuito i que siguió al agente aglutinante para aglutinar tripsina. La segunda variante contuvo una secuencia de circuito i novedosa que descubrió de nuevo, usando un sistema de archivo molecular y de generación de circuito automático y al azar. Esta molécula también se unió a la tripsina. Las moléculas de agente aglutinante son muy estables y funcionales, por tanto el sistema de agente aglutinante puede ser usado para crear un número ilimitado de agentes aglutinantes y éstos pueden ser usados para reemplazar los anticuerpos convencionales en las pruebas de diagnóstico.

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Todas las publicaciones y patentes son incorporadas aquí por referencia, aún cuando se hayan incorporado individualmente por referencia. La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos, ya que deberá entenderse el que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse las cuales permanecen dentro del espíritu y alcance de la invención definida por las reivindicaciones.

Claims (50)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un agente aglutinante aislado que comprende un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID N0:4.

2. El agente aglutinante aislado tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el polipéptido puede aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada.

3. El agente aglutinante aislado tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el polipéptido tiene cinco circuitos aglutinantes cada circuito comprendiendo aminoácidos Xaa, y en donde los aminoácidos Xaa son L-aminoácidos codificados genéticamente, L-aminoácidos no codificados genéticamente que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiómeros de los mismos.

4. El agente aglutinante aislado tal y como se reivindica en la cláusula 3 , caracterizado porque cada aminoácido Xaa es intercambiado por un aminoácido específico y el polipéptido puede aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada .

5. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO : 2 o SEQ ID N0:4.

6. El ácido nucleico aislado tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque el ácido nucleico comprende SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO : 3.

7. El ácido nucleico aislado tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque el ácido nucleico está dentro de un vector duplicable o un plásmido duplicable .

8. ün ácido nucleico aislado que comprende SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO: 29.

9. Un agente aglutinante aislado que comprende un polipéptido con una conformación de barril beta en donde el polipéptido comprende SEQ ID NO: 37.

10. El agente aglutinante aislado tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque el polipéptido puede aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada.

11. El agente aglutinante aislado tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque el polipéptido tiene cinco circuitos aglutinantes que comprenden aminoácidos Xaa, y en donde los aminoácidos Xaa son L-aminoácidos codificados genéticamente, L-aminoácidos no codificados genéticamente que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiómeros de los mismos.

12. El agente aglutinante aislado tal y como se reivindica en la cláusula 11, caracterizado porque el aminoácido Xaa es intercambiado por un aminoácido especifico y el polipéptido puede aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada .

13. Un vector de expresión que comprende un promotor y un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende SEQ ID NO : 2 o SEQ ID NO : .

1 . El vector de expresión tal y como se reivindica en la cláusula 13, caracterizado porque el polipéptido tiene cinco circuitos aglutinantes que comprenden aminoácidos Xaa , y en donde los aminoácidos Xaa son L-aminoácidos codificados genéticamente, L-aminoácidos no codificados genéticamente que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiómeros de los mismos.

15. El vector de expresión tal y como se reivindica en la cláusula 13, caracterizado porque cada aminoácido Xaa es intercambiado por un aminoácido específico y el polipéptido puede aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada.

16. El vector de expresión tal y como se reivindica en la cláusula 13, caracterizado porgue el ácido nucleico comprende SEQ ID N0:1 o SEQ ID N0:3.

17. Un vector de expresión que comprende un promotor y un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una conformación de barril beta en donde el polipéptido de agente aglutinante comprende SEQ ID NO: 37.

18. El vector de expresión tal y como se reivindica en la cláusula 17, caracterizado porque el polipéptido puede aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada.

19. El vector de expresión tal y como se reivindica en la cláusula 18, caracterizado porque el polipéptido tiene cinco circuitos aglutinantes que comprenden aminoácidos Xaa, y en donde los aminoácidos Xaa son L-aminoácidos codificados genéticamente, L-aminoácidos no codificados genéticamente que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiómeros de los mismos.

20. El vector de expresión tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque cada aminoácido Xaa es intercambiado por un aminoácido específico y el polipéptido puede aglutinar a una molécula de objetivo seleccionada .

21. Una biblioteca para agentes aglutinantes en donde cada agente aglutinante en la biblioteca comprende un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2.

22. Una biblioteca de agentes aglutinantes en donde cada agente aglutinante en la biblioteca comprende un polipéptido con una conformación de barril beta que comprende SEQ ID NO: 37.

23. Un método para hacer una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituir cada oligonucleótido al azar en un ácido nucleico que comprende SEQ ID N0:1 para generar una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante .

24. El método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar comprende SEQ ID NO: 25, SEQ ID N0:2S, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:28 o SEQ ID N0:29.

25. El método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque el método además comprende el colocar la biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas.

26. Un método para hacer una biblioteca de vectores duplicables que codifica polipéptidos de agente aglutinante que comprende : generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de '6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G O T; y sustituir cada oligonucleótido al azar en un vector duplicable que comprende la SEQ ID NO:l para generar una biblioteca de vectores duplicables que codifican los polipéptidos de agente aglutinante .

27. El método tal y como se reivindica en la cláusula 26, caracterizado porque por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar comprende SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 O SEQ ID NO:29.

28. El método tal y como se reivindica en la cláusula 26, caracterizado porque el método además comprende el colocar la biblioteca de vectores de agente aglutinante en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas.

29. Un método para hacer una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; sustituir cada oligonucleótido al azar en un vector de expresión que comprende la SEQ ID N0:1 para generar una biblioteca de vectores de expresión que codifican los polipéptidos de agente aglutinante; y colocar la biblioteca de vectores de expresión en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas que expresan una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante .

30. El método tal y como se reivindica en la cláusula 29, caracterizado porque por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar comprende SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:26, SEQ ID N0:27, SEQ ID NO:28 o SEQ ID N0:29.

31. Un método para hacer una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituir cada oligonucleótido al azar en un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 37 para generar una biblioteca de ácidos nucleicos de agente aglutinante.

32. El método tal y como se reivindica en la cláusula 31, caracterizado porque por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar comprende SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 O SEQ ID NO:29.

33. Un método para hacer una biblioteca de vectores que pueden ser duplicados que codifican polipéptidos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; y sustituir cada oligonucleótido al azar en un vector que puede ser duplicado que comprende SEQ ID NO: 37 para generar una biblioteca de vectores que pueden ser duplicados y que codifican los polipéptidos de agente aglutinante.

3 . El método tal y como se reivindica en la cláusula 33, caracterizado porque por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar comprende SEQ ID N0:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29.

35. El método tal y como se reivindica en la cláusula 33, caracterizado porque el método además comprende el colocar la biblioteca de vectores de agente aglutinante en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas .

36. ün método para hacer una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante que comprende: generar una colección de oligonucleótidos al azar, cada oligonucleótido al azar comprende una secuencia al azar de alrededor de 6 a alrededor de 30 n nucleótidos, en donde n es A, C, G o T; sustituir cada oligonucleótido al azar en un vector de expresión que comprende la SEQ ID NO: 37 para generar una biblioteca de vectores de expresión que codifican los polipéptidos de agente aglutinante; y colocar la biblioteca de vectores de expresión en una población de células anfitrionas para generar una biblioteca de células anfitrionas que expresan una biblioteca de polipéptidos de agente aglutinante .

37. El método tal y como se reivindica en la cláusula 36, caracterizado porque por lo menos uno de la colección de oligonucleótidos al azar comprende SEQ ID NO:25, SEQ ID NO-.26, SEQ ID -NO -.27, SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29.

38. ün método implementado por computadora para hacer una biblioteca de agentes aglutinantes que comprende: definir una zona de búsqueda que comprende un sitio de interacción sobre una molécula de objetivo a la cual un agente aglutinante con por lo menos un circuito aglutinante puede interactuar; definir el número de circuitos aglutinantes para búsqueda y un tamaño para cada circuito aglutinante; definir una clase de aminoácidos para cada posición ' en cada secuencia de aminoácido de circuito aglutinante ; sustituir los miembros de una clase definida de aminoácidos en posiciones de cada secuencia de aminoácido de circuito aglutinante para generar una pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida; ajustar cada una de la pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida a la zona de búsqueda y para crear una calificación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; y poner en rango la pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida mediante la calificación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; en donde el agente aglutinante comprende SEQ ID N0:2 o SEQ ID NO:37.

39. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38, caracterizado porque la zona de búsqueda comprende las coordinadas x- , y- y z- de cada átomo sin hidrógeno en la molécula de objetivo.

40. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38, caracterizado porque el método además comprende meter las coordinadas x- , y- y z- de cada átomo sin hidrógeno en el agente aglutinante que comprende SEQ ID NO:l o SEQ ID NO :37.1a molécula de objetivo.

41. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38, caracterizado porgue el método además comprende el recibir una selección de porcentaje de entrada para limitar las secuencias de circuito aglutinante de salida a un cierto porcentaje; en donde la selección de porcentaje de entrada es capaz de limitar un tamaño de expediente de biblioteca de salida y una complejidad de biblioteca.

42. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38, caracterizado porque las secuencias de circuito aglutinante de salida con calificaciones de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo superiores pueden aglutinar con una afinidad superior a la molécula de objetivo.

43. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38, caracterizado porque cada clase de aminoácidos separadamente comprende uno cualquiera de L-aminoácidos codificados genéticamente, L-aminoácidos no codificados genéticamente que ocurren naturalmente, L-aminoácidos sintéticos, D-enantiómeros de aminoácidos genéticamente codificados, D-enantiómeros de aminoácidos no genéticamente codificados que ocurren naturalmente, o D-aminoácidos sintéticos .

44. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38, caracterizado porque cada clase de aminoácidos separadamente comprende uno cualquiera de aminoácidos hidrofílieos , aminoácidos hidrofóbicos , aminoácidos tipo cisteína, aminoácidos acídicos, aminoácidos básicos, aminoácidos polares, aminoácidos aromáticos, aminoácidos apolares, o aminoácidos alifáticos .

45. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38, caracterizado porque la molécula de objetivo es tripsina bovina y uno de la secuencia de circuito aglutinante de salida es SEQ ID NO: 35.

46. ün sistema para generar secuencias de polipéptido que comprenden: un procesador; una memoria acoplada al procesador; un exhibidor acoplado al procesador; un componente de secuencia de péptido de circuito de realización capaz de ejecutar sobre el procesador para generar secuencias de péptido de circuito de salida; un componente de archivo molecular capaz de ajustar una pluralidad de secuencias de péptido de circuito de salida a una zona de búsqueda sobre una molécula de objetivo y generar una calificación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; un componente de secuencia de circuito de salida capaz de ejecutar sobre el procesador para exhibir las secuencias de péptido de circuito; y un componente de secuencia de agente aglutinante de salida capaz de ejecutar sobre el procesador para exhibir secuencias de agente aglutinante.

47. Un medio accesible por una máquina que tiene un contenido asociado capaz de dirigir la máquina para llevar a cabo un método, el método comprende: definir una zona de búsqueda que comprende un sitio de interacción sobre una molécula de objetivo a la cual un agente aglutinante con por lo menos un circuito aglutinante puede interactuar; definir un número de circuitos aglutinantes para buscar y un tamaño para cada circuito aglutinante; definir una clase de aminoácidos para cada posición en cada secuencia de aminoácido de circuito aglutinante; miembros dé sustitución de una clase definida de aminoácidos en posiciones de cada secuencia de aminoácido de circuito aglutinante para generar una pluralidad de secuencias 'de circuito aglutinante de salida; ajustar cada una de la pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida a la zona de búsqueda y para crear una calificación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; y calificar la pluralidad de secuencias de circuito aglutinante de salida mediante una calificación de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo; en donde el agente aglutinante comprende SEQ ID N0:2 o SEQ ID NO:37.

48. El medio accesible por la máquina tal y como se reivindica en la cláusula 47, caracterizado porque el método además comprende almacenar las calificaciones de ajuste de secuencia de circuito aglutinante-molécula de objetivo de rango superior y las secuencias de circuito aglutinante asociadas .

49. El medio accesible por la máquina tal y como se reivindica en la cláusula 47, caracterizado porque el medio accesible por la máquina además comprende un expediente de coordinadas x- , y- y z- para cada átomo sin hidrógeno en el agente aglutinante que comprende SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO : 38.

50. El medio accesible por la máquina tal y como se reivindica en la cláusula 47, caracterizado porque las coordinadas x- , y- y z- de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 son usadas por el programa de archivo molecular para alinear cada secuencia de circuito aglutinante con la molécula de objetivo. R E S U E N La invención está dirigida a agentes aglutinantes que tienen circuitos aglutinantes y una conformación de barril beta estable. Los circuitos aglutinantes de éstos agentes pueden fácilmente ser alterados de manera que el agente aglutinante pueda aglutinar cualquier molécula de objetivo seleccionada. También son proporcionados una variedad de métodos para generar agentes aglutinantes con diferentes circuitos aglutinantes.