MXPA04009996A

MXPA04009996A - Metodos para la identificacion de moduladores de la angiogenesis, compuestos descubiertos por los mismos, y metodos de tratamiento usando los compuestos.

Info

Publication number: MXPA04009996A
Application number: MXPA04009996A
Authority: MX
Inventors: Ye Qian
Original assignee: Celgene Corp
Priority date: 2002-04-12
Filing date: 2003-04-14
Publication date: 2005-07-01
Also published as: EP1496878A1; ZA200408369B; NZ536050A; EP1496878A4; AU2003237078B2; IL164533A0; CA2481387A1; CN1658848A; KR20050000398A; WO2003086373A1; US20050148034A1; JP2005536189A; AU2003237078C1; AU2003237078A1

Abstract

La presente invencion se refiere a los metodos para identificar los moduladores de la angiogenesis utilizando celulas humanas. Los metodos de la invencion se pueden emplear para ensayar compuestos y moleculas pequenas para su capacidad de modular la angiogenesis humana utilizando celulas madre pluripotentes, humanas, en un sistema de ensayo in vitro. La presente invencion ademas se refiere a metodos para la identificacion de moduladores de la angiogenesis humana mediante la determinacion de la capacidad de un compuesto de prueba para modular la vasogenesis espontanea en un sistema de ensayo in vitro que utiliza celulas madre pluripotentes no embrionarias. La presente invencion se refiere a los sistemas de ensayo in vitro que utilizan celulas madre pluripotentes, no embrionarias, para la identificacion de compuestos que modulan la angiogenesis humana o la vasogenesis humana. La presente invencion tambien se refiere a metodos de tratamiento que requieren la modulacion de la angiogenesis o vasogenesis humana, que comprenden la administracion a pacientes en necesidad de tales compuestos o moleculas pequenas de tratamiento que se han identificado como inhibidores de la angiogenesis o vasogenesis humana.

Description

METODOS PARA LA IDENTIFICACION DE MODULADORES DE LA ANGIOGÉNESIS, COMPUESTOS DESCUBIERTOS POR LOS MISMOS, Y MÉTODOS DE TRATAMIENTO UTILIZANDO LOS COMPUESTOS. 1. CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a los métodos para la identificación de moduladores de la angiogénesis usando células de vasos sanguíneos o células madre no embrionarias. Los métodos de la invención se pueden emplear para ensayar compuestos y moléculas pequeñas por su capacidad de modular la angiogénesis humana utilizando células madre pluripotentes, humanas, en un sistema de ensayo in vitro. La presente invención además se refiere a métodos para la identificación de moduladores de la angiogénesis humana mediante la determinación de la capacidad de un compuesto de prueba para modular la vasogénesis espontánea en un sistema de ensayo in vitro que utiliza células madre pluripotentes no embrionarias. La presente invención se refiere a los sistemas de ensayo in vitro que utilizan células madre pluripotentes no embrionarias para la identificación de compuestos que modulan la angiogénesis humana o la vasogénesis humana. La presente invención también se refiere a métodos de tratamiento que requieren la modulación de la angiogénesis o vasogénesis humana, que comprenden la administración a pacientes en necesidad de tales compuestos o moléculas pequeñas de tratamiento que se han identificado como inhibidores de la angiogénesis o vasogénesis humana. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe" ~ un " interés—cons-i-derable.-,en._la __identificación y generación de compuestos que modulen la angiogénesis humana. El mayor obstáculo en la identificación de compuestos que modulen la angiogénesis y vasogénesis humana es la falta de sistemas de ensayo in vitro los cuales simulen de manera real la angiogénesisis y vasogénesis humana como estos procesos ocurren en vivo. Se ha demostrado que varios procesos de enfermedades requieren la invasión o migración de células endoteliales como .parte de su patología, que incluyen invasión tumoral, metástasis tumoral, angiogénesis patológica, inflamación y endometriosis (Aznavoorian et al., 1993, Cáncer 71(4): 1368-1383; Fernández et al., 1995, Fértil, and Steril. 63 ( 1 ) : 45-51 ; Fox et al., 1996, J. Pathol . 179:232-237; Lennarz et al., 1991, Biochem. Biophys . Acta 1071:149-158; Liotta et al., 1991,. Cell 64 : 327-336; Mareel et al., Cáncer and Metástasis Rev. 9 -.45-62; y Osborn 1990, Cell 62 :3-6). La angiogénesis también esta involucrada en muchas otras enfermedades y condiciones que son dependientes de la angiogénesis, incluyendo artritis y placas ateroscleróticas , retinopatía diabética, glaucoma neovascular, tracoma y neovasculari zación de injerto córneo, soriasis, escleroderma , hemangioma y cicatrización hipertrófica, adhesiones vasculares y angiofibroma . LTa" ~ahgiogénesi"s—es—e1—proceso—de_-ls—formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes . La vasogénesis es el proceso de la formación en tubo de una sola capa de células endoteliales . Bajo condiciones fisiológicas normales, los humanos o los animales experimentan angiogénesis y vasogénesis en situaciones muy específicas, tales como en la cicatrización de heridas, desarrollo embrionario y fetal y la formación de cuerpo lúteo, endometrio y placenta. Células endoteliales forman una sola capa de células que revisten todos los vasos sanguíneos y regulan el intercambio entre la corriente sanguínea y los tejidos de los alrededores. Nuevos vasos sanguíneos se desarrollan desde las paredes de los vasos pequeños que existen mediante la excrecencia de estas células endoteliales, las cuales tienen la capacidad de formar tubos capilares huecos aun cuando son aislados en cultivos. Una vez que el sistema vascular esta completamente desarrollado, las células endoteliales de los vasos sanguíneos normalmente permanecen estables sin nueva formación de vasos sanguíneos. Si ocurre alguna enfermedad o lesión la formación de nuevos vasos sanguíneos puede proceder de manera normal, como en la curación natural de heridas. La formación insuficiente de nuevos vasos sanguíneos puede resultar en ulceras dérmicas crónicas. Alternativamente, una desregulación de crecimiento puede elevar un incremento anormal en la déñsidad de" los ~vasos- como~en—t-umo-igénesis ,—retinopa.tíL. diabética, soriasis e inflamación. Así, la inhibición de la angiogénesis inapropiada o el reforzamiento de la angiogénesis en heridas que no sanan es por lo tanto un objetivo extremadamente importante para programas de descubrimiento de fármacos. Sin embargo la investigación es esta área ha sido pospuesta por la falta de modelos in vitro de angiogénesis que simulen de manera precisa el medio ambiente natural de los vasos in vivo. La angiogénesis es un proceso extremadamente complejo el cual involucra una amplia gama de factores de crecimiento, moléculas de matrices ' extracelulares , enzimas y varios tipos de células. Una complejidad de relaciones tal ha resultado en dificultades mayores en el desarrollo de un ensayo in vitro que modele el proceso entero in vivo. La angiogénesis puede subdividirse en tres fases: proliferación, migración y diferenciación. Existen ensayos que modelan cada una de estas fases de manera separada. En particular, ensayos simples in vitro miden los cambios, en la proliferación de un gama de tipos de células y evalúa la migración sobre proteínas de membrana basal . Sistemas de ensayo in vitro actuales, las cuales dependen en la provisión de una matriz proteinica, generalmente miden la capacidad de las células endoteliales para formar vasos sanguíneos. Sistemas de ensayo que miden la 3'i'ferenci'acióñ involucran—l-a—formación—de- -un- -.estructuras, parecidas a cordón mediante células endoteliales. Todos los sistemas tales dependen en el suministro de las células con proteínas básales exógenas en las que las células emigran para formar tubos pequeños. Sin embargo, el problema con estos ensayos es que ninguno de ellos combina todas las etapas requeridas para la angiogénesis . Un sistema de modelación in vitro es el modelo anillo de rata aórtico. En el modelo anillo de rata aórtico, cultivos explantados del anillo de aorta de rata son utilizados bajo condiciones de conservación por periodos cortos y periodos largos. En este sistema de ensayo, segmentos del anillo de rata aórtico son cultivados bajo condiciones de conservación •por periodos cortos por tres a cuatro días para obtener poblaciones puras de células musculares y endoteliales. En contraste, cultivos explantados del anillo de rata aórtico en periodos largos se permiten para la excrecencia coordinada y proliferación de ambas células musculares lisas y endoteliales. (Diglio et al., 1989, Laboratory Investigation 60 (4) ; 523-521) .

Recientemente, otro grupo ha intentado generar un ensayo humano in vitro para estudiar la angiogénesis, y al hacerlo ha utilizado explantaciones de anillo aórtico embrionario de embriones de 11 a 12 días de edad implantados en geles de colágeno (Al'lesandri— et - -a-1-.-,—2001-,:—Laborator.y.._Inv.es.tigati n. 8(16) : 875-885) . Otros ensayos in vitro que modelan las etapas combinadas de la angiogénesis incluyen el uso de fragmentos de vasos sanguíneos de tejidos de placenta humana obtenidos dentro de ;seis horas de parto (Parish et al., Patente norteamericana No. 5,976,782), y el uso de . arterias carótidas porcinas comercialmente convenientes ( Stiffey-Wilusz , Aplicación de Patente Norteamericana No. 2001/0046666), y el uso de un cultivo dual de células endoteliales y fibroblastos (Grant et al., W099/17116; Grant et al., Aplicación de Patente Norteamericana No 2001 0005581) . Mediante la siembra del cultivo dual con una proporción celular de 2:1 a 8 : 1 de fibroblastos dérmicos de adulto humano a células endoteliales de vena umbilical humana, el modelo multicelular más estrechamente parecido in vivo a la angiogénesis (Grant et al., W099/17116; Grant et al., Aplicación de Patente Norteamericana No. 2001/0005581) . Hasta la fecha, sin embargo, los modelos de la angiogénesis no utilizan células madre, o células madres en combinación con tejido de vasos sanguíneos, o células de tumores en combinación con cualquiera de los dos células madres o secciones de tejidos de vasos sanguíneos. Se cree que los ensayos de la angiogénesis que utilizan estas células reflejarán -de-manera- -más÷precisa~el-proceso-de_la, .angio.génesis. que los ensayos previamente descritos. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a sistemas de ensayo in vitro que utilizan células madre pluripotentes o ;pluripotenciales , humanas, para la identificación de compuestos, los cuales modulan la angiogénesis humana o la vasogénesis humana. En una modalidad preferida, las células madres pluripotentes, humanas son placentales en origen. Los ensayos de selección de la presente invención pueden ser usados para identificar compuestos que inhiben o estimulan la angiogénesis y/o la vasogénesis. La presente invención se refiere a ensayos para seleccionar por moduladores de angiogénesis que comprenden la cultivación de células, madres pluripotentes humanas con porciones de vasos sanguíneos, i.e., anillos de vasos, bajo condiciones para permitir por angiogénesis y determinación el efecto que los compuestos de prueba tienen sobre el proceso de la angiogénesis. En una modalidad preferida de la invención, las células madres pluripotentes son de origen no embrionario.

En una modalidad preferida de la invención, las células madres no embrionarias son células madres derivadas de placenta. En otra modalidad preferida de la invención, las partes de los vasos sanguíneos son humanos en origen, preferiblemente del ""cordón—umbil-i-ca-l—humano .—— _ . _ La invención preferiblemente también proporciona ensayos para selección de moduladores de angiogénesis que comprenden la cultivación de anillos de vasos sanguíneos, o células madre, en la presencia de células tumorales, bajo condiciones -.para permitir por angiogénesis, y determinación del efecto que tienen los compuestos de prueba sobre el proceso de la angiogénesis. Preferiblemente los ensayos de selección de la invención -comprenden los pasos de: (a) proporcionar en un recipiente de crecimiento conveniente un medio de cultivo conveniente para mantener por lo menos el crecimiento de células endoteliales ; (b) cultivar por lo menos 24 horas en dicho recipiente de , crecimiento una muestra de vaso humano, estando dicho vaso libre de tejido conectivo; (c) cambiar el medio de cultivo por intervalos regulares; y (d) monitorear la formación de excrecencia de microvasos. Así, en una modalidad, la invención proporciona un método de identificación de un modulador de la angiogénesis que comprende: (a) la cultivación de una pluralidad de células madre en la presencia de un compuesto de prueba, por un tiempo y bajo condiciones convenientes para el crecimiento de células endotel iales ; y (b) la comparación de la cantidad de excrecencia de vasos de dichas células madre en la presencia —de- dicho - compuesto--de prueba—y- compararlo_a._una_cantidad._jde. control de excrecencia de los vasos, en donde si dicha excrecencia de los vasos es más grande o menor a dicho nivel de control de excrecencia de los vasos, el compuesto de prueba es identificado como un modulador de la angiogénesis . En una .modalidad especifica, dichas células madre son cultivadas con un sección de vaso. En otra modalidad especifica, dichas células , madre son cultivadas con una pluralidad de células > tumorales. En más modalidades especificas dichas células •tumorales son células de una linea celular tumoral . En otra modalidad especifica, dichas células madres son adicionalmente cultivadas en la presencia de hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico, o extracto cerebral bovino. En una . modalidad aún más especifica, dicho modulador de la angiogénesis es identificado como un agente anti-angiogénico . En otra modalidad especifica, dicho modulador de la angiogénesis es identificado como un agente angiogénico. En otra modalidad especifica, dicho cultivo de una pluralidad de células madre en la presencia de un compuesto de prueba es para por lo menos siete días. En otra modalidad especifica, dicho cultivo de una pluralidad de células madres en la presencia de un compuesto de prueba es para por lo menos cuarenta días. En otra modalidad aún más especifica, dichas células madres son cultivadas en una matriz que comprende f bri-na-:—En- otra- modalidad—-especifica,__dichas células__ma_dre_. son cultivadas en un gel fisiológico que comprende fibrina. En otra modalidad especifica, dichas células madre son cultivadas en un gel fisiológico que comprende colágeno no desnaturalizado . En otra modalidad, la invención proporciona un método de identificación de un modulador de la angiogénesis que comprende: (a) la cultivación de la sección de un vaso en la presencia de una pluralidad de células tumorales y un compuesto de prueba, por un tiempo y bajo condiciones convenientes para el crecimiento de células endoteliales y dichas células tumorales; y (b) la comparación de la cantidad de excrecencia de vasos de dicha sección de vaso en la presencia de dicho compuesto de prueba comparado a una cantidad de control de protuberancias de microvasos, en donde si dicha excrecencia de los vasos es más grande o menor que dicho nivel de control de excrecencia de los vasos, el compuesto de prueba es identificado como un modulador de la angiogénesis .

La presente invención también proporciona métodos de tratamiento individuales con compuestos identificados en el ensayo anterior. A este respecto, la presente invención se refiere a métodos de tratamiento que requieren la modulación --5—de—la—ang-iogénesis—humana o_-la._vasogénesis—que comprenden_la_ administración a pacientes en necesidad de tales compuestos de tratamiento o pequeñas moléculas que han sido identificadas como inhibidores de la angiogénesis humana o la vasogénesis. La presente invención también se refiere a métodos de 10 ¿tratamiento que requieren la modulación de la angiogénesis humana o la vasogénesis que comprenden la administración a pacientes en necesidad de tales compuestos de tratamiento o moléculas pequeñas que han sido identificadas como ^estimuladores de la angiogénesis o la vasogénesis. 15 De esta manera, en una modalidad, la invención proporciona un método de tratamiento de un individuo, teniendo dicho individuo una enfermedad o condición que se asocia con el crecimiento anormal de los vasos, que comprende la administración a dicho individuo de una cantidad 20 terapéuticamente efectiva de un inhibidor TNF-a. En una modalidad especifica, dicho inhibidor TNF-ct es un IMiD™. En otra modalidad especifica, dicho IMiD™ es Actimid™, Revimid™. En otra modalidad especifica, dicha enfermedad o condición es cáncer. En una modalidad más especifica, dicho cáncer es cáncer de mama. En otra modalidad especifica, dicha enfermedad o condición es seleccionada del grupo que consiste de inflamación, endometriosis, artritis, placas ateroscleróticas, —ret-i-nopa-t-ia—- diabética , neo ascularización _del glau_coma,_ tracoma, neovasculari zación de injerto de cornea, soriasis, escleroderma , hemangioma y cicatrización hipertrófica, adhesiones vasculares y angiofibroma . La invención también proporciona métodos de inhibición de la angiogénesis en cualquier contexto. Asi, la invención proporciona un método de inhibición de la angiogénesis, que comprende el contacto de una pluralidad de células, siendo -capaces dicha pluralidad de células de formar un vaso, con un inhibidor de TNF-a. En una modalidad, especifica, dicho inhibidor de TNF-a es actimid™ o revimid™. En otra modalidad especifica, dicha pluralidad de células es una pluralidad de células dentro de un individuo. En otra modalidad especifica, 'dicha pluralidad de células es una pluralidad de células en cultivo celular. La presente invención también se refiere a un equipo reactivo de ensayos de angiogénesis que comprende una muestra de células madre derivadas de placenta y una muestra de cordón umbilical humano. En otra modalidad de la invención, el equipo reactivo de ensayo comprende además una muestra de plasma sanguíneo de cordón umbilical humano. Ejemplos de compuestos de prueba que pueden utilizarse en conexión con los ensayos de selección de la invención -^-r-i-ncl-uyen,—pero—no -se-~limitan~a„pequeñas_moléculas.,_cpmpuest s_ orgánicos, compuestos inorgánicos, polipéptidos , péptidos, proteínas, hormonas, citocinas, oligonucleótidos , ácidos nucleicos u otras macromoléculas . Otros ejemplos de los compuestos moleculares pequeños que pueden usarse en conexión ¦con la invención, incluyen, pero no están limitados a, compuestos que inhiben la actividad TNF-a. Preferiblemente, el peso molecular del compuesto es menos de 1000 gramos/mol. Tales compuestos incluyen, pero no están limitados a derivados ciano y carboxilo de estírenos sustituidos, las imidas cíclicas, las cicloalquil amidas y cicloalquil nitritos, las aril amidas, el l-oxo-2- (2, 6-dioxo-3-fluoropiperidin-3yl) isoindolirías y 1 , 3-dioxo-2- ( 2 , 6-dioxo-3-fluoropiperidina-3- yl) isoindolinas, el 2- (2, 6-dioxopiperdin-3-yl ) -1- oxoisoindolinas tetra sustituido, los éteres imida/amida y alcoholes, las succinimidas y maleimidas, 1-oxo y 1,3 dioxo-2- ( 2 , 6-dioxopiperidin-3yl ) isoindolinas, amidas cíclicas no polipeptidas, ácidos alcanohidroxámicos imido y amido sustituidos, fenetilsulfones sustituidos, talidomina, aminotalidomina , 3- ( 4-amino-l-oxo-l , 3-dihidro-isoindol-2-yl ) - piperidina-2., ß-diona, además de sus análogos, productos de hidrólisis, metabolitos , derivados y precursores de talidomina, aminotalidomina, y 3- ( 4-amino-l-oxo-l , 3-dihidro---5-—i-soi-ndol--2—y -) -piperidina-2,-6=diona,—aril_ _amidas,,.__f.talimidas. 2- ( 2 , 6-dioxipiperidin-3-yl ) sustituidas y 2- (2, 6- dioxopiperidin-3-yl ) -1-oxoísoindoles sustituidos, y compuestos isoendole-imida . En una modalidad, los compuestos preferidos son talidomina, además de sus análogos, productos de 10 ^hidrólisis , metabolitos, derivados y precursores de talidomina . En otra modalidad, los compuestos son IMiD™, que incluyen pero no se limitan a Actimid™, y Revimid™ (Celgene Corp., Marren, NJ) , o SelCIDs™. 15 En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras no son derivadas de una placenta posparto pero en cambio son aisladas de otras fuentes tales como sangre del cordón umbilical, medula ósea, sangre periférica o sangre de adulto. 20 3.1 DEFINICIONES Como se usan aquí, los términos "angiogénesis" y "vasogénesis" se refieren a la generación de nuevos vasos sanguíneos .

Como se utiliza aquí, el término "bioreactor" se refiere a un sistema ex vivo para la propagación de células, producción o expresión de materiales biológicos y crecimiento o cultivo de tejidos celulares, organoides, virus, proteínas, pol-i-nucleotidos- -y~microorganismos..— . ___ Como se utiliza aquí, el término "célula madre embrionaria" se refiere a una célula que se deriva desde la masa celular interna de un blastocito (e.g., un embrión humano de 4 a 5 días de edad) y que es pluripotente . Como se utiliza aquí, el término "célula madre similar embrionaria" se refiere a una célula que no es derivada desde la masa celular interna de un blastocito. Como se usa aquí, una "célula madre similar embrionaria" puede también ser referida a una "célula madre de placenta". Una célula madre similar embrionaria es preferiblemente pluripotente. Sin embargo, las células madre, que pueden obtenerse de la placenta, incluyendo células madre similar embrionarias, células multipotentes , y células progenitoras comprometidas. De acuerdo a los métodos de la invención, las células madre similares a las embrionarias desde la placenta pueden ser colectadas de la placenta aislada una vez que ha sido sometida a desangrado y perfusado por un periodo de tiempo suficiente para eliminar células residuales.

Como se utiliza aqui, el termino "endotelio" se refiere a una capa delgada de células epiteliales lisas que normalmente revisten las cavidades serosas, vasos linfáticos, y vasos sanguíneos . . - —Como se utili za aquí , -el—termino__J_.desangrado" o, "desangramiento" cuando se usa con respecto a la placenta, se refiere a la extirpación y/o al drenado de manera sustancial de toda la sangre del cordón umbilical de la placenta. De acuerdo con la presente invención, el desangramiento de la ...placenta puede llevarse a cabo por, por ejemplo, pero no a manera de limitación, drenado, chorro inducido por gravedad, masaje, presión, bombeo, etc. En una modalidad preferida, el desangramiento de la placenta puede además ser llevado a cabo ¡mediante perfusado, enjuague o lavado con descarga de agua a la placenta con un fluido que puede o no puede contener agentes, .tales como anticoagulantes, para ayudar en el desangramiento de la placenta. Como se utiliza aquí, el termino "perfusión" o "difusión" se refiere al acto de derramar o pasar un fluido sobre o a través de un órgano o un tejido, preferiblemente el paso de un fluido a través de un órgano o un tejido con suficiente fuerza o presión para eliminar cualquier célula residual, e.g., células no adheridas al órgano o tejido. Como se utiliza aquí, el termino "perfusado" se refiere al fluido recolectado que sigue su paso a través de un órgano o tejido. En una modalidad preferida, el perfusado contiene uno o más anticoagulantes. Como se utiliza aquí, el término "células endógenas" se refiere a una célula "no ajena", es decir, una célula misma o -autól-oga,—que- -se-deriva-de-la..placenta .—. __ . Como se utiliza aquí, el termino "célula exógena" se refiere a una célula "ajena" i.e., una célula heteróloga (i.e., una célula "no autónoma" derivada de otra fuente diferente a la placenta donada) o una célula heteróloga (i.e., .una célula autónoma derivada de la placenta donada) que se deriva de un órgano o tejido diferente a la placenta. Como se utiliza aquí, el termino "organoide" se refiere a una agregación de una o más tipos de células congregadas en apariencia superficial o en estructura actual como cualquier órgano o glándula de un cuerpo mamífero, preferiblemente el cuerpo humano. Como se utiliza aquí, el término "célula multipotente" se refiere a una célula que tiene la capacidad para crecer en cualquiera de los subconjuntos de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de los mamíferos. Diferente de una célula pluripotente, una célula multipotente no tiene la capacidad para formar todos los tipos de células. Como se utiliza aquí, el termino "célula pluripotente" se refiere a una célula que tiene versatilidad de diferenciación completa, i.e., la capacidad para crecer en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de los mamíferos. Una célula pluripotente puede ser auto-renovable, y puede permanecer dormida o quieta dentro de ¦un—te-j-ido .- -A -d-iferenc-ia—de—una—célula—toti-pot-ent-e—( es- deci-r-,— una célula de huevo diploide, fertilizada) , una célula madre embrionaria no puede formar de manera usual un nuevo blastocito . Como se utiliza aquí, el término "célula progenitora" se refiere a una célula que esta comprometida a diferenciarse en un tipo especifico de céluLa o para formar un tipo especifico de tejido. Como se utiliza aquí, el termino "célula madre" se refiere a una célula principal que puede reproducirse de manera indefinida para formar las células especializadas de tejidos y .órganos-. Una célula madre es una célula multipotente o pluripotente desarrollada. Una célula madre puede dividirse para producir dos células madres hijas, o una célula madre hija y una célula progenitora ("transitoria"), las cuales entonces proliferan en la madurez del tejido como células totalmente formadas. Como se utiliza aquí, el termino "célula totipotente" se refiere a una célula que es capaz de formar un embrión completo (e.g., blastocito).

Como se utiliza aquí el termino "vasogénesis" se refiere a la generación o formación de tubos o microtúbulos . Como se utiliza aquí, el termino "anillo de vaso" quiere decir una sección del vaso. Generalmente la sección del vaso -es—una—sección -tr-ansver-sa-l—que— aparenta --forma—de—an-i-l-io>~pero- puede ser cualquier sección del vaso que sea cultivable. El vaso puede ser cualquier vaso (es decir, arterial, venoso, linfático, etc . ) 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1 (A-D) . Fotomicrografías de células cultivadas en ensayos de anillo de vasos de cordón umbilical como se describe en la sección 6.2. A. Control positivo. La explantación se cultivó en medio +EGCF 200 µg/ml. Células 'numerosas que emigraron desde la explantación rodearon la explantación y las células individuales exhibieron extensiva excrecencia. B. Control negativo. La explantación se cultivó en un medio de placenta condicionado + suplemento. En la .ausencia de EGCF, menos células emigraron de la explantación que en el control positivo (A) . C. Tratamiento grupo 3. La explantación se cultivó en un medio de placenta condicionado.

En la presencia de 100 µ?/ml de talomida™, las células emigraron a una distancia más corta de la explantacion que en el control positivo A. D. Tratamiento grupo 2. La explantación se cultivó en un medio de placenta condicionado + 200 de EGCF + 10 µg/ml de Talomid™ . En la presencia de 10 µ?/ml de Talomid™, las células emigraron a una distancia más corta de la explantación y exhibieron menos densidad de excrecencia que en el' control positivo (A) . Las figuras 2 (A-C) . Fotomicrografías de células cultivadas en ensayos de anillo de vaso de cordón umbilical como se muestra en la sección 6.2. A. Control. Las células se cultivaron en medio de placenta condicionado + 200 µg/ml de 'ECGF + 1 µg ml de DIVISO. B. Las células se cultivaron en un medio de placenta condicionado + 200 µg/ml de ECGF + 1 µg ml de DMSO + 1 µg/ml de Talomid™. Son vistas menos células que en el control (A) . B. Las células se cultivaron en un medio de placenta condicionado + 200 µg/ml de ECGF + 1 µ?/ml de DMSO + 10 µ?/p?? de Talomid™. Son vistas menos células que en el control (A) o en (B) . Las figuras 3 (A-B) . Fotomicrografías de células cultivadas en ensayos de anillo de vasos de cordón umbilical como se describe en la sección 6. A. Control. Las células se cultivaron en un medio de placenta acondicionado + DMSO. Las células exhiben de manera predominante un fenotipo no ramificado (por ejemplo, endotelio) . B. Las células se cultivaron en medio de placenta condicionado + DMSO + Talomid . Más células exhiben un fenotipo ramificado (por ejemplo, neuronal) que en el control (A) . La figura 4 es una representación gráfica de los efectos de diferentes concentraciones de Thall, Actimid™ (CC-4047) y Fumagi"lina~:"Sobre~ lra~angi'ogénesi"s "humana".' ~ ~~ ' La figura 5 son pictomicrografias de células madre similares las embrionarias de placenta cultivadas en un ensayo de anillo de vaso de cordón umbilical como se describe en la sección 6.3 en la presencia de concentraciones variadas de Thall, Actimid™ (CC-4047) y Fumagilina. La figura 6 es una representación gráfica de un ensayo de un anillo de vaso de cordón umbilical. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN. La presente invención se refiere a sistemas de ensayo in vitro que utilizan células madre pluripotentes , humanas, para la identificación de compuestos que modulan la angiogénesis o la vasogénesis humana. Los ensayos de selección de la presente invenció se pueden utilizar para identificar compuestos que inhiben o estimulan la angiogénesis y/o la vasogénesis. La presente invención se refiere a ensayos para la selección de moduladores de la angiogénesis que comprenden cultivos de células madres pluripotentes humanas o partes de vasos sanguíneos bajo condiciones para permitir por angiogénesis y determinación del efecto que compuestos de prueba tienen sobre el proceso de la angiogénesis . En una modalidad preferida de la invención las células madres pluripotentes son en origen no embrionarias. En una modalidad particularmente preferida de la invención, las células madres —-po -embrionarias- son" célul'as-"madres~derivada"s de~~placent'a ~En otra modalidad preferida de la invención de la invención, las partes de los vasos sanguíneos son humanos en origen, y son preferiblemente derivadas de cordón umbilical humano. En otra modalidad de la invención, las células madres o progenitoras ¦ no son derivadas de una placenta perfusada de posparto, pero son aisladas de otras fuentes tales como sangre de cordón umbilical, medula ósea, sangre de la periferia o sangre de adulto . La presente invención abarca ensayos de selección in vitro para la identificación de moduladores de la angiogénesis, ensayos que dependen del co-cultivo de células madres pluripotentes humanas con vasos sanguíneos derivados del cordón umbilical humano. En una modalidad preferida, las células madre pluripotentes son de placenta en origen. La presente invención también se refiere a equipos de ensayo de la angiogénesis que comprenden una muestra de células madre derivadas de placenta y una muestra de cordón umbilical humano. En otra modalidad de la invención, los equipos de ensayo comprenden además una muestra de plasma de sanqre de cordón umbilical humano. La presente invención también se refiere a métodos de tratamiento que requieren la modulación de la angiogéneis -5-—humana——o—vasogénesis—que-"comprende~~~±ar admin1stración a" pacientes en necesidad de tales compuestos de tratamiento o moléculas pequeñas que se han identificado como inhibidores de la angiogénesis humana o vasogénesis. La presente invención también se refiere a métodos de tratamiento que requieren la 10 -modulación de la angiogénesis humana o la vasogénesis, que comprenden la administración a pacientes en necesidad de tales compuestos de tratamiento o moléculas pequeñas que se han identificado como estimuladores de la angiogénesis humana o la vasogénesis . 15 Ejemplos de compuestos de prueba que pueden utilizarse en conexión con los ensayos de selección de la invención incluyen, pero no se limitan a moléculas pequeñas, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos, polipéptidos, péptidos, proteínas, hormonas, citocinas, oligonucleótidos, ácidos 20 nucleicos, u otras macromoléculas . * Ejemplos de compuestos moleculares pequeños que pueden utilizarse en los métodos de tratamiento descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, compuestos que inhiben la actividad TNF-cc. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, derivados ciano y carboxilo de estírenos sustituidos, las imidas cíclicas, las cicloalquil amidas, y los cicloalquil nitritos, las aril amidas, el l-oxo-2- (2 , 6-dioxo-3-fluoropiperidin-3yl ) isoindolinas y 1 , 3-dioxo-2- (2 , 6-dioxo-3-f-luoroipiperidina-3-yl") isoindoTinasT" " 3-yl ) -1-oxoisoindolinas tetra sustituido, los éteres imida/amida y alcoholes, las succinimidas y maleimidas, 1-oxo y 1,3 dioxo-2- (2 , 6-dioxopiperidin-3yl ) isoindolinas, amidas cíclicas no polipeptidas , ácidos alcanohidroxámicos imido y amido sustituidos, fenetilsulfones sustituidos, talidomina, aminotalidomina, 3- (4-amino-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-yl ) -piperidina-2 , 6-diona, además de sus análogos, productos de hidrólisis, metabolitos, derivados y precursores de talidomina, aminotalidomina, y 3- (4-amino-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-yl ) -piperidina-2 , 6-diona, aril amidas, ftalimidas 2- (2 , 6-dioxipiperidin-3-yl ) sustituidas y 2-(2,6-íiioxopiperidin-3-yl ) -1-oxoí soindoles sustituidos, y compuestos isoendoles-imida . En una modalidad, los compuestos preferidos son talidomina, además de sus análogos, productos de hidrólisis, metabolitos, derivados y precursores de talidomina . Cualquier célula madre humana puede ser usada de acuerdo con los métodos de la invención, incluyendo pero no limitados a, células madre aisladas de la sangre del cordón umbilical tcélulas X,CB") , placenta y otras fuentes. Las células madre pueden incluir células pluripotentes , es decir., células que tienen versatilidad de diferenciación completa, que son auto renovables, y pueden permanecer dormidas o quietas dentro del -5——teja-do- has»—•cél-ul-as~madre pueden"también inclui "célillas mult ipotentes o células progenitoras comprometidas. En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son viables, quietas, células madre pluripotentes que existen dentro del termino de la placenta que pueden ser recuperadas 10 siguiendo un parto exitoso y la expulsión de la placenta, el desangrado y la perfusión que resulta en la recuperación de células madre pluripotentes o multipotentes . 5.1 ENSAYOS DE SELECCIÓN PARA IDENTIFICAR MODULADORES DE LA 15 ANGIOGÉNESIS . La presente invención abarca ensayos de selección para identificar moduladores de la angiogénesis que comprenden la selección por la capacidad de un compuesto de prueba para modular la vasogénesis o formación de tubos. Dé acuerdo con 20 este aspecto de la invención, células madre pluripotentes, humanas, o anillos de vasos sanguíneos se hacen crecer en cultivo y se contactan con compuestos de prueba, y se determina el efecto sobre la angiogénesis. 5.1.1 Métodos de ensayo La presente invención proporciona un método para identificar moduladores de la vasogénesis o la angiogénesis , en donde los vasos se originan de células madre colocadas en placas. Las células madre son colocadas en placas, y las -cé1-u1as -adherentes--son~separ-adas~de~poblaciones~ño"acihereñtes preferiblemente después de 24 horas de cultivo. Células adherentes son cultivadas en medios de cultivo convenientes.

Cualquier medio de cultivo conveniente esta incluido en el método; un medio preferido es DMEM adicionado con 5-20% de suero de sangre de cordón umbilical (CBS) y antibióticos.

Preferiblemente, el medio se . adiciona además con hidrocortisona , factor de crecimiento epidérmico y/o extracto de cerebro de bovino. El cultivo de células madre resulta en la vasogénesis espontánea. La vasogénesis espontánea se puede caracterizar por el ensamble de estructuras micro tubulares.

Los inhibidores de la angiogénesis pueden ser identificados en base a su capacidad de prevenir o incrementar el proceso de formación de microtubos comparado a un control, por ejemplo, condiciones de ensayo en la ausencia del compuesto de prueba.

Contrariamente, los estimuladores de la angiogénesis se pueden » identificar en base a su capacidad para reforzar o incrementar el proceso de formación de microtubos en comparación a un control, por ejemplo, condiciones de ensayo en la ausencia del compuesto de prueba.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para seleccionar sustancias para activar la modulación de la angiogénesis que comprende la cultivación de células madre pluripotentes no embrionarias de un espécimen biológico j unt-o-con—un-gel—f siológico"nutrientes coh"veñTeñtes y" "por 1o menos una sustancia que se sospecha tiene la actividad de modulación de la angiogénesis por un tiempo y bajo condiciones para permitir el crecimiento de nuevo tejido vascular, examinar dicho fragmento por el crecimiento de nuevo tejido vascular y comparar dicho crecimiento al de un control. El termino "modulación de la angiogénesis" se refiere a la capacidad de una sustancia para modular o cambiar la actividad angiogénica normal de los fragmentos de los vasos sanguíneos e incluye la inhibición, promoción, y reforzamiento de la actividad angiogénica. El método se puede utilizar para compuestos de prueba o sustancias que son posibles inhibidores, promotores, o reforzadores de la angiogénesis. El termino "espécimen biológico" se refiere a cualquier especie que es esencialmente derivada de un tejido animal en donde es deseable probar si una sustancia tiene la actividad de modulación de la angiogénesis para ese tejido particular y/o especies animales. Preferiblemente, el espécimen biológico es derivado de tejido humano.

I Las células madre que pueden utilizarse de acuerdo con la invención, incluyen, pero no se limitan a, células madre de (CB) de sangre de cordón umbilical, células madre de placenta, células madre (ES) embrionarias, células madre « similares- a—las—embrionarias~~cel'ulas madre"~be trofoblastos , células progenitoras , y células totipotentes , multipotentes y pluripotentes . En una modalidad preferida, las células madre pluripotentes no embrionarias son utilizadas para ambos, el control y los cultivos siendo seleccionadas con compuestos de prueba que tienen potencial en la actividad de modulación de la angiogénesis . La presente invención también abarca la identificación de moduladores de la angiogénesis, en donde los vasos sanguíneos se originan de anillos -de vasos sanguíneos cultivados, es decir, secciones de vasos creciendo in vitro. De acuerdo con este aspecto de la invención, secciones de anillos de vasos, preferiblemente obtenidos de cordón umbilical, son cultivados bajo condiciones que permiten la excrecencia de los vasos. En una modalidad los vasos sanguíneos aproximadamente de 1-2 mm de diámetro y de 1-2 cm de longitud son extirpados de cordón umbilical humano. Preferiblemente, tal escisión se lleva a cabo dentro de 12 a 24 horas del nacimiento. Ambos, el tejido arterial y el venoso son cosechados y mantenidos de manera separada. Los vasos sanguíneos son colocados en un medio de cultivo, tal como el DMEM que contiene 2.5 µq/ml de fungizona, y son cortados en secciones de 1-2 mm de largo. Fragmentos de vasos sanguíneos son preferiblemente liberados de coágulos residuales y mojados en un medio de cultivo antes de usarse. Lía-d secc orT y" seccíonamiento de los vasos sanguíneos se lleva mejor a cabo con la ayuda de un microscopio quirúrgico. Los vasos sanguíneos de origen venular o arterial también pueden ser utilizados. Preferiblemente, para cada experimento, son utilizados fragmentos de vasos de únicamente un vaso. Los ensayos de la excrecencia de los vasos son llevados a cabo en cajas de petri o placas de cultivo de pozos múltiples ,(Costar, Cambridge, Mass.) . Los placas de cultivo son •preferiblemente preparados mediante el revestimiento cada uno con 0.1 de gelatina (Sigma, St Louis, MO) o Matrigel para formar una matriz. Continuando con el revestimiento, los placas de cultivo se revisten con un medio de cultivo. Como una modalidad ejemplar de la invención, siguiendo con el revestimiento de las placas, 50 µ? de plasma de sangre de cordón umbilical en 5 mi de DMEM se adiciona a cada caja/pozo para formar una película superficial sobre la matriz. La película se deja colocada a 37 °C por 90 minutos la cual después se elimina dejando una película delgada en cada caja/pozo. Una vez que la preparación de las placas de cultivo esta completa, los segmentos de anillo de los vasos se colocan en las placas de cultivo. Los segmentos de anillo de los vasos generalmente se adhieren a los materiales de la matriz en 12 horas, —5r—permitiendo—la adi"ción~del me io- ~s in 11 separación de los segmentos de vasos debido a la flotabilidad. Siguiendo la adherencia, los vasos sanguíneos son cultivados a 37 °C en ambiente humidificado por 7 a 21 días. Preferiblemente el medio se cambia a intervalos regulares, por ejemplo, 10 intervalos de 72 horas. Condiciones de cultivo ejemplares comprenden mantener los cultivos en DMEM adicionado con 2% de plasma de sangre de cordón umbilical, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y heparina. Preferiblemente, el .medio es además suplementado con hidrocortisona, factor de 15 crecimiento epidérmico y/o extracto cerebral de bovino. En una modalidad preferida, los fragmentos de los vasos sanguíneos son cultivados por un tiempo suficiente para establecer un una buena respuesta angiogénica antes que la sustancia que es administrada, tal como, por ejemplo, 14 días antes de la 20 administración. La extensión de esta respuesta es entonces preferiblemente cuantificada y registrada. Son administrados compuestos de prueba durante el cultivo para determinar cualquier modulación de la angiogénesis . Estos compuestos de prueba pueden ser administrados en un cambio de medio, o pueden ser adicionados de manera separada a cualquier tiempo durante el cultivo. Preferiblemente, los compuestos de prueba son adicionados una vez que las células madre o los anillos de los vasos son adheridos, y el cultivo continua por los—siete~di"as: completos'!"7- Siñ - em afgo7~ G5s~~~ compuestos de prueba pueden ser adicionados en otros tiempos. Por ejemplo, la excrecencia de los vasos puede permitirse en un medio por l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 días o más, continuando mediante una administración individual del compuesto de prueba. Cada compuesto de prueba se evaluara a varias concentraciones para posibilitar la generación de un análisis de reacción de dosificación. Un control positivo puede definirse como, por ejemplo, la reacción (por ejemplo, la excrecencia de los vasos) al suplemento (ECGS; Collaborative Research, Bedford, MA) de crecimiento de células endoteliales y el control negativo puede definirse, por ejemplo, como la reacción únicamente al medio. La excrecencia de los vasos puede ser marcada como ambos como comparación cuantitativa a controles positivos y negativos como se define en la tabla de abajo y de manera morfométrica como ambos, la distancia máxima de el crecimiento de los brotes de los vasos en micrones del anillo de vaso y como el área total de protección de células endoteliales (ECA) / el área del anillo de vaso (VRA) .

En otra modalidad más, los ensayos de selección de la invención, una sección pequeña de anillos de vasos umbilicales humanos obtenidos de arterias umbilicales se implanta en una solución, tal como colágeno humano plus MATRIGEL(R), y se cuitiva~en_ un :r.edic~opr. iir:i"zado-, prefeTfilDiéTnerite J un medio libre de suero que contiene factores de crecimiento. Los anillos de vasos umbilicales pueden ser cultivados en por una o cuatro semanas, de manera óptima tres semanas, o hasta un tiempo tal que los vasos se desarrollen desde los anillos. Estos compuestos pueden ser ensayados por su capacidad para reforzar o inhibir el crecimiento de los vasos como una indicación de su capacidad para inhibir o reforzar la angiogénesis . En una combinación de los dos métodos anteriores, los anillos de los vasos se obtienen y colocan en placas como anteriormente, y son cultivados en la presencia de células madre, también como se obtuvieron anteriormente. Los anillos de los vasos y las células madre son co-cultivadas por 7 a 21 días, en un tiempo en el que la extensión de la excrecencia de los vasos este determinada. Aquí, cualquier medio de cultivo que permita el crecimiento de células endoteliales , y otras células puede ser usado. En esto se espera que la adición de células madre resultará en la diferenciación de estas células en tipos de células que facilitaran el desarrollo de los vasos, de esta manera recreando el medio ambiente natural de los vasos de manera más exacta que otros métodos de ensayo. Como anteriormente, los compuestos de prueba y control pueden ádicionarse al medio de cultivo al comienzo del cultivo, o a -cuaiqui-er- tiempo" durante'"e"l—cul'tivo ^ ~ Asi, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la capacidad de una sustancia para modular (por ejemplo, cualquiera de los dos prevenir o estimular) el crecimiento de nuevo tejido vascular y/o inducir la regresión de nuevo tejido vascular que comprende la cultivación de células madre pluripotentes no embrionarias ^unto con una sección de vaso, gel fisiológico y nutrientes convenientes por un tiempo suficiente para permitir el crecimiento de nuevo tejido vascular, administrar la sustancia a dicho fragmento, y cultivar dicho fragmento junto con nutrientes convenientes por un tiempo, entonces examinar dicho fragmento para determinar si ha ocurrido la prevención del crecimiento de nuevo tejido vascular y/o la regresión de nuevo tejido vascular. * En otra modalidad, dichas células madre o anillos de vasos pueden ser co-cultivados con células tumorales, particularmente células que tienen un origen en cáncer metastático. Debido a que muchos cánceres agresivos o metastáticos tienen un componente angiogénico (esto es, el tumor secreta factores que fomentan la angiogénesis ) , un co-cultivo tal recreará el medio ambiente natural de un tumor. Las células tumorales utilizadas en un cultivo tal pueden ser células tumorales obtenidas directamente de un individuo y almacenadas- -o—cualquiera1 de~~ün número de" lineas ele c~eíuTas tumorales inmortalizadas conocidas por aquellos de experiencia en el arte. Tales lineas de células tumorales incluyen, por ejemplo, células HTB-104 o CRL-1973 (células de tumor testicular; disponibles . del American Type Culture Collection); o células BT483, Hs578T, HTB2 , BT20, o T47D (lineas de células de cáncer de mama) . Otras lineas de células cancerígenas conocidas pueden ser utilizadas también por aquel los en el arte . La naturaleza de la matriz sobre la que los anillos de los vasos y/o las células madre o tumorales son cultivadas es importante para el éxito de la angiogénesis. Por lo tanto, una modalidad preferida de la invención es para estos tejidos y células cultivados sobre placas o platos que han sido preparados con un gel fisiológico para crear una matriz de crecimiento. Preferiblemente, esta matriz de crecimiento comprende colágeno humano no desnaturalizado. En otra modalidad preferida, el gel fisiológico es fibrina, colágeno o MATRIGEL(R). Más preferiblemente el gel es fibrina.

Cualquier sustancia, o combinación de sustancias que se sospecha de actividad de modulación de la angiogénesis puede ser seleccionado mediante el método. Estas incluyen preparaciones purificadas de compuestos y varios extractos -5— taies como extractos—de_tej'i:dos"~dé~"p antas "y'"a!Timal"e"s o pueden" ser de un microorganismo. De conformidad, tales sustancias pueden tener que ser realizadas en una forma conveniente para la administración a las células madre pluripotentes no embrionarias. Aquellos expertos en el arte se familiarizarán 10 con varios métodos para formular tales sustancias en forma conveniente para la administración. En otra modalidad preferida, cuando el método se utiliza por compuestos de prueba para el reforzamiento de la angiogénesis, el medio esta sustancialmente libre de suero tal 15 que el suero total esta ausente y el medio no tiene constituyentes de suero o un mínimo numero de constituyentes de suero u otras fuentes que son necesarias para la angiogénesis . En otra modalidad preferida, después de que la sustancia 20 se administra, las células madre pluripotentes no embrionarias son cultivadas por un tiempo suficiente para permitir la prevención y/o la regresión del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, tal como, por ejemplo, de 7 a 14 días después de que se administra la sustancia. El estado de crecimiento de los nuevos vasos sanguíneos es entones comparado a la reacción registrada y preferiblemente a un control. 5.1.2. Caracterización de la angiogénesis De acuerdo con la presente invención, la angiogénesis — uede—ser -medida—mediante l'a ident'i'f cációñ"~dé~~ marcadores superficiales de células, utilizando técnicas estándar en el arte, tal como la inmunocitoquímica . De acuerdo con este aspecto de la invención, muestras que manifiestan reacciones (i.e., nuevo crecimiento vascular) angiogénicas detectables pueden ser ensayadas utilizando inmunohistoquímica . Ejemplos de anticuerpos que pueden utilizarse incluyen el antígeno relacionado con el Factor VIII anti-humano de ratón, monoclonal (Dako, Dinamarca), un mAb de cálulas endoteliales , anti-humanas (Gibco, Grand island, N..Y.) y un mAb específico de CD31 (clone 20G5) producido en el John Curtin School of Medical Research. El teñido inmunohistoquímico de muestras angiogénicas puede ser realizados para detectar el Factor VIII relacionado al antígeno, una reacción que claramente demuestra que la excrecencia son vasos sanguíneos. Los vasos también reaccionan con un mAb especifico para células (Gibco) endoteliales humanas y con un mAb para CD31, un antígeno únicamente manifestado sobre células endoteliales, plaquetas y algunos leucocitos. El exámen de muestras angiogénicas bajo el microscopio electrónico puede también ser realizado para revelar células con una morfología endotelial clásica. Siguiendo con el cultivo por 7 a 21 días, la angiogénesis se cuantifica y compara con los cultivos de control. En el —5:—caso- de- -sustancias- -anti-angrogénicas ~putát as~ se —determinará" un crecimiento reducido de vasos sanguíneos comparado con los cultivos de control. La invención también abarca el ensayo de sustancias de prueba por su capacidad para inducir la regresión de vasos sanguíneos recientemente formados mediante 10 la adición de la sustancia de prueba para establecer la reacción de la angiogénesis y monitorear la "muerte posterior" de los vasos sanguíneos de manera microscópica para los próximos 7 a 14 días. En ciertas modalidades, la angiogénesis puede 15 identificarse mediante la caracterización de los genes expresados de manera diferencial (por ejemplo, la caracterización de un banco de genes de una célula (s) progenitora no diferenciada de interés contra un banco de genes de una célula diferenciada derivada de la célula 20 progenitora) . Por ejemplo, métodos de amplificación de ácido nucleico tales como la reacción en cadena de polimerización (PCR) , o métodos de amplificación basados en trascripción (e.g., trascripción in vitro (IVT)) pueden utilizarse para describir la expresión de los genes en diferentes poblaciones de células, e.g., mediante el uso de un microarreglo de polinucleotido . Tales métodos para describir o perfilar la expresión diferencial de genes son bien conocidos en el arte (vea e.g., Wieland et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA -r5-—8-7·:- 2-7-2-0-2 -24 ;· -- -sitsyn—et^-al"-—G993 ~Sc¾nce~2 9":" ~94'6-95iT Lisitsyn et al., 1995, Meth. Enzimology 254:291-304; Patente Norteamericana No 5,436,142; Patente Norteamericana No 5,501,964; Lisitsyn et al., 1994, Nature Genetics 6: 57-63; Hubank and schatz, 1994, Nucleic Acids Research 22 : 5640- 10 5648; Zeng et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385; Patente Norteamericana No 5,525,471; Linsley et al., Patente Norteamericana No 6,271,002; titulada "RNA amplification method, " emitida el 7 de agosto del 2001; Van Gelder et al., Patente Norteamericana No 5,716,785, titulada "Processes for 15 genetic manipulations using promoters," emitida el 10 de Febrero de 1998; Stoflet et al., 1998, Science 239:491-494, 1988; Sarkar and Sommer, 1989, Science 244:331-334; Mullís et al., Patente Norteamericana No 4,683,195; Malek et al., Patente Norteamericana No. 5,130,238; Kacian and Fultz, Patente 20 Norteamericana No 5,399,491; Burg et al., Patente Norteamericana No 5,437,990; Van Glder et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1663 ; Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol. 14, 1675; Shannon, Patente Norteamericana No 6,132,997; Lindemann et al., Patente Norteamericana No 6,235,503, titulada "Procedure for subtractive hybridization and difference análisis," emitida el 22 de Mayo del 2001). Equipos comercialmente disponibles están disponibles para la descripción de genes, por ejemplo, la series de equipos de -5—-despliegue-FROFILE™ -(Qbiogene'; Carlsbad,~~CA "Tas cuales usan un enfoque en base gel para describir la expresión de los genes. Los equipos utilizan Despliegue Diferencial del Fragmento de Restricción-PCR (RFDD-PCR) para comparar los patrones de expresión de genes en células eucarióticas . Un 10 equipo (Clontech) de Sustracción de Selección (PCR) y un equipo (Clontech) de Selección Diferencial por Selección por - PCR pueden también ser usados, lo cual permite la identificación de clones expresados de manera diferencial en una genoteca substraída. Después de que se generan los bancos 15 de genes expresados de manera diferencial con el equipo de sustracción selecto-PCR, se utiliza el equipo de selección diferencial selecto-PCR. La genoteca substraída se hibridiza con sondas sintetizadas directamente desde las poblaciones de prueba y accionamiento, una sonda hecha de el ADNc, y una 20 sonda hecha del ADNc sustraído inverso (una segunda sustracción se realiza en reversa) . Los clones que hibridizan para probar pero no para accionar son expresados de manera diferencial; sin embargo, sondas no sustraídas no son lo suficiente sensitivas para detectar mensajes poco comunes. Las sondas sustraídas son grandemente enriquecidas por el ADNc expresados de manera diferencial, pero pueden dar resultados positivos falsos. Usando ambos, sondas sustraídas y no sustraídas de acuerdo a las instrucciones del fabricante (G-lontech-) -- se—i^ientrfica~~lOS~~genes"~expresa"dós' de manera diferencial. ¾ 5.2 LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN Ejemplos de compuestos de prueba que pueden ser seleccionados para la modulación de la angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos, polipéptidos , péptidos, proteínas, hormonas, citocinas, oligonucleotidos, ácidos nucleicos u otras macromoléculas . El término "compuesto" como se utiliza aquí describe cualquier molécula, por ejemplo, un farmacéutico orgánico no proteínico o proteínico. Generalmente, una pluralidad de mezclas de ensayo se corren en paralelo con concentraciones de compuestos diferentes para obtener una respuesta diferencial a J.as varias concentraciones. De manera típica, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a cero concentración o bajo el nivel de detección. Compuestos candidatos abarcan numerosas clases de guímicqs, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferiblemente pequeños compuestos orgánicos que tienen un peso molecular de más de 50 y menor a aproximadamente 2,500 daltons. Compuestos candidatos comprenden grupos funcionales para la interacción estructural con proteínas, particularmente que enlacen con hidrógeno, y típicamente incluyen por lo menos —una ami-na-,-——carboni-lo —-hidroxrlO ' o~un: grupo " ~car]5oxílo',' preferiblemente por lo menos dos de los grupos funcionales químicos. Los compuestos candidatos frecuentemente comprenden carbono cíclico en estructuras heterocíclicas y/o aromáticas o estructuras poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Compuestos candidatos también pe encuentran a entre biomoléculas que incluyen, pero no se limitan a, péptidos, sacárídos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. » Compuestos moduladores candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes que incluyen, genotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, numerosos medios están disponibles por síntesis dirigida y aleatoria de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen expresión de oligonucleotidos y oligopeptidos aleatorios. Alternativamente, genotecas de compuestos naturales en la forma de extractos de bacterias, hongos, plantas o animales están disponibles o se producen con facilidad. Adicionalmente, genotecas producidas de manera sintética o natural son modificados con facilidad a través de medios convencionales químicos, físicos y bioquímicos, y pueden utilizarse para producir genotecas combinadas. Agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones -di-rigidas - -o—aieatorras~~ta "es~"como~*a'c*il¾c~iorí7 algui lacion , esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales. Nuevos agentes potencialmente terapéuticos también pueden crearse utilizando métodos tales como el diseño racional de fármacos o el modelaje por computadora. La selección puede ser dirigida para conocer compuestos fármacológicamente activos y análogos químicos del mismo, o para nuevos compuestos con propiedades desconocidas tales como aquellos creados a través de diseño racional de fármacos. 5.2.1 Inhibidores de TNF-ct ' Miembros de una clase de compuestos se han identificado, utilizando los métodos de ensayo divulgados aquí o en otra parte, como moduladores de la angiogénesis y/o la vasogénesis; específicamente, estos compuestos son compuestos anti- ángiogénicos ; más específicamente, estos compuestos incluyen IMiDs™ (Celgene Corporation) . Como se utiliza aquí y a menos que otra cosa se indique, el termino "compuestos anti- angiogénicos" o "(IMiDs™)" utilizados aquí abarca pequeñas moléculas orgánicas que inhiben de manera notable el TNF-a, y que tienen una actividad anti-angiogénica ; esto es, ellas actúan para inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos. Específicamente, los compuestos anti-angiogénicos de la invención aumentan la degradación de TNF- ARNm. Esta clase incluye racémico™ enriquecido—en—forma—estereomérica—o—-puro— estereoméricamente y sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, hidratos, estereoisómeros , clatratos, y profármacos de estos compuestos anti-angiogénicos. Compuestos preferidos utilizados en la invención son pequeñas moléculas orgánicas que tiene un peso molecular menor a aproximadamente 1000 g/mol, y no son proteínas, péptidos, oligonucleótidos, oligosacáridos , u otras macromoléculas . Compuestos específicos de la invención son discutidos' abajo. Estos compuestos pueden obtenerse de manera comercial de Celgene (Warren, NJ) , o pueden prepararse de acuerdo con los métodos descritos en las patentes o publicaciones enlistadas aquí. Ejemplos específicos de compuestos anti-angiogénicos de la invención, incluyen, pero no se limitan a, derivados ciano y carboxi de estírenos sustituidos tales como aquellos divulgados en la Patente Norteamericana No. 5,929,117; 1-oxo-2- ( 2 , 6-dioxo-3-fluoropiperidin-3il ) isoindolinas y 1,3-dioxo-2- ( 2 , 6-dioxo-3-fluoropiperidina-3-il ) isoindolinas tales como aquellas descritas en la Patente Norteamericana No 5,874,448; _as 2- (2, 6-dioxopiperdin-3-il ) -1-oxoisoindolinas tetra sustituidas descritas en la Patente Norteamericana No 5,798,368; 1-oxo y 1 , 3-dioxo-2- ( 2 , 6-dioxopiperidin-3-il ) isoindolinas (por ejemplo, derivados de 4-metil de talidomida -y—£?-12·)-,—que- -incluyen,—pero—que—no~se—limitan—a,—aquellos-divulgados en la Patente Norteamericana 5,635,517; y una clase de amidas cíclicas no polipéptidas divulgadas en las Patentes Norteamericanas No 5,698,579 y 5,877,200. La totalidad de cada una de las patentes identificadas aquí están incorporadas aquí por referencia. Compuestos anti-angiogénicos que nos son de la invención, sin embargo, incluyen talidomida. Otros compuestos anti-angiogénicos específicos de la invención incluyen, pero no se limitan a, 1-oxo y l,3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas sustituidas con araino o sustituidas o con amino sustituido en el anillo benzo como se describe en la Patente Norteamericana No 5,635,517 la cual esta incorporada aquí. Estos compuestos tienen la estructura en la que una de X y Y es C=0, la otra de X y Y es C=0 o CH2, y R2 es hidrógeno o alquilo inferior, metilo en particular. Compuestos anti-angiogénicos específicos incluyen pero no se limitan a : —~l--oxo-2--(-27-6-diOxopiperidin-3-i )~4-amÍnd'sbXrido - l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina; l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -6-aminoisoindolina; l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -7-aminoisoindolina; 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -4-aminoisoindolina; y 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -5-aminoisoindolina; Otros compuestos anti-angiogénicos específicos de la invención corresponden a una clase de 2- (2, 6-dioxopiperidin-3- il) ftalimidas sustituidas y 2- (2 , 6-dioxopiperidin-3-il ) -1- oxoisoindoles sustituidos, tales como aquellos descritos en las Patentes Norteamericanas No 6,281,230; 6,316,471; 6,335,349; y 6,476,052, y la Aplicación Internacional de Patente No. PCT/US97/13375 (Publicación Internacional No O 98/03502), cada una de las cuales esta incorporada aquí por referencia en su totalidad. Compuestos representativos de esta clase son de las formulas: en donde R1 es hidrógeno o metilo. En una modalidad separada, la invención incluye el uso de formas enantiómeras puras (por ejemplo, enantíómeros (R) o (S) ópticamente puros) de estos compuestos. Aun otros compuestos anti-angiogénicos específicos de la invención corresponden a una clase de isoindol-imidas divulgadas en las aplicaciones de patentes norteamericanas nos. 10/032,286 y 09/972,487, y la Solicitud Internacional No. PCT/US01/50401 (Publicación Internacional No. WO 02/059106), cada una de las cuales esta incorporada por referencia en su totalidad. Compuestos representativos son de la formula II: y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, clatratos, enantiómeros, diastereómeros , racematos, y mezclas de los mismos estereoisomeros , en donde: , Uno de X y Y es C=0 y el otro es CH2 o C=0; R1 es H, alquilo (Ci-C8) , cicloalquilo (C3-C7) , alquenilo (C2-C8) , arilo, bencilo, alquinilo (C2-C8) , . alquil (C0-C4 ) -heterocicloalquil (Ci-C6) , alquil (C0-C4 ) -heteroaril (C2-C5) , C(0)R3, C(S)R3, alquil (CI-C8) -N(R6) 2, alquil (Ci-C8) -0R5, alquil (Ci-Ce) -C (O) OR5, C(0)NHR3, C(S)NHR3, C(0)NR3R3', C(S)NR3R3' o alquil (d-C8) -O (CO) R5; R2 es H, F, bencilo, alquilo (Ci-C8 ) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) ; R3 y R3 son de manera independiente alquilo (Ci-C8 ) , cicloalquilo (C3-C7) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , arilo, bencilo, alquil (C0-C4) -heterocicloalquil (Ci-C6) , alquil (C0-C4 ) -heteroaril (C2-C5) , alquil (C0-C8) -N (R6) 2, alquil (Ci-C8) -OR5, alquil(Ci-C8) -C (O)OR5, alquil (Ci-Cg) -O (CO) R5, o C(0)OR5; 4 R4 es alquilo (Ci-Cg) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , alquilo (Ci-C ) -OR5, bencilo, arilo, alquil (C0-C4) - heterocicloalquil (Ci-Cg) , o alquil (C0-C4) -heteroaril (C2-C5) ; R5 es alquilo (Ci-C8) , alquenilo ( C2-C8 ) , alquinilo ( C2-C8 ) , ——benci-lo,—ari-lo o heteroarilo^Cf-Gs)"; " ' ——' * 1 Cada vez que aparece R6 ¿s de manera independiente H, alquilo (Ci-Cs) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, heteroarilo (C2-C5) o alquilo (C0-C8 ) -C (0) 0-R5, o los grupos R6 pueden unirse para formar un grupo heterocicloalquilo; n es 0 o 1; y * representa el centro de un carbono quiral. En compuestos específicos de la formula II, cuando n es 0 entonces R1 es cicloalquilo (C3-C7 ) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , bencilo^ arilo, alquil (C0-C4) - heterocicloalquil (Ci-Cs) , alquil (C0-C4) -heteroaril (C2-C5) , C(0)R3, C(0)0R4, alquilo (Ci-C8) -N (R6) 2, alquilo (Ci-C8) -OR5, alquilo (C!-C8)-C(0)OR5, C(S)NHR3, o alquilo (Ci-C8) -0 (CO) R5; R2 es H o alquilo (Ci-C8) ; y R3 es alquilo (Ci-Cs) , cicloalquilo (C3-C7 ) , alquenilo ( C2-C8 ) , alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, alquil (C0-C4) - heterocicloalquil (Ci-C6) , alquil (C0-C4) -heteroaril (C2-C5) , alquilo (C5-C8) -N (R6) 2; alquilo (C0-C8) -NH-C (0) 0-R5; alquilo (Ci-C8)-OR5, alquilo (Ci-C8) -C (O) OR5, alquilo (C'i-C8) -O (CO) R5, o C(0)OR5; y las otras variables tienen las mismas definiciones. s En otros compuestos específicos de la formula II, R2 es H o alquilo (C1-C4 ) :—-En—otros—compuestos—especxf cos" ~de~l'á: formula" II, R1"™^ alquilo (Ci-Cs) o bencilo , En otros compuestos específicos de la formula II, R1 es H, o alquilo (Ci-C8) , bencilo, CH2OCH3, CH2CH2OCH3, o En otra modalidad de los compuestos de la formula II, R es en donde Q es 0 o S, y cada uno ocurre de R7 es de manea independiente H, alquilo (Ci-C8) , bencilo, CH2OCH3, o CH2CH2OCH3.

En otros compuestos específicos de la formula II, R1 es C(0)R3. En otros compuestos específicos de la formula II, R3 es alquil (C0-C4) -heteroaril (C2-C5) , alquilo (Cx-Ce) , arilo, o alquilo (C2-C5) -0R5. * En otros compuestos específicos de la formula II, el heteroarilo es piridilo, furilo, o tienilo.

En otros compuestos específicos de la formula II, R1 es C (O) OR4. En otros compuestos específicos de la formula II, el H del C(0)NHC(0) puede remplazarse con alquilo (Ci-C4 ) , arilo o — enciloy ¦ -¦ —~ Aún en otros compuestos anti-angiogénicos específicos de la invención pertenece a una clase de isoindol-imidas divulgadas en la solicitud de Patente Nortemericana no. 09/781,179, Publicación Internacional No. WO98/54170, y la « Patente Nortemericana No. 6,395,754, cada una de las cuales están incorporadas aquí por referencia. Compuestos representativos son de la formula III: Y sales farmacéuticamente aceptables de, hidratos, solvatos, clatratos, enantiómeros , diastereómeros ,. racematos y mezclas de los mismos estereoisómeros , en donde: Uno de X y Y es C=0 y el otro es CH2 o C=0; R es H o CH2OCOR' ; ^ (i) cada uno de R1, R2, R3, independientemente de los otros, es halo, alquilo, de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3 o R4 es nitro o -NHR5 y los que permanecen de R1, R2, R3 o R4 es hidrógeno; R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 carbonos R6 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, —5—-benzo—c-l-oro--o—fluoro ;— ¦ --— ~- R' es R7-CHR10-N(R8R9) ; R7 es m-fenileno o p-fenileno o -(Cn H2n) - en los que n tiene un valor de 0 a 4 ; cada uno de R8 y R9 tomados independientemente del otro es 10 H o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono o R8 y R9 tomados juntos son tetrametileno, pentametileno , hexametileno, o CH2CH2 (X) X!CH2CH2- en el que (X)Xi es -O-, -S-, o -NH-; R10 es hidrógeno, un alquilo de 8 átomos de carbono, o fenil; y 15 * representa el centro de un carbono quiral Los compuestos anti-angiogénicos más preferidos de la invención son 4- (amino) -2- (2, 6-dioxo (3-piperidil ) ) -isoindolin- 1,3-diona y 3- ( 4-amino-l-oxo-l , 3-dihidro-isoindol-2-il ) -¦ piperidin-2 , 6-diona . Los compuestos pueden obtenerse vía 20 métodos sintéticos, estándar (ver por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,635,517, incorporada aquí por referencia) . Algunos de estos compuestos, tales como la talidomida pueden ser comercialmente disponibles (e.g., Thalomid™, Actimid™, y Revimid™ (Celgene, Inc, Warren, New Jersey)) . El 4- (amino) -2- (2, 6-dioxo (3-piperidil) ) -isoindolin 1,3-diona (ACTIMID™) tiene la siguiente estructura química: la 3- (4-amino-l-oxo-l, 3-di idro-isoindol-2-il) -piperidin-2 , 6- diona (REVIMID™) tiene la siguiente estructura química: Otros compuestos anteriores pueden crearse por métodos ¦conocidos en el arte, incluyendo aquellos divulgados en las patentes citadas anteriormente las cuales están incorporadas por referencia en su totalidad. Evidentemente, los compuestos más preferidos de la invención es la talidomida, aminotalidomida, y el 3- (4-amino- l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -piperidina-2 , 6-diona. Los compuestos de la invención pueden ensayarse por su capacidad para modular la producción de TNF-oc utilizando métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo, aquellos ensayos divulgados en Robarge et al., publicación de solicitud Norteamericana No. de serie US 2003045552, publicada el 6 de Marzo del 2003, titulada "Isoindole-Imide Compounds, Composit ions , and Uses Thereof," la cual esta incorporada aquí por referencia en su totalidad. Como se usa aqui, y a menos de que se indique otra cosa, ___el termino "estereoméricamente__p_ur.o" se refiere —a—una. composición que comprende un estereoisómero de un compuesto y que esta sustancialmente libre de otros estereoisómeros de ese compuesto. Por ejemplo, una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral estará sustancialmente libre del enantiómero opuesto del compuesto. Una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene dos centros quirales será sustancialmente libre de otros diastereómeros del compuesto. Como se utiliza aqui, y a menos de que se indique otra cosa, el termino "enantioméricamente puro" se refiere a una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. Como se usa aqui, y a menos de que se indique otra cosa, el termino "estereoméricamente enriquecido" quiere decir una composición que comprende más del 60% en peso de un estereoisómero de un compuesto, preferiblemente más de aproximadamente el 70% en peso, más preferiblemente, mayor a aproximadamente 80% en peso de un estereoisómero de un compuesto. Como se utiliza aqui, el termino "enant ioméricamente puro" quiere decir una composición de un compuesto que tiene un centro quiral. De manera similar, el termino "enant ioméricamente enriquecido" quiere decir una composición estereoméricamente enriquecida de un compuesto que tiene un centro quiral. 5.2.2 Inhibidores de PDE IV _„5™__-__0tra_-cla se—de—compuestos—que —se-—espera—tienen --una actividad anti-angiogénica son referidos como inhibidores PDE IV. Los inhibidores PDE IV, similares a los ImiDs, tienen actividad de inhibición TNF-a. Compuestos preferidos utilizados en la invención son fármacos inhibidores de 10 'citocina Selectiva (SelCIDs) de Celgene Corporation. Miembros de esta clase de compuestos pueden también probarse por la actividad de modulación de la angiogénesis . Como se utiliza aquí, y a menos de que se indique otra •cosa, el término "SelCIDs™" utilizado en la invención abarca 15 fármacos de pequeñas moléculas, por ejemplo, pequeñas moléculas orgánicas que no son péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, oligosacéridos, u otras macromoléculas . Compuestos preferidos que inhiben la producción TNF-a. Además, los compuestos pueden también tener un efecto de inhibición 20 modesto sobre el LPS, ILi y IL12 inducido. Más preferiblemente, los compuestos de la invención son inhibidores potentes de PDE IV. El PDEIV es una de las isoenzimas de fosfodiesterasa pirncipales encontradas en las células de linaje mieloide y linfoide humanas. La enzima juega una parte crucial en la regulación de la actividad celular mediante la degradación del segundo mensajero ubicuo AMPc y manteniéndolo a bajos niveles intracelulares . _-~Ej,emplos~específicos—de—fármacos—inhibidores—de—e-it-oci-na-selectiva incluyen, pero no se limitan a, las imidas cíclicas divulgadas en la patente norteamericana No. 5,605,914; las cicloalquil amidas y los cicloalquil nitrilos de las patentes norteamericanas Nos. 5,728,844 y 5,728,845, respectivamente; .las aril amidas (por ejemplo, siendo en una modalidad N-benzoilo-3-amino-3- (3 ' , 4 ' -dimetoxifenil ) -propanamida) de las patentes nortemericanas Nos. 5,801,195 y 5,736,570; los éteres y alcoholes de imida/amida (por ejemplo, 3-ftalimido-3- ( 3 ' , 4-.dimetoxiferil ) propan-l-ol ) divulgados en la patente norteamericana no. 5,703,098; las succinimidas y maleimidas (por ejemplo 3- ( 3 ' , 4 ' , 5 ' , 6 ' -petrahidroftalimdo ) -3- ( 3" , 4 "-dimetoxifenil ) propionato) de metilo divulgado en la patente norteamericana no. 5,658,940; ácidos alcanohidroxámico imido y amido sustituidos divulgados en WO99/06041 y fenetilsulfonas sustituidos divulgados en la patente norteamericana no. 6,020,358; y aril amidas . tal como el N-benzoil-3-amino-3- (3 ', ' -dimetoxifenil) propanamida como se describe en la patente norteamericana No. 6,046,221. La totalidad de cada una de las patentes y aplicaciones de patente identificadas aqui son incorporadas aqui por referencia. Fármacos inhibidores de citocina selectiva adicionales pertenecen a una familia de compuestos químicos sintetizados de...los...que_..modalidades_ 3_-dioxobe_nzo- ( f ) isoindol-2-il ) -3- ( 3-ciclopentiloxi- -metoxifenil ) -propionamida y 3- ( 1 , 3-dioxo-4-azaí soindol-2-il ) -3- ( 3 , 4-dimetoxifenil) -propionamida. Otros fármacos inhibidores de citocina selectiva específicos pertenecen a una clase de amidas cíclicas no polipéptidas divulgados en las patentes norteamericanas Nos. 5,698,579 y 5,877,200, ambas de los cuales están incorporados aquí. Amidas cíclicas representativas incluyen compuestos de la fórmula: en donde n tiene un valor de 1, 2, o 3; R5 es o-fenileno, sustituido o insustituido con 1 a 4 sustituyentes cada uno seleccionado de manera independiente del grupo que consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi , carbopropoxi, acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, acilamino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono; y halo; *5~" R7—es- (i)-- fenilo -o —fenilo sustituido con uno o más sust ituyentes cada uno seleccionado de manera independiente del otro del grupo que consiste de nitro, ciano, trif luorometilo, carbetoxi, carbometoxi, carbopropoxi, acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, amino, alquilo 0 de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, y halo; (ii) bencilo insustituido o sustituido con 1 a 3 sust ituyentes seleccionados del grupo que consiste de nitro, ciano, trifluoromet ilo, carbotoxi, carbometoxi, carbopropoxi, acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, 15 amino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, y halo, (iii) naftilo, , y (iv) benciloxi; R12 es -OH, alcoxi de 1 a 12 átomos de carbonos, o 0 R8 es hidrógeno o alquilo de 1 a 10 átomos de carbono; y R9 es hidrógeno, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, -COR10, o -SO2R10, en donde R10 es hidrógeno, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, o fenilo Compuestos específicos de esta clase incluyen, pero no se limitan—a-:———: —r— Ácido 3-fenil-2- ( l-oxoisoindolin-2-il ) propiónico; 3-fen.il-2- ( l-oxoisoindolin-2-il ) propionamida ; ácido 3-fenil-3- ( l-oxoisoindolin-2-il) propiónico; 3-fenil-3- ( l-oxoisoíndolin-2-il ) propionamida ; ácido 3- ( 4 -metoxifenil ) -3- ( l-oxisoindolin-il ) propiónico; «. 3 -(4-metoxifenil) -3- (l-oxisoindolin-il) propionamida ácido 3- (3, 4, -dimetoxifenil) -3- ( l-oxisoindolin-2-il) -propiónico; 3- (3, 4, -dimetoxi-fenil) -3- (1-oxo-l, 3-dihidroisoindol-2-il ) propionamida ; 3- (3, 4, -dimetoxifenil ) -3- ( l-oxisoindolin-2-il ) propionamida ; ácido 3- (3, 4-dietoxifenil) -3- ( l-oxisoindolin-il ) propiónico ; 3- ( l-oxosoindolin-2-il) -3- ( 3-etoxi- 4-metoxifenil ) propionato de metilo; ácido 3- ( l-oxoisoindolin-2-il) -3- ( 3-etoxi-4-metoxifenil) -propiónico; ácido 3- (l-oxoisoindolin-2-il) -3- ( 3-propoxi-4 -metoxifenil) -propiónico; ácido 3- ( l-oxoisoindolin-2-il ) -3- ( 3-butoxi-4-metoxifenil) - propiónico ; 3- ( l-oxoisoindolin-2-il ) -3- (3-propoxi-4-metoxifenil) - propionamida ; 3-'( --oxoi*soi'ndo -n-2-il^—3^(3-=butoxir.4 metoxifenil)_- propionamida ; 3- ( l-oxosoindolin-2-il ) -3- ( 3-butoxi-4 -metoxifenil) propionato de metilo; 3- ( l-oxosoindolin-2-il ) -3- ( 3-propoxi- 4 -metoxifenil ) propionato de metilo; Otros fármacos inhibidores de citocina selectiva específicos incluyen los ácidos alcanohidroxamicos amido e • imido sustituidos divulgados en WO 99/06041, la cual esta incorporada aquí por referencia. Ejemplos de tales compuestos. incluyen, pero no se limitan a en donde cada uno de R1 y R2, cuando se toman de manera independiente uno del otro, es . hidrógeno, alquilo inferior, o R1 y R2, cuando se toman juntos con los átomos de carbono representados a los cuales cada uno esta enlazado, es o- fenileno, o-naftileno, o ciclohexano-1 , 2-diilo , insustituido o sustituido con 1 a 4 sustituyentes cada uno seleccionado de manera independiente del grupo que consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi, carbopropoxi , ~~acet -lo~, 1ca-rbamoi1o , acetoxi carbpxi , hidroxi, amino , alquilamino, dialquilamino , acilamino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de acarbono, y halo; R3 es fenilo sustituido con de uno a cuatro sustituyentes seleccionados del grupo que . consiste de nitro, ciano, trifluorometilo, carbetoxi, carbometoxi, carboprpopoxi , acetilo, carbamoilo, acetoxi, carboxi, hidroxi, amino, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 10 átomos de carbono, benciloxi, cicloalcoxi de 3 a 6 átomos de carbono, C4-C6- cicloalquilidenometil , C3-Cio-alquilidenometil , indaniloxi, y halo; R4 es hidrógeno, alquilo de 1 a 6. átomos de carbono, fenilo o bencilo; R4 es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R5 es -CH2-, -CH2-CO-, -SO2-, o -NHCO-; n tiene un valor de 0, l o 2; y las sales de adición ácidas de dichos compuestos las cuales contienen un átomo de nitrógeno capaz de protonarse.

Fármacos inhibidores de citocina selectiva adicionales específicos incluyen, pero no se limitan a: 3- ( 3-etoxi-metoxifenil ) -N-hidroxi-3- (1-oxoisoindolinil) -propionamida 3-~( 3=-etoxi-4-met-ox-i-fenil)--N.-metoxi.-3_^( ^oxois .indolini_l )j; propionamida ; N-benciloxi-3- ( 3-etoxi- -metoxifenil ) -3-ftalimidopropionamida ; N-benciloxi-3- ( 3-etoxi -4 -metoxifenil) -3- (3-nitroftalimido) propionamida; N-benciloxi-3- ( 3-etoxi- -metoxifenil ) -3- ( 1-oxoisoindolinil ) propionamida ; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil ) -N-hidroxi-3-ftalimidopropionamida ; N-hidroxi-3- (3, 4-dimetoxifenil) -3-ftalimidopropionamida ; 3- ( 3-etoxi-4 -metoxifenil ) -N-hidroxi-3- ( 3-nitroftalimido) -propionamida ; N-hidroxi-3- (3, -dimetoxifenil) -3- (1-oxoisoindolinil) -propionamida; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- (4-metil-ftalimido) -propionamida ; 3- (3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3-ftalimidopropionamida; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- (1, 3-dioxo-2, 3-dihidro-lH-benzo ( f ) isoindol-2-il ) propionamida; N-hidroxi-3- (3- (2-propoxi) -4-metoxifenil ) -3-ftalimidopropionamida ; 3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -3- (3, ß-difluoroftalimido) -N-hidroxipropionamida ; 3~{ -arninoftal-imido) -3- (-3-etoxi-4 -metoxifenil)_r;N- _ hidroxipropionamida; 3- ( 3-aminoftalimido) -3- (3-etoxi-4-metoxifenil) -N-hidroxipropionamida; N-hidroxi-3- (3, -dimetoxifenil) -3- (1-oxoisoindolinil ) propionamida ; 3- (3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil) -N-hidroxi-3- (1-oxoisoindolinil ) propionamida ; y N-benciloxi-3- ( 3-etoxi-4-metoxifenil ) -3- ( 3 -nitroftalimido) propionamida . Fármacos inhibidores de citocina selectiva adicionales utilizados en la invención incluyen los fenetilsulfones sustituidos, sustituidos en el grupo fenilo con un grupo oxoisoindino . Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, aquellos divulgados en la patente norteamericana No. 6,020,358, que esta incorporada aquí, los cuales incluyen lo siguiente: en donde el átomo de carbono designado * constituye un centro de quiralidad; Y es C=0, CH2, S02, 0 CH2C=0; cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los otros, es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, nitro, ciano, hidroxi, o -NR8R9; o dos cualesquiera de R1, R2, R3, y R4, en átomos de carbono adyacentes, junto con el anillo de fenileno representado son naftilideno; Cada uno de R5 y R6, independientemente de los otros, es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, ciano, o cicloalcoxi de más de 18 átomos de carbono ; R7 es hidroxi, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, bencilo, o NHR8'R9'; cada uno de R8 y R9 tomados independientemente del otro es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, o bencilo, o uno de R8 y R9 es hidrógeno y el otros es -COR10 o -S02R10 tomados juntos son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, o -CH2CH2X1CH2CH2- en el que X1 es -0-, -S-, o -NH-; y cada uno de R8 y R9 tomados de manera independiente del otro es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, o~be c lO~o—uno—de—R8—y—R9—es~hidrógeno_.y__el. otro es -COR10 o -SO2R10 , o R8 y R9 tomados juntos son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, o -CH2CH2X2CH2CH2- en el que X2 es -O-, -S-, -NH-. Se apreciara que mientras que por conveniencia los compuestos anteriores se identifican como fenetilsulfonas , ellos incluyen sulfonamidas cuando R7 es NHR8 R9 . Grupos específicos de tales compuestos son aquellos en los que Y es C=0 o CH2. Un grupo específico adicional de tales compuestos son aquellos en los que cada uno de R1, R2, R3, y R4 independientemente de los otros, es hidrógeno, halo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, nitro, ciano, hidroxi, o -NHR8R9 en los que cada uno de R8 y R9 tomados independientemente del otro es hidrógeno o metilo o uno de R8 y R9es hidrógeno y el otro es -COCH3. Compuestos particulares son aquellos en los que uno de R1, R2, R3, y R4 es -NH2 y los que permanecen de R1, R2, R3, y R4 son hidrógenos.

Compuestos particulares son aquellos en los que uno de R1, R2, R3, y R4 es -NHCOCH3 y los que permanecen de R1, R2, R3, y R4 son hidrógenos. Compuestos particulares son aquellos en los que uno de R1~R-27~-R3 —y-R-es-~N-(CH3 )-2"--y~los~que_permanecen_de.,.RÍ,„.R2., Rj^ y R4 son hidrógenos . Un grupo preferido adicional de tales compuestos son aquellos en los que uno de R1, R2, R3, y R4 es metilo y los que permanecen de R1, R2, R3, y R4 son hidrógenos. Compuestos particulares son aquellos en los que uno de R1, R2, R3, y R4 es fluoro y los que permanecen de R1, R2, R3, y R4 son hidrógenos. Compuestos particulares son aquellos en los que cada uno de R5 y R6 independientemente del otro es hidrógeno, metilo, etilo, propilo, metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentoxi , o ciclohexoxi . Compuestos particulares son aquellos en los que R5 es metoxi y R6 es monocicloalcoxi , policicloalcoxi , y benzocicloalcóxi . Compuestos particulares son aquellos en los que R5 es metoxi y R6 es etoxi. Compuestos particulares son aquellos en los que R7 es hidroxi, metilo, etilo, fenilo, bencilo, o NR8 R9 en el que cada uno de R8 y R9 tomados de manera independiente del otro es hidrógeno o metilo. Compuestos particulares son aquellos en los que R7 es metilo, etilo, fenilo, bencilo, o NR8 R9 en el que cada uno de R-—y—R9—tomados—:i-ndependientemente—del otro _ es,. _hidr_óqeno o metilo . Compuestos particulares son aquellos en los que R7 es metilo . Compuestos particulares son aquellos en los que R7 es /NR8 R9 en el que cada uno de R8 y R9 tomados de manera independiente del otro es hidrógeno o metilo. Otros fármacos inhibidores de citocina selectiva específicos incluyen compuestos de 1 , 3-dihidro-isoindolil fluoroalcoxi- sustituidos que se encuentran en la solicitud provisional norteamericana No. 60/436,975 a G. Muller et al., expedida el 30 de Diciembre del 2002, la cual está incorporada aquí en su totalidad por referencia. Compuestos de 1,3- dihidro-isoindolil , fluoroalcoxi-sustituidos incluyen compuestos de la formula: en donde : Y es -C(0)-, -CH2, -CH2C(0)-, -C(0)CH2-, 0 S02; Z es -H, -C(0)R3, - (Co-i-alquil) -S02- (Ci- 4-alquil) , -Ci_8-alquil, -CH2OH, CH2 (O) (Ci-8-alquil) o -CN; Ri y R2 son cada uno de manera independiente -CHF2, -Ci_8-alquil, -C3-i8-cicloalquil o - (Ci-io-alquil ) (C3-i8-cicloalquil) , y por lo menos uno de Ri y R2 es CHF2; R3 es -NRR5, -alquilo, -OH, alquilo-O-, fenilo, bencilo, fenilo sustituido, o bencilo sustituido; R4 y R5 son cada uno de manera independiente -H, alquilo-Ci-s-, -OH, -OC(0)R6; . R6 es alquilo-Ci-s-, amino (alquil-Ci-8) , -fenilo, -bencilo, o -arilo; Xi, 2 ¾<¦ y son cada uno de manera independiente -H, -halógeno, -nitro, -NH2, -CF3/ -alquilo-Ci-6-, - ( alquil-C0-4 ) - (cicloalquil-C3-6) , (alquilo-C0-4) -NR7R8 , (alquil-C0-4) -N (H) C (0) - (R8), (alquil-C0-,)-N(H)C(O)N(R7R8) , (alquil-C0-4) - N (H) C (O) O (R7R8) , (alquil-C0-4) -OR8, (alquil-C0-4) -imidazolil, (alquil-Co-4 ) -pírrolil , (alquil-C0-4) -oxadiazolil, o (alquil-Co-4 ) -triazolil , o dos de Xír X2, X3, y X4, pueden unirse para formar un anillo heterocicloalquilo o cicloalquilo, (e.g., Xi y X2, x2 y X3, X3 y ¾/ Xi y X3r X2 y X4, o Xi y X¿¡, pueden formar ui:"-dni'"i"i'o~a - 3-,— t—5>-6 ,—o—~-miembros._que ..puede__ser_arpmático_,_ y por medio de esto formar un sistema biciclico con el anillo isoindolilo) ; y R7 y R8 son de manera independiente H, alquilo-Ci-9, cicloalquil-C3_6, (alquil-Ci-6) - (cicloalquil-C3-6) , (alquil-Ci-6) _ :N(R7R8), (alquil-Ci-e) -OR8, fenilo, bencilo, arilo; o sales farmacéuticamente aceptables, solvatos, hidratos, estereoisomeros , clatratos, o profármacos de los mismos. Compuestos preferidos incluyen, pero no se. limitan a: Ácido 3- (4-acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3-dihidro-ísoindol-2-il) -3- ( 3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil ) -propionico; 3- (4-Acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -3- ( 3-ciclopropilmetoxi- -difluorometoxi-fenil) -N, -dimetil-propionamida ; 3- ( -Acetilamino-1 , 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -3- ( 3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil ) -propionamida; ácido 3- (3-ciclopropilmetoxi-4- difluorometoxi-fenil ) -3- (1, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -propionico; 3- (3-Ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil ) -3- ( 1, 3- dioxo-1, 3-dihidro-isoindol-2-il) -N-hidroxi-propionamida ; metil éster del ácido 3- ( 3-ciclopropilmetoxi-4 difluorometoxi-fenil ) -3- (7-nitro-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2- il ) -propiónico; ácido 3- ( 3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil ) -3 "~( 7 -ni-tro-l--oxo-l-re-dihidro-isoindol=2-il ).-propiónicA; 3- (3-Ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil) -3- (7- nitro-l-oxo-1, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -N, N-dimetil- pr.opio amida ; 3- ( 7-Amino-l-oxo-l , 3-dihidro-isoindol-2-il ) -3- ( 3- ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxi-fenil ) -N, N-dimetil- propionamida ; metil éster del ácido 3- (4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil) 3- (7-nitro-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -propiónico; metil éster del ácido 3- (7-Amino-l-oxo-l, 3-dihidro isoindol-2-il ) -3- (4- difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -propiónico; metil éster del ácido 3- ( - (Ciclopropanocarbonil-amino) 1-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -3- ( 4-difluorometoxi-3-etoxi- fenil) -propiónico; metil éster del ácido 3- ( 7-acetilamino-l-oxo-l , 3-dihidro isoindol-2-il ) -3- ( -difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -propiónico; ácido 3- (7-acetilamino-l-oxo-l , 3-dihidro-isoindol-2-il ) 3- ( 4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -propiónico; ácido 3- (7- (Ciclopropanocarbonil-amino) -1-oxo-l, 3- dihidro-isoindol-2-il) -3- (4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) - propiónico ; (2- ( 2-carbamoil-l- ( 4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -etil ) - ~5: 3-oxo-2—3 -di-hidro--l-H--i soindo1 -4 -i 1 )~amida.. _ de1 ácido ciclopropanocarboxilico; (2- (1- ( -difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -2- dimetilcarbamoil-et il ) -3-oxo-2, 3-dihidro-lH-isoindol-4-il) - del ácido ciclopropanocarboxilico; 10 ( 2- ( 1- ( 4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -2- hidro icarbamoil-etil ) -3-oxo-2 , 3-dihidro-lH-isoindol-4-il ) - amida del ácido ciclopropanocarboxilico; 3- (7 -acet ilamino- 1-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -3- (4- difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -propionamida ; 15 3- (7 -acetilamino- 1-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -3- (4- difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -N, N-dimet i 1-propionamida ; 3- (7-acetilamino-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -3- (4- difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -N-hidroxi-propionamida; ácido 3- ( 4-acetilamino-l , 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-20 il) -3- ( 4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -propiónico; 3- (4-Acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -3- ( -difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -propionamida ; 3- (4-Acetilamino-l, 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -3- ( -difluorometoxi-3-etoxi-fenil) -N, N-dimeti 1-propionamida; 3- ( 4-Acetilamino-l , 3-dioxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -3- ( 4-difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -N-hidroxi-propionamida ; (2- (1- ( 4-difluoromeoxi-3-etoxi-fenil ) -2-metanosulfonil- etil) -3-OXO-2, 3-dihidro-lH-ísoindol-4-il) -amida del ácido ~5: ~clclOpropanocarboxí-l~i-co; . —..... ,, . N- (2- (1- ( 4-Difluorometoxi-3-etoxi-fenil ) -2- metanosulfonil-etil) -1, 3-dioxo-2, 3-dihidro-lH-isoindol-4-il ) - acetamida; y (2- (2-carbamoil-l- ( 4-difluoromeoxi-3-etoxi-fenil ) -etil) - 10 7 -cloro-3-oxo-2 , 3-dihidro-lH-isoindol-4-il) -amida del ácido ciclopropanocarboxilico ; Otros fármacos inhibidores de citocina selectiva incluyen compuestos de isoindolil 7-amido sustituidos encontrados en la solicitud provisional norteamericana No. 60/454,155 a G. 15 Muller et al., expedida el 12 de Marzo del 2003, la cual esta incorporada aquí en su totalidad por referencia. Compuestos de isoindolil 7-amido sustituidos representativos incluyen compuestos de la fórmula: en donde : Y es -C(0)-, -CH2, -CH2C(0)- o S02; X es H, Z es ( alqui lo-Co- ) -C (0) R3, alquilo-Ci-4, (alquilo-Co-4) -OH, ( alquil-C1-4) -0 (alquilCi-4) , ( alquiI0-C1-4 ) -S02 ( alquilo-Ci_4 ) , (alquilo-Co-4) -SO ( alquilo-Ci-4 ) , (alquilo-Co-4) -NH2, (alquilo-Co-4) - (H) (OH) , CH2NS02 (alquilo-C^) ; Ri y R2 son de manera independiente (alquilo-Ci-e) , cicloalquilo, o (alquilCi-4) cicloalquilo; R3 es, NR4R5, OH, u 0- (alquilo-Ci-8) ; R4 es H; R5 es -OH, o -0C(0)R6; R6 es alquilo-Cx-s, amino- (alquil-Ci_8) , (alquil-Ci-s) - (cicloalquil-C3-6) , cicloalquil-C3-6, fenilo, bencilo, o arilo; o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, estereoisomero, clatrato, o profármacos de los mismos; o la formula : en donde : Y es -C (0) -, -CHz, -CH2C (0) X es halógeno, -CN, -NR7R8, es Z es (alquil-Co-4) -S02 (alquil-Ci_ ) , - (alquil-C0-4 ) -CN, (alquil-Co-4) -C (0) R3, alquilo-Ci_4, (alquil-C0-4) OH, (alquil-Co-4) 0 (alquil -Ci_4) , (alquil-Co-4) SO (alquil-Ci- ) , (alquil-Co^) NH2, (alquil-Co-4) N (alquil-C1-8)2, (alquil-Co-4 ) N (H) (OH) , o (alquil-C0-4)NSO2 (alquil-d-4) W es cicloalquilo-C3-6, - ( alquil-Ci-8) - ( cicloalquil-C3-6) , - (alquil-Co-s) - (cicloalquil-C3_6) -NR7R8, (alquilo-C0-s) -NR7Rs, (alquilo-Co-4) -CHR9- (alquil-Co-4) -NR7Rs, Rx y R2 son de manera independiente alquil-Ci-8, cicloalquil, o (alquil-Ci-4) cicloalquilo; R3 es alquil-Ci-8, NR4R5, OH, o 0- (alquil-Ci-8) ; R4 y R5 son de manera independiente H, alquil-Ci-s, (alquil-Co-s) - (cicloalquil-C3-6) , OH, o OC(0)R6 R5 es alquil-Ci-8, (alquil-Co-s) _ (cicloalquil-C3_5) , amino--(-aiqu-i-l-.-.Gi^e-)-> —f-eni 1o ,—bencilo,__o_arilo.;„ R7 y Re son cada uno de manera independiente H, alquil-Ci- s, (alquil-Co-s ) ~ ( cicloalquil-C3-6) , fenilo, bencilo, arilo, o también pueden unirse con el átomo que los conecta para formar un anillo heteroarilo o heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros; R9 es alquil-Ci-4, aril (alquil-C0-4 ) , (alquil-C0-4) _ (cicloalquil-C3-6) , (alquil-C0-4) -heterociclo; o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, -estereoisomero, clatrato, o profámacos de los mismos. Otros fármacos inhibidores de citocina selectiva todavía incluyen compuestos de ácido-isoindolil N-alquil-hidroxamico que se encuentran en la Aplicación Provisional Norteamericana No. 60/454,149 a G. Muller et al., expedida el 12 de Marzo del 2003, la cual esta incorporada aquí por referencia. Compuestos representativos de ácido-isoindol N-alquil-hidroxámico incluyen compuestos de la formula: en donde: Y es -C(0), -CH2, -CH2C(0)- o S02; Ri y R2 son de manera independiente alquil-Ci_8, CF2H, CF3, CH2CH F2 , cicloalquil, o (alquil-Ci-s) ciclcoalquilo; Zi es H, alquil-Ci-6, -NH2-NR3R4 o 0R5; Z2 es H o C(0)R5; Xi, X2, X3, X4, son cada uno independientes H, NO2 , 0R3, 'CF3, alquil-C i-e, (alquil-Co-4) - (cicloalquil-C3-6) , (alquil-C0-4 ) - N-(-R8R9), (alquil-Co-4) -NHC (0) - (-R8) , ( alquil-Co-4 ) - NHC (0) CH (R8) (R9) , (alquil-Co-4) -NHC (0) N (R8R9) , ( alquil -C0-4 ) - NHC(0)0(R8), (alquil-Co-4) -0-R8, (alquil-Co-4) -imidazoil, (alquil-Co-4) -pirrolil, (alquil-Co-4) -oxadiazolil , (alquil-Co-4) - triazolil o (alquil-Co-4) -heterociclo ; R3/ R4 y R5 son de manera independiente H , alquil-C-1-6, 0- alquil-Ci-6, fenilo, bencilo, o arilo; R6 y R7 son de manera independiente H o alquil-Ci_6; R8 y R9 son cada uno de manera independiente H o alquil- C1-9, cicloalquil-C3-6, (alquil-Ci_6) - (cicloalquil-C3-e) , (alquil-Co-ß) -N (R4R5) , (alquil-Ci-6) -0R5/ fenilo, bencilo, arilo, piperidinilo, piperizinil, pirolidinilo, morfolino, o heterocicloalquil-C3-7,- y o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, estereoi-sornero:,—c1at rato.,- -o_profármaco_de_1ps^m.i rnqs_. Fármacos inhibidores de citocina selectiva específicos incluyten, pero no se limitan a: 2-[l- ( -3-etoxi-4-metoxifenil ) -2-metil-sulfoniletil]-isoindolin-l-ona 2-[l- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2- (N-N-dimetil-aminosul foni 1 ) etil]isoindulin-l-ona; 2-[l- ( 3-etoxi-4-metoxifenil) -2-metil-sulfoniletil]-5-nitro-isoi.ndolina-1 , 3-diona; 2-[l- ( 3-etoxi-4-metpxifenil ) -2-metil-sulfoniletil]-5-nitro-isoindolina-1 , 3-diona; 2-[l- ( 3-etoxi-4-metoxifenil ) -2-metil-sulfoniletil]-4-nitroisoindolina-1, 3-diona; 2-[l- ( 3-etoxi-4-metoxifenil ) -2-metilsulfoniletil]-4-aminoisoindolina-1 , 3-diona; 2-[l- ( 3-etoxi-4-metoxi fenil ) -2-metilsulfoniletil]-5-metilisoindolina-1 , 3-diona; 2-[l- ( 3-etoxi-4-metoxifenil ) -2-metilsulfoniletil]-5-acetamidoisoindolina-1 , 3-diona ; 2-[l- ( 3-etoxi-4 -metoxifenil ) -2-metilsulfoniletil]-4- dimet ilaminoisoindolina-1 , 3-diona ; 2-[l- (3-etoxi-4-metoxifenil) -2-metilsulfonileti l]-5- dimetilaminoisoindolina-1 , 3-diona; metilsulfoni 1etil]benzo[e]isoindol ina-1 , 3-diona; 2-[l- ( 3-etoxi-4 -metoxifenil ) -2-metilsulfoniletil]-4- metoxiisoindolina-1 , 3-diona; 1- ( 3-ciclopentiloxi-4 -metoxifenil ) -2-metilsulfoniletil- amina; 2-[l- ( 3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil ) -2- metilsulfonilet il]-isoindolina-l , 3-diona; y 2-[l- ( 3-ciclopentiloxi-4 -metoxifenil ) -2- met i lsulfoni letil]-4 -dimeti laminoisoindolina-1, 3-diona ; Fármacos inhibidores de citocina selectiva adicionales incluyen los compuestos enant iomericamente puros divulgados en las aplicaciones de patente provisionales norteamericanas Nos. 60/366,515 y 60/366,516 a G. uller et al, ambas se expidieron el 20 de Marzo del 2002, y las aplicaciones de patente provisionales nos. 60/438,450 y 60/438,448 aG. Muller et al, ambas se expidieron el 7 de Junio del 2003, y todas están incorporadas aquí por referencia. Compuestos preferidos incluyen un enantiomero del 2-[l- ( 3-etoxi-4 -metoxifenil ) -2-metilsulfoniletil]-4-acetilaminoisoindolina-l, 3-diona y un enantiomero de 3- (3, 4-dimetoxi-fenil) -3- (1-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-il) -propionamida . . Fármacos "inñüJi'iores de 'citocina~—se-lectiva-r—preferida-utilizados en la invención son 3- ( 3, 4 -dimetoxi-fenil ) -3- ( 1-oxo-1, 3-dihiodro-isoindol-2-il) propionamida y 2-[l- (3-etoxi-4-metoxi-fenil ) -2-metanosulfonil-etil]-3-oxo-2 , 3-dihídro-lH-isoindol-4-il ("-amida del ácido ciclopropanocarboxilico, los cuales están disponibles en Celgene Corp., Warren, J. El 3- (3,4 -dimetoxi-fenil ) -3- ( 1-oxo-l , 3-di idro-isoindol-2-il ) -propianamida tiene la siguiente estructura química: La H2—[1— { 3-etoxi-4-metoxi-fenil) -2-metanosulfoni1-etil]-3-oxo-2, 3-dihidro-lH-isoindol-4-ilí>-amida del ácido ciclopropanocarboxilico tiene la siguiente estructura química: Los compuestos de la invención también incluyen, pero no se limitan a compuestos que inhiben la actividad PDE IV tales como cilomast, teofilinas, zardaverina, rolipram, pentoxifilina, enoximona, isoindol-imidas , fenetilsulfones, ""áci'dos—aicanohi-droxami-cos ,—amidas—cíclicas nc^polipeptidas^ oxoisoindoles, isoindoles, indazoles, piridinas heterosustituidas , difenilpiridinas , tiofenos de arilo, furanos de arilo, indenos, fenilos trisustituidos, ftalazinones , bencenosulfonamidas, compuestos tetreciclicos y sales, solvatos, isómeros, clatratos, profármacos, hidratos o derivados de los mismos. En una modalidad, el compuesto es un no polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleotido o ácido nucleico. En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura: que incluyen isómeros, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, clatratos de los mismos, en donde : Y representa N o N-óxido Ri~y-R2—-son-de manera -ind-epe-nd-iente_se.leccionados_.de..: H, alquil-Ci-6, y halo alquil-Ci-6 R3 y R4 son de manera independiente seleccionados de H, y alquil-Ci-6/ o R3 y R4 ligados el mismo átomo de carbono representan unidos un átomo de oxigeno carbonilo, o R3 y R4 ligados a diferentes átomos de carbono considerados en combinación con los átomos de carbono a los que están unidos a lo largo con cualquier átomo que intervenga representa un anillo carboxiclico saturado de 5, 6, o 7 miembros; R5 y 6 de manera independiente representa un miembro seleccionado del grupo que consiste de: H, alquil-Ci-6, y halo alquil-Ci-6 y CN; N representa un numero entero de 0 a 6; Ari se selecciona del grupo que consiste de: tienilo, tiazolilo, piridilo, fenilo, y naftilo; dicho Ari siendo opcionalmente sustituido con 1 a 3 miembros seleccionados del grupo que consiste de halo, alcoxi-Ci-s, alquitio, CN, alquilo-Ci-6, hidroxi alquilo-Ci-6, -C (0) alquil-Ci-6, -C02H, -C02alquil-Ci-6, NH(S02Me), N(S02Me)2 S02Me, S02NH2, S02NH alquil-Ci-6, N02 N (alquil-Ci_6) 2 N02, alquenilo-C2_6, alquilo-Ci-6, y NH2; r~~~y"~cuando--?G?—representa—un—grupo—fenilo-.o_.naf ilo_con_do.s o tres sustituyentes, dos de tales sustituyentes pueden considerarse en combinación y representa un anillo lactona fundido de 5 o 6 miembros. Esta modalidad además abarca compuestos tales como -aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 6,316,472, la cual esta incorporada aquí por referencia en su totalidad . En otra modalidad, los compuestos de la invención tienen la siguiente estructura: que incluye isómeros, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, clatratos de los mismos, en donde Ri y R2 representan alquile—Ci_C4, o cicloalquilo-C3-Cio; R3 y 4 de manera independiente representan o cicloalquilo , -C2_C , alquílenos C2_C4que tienen un doble enlace, alquílenos C2-C que tienen un triple enlace, (CH2) nC0 (CH2) mCH3, (CH2)PCN, (CH2)pC02 Me, o unidos con una átomo de nitrógeno al —cual-están—unidosr~-fo man-un-ani-l-l-o~de-3-a—10-miembros ; n y m son de 0 a 3 ; p es 1 a 3. Esta modalidad además abarca compuestos tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 6,162, 830, la cual esta incorporada aquí por referencia en su totalidad . En otra modalidad, los compuestos de la invención tienen la siguiente estructura (III): que incluyen isómeros, profármacos, y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, clatratos de los mismos, en donde : Ri es seleccionado de manera independiente de en cada instancia el grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, alcoxi inferior, hidroxi, alquilo inferior mercapto, alquilsulfonilo inferior, alquilamino inferior, alquil amino di-inferior, amino, nitro, nitrilo, carboxilato alquilo inferior, -CO2 H, y sulfonamido ; -R2—se—selecciona—del-grupo_que...consiste„ de_hidr ,geno. y alquilo inferior ; R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo inferior, hidroxi y amino; R se selecciona del grupo que consiste de -COM y CH2OH en donde M se selecciona del grupo que consiste de : hidroxi, alcoxi inferior sustituido, amino, alquilamino, dialquilamino, N-morfolino, hidroxialquilamino, 'polihidroxiamino, dialquilaminoalquilamino, aminoalquilamino, .y el grupo OMe, en donde Me es un catión; R5 es un alquil sulfonilo; y n es un numero entero de 0 a 4. Esta modalidad .además abarca compuestos divulgados en la Patente Norteamericana No. 6,177,471, la cual esta incorporada aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (IV): H que incluye isómeros, profármacos, y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, clatratos de los mismos, en donde : .Ro representa hidrógeno, halógeno, o alquilo-Ci_6; *Ri se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno; alquilo-Ci-6 opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de fenilo, halógeno, -C02Ra, NRaRb, cicloalquilo-C3_6, fenilo, y un anillo heterociclico de 5 o 6 miembros seleccionados del grupo que consiste de piridilo, morfolinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, y piperidinilo, y siendo opcionalmente sustituido por uno o más alquilo-Ci-6 y opcionalmente enlazado a un átomo de nitrógeno al cual Ri esta unido vía un alquilo-Ci-6; R2 se selecciona del grupo que consiste de: fenilo opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de -ORa, -NRa, Rb, halógeno, hidroxi, trifluorometilo , ciano y nitro; y Ra y ¾ representan de manera independiente hidrógeno, alquilo-Ci-6, que incluye isómeros, profármacos, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. ——-Esta—moda1 idad a_demás abarca_ corapuestos_ tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 6,218,400, la cual está incorporada aquí por referencia en su totalidad . En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (V) : que incluye isómeros, profármacos, y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, clatratos de los mismos, en donde: X es S u O; Ari es un anillo aromático seleccionado de fenilo, piridinilo, o furilo, opcionalmente sustituidos con más de dos sustituyentes , cada sustituyente de manera independiente es: alquilo-Ci-6, opcionalmente sustituido con -OH, -C02H, C02alquilo-Ci_3, o CN; alcoxi-Ci-6 alquilt Í0-C1-3, alquilsulfonilo-Ci-3, fluoroalquilo-Ci-3, opeionalmente sustituidos con -OH; halo, -OH, -C02H, o -C02alqui I0-C1-3 ; R2 es hidrógeno o alquilo-Ci-3; y R3 es fenilo, piridinilo, quinolinilo, o furilo, opcionalmente sust-i-tuidos~con-más-de-_dos_&^ de manera independiente: alquilo C1-3, fluoroalquilo C1-3, alcoxi C1-6, fluoroalcoxi C1-3, alquiltio-Ci-3, halo, o -OH. Esta modalidad además abarca compuestos tales como aquellos que se encuentran en la Patente Norteamericana No. 6,034,089 y la Patente Norteamericana No. 6,020,339, las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

En otra modalidad, los compuestos de esta invención tienen la siguiente estructura (VI): que incluye isómeros, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, clatratos de los mismos, en donde: Y es un halógeno o un alquilo o un grupo -XRa; Z es -O-, -S(0)p- o -N(Rb)- en donde p es cero o un numero entero 1 o 2; L es -XR, -C(Rn)C(Ri) (R2) , donde n es cero o el numero entero 1; cada uno de Ra y b es de manera independiente hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido; ¦—-RT—es un——:gr.upo- alquilo, .,.„ , ,alquenilo,_ cicloalquilo_ o cicloalquenilo opcionalmente sustituido; cada uno de Ri y R2 que pueden ser el mismo o diferentes, es hidrógeno, fluorina, -CN, -NO2 , o un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alquiltio, -C02 Re, - CONR9R10 o -CSNR9R10 .opcionalmente sustituido, o Ri y R2 unidos con el átomo de carbono al cual están unidos, son enlazados para formar un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo opcionalmente sustituido; R3 es hidrógeno, flúor, hidroxi o un grupo alquilo lineal o '.ramificado opcionalmente sustituido; R4 es hidrógeno, -(CH2)tAr o - (CH2) t_Ar- (Li) n-Ari, donde t es cero o un numero entero 1, 2, o 3; R5 -(CH2)t Ar o -(CH2) t-Ar-(Li)n-Ar'; R6 es hidrógeno, flúor, o un grupo alquilo opcionalmente sustituido ; R7 es hidrógeno, flúor, o un grupo alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido, -ORc, donde Re es hidrógeno o un grupo alquilo o alquenilo opcionalmente sustituido, o un grupo formilo, alcoxialquilo, alcanoilo, carboxamido o tiocarboxamido; cada uno de Re, R9 y io son de manera independiente hidrógeno o un grupo alquilo, aralquilo o arilo opcionalmente sustituidos; y R11 es hidrógeno, flúor o un grupo metilo. _5„ -rEsta—modalidad —además abarca compuestos tales como aquellos encontrados en la Patente Norteamericana No. 5,798,373, la cual esta incorporada aquí por referencia en su totalidad . En una modalidad preferida, el compuesto es de estructura 10 (VII) : o una sal farmacéuticamente aceptable, hidrato, solvato, clatrato, enantiómero, diastereómero, racemato, o una mezcla de los mismos estereoisomeros . En otra modalidad preferida, el compuesto es de estructura (VIII) : que incluye isómeros, sales, clatratos, solvatos, hidratos, -profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Algunos de estos compuestos pueden ser compercialmente disponibles en Celgene Corp. Warren, New Jersey. Otros - compuestos anteriores pueden ser hechos por métodos conocidos en el arte, incluyendo aquellos divulgados en las patentes citadas anteriormente y que están incorporadas aquí por referencia en sus totalidades. Ejemplos adicionales de inhibidores de PDE IV los cuales son utilizados en métodos de la presente invención incluyen aquellos divulgados en GB 2 063 249 A, EP 0607 439 Al, Pat. U.S. No. 6, 333,354, Pat U:S: No. 6, 300,335, Pat. U.S. No. 6,166,041, Pat. U.S. No. 6,069,156, Pat. U.S. No. 6,011,060, Pat. U.S. No. 5,891,896, Pat. U.S. No. 5,849,770, Pat. U.S.

No. 5,710,170, Pat. U.S. No. 4,101,548, Pat. U.S. No. 4,001,238, Pat. U.S. No. 4,001,237, Pat. U.S. No. 3,920,636, Pat. U.S. No. 4, 060, 615, WO 97/03985, EP 0 607 437 Al, Pat.

U.S. No. 4, 101,548, Pat. U.S. No. 4, 001, 238, Pat. U.S. No. 4,001, 237, Pat. U.S. No. 3,920, 636, Pat . U.S. No. 4,060,615, WO 97/03985, EP 0 395 328, Pat. U.S. No. 4,209,623, EP 0 395 328, Pat. U.S. No. , 209, 623, Pat. U.S. No. 5,354,571, EP 0 428 268 A2, Pat. U.S. No. 5, 354,571, EP 0 428 268 A2, 807, 826, -5~—Pat^U-S^No.— 37 31,.450,~.Pat, U...S.._No. 3,322,755,. Pat. U.S._ No. 5,401, 774, 807, 826 Pat. U.S. No. 3,031, 450 Pat. U.S. No.3, 322, 755, Pat. U.S. No. 5,401, 774, Pat. U.S. No. 5, 147, 875, PCT WO 93/12095, Pat. U.S. No. 5, 147,875, PCT WO 93/12095, Pat. U.S. No. 4,885,301, WO 93/07149, EP 0 349 239 0 ,.A2, EP 0 352 960 A2, EP 0 526 004 A2 , EP 0 526 004 Al, EP 0 463 756 Al, EP 0 607 439 Al, EP 0 607 439 Al, WO 94/05661, EP 0 351 058, Pat. U.S. No. 4,162,316, EP 0 347 146, Pat. U.S. No. 4,047,404, Pat. U.S. No. 5,614,530, Pat. U.S. No. 5,488,055, WO 97/03985, WO 97/03675, WO 95/19978, Pat. U.S. 5 No. 4,880,810, WO 98/08848, Pat. U.S. No. 5,439,895, Pat. U.S. No. 5,614,627, PCT US94/01728, WO 98/16521, EP 0 722 943 Al, EP 0 722 937 Al, Ep 0 722 944 Al, WO 98/17668, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 98/06722, PCT/JP97/03592, WO 98/23597, WO 94/29277, WO 98/14448, WO 0 97/03070, WO 98/38168, WO 96/32379 y PCT/GB98/03712 , todas las cuales están incorporadas aquí como referencia. Muchos . de los compuestos que son contemplados como parte de la presente invención pueden enriquecerse en enantiómeros ópticamente activos de los compuestos especificados anteriormente, utilizando resolución estándar o síntesis asimétrica conocidos en el arte. Vea por ejemplo, Shealy et al., Chem. Indus. 1030(1965); y Casini et al., Fármaco Ed. Sci. 19 :563 (1964). -La—presente- invención—también_concierne a la adición de sales de ácidos fisiológicamente aceptables no tóxicos de los mismos compuestos. Tales sales incluyen aquellos derivados de ácidos o bases orgánicos e inorgánicos conocidos en la técnica: tales ácidos incluyen por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido embólico, ácido enántico, y los similares. Compuestos de la invención que son ácidos por naturaleza son capaces e formar sales' con varias bases farmacéuticamente aceptables. Las bases que pueden ser utilizadas para preparar sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables de tales compuestos ácidos de la invención son aquellos que forman sales de adición de bases no tóxicas, por ejemplo, sales que contienen cationes farmacológicamente aceptables tales como, pero no limitados a, metal alcalino o sales de metales alcalino férreos y el calcio, magnesio, sodio, o sales de potasio en particular. Bases orgánicas convenientes incluyen, pero no se limitan a, N, N-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina , etilendiamina, meglumaina (N-metilglucamina) , lisina, y procaina. Los compuestos de la invención pueden ensayarse por su capacidad para inhibir el PDE IV utilizando métodos bien -conocidos—en-el—arte-,.—por_ej emplo,_aquellos„ensayos_ divulgados en la Patente Norteamericana No. 6,316,472; la Patente Norteamericana No. 6,204,275; Featherstone R.L. et al. (2000) "Comparison of phosphodiesterase inhibitors of differing isoenzyme selectivity added to St. Thomas ' Hospital cardioplegic solution used for hypothermic preservation of rat lungs", Am . J.Respir Crit. Care ed. 162:850-6; y Brackeen M.F. et al. (1995) "Design and synthesis of conformationally constrained analogues of 4- (3-butoxy-4-methoxybenzyl) imidazolidin. -2- one (Ro 20-1724) as potent inhibitors of cAMP-specific phosphodiesterase", J. Med. Chem.38 : 848-54, las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

Los compuestos de la invención pueden ser comprados cada uno en Celgene Corp. (Warren, NJ) , o pueden prepararse de acuerdo a los métodos descritos en las patentes o publicaciones de patente divulgadas aquí. Además, composiciones ópticamente puras pueden ser sintetizadas asimétricamente o resueltas utilizando agentes de resolución o columnas quirales además de otras técnicas químicas orgánicas sintéticas estándar. 5.3 POBLACIONES DE CÉLULAS MADRE La presente invención proporciona métodos de identificación de compuestos que modulan la angiogénesis humana. Cualquier célula madre humana puede ser usada en los -:—-mét-odos—de—la—invención,„.que_incluy.e_n ,__per _no se limitan a_,_ células madre aisladas de cordón umbilical (células de CB) , sangre periférica, sangre de adulto, medula espinal, placenta, células madre mesenquimales y otras fuentes. En una modalidad no preferida, las células madre son células madre son células madre embrionarias que se han aislado de otras fuentes diferentes a la placenta. Fuentes de células madre mesenquimales incluyen medula espinal, saco vitelino embrionario, placenta, cordón umbilical, piel fetal y adolescente, y sangre. Las células de medula espinal se pueden obtener de cresta iliaca, femoral, tibia, espina, costilla, u otros espacios medulares. Las células madre utilizadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden incluir células pluripotentes , es decir, células que tienen versatilidad de diferenciación completa, que son auto renovables, y pueden permanecer dormidas o latentes en el tejido. Las células madre también pueden incluir células multipotentes , células progenitoras comprometidas, y células de fibroblastos. En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son viables, quietas, células madre pluripotentes aisladas de una placenta perfusada, desangrada en un plazo completo. Poblaciones de células madre pueden consistir de células madre de placenta obtenidas a través de un servicio comercial, -5—por—,ej.emplo,—LifeBank._USA_.(Cedar_Knolls.,.. _.NJ)_, ViaCord (Boston MA) , Cord Blood Registry (San Bruno, CA) y Cryocell (Clearwater, FL) . Poblaciones de células madre pueden también consistir de células madre de placenta recolectadas de acuerdo a los 10 métodos divulgados en la publicación de solicitud Norteamericana No. US 2002/0123141, publicada el 5 de Septiembre del 2002, titulada "Method of collecting Placental Stem Cells" y la publicación de solicitud Norteamericana No. US 2003/0032179, publicada en Febrero del 2003, titulada 15 "Post-Partum Mammalian placent, its Use and Placental Stem Cells Therefrom" (ambas de las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad) . Células preferidas para usarse de conformidad con la presente invención son células madre similares a las 20 embrionarias que se originan de un desangrado perfusado de placenta, o células que se derivan de células madre de placenta similares a las embrionarias. Las células madre similares a las embrionarias de la invención pueden caracterizarse mediante la medida de cambios en su morfología y marcadores superficiales de células utilizando técnicas tales como citometria de flujo e inmunocitoquimica y midiendo los cambios en la expresión del gen utilizando técnicas, tales como la PCR. En una modalidad de la invención, tales células -5-.—madre,—simila es—-a—las—einbrionarias__p.ueden c.aractjsriz_arse_ mediante la presencia de los siguientes marcadores de células superficiales CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, SH3 , SH4 , OCT-4 y ABC-p, o la ausencia de los siguientes marcadores superficiales de células CD34, CD38, CD45, SSEA4. En una 10 .modalidad preferida, tales células madre similares a las .embrionarias pueden caracterizarse por la presencia de marcadores superficiales de células OCT-4+ APC-p+. Tales marcadores superficiales de células son de manera rutinaria 'determinados de acuerdo a métodos bien conocidos en el arte, 15 por ejemplo, por citometria de flujo, seguida de lavado con agua y teñidocon un anticuerpo marcador superficial de anticélulas. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD-34, o CD-38, las células pueden ser lavadas en PBS y entonces teñidas doble con picoeritrina anti-CD34, e isotiocianato 20 fluoroceina anti-CD-38 (Becton Dickinson, ountain View, CA) . Células madre similares a las embrionarias que se originan de la placenta tienen características de células madre embrionarias pero no son derivadas de embrión. En otras palabras, la .invención comprende el uso de células OCT-4+ y ABC-p+ que son células madre no diferenciadas que son aisladas de una placenta de un perfusado de un post-parto. Tales células son tan versátiles (por ejemplo, pluripotentes) como las células madre embrionarias. Como se menciono t~5¦—--a teri-ormente , ¦ - -,-un :número de diferentes cé1u1as madre pluripotentes o multipotentes pueden ser aisladas del perfusado de una placenta en diferentes momentos por ejemplo, células hematopoyéticas CD34+ /CD389+, CD34+/CD38-, y CD34- /CD38-. De acuerdo a los métodos de la invención la placenta 10 .humana se utilizada después del nacimiento como la fuente de células madre similares a las embrionarias. Por ejemplo, después de la expulsión desde la matriz, la placenta es desangrada tan rápido como sea posible para ..prevenir o minimizar la apoptosis. Subsecuentemente, tan 15 pronto como sea posible después de desangrar la placenta es perfusada para eliminar la sangre, células residuales, proteínas, factores y otros materiales cualesquiera que estén presentes en el organismo. Desechos de materiales pueden también ser eliminados de la placenta. La perfusión se 20 continua de manera normal con un perfusado apropiado de por lo menos dos o más de veinticuatro horas. En varias modalidades adicionales la placenta es perfusada por por lo menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, y 22 horas. En otras palabras, esta invención se basa por lo menos en parte en el descubrimiento de que las células de una placenta de post-parto pueden ser activadas mediante el desangrado y perfusado por una cantidad de tiempo. Por lo tanto, la placenta puede utilizarse con facilidad como una fuente rica y abundante de células madre simi-la es—a—las—embriona i s_.las__cuales _pueden._ ut il i zar_s.e_para_ la investigación, incluyendo el descubrimiento de fármacos, tratamiento y prevención de enfermedades, en particular en las cirugías de trasplantación y terapias, y la generación de células comprometidas, tejidos y organoides . Vea, publicación :de solicitud Norteamericana No. US 20020123141, publicada el 5 de Septiembre del 2002, titulada "Method of collecting Placental Stem Cells" y la Publicación de Aplicación Norteamericana No. US 2003/0032179, publicada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom" (ambas de las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad) . Células madre similares a las embrionarias son extraídas de una placenta, drenada por medio de una técnica de perfusión que utiliza cada uno o ambos de la arteria umbilical y la vena umbilical. La placenta es drenada preferiblemente mediante el desangrado y recolección de sangre residual (por ejemplo, sangre residual de cordón umbilical) . La placenta drenada es entonces procesada de tal forma que se establezca un bioreactor natural ex vivo medio ambiente en el que las células madre similares a las embrionarias residentes son reclutadas en el espacio extravascular y parénquima. Las células madre similares a las embrionarias migran en el drenado, desalojando la microcirculación donde, de acuerdo a los—métodos—de—la—invención— son.^colectados,,, _preferib1emente_ mediante lavado con agua en un recipiente de recolección por perfusión . 5.4 MÉTODOS DE CULTIVO DE CÉLULAS MADRE En ciertas modalidades de la invención, células progenitoras o células madre, que incluyen pero no se limitan a células madre embrionarias, células madre similares a las embrionarias, células progenitoras, células pluripotentes, células totipotentes , células multipotentes, células endógenas de una placenta perfusada de pos-parto, células de sangre de cordón umbilical, -células madre o progenitoras derivadas de sangre periférica o sangre de adulto, o células de medula espinal, son utilizadas en los ensayos de selección in vitro de la presente invención. En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras no se derivan de una placenta perfusada de posparto pero en su lugar, son aisladas de otras fuentes tales como sangre de cordón umbilical, medula espinal, sangre periférica o sangre de adulto, son expuestos a los compuestos de la invención y ensayados por angiogénesis .

En otra modalidad, el cultivo de células madre, por ejemplo, células madre cultivadas in vitro o en una placenta prefusada de pos-parto, son estimuladas para proliferar en cultivo, ' por ejemplo, mediante la administración de erit ropoyefe-i-nav—-ci.tocinas , linfocinas ,__inter_ferones, factores de estimulación de colonias (CFS's), interferones , quimocinas, 'interleucinas, factores de crecimiento hematopoyético recombinante humano que incluye ligandos, factores de células madre, t rombopoyetina ( po) , interleucinas, y factor de -estimulación de colonias de granulositos (G-CSF) u otros factores de crecimiento. 5.4.1 Cultivo de Células Madre In Vitro Métodos para el cultivo de células madre o progenitoras .son bien conocidos en el arte, por ejemplo, Thomson et al., 1998, Science 282:1145-47 (embryonic stem cells); Hirashima et al., 1999, Blood 93(4) : 1253-63, y Hatzopoulos et al., 1998, Development 125:1457-1468 (endóthelial cell progenitors); Slager et al., 1993, Dev. Genet. 14(3) :212-24 (neuron or muscle progenitors); Genvachev et al., 1995, Reprod. Toxicol. 9(3) :245-55 (cytotrophoblasts, es decir, placental epitelial cell progenitors) ; Nadkarni et al., 1984, Tumori 70:503-505, Melchner et ' al., 1985, Blood 66(6) : 1469-1472, publicación internacional PCT WO 00/27999 publicada el 18 de Mayo, del 2000, Himori et al., 1984, Intl. J. Cell Cloning 2:254-262, y Douay et al., 1995, Bone Marrow Transplantation 15:769-775 (hematopoietic progenitor cells); Shamblott et al., 1998, Proc Nati. Acad. Sci . USA 95:13726-31 (primordial germ cells); Yan et al., 2001, Devel . Biol.. 235:422-432 (trophoblast stem -5- —cel-l-s-)-r: . -———¦ , , 5.4.2 Cultivo de Células Madre en una Placenta Perfusada de Post-parto Los métodos de la presente invención abarcan el uso de células madre pluripotentes derivadas de una placenta. Métodos 10 -de obtención y cultivo de tales células, como se describe abajo es descrita en detalle en la publicación de solicitud Norteamericana No. US 20020123141, publicada el 5 de Septiembre del 2002, titulada "Method of Collecting Placental <Stem Cells" y en la publicación de solicitud Norteamericana 15 No. US 20030032179 123141, publicada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom, " ambas de las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad. 5.4.2.1 Pretratamiento de la placenta 20 De acuerdo a los métodos de la invención, una placenta humana se recupera poco después de su expulsión después del nacimiento y, en ciertas modalidades, se recupera la sangre del cordón umbilical en la placenta. En ciertas modalidades, la placenta se somete a un proceso de recuperación de sangre de cordón umbilical convencional. De manera típica se utiliza una aguja o cánula, con la ayuda de la gravedad, para drenar la sangre del cordón umbilical de (es decir, desangrado) la placenta (Boyse et al., Patente Norteamerricana No. 5,192,553, -5—emi-t-i-dar-—el-,—-9——de—Marzo—.19.93.;-__.Boyse et al . , Patente Norteamericana No. 5,004, 681 , emitida el 2 de Abril de 1991: Anderson, Patente Norteamericana No 5,372,581, emitida el 13 de Diciembre de 1994; Hessel et al., Patente Norteamericana No 5,415,665, titulada "Umbilical cord camping, cutting, and blood LO collecting device and method", emitida el 16 de Mayo de 1995) . La sangre del cordón umbilical recuperada puede obtenerse de manera comercial, por ejemplo, LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ) , ViaCord (Boston MA) , Cord Blood Registry (San Bruno CA) y Cryocell (Clearwater, FL) . La sangre del cordón umbilical 15 puede drenarse poco después de la expulsión de la placenta. La placenta del post-parto se drena de la sangre del cordón umbilical. La placenta almacenada puede estar bajo condiciones estériles y uno de los dos estar a temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25 °C (centígrados) . La 20 placenta puede ser almacenada por un periodo de no más de cuarenta y ocho horas, y preferiblemente por un periodo de cuatro a ¦ veinticuatro horas antes de la perfusión de la placenta para eliminar cualquier sangre de cordón umbilical residual .

La placenta se recupera preferiblemente después de la expulsión bajo condiciones asépticas, y se almacena en una solución anticoagulante a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados) . Soluciones anticoagulantes convenientes son ¦bien—conocidas- -en —el— ar.te..._P.qr„e ,emplo,__una__ solución de heparina o warfarina-sodio pueden utilizarse, por ejemplo, una solución de heparina (una solución 1% p/p en 1:1000). La placenta drenada se almacena preferiblemente por no más de 36 horas antes de que las células madre similares a las embrionarias sean colectadas. La solución que se utiliza para la perfusión de la placenta para eliminar células residuales puede ser la misma solución utilizada para la perfusión y cultivo de la placenta para la resuperación de las células madre. Cualquiera de esos perfusados pueden ser colectados y utilizados como una fuente de células madre similares a las embrionarias . La placenta también puede ser recuperada de un paciente mediante el consentimiento informado y un historial médico completo del paciente antes, durante y después del embarazo también se toma: y se asocia con la placenta. Estos registros médicos pueden utilizarse para coordinar el uso subsecuente de la placenta o las células madre cosechadas de ahí. Por ejemplo, las células madre de placenta humana pueden entonces ser fácilmente utilizadas para medicina personalizada para el infante en cuestión, los padres, hermanos u otros relativos. Después, las células madre de placenta humana son más versátiles que las de sangre de cordón umbilical. De cualquier modo, deberá notarse que la invención incluye la adición de ¦cé-l-u-las——madre—de placenta humana producidas mediante desangrado, perfusado y/o cultivado de placenta o sangre de cordón umbilical de la misma o diferente placenta y cordón umbilical. La sangre de cordón umbilical resultante tendrá un incremento en la concentración/población de células madre humanas y por tal es más útil para el trasplante, por ejemplo, para trasplantes de medula espinal. 5.4.2.2 Desangrado de la Placenta y Eliminación de Células Residuales De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, células madre o progenitoras , que incluyen pero no se limitan a células madre similares a las embrionarias, pueden recuperarse de una placenta que se desangra, es decir, completamente drenada de la sangre de cordón umbilical que permanece después del nacimiento y/o un procedimiento de recuperación convencional de la sangre de cordón umbilical. 5.4.2.3 Cultivo de la Placenta y Células Madre de Esta. Después del desangrado y un tiempo suficiente de perfusión de la placenta, las células madre similares a las embrionarias son observadas para migrar en la microcirculación de desangrado y perfusado de la placenta donde, de acuerdo a los métodos de la invención, ellas son recolectadas en un recipiente de recolección de perfusión. La perfusión aislada de la placenta no solo sirve para eliminar sangre de cordón -umbi-l-ical—-residual—sino—que_.también„proporciona ^.a_la..placenta^ con los nutrientes apropiados, incluyendo oxigeno. La placenta puede cultivarse y ser perfusada con una solución similar a la que se utilizó para eliminar las células de la sangre de cordón umbilical residual, preferiblemente, sin la adición de agentes anticoagulantes. En ciertas modalidades de la invención, la placenta desangrada, drenada se cultiva como un bioreactor, es decir, un sistema ex vivo para la propagación de células o para la producción de materiales biológicos. El número de células propagadas o nivel de material biológico producido en el bioreactor de la placenta se mantiene en un estado continuo de crecimiento balanceado por eliminación continua o periódica de una parte de un medio de cultivo o fluido de perfusión que se introduce en el bioreactor de la placenta, y de los cuales las células propagadas o el material biológico producido puede ser recuperado. El medio fresco o fluido de perfusión se introduce en la misma proporción o en la misma cantidad. El numero y tipo de células propagadas pueden fácilmente ser monitoreadas mediante la medida de los cambios en la morfología y marcadores superficiales de células utilizando técnicas de detección estándar tales como citometría de flujo, clasificación célular, inmunocitoquimica (por ejemplo, teñido con anticuerpos específicos del tejido o específicos del —-marcador——ce1ular:)-r-=—clasificación„_.ce1u1ar_ a.ctivada_ ... con fluorescencia (FACS), clasificación celular magnética activada (MACS) , por examinación de la morfología de células utilizando luz o microscopía confocal o mediante la medida en los cambios en la expresión de gen utilizando técnicas bien conocidas en el arte, tales como PCR y perfil de expresión de gen. Los factores de crecimiento introducidos en la solución de perfusión pueden estimular la propagación de células madre •similares no embrionarias, no diferenciadas, células progenitoras comprometidas, o células diferenciadas (por ejemplo, células hematopoyéticas diferenciadas) . Los factores de crecimiento pueden estimular la producción de materiales biológicos y moléculas bioactivas que incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas , hormonas, enzimas o factores de crecimiento como se describió previamente. La placenta cultivada deberá ser "alimentada" de manera periódica para eliminar el medio consumido, células liberadas despobladas, y adicionar un medio fresco. La placenta cultivada deberá ser almacenada bajo condiciones de esterilidad para reducir la posibilidad de contaminación, y mantener bajo presurización periódica e intermitente para crear condiciones que mantengan un suplemento adecuado de nutrientes a las células de la placenta. Se deberá reconocer que el perfusado y cultivo de la placenta pueden ser ambos automatizados y computarizados por -la—efici-enci-a—y~capacidad -incrementada , En otra modalidad, la placenta se procesa para eliminar todas las células endógenas que proliferan, tales como las células madre similares a las embrionarias, y para permitir a células ajenas o extrañas (es decir, exogéno) introducirse y propagarse en el medio de la placenta perfusada. La invención contempla una gran variedad de células madre o progenitoras que pueden cultivarse en el bióreactor de la placenta, incluyendo, pero no limitado a, células madre similares a las células madre similares a las embrionarias, células madre mesenquimales , células de la estroma, células endoteliales , hepatocitos, queratinocitos , y células madre o progenitoras, para un tipo de célula particular, tejido u órgano, que incluyen pero no se limitan a neuronas, mielina, músculo, sangre, médula espinal, piel, corazón, tejido conectivo, pulmón, riñon, hígado y páncreas (por ejemplo, células de isletas pancreáticas) . 5.5 MÉTODOS DE TRATAMIENTO QUE UTILIZAN COMPUESTOS DE ENSAYO-IDENTIFICACIÓN Como se muestra en los ejemplos de trabajo (vea la Sección 6, abajo) los ensayos identifican una clase de compuestos que presentan actividad de anti-angiogénesis . Estos compuestos son miembros representativos de la clase de compuestos-—descritos- - -en -la. Sección____ anterior 5..2 ,_ específicamente, los compuestos representativos son Actimid™, Revimid™, y talidomida. Otros compuestos pueden ser identificados por el ensayo en la misma forma como se describió en los ejemplos, y en otra parte aquí. Tales compuestos pueden ser cualquier compuesto que tiene el efecto modulador deseado sobre la angiogénesis o la vasogénesis, y puede ser una proteína, un péptido, un análogo de un péptido, ácido nucleico o un análogo de un ácido nucleico, carbohidratos, lípidos, pequeña molécula inorgánica, etc. Compuestos identificados como anti-angiogénicos pueden utilizarse para tratar cualquier enfermedad o condición que tiene un componente angiogénico. Por ejemplo, un marcador de agresividad en cáncer, tal como el cáncer de mama, es la producción de tumores cancerígenos de agentes angiogénicos ; y el incremento en la vascularización dentro y en la periferia al tumor ' conduce a un incremento en la proporción del crecimiento -del tumor y la metástasis del tumor. Suprimiendo este potencial angiogénico ayudará a suprimir el crecimiento y la metástasis del tumor. De esta manera, los compuestos de la invención, pueden usarse para tratar el cáncer, incluyendo cáncer metastático. Tal tratamiento es preferiblemente combinado con otras terapias de cáncer. Otras alteraciones que pueden tratarse con los compuestos identificados mediante los —5—métodos—de ¦ selección—de—la—invención incluyen inflamación,_ endometriosis , artritis, placas ateroscleróticas , retinopatia diabética, glaucoma neovascular, tracoma, neovascular i zación suave corneal, psoriasis, escleroderma, hemangioma y cicatrices hipertróficas, adhesiones vasculares y 10 angiofibroma . Asi, en una modalidad, la invención proporciona un método de tratamiento a un individuo, en donde dicho individuo tiene una condición o enfermedad asociada con la angiogénesis o la vasogenesis, que comprende la administración a dicho individuo 15 de una cantidad de un agente suficiente para reducir dicha angoigénesis o vasogénesis, en donde dicho agente ha sido identificado, en un ensayo descrito aquí que tiene actividad anti-angiogénica o anti-vasogénica . En una modalidad especifica, dicho agente es un compuesto que suprime la 20 actividad de TNF-ot. En una modalidad más especifica, dicho agente se selecciona del grupo que consiste de talidomida, Actimid™ o Revimid™. En otra modalidad, la invención proporciona un método de tratamiento a un individuo, en donde dicho individuo tiene una condición o enfermedad asociada con la angiogénesis o la vasogénesis, que comprende la administración a dicho individuo de una cantidad de un compuesto que suprime la actividad de TNF-oc, en donde dicha ""cantidad "es suf±exente—para—reduci-r— -dicha—angiogénesis—o_ vasogénesis. En una modalidad más especifica, dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de talidomida, Actimid™, o Revimid™. El mismo método de identificación puede ser utilizado .para identificar compuestos que incrementan la angiogenseis o la vasogénesis, es decir, compuestos angiogénicos : tales agentes pueden ser utilizados para tratar enfermedades o condiciones con la vascularización insuficiente o lesión en los vasos. Por ejemplo, tales compuestos pueden administrarse a un individuo que experimenta una cirugía, particularmente cirugía en los vasos o cardiaca, para mejorar la proporción en la reparación de los vasos. En un segundo ejemplo, tales compuestos pueden utilizarse para tratar individuos que tienen flujo de sangre periférico insuficiente, tales como individuos que tienen una herida que no cicatriza, o la enfermedad de Reynaud. Así, en otra modalidad la invención proporciona un método de tratamiento a un individuo, en donde dicho individuo tiene una condición o enfermedad asociada con la angiogénesis o vasogénesis suficiente, que comprende la administración a dicho individuo de una cantidad de un agente que incrementa la angiogénesis o la vasogénesis, dicho agente administrado en una cantidad suficiente para incrementar dicha angiogénesis o —5— asogénesi-s¦, : — . _ Moduladores de la angiogénesis y/o vasogénesis pueden administrarse mediante métodos resumidos en la Sección 5.6, aba o . 5.6 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS 10 La presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos identificados como moduladores de la angiogénesis mediante los métodos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden .administrarse a un sujeto en la necesidad de tal tratamiento 15 para modular la angiogénesis La administración de los compuestos de la invención pueden ser sistémicos o locales. En más casos, la administración a un mamífero resultará en una liberación sistémica de los compuestos de la invención (es decir, en el 20 torrente . sanguíneo) . Métodos de administración incluyen vías entérales, tales como oral, bucal, sublingual y rectal; administración tópica, tales como transdérmica e intradérmica; y administración parenteral . Rutas parentales convenientes incluyen la inyección vía aguja hipodérmica o catéter, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal , intraarterial , intraventricular , intratecal, e inyección inttracameral, y rutas de no inyección tales como la recta intravaginal o la administración nasal. __-5 Pref-e i-bl-emente ,· 1os_-—compuestos y compos iciones „ _de la. invención se administran de manera oral. En modalidades especificas, puede ser . deseable administrar uno o más compuestos de la invención de manera local al área en necesidad de tratamiento. Esto puede ser llevado a cabo, por 10 .ejemplo, mediante una infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con una herida vendada después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, por medio de un implante, siendo dicho implante de un material gelatinoso, 15 poroso, no poroso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Los compuestos de la invención pueden administrarse de manera típica además de sistemas de liberación no estándar, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropart ículas , 20 microcapsulas , capsulas, etc. Por ejemplo, los compuestos y composiciones de la invención pueden liberarse en una vesícula, en particular en un liposoma (vea Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in Therapy of infeetious Disease and cáncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp . 317-327; vea de manera general ibid.) . En otro ejemplo, los compuestos y composiciones de la invención pueden liberarse en un sistema de liberación controlado. En otra ^—5—modal-idad,-—puede:—útil i zarse—.ur.a bomba ... Í.ve Langer,. _supra Sefton, 1987, CRC Crit.Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507 Saudek et al., 1989, N. Engl . J. Med. 321:547) . En otro ejemplo, pueden utilizarse materiales poliméricos vea Medical Applications of Controlled Released, 10 Langer and ise (eds.), CRC Press., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Biovailability , Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), idley, New York (1984); Ranger and Peppas, .1983, J. Macromol. Sci . Rev Macromel. Chem. 23:61; vea también Levy et al., 1985, Science 15 .228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71 :105) . Aún en otro ejemplo, un sistema de liberación . controlada puede colocarse en la proximidad de un área objetivo a ser tratada, e.g., el hígado, así que requiere únicamente una fracción de la dosis sistémica 20 (vea por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)) . Se pueden utilizar otros sistemas de liberación controlada descritos en la revisión de Langer, 1990, Science 249: 1527- 1533) . Cuando se administran como una composición, se formulará un compuesto de la invención con una cantidad adecuada de un vehículo o portador aceptable farmacéuticamente para proporcionar la forma para una administración apropiada al mamífero. El término "aceptable farmacéuticamente" significa—aprobado—por„._una_agen ia_de„re.gu1ació_n federal o ? de un gobierno estatal, o listado en la Farmacopea Norteamericana u otra farmacopea reconocida generalmente, para su uso en mamíferos, y más particularmente en humanos. El término "vehículo", se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o portador con el cual un compuesto de la invención se formula para su administración a un mamífero. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, que incluyen aquellos de petróleo, de origen animal, vegetal o \ sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite mineral, aceite de. ajonjolí y similares. Los vehículos farmacéuticos pueden ser de solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea, y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizadores, espesantes, lubricantes y colorantes. Preferiblemente, cuando se administran a un mamífero, los compuestos y composiciones de la invención y los vehículos, excipientes o diluyentes aceptables farmacéuticamente, son estériles. Un medio acuoso es un vehículo preferido cuando se administra intravenosamente el compuesto de la invención, tal como agua, soluciones salinas, y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol. Los presentes compuestos y composiciones pueden tener la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, comprimidos, grageas, —5 : — r-pol~vos , —grá-nu1os.,. -.j arabes , e1ixires , so1uciones,,„_s_u_sp_ensiones emulsiones, supositorios, o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, o cualquier otra forma adecuada para su administración a un mamífero. En una modalidad preferida, los compuestos y composiciones de la invención se formulan 10 para su administración de conformidad con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica, adaptada para administración oral o intravenosa a humanos. En una modalidad, el vehículo aceptable farmacéuticamente es una cápsula de gelatina dura. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos 15 adecuados y métodos para la formulación de los mismos, se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co . Easton, PA, 19th ed., 1995, Capítulos 86, 87, 88, 91, y 92, incorporada aquí como referencia. 20 Los compuestos y composiciones de la invención formulados para suministro oral, preferiblemente están la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, o cualquier forma farmacéutica comprimida. Además, cuando están en la forma de tableta o pildora, los compuestos y composiciones de la invención se pueden recubrir para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal proporcionando de este modo una acción sostenida durante un periodo de tiempo prolongado. Las membranas permeables selectivamente que circundan_un_compues.to_conductor._actiyo o_smót_icamenté , también son adecuados para administrar oralmente compuestos y composiciones de la invención. En estas últimas plataformas, el fluido del ambiente que rodea la cápsula se impregna por el compuesto conductor que se hincha para desplazar el agente o composición de agentes a través de una abertura. Estas plataformas de suministro pueden proporcionar un perfil de suministro esencialmente en el orden de cero a diferencia de los perfiles neutralizados de las formulaciones de liberación intermediada. También se puede utilizar un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir vehículos, excipientes, y diluyentes estándar, tales como estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, jarabe, y metilcelulosa, las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio, aceite mineral, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservadores tales como metil- y propilhidroxibenzoatos. Tales vehículos preferiblemente son de calidad farmacéutica. Los compuestos y composiciones administrados oralmente de la invención pueden incluir opcionalmente uno o más ^gen^^__ed_ulcorantes, tales como fructosa, aspartamo o sacarina, uno o más agentes saborizantes ¦tales como hierbabuena, aceite de gaulteria, o cereza; o uno o más agentes colorantes para proporcionar una preparación apetecible farmacéuticamente. Un régimen de dosificación efectiva terapéuticamente para el tratamiento de un desorden o condición particular dependerá de su naturaleza y severidad, y se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar de conformidad con la opinión de un practicante médico. Además, se pueden utilizar ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar dosificaciones óptimas. Por supuesto, la cantidad, de un compuesto de la invención que constituye una dosis efectiva terapéuticamente también depende de la ruta de administración. En general, los rangos adecuados de dosificación para administración oral son de alrededor de 0.001 miligramos a alrededor de 20 miligramos de un compuesto de la invención por kilogramo del peso corporal por día, preferiblemente, alrededor de 0.7 miligramos hasta alrededor de 6 miligramos, más preferiblemente, desde alrededor de 1.5 miligramos hasta alrededor de 4.5 miligramos. En una modalidad preferida, un mamífero, preferiblemente, un humano se administra oralmente con alrededor de 0.01 mg hasta alrededor de 1000 mg de un compuesto de la invención por día, más preferiblemente, a1redeclof"~de 0~1— mg—hasta—:alrededqr_ de 3_00 mg por día, o alrededor de 1 mg hasta alrededor de 250 mg en dosis individuales o divididas. Las cantidades de dosificación descritas aquí se refieren a cantidades totales administradas; es decir, si se administra más de un compuesto de la invención, las dosificaciones preferidas corresponderán a la cantidad total de los compuestos de la invención administrados. Las composiciones orales preferiblemente contienen de 10% a 95% en peso de un compuesto de la invención. Las formas preferidas de dosificación oral unitaria incluyen pildoras, tabletas, y cápsulas, más preferiblemente cápsulas. Típicamente tales formas de dosificación unitaria contendrán alrededor de 0.01 mg, 0.1 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, ó 500 mg de un compuesto de la invención, preferiblemente, desde alrededor de 5 mg hasta alrededor de 200 mg del compuesto por dosificación unitaria. En otra modalidad, los compuestos y composiciones de la invención se pueden administrar parenteralmente (por ejemplo, mediante rutas intramusculares, intratecales , intravenosas, e intraarteriales) , preferiblemente, intravenosamente.

Típicamente, los compuestos y composiciones de la invención para una administración intravenosa, son soluciones en vehículos acuosos, isotónicos, estériles, tales como agua, solución salina, solución de Ringer, o solución de dextrosa. Cuando " sea~ ne¾e"sario7^ras~composiciones—también_pueden_incluir un agente de solubilización . Las composiciones para administración intravenosa opcionalmente pueden incluir un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Para la administración intravenosa, los compuestos y composiciones de la invención se pueden suministrar como un polvo liofilizado, seco, estéril, o un concentrado libre de agua en un contenedor sellado herméticamente, tal como una ampolleta o sachette (saquito o ámpula) , el contenedor indica la cantidad de un agente activo. Tal polvo o concentrado se diluye entonces con un medio acuoso apropiado antes de la administración intravenosa. Se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril, solución salina, u otro medio acuoso apropiado con el polvo o concentrado para su dilución antes de la administración. O se pueden suministrar las composiciones en forma pre-mezclada, lista para su administración. Cuando un compuesto y composición de la invención se va a administrar mediante infusión intravenosa, se puede distribuir, por ejemplo, con un frasco de infusión que contenga agua de calidad farmacéutica, solución salina, u otro medio adecuado. Se puede efectuar la administración rectal a través del uso de supositorios formulados a partir de portadores convencÍOnal:e's~t'al'es"Corao-manteca—de—cacao, _aceite_s__yegeta1es modificados, y otras bases. Los supositorios se pueden formular mediante métodos bien conocidos utilizando formulaciones bien conocidas, por ejemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co . Easton, PA, 19th ed. , 1995, pp. 1591-1597, incorporada aquí como referencia. Para formular y administrar formas de dosificación tópicas, se pueden utilizar medios bien conocidos de suministro, transdérmico e intradérmico tales como lociones, cremas, y ungüentos y dispositivos de suministro transdérmicos tales como parches (Ghosh, T.K.; Pfister, .R.; Yum, S.I. Transdermal and Topical Drug Delívery Systems, Interpharm Press, Inc. p. 249-297, incorporada aquí como referencia) . Por ejemplo, un diseño de parche de tipo depósito puede comprender una película de respaldo revestida con un adhesivo, y un compartimiento de depósito que comprende un compuesto o composiciones de la invención, que se separa de la piel mediante una membrana semipermeable (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,615,699, incorporada aquí como referencia) . La capa de respaldo revestida con adhesivo se extiende alrededor de los bordes del depósito para proporcionar un sello concéntrico con la piel y para mantener el depósito adyacente a la piel. La i"ñvención también—proporciona—-paquetes.._o_ e¾uip_os_ farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores rellenos con uno o más compuestos de la invención. Opcionalmente puede estar asociada con tal (es) contenedor ( s ) , una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuya notificación refleje la aprobación de la agencia de fabricación, para su uso o venta para administración humana. En una modalidad, el equipo contiene más de un compuesto de la invención. En otra modalidad, el equipo comprende un compuesto de la invención y otro agente activo biológicamente. Los compuestos de la invención preferiblemente se evalúan in vitro e in vivo, para la actividad terapéutica o prolifáctica deseada, antes de su uso en humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos in vitro para determinar si se prefiere la administración de un compuesto especifico de la invención o una combinación de compuestos de la invención. Los compuestos y composiciones de la invención también puede demostrar ser efectiva y seguridad utilizando sistemas con modelos animales. Otros métodos serán conocidos para el experto y están dentro del alcance de la invención. 6. EJEMPLOS 6.1. Ejemplo 1 : Desarrollo de Ensayo de Angiogénesis ~~~Humana ~~ — — — - — r ¦ — — : . — „ — - Vasogénesis Espontánea (Formación de Tubos) a partir de Células Madre de la Placenta, Pluripotentes. Las células madre, pluripotentes, humanas se colocaron en placas inmediatamente después del aislamiento y las células adherentes se seleccionaron a partir de las poblaciones no adherentes después de 24 horas. Estas células adherentes se cultivaron en DMEM suplementado con suero de sangre del cordón umbilical (CBS) y antibióticos. El perfil del curso del tiempo de la vasogénesis espontánea, cuando se caracteriza por el montaje de las estructuras microtubulares , se determinó y los especímenes celulares se recolectaron en varios momentos para ensayar los marcadores espe.cíficiso endoteliales y los productos sintéticos. Con base en el curso de tiempo así obtenido, la dosis de tratamiento y los itinerarios se desarrollaron para seleccionar los químicos moduladores de la angiogénesis del candidato. Preparación de los Anillo de los Vasos Sanguíneos del Cordón Umbilical .

Se cortaron los vasos sanguíneos, de aproximadamente 1-2 mm en diámetro y 1-2 cm de longitud del cordón umbilical humano dentro de 12 horas del nacimiento. Tanto los tejidos arteriales como venosos se cosecharon y mantuvieron separadamente" rL"os~vasos—se-col-oca-ron-en- DMEM_que._contenía_2_._5_ pg/ml de fingizona y se cortaron en fragmentos de longitudes de 1-2 mm usando pinzas de disección finas y tijeras de iridectomía. Los fragmentos de los vasos se liberaron y los coágulos residuales y se enjuagaron en D EM antes del uso. La disección y el seccionamiento de los vasos se realizaron con la ayuda de un microscopio quirúrgico. Se obtuvieron respuestas angiogénicas similares a partir de vasos sanguíneos de origen venular y arterial pero para cada ensayo, se usaron los fragmentos de vasos de solamente un vaso. Ver la Fig . 6 para una representación gráfica del ensayo. Establecimiento del Ensayo Los ensayos se llevaron a cabo en cajas de petri (10 a 25 cm2) o placas de cultivo de 6 pozos (Costar, Cambridge, Mass.), los cuales se prepararon pre-revistiéndolas ya sea con gelatina al 0.1% (Sigma, St. Louis, MO) o ' MATRIGEL© (BD Biosciences) para formar una matriz. Enseguida del revestimiento de las placas, 50 µ? de plasma de sangre del cordón humano en 5 mL de DMEM se agregaron a cada plato/pozo para formar una película superficial sobre la matriz. Se permitió a la película fijarse a 37°C por 90 minutos, después de lo cual se removió, dejando una película delgada en cada plato/pozo. Los segmentos anulares del recipiente se colocaron entonces dentro de las posiciones centrales de las placas o ??G??os ;~E6's~pina os--de- perri-- se---dividicror._cr. _c ar:cs,, y__!°§. segmentos anulares del recipiente se colocaron en el centro de cada uno de los cuadrantes . En el caso de las placas de cultivo de 6 pozos, un segmento anular del recipiente se colocó en cada uno de los pozos. Los segmentos anulares del recipiente se adhieren de manera general a la matriz revestida en un plazo de 12 horas, permitiendo la adición del medio sin riesgo de desprendimiento debido a la flotación. Enseguida de la adherencia, los recipientes se cultivaron con DMEM suplementado con 20% de plasma de sangre del cordón humano, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y heparina, a 37 °C en un ambiente humidificado durante 14-21 días. El medio se cambió a intervalos de aproximadamente 72 horas. Los fibroblastos contaminaron ocasionalmente los cultivos, pero sólo aparecieron usualmente como una monocapa sobre el fondo de los pozos de cultivo porque, a diferencia de las células endoteliales , los fibroblastos no pueden invadir los MATRIGELs. Las excrecencias de los fibroblastos son despreciables cundo los fragmentos de los vasos se suspenden en gel de fibrina en lugar que en contacto con la base plástica de los pozos de cultivo. Para inhibir la reacción de coagulación y la contaminación con fibroblastos resultante, el inhibidor fibrinolitico, ácido epsilon-aminocaproico puede ser incluido en el medio de cultivo. Administración—de—los-Compuestos-de-.Prueba_y__Calificación_ de Resultados Los compuestos de prueba se administraron al inicio del cultivo, una vez que se seleccionaron las células madre adherentes, o una vez que se determinó que los anillos de vasos se hablan adherido a la matriz. Cada compuesto de prueba se evalúa a varias concentraciones para permitir la generación de un análisis de respuesta a la dosis. La modulación de la angiogénesis se definió como el cambio en la angiogénesis en cada ensayo cuando se compara con un control positivo y negativo. El control positivo se definió como la respuesta al suplemento de crecimiento celular endotelial (ECOS; 200pg/ml; Collaborative Research, Bedford, MA) . El control negativo se definió como la respuesta a DMSO. La excrecencia de los vasos se calificó como una comparación cuantitativa con los controles positivo y negativo, usando las siguientes notaciones: - negativo; +/-mínimamente arriba del control negativo; + nivel bajo de excrescencia; ++ nivel moderado de excrecencia; +++ nivel alto de excrecencia; ++++ nivel del control positivo de excrecencia. La excrecencia de los vasos se calificó también morfometricamente como la distancia máxima del crecimiento de brotes de vasos en micrones desde el anillo de vasos, y como el área total de cobertura de células endoteliales (ECA) /área Ensayo de Migración Como los brotes de vasos parecen ser sensibles a la presencia y la naturaleza de la matriz extracelular en el origen de los brotes, se uso un método modificado para 10 estimular el ambiente extravascular fisiológico. Usando una matriz de colágeno humano no desnaturalizada (Antromatriz) , segmentos de arterias umbilicales humanas fijadas se cultivaron bajo las mismas condiciones descritas arriba para los segmentos de anillos de vasos. Como una modificación, 15 estos segmentos de vasos se montaron en una posición fija sobre la matriz. Con este arreglo, los brotes endoteliales crecieron sobre la matriz, y se recuperó un "cartucho" completo del segmento de vaso, a partir del plato para cultivos celulares para el análisis. El grado de angiogénesis 20 se calificó como arriba. Inmunohistoquimica Las placas que demostraron respuestas angiogenicas detectables (es decir, nuevo crecimiento vascular) se fijaron durante toda la noche en paraformaldehído al 4% en PBS a 4°C como preparación para la inmunohistoquimica . Las matrices fijadas se embeben en parafina. A partir de estas matrices embebidas, secciones histológicas de 3 pm se cortaron y se montaron sobre láminas de vidrio de microscopio revestidas con 'poM'-t-i'rs na-T—-Las--secciones~.se---trataron_con„micro_onda^por__3_ minutos y se digirieron parcialmente con tripsina al 0.1% en CaCl2 al 0.1% para exponer los antigenos. Las secciones se hicieron reaccionar entonces con los anticuerpos e Ig anti-raton de F(ab' )2 de oveja acoplado a peroxidasa de rábano picante (Amersham, Amersham, Herts., U.K.) se uso como el sistema de detección. Las secciones se hicieron reaccionar con diaminobencidina con mejoramiento de plata y se contratiñeron con hematoxilina . Los anticuerpos usados incluyen el antigeno relacionado con el factor VII anti-humano de ratón monoclonal (Dako. Dinamarca), células mAb endoteliales anti-humano (Gibco, Grand Island, N.Y.) y un mAb especifico de CD31 (clon 20G5) producido en la John Curtís School of Medical Research. El teñido inmunohistoquímico de las muestras angiogenicas se llevó a cabo para detectar el antígeno relacionado con el factor VIII, una reacción que demuestra claramente si las excrecencias son vasos sanguíneos. Los vasos se hicieron reaccionar también con un mAb específico para células endoteliales humanas (Gibco) y con mAb para CD31, un antígeno expresado solamente en células endoteliales, plaquetas y algunos leucocitos. En algunos casos, la examinación se las muestras angiogenicas bajo el microscopio electrónico se llevó a cabo también para detectar células con una morfología endotelial clásica. " -Método-y-Ensayo-de- alidación . Enseguida del cultivo por 1.-21 días, como se describe arriba, se cuantificó la angiogénesis y se comparó con los cultivos de control. Las siguientes substancias se probaron para establecer los valores de línea base: • heparina (100 pg/ml) • heparina de bajo peso molecular (100 yg/ml) ¦ · suramina (un potente inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular) (100 pg/ml y 10 g/ml) • · 3-hidrocortisona (10~5 M) • 3-hidrocortisona (10~5 M) y heparina (100 pg/ml) • anticuerpos neutralizantes policlonales para el factor de crecimiento ácido de fibroblastos (aFGF) • anticuerpos neutralizantes para el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) •mezcla de anticuerpos neutralizantes policlonales para aFGF y bFGF • anticuerpos neutralizantes policlonales para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGA) Criterios de Validación del Desarrollo Estos estudios se llevaron a cabo para demostrar que el sistema es efectivo para ensayar moduladores conocidos de la angiogénesis . —5 - - r-r Tja~heparina—-y—la—rhepa-r-ína—de—ba o peso molecular_,(.ipO. µq/ l) individualmente usualmente no inhiben la angiogénesis. Folkman & Brem (1992) "Angiogénesis and Inflammation, " En: INFLAMMATION, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL CORRELATES Gallin et al., eds . , Raven Press, Nueva York. Estas dos moléculas, 10 sin embargo, exhiben una pequeña pero significativa inhibición de la angiogénesis en el ensayo mostrado. Sin embargo, este efecto inhibidor no puede ser reproducido en otros ensayos. En contraste, la suramina a 100 pg/ml virtualmente inhibe totalmente la angiogénesis en tanto que a 10 pg/ml se pierde 15 la actividad inhibidora de este compuesto. La hidrocortisona individualmente, como la heparina, usualmente tiene poca o ninguna actividad angiogenica (Folkman & Brem (1992)) . Se sabe que la hidrocortisona, a la concentración relativamente alta de 10"5 , parcialmente inhibe la angiogénesis en comparación 20 con el diluyente de control DMSO (0.5%) [CITA] . Aquí, sin embargo, una combinación de heparina e hidrocortisona inhibe casi completamente la respuesta angiogénica. Tal resultado ha sido mostrado en vivo donde la heparina se sinergiza con los esteroides para causar la regresión de los capilares crecientes (Folkman & Brem (1992)). Controles Positivos Los factores de crecimiento, factor de crecimiento ácido de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento básico de 'frbrob'lastos——están:— entre los— -factores—, ..angiogénicos más. potentes conocidos. Más recientemente, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGA) ha sido identificado como un factor angiogénico importante, particularmente en la embriogénesis y tumores sólidos. Una lista de controles positivos potenciales se proporciona en la Tabla 1. Tabla 1. Estimuladores de Formación Natural de la Angiogenesis Proteínas • Factor de crecimiento ácido de los fibroblastos ( aFGF) • Angiogenina • Factor de crecimiento básico de los fibroblastos (bFGF) • Factor de crecimiento epidérmico • Factor estimulante de la colonia de granulocitos • Factor de crecimiento de hepatocitos • Interleucina 8 • Factor de crecimiento placentario • Factor de crecimiento endotelial rebatido por plaquetas • Factor de dispersión • Factor alfa de crecimiento transformante • Factor alfa de necrosis de tumores • factor de crecimiento endotelial vascular (VEGA) ~ ¦ — Moléculas-Pequeñas , ^ • Adenosina • 1-Butiril glicerol • Nicotinamida • Prostaglandinas El y E2 Se encontró que, en comparación con los anticuerpos de control, los anticuerpos neutralizantes policlonales contra bFGF y aFGF inhiben parcialmente la angiogénesis., el anticuerpo anti-bFGF es el más inhibidor de los dos. En contraste los anticuerpos neutralizantes contra VEGF no tienen efecto sobre la respuesta angiogenica. Estos datos revelan que bFGF y aFGF, pero no el VEGF, juegan un papel importante en el ensayo de angiogénesis in vitro descrito. Para cuantificar las respuestas positivas y/o máximas, los cultivos se hambrearon de suero para producir la angiogénesis espontánea. Este paso involucra mantener los cultivos en medio conteniendo 20% de suero humano por las primeras 24 horas y después cultivar las muestras en medio libre de suero por los siguientes 13-20 días con el medio siendo cambiado cada 3-4 días. Las alícuotas separadas se substancias sospechosas de poseer actividad de aumento de la angiogénesis se agregan a los pozos individuales como se describe arriba. Desarrollo de Datos de Respuesta a la Dosis para los ~ :—Factores—Pro-angiogénesis-Conocidos—_ . _ _ Diferentes concentraciones de los factores de crecimiento angiogenicos bFGF, aFGF y VEGF se evaluaron para determinar su habilidad para aumentar la angiogénesis en cultivos hambreados de suero. Se llevaron a cabo análisis de respuesta a la dosis estándares. Aunque el ensayo puede ser llevado a cabo usando condiciones de cultivo "hambreadas de suero", se uso suero conteniendo los constituyentes mínimos del suero para la sobrevivencia de las células endoteliales , cuando se probaron las substancias que aumentan la .angiogénesis . Controles Negativos Se hicieron análisis de respuesta a la dosis similares, con los factores conocidos por tener efectos anti-angiogenicos documentados . 6.2 Ejemplo 2: Efectos de la Talomida™, Actimida™ y Revimida™ sobre la Proliferación y Diferenciación de Células Madre Similares a las Embrionarias Derivadas de la Placenta Los siguientes experimentos evaluaron los efectos de la Talomida™, Actimida™ y Revimida™ sobre la diferenciación morfológica de las células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta. La diferenciación morfológica de células madre similares a las embrionarias cultivadas se evaluó después de catorce días de cultivo en presencia de ~5:—=medi-o—condicionado—pl-acentario—y —con -DMSO— .( control ).,.„..EGCF.,, Talomida™, Actimida™ o Revimida™. Las células se examinaron y se calificaron con respecto a la presencia de varios marcadores celulares, asi como con respecto a la apariencia morfológica tal como el área total ocupada en el plato de 10 cultivo y la cantidad de ramificaciones y/o bifurcaciones exhibidas . 6.2.1 Materiales y Métodos Las células madre similares a las embrionarias se aislaron de la placenta como se describe arriba en la Sección 15 5.4. Las células madre similares a las embrionarias se cultivaron usando las condiciones de cultivo descritas arriba. Las células se calificaron con por la expresión de CD34 (un marcador de las células progenitoras hematopoyéticas tempranas; también un marcador de las células endoteliales ) , 20 CD45 (un marcador de todas las células hematopoieticas excepto los eritrocitos) , CD105 (un marcador de las células endoteliales proliferativas ) , la cadena pesada de miosina especifica de las células musculares lisas (SMC) , nestina (un marcador de la angiogénesis ) , y la proteina ácida fibrilar del glial (GFAP) . Se determinaron también las relaciones de células CD34/TNC (Número Total de Células), células CD45/TNC y células CD105/TNC. Las células se calificaron también usando inspección por microscopía luminosa con respecto al área total -5r~^de"l"~T~reci i'enter-÷-o—e-1—--campo—ocupado,—y—con ~respecto_. a si. exhibían ramificaciones o bifurcaciones. 6.2.2 Resultados y Discusión Las tablas 2-4 de abajo, y las FIGS. 1A-1C resumen los resultados. En la Tabla 2, la calificación fue como sigue: 10 -: no teñidas; +/-: <20% teñidas; +:20-50 teñidas; ++ : 50-75% teñidas; +++: >75% teñidas. Los resultados en la Tabla 2 muestran que los números de células que expresan CD34, CD35 y la cadena pesada de miosina específica de las células musculares lisas (SMC) disminuyen 15 cuando se cultivan en presencia de, Talomida™, Actimida!M, o Revimida™ y los números de células que expresan la nestina y la proteína ácida fibrilar del glial (GFAP) se incrementan. 20 Tabla 2: Efecto de DMSO, Talomida , Actimida™ o Revimida™ sobre la Expresión de CD3 , CD45, Cadena Pesada de Miosina, Nestina o GFPA En otro experimento, los resultados de los cuales se resumen en la Tabla 3, células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta se cultivaron, usando las condiciones descritas en el ensayo de anillo del vaso umbilical descrito arriba, en presencia de medio condicionado de placenta con DMSO (control negativo) , Talomida™, Actimida™ o Revimida™. Después de 14 días en cultivo, las células se inmunotiñeron entonces por la expresión de CD34+, CD45+, y CD105+. Los resultados muestran que el cultivo en presencia de Talomida™, Actimida™ o Revimida™ produce una disminución en los números de células que expresan CD34, CD45 y CD105. Ver las-F-IGS. -2A-2C .; ^_ . . Tabla 3: Efecto del DMSO, Talomida™, Actimida™ o Revimida™ sobre la Expresión de CD3 , CD45, y CD105 en Células Madre Placentarias Cultivadas En otro experimento, los resultados del cual se resumen en la Tabla 4, células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta se cultivaron, usando las condiciones de cultivo descritas arriba, y en presencia de EGCF, DMSO, Talomida™, Actimida™, o Revimida™ Un significa que se observó una ramificación o bifurcación y un significa que no se observaron ramificaciones o bifurcaciones. Los resultados presentados en la Tabla 4 muestran que cultivar células madre similares a las embrionarias de la placenta en presencia de Talomida™, ActimidaT-~o_l¾evimida^~causa~-una -disminución—en.,~el—área~total del recipiente/campo cubierto por las células, y también disminuye las ramificaciones y/o bifurcaciones exhibidas por las células. Ver también FIGS. 3A, 3B.

Tabla 4: Efecto de ECGF , ECGF+DMSO, Talomida™, Actimida Revimida™ sobre la Angiogénesis 6. 3 Ejemplo 3 : Efectos de la Talomida en los Ensayos de Ang ogenesls In Vitro El siguiente ejemplo demuestra la efectividad de los ensayos in vitro de la invención para identificar los moduladores de la angiogénesis humana. Cuando se comparan con los ensayos in vitro de la técnica previa, por ejemplo, los ensayos de angiogénesis de ratas, los ensayos in vitro de la presente invención demuestran un mayor nivel de especificidad y sensibilidad permitiendo la detección de moduladores de la T~5~^angÍOgénesi'S--que—-no—serían-—detectados—po — los—ensayos—de—la, técnica previa. 6.3.1 Ensayo de Angiogénesis Aórtica de Rata: Doce placas grado cultivo de tejido de doce pozos se cubrieron con 250 µ? de Matrigel y se les permitió melificarse 10 por 30-45 min a 37°C, 5% C02. Las aortas toráxicas fueron escindidas de ratas de Sprague Dawley machos de diez semanas de edad y se removió el tejido fibroadiposo . Las aortas se seccionaron en secciones de 1. mm de largo, se enjuagaron ocho veces con EGM-2 /Clonetics Corp) , se colocaron sobre los pozos 15 revestidos con Matrigel, se cubrieron con 250 µ? adicionales de Matrigel, y se les permitió melificarse por 30-45 min a 37°C. Los anillos se cultivaron por 24 horas en 2 mi de EGM-2. Después de 24 horas, endostatina de murino recombinante se reconstituyó en EBM y se agregó como un tratamiento individual 20 en el día 1. Se agregó talidomida a diferentes concentraciones (1 µ?/???, 5 µ?/p??, 10 µ?/?a?, 50 y 100 yg/ml) en presencia o ausencia de microsomas de conejo como se señala en la Tabla 5. Los anillos aórticos se fotografiaron por día. Los resultados en la Tabla 5 indican que la talidomida requiere la adición de microsomas de conejo para mostrar inhibición eficiente de la formación de vasos. La Actimida™ sin embargo, no requiere . microsomas para la inhibición de la formación de vasos. Tabla -5 :-rEfecto-de-la—^talidomida-sobre-el-crecimiento^promedio de microvasos en el ensayo de angiogénesis aórtica de rata (expresado como & del control) 6.3.2 Angiogénesis Humana Cordones umbilicales humanos frescos se recolectaron por el personal medico entrenado bajo el consentimiento escrito de donadores de los hospitales locales. los cordones se transportaron y se trataron en un plazo de tres horas. Los cordones umbilicales y las aberturas de los vasos se enjuagaron con medio nutriente basal congelado. Las arteria se removió de los cordones usando medios mecánicos. Fórceps y tijeras quirúrgicas pequeñas en un campo aséptico. Los vasos se limpiaron del tejido conectivo y los anillos de los vasos se cortaron de manera transversal en una longitud de 1 mm.

Los anillos se colocaron en medio EGM-2 (Clonetics Corp.) en un tubo de fondo cónico de 50 mi y se almacenaron a 4°C. Placas de cultivo de tejidos de seis pozos se cubrieron con 250 mi de atrigel y se les permitió melificarse por 30-45 min —a—-37-°-G>—baj o—5%--de-C02:,—Los—anillos--de._los-.-vasos_se„enj uaga on en medio EGM-2 y se colocaron sobre los pozos revestidos con Matrigel, se cubrieron con 250 µ? adicionales de Matrigel, y se les permitió gelificarse por 30-45 min a 37°C (Ver la FIGURA 6) . Los vasos se cultivaron por 24 horas en 4 mi de EGM-2 para permitirle al tejido adaptarse a su nuevo ambiente. Después de 24 horas de incubación, los anillos se trataron ya sea con DMSO al 1% como control, o diferentes concentraciones de los compuestos (Talidomida o' CÉLULAS DE CONTROL- 0 7 ) . El medio de cultivo se cambió dos veces por semana durante un total de tres semanas. Los efectos de los compuestos sobre los anillos de vasos cultivados se compararon con el efecto del DMSP sobre los anillos de vasos. Los resultados se analizaron usando el programa Image-Pro® Plus (MediaCybernetics , IN. Carlsbad, California) . Como se muestra en la Tabla 6, y las Figuras 4 y 5, Tanto la talidomida y la Actimida™ inhibieron la formación de excrecencias de microvasos en una manera dependiente de la dosis cuando se comparan con las muestras tratadas con DMSO.

Estos experimentos se hicieron en duplicados y los resultados son el promedio de dos anillos en un mismo experimento. Una concentración diferente de Fumagilina se usa como el control positivo en este experimento.

Tabla 6 : Efecto de la Talidomida y la Actimida Sobre el Crecimiento de Microvasos en el Ensayo de Angiogénesis Humana Es importante señalar que en este ensayo no hay necesidad de microsomas ya sea de humano o de conejo para que funcione la talidomida (comparando los resultados de anillos humanos con anillos de rata) . 6.4 Ejemplo 4: Ensayo por moduladores de la Angiogénesis Usando Anillos de Vasos y Células Madre Anillos de vasos, al menos diez, se cultivaron individualmente, se co-cultivaron con células madre para recrear efectivamente el ambiente natural de los vasos. Se obtienen secciones de vasos y se colocan sobre placas como se demuestra en el Ejemplo 1, de arriba. Las células madre similares a las embrionarias obtenidas de la placenta se colocan en placas con as secciones de vasos, y tanto a las secciones de vasos y a las células madres se les permite adherirse. Después de 12 horas del cultivo, las células madre no adherentes se remueven suavemente mediante lavado. Los cultivos se dividen en al menos dos grupos. Un grupo de "coculti os~se_trata—entonces-eon-~DMSO—como—control ._El-.seg.undo grupo de cocultivos se trata con un compuesto de prueba. Otros cocultivos pueden ser tratados como controles positivos, u otros controles. Los cocultivos de células madre y secciones de vasos se cultivan por 21 días adicionales. Al final de los 21 días, los cocultivos de control y de prueba se examinan y se determina la extensión de la angiogénesis mediante exploración de imágenes. Los cultivos de prueba demuestran que el compuesto de prueba es angiogenico cuando el área promedio de la excrecencia de miero asos es mayor que el área promedio de la excrecencia de vasos para los cocultivos de control, y anti-angiogenico si el área es menor que la del control. 6.5 Ejemplo 5: Ensayo por Moduladores de Angiogénesis Usando Anillos de Vasos y Células de Tumores Anillos de vasos, al menos diez, se cultivan individualmente, se co-cultivan con células de tumores para recrear efectivamente el ambiente natural de los vasos dentro o cerca de un tumor. Las secciones de vasos se obtienen y se colocan sobre placas como se demuestra en el Ejemplo 1, de arriba. Las células se Tumor se obtienen ya sea de una muestra de tumor, o de una línea celular de tumor. Las células de tumor se colocan sobre placas con las secciones de vasos para formar cocultivos, y tanto a las secciones de vasos y a las células madre se les permite adherirse. Los cocultivos se ~5: disiden en al menos-dos—grupos —-Un--grupo- de—cocultivos se. trata con DMSO como control. El segundo grupo de cocultivos se trata con un compuesto de prueba. Otros cocultivos pueden ser tratados como controles positivos, u otros controles. Los cocultivos de células madre y secciones de vasos se cultivan 10 por 21 días adicionales. Al final de los 21 días, los cocultivos de control y de prueba se examinan y se determina la extensión de la angiogénesis mediante exploración de imágenes. Los cultivos de prueba demuestran que el compuesto de prueba es angiogenico cuando el área promedio de la 15 excrecencia de microvasos es mayor que el área promedio de la excrecencia de vasos para los cocultivos de control, y anti- angiogenico si el área es menor que la del control. La presente invención no deberá ser limitada en su ámbito por las modalidades específicas descritas aquí. Ciertamente, 20 varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas aquí se volverán aparentes para aquellas personas experimentadas en la técnica a partir de la anterior descripción. Tales modificaciones se destinan para caer dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.

. Referencias Todas las referencias citadas aquí se incorporan aquí como referencia en su totalidad y para todos los propósitos en la misma extensión como si cada publicación individual, - "5 patente" ~ O' sorri'citud—=de—patente—f-ue.ra—específicamente. „e. individualmente indicada para ser incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos. La cita de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debería ser considerada 10 como una admisión de que la presente invención no esta facultada para preceder a tal publicación en virtud de la invención previa. 1. Folkman, J. and Brem, H. (1992) Angiogenesis and inflammation . In: " Inflammation, Basic Principies and Clinical 15 Correlates". Eds Gallin, J.I., Goldstein, I.M. y Snyderman, R.S., Raven Press, New York. 2. Folkman, J. (1985) Tumour angiogenesis. Adv. Cáncer Res. 43, 175. 3. Folkman, J. y Klagsbrun, M. (1987). Angiogenic 20 factors. Science 235, 442. 4. Folkman, J. (1985). Towards an understanding of angiogenesis: Search and discovery. Perspect . Biol. Med. 29, 10. 5. Langer, R. y Folkman, J. (1976). Polymers for the sustained reléase of proteins and other macromolecules. Nature 263. 797. 6. Montesano, R . , Orci, L. y Vassalli, P. (1983) . In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-IT e ñe'twdrks~i"s~promoted~by~coliagen-matr-ices J..—Cell. Biol... 97, 1648. 7. Madri, J.A. y Williams, S.K. (1983) . Capillary endothelial cell cultures: phenotypic modulation by matrix components. J. Cell Biol. 97, 153. 8. Kubota, Y., Kleinnmann, H.K., Martin, G.R. y Lawley, T. (1988) . Role of laminin and basement membrane in t.he morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589. 9. Leibovish, S.J., Polverini, S.J., Shepard, R.M., Wiseman, D . M . , . Shively, V. y Nuseir, N. (1987) . Macrophage-induced angiogenesis is mediated by tumor necrosis factor-alpha. Science 329, 640. 10. Montesano, R. , Vassalli, J.D., Baird, A., Guillemin, R. y Orci, L. (1986) . Basic fibroblast growth factor induces angiogenesis in vitro. Frac. Nati. Acad. Sci. 83, 7297. 11. Montesano, R . , Pepper, M.S., Vassalli, J.D., y Orci, L. (1987) . Phorbol ester induces cultured endothelial cells to invade a fibrin matrix in presence of fibrinolytic inhibitors. J. Cell. Physiol. 132,509.. 12. Nicosia, R.F. and Ottinetti, A. (1990) . Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63, 115. ????7-?-·-/- Crooks-S- Scaife:.—M.C.-^y—Patel, £.._..(.": 98.7.)....

Role of plasminogen, plasmin and plasminogen activators in the migration of fibroblasts into plasma clots. J. Cell Physiol. 132, 501. 14. LaRocca, R.V., Stein, C.A., Danesi, R., Jamis-Dow, C.A., Weiss, G.H. y Myer, CE. (1990) . Suramin in adrenal cáncer: modulation of steroid hormone production, cytotoxicity in vitro. and clinical antitumour effect. J. Clin. Endocrinol. Metab. 71, 497.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un modulador de la angiogénesis , que comprende: (a) cultivar una pluralidad de células madre en presencia Bé~T-ün~"~compuesto~ "de—prueba—-durante—un—tiempo- -.-y- -baj o las.._ condiciones adecuadas para el crecimiento de células endoteliales ; y (b) comparar la cantidad de excrecencia de microvasos desde dichas células madre en presencia de dicho compuesto de prueba cuando se compara con una cantidad de control de excrescencia de microvasos, caracterizado porque, si dicha excrescencia de microvasos es mayor o menor que dicho nivel de control de excrescencia de microvasos, el compuesto de prueba se identifica como un modulador de la angiogénesis. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células madre se cultivan con una sección de vaso. 3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células madre se cultivan con una pluralidad de células de tumor. 4. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque dichas células de tumor son células de una linea celular de tumo . 5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células madre se cultivan adicionalmente en presencia de hidrocort i sona , factor de crecimiento epidérmico, o extracto de cerebro de bovino. 6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque ~5~^i¾h'o'~ modulador :de- -?-a·—angiogénes-i-s—-se—identifica- -como. _un_ agente anti-angiogenico . 7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho modulador de la angiogénesis se identifica como un agente angiogenico. 10 8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho cultivo de una pluralidad de células madre en presencia de un compuesto de prueba es durante al menos siete días. 9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho cultivo de una pluralidad de células madre en presencia 15 de un compuesto de prueba es durante al menos catorce días. 10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células madre se cultivan sobre una matriz que comprende fibrina. 11. El método de la reivindicación 1, caracterizado 20 porque dichas células madre se cultivan en un gel fisiológico que comprende fibrina. 12. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células madre se cultivan en un gel fisiológico que comprende colágeno no desnaturalizado. 13. Un método para identificar un modulador de la angiogénesis que comprende: (a) cultivar una sección de vaso en presencia de una pluralidad de células de tumor y un compuesto de prueba, ~5 durante un~"tiempo"~y"~baj o las—condiciones^-adecuadas—para—el- crecimiento de células endoteliales y dichas células de tumor; y (b) comparar la cantidad de excrescencia de microvasos desde dicha sección de vaso en presencia de dicho compuesto de 10 prueba cuando se compara con la cantidad de control de excrescencia de microvasos, caracterizado porque, si dicha excrescencia de microvasos es mayor o menor que dicho novel de control de excrescencia de microvasos, el compuesto de. prueba se identifica como un 15 modulador de la angiogénesis. 14. Un método para tratar a un individuo, dicho individuo que tiene una enfermedad o condición que se asocia con el crecimiento anormal de vasos, caracterizado porque, comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente 20 efectiva de un inhibidor de TNF-a. 15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque dicho inhibidor de TNF-a es un ImiD™. 16. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque ImiD™ es Actimid™ o Revimid™. 17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque dicha enfermedad o condición es cáncer. 18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque, dicho cáncer es un cáncer metastático. —— i"9".'~'El~método—¡de —l-a— re-i-vi-nd-icación—1-7-,—caracterizado— porque dicho cáncer es cáncer de pecho. 20. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque dicha enfermedad o condición se selecciona a partir del grupo que consiste de inflamación, endometriosis , artritis, placas ateroscleroticas, retinopatia diabética, glaucoma neovascular, tracoma, .neovascularización de injerto corneal, psoriasis, esclerodermia , hemangioma y cicatrización hipertrófica, adhesiones vasculares y angiofibroma . 21. Un método para inhibir la angiogénesis , caracterizado porque comprende poner en contacto una pluralidad de células, dicha pluralidad de células que es capaz de formar un vaso, con un inhibidor de TNF- . 22. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicho inhibidor de TNF-a es Actimida™ o Revimida™. 23. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicha pluralidad de células es una pluralidad de células dentro de un individuo. 24. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicha pluralidad de células es una pluralidad de células en un cultivo celular.