MXPA02009224A

MXPA02009224A - Moleculas similares a receptor de factor de crecimiento de fibroblastos y usos de las mismas.

Info

Publication number: MXPA02009224A
Application number: MXPA02009224A
Authority: MX
Inventors: Thomas Charles Boone
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2001-03-22
Publication date: 2003-03-12
Also published as: EP1268793A2; JP2003527858A; AU2001252940A1; US7348162B2; US20030087384A1; JP2009278975A; WO2001070977A2; CA2403572A1; WO2001070977A3; JP2006340720A; US20020009776A1; US20080044859A1

Abstract

La presente invencion proporciona polipeptidos similares a receptor de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-L) y moleculas de acido nucleico que codifican para los mismos. La invencion tambien proporciona agentes de union selectivos, vectores, celulas huespedes y metodos para producir polipeptidos FGFR-L. Ademas, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas y metodos para el diagnostico, tratamiento, disminucion o para evitar enfermedades, desordenes y condiciones relacionados con polipeptidos FGFR-L.

Description

MOLÉCULAS SIMILARES A RECEPTOR DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos similares al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-L, por sus siglas en inglés) y moléculas de ácido nucleico que codifican para los mismos. La invención se relaciona también con agentes de unión selectivos, vectores, células huéspedes y métodos para producir polipéptidos FGFR-L. La invención se relaciona además con composiciones farmacéuticas y métodos para el diagnóstico, tratamiento, disminución o para evitar enfermedades, desórdenes y condiciones relacionados con polipéptidos FGFR-L.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances técnicos en la identificación, clonación, expresión y manipulación de moléculas de ácido nucleico así como el descifrado del genoma humano han acelerado en gran medida el descubrimiento de sustancias terapéuticas novedosas. Las técnicas rápidas de secuenciado de ácido nucleico ahora pueden generar información de Ref: 142250 secuencia a velocidades sin precedentes y, junto con e análisis computacional, también permiten ensambla secuencias superpuestas en genomas parciales y completos as como la identificación de regiones que codifican par polipéptídos . Una comparación de una secuencia predicha d aminoácidos contra una compilación de base de datos d secuencias conocidas de aminoácidos nos permite determina el grado de homología con secuencias identificada previamente o con marcas. La clonación y expresión de un región que codifica para un polipéptids de una molécula d ácido nucleico proporciona un producto polipeptídico par análisis estructural y funcional. La manipulación de la moléculas de ácido nucleico y polipéptidos codificado pueden conferir propiedades ventajosas en un producto par uso como una sustancia terapéutica. Pese a los avances técnicos importantes en l investigación del genoma durante los últimos diez años, aú está por realizarse un avance potencial en el desarrollo d sustancias terapéuticas novedosas en base en el genom humano. Muchos genes que codifican para sustancia terapéuticas polipeptídicas potencialmente benéficas aquéllas que codifican para polipéptidos, las cuales puede actuar como "objetivos" para moléculas terapéuticas, aún n se han identificado. En consecuencia, un objetivo de l invención es identificar polipéptidos novedosos y molécula de ácido nucleico que codifican para los mismos, los cuales tienen beneficio diagnóstico o terapéutico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con moléculas novedosas de ácido nucleico para FGFR-L y polipéptidos codificados . La invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4; (b) la secuencia nucleotídica del inserto de ADN en ATCC, Depósito No. ; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; (d) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada con el complemento de las secuencias de cualquiera de los incisos (a)-(c) ; y (e) una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de cualquiera de los incisos (a) - (c) .

La invención también proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucloeotídica que codifica para un polipéptido el cual es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntico al polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 ; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia nucleotídica, como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, la secuencia nucleotídica del inserto de ADN en ATCC, Depósito No. o (a) ; (c) una región de la secuencia nucleotídica de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, el inserto de ADN en ATCC, depósito No. (a) o (b) codificar un fragmento polipeptídico de por lo menos 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento polipeptídico tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, o que sea antigénico; (d) una región de la secuencia nucleotídica de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, el inserto de ADN en ATCC Depósito No. _, o cualquiera de los incisos (a) - (c) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; (e) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada con el complemento de cualquiera de los incisos (a) - (d) ; y (f) una secuencia nucleotídica complementaria con las secuencias de cualquiera de los incisos (a) - (d) . La invención proporciona además una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una sustitución conservadora de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 ; fb) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; fe) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una supresión de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; (d) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, el cual tiene una parte truncada C o N terminal, o ambas, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido como se establece ya sea en las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; fe) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos, cortes en la parte C y N terminal, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad de polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; ff) una secuencia nucleotídica de cualquiera de los incisos (a) - fe) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; fg) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada con el complemento de cualquiera de las secuencias de los incisos (a) - (f) ; y (h) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de las secuencias de los incisos (a) - (e) . La presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; y (b) la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADN en ATCC, Depósito No. . La invención también propociona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, que opcionalmente comprende además una metionina amino terminal; fb) una secuencia de aminoácidos para un ortólogo de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; (c) una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; (d) un fragmento de la secuencia de aminoácidos cómo se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 que comprende por lo menos 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, o es antigénico; y fe) una secuencia de aminoácidos para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADN en ATCC, Depósito No. , 9 cualquiera de las secuencias de los incisos (a) - (c) . La invención proporciona además un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una sustitución conservadora de aminoácidos, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; (b) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad de polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; (c) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, con por lo menos una supresión de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; (d) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, la cual tiene una parte cortada C o N terminal, o ambas, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece en ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; y fe) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones, y supresiones de aminoácidos, cortes en la parte C y N terminal, en donde el polipéptido tiene una actividad del polípéptido que se establece en ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. También se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden secuencias de aminoácidos de FGFR-L. La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende las moléculas aisladas de ácido nucleico como se establecen en la presente, células huéspedes recombinantes que comprenden las moléculas recombinantes de ácido nucleico como se establecen en la presente, y un método para producir un polipéptido FGFR-L que comprende cultivar las células huéspedes y opcionalmente aislar el polipéptido producido de esta manera.

También se abarca por la invención un animal no humano transgénico, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido FGFR-L. Las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L se introducen en el animal de una manera que se permite la expresión y niveles aumentados de un polipéptido FGFR-L, el cual puede incluir niveles circulantes aumentados. De manera alternativa, se introducen moléculas de ácido nucleico para FGFR-L dentro del animal de una manera que evita la expresión del polipéptido FGFR-L endógeno (es decir, se genera un animal transgénico que presenta la carencia del gen para el polipéptido FGFR-L) . El animal no humano transgénico preferiblemente es un mamífero, y de manera más preferible un roedor, tal como una rata o un ratón. También se proporcionan derivados de los polipéptidos FGFR-L de la presente invención. Se proporcionan adicionalmente agentes de unión selectivos tales como anticuerpos y péptidos capaces de unir específicamente los polipéptidos de FGFR-L de la invención. Tales anticuerpos y péptidos pueden ser agonistas o antagonistas . También se abarcan por la invención composiciones farmacéuticas que comprenden los nucleótidos, polipéptidos o agentes de unión selectivos de la invención y uno o más agentes de formulación farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas se utilizan para proporcionar cantidades terapéuticamente eficaces de los nucleótidos o polipéptidos de la presente invención. La invención también se relaciona con métodos para utilizar los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico y agentes de unión selectivos. Los polipéptidos FGFR-L y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para tratar, evitar, disminuir o detectar enfermedades y desórdenes que incluyen a los mencionados aquí. La presente invención también proporciona un método para realizar ensayos de moléculas de prueba para identificar una molécula de prueba que se una a un polipéptido FGFR-L. El método comprende poner en contacto un polipéptido FGFR-L con una molécula de prueba para determinar el grado de unión de la molécula de prueba al polipéptido. El método comprende además determinar si tales moléculas de _ prueba son agonistas o antagonistas de un polipéptido FGFR-L. La presente invención proporciona además un método para probar el impacto de moléculas en la expresión de polipéptido FGFR-L o en la actividad del polipéptido FGFR-L. También se abarcan por la invención métodos para regular la expresión y modular (es decir, aumentar o disminuir) los niveles de un polipéptido FGFR-L. Un método comprende administrar a un animal una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido FGFR-L. En otro método, se puede administrar una molécula de ácido nucleico que comprende elementos que regulan o modulan la expresión de un polipéptido FGFR-L. Los ejemplos de estos métodos incluyen terapia de genes, terapia celular y terapia antisentido, como se describe adicionalmente en la presente. El polipéptido FGFR-L se puede utilizar para identificar ligandos del mismo. Se han utilizado diversas formas de "clonación de expresión" para clonar ligandos para receptores fpor ejemplo Davis et al . , 1996 , Cell , 87:1161-69) . Este y otros experimentos de clonación del ligando para el polipéptido FGFR-L se describen con mayor detalle en la presente. El aislamiento de un ligando de polipéptido FGFR-L permite la identificación o desarrollo de agonistas o antagonistas novedosos de la vía de señalización del polipéptido FGFR-L. Tales agonistas y antagonistas incluyen a los ligandos del polipéptido FGFR-L, anticuerpos del ligando del polipéptido contra FGFR-L y derivados del mismo, moléculas pequeñas u oligonucleótidos antisentido, cualquiera de los cuales se puede utilizar para tratar potencialmente una o más enfermedades o desórdenes incluyendo los que se mencionan en la presente.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura ÍA a 1C ilustran la secuencia nucleotídica del gen para FGFR-L murino (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1) y la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido FGFR-L murino (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2) . Se indican el péptido señal predicho (subrayado) y el dominio transmembranal (doble subrayado) ; * las figuras 2A a 2C ilustran la alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR-L murino (Smaf2-00017-f4; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2) y de gallipato (Pleurodeles waltlii) Receptor-4 de factor de crecimiento de fibroblastos (PIR:B49151; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7); las figuras 3A y 3B ilµstran la secuencia nucleotídica de un clon de ADNc que codifica para la porción N terminal del gen para FGFR-L humano (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4) "y la secuencia deducida de aminoácidos de la porción N terminal del polipéptido FGFR-L humano (SECUENCIA DE IDEN IFICACIÓN NO: 5) . Se indican el péptido señal predicho (subrayado) y el dominio transmembranal (doble subrayado) ; la figura 4 ilustra la alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR-L murino (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2) y la secuencia del polipéptido FGFR-L humano virtual (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8) construida de los residuos 1-472 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 y los residuos 473-504 de GenBank, Acceso No. AJ277437. Se indican el péptido señal predicho (subrayado) y el dominio transmembranal (doble subrayado) y los sitios de glucosilación unidos a N (negrillas) ; la figura 5 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L, detectado por análisis de transferencia Northern en los embriones de ratón de 7, 11, 15 y 17 días; la figura 6 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L detectada por análisis de transferencia Northern en corazón, cerebro, bazo, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñon y testículos murinos; la figura 7 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L detectado por análisis de transferencia Northern en células NIH 3T3 y líneas de células de estroma derivada de médula ósea de ratón FIO, F4 y D3 ; la figura 8 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L como se detecta por análisis de transferencia Northern en cerebro, corazón, músculo esquelético, colon, timo, bazo, riñon, hígado, intestino delgado, placenta, pulmón y leucocitos de sangre periférica, humanos; la figura 9 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L como se detecta por análisis de transferencia Northern en células HL-60 de leucemia promiolecítica, células HeLa S3 , células L-562 de leucemia mielógena crónica, células MOLT-4 de leucemia linfoblástica, células Raji de linfoma de Burkitt, células SW480 de adenocarcinoma colorrectal, células A549 de carcinoma de pulmón y células G361 de melanoma; la figura 10 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L, detectado por análisis de transferencia Northern, corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñon y páncreas, humanos; la figura 11 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L, detectado por análisis de transferencia Northern en células 266-6, células AR42J, células CaPan I, células HIG-82, células OHS4, células SW1353,_ células SW 872, células K5642 (pasaje viejo, es decir, posterior), K562 (pasaje nuevo, es decir, anterior), células Jurkat y células F4; las figuras 12A a 12B ilustran la expresión de ARNm para FGFR-L, detectado por análisis de transferencia Northern en tejido adiposo humano (utilizando una sonda derivada de FGFR-L humano) y tejido adiposo murino (utilizando una sonda derivada de FGFR-L murino) ; la figura 13 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L en diversos tejidos murinos como se detecta en un ensayo de protección de ribonucleasa. La ausencia de la banda de ciclofilina en la muestra de ARN de páncreas sugiere que esta muestra fue degradada; la figura 14 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L detectada por hibridación in si tu en tejido adiposo perirrenal, blanco y café de un ratón, adulto normal (H&E = tinción contrastante de Jhematoxilina y eosina; ISH = hibridación ín si tu) ; la figura 15 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L detectada por hibridación in si tu en el duodeno, íleon, colon y páncreas de ratones adultos normales (H&E = tinción contrastante de hematoxilina y eosina; ISH hibridación in si tu) ; la figura 16 ilustra la expresión de ARNm para FGFR-L detectada por hibridación in si tu en la tráquea, cartílago articular de la articulación de la rodilla, bazo y útero de un ratón adulto normal (H&E = tinción contrastante de hematoxilína y eosina; ISH = hibridación in situ) ; la figura 17 ilustra la inducción de ARNm para FGFR-L en células ST2 osteoblásticas bajo condiciones de osteoclastogénesis (es decir, exposición durante 5 días a vitamina D3 y dexametasona) ; la figura 18 ilustra el resultado del análisis de transferencia Western de proteínas derivadas de E. coli Des7-FGFR-L/ECD y derivadas de CHO FGFR-L/ECD-Fc utilizando el antisuero del polipéptido FGFR-L; la figura 19 ilustra el resultado del análisis de transferencia Western de ojo murino (carril 1) y de tejido adiposo (carril 2) utilizando el antisuero del polipéptido FGFR-L; las figuras 20A a 20B ilustran los resultados del análisis FACS en células de estroma de médula ósea F4 y D3 utilizando antisuero de polipéptído FGFR-L; las figuras 21A a 21D ilustran los resultados de ensayos de proliferación utilizando células estromales de médula ósea D3 (ya sea sin transducir o transducidas con un plásmido recombinante que codifica para el polipéptido FGFR-L) después de 72 horas de exposición a rhuPDGF (panel A) , rhuFGF-2 (panel B) , rhuFGF-4 (panel C) o rhuFGF-6 (panel D) ; la figura 22 ilustra los resultados de ensayos de proliferació utilizando células estromales de médula ósea A5-F después de exposición a proteína derivada de E. coli Des7-FGFR-L/ECD y suero, PDGF, FGF-2, FGF-4, o FGF-6; la figura 23 ilustra los resultados de los ensayos de proliferación utilizando células estromales de médula ósea A5-F después de exposición a proteína FGFR-L/ECD-Fc derivada de CHO y suero, PDGF, FGF-4, o FGF-6; la figura 24 ilustra la expresión del gen de resistencia a neomicina, detectado por análisis de transferencia Northern de ARN de células mononucleares de sangre periférica (PBMN, por sus siglas en inglés) a partir de dos ratones sometidos a transducción con FGFR-L/neo (carriles 1 y 2) y dos ratones control sin transducción (carriles 3 y 4) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los encabezados de sección se utilizan en la presente con propósitos de organización únicamente y no se deben considerar como limitantes de la materia objeto que se describe. Todas las referencias que se mencionan en esta solicitud se incorporan de manera expresa como referencia en la presente.

Definiciones Los términos "gen para FGFR-L" o molécula de ácido nucleico para FGFR-L" o "polinucleótido para FGFR-L" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste de una secuencia nucleotídica como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, una secuencia nucleotídica del inserto de ADN en ATCC Depósito No. , y moléculas de ácido nucleico^ como se definen en la presente. El término "variante alélica del polipéptido FGFR-L", se refiere a µna o varias posibles formas alternativas que se presenten de manera natural de un gen que ocupa" "un locus dado en un cromosoma de un organismo o una población de organismos. El término "variante de empalme del polipéptido FGFR-L" se refiere a una molécula de ácido nucleico, habitualmente ARN, el cual se genera por procesamiento alternativo de secuencia de intrón de un transcrito de ARN de la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR-L, como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. El término "molécula aislada de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la invención que: (1) se ha separado de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de las proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales se encuentra naturalmente cuando se aisla el ácido nucleico total de las células fuente, (2) no está unido a la totalidad o a una porción del polinucleótido al cual la "molécula aislada de ácido nucleico" está unida en la naturaleza, (3) está unido operablemente a un polinucleótido con el cual no está unido en la naturaleza, o (4) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia polinucleotídica más grande. Preferiblemente, la molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención está sustancialmente libre de cualquier otra molécula contaminante de ácido nucleico u otros contaminantes que se encuentren en su ambiente natural y que pueden interferir con su uso en la producción de polípéptidos o su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación. El término "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ADN o ARN. El .término abarca moléculas que se forman de cualquiera de los análogos de base conocidos de AD? y AR? tales como, pero sin limitarse a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-?6-metiladenosina, aziridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracílo, 5- •fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2 -tiouracilo, 5 -carboxi -metilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, ?6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2- etilguanina, 3 -metilcitosina, 5-metilcitosina, ?6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxícarbonil -metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-?6- isopenteniladenina, metiléster del ácido uracil-5- oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, ácido 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, ^ 4-tiouracilo, 5-metíluracilo, éster metílico del ácido ?-utacil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2 , 6-diaminopurina . El término "vector" se utiliza para referirse a cualquier molécula (por ejemplo ácido nucleico, plásmido o virus) utilizado para transferir información codificante a una célula huésped. El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para transformación de una célula huésped y que contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen o controlan la expresión de secuencias heterólogas insertadas de ácido nucleico. La expresión incluye, pero no se limita a procesos tales como transcripción, traducción y maduración (corte y empalme) de ARN, están presentes intrones . El término "unido operablemente" se utiliza en la presente para referirse a una distribución de secuencias flanqueantes en donde las secuencias flanqueantes descritas de esta manera se configuran o ensamblan de manera que realizan su función habitual. Por lo tanto, una secuencia flanqueante unida operablemente a una secuencia codificante puede ser capaz de llevar a cabo la replicación, transcripción o traducción de la secuencia codificante. Por ejemplo, una secuencia codificante se une operablemente a un promotor cuando el promotor es capaz de detectar la transcripción de esa secuencia codificante. Una secuencia flanqueante no necesita estar contigua a la secuencia codificante, en la medida en que funcione correctamente. Así, por ejemplo, las secuencias interpuestas no traducidas aunque transcritas pueden estar presentes entre una secuencia promotora y una secuencia codificante y la secuencia promotora aún se puede considerar como "unida operablemente" a la secuencia codificante. El término "célula huésped" se utiliza para referirse a una célula la cual se ha transformado, o es capaz de ser transformada con una secuencia de ácido nucleico y después expresar un gen de interés seleccionado. El término incluye la progenie de la célula original, ya sea que la progenie sea o no idéntica en morfología o en la constitución genética con respecto a el padre original en la medida en que se presente el gen seleccionado. El término "polipéptido FGFR-L" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 y polipéptidos relacionados. Los polipéptidos relacionados incluyen fragmentos de polipéptido FGFR-L, ortólogos del polipéptido FGFR-L, variantes del polipéptido FGFR-L y derivados del polipéptido FGFR-L, los cuales poseen por lo menos una actividad del polipéptido, como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Los polipéptidos FGFR-L pueden ser polipéptidos maduros, como se definen en la presente y pueden o no tener un residuo metíonina amino terminal, en base en el método en el cual se prepararon. El término "fragmento de polipéptido FGFR-L" se refiere a un polipéptido que comprende un corte en la parte amino terminal (con o sin una secuencia líder) o un corte en la parte carboxilo terminal del polipéptido, como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. El término "fragmento de polipéptido FGFR-L" también se refiere a cortes en la parte amino terminal o carboxilo terminal de los ortólogos del polipéptido FGFR-L, derivados del polipéptido FGFR-L o variantes del polipéptido FGFR-L, o con cortes en la parte amino terminal o carboxilo terminal de los polipéptidos codificados por las variantes alélicas del polipéptido FGFR-L o las variantes de maduración del polipéptido FGFR-L. Los fragmentos del polipéptido FGFR-L pueden resultar de maduración de ARN alternativa o de actividad de proteasa in vivo . Las formas unidas a membrana de un polipéptido FGFR-L también están contempladas por la presente invención. En las modalidades preferidas, los cortes o supresiones comprenden aproximadamente 10 aminoácidos o aproximadamente 20 aminoácidos, o aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 75 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos o más de aproximadamente 100 aminoácidos.

Los fragmentos polipeptídicos producidos de esta manera comprenderán aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, o aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 75 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 150 aminoácidos, o aproximadamente 200 aminoácidos, o más de aproximadamente 200 aminoácidos. Tales fragmentos del polipéptido FGFR-L opcionalmente pueden comprender un residuo metionina amino terminal . Se apreciará que tales fragmentos se pueden utilizar, por ejemplo, para generar anticuerpos para los polipéptidos FGFR-L. El término "ortólogo del polipéptido FGFR-L" se refiere a un polipéptido que corresponde a la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR-L como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Por ejemplo, los polipéptidos FGFR-L de ratón y de humano se consideran ortólogos entre sí. El término "variantes de polipéptido FGFR-L" se refiere a polipéptidos FGFR-L comprende secuencias de aminoácidos que tienen una o más sustituciones, supresiones (tales como supresiones internas o fragmentos de polipéptido FGFR-L) o adiciones (tales como adiciones internas o polipéptidos de fusión de FGFR-L) en la secuencia de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR-L que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 (con o sin una secuencia líder) . Las variantes pueden ser las que se presentan de manera natural (por ejemplo, variantes alélicas del polipéptido FGFR-L, ortólogos del polipéptido FGFR-L y variantes de maduración del polipéptido FGFR-L) o bien se pueden construir artificialmente. Tales variantes del polipéptido FGFR-L se pueden preparar a partir de las moléculas correspondientes de ácido nucleico que tengan una secuencia de ADN que varíe en consecµencia, a partir de la secuencia de ADN como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: l o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4. En modalidades preferidas, las variantes tienen de 1 a 3 , o de 1 a 5, o de 1 a 10, o de l a 15, o de l a 20, o de l a 25, o de l a 50, o de 1 a 75, o de 1 a 100, o más de 100 sustituciones, inserciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, en donde las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras, o cualquier combinación de las mismas. El término "derivados del polipéptido FGFR-L" se refiere a un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, fragmentos de polipéptido FGFR-L, ortólogos del polipéptido FGFR-L o variantes del polipéptido FGFR-L, como se definen en la presente, que se han modificado químicamente. El término "derivados del polipéptido FGFR-L" también se refiere a los polipéptidos codificados por las variantes alélicas del polipéptido FGFR-L o las variantes de maduración del polipéptido FGFR-L, como se define en la presente, que se han modificado químicamente . El término "polipéptido FGFR-L maduro" se refiere a un pólipéptido FGFR-L que carece de una secuencia líder. Un polipéptido FGFR-L maduro también puede incluir otras modificaciones tales como procesamiento proteolítico de la parte amino terminal fcon o sin una secuencia líder) o de la parte carboxi terminal, separación de un polipéptido más pequeño a partir de un precursor más grande, glucosilación unida a N o unida a 0, y similares. Un polipéptido FGFR-L maduro ejemplar se muestra por la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6. El término "polipéptido de fusión de FGFR-L" se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos (tales como una proteína o polipéptido heterólogo) en la parte amino o carboxilo terminal del polipéptido, como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, fragmentos de polipéptido FGFR-L, ortólogos de polipéptido FGFR-L, variantes de polipéptido de FGFR-L, o derivados de FGFR-L, como se definen en la presente. El término "polipéptido de fusión de FGFR-L" también se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos en la parte amino o carboxilo terminal del polipéptido codificado por las variantes alélicas del polipéptido FGFR-L o las variantes de maduración del polipéptido FGFR-L, como se definen en la presente. El término "polipéptidos FGFR-L biológicamente activos" se refiere a polipéptidos FGFR-L que tienen por lo menos una actividad característica del polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Además, un polipéptido FGFR-L puede ser activo como un inmunógeno; esto es, el polipéptido FGFR-L contiene por lo menos un epítopo para el cual se pueden generar anticuerpos. El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido de la presente invención que: (1) se ha separado de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales se encuentra de manera natural cuando se aisla de la célula fuente, (2) no está unido (por interacción covalente o no covalente) a la totalidad o una porción de un polipéptido al cual se enlaza en la naturaleza el "polipéptido aislado", (3) está unido de manera operable (por interacción covalente o no covalente) a un polipéptido con el cual no está unido en la naturaleza, o (4) no se presenta en la naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquier otro polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentren en su ambiente natural y que puedan interferir con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación . El término "identidad", como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, determinado al comparar las secuencias. En la técnica "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, según sea el caso, determinado por la coincidencia entre cadenas de dos o más secuencias nucleotídicas o dos o más secuencias de aminoácidos. La "identidad" mide el por ciento de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de separación (si las hay) resueltas por un modelo matemático particular o un programa de computadora fes decir, "algoritmos") . El término "similitud" es un concepto relacionado, pero a diferencia de "identidad", "similitud" se refiere a una medición de la „ relación la cual incluye tanto coincidencias idénticas como coincidencias por sustitución conservadora. Si por ejemplo dos secuencias polipeptídicas tienen 10/20 aminoácidos idénticos, y los últimos son sustituciones no conservadoras, entonces el por ciento de identidad y similitud sería de 50% en ambas. Si en el mismo ejemplo existen cinco posiciones adicionales en donde existen sustituciones conservadoras, el por ciento de identidad permanece en 50%, pero el por ciento de similitud será de 75% (15/20) . Por lo tanto, en casos en donde existen sustituciones conservadoras, el por ciento de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el por ciento de identidad entre estos dos polipéptidos. Los términos "que se presentan de manera natural" o "nativo", cuando se utilizan en relación a materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células huéspedes y similares, se refiere a materiales los cuales se encuentran en la naturaleza y no han sido manipulados por el hombre. De manera similar, "que no se presenta de manera natural" o "no nativo", como se utiliza en la presente, se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente o sintetizado por humanos. Los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se^ refieren cada uno a la cantidad de un polipéptido FGFR-L, molécula de ácido nucleico para FGFR-L utilizada para soportar un nivel observable de una o más actividades biológicas de los polipéptidos FGFR-L, como Se establece en la presente. El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable", como se utilizan en la presente, se refiere a uno o _ más materiales de formulación adecuados para llevar a cabo o para aumentar el suministro del polipéptido FGFR-L, la molécula de ácido nµcleico de FGFR-L o para un agente de unión selectivo de FGFR-L como una composición farmacéutica. El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de que se una por un agente de unión selectivo, tal como un anticuerpo y adicionalmente capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ése antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. . El término "agente de unión selectiva" se refiere a una molécula o moléculas que tienen especificidad por un ^polipéptido FGFR-L. Como se utiliza en la presente, el término específico" y "especificidad" se refiere a la capacidad de los agentes de unión selectivos para unirse a polipéptidos FGFR-L humanos y para no unirse a polipéptidos FGFR-L que no son humanos. Sin embargo, se apreciará que los agentes de unión selectivos también pueden unir ortólogos del polipéptido como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, es decir, versiones entre especies de los mismos, tales como los polipéptidos FGFR-L de ratón y de rata. El término "transducción" se utiliza para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente por un fago. El término "transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus. El término "transfección" se utiliza para referirse a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando se ha introducido ADN exógeno dentro de la membrana de la célula. Se conocen bien en el arte muchas técnicas de transfección y se describen en la presente. Véase, por ejemplo, Graham et al . , 1973, Virology 52:456; Sambrook et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al . , Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986); y Chu et al . , 1981, Gene 13:197. Tales técnicas se pueden utilizar para introducir una o más porciones de ADN exógeno dentro de células huéspedes adecuadas. El término "transformación", como se utiliza en la presente, se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula y una célula ha sido transformada cuando ha sido modificada para contener un ADN nuevo. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente de su estado nativo. Después de la transfección o traducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula al integrarse físicamente dentro de un cromosoma de la célula, o se puede mantener transitoriamente como un elemento episómico sin que se replique o bien se puede replicar independientemente como un plásmido. Se considera que una célula ha sido transformada de manera estable cuando el ADN se replica con la división de la célula.

Relación de las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos Se entiende que las moléculas de ácido nucleico relacionadas incluyen variantes alélicas o de maduración (corte y empalme) de la molécula de ácido nucleico ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, e incluye secuencias que son complementarias con cualquiera de las secuencias nucleotídicas anteriores. Las moléculas de ácido nucleico relacionadas también incluyen una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que comprende o que consiste esencialmente de una sustitución, modificación, adición o supresión de uno o más residuos aminoácidos en comparación con el polipéptido en ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Tales polipéptidos FGFR-L relacionados pueden comprender, por ejemplo, una adición o supresión de uno o más sitios de glucosilación unidos a N o unidos a 0, o una adición o supresión de uno o más residuos cisteína. Las moléculas de ácido nucleico relacionadas también incluyen fragmentos de moléculas de ácido nucleico para FGFR-L las cuales codifican para un polipéptido de por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, o aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 75 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos, o aproximadamente 150 aminoácidos, o aproximadamente 200 aminoácidos, o más de 200 residuos aminoácidos del polipéptido FGFR-L de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Además, las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L relacionadas también incluyen aquéllas moléculas las cuales comprenden secuencias nucleotídicas que hibridizan bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada como se define en la presente con una secuencia complementaria completa de la molécula de ácido nucleico para FGFR-L de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, o de una molécula que codifica para un polipéptido, polipéptido el cual comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, o un fragmento de ácido nucleico como se define en la presente, o de un fragmento de ácido nucleico que codifica para un polipéptido como se define en la presente. Se pueden preparar sondas de hibridación utilizando secuencias para FGFR-L que se proporcionan en la presente para cribar ADNc, bibliotecas de ADN genómico o sintético para secuencias relacionadas. Las regiones de ADN o la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR-L que muestren identidad importante con secuencias conocidas se determina con facilidad utilizando algoritmo de alineación de secuencia, como se describe en la presente y estas regiones se pueden utilizar para diseñar sondas para cribado. El término "condiciones de rigurosidad elevada" se refieren a aquéllas condiciones que se diseñan para permitir la hibridación de cadenas de ADN cuyas secuencias son altamente complementarias y que excluyen la hibridación de los ADN mal pareados de manera significativa. La xigurosidad en la hibridación se determina principalmente por la temperatura, fuerza iónica y la concentración de los agentes desnaturalizantes tales como formamida. Los ejemplos de "condiciones de alta rigurosidad" para hibridación y lavado son cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M a 65-68 °C, o cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M y formamida 50% a 42 °C. Véase Satnbrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson et al . , Nucleic Acid Hybridisation : A Practical Aproach Ch. 4 (IRL Press Limited) .

También se pueden utilizar condiciones más rigurosas (tales como una mayor temperatura, menor fuerza iónica, una mayor concentración de formamida o de otro agente desnaturalizante) - sin embargo, se alterará la velocidad de hibridación. Se pueden incluir otros agentes en los amortiguadores de hibridación y de lavado con el propósito de reducir la hibridación inespecífica o de fondo. Los ejemplos son albúmina sérica bovina 0.1%, polivinilpirrolidona 0.1%, pirofosfato de sodio 0.1%, dodeciisulfato de sodio 0.1%, NaDodS0 , (SDS), Ficoll, solución Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano, aunque también se pueden utilizar otros agentes adecuados. La concentración y los tipos de estos aditivos pueden cambiar sin que se altere sustancialmente la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Los experimentos de hibridación habitualmente se llevan a cabo a un pH de 6.8-7.4; sin embargo, en condiciones típicas de fuerza iónica, la velocidad de hibridación es casi independiente del pH. Véase Anderson et al . , Nucleic Acid Hybridisation : A Practical Approach Ch. 4 (RIL Press Limited) . Los factores que alteran la estabilidad de una cadena doble de ADN incluyen la composición de bases, longitud y grado de mal pareamiento de pares de bases. Se pueden ajustar las condiciones de hibridación por los expertos en la técnica con el fin de adaptar estas variables y permitir que los ADN de relación de secuencia diferentes formen híbridos . Se puede determinar la temperatura de fusión de una cadena doble de ADN pareada perfectamente, por la siguiente ecuación: Tm (°C) = 81.5 + 16.6 (log[Na+j) + 0.41 (%G + C) -600/N-O .72 (% de formamida) en donde N es la longitud de la cadena doble que se forma [Na+] es la concentración molar del ion sodio en la solución -de hibridación o de lavado, %G + C es el porcentaje de bases (guanina + citosina) en el híbrido. Para híbridos pareados de manera imperfecta, se reduce la temperatura de fusión aproximadamente 1°C por cada 1% de mal pareamiento. El término "condiciones de rigurosidad moderada" se refiere a condiciones bajo las cuales se produce una cadena doble de ADN con un mayor grado de mal pareamiento de pares de bases bajo las que se podrían formar bajo "condiciones de alta rigurosidad". Los Ejemplos de "condiciones de rigurosidad moderadas" típicas son cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M a 50-65°C o cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M y formamida 20% a 37-50°C. A modo de ejemplo, las "condiciones de rigurosidad moderadas" de 50 °C en ion sodio 0.015 M permitirán aproximadamente un 21% de mal pareamiento. Se apreciará por aquéllos expertos en la técnica que no hay diferenciación absoluta entre • "condiciones de alta rigurosidad" y "condiciones de rigurosidad moderada" . Por ejemplo, el ion sodio 0.015 M (sin formamida),. la temperatura de fusión de un ADN de longitud pareada perfectamente es de aproximadamente 71 °C. Con un lavado a 65°C fa la misma fuerza iónica), esto permitiría aproximadamente un mal pareamiento de 6%. Para retener secuencias relacionadas de manera más distante, una persona experta en la técnica simplemente disminuye la temperatura o aumenta la fuerza iónica. Una buena determinación de la temperatura de fusión es NaCl* 1M para sondas oligonucleotídicas de hasta aproximadamente 20 nucleótidos y está proporcionada por: Tm = 2°C por pares de bases A-T + 4°C por pares de bases G-C *La concentración del ion sodio en citrato de sodio salino 6X fSSC) es ÍM. Véase Suggs et al . , Developmental Biology Using Purified Genes 683 (Brown y Fox, eds., 1981) . Las condiciones de lavado de alta rigurosidad para oligonucleótidos habitualmente se realizan a una temperatura de 0-5cC por debajo de la Tm del oligonucleótido en 6X SSC, SDS 0.1%.

En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico relacionadas comprenden o consisten de una secuencia nucleotídica que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia nucleotídica como se muestra en ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: l o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 4, o comprenden o consisten esencialmente de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntico al polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. En las modalidades preferidas, las secuencias nucleotídicas son aproximadamente 75 por ciento, o aproximadamente 80 por ciento, o aproximadamente 85 por ciento, o aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento idénticas a la secuencia de nucleótidos como se muestra ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, o las secuencias nucleotídicas codifican para un polipéptido que es aproximadamente 75 por ciento, o aproximadamente 80 por ciento, o aproximadamente 85 por ciento, o aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento idéntico a la secuencia polipeptídica como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Las moléculas de ácido nucleico relacionadas codifican para polipéptidos que poseen por lo menos una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Las diferencias en la secuencia de ácido nucleico puede resultar en modificaciones conservadoras o no conservadoras de la secuencia de aminoácidos en relación a la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Las modificaciones conservadoras de la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 (y las modificaciones correspondientes a los nucleótidos codificantes) producirán un polipéptido que tiene características funcionales y químicas similares a las de los polipéptidos FGFR-L. En contraste, las modificaciones sustanciales en las características funcionales o químicas de los polipéptidos FGFR-L se pueden llevar a cabo al seleccionar sustituciones en la secuencia de aminoácidos ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 que difieran significativamente en su efecto para mantener: (a) la estructura principal molecular en el área de la sustitución, por ejemplo una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral.

Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede involucrar la sustitución de un residuo aminoácido nativo con un residuo no nativo de manera que exista poco o nulo efecto en la polaridad o carga del residuo aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también se puede sustituir con alanina, como se ha descrito previamente para "mutagénesis de exploración con alanina" . Las sustituciones conservadoras de aminoácidos también abarcan residuos aminoácidos que no se presentan de manera natural y que típicamente se incorporan por síntesis peptídica química en vez de hacerse por síntesis en sistemas biológicas. Estos incluyen péptido miméticos y otras formas invertidas o revertidas de porciones de aminoácidos. Los residuos que se presentan de manera natural se pueden dividir en clases, basados en las propiedades comunes de las cadenas laterales: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) residuos que alteran la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el cambio de un elemento de una de estas clases por un elemento de otra clase. -Tales residuos sustituidos se pueden introducir en regiones del polipéptido FGFR-L humano que sea homologa con polipéptidos FGFR-L no humanos o dentro de regiones no homologas de la molécula. Al realizar tales cambios, se debe de considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base en su hidrofobicidad y características de carga. Los índices hidropáticos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteina/cistina (+2.5); metionina (+1.9), alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9), tirosina (-1.3) prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5) glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5) lisina (-3.9); y arginina (-4.5). La importancia del índice de aminoácido hidropático al conferir una función biológica interactiva en una proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte et al . , 1982, ". Mol . Biol . 157:105-31). Se sabe que algunos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o una calificación hidropática similar y aún así retener una actividad biológica similar. Al realizar cambios en base en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos se encuentren ±2 , y se prefieren particularmente aquéllos los cuales están dentro de +1 y se prefieren de manera más particular aquéllos que están incluso dentro de ±0.5. También debe entenderse en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar de manera eficaz en base en la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido funcionalmente equivalente de manera biológica creado de esta manera se diseña para uso en modalidades inmunológicas, como en el presente caso. La mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, en la manera en que se gobierna por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a estos residuos aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1); glutamato (+3.0 ± 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (- 0.5); histidina (-0.5); cisteina (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); y triptofano (-3.4). Al realizar cambios en base en los valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad estén dentro de ±2, se prefieren particularmente aquéllos los cuales están dentro de +1, y se prefie en incluso de manera más particular aquéllos dentro de ±0.5. Uno también puede identificar epítopos de las secuencias de aminoácidos primarios en base en la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan como "regiones de núcleo epitópico" . Las sustituciones deseadas de aminoácidos (conservadoras o no conservadoras) se pueden determinar por los expertos en la técnica en el momento en que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes del polipéptido FGFR-L o para aumentar o disminuir la afinidad de los polipéptidos FGFR-L descritos en la presente. En la Tabla 1 se describen sustituciones ejemplares de aminoácidos.

Tabla I Sustituciones de aminoácidos Una persona experta en la técnica será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipéptido como se establecen ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 utilizando técnicas bien conocidas. Para identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiar sin destruir la actividad biológica, una persona experta en la técnica puede determinar áreas que no se consideren como importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares a partir de la misma especie o de otra especie, una persona experta en la técnica puede comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptído FGFR-L con tales polipéptidos similares. Con tal comparación, uno puede identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. Se apreciará que los cambios en áreas de la molécula FGFR-L que no estén conservados en relación a tales polipéptidos similares es menos probable que alteren de manera adversa la actividad biológica o la estructura de un polipéptido FGFR-L. Una persona experta en la técnica también sabe que, incluso en regiones conservadas relativamente, uno puede sustituir aminoácidos químicamente similares por residuos que se presenten de manera natural mientras se conserve la actividad (sustituciones conservadoras de residuos aminoácidos) . Por lo tanto, incluso las áreas que pueden ser importantes para actividad biológica o para estructura se pueden someter a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir su actividad biológica o sin afectar de manera adversa la estructura del polipéptido. De manera adicional, una persona experta en la técnica puede revisar los estudios de estructura y función para identificar residuos en polipéptidos similares que sean importantes en cuanto a actividad o estructura. En vista de tal comparación, uno puede predecir la importancia de los residuos aminoácidos en un polipéptido FGFR-L que corresponda a los residuos aminoácidos que son importantes para actividad o estructura en polipéptidos similares. Una persona experta en la técnica puede decidir sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos aminoácidos importantes predichos de los polipéptidos FGFR-L. Una persona experta en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación a esa estructura, en polipéptidos similares. En vista de tal información, una persona experta en la técnica puede predecir la alineación de residuos aminoácidos del polipéptido FGFR-L respecto a su estructura tridimensional. Una persona experta en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales a los residuos aminoácidos predichos para que estén en la superficie de proteína, dado que tales residuos pueden estar relacionados con interacciones importantes con otras moléculas. Además, una persona experta en la técnica puede generar variantes de prueba que contengan una sola sustitución de aminoácido en cada residuo aminoácido. Las variantes pueden ser cribadas utilizando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la técnica. Tales variantes se pueden utilizar para adquirir información acerca de las variantes adecuadas. Por ejemplo, si uno descubre que un cambio en un residuo aminoácido particular resulta en que se destruye, o bien se reduce de manera indeseable o se presenta una actividad no adecuada, se deben evitar las variantes con tal cambio. En otras palabras, en base en la información recuperada de tales experimentos sistemáticos, una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en donde deben evitarse tales sustituciones adicionales, ya sea solas o en combinación con otras mutaciones. Se han desarrollado muchas publicaciones científicas respecto a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult, 1996, Curr. Opin . Biotechnol . 7:422-27; Chou et al . , 191 A , Biochemistry 13:222-45; Chou et al . , 191 A , Biochemistry 113:211-22; Chou et al . , 1978, Adv. Enzymol . Relat . Áreas Mol . Biol . 47:45-48; Chou et al . , 1978, Ann . Rev. Biochem. 41 -.251-216 ; y Chou et al . , 1979, Biophys . J. 26:367-84. Además, están disponibles actualmente programas de computadora para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas las cuales tienen una identidad de secuencia mayor de 30% o una similitud mayor de 40%, con frecuencia tienen topologías estructurales similares. El desarrollo reciente de la base de datos estructural de proteínas (PDB, por sus siglas en inglés) ha demostrado una capacidad de predicción mejorada de la estructura secundaria, que incluye el número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:244-47. Se ha sugerido que existe un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se vuelve notablemente más precisa (Brenner et al., 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 1:369-16) . Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "trenzado" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "análisis de perfil" (Bowie et al., 1991, Science , 253:164-70; Gribskov et al., 1990, Methods Enzymol. 183:146-59; Gríbskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. 84:3455-58), y "enlace evolutivo" (Véase Holm et al., supra y Brenner et al., supra) .

Las variantes del polipéptido FGFR-L preferidas incluyen variantes de glucosilación en donde el número o tipo de sitios de glucosilación han sido alterados en comparación con la secuencia de aminoácidos que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. En una modalidad, las variantes del polipéptido FGFR-L comprenden un número mayor o menor de sitios de glucosilación unidos a N en comparación con la secuencia de aminoácidos que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Un sitio de glucosilación unido a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo aminoácido, excepto prolina. La sustitución de los residuos aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un sitio nuevo potencial para la adición de una cadena de carbohidrato unida a N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminarán una cadena carbohidrato unida a N existente. También se proporciona un rearreglo de cadenas carbohidrato unidas a N en donde uno o más de los sitios de glucosilación unidos a N (típicamente aquéllos que se presentan de manera natural) se eliminan, y se generan uno o más sitios nuevos unidos a N. Las variantes FGFR-L preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína, en donde uno o más residuos cisteína se suprimen o bien se sustituyen con otro aminoácido (por ejemplo serina), en comparación con la secuencia de aminoácidos que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Las variantes de cisteína son útiles cuando los polpéptidos FGFR-L deben renaturalizarse en una conformación biológicamente activa por ejemplo después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos residuos cisteína en comparación con la proteína nativa y típicamente tienen un número par, para minimizar interacciones que resultan de cisteínas no pareadas. En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico relacionadas comprenden o consisten de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece en ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una inserción de aminoácido y en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, o una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una supresión de aminoácidos y en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Las moléculas relacionadas de ácido nucleico también comprenden o consisten de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, en donde el polipéptído tiene un corte en la parte carboxilo o amino terminal y además en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Las moléculas relacionadas de ácido nucleico también comprenden o consisten de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos, cortes en la parte carboxilo o amino terminal y en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Además, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 u otro polipéptido FGFR-L se puede fusionar a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o con un polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los péptidos y polipéptidos heterólogos incluyen, pero no se limitan a: un epítopo para permitir la detección o el aislamiento de un polipéptido de fusión FGFR-L; una proteína receptora transmembranal o una porción de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio transmembranal e intracelular; un ligando o una porción del mismo el cual se une a la proteína receptora transmembranal; una enzima o una porción de la misma la cual es catalíticamente activa; un polipéptido o péptido que promueve la oligomerización, tal como el dominio de cremallera de leucina; un polipéptido o péptido que aumenta la estabilidad, tal como una región constante de inmunoglobulina; y un polipéptido el cual tiene una actividad terapéutica diferente de la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, u otro polipéptido FGFR-L. Las fusiones se pueden realizar ya sea en la parte amino terminal o carboxilo terminal del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 u otro polipéptido FGFR-L. Las fusiones se pueden dirigir sin molécula enlazante o adaptadora o pueden ser a través de una molécula enlazante o adaptadora. Una molécula enlazante o adaptadora puede ser uno o más residuos aminoácidos, habitualmente de aproximadamente 20 a aproximadamente • 50 residuos aminoácidos. Una molécula enlazante o adaptadora también se puede diseñar con un sitio de separación para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa, para permitir la separación de las porciones fusionadas. Se apreciará que, una vez construidos, los polipéptidos de fusión pueden formar derivados de acuerdo con los métodos que se describen en la presente. En una modalidad adicional de la invención, se fusiona el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, u otro polipéptido FGFR-L a uno o más dominios de una región Fc de IgG humana. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab" que une un antígeno, y un dominio constante conocido como "Fc" que se relaciona con las funciones efectoras tales como activación de complemento y ataque por células fagocíticas. Un Fc tiene una vida media en suero prolongada, mientras que un Fab tiene poca duración. Capón et al . , 1989, Nature 337:525-31. Cuando se construyen junto con una proteína terapéutica, un dominio Fc puede proporcionar una vida media más prolongada o incorporar funciones tales como unión del receptor Fc, unión de proteína A, fijación de complemento y tal vez incluso transferencia placentaria. Id. La tabla II resume el uso de algunas fusiones de Fc conocidos en la técnica. Tabla 2 Fusión de Fc con Proteínas Terapéuticas En un ejemplo, las regiones de bisagra de IgG humana, CH2 y CH3 se pueden fusionar ya sea a la parte amino terminal o carboxilo terminal del polipéptido FGFR-L utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En otro ejemplo, la región de bisagra IgG humana CH2 y CH3 se puede fusionar ya sea en la parte amino terminal o carboxilo terminal de un fragmento de polipéptido FGFR-L (por ej-emplo la porción extracelular predicha del polipéptido FGFR-L) . El polipéptido de fusión FGFR-L resultante se puede purificar mediante el uso de una columna de afinidad de proteína A. Se ha encontrado que los péptidos y proteínas fusionados a una región Fc muestran una visa media sustancialmente mayor in vivo en comparación con su contraparte no fusionada. Además, la fusión a una región Fc permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión. La región Fc puede ser una región Fc que se presente de manera natural, o puede estar alterada para mejorar algunas cualidades, tales como la calidad terapéutica, tiempo de circulación o agregación reducida. La identidad y similitud de moléculas de ácido nucleico y polipéptidos, relacionados, se calcula fácilmente por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a los descritos en Computational Molecular Biology (A.M. Lesk, ed., Oxford University Press 1988); Biocomputing : Informatics and Genome Projects (D.W. Smith, ed. , Academic Presss 1993) ; Computer Analysis of Sequence Data (Parte 1, A.M. Griffin y H.G. Griffin, eds., Humana Press 1994) ; G. von Heinle, Sequence Analysis in Molecular Biology (Academic Press 1987) ; Sequence Analysis Primer (M. Gribskov y J. Devereux, eds., M. Stockton Press 1991); y Carrillo et al . , 1988, SIAM J. Applied Math . , 48:1073. Los métodos preferidos para determinar identidad o similitud se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias que se prueban. Los métodos para determinar identidad y similitud se describen en programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos preferidos de programa de computadora para determinar identidad y similitud entre dos secuencias, incluyen, pero no se limitan al paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al . , 1984, Nucleic Acids Res . 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl) , BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al . , 1990, J\ Mol . Biol . 215:403-10). El programa BLASTX está disponible públicamente del National Center for Biotechnology Information (NCBI, por sus siglas en inglés) y otras fuentes (Altschul et al . , BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, MD) ; Altschul et al . , 1990, supra) . También se puede determinar el algoritmo bien conocido de Smith Waterman para determinar identidad. Algunos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en la coincidencia de solo una región corta de las dos secuencias, y esta región pequeña alineada puede tener una alta identidad de secuencia aunque no existe una relación importante entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, en una modalidad preferida, el método de alineación seleccionado (programa GAP) resultará en una alineación que abarca por lo menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido reivindicado. Por ejemplo, utilizando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, l) , se alinean dos polipéptidos para los cuales de va a determinar el por ciento de identidad de secuencia, para coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (el "alcance coincidente" determinado por el algoritmo) . Se utilizan un castigo por abertura de separación (la cual se calcula como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de comparación que se utilice; la "diagonal" es la calificación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y un castigo por extensión de separación (la cual habitualmente es de 0. IX el castigo de abertura de separación), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62, junto con el algoritmo. También se utiliza una matriz de comparación estándar por el algoritmo (véase Dayhoff et al . , Atlas of Protein Sequence and Structure (Supp. 3 1978) (matriz de comparación PAM250) ; Henikoff et al . , 1992, Proc. Nati . Acad. Sci E. U.A . 89:10915-19 (matriz de comparación BLOSUM 62) ) . Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, 1970, J". Mol . Biol . 48:443-53; Matriz de comparación: BLOSUM 62 (Henikoff et al . , supra) ; Castigo de separación: 12 Castigo de longitud de separación: 4 Umbral de similitud; 0 El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados antes son parámetros por omisión para comparaciones de polipéptidos (junto con carencia de castigo para finalización de separaciones) utilizando el algoritmo GAP. Los parámetros preferidos para la comparación de una secuencia de una molécula de ácido nucleico incluyen los siguientes : Algoritmo: Needleman y Wunsh, supra; Matriz de comparación: coincidencias = +10, malpareamiento = 0 Castigo por separación: 50 Castigo por longitud de separación: 3 El programa GAP también es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados antes- son parámetros por omisión para comparación de moléculas de ácido nucleico. Se pueden utilizar otros algoritmos ejemplares, castigos por abertura de separación, castigos por extensión de separación, matrices de comparación y umbrales de similitud, incluyendo los que se establecen en el Program Manual, Wisconsin Package, Versión 9, septiembre, 1997. Las elecciones particulares que se realicen serán evidentes para los expertos en la técnica y dependerán de la comparación específica que se realice, tal como ADN a ADN, proteína a proteína, proteína a ADN; y adicionalmente, si la comparación es entre pares dados de secuencias (en cuyo caso se prefieren en general GAP o BestFit) o bien entre una secuencia o una base de datos grande de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA) .

Moléculas de Acido Nucleico Las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L se pueden obtener fácilmente de diversas maneras que incluyen, sin limitación, síntesis química, ADNc o cribado de una biblioteca genómica, cribado de una biblioteca de expresión o amplificación por PCR de ADNc. Los métodos de ADN recombinante utilizados en la presente generalmente son los que se establecen en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al . , eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994) . La invención proporciona moléculas de ácido nucleico como se describe en la presente y métodos para obtener tales moléculas. Cuando se ha identificado de una especie el gen que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L, la totalidad o una porción de ese gen se puede utilizar como una sonda para identificar ortólogos o genes relacionados de la misma especie. Se pueden utilizar sondas o cebadores para cribar bibliotecas de ADNc de diversas fuentes de tej ido que se crea expresan el polipéptído FGFR-L. Además, una parte o la totalidad de la molécula de ácido nucleico que tenga la secuencia como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 se puede utilizar para cribar una biblioteca genómica para identificar y aislar un gen que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L. Típicamente se utilizarán condiciones de rigurosidad moderada o elevada para el cribado, con el fin de minimizar el número de resultados falsos positivos que se obtengan del cribado . Las moléculas de ácido nucleico que codifican para la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos FGFR-L también se pueden identificar por clonación de expresión la cual utiliza la detección de clones positivos en base en una propiedad de la proteína expresada. Típicamente, las bibliotecas de ácido nucleico se criban por la unión de anticuerpo u otro asociado de unión (Por ejemplo receptor o ligando) a proteínas clonadas que se expresan y se exhiben en la superficie de una célula huésped. El anticuerpo o asociado de unión se modifica con una marca detectable para identificar aquellas células que expresen el clon deseado. Se pueden seguir técnicas de expresión recombinantes llevadas a cabo de acuerdo con las descripciones que se establecen en lo siguiente para producir estos polinucleótidos y para expresar los polipéptidos codificados. Por ejemplo, al insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L dentro de un vector apropiado, una persona experta en la técnica puede producir fácilmente grandes cantidades de la secuencia nucleotídica deseada. Las secuencias se pueden utilizar después para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, se puede insertar en un vector de expresión un polinucleótido que codifique para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L. Al introducir el vector de expresión en un huésped apropiado, el polipéptido FGFR-L codificado se puede producir en grandes cantidades. Otro método para obtener una secuencia adecuada de ácido nucleico es la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) . En este método se prepara ADNc a partir de poli (A) +ARN o ARN total utilizando la enzima transcriptasa inversa. Después se agregan al ADNc dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas de ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L, al ADNc junto con una polimerasa tal como la polimerasa Taq y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores. Otro medio para preparar una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L es la síntesis química utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica tales como los que se describen por Engels et al . , 1989, Angew. Chem. Intl . Ed. 28 : 716-34. Estos métodos incluyen, por ejemplo, los métodos de fosfotriéster, fosforoamidita y H-fosfonato para síntesis de ácido nucleico. Un método preferido para tal síntesis química es la síntesis soportada por polímero utilizando la química de fosforoamidita estándar. Típicamente, el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L tendrá varios cientos de nucleótidos de longitud. Se pueden sintetizar ácidos nucleicos más grandes de aproximadamente 100 nucleótidos, como varios fragmentos utilizando estos métodos. Los fragmentos después se pueden unir ligándolos para formar la secuencia nucleotídica de longitud completa de un gen para FGFR-L. Habitualmente, el fragmento de ADN que codifica para la parte amino terminal del polipéptido tendrá un ATG, que codifica para un residuo metionina. Esta metionina puede o no estar presente en la forma madura del polipéptido FGFR-L, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula huésped se diseña para ser secretado de esa célula. También se pueden utilizar otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas modalidades, las variantes de ácido nucleico contienen codones los cuales han sido alterados para expresión óptima de un polipéptido FGFR-L en una célula huésped dada. Las alteraciones de codón particulares dependerán del polipéptido FGFR-L y la célula huésped seleccionada para expresión. Tal "optimización de codón" se puede llevar a cabo por diversos métodos, por ejemplo al seleccionar codones que se prefiere para uso en genes altamente expresados en una célula huésped dada. Los algoritmos de computadora que incorporan tablas de frecuencia de codones tales como "Eco_high.Cod" para preferencia de codón de genes bacterianos altamente expresados se pueden utilizar y se proporcionan por la University of Wisconsin Package Versión 9.0 (Genetics Computer Group, Madison, Wl) . Otras tablas de frecuencia de codón útiles incluyen "Celegans_high. cod, " "Celegans_low.cod, " "Drosophila_high. cod, " "Human_high. cod, " "Maize_high.cod, " y "Yeast-high. cod." En algunos casos puede desearse preparar moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes del polipéptido FGFR-L. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes se pueden producir utilizando mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR u otros métodos apropiados en donde el o los cebadores tienen las mutaciones puntuales deseadas (véase Sambrook et al . , supra, y Ausubel et al . , supra, para descripciones de técnicas de mutagénesis) . La síntesis química utilizando los métodos descritos por Engels et al., supra, también se pueden utilizar para preparar tales variantes. Igualmente se pueden utilizar otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Vectores y Células Huéspedes La molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L se inserta en un vector de expresión apropiado utilizando técnicas de ligación estándar. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula huésped particular utilizada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de manera que pueda producirse la amplificación del gen o la expresión del gen) . Una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido FGFR-L se puede amplificar/expresar en células huéspedes procariotas de levadura, de insecto (sistema de baculovirus) o células huéspedes eucariotas. La selección de la célula huésped dependerá, en parte, de si el polipéptido FGFR-L va a ser modificado post-traduccionalmente (es decir, glucosilado o fosforilado) . Si es así, son preferibles células huéspedes de levadura, insecto o mamífero. Para una revisión de los vectores de expresión véase Meth . Enz . , vol. 185 (D.V. Goeddel, ed. , Academic Press 1990) . Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células huéspedes contendrá secuencias para el mantenimiento del plásmido y para clonación y expresión de secuencias nucleotídicas exógenas. Tales secuencias se denominan colectivamente como "secuencias flanqueantes" en algunas modalidades típicamente incluirán una o más de las siguientes secuencias nucleotídicas: un promotor, una o más secuencias mejoradoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación de transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene sitios de empalme, donador y aceptor, una secuencia que codifica para una secuencia líder para secreción de polipéptido, un sitio de unión de ribosoma una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se discute en lo siguiente. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifique para una "etiqueta" es decir, una molécula oligonucleotídica que se localice en el extremo 5 ' o 3 ' de la secuencia que codifica para el polipéptido FGFR-L; la secuencia oligonucleotídica codifica para polyHis (tal como hexaHis) , u otra "etiqueta" tal como FLAG, HA (hemaglutinina de virus de influenza) o myc para el cual existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta típicamente se fusiona al polipéptido ante la expresión del polipéptido, y puede servir como un medio para purificación de afinidad del polipéptido FGFR-L de la célula huésped. La purificación de afinidad se puede llevar a cabo, por ejemplo, por cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta se puede separar subsecuentemente del polipéptido FGFR-L purificado por diversos medios tales como la utilización de ciertas peptidasas para separación. Las secuencias flanqueantes pueden ser homologas (es decir, de la misma especie o cepa que la célula huésped) heterólogas (es decir, de una especie diferente a la especie o cepa de la célula huésped) , híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente) o sintéticas, o bien las secuencias flanqueantes pueden ser secuencias nativas las cuales funcionan normalmente para regular la expresión del polipéptido FGFR-L. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta con la condición de que la secuencia flanqueante sea funcional y se pueda activar por los organelos de la célula huésped. Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención se pueden obtener por cualquiera de los diversos métodos bien conocidos en la técnica. Habitualmente las secuencias flanqueantes útiles en la presente - además de las secuencias flanqueantes del gen FGFR-L - se han identificado previamente por mapeo o digestión con endonucleasas de restricción y de esta manera se pueden aislar de la fuente de tejido apropiada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos se puede conocer la secuencia nucleotídica completa de una secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar utilizando los métodos que se describen en la presente para la síntesis o clonación de ácido nucleico. Cuando se conoce la totalidad o solo una porción de la secuencia flanqueante, se puede obtener utilizando PCR o por cribado de una biblioteca genómica con un oligonucleótido o fragmento de secuencia flanqueante adecuados de la misma especie o de otra. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante a partir de una pieza más grande de ADN que pueda contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede llevar a cabo por digestión con endonucleasa de restricción para producir el fragmento apropiado _ de ADN seguido por aislamiento utilizando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna QiagenMR (Chatsworth, CA) , u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. La selección de las enzimas adecuadas para llevar a cabo este propósito serán evidentes fácilmente para una persona con habilidad habitual en la técnica. Un origen de replicación es típicamente una parte de aquellos vectores de expresión de procariota adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. En algunos casos, la amplificación del vector a cierto número de copias puede ser importante para la expresión óptima de un polipéptido FGFR-L. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, se puede sintetizar químicamente uno en base en una secuencia conocida, y se puede ligar en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayor parte de las bacterias gramnegativas y son útiles diversos orígenes (por ejemplo SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitios vesicular (VSV, por sus siglas en inglés) o papilomavirus tales como HPV o BPV) para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen SV40 con frecuencia se utiliza solo debido a que contiene el promotor temprano) . Una secuencia de terminación de transcripción se localiza típicamente 3 ' respecto al extremo de la región codificante del polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación de transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente de una biblioteca- o incluso se compra comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos para síntesis de ácido nucleico tales como los que se describen en la presente . Un elemento de gen marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula huésped que crece en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican para proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huéspedes procariotas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles de los medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. También se puede utilizar un gen de resistencia a neomicina para la selección en células huéspedes procariotas y eucariotas. Se pueden utilizar otros genes de selección para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es un proceso en donde los genes que presentan mayor demanda para la producción de una proteína crítica para crecimiento son copiados en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección en donde únicamente los transformantes se adaptan de manera única para sobrevivir en virtud al gen de selección presente en el vector. Se impone presión de selección al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales cambia sucesivamente la concentración del agente de selección en el medio, y de esta manera lleva a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica para un polipéptido FGFR-L. Como resultado,, se sintetizan cantidades aumentadas del polipéptido FGFR-L a partir del ADN amplificado. Habitualmente es necesario un sitio de unión de ribosoma para el inicio de traducción del ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas) . El elemento típicamente se localiza 3 ' respecto al promotor y 5' respecto a la secuencia codificante de un polipéptido FGFR-L que se va a expresar. Se hace variar la secuencia de Shine-Dalgarno pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un contenido elevado de A-G) . Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos que se establecen en la presente y se utilizan en un vector procariota. Una secuencia líder o señal se puede utilizar para dirigir un polipéptido FGFR-L de la célula huésped.

Típicamente, se coloca una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de señal en la región codificante de una molécula de ácido nucleico FGFR-L o directamente en el extremo 5' de una región que codifica para el polipéptido FGFR-L. Se han identificado muchas secuencias de señal y algunas de estas son funcionales en la célula huésped seleccionada y se pueden utilizar junto con una molécula de ácido nucleico para FGFR-L. Por lo tanto, una secuencia de señal puede ser homologa fes decir, se presenta de manera natural) o heteróloga a la molécula de ácido nucleico para FGFR-L. Adicionalmente, una secuencia de señal se puede sintetizar químicamente utilizando los métodos que se describen en la presente. En la mayor parte de los casos, la secreción de un polipéptido FGFR-L de una célula huésped vía la presencia de un péptido señal resultará en la separación del péptido señal del polipéptido FGFR-L secretado. La secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de una molécula de ácido nucleico de FGFR-L que se inserta en el vector. Se incluye dentro del alcance de esta invención el uso de ya sea una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de señal polipeptídica de FGFR-L nativa unida a una región que codifica para el polipéptido FGFR-L o una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de señal heteróloga unida a una región codificante para el polípéptido FGFR-L. La secuencia de señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada, es decir, que se pueda separar por la peptidasa señal, por la célula huésped. Para células huéspedes procariotas que no reconocen y procesan la secuencia de señal del polipéptido FGFR-L nativo, la secuencia de señal se sustituye por una secuencia de señal procariota que se selecciona, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa o líderes de enterotoxina II termoestable. Para secreción de levadura, la secuencia de señal del polipéptido FGFR-L nativa se puede sustituir por la invertasa de levadura, el factor a o líderes de fosfatasa acida. En la expresión de células de mamífero, la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamífero. En algunos casos, por ejemplo cuando se desea glucosilación en un sistema de expresión de célula huésped eucariota, uno puede manipular las diversas presecuencias para mejorar la glucosilación o el rendimiento. Por ejemplo, uno puede alterar el sitio de separación de peptidasa de un péptído señal particular, o agregar prosecuencias las cuales también pueden alterar la glucosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición -1 (en relación al primer aminoácido de la proteína madura) , uno o más aminoácidos adicionales que inciden en la expresión, los cuales pueden no haber sido separados totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos aminoácidos que se encuentren en el sitio de separación de peptidasa, unidos a la parte amino terminal. Alternativamente, el uso de algunos sitios de separación de enzima pueden resultar en una forma ligeramente truncada del polipéptido FGFR-L deseado, si la enzima corta en tal área dentro del polipéptido maduro. En muchos casos, la transcripción de la molécula de ácido nucleico aumenta por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando se produce un polipéptido en células huéspedes eucariotas, especialmente células huéspedes de mamífero. Los intrones utilizados pueden ser los que se presentan de manera natural dentro del gen FGFR-L especialmente cuando el gen utilizado es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no se presenta de manera natural dentro del gen (como en la mayor parte de los casos de ADNc), el intrón se puede obtener de otra fuente. Generalmente es importante la posición del intrón con respecto a las secuencias flanqueantes y el gen para FGFR-L, dado que el intrón debe ser transcrito para que sea eficaz. Así, cuando se va a transcribir la molécula de ADNc para FGFR-L, la posición preferida del intrón es 3 ' respecto al sitio de inicio de transcripción y 5 ' respecto a la secuencia de terminación de transcripción poli-A. Preferiblemente, el o los intrones se localizarán en un lado u otro fes decir, 5 ' o 3 ' ) respecto al ADNc de manera que no interrumpa la secuencia codificante. Se puede utilizar para llevar a la práctica esta invención cualquier intrón de cualquier fuente incluyendo organismos virales, procariotas y eucariotas (vegetales o animales) , con la condición de que sea compatible con la célula huésped en la cual se inserta. También se incluyen en la presente intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede utilizar en el vector más de un intrón. Los vectores de expresión y clonación de la presente invención típicamente contendrán un promotor que se reconoce por el organismo huésped y que se une operablemente a la molécula que codifica para el polipéptido FGFR-L. Los promotores son secuencias no transcritas que se localizan hacia el extremo 5 ' respecto al codón de inicio del gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente, o un cambio en la temperatura.

Por otra parte, los promotores constitutivos inician la producción continua del producto del gen; esto es, existe poco o nulo control sobre la expresión del gen. Son bien conocidos una gran cantidad de promotores, reconocidos por diversas células huéspedes potenciales. Un promotor adecuado está unido operablemente al ADN que codifica para el polipéptido FGFR-L al separar el promotor del ADN fuente por digestión con enzimas de restricción e insertar la secuencia promotora deseada en el vector. Se puede utilizar la secuencia promotora FGFR-L nativa para dirigir la amplificación o expresión de una molécula de ácido nucleico para FGFR-L. Sin embargo, se prefiere un promotor heterólogo, si permite una mayor transcripción y rendimientos más altos de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo, y si es compatible con el sistema de célula huésped que se ha seleccionado para uso. Los promotores adecuados para uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina; un sistema promotor de triptofano (trp) ; y promotores híbridos tales como el promotor tac. Son adecuados también otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias se han publicado, por lo que permiten a una persona experta en la técnica ligarlos a la secuencia deseada de ADN, utilizando enlazadores o adaptadores según se necesite para suministrar cualquier sitio de restricción útil . Los promotores adecuados para uso con huéspedes de levadura también son bien conocidos en la técnica. Los mejoradores de levadura se utilizan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para uso con células huéspedes de mamífero son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a los que se obtienen de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela, adenovirus (tal como adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis B y, de manera más preferible, virus simio 40 (SV40, por sus siglas en inglés) . Otros promotores adecuados de mamífero incluyen los promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo promotores de choque térmico y el promotor de actina. Los promotores adicionales los cuales pueden ser de interés para controlar la expresión del gen para FGFR-L incluye, pero no se limitan a: la región del promotor temprano SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290:304-10), el promotor CMV; el promotor contenido en la secuencia repetida terminal larga 3 ' del virus de sarcoma de Rsus (Yamamoto, et al . , 1980, Cell 22:787-97); el promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner et al . , 1981, Proc . Nati Acad. Sci . E. U.A . 78:1444-45); las secuencias reguladoras del gen para metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); los evctores de expresión de procariota tales como el promotor de ß-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 75 :3727-31) ; o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control de transcripción en animales, que muestran especificidad de tejido y que se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I la cual es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de insulina, la cual es activa en células ß pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); la región de control del virus de tumor mamario en ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); la región de control de gen de albúmina que es activa en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel 1:268-76); la región de control del gen para a-fetoprotexna, la cual es activa en hígado (Krumlauf et al . , 1985, Mol . Cell . Biol . , 5:1639-48; Hammer et al . 1987, Science 235:53-58); la región de control del gen par o; 1-antitripsina, la cual es activa en el hígado (Kelsey e al . , 1987, Genes and Devel . 1:161-71); la región de contro del gen para ß-globina, la cual es activa en célula mieloides (Mogram et al . , 1985, Nature 315:338-40; Kollia et al . , 1986, Cell 46:89-94); la región de control del ge para la proteína básica de mielina la cual es activa e células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al . 1987, Cell 48:703-12); la región de control del gen de l cadena 2 ligera de miosina la cual es activa en múscul esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); y la región d control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica la cual es activa en el hipotálamo (Masón et al . , 1986 Science 234:1372-78) : Se puede insertar en el vector una secuenci mejoradora para aumentar la transcripción de un ADN qu codifica para el polipéptido FGFR-L de la presente invenció por eucariotas superiores. Los mejoradores son elementos d ADN que actúan cis, habitualmente de 10-300 pb de longitud que actúan en el promotor para aumentar la transcripción Los mejoradores son relativamente independientes en cuanto orientación y posición. Se han encontrado 5' y 3' respecto la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencia mejoradoras disponibles de genes de mamífero (por ejempl globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina) . Sin embargo, típicamente se utilizará un mejorador de un virus. El mejorador SV40, el mejorador del promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polioma y los mejoradores de adenovirus son elementos mejoradores ejemplares para la activación de promotores eucariotas. Aunque un mejorador puede ser madurado (cortado y empalmado) en el vector en una posición 5 ' o 3 ' respecto a una molécula de ácido nucleico para FGFR-L, habitualmente se localiza en un sitio 5' respecto al promotor. Los vectores de expresión se pueden construir a partir de un vector de inicio tales como los vectores disponibles comercialmente. Tales vectores pueden o no contener la totalidad de las secuencias flanqueantes deseadas . Cuando una o más de las secuencias flanqueantes que se describen en la presente no se encuentran de antemano en el vector, se pueden obtener individualmente y ligar en el vector. Los métodos utilizados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores preferidos para llevar a la práctica esta invención son aquellos los cuales son compatibles con células huéspedes bactrianas, de insectos y de mamíferos. Tales vectores incluyen, por ejemplo, pCRII, pCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA) , pBSII (Stratagene, La Jolla, CA) , pET15 (Novagen, Madison, Wl) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacII, Invitrogen) , pDSR-a (Publicación PCT número WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY) . Los vectores adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero se apreciará que el sistema vector debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a plásmidos tales como los derivados del plásmido Bluescript" (un fagémido basado en ColEl con un número alto de copias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA) , plásmidos de clonación de PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados por Taq (por ejemplo, el equipo TOPOMR TA Cloning"11, los derivados de plásmido PCR2.1MR, Invitrogen, Carlsbad, CA) , y vectores de mamífero, levadura o virus tales como el sistema de expresión de baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA) . Después de que se ha construido el vector y se ha insertado en el sitio apropiado del vector la molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido FGFR-L, el vector completado se puede insertar en una célula huésped adecuada para amplificación o expresión polipeptídica. La transformación de un vector de expresión para un polipéptido FGFR-L en una célula huésped seleccionada se puede llevar a cabo por métodos bien conocidos que incluyen métodos tales como transfección, infección, electroporación con cloruro de calcio, microinyección, lipofección, método de DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado en parte será una función del tipo de célula huésped que se va a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se establecen, por ejemplo, en Sambrook et al . , supra . Las células huéspedes pueden ser células huéspedes procariotas (tales como E. coli) Q células huéspedes eucariotas (tales como células de levadura, de insecto o vertebrados) . Cuando la célula huésped se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza un polipéptido FGFR-L el cual subsecuentemente se puede recolectar del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta al medio) o directamente de la célula huésped que lo produce fsi no lo secreta) . La selección de una célula huésped apropiada dependerá de diversos factores tales como los niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptidos que sean deseables o necesarias para actividad (tales como glucosilación o fosforilación) y la facilidad de plegado en una molécula biológicamente activa. En la técnica se conocen muchas células huéspedes adecuadas y muchas están disponibles de American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA. Los ejemplos ?4 - incluyen, pero no se limitan a células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO) , células CHO, DHFR(-) (Urlaub et al . , 1980, Proc. Nati . Acad. Sci . E. U.A . 97:4216-20), células 293 o 293T de riñon embriónico humano (HEK, por sus siglas en inglés), o células 3T3. La selección de células huéspedes de mamífero adecuadas así como los métodos para transformación, cultivo, amplificación, cribado, producción de producto y purificación se conocen en la técnica. Otras líneas de células de mamífero adecuadas son las líneas de células de mono COS-1 y COS-7, y la línea de células CV-1. Las células huéspedes de mamífero ejemplares adicionales incluyen líneas de células de primate y líneas de células de roedor que incluyen líneas de células transformadas. Células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario así como explantes primarios, los cuales también son adecuados. Las células candidato pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúe de manera dominante . Otras líneas de células de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de las líneas de células de ratón Swiss, Balb-c o NIH o de hámster BHK o HaK. Cada una de estas lineas celulares se conoce y está disponible para los expertos en la técnica de expresión de proteínas.

De manera similar, las células huéspedes útiles adecuadas para la presente invención son células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo HB101, DH5a, DH10 y MC1061) , son bien conocidas como células huéspedes en el campo de la biotecnología. También se pueden utilizar en este método diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp. , otros Bacillus spp. , Streptomyces spp. , y similares. Muchas cepas de células de levaduras conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células huéspedes para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Las células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris . Adicionalmente, cuando se desee, se pueden utilizar sistemas de células de insecto en los métodos de la presente invención. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts et al . , 1993, Biotechniques, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr. Opin . Biotechnol . 4:564-72; y Lucklow et al . , 1993 , J. Virol . , 61 : 4566-79. .Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen) . Uno también puede utilizar animales transgénicos para expresar polipéptidos FGFR-L glucosilados. Por ejemplo, uno puede utilizar un animal transgénico productor de leche (por ejemplo una vaca o chiva) y obtener el polipéptido glucosilado presente en la leche del animal . Uno también puede utilizar plantas para producir los polipéptidos FGFR-L, sin embargo, en general, la glucosilación que se produce en plantas es diferente a la que se produce en células de mamífero y puede resultar en un producto glucosilado el cual no sea adecuado para uso terapéutico humano.

Producción Polipeptídica Se pueden cultivar células huéspedes que comprendan el vector de expresión del polipéptido FGFR-L utilizando medios estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. El medio habitualmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivo de células E. coli incluyen, por ejemplo, caldo luria (LB, por sus siglas en inglés) , o caldo Terrific (TB, por sus siglas en inglés) . Los medios adecuados para cultivar células eucariotas incluyen el medio del Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) , medio esencial mínimo (MEM, por sus siglas en inglés) o medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) , la totalidad de los cuales se puede enriquecer con suero o factores de crecimiento según se necesiten para la línea de células particular que se cultiva. Un medio adecuado para cultivos de insecto es el medio de Grace suplementado con yeastolato, hidrolizado de lactalbúmina o suero bovino fetal, según se necesite. Típicamente se agrega como un suplemento al medio un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transfectadas o transformadas. El compuesto que se utilice estará determinado por el elemento marcador seleccionable que esté presente en el plásmido con el cual se ha transformado la célula huésped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es resistente a kanamicina, el compuesto agregado al medio de cultivo será kanamicina. Otros compuestos para crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina. La cantidad de un polipéptido FGFR-L producido por una célula huésped se puede evaluar utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por cromatografía líquida de alta resolución (CLAP) , inmunoprecipitación o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento de gel de unión de ADN. Si se ha diseñado un polipéptido de FGFR-L para ser secretado de las células huéspedes, la mayor parte del polipéptido se puede encontrar en el medio de cultivo celular. Sin embargo, si el polipéptido FGFR-L no es secretado de las células huéspedes, estará presente en el citoplasma o núcleo (para células huéspedes eucariotas) o en el citosol (para células huéspedes bacterias gramnegativas) . Para un polipéptido FGFR-L que se encuentra en el citoplasma o núcleo de células huéspedes (para células huéspedes eucariotas) o bien en el citosol (para células huéspedes bacterianas) , se puede extraer el material intracelular (incluyendo cuerpos de inclusión de bacterias gramnegativas) de la célula huésped utilizando cualquier técnica estándar conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células huéspedes se pueden lisar para liberar el contenido del periplasma/citoplasma por una prensa francesa, homogeneización o sonicación, seguido de centrifugación. - Si un polipéptido FGFR-L ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión con frecuencia se pueden unir a las membranas celulares interior o exterior y por lo tanto se pueden encontrar principalmente en el material sedimentado después de centrifugación. El material sedimentado después se puede tratar a pH. extremos o con un agente caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris carboxietilfosfina a un pH ácido para liberar, separar y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido FGFR-L solubilizado después se puede analizar utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similar. Si se desea aislar el polipéptido FGFR-L, el aislamiento se puede llevar a cabo utilizando métodos estándar tales como los descritos en la presente y en Marston et al . , 1990 , Meth. Enz. , 182:264-75. En algunos casos, el polipéptido FGFR-L puede no ser biológicamente activo después del aislamiento. Se pueden utilizar diversos métodos para "renaturalizar" o convertir el polipéptido a su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH habitualmente superior a 7 y en presencia de una concentración particular de un caotropo. La selección de caotropo es muy similar a las elecciones utilizadas para solubilización de cuerpos de inclusión, pero habitualmente el caotr?po se utiliza a una concentración menor y no necesariamente la misma que los caotropos utilizados para la solubilización. En la mayor parte de los casos la solución de renaturalización/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una relación específica para generar un potencial redox particular que permita que se produzca la transferencia disulfuro en la formación de los puentes de cisteína de la proteína. Algunos de los pares redox utilizados habitualmente incluyen cisteína/cistamina, glutatión (GSH) /ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT) /ditiano DTT ' y 2,2-mercaptoetanol (bME) /ditio-b(ME) . En muchos casos se puede utilizar un cosolvente o se puede necesitar para aumentar la eficiencia de la renaturalización y los reactivos utilizados más comúnmente para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, arginina y similares . Si no se forman cuerpos de inclusión en un grado significativo ante la expresión de un polipéptido FGFR-L, entonces el polipéptido se encontrará principalmente en el sobrenadante después de centrifugación del homogeneizado celular. El polipéptido puede ser aislado adicionalmente del sobrenadante utilizando métodos tales como los que se describen en la presente. Se puede llevar a cabo la purificación de un polipéptido FGFR-L de la solución utilizando diversas técnicas. Si el polipéptido ha sido sintetizado de manera que contenga una etiqueta tal como hexahistidina (polipéptido FGFR-L/hexaHís) u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co . , New Haven, CT) o myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) ya sea en la parte carboxilo o amino terminal, se puede purificar en un proceso de una etapa al hacer pasar la solución a través de una columna de afinidad en donde la matriz de la columna tenga una alta afinidad por la etiqueta. Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y específicamente a níquel. De esta manera, se puede utilizar una columna de afinidad de níquel (tales como las columnas de níquel QiagenMR) para purificación del polipéptido FGFR-L/poliHis. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 (Ausubel et al . , eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1993) . Adicionalmente, los polipéptidos FGFR-L se pueden purificar mediante el uso de un anticuerpo monoclonal que es capaz de reconocer específicamente y unirse a un polipéptido FGFR-L. Otros procedimientos adecuados para purificación incluyen, sin limitación, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamiz molecular, CLAP, electroforesis (que incluye electroforesis en gel nativo) seguido por elusión en gel y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific, San Francisco, CA) . En algunos casos se pueden combinar dos o más técnicas de purificación para obtener la pureza aumentada. Los polipéptidos FGFR-L también se pueden preparar por métodos de síntesis química (tales como síntesis peptídica en fase sólida) utilizando técnicas conocidas en el arte tales como las que se establecen por Merrifield et al . , 1963 , J. Am. Chem. Soc . 85:2149; Houghten et al . , 1985, Proc Nati Acad. Sci . E. U.A . 82:5132; y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co. 1984) . Tales polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina en la parte amino terminal. Los polipéptidos FGFR-L sintetizados químicamente se pueden oxidar utilizando métodos que se establecen en estas referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que los polipéptidos FGFR-L sintetizados químicamente tengan actividad biológica comparable con los polipéptidos FGFR-L correspondientes producidos de manera recombinante o purificados de fuentes naturales, y de esta manera se pueden utilizar intercambiablemente con un polipéptido FGFR-L recombinante o natural . Otro medio para obtener el polipéptido FGFR-L es vía purificación de muestras biológicas de tejidos o fluidos de fuente en los cuales, se encuentra de manera natural el polipéptido FGFR-L. Tal purificación se puede llevar a cabo utilizando métodos para purificación de proteínas como se describen en la presente. Se puede supervisar la presencia del polipéptido FGFR-L durante la purificación, por ejemplo, utilizando un anticuerpo preparado contra el polipéptido FGFR-L producido de manera recombinante o fragmentos peptídicos del mismo. Se conocen en la técnica muchos métodos adicionales para producir ácidos nucleicos y polipéptidos, y los métodos se pueden utilizar para producir polipéptidos que tengan especificidad por el polipéptido FGFR-L. Véase, por ejemplo, Roberts et al . , 1997, Proc . Nati . Acad. Sci . E. U.A . 94:12297-303, el cual describe la producción de proteínas de fusión entre un ARNm y su péptido codificado. Véase también Roberts, 1999, Curr. Opin . Chem. Biol . 3:268-73. Adicionalmente, la patente de E.U.A. número 5,824,469 describe métodos para obtener oligonucleótidos capaces de llevar a cabo una función biológica específica. El procedimiento involucra generar un acumulado heterogéneo de oligonucleótidos, cada uno con una secuencia aleatorizada 5 ' , una secuencia seleccionada previamente central y una secuencia aleatorizada 3 ' . El acumulado heterogéneo resultante se introduce en una población de células que no muestra la función biológica deseada. Después se criban las subpoblaciones de las células en búsqueda de aquella que muestre la función biológica determinada previamente. A partir de esta subpoblación se aislan oligonucleótidos capaces de llevar a cabo la función biológica deseada. Las patentes de E.U.A. números 5,763,192; 5,814,476; 5,723,323; y 5,817,483 describen procesos para producir péptidos o polipéptidos. Esto se realiza al producir genes estocásticos o fragmentos de los mismos y después introducir estos genes en células huéspedes que producen una o más proteínas codificadas por los genes estocásticos. Las células huéspedes después se criban para identificar aquellas clonas que produzcan péptidos o polipéptidos que tengan la actividad deseada. Otro método para producir péptidos o polipéptidos se describe en PCT/US98/20094 (WO99/15650) presentado por Athersys, Inc. Conocido como "Random Activation of Gene Expression for Gene Discovery" (RAGE-GD, por sus siglas en inglés) , el proceso involucra la activación de un gen de expresión endógeno o la sobreexpresión de un gen por métodos de recombinación in situ. Por ejemplo, la expresión de un gen endógeno se activa o aumenta por integración de una secuencia reguladora en la célula objetivo la cual es capaz de activar la expresión del gen por recombinación no homologa o ilegítima. El ADN objetivo primero se somete a radiación y se inserta un promotor genético. El promotor finalmente localiza una ruptura en la parte frontal de un gen, iniciando la transcripción del gen. Esto resulta en la expresión del péptido o polipéptido que se desea. Se apreciará que estos métodos también se pueden utilizar para generar bibliotecas de expresión del polipéptido FGFR-L comprensivas, las cuales posteriormente se pueden utilizar para el cribado fenotípico de alto rendimiento en diversos ensayos tales como ensayos bioquímicos, ensayos celulares y ensayos de organismos completos (por ejemplo plantas, ratones, etc) .

Síntesis Se apreciará por los expertos en la técnica que las moléculas de ácido nucleico y de polipéptido que se describen en la presente se pueden producir por medios recombinantes y otros medios.

Agentes de Unión Selectivos El término "agente de unión selectivo" se refiere a una molécula que tiene especificidad por uno o más polipéptidos FGFR-L. Los agentes de unión selectivos adecuados incluyen, pero no se limitan a anticuerpos y derivados de los mismos, polipéptidos y moléculas pequeñas.

Se pueden preparar agentes de unión selectivos adecuados utilizando métodos conocidos en la técnica. Un agente de unión selectivo de polipéptido FGFR-L ejemplar de la presente invención es capaz de unirse a cierta porción del polipéptido FGFR-L y de esta manera inhibir la unión del polipéptido a un receptor para el polipéptido FGFR-L. Los agentes de unión selectivos tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se unen a polipéptidos FGFR-L están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden seir policlonales incluyendo policlonales monoespecíficos; monoclonales (Mab, por sus siglas en inglés) ; recombinantes; quiméricos; humanizados tales como el injertado con CDR; humano, de cadena sencilla o biespecíficos; así como fragmentos; variantes o derivados de los mismos. Los fragmentos de anticuerpo incluyen aquellas porciones del anticuerpo que se unen a un epítopo en el polipéptido FGFR-L. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen los fragmentos Fab y F(ab') generados por separación enzimática de anticuerpos de longitud completa. Otros fragmentos de unión incluyen los que se generan por técnicas de ADN recombinante, tales como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones variables de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un polipéptido FGFR-L generalmente se producen en animales (por ejemplo conejos o ratones) por medio de inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales del polipéptido FGFR-L y un adyuvante. Puede ser útil conjugar un polipéptido FGFR-L a una proteína portadora que sea inmunogénica en las especies que se van a inmunizar, tal como hemocianina de lapa de ojo de cerradura, suero, albúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya. Además, se utilizan agentes agregantes tales como alumbre para mejorar la respuesta inmunitaria. Después de inmunización se extrae la sangre de los animales y se realizan ensayos en el suero para determinar el título de anticuerpos contra FGFR-L. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia polípéptidos FGFR-L se producen utilizando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas de células continuas en cultivo. Los ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de hibridoma de Kohier et al . , 1975, Nature 256:495-97 y el método de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor, 1984, J. Immunol . 133:3001; Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51:63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). También se proporcionan por la invención líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con polipéptidos FGFR-L. Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden modificar para uso como sustancias terapéuticas. Una modalidad es un anticuerpo "quimérico" en el cual una porción de la cadena pesada (H, por sus siglas en inglés) o ligera (L, por sus siglas en inglés) es idéntica u homologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas u homologas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de tales anticuerpos, en la medida en que muestren la actividad biológica deseada. Véase la patente de E.U.A. Número 4,816,567; Morrison et al . , 1985, Proc . Nati . Acad. Sci . 85:6851-55. En otra modalidad, un anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo "humanizado" . Los métodos para humanizar anticuerpos que no son humanos son bien conocidos en la técnica. Véanse las patentes de E.U.A. números 5,585,089 y 5,693,762. De manera general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. La humanización se puede realizar, por ejemplo, utilizando métodos que se describen en la técnica (Jones et al . , 1986, Nature, 321:522-25; Riechmann et al . , 1998, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al . , 1988, Science 239:1534-36), al sustituir por lo menos una porción de una región determinadora de complementariedad de roedor (CDR, por sus siglas en inglés) por las regiones correspondientes del anticuerpo humano. También se abarcan por la invención anticuerpos humanos que unen polipéptidos FGFR-L. Utilizando animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces de producir una gama de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena, tales anticuerpos se producen por inmunización con un antígeno polipeptídico FGFR-L (es decir, tienen por lo menos 6 aminoácidos contiguos) , opcionalmente conjugados a un portador. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al . , 1993, Proc . Nati . Acad. Sci . 90:2551-55; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-58; Bruggermann et al . , 1993, Year in Immuno . 7:33. En un método, tales animales transgénicos se producen al incapacitar los loci endógenos que codifican para las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina en el mismo e insertar loci que codifican para las proteínas de cadena pesada y ligera humanas dentro del genoma del mismo. Los animales modificados parcialmente, esto, es aquellos que tienen menos del complemento completo de las modificaciones, después se someten a cruzamiento para obtener un animal que tiene la totalidad de las modificaciones deseadas en el sistema inmunitario. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos con secuencias de aminoácidos humanos (en vez de, por ejemplo, murinos) , incluyendo regiones variables las cuales son inmunoespecíficas para estos antígenos. Véanse las solicitudes PCT números PCT/US96/05928 y PCT/US93/06926. Se describen métodos adicionales en la patente de E.U.A. Número ,545,807, solicitud PCT números PCT/US91/245 y PCT/GB89/01207 y en las Patentes Europeas Números 546073B1 y 546073A1. También se pueden producir anticuerpos humanos por la expresión de ADN recombinante en células huéspedes o por expresión en células de hibridoma como se describe en la presente . En una modalidad alternativa, también se pueden producir anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de exhibición de fago (Hoogenboom et al . , 1991, J. Mol . Biol . 227:381; Marks et al . , 1991 , J. Mol . Biol . 222:581). Este proceso imita la selección inmunitaria mediante la exhibición de repetorios de anticuerpos en la superficie de bacteriófagos filamentosos y la selección subsecuente del fago por su unión a un antígeno de elección. Una de tales técnicas se describe en la solicitud PCT número PCT/US98/17364, la cual describe el aislamiento de anticuerpos de alta afinidad y agonistas funcionales para los receptores MPL- y msk- utilizando tal enfoque. Los anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados típicamente se producen por métodos recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos se introducen en las células huéspedes y se expresan utilizando materiales y procedimientos que se describen en la presente. En una modalidad preferida, los anticuerpos se producen en células huéspedes de mamífero tales como células CHO. Se pueden producir anticuerpos monoclonales (por ejemplo humanos) por la expresión de ADN recombinante en células huéspedes o por expresión en células de hibridoma, como se describe en la presente. Los anticuerpos contra FGFR-L de la invención se pueden utilizar en cualquier método de ensayo conocido, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de interposición directa e indirecta y en ensayos de inmunoprecipitación (Sola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)) para la detección y cuantificación de polipéptidos FGFR-L. Los anticuerpos unirán polipéptidos FGFR-L con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se utilice. Para aplicaciones diagnósticas, en algunas modalidades, los anticuerpos contra FGFR-L se pueden marcar con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radionúclido tal como 3H, 1C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, In o e7Ga; un compuesto fluorescente o quimiolumíniscente tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o peroxidas de rábano (Bayer et al., 1990, Meth. Enz . 184:138-63). Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad de un estándar marcado (por ejemplo un polipéptido FGFR-L o una porción inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de la muestra" de prueba (un polipéptido FGFR-L) por unión con una cantidad limitada de anticuerpo contra FGFR-L. La cantidad de un polipéptido FGFR-L en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar ?a determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos típicamente se insolubulizan antes o después de la competencia, de manera que el estándar y el analito que se unen a los anticuerpos se pueden separar adecuadamente del estándar y analito que permanecen sin unirse. Los ensayos de interposición típicamente involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción ínmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína que se va a detectar o cuantificar. En un ensayo de interposición, el analito de la muestra de prueba típicamente se une a un primer anticuerpo el cual se inmoviliza en un soporte sólido, y posteriormente un segundo anticuerpo se une al analito y de esta manera se forma un complejo insoluble de tres partes. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 4,376,110. El segundo anticuerpo por si mismo puede ser marcado con una porción detectable (ensayos de interposición directa) o bien se puede medir utilizando un anticuerpo contra inmunoglobulina que este marcado con una porción detectable (ensayos de interposición indirecta) . Por ejemplo, un tipo de ensayo de interposición es el ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) , en cuyo caso la porción detectable es una enzima. Los agentes de unión selectivos, que incluyen anticuerpos contra FGFR-L también son útiles para formación de imágenes in vivo . Un anticuerpo marcado con una porción detectable se puede administrar a un animal, preferiblemente en la corriente sanguínea, y en presencia y localización del anticuerpo marcado en el huésped ensayado. El anticuerpo se puede marcar con cualquier porción que sea detectable en un animal, ya sea por resonancia magnética nuclear, radiología u otro medio de detección conocido en la técnica. Los agentes de unión selectivos de la invención incluyen anticuerpos, que se pueden utilizar como sustancias terapéuticas. Estos agentes terapéuticos generalmente son agonistas o antagonistas en la medida en que mejoran o reducen, respectivamente, por lo menos una de las actividades biológicas del polipéptido FGFR-L. En una modalidad, los anticuerpos antagonistas de la invención son anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos los cuales son capaces de unirse específicamente a un polipéptido FGFR-L y los cuales son capaces de inhibir o eliminar la actividad funcional de un polipéptido FGFR-L in vivo o in vi trq. En las modalidades preferidas, el agente de unión selectivo, por ejemplo un anticuerpo antagonista, inhibirá la actividad funcional de un polipéptido FGFR-L en al menos aproximadamente 50%, y de manera preferible en por lo menos aproximadamente 80%. En otra modalidad, el agente de unión selectivo puede ser un anticuerpo contra el polipéptido FGFR-L que sea capaz de interactuar con un asociado de unión del polipéptido FGFR-L (un ligando o receptor) por lo que de esta manera se inhibe o elimina la actividad del polipéptido FGFR-L in vi tro o in vivo . Los agentes de unión selectivos, que incluyen agonistas y antagonistas de los anticuerpos contra el polipéptido FGFR-L, se identifican por ensayos de cribado que son bien conocidos en la técnica. La invención también se relaciona con un equipo que comprende agentes de unión selectivos para FGFR-L (tales como anticuerpos) y otros reactivos útiles para detectar concentraciones de polipéptido FGFR-L en muestras biológicas. Tales reactivos pueden incluir una marca detectable, suero bloqueador, muestras de control positivas y negativas y reactivos de detección.

Microarreglos Se apreciará que se puede utilizar la tecnología de microarreglo de ADN de acuerdo con la presente invención.

Los microarreglos de ADN son arreglos en miniatura de alta densidad de ácidos nucleicos que se colocan sobre un soporte sólido tal como vidrio. Cada celda o elemento dentro del arreglo contiene muchas copias de una sola especie de ácido nucleico que actúa como un objetivo para hibridación con una secuencia complementaria de ácido nucleico (por ejemplo ARNm) . En la expresión que establece el perfil utilizando la tecnología de microarreglo de ADN, se extrae primero ARNm de una célula o muestra de tejido y después se convierte enzimáticamente a ADNc marcado fluorescentemente. Este material se hibridiza al microarreglo y se elimina por lavado en ADNc que no se ha unido. La expresión de genes separados representados en el arreglo después se visualiza al cuantificar la cantidad de ADNc marcado que se une específicamente a cada molécula de ácido nucleico objetivo. De esta manera, se puede cuantificar la expresión de miles de genes con alto rendimiento y en paralelo a partir de una sola muestra de material biológico. Esta determinación de perfil de expresión de alto rendimiento tiene una amplia gama de aplicaciones con respecto a las moléculas FGFR-L de la invención que incluye, pero que no se limita a: la identificación y validación de genes relacionados con enfermedad de FGFR-L como objetivos para sustancias terapéuticas; toxicología molecular de moléculas de FGFR-L relacionadas e inhibidores de las mismas; estratificación de poblaciones y generación de marcadores asociados para ensayos clínicos; y mejoramiento del descubrimiento de medicamentos de moléculas pequeñas polipeptídicas de FGFR-L relacionadas al ayudar en la identificación de compuestos selectivos en cribados de alto rendimiento .

Derivados Químicos Los derivados modificados químicamente de los polipéptidos FGFR-L se pueden preparar por un experto en la técnica, dada la descripción que se presenta aquí. Los derivados del polipéptido FGFR-L se modifican de manera que sean diferentes - ya sea en el tipo de ubicación de las moléculas unidas naturalmente al polipéptido. Los derivados pueden incluir moléculas que se formen por la supresión de uno o más grupos químicos unidos de manera natural . El polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 u otro polipéptido de FGFR-L se pueden modificar por unión covalente de uno o más polímeros. Por ejemplo, el polímero seleccionado típicamente es hidrosoluble de manera que la proteína a la cual se une no precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Se incluye dentro del alcance de los polímeros adecuados las mezclas de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Cada uno de los polímeros puede ser de cualquier peso molecular y pueden estar ramificados o sin ramificar. Cada uno de los polímeros típicamente tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones del polímero hidrosoluble, algunas moléculas tendrán mayor peso, algunas menos que el peso molecular indicado) . El peso molecular promedio de cada polímero preferiblemente está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, de manera más preferible entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa, y de manera mucho más preferible entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa. Los polímeros hidrosolubles adecuados o mezclas de los mismos incluyen, pero no se limitan a carbohidratos unidos en N o unidos en Ot azúcares, fosfatos, polietilenglicol (PEG) (que incluye las formas de PEG que se han utilizado para formar derivados de proteínas que incluyen monoalcoxi de 1 a 10 átomos de carbono- o ariloxi-polietilenglicol) , monometoxipolietilenglicol, dextrano (tal como el dextrano de peso molecular bajo de, por ejemplo, aproximadamente 6 kD) , celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli- (N-vinilpirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles " polioxietilados (por ejemplo glicerol) y alcohol polivinílico. También se abarcan por la presente invención moléculas de reticulación bifuncionales las cuales se pueden utilizar para preparar multímeros de polipéptido FGFR-L unidos covalentemente. En general, la formación química de derivados se puede llevar a cabo bajo cualquier condición adecuada utilizada para hacer reaccionar una proteína con una molécula polimérica activada. Los métodos para preparar derivados químicos de polipéptidos generalmente comprenderán las etapas de: (a) hacer reaccionar el polipéptido con una molécula polimérica activada (tal como un éster reactivo o un derivado aldehido de la molécula polimérica) bajo condiciones por las cuales el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 u otro polipéptido FGFR-L, se adhiera a una o más moléculas de polímero y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán en base en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación de moléculas de polímero respecto a la proteína, mayor será el porcentaje de molécula polimérica unida. En una modalidad, el derivado del polipéptido FGFR-L puede tener una única porción de molécula polimérica en la parte amino terminal. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 5,234,784. La pegilación (formación de un derivado de polietilenglicol) de un polipéptido se puede llevar a cabo específicamente utilizando cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica. Tales reacciones se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Francis et al . , 1992, Focus on Growth Factors 3:4-10; Patentes Europeas Números 0154316 y 0401384; y patente de E.U.A. número 4,179,337. Por ejemplo, la pegilación se puede llevar a cabo por medio de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilenglicol (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo) , como se describe en la presente. Para las reacciones de acilación, un polímero seleccionado debe tener un único grupo éster reactivo. Para alquilación reductiva, un polímero seleccionado debe tener un único grupo aldehido reactivo. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, polietilenglicolpropionaldehído, el cual es termoestable o derivados monoalcoxi de 1 a 10 átomos de carbono o ariloxi de los mismos (véase la patente de E.U.A. número 5,252,714). En una modalidad, los polipéptidos FGFR-L se pueden acoplar químicamente a biotina. Las moléculas de biotina/polipéptido FGFR-L después se permite que se unan a avidina, lo que resulta en moléculas tetravalentes de avidina/biotina/polipéptido FGFR-L. Los polipéptidos FGFR-L también se pueden acoplar covalentemente a dinitrofenol (DNP, por sus siglas en inglés) o trinitrofenol (TNP, por sus siglas en inglés) y los conjugados resultantes se precipitan con IgM contra DNP o contra TNP para formar conjugados decaméricos con una valencia de 10. Generalmente las condiciones que pueden aliviar o modular la administración de los presentes derivados de polipéptido FGFR-L incluyen los que se describen en la presente para polipéptidos FGFR-L. Sin embargo, los derivados polipeptídicos de FGFR-L descritos en la presente pueden tener actividades adicionales, actividad biológica aumentada o reducida, u otras características tales como una duración media aumentada o disminuida, en comparación con las moléculas que no forman derivados.

Animales No Humanos Sometidos A Ingeniería Genética Incluidos adicionalmente dentro del alcance de la presente invención están los animales no humanos tales como ratones, ratas y otros roedores; conejos, chivos, borregos u otros animales de granja en los cuales se han anulado los genes que codifican para el polipéptido FGFR-L nativos (es decir, "se ha anulado la expresión del gen") de manera que el nivel de expresión del polipéptído FGFR-L disminuye de manera significativa o queda abolida por completo. Tales animales se pueden preparar utilizando técnicas y métodos tales como los descritos en la patente de E.U.A. número 5,557,032. La presente invención incluye además animales no humanos tales como ratones, ratas u otros roedores, conejos, chivos, ovejas u otros animales de granja en los cuales ya sea la forma nativa de un gen para FGFR-L para ese animal o bien un gen para FGFR-L heterólogo se sobreexpresa por el animal, por lo que se genera un animal "transgénico". Tales animales transgénicos se pueden preparar utilizando métodos bien conocidos tales como los que se describen en la patente de E.U.A. Número 5,489,743 y publicación PCT Número WO 94/28122. La presente invención incluye además animales no humanos en los cuales el promotor de uno o más de los polipéptidos FGFR-L de la presente invención se activa o inactiva (por ejemplo mediante la utilización de métodos de recombinación homologa) par alterar el nivel de expresión de uno o más de los polipéptidos FGFR-L nativos. Estos animales no humanos se pueden utilizar para cribado de medicamentos candidato. En tal cribado, se puede medir el impacto de un medicamento candidato en el animal . Por ejemplo, los medicamentos candidato pueden disminuir o aumentar la expresión del gen para FGFR-L. En algunas modalidades, se puede medir la cantidad del polipéptido FGFR-L que se produce después de la exposición del animal al medicamento candidato. Adicionalmente, en algunas modalidades, se puede detectar el impacto real del medicamento candidato en el animal. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen particular puede resultar o se puede asociar con una enfermedad o condición patológica. En tales casos, uno puede probar la capacidad del medicamento candidato para disminuir la expresión del gen o su capacidad para evitar o inhibir una condición patológica. En otros ejemplos, la producción de un producto metabólico particular tal como un fragmento de un polipéptido puede resultar o asociarse con una enfermedad o condición patológica. En tales casos uno puede probar la capacidad del medicamento candidato para disminuir la producción de tal producto metabólico o su capacidad para evitar o inhibir una condición patológica.

Ensayo para Otros Moduladores de la Actividad del Polipéptido FGFR-L En algunos casos se puede desear identificar moléculas que son moduladores, es decir agonistas o antagonistas de la actividad del polipéptido FGFR-L. Las moléculas naturales o sintéticas que modulan el polipéptido FGFR-L se pueden identificar utilizando uno o más ensayos de cribado, tales como los descritos en la presente. Estas moléculas se pueden administrar ya sea ex vivo o in vivo por inyección o por suministro oral, un dispositivo de implantación o similar. El término "molécula de prueba" se refiere a una molécula que se encuentra bajo evaluación para determinar su capacidad para modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad de un polipéptido FGFR-L. Más comúnmente, una molécula de prueba interactuará directamente con un polipéptido FGFR-L. Sin embargo, también se contempla que una molécula de prueba también puede modular indirectamente la actividad del polipéptído FGFR-L, por ejemplo al alterar la expresión del gen para FGFR-L o al unirse a un asociado de unión del polipéptido FGFR-L (por ejemplo receptor o ligando) . En una modalidad, una molécula de prueba se unirá a un polipéptido FGFR-L con una afinidad constante de por lo menos aproximadamente 10"SM, de manera preferible, aproximadamente 10_8M, de manera más preferible aproximadamente 10"9M, e incluso de manera más preferible aproximadamente 10"10M. Los métodos para identificar compuestos que interactúan con los polipéptidos FGFR-L están abarcados por la presente invención. En algunas modaliddes, se incuba un polipéptido FGFR-L con una molécula de prueba bajo condiciones que permiten la interacción de la molécula de prueba con un polipéptido FGFR-L y se mide el grado de interacción. La molécula de prueba puede ser cribada en una forma sustancialmente purificada o en una mezcla cruda. En algunas modalidades, un agonista o antagonista del polipéptido FGFR-L puede ser una proteína, péptido, carbohidrato, lípido o molécula con peso molecular pequeño que interactúa con el polipéptido FGFR-L para regular su actividad. Las moléculas que regulan la expresión del polipéptido FGFR-L incluyen ácidos nucleicos que son complementarios a ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido FGFR-L o que son complementarios a secuencias de ácido nucleico las cuales dirigen o controlan la expresión del polipéptido FGFR-L y las cuales actúan como reguladores de expresión antisentido. Una vez que se ha identificado una molécula de prueba como interactuante con un polipéptido FGFR-L, la molécula puede ser evaluada adicionalmente para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la actividad del polipéptido FGFR-L. La medición de la interacción de una molécula de prueba con el polipéptido FGFR-L se puede llevar a cabo en varios formatos que incluyen ensayos de unión basados en célula, ensayos de unión de membrana, ensayos en fase en solución e inmunoensayos. En general, una molécula de prueba se incuba con un polipéptido FGFR-L por un período de tiempo especificado, y se determina la actividad de polipéptido FGFR-L por uno o más ensayos para medi actividad biológica. La interacción de las moléculas de prueba con lo polipéptidos FGFR-L también se puede ensayar directament utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales en u inmunoensayo. Alternativamente, se pueden utilizar e solución e inmunoenayos formas modificadas de polipéptido FGFR-L que contengan etiquetas de epítopo como se describ en la presente. En el caso en el que los polipéptidos FGFR-muestren actividad biológica por medio de interacción con u asociado de unión (por ejemplo un receptor o un ligando) , s pueden utilizar diversos ensayos in vitro para medir l unión de un polipéptido FGFR-L al asociado de unió correspondiente (tal como un agente de unión selectivo receptor o ligando) . Estos ensayos se pueden utilizar par cribar moléculas de prueba para determinar su capacidad par aumentar o disminuir la velocidad o el grado de unión de u polipéptido FGFR-L a su asociado de unión. En un ensayo, s inmoviliza un polipéptido FGFR-L en los pozos de una plac de microtitulación. Después se pueden agregar el asociado d unión del polipéptido FGFR-L radiomarcado (por ejempl asociado de unión de polipéptido FGFR-L yodado) y l molécula de prueba, ya sea uno a la vez (en cualquier orden o simultáneamente a los pozos. Después de la incubación, los pozos se lavan y se realiza determinación de radioactividad utilizando un contador de centelleo para determinar el grado con el cual el asociado de unión se ha unido al polipéptido FGFR-L. Típicamente, una molécula se probará sobre un intervalo de concentraciones y se pueden utilizar una serie de pozos de control que carecen de uno o más elementos de los ensayos de prueba para precisión en la evaluación de los resultados. Una alternativa a este método involucra invertir las "posiciones" de las proteínas, es decir, inmovilizar al asociado de unión del polipéptido FGFR-L a los pozos de las placas de microtitulación, incubar con la molécula de prueba y el polipéptido FGFR-L radiomarcado y determinar el grado de unión del polipéptido FGFR-L. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 18 (Ausubel et al . , eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1995). Como una alternativa al radiomarcado, un polipéptido FGFR-L o su asociado de unión se pueden conjugar a biotina, y después se puede detectar la presencia de la proteína biotinada utilizando estreptavidina unida a una enzima, tal como peroxidasa de rábano, (HRP, por sus siglas en inglés) o fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) , las cuales se pueden detectar colorimétricamente, o por etiquetado fluorescente de estreptavidina. También se puede utilizar un anticuerpo dirigido a un polipéptido FGFR- L o a un asociado de unión del polipéptido FGFR-L y el cual esté conjugado a biotina, con propósito de detección después de la incubación del complejo con estreptavidina unida a enzima, unido a AP o HRP. También se pueden inmovilizar un polipéptido FGFR- L o un asociado de unión del polipéptido FGFR-L por unión a esferas de agarosa, esferas acrílicas u otros tipos de tales sustratos en fase sólida inertes. El complejo sustrato-proteína se puede colocar en una solución que contenga la proteína complementaria y el compuesto de prueba. Después de incubación, las esferas se pueden precipitar por centrifugación y se puede determinar la cantidad de unión entre un polipéptido FGFR-L y su asociado de unión utilizando los métodos que se describen en la presente. Alternativamente, el complejo sustrato-proteína se puede inmovilizar en una columna con la molécula de prueba y la proteína complementaria pasa a través de la columna. Después se puede determinar la formación de un complejo entre un polipéptido FGFR-L y su asociado de unión utilizando cualquiera de las técnicas que se describen en la presente (por ejemplo, radiomarcado o unión de anticuerpo) . Otro ensayo in vi tro que es útil para identificar una molécula de prueba que aumenta o disminuye la formación de un complejo entre una proteína de unión de polipéptido FGFR-L y un asociado de unión del polipéptido FGFR-L es el sistema detector de resonancia de plasmón de superficie tal como el sistema de ensayo BIAcore (Pharmacia, Piscataway, NJ) . El sistema BIAcore se utiliza como lo especifica el fabricante. Este ensayo involucra esencialmente la unión covalente ya sea del polipéptido FGFR-L o un asociado de unión del polipéptido FGFR-L a un chip detector recubierto con dextrano que se localiza en un detector. El compuesto de prueba y la otra proteína complementaria después se inyectan, simultánea o secuencialmente, dentro de la cámara que contiene el chip detector. Se puede determinar la cantidad de proteína complementaria que se une en base en el cambio en la masa molecular que se relaciona físicamente con el lado recubierto con dextrano del chip detector, con el cambio en la masa molecular que se mide por el sistema detector. En algunos casos puede ser deseable evaluar dos o más compuestos de prueba juntos para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la formación de un complejo entre un polipéptido FGFR-L y un asociado de unión del polipéptido FGFR-L. En estos, casos, los ensayos que se establecen en la presente se pueden modificar con facilidad al agregar el o los compuestos de prueba adicionales ya sea de manera simultánea o subsecuente al primer compuesto de prueba. El resto de las etapas en el ensayo son como se establecen en la presente.

Los ensayos in vi tro tales como los que se describen en la presente se pueden utilizar ventajosamente para cribar grandes cantidades de compuestos para determinar un efecto en la formación de un complejo entre un polipéptido FGFR-L y un asociado de unión del polipéptido FGFR-L. Los ensayos pueden ser automatizados para cribar compuestos generados en exhibición de fago, péptidos sintéticos y bibliotecas de síntesis química. Los compuestos que aumenten o disminuyan la formación de un complejo entre un polipéptido FGFR-L y un asociado de unión del polipéptido FGFR-L también se pueden cribar en un cultivo celular utilizando células y líneas celulares que expresen el polipéptido FGFR-L o el asociado de unión del polipéptido FGFR-L. Las células y líneas celulares se pueden obtener de cualquier mamífero, pero preferiblemente serán de fuente humana o de otro primate, canino o roedor. Se evalúa la unión de un polipéptido FGFR-L a células que expresan el asociado de unión del polipéptido FGFR-L en la superficie, en presencia o ausencia de las moléculas de prueba y se puede determinar el grado de unión, por ejemplo, por citometría de flujo utilizando un anticuerpo biotinado contra un asociado de unión del polipéptido FGFR-L. Los ensayos de cultivo celular se pueden utilizar provechosamente para evaluar adicionalmente compuestos que den un resultado positivo en los ensayos de unión de proteína que se describen en la presente. Los cultivos celulares también se pueden utilizar para determinar el impacto de un medicamento' candidato. Por ejemplo, los medicamentos candidato pueden disminuir o aumentar la expresión del gen para FGFR-L. En algunas modalidades la cantidad de polipéptido FGFR-L o de un fragmento del polipéptido FGFR-L que se produce se puede medir después de la exposición del cultivo celular al medicamento candidato. En algunas modalidades, se puede detectar el impacto real del medicamento candidato sobre el cultivo celular. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen particular puede tener un impacto particular sobre el cultivo celular. En tales casos, uno puede probar la capacidad del medicamento candidato para aumentar o "disminuir la expresión del gen o su capacidad para evitar o inhibir un impacto particular en el cultivo celular. En otros ejemplos, la producción de un producto metabólico particular tal como un fragmento de un polipéptido puede resultar o estar asociado con una enfermedad o con una condición patológica. En tales casos uno puede probar la capacidad del medicamento candidato para disminuir la producción de tal producto metabólico en un cultivo celular.

Proteínas Internalizantes Se puede utilizar la secuencia de la proteína tat (de VIH) para internalizar proteínas en una célula. Véase, por ejemplo Falwell et al . , 1994, Proc . Nati . Acad. Sci . U. S.A . 91:664-68. Por ejemplo, se ha descrito una secuencia de 11 aminoácidos (Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9) de la proteína tat VIH (denominada la "proteína de dominio de transducción" o TAT PDT) como un elemento que media el suministro a través de la membrana citoplásmica y la membrana nuclear de una célula. Véase Schwarze et al . , 1999, Science 285 : 1569-72; y Nagahara et al . , 1998, Nat . Med. 4:1449-52. En estos procedimientos se preparan plásmidos recombinantes conjugados con FITC (G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-; marcado con. FITC SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10), los cuales penetran tejidos después de administración intraperitoneal, y se detecta la unión de tales plásmidos recombinantes a las células mediante análisis de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) . Las células tratadas con la proteína de fusión tat-ß-gal mostrarán actividad ß-gal. Después de la inyección se puede detectar la expresión de tal plásmido recombinante en muchos tejidos que incluyen hígado, riñon, pulmón, corazón y tejido cerebral. Se considera que tales plásmidos recombinantes experimentan cierto grado de desnaturalización con el fin de entrar a la célula y, como tal, puede requerir renaturalización después de entrar a la célula. Por lo tanto, se apreciará que la secuencia de la proteína tat se puede utilizar para 'internalizar un polipéptido deseado a una célula. Por ejemplo, utilizando la secuencia de proteína tat, se puede administrar intracelularmente un antagonista de FGFR-L (tal como un agente de unión selectivo contra FGFR-L, una molécula pequeña, un receptor soluble o un oligonucleótido antisentido) para inhibir la actividad de la molécula FGFR-L. Como se utiliza en la presente, el término "molécula FGFR-L" se refiere tanto a moléculas de ácido nucleico para FGFR-L como a polipéptidos FGFR-L como se definen en la presente. Cuando se desee, la proteína misma de FGFR-L también se puede administrar internamente a una célula que utilice estos procedimientos. Veáse también Straus, 1999, Science 285:1466-67.

Identificación de la Fuente Celular Utilizando el Polipéptido FGFR-L De acuerdo con algunas modalidades de la invención, puede ser útil poder determinar la fuente de algún tipo de célula relacionada con un polipéptido FGFR-L. Por ejemplo, puede ser útil determinar el origen de una enfermedad o condición patológica como un auxiliar en la selección de una terapia adecuada. En algunas modalidades se pueden utilizar ácidos nucleicos que codifiquen para un polipéptido FGFR-L como una sonda para identificar células descritas en la presente por cribado de los ácidos nucleicos de las células con tal sonda. En otras modalidades se pueden utilizar anticuerpos contra el polipéptido FGFR-L para hacer pruebas para determinar la presencia del polipéptido FGFR-L en células y de esta manera determinar si tales células son de los tipos que se describen aquí .

Composiciones de Polipéptidos FGFR-L y Administración de las mismas Las composiciones terapéuticas están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones farmacéuticas de polipéptido FGFR-L pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGFR-L o una molécula de ácido nucleico para FGFR-L mezclada con un agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable que se selecciona por lo adecuado para el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes de unión selectivos de polipéptido FGFR-L en mezcla con un agente de formulación aceptable farmacéutica o fisiológicamente que se selecciona por lo adecuado con el modo de administración. Los materiales de formulación aceptables preferiblemente son no tóxicos al receptor a las dosificaciones y concentraciones utilizadas. _ La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) sustancias antimicrobianas, antioxidantes (tales como ácidos ascórbico, sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) , amortiguadores (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) , agentes de volumen (tales como manitol o glicina) , agentes quelantes (tales como ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) ) , agentes que forman complejos (tales como cafeína, polivinilpírrolidona, ß-ciclodextrina o hidroxipropil-ß-ciclodextrina) , rellenos, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, ma osa o dextrinas) , proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas) , agentes colorantes, saborizantes y diluyentes, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona) , polipéptidos de peso molecular bajo, contraiones formadores de sal (tales como sodio) , conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácidos salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) , solventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol) alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol) , agentes que mejoran la suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics; PEG; esteres de sorbitano; polisorbatos tales como Polysorbate 20 o Polysorbate 80; Tritón; trometamina; lecitina; colesterol o Tyloxapal) , agentes que mejoran la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes que mejoran la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino -preferiblemente cloruro de sodio o de potasio- o manitol sorbitol) , vehículos de suministro, diluyentes, excipientes o adyuvantes farmacéuticos. Véase Remington ' s Pharmceutical Sciences (18th Ed. , A.R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company 1990. La composición farmacéutica óptima estará determinada por un experto en la técnica en base, por ejemplo en la vía de administración deseada, el formato de suministro y la dosificación que se desee. Véase, por ejemplo Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra . Tales composiciones pueden influir en _ el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo de la molécula FGFR-L. El vehículo primario o portador en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente enriquecido con otros materiales habituales en composiciones para administración parenteral. La solución salina amortiguada neutra o la solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéutica ejemplares comprenden amortiguador Tris de pH aproximadamente 7.0-8.5 o amortiguador acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, el cual puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado, en una modalidad de la presente invención, las composiciones de polipéptido FGFR-L se pueden preparar por almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tenga el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, el producto de polipéptido FGFR-L se puede formular como un liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa. Las composiciones farmacéutica de polipéptido FGFR-L se pueden seleccionar para suministro parenteral . Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para inhalación o suministro a través del tracto digestivo, por ejemplo por vía oral. Las preparaciones de tales composiciones farmacéuticamente aceptables están dentro de la habilidad de la técnica. Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo se utilizan amortiguadores para mantener la composición a pH fisiológico o un pH ligeramente menor, habitualmente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende la molécula deseada de FGFR-L en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual se formula la molécula de FGFR-L como una solución isotónica estéril conservada adecuadamente . Otra preparación puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , esferas o liposomas que proporcionen liberación controlada o sostenida del producto el cual se puede suministrar después por medio de una inyección de deposición. También se puede ' utilizar ácido hialurónico, y este puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otro medio adecuado para la introducción de la molécula deseada incluye dispositivos implantables para el suministro del medicamento . En una modalidad, se puede formular una composición farmacéutica para inhalación. Por ejemplo, el polipéptido FGFR-L se puede formular como un polvo seco para inhalación. Las soluciones para inhalación del polipéptido FGFR-L o de moléculas de ácido nucleico también se pueden formular con un propelente para suministro en aerosol. En otra modalidad adicional, las soluciones pueden ser nebulizadas. La administración pulmonar se describe adicionalmente en PCT publicación No. WO 94/20069, la cual describe el suministro pulmonar de proteínas modificadas químicamente . También se contempla que algunas formulaciones se puedan administrar por vía oral. En una modalidad de la presente invención, los polipéptido FGFR-L que se administran de esta manera se pueden formular con o sin los portadores utilizados habitualmente en la elaboración de compuestos en forma de dosificación sólida tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, se puede diseñar una cápsula para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el que se maximiza la biodisponibilidad en el tracto gastrointestinal y se minimiza la degradación presistémica. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción del polipéptido FGFR-L. También se pueden utilizar diluyentes, saborizantes, ceras con temperatura de fusión baja, aceites vegetales, lubricantes, agentes que mejoren la suspensión, agentes desintegrantes de comprimidos y aglutinantes. Otra composición farmacéutica puede involucrar una cantidad eficaz de los polipéptido FGFR-L en una mezcla con excipientes no tóxicos que sean adecuados para la elaboración de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, se pueden preparar soluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes de unión tales como almidón, gelatina o goma acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales del polipéptido FGFR-L serán evidentes para aquellos expertos en la técnica e incluyen formulaciones que involucran polipéptidos FGFR-L en formulaciones de suministro sostenido o controlado. Las técnicas para formulación de diversos medios de suministro sostenido o controlado tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables o esferas porosas e inyecciones de deposición también se conocen por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, PCT/US93/00829, la cual describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (Patente de E.U.A. No. 3,773,919 y Patente Europea No. 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato (Sidman et al . , 1983, Biopolymers 22:547-56), poli (2 -hidroxetil-metacrilato) , acetato de vinil etileno (Langer et al . , 1981, J. Biomed. Mater. Res . 15:167-277 y Langer, 1982, Chem, Tech . 12:98-105) o ácido poli-D(- ) -3 -hidroxibutírico (Patente Europea No. 133988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas los cuales se pueden preparar por cualquiera de 'varios métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Eppstein et al . , 1985, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 82:3688-92; y las Patentes Europeas Nos. 036676, 088046 y 143949.

La composición farmacéutica de FGFR-L para s utilizada en administración in vivo habitualmente debe s estéril. Esta se puede llevar a cabo por filtración a trav de membranas de filtración estéril . La composición liofiliza, se esteriliza utilizando este método y se pue llevar a cabo ya sea antes de o después de la liofilizaci y reconstitución. La composición para administraci parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en u solución. Además, las composiciones parenteral generalmente se colocan en un recipiente que tiene orificio de acceso estéril, por ejemplo una bolsa solución intravenosa o un frasco que tiene un tap perforable por una aguja para inyección hipodérmica. Una vez que se ha formulado la composici farmacéutica, se puede almacenar en frascos estériles co una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenar en una forma lista para usarse o en u forma (por ejemplo liofilizada) que requiere reconstituci antes de su administración. En una modalidad específica, la presente invenci se relaciona con equipos para producir una unidad administración de una sola dosis. Cada uno de los equip puede contener un primer envase que tiene una proteína se y un segundo envase que tiene una formulación acuos También se incluye dentro del alcance de esta invención equipos que contienen jeringas llenadas previamente de cámara sencilla o cámaras múltiples (por ejemplo jeringas de líquidos y lisojeringas) . La cantidad eficaz de una composición farmacéutica de FGFR-L que se va a utilizar terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Una persona experta en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para tratamiento variarán en base, en parte, de la molécula que se suministra, la indicación para la cual se utiliza la molécula de FGFR-L, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y condición (edad y salud general) del paciente. En consecuencia, el médico puede adecuar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación habitual puede variar de aproximadamente 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, en base en los factores mencionados antes. En otxas modalidades, la dosificación puede variar de 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula de FGFR-L en la formulación que se utilice. Habitualmente, el médico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que proporcione el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una dosis única, o bien como dos o más dosis (las cuales pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) con respecto al tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implantación o catéter. Un ajuste adicional de la dosificación apropiada se puede realizar de manera habitual por aquellos que comúnmente son expertos en la técnica y que está dentro del ámbito de las tareas realizadas habitualmente por los mismos. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante el uso de datos apropiados de dosis y respuesta. La vía de administración de la composición farmacéutica concuerda con métodos conocidos, por ejemplo por vía oral, por medio de inyección por vía intravenosa, íntraperitonial, intracerebral (dentro del parénquima), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida; o por dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones se pueden administrar por inyección en bolo o continuamente por infusión o por un dispositivo de implantación. De manera alternativa o adicional, la composición se puede administrar local vía implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo de puede implantar en cualquier tej ido u órgano adecuado y el suministro de la molécula deseada puede ser por difusión, inyección rápida de liberación sincronizada o administración continua. En algunos casos puede ser deseable utilizar composiciones farmacéuticas del polipéptido FGFR-L de una manera ex vivo . En tales casos, las células, tejidos u órganos que se han extraído del paciente se exponen a las composiciones farmacéuticas del polipéptido FGFR-L después de los cuales las células, tejidos u órganos se implantan subsecuentemente de nuevo al paciente. En otros casos se puede suministrar un polipéptido FGFR-L al implantar ciertas células que han sido sometidas a ingeniería genética, utilizando métodos tales como los descritos en la presente para expresar y secretar el polipéptido FGFR-L. Tales células pueden ser células de animal o de humano, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogeneicas . Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Para disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, las células se pueden encapsular para evitar infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación típicamente son recintos poliméricos semipermeables biocompatibles o membranas que permiten la liberación de el o los productos proteínicos pero que evitan la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores dañinos de los tejidos circundantes. Como se discute en la presente, puede ser deseable tratar poblaciones de células aisladas (tales como hemocitoblastos, linfocitos, eritrocitos, condrocitos, neuronas y similares) con uno o más polipéptidos FGFR-L. Esto se puede llevar a cabo al exponer las células aisladas al polipéptido directamente, en donde se encuentra una forma que es permeable para la membrana celular. Las modalidades adicionales de la presente invención se relacionan con células y métodos (por ejemplo métodos de producción de recombinación homologa o producción recombinante) , tanto para la producción in vi tro de polipéptidos terapéuticos o para la producción y suministro de polipéptidos terapéuticos por terapia de genes o por terapia celular. Los métodos homólogos u otros métodos de recombinación se pueden utilizar para modificar una célula que contenga un gen FGFR-L que normalmente no se manifiesta transcripcionalmente, o un gen subexpresado y de esta manera producir una célula que exprese cantidades terapéuticamente eficaces de polipéptido FGFR-L. La recombinación homologa es una técnica desarrollada originalmente para dirigir genes para inducir o corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos. Kucherlapati, 1989, Prog. in Nucí . Acid Res. & Mol . Biol . 36:301. La técnica básica se desarrolló como un método para introducir mutaciones específicas dentro de regiones específicas de un genoma de mamífero (Thomas et al . , 1986, Cell 44:419-28; Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503-12; Doetschman et al . , 1988, Proc . Nati . Acad. Sci . U. S. A . 85:8583-87) o para corregir mutaciones específicas dentro de genes defectuosos (Doetschman et al . , 1987, Nature 330:576-78) . Las técnicas de recombinación homologa ejemplares se describen en la Patente de E.U.A. No. 5,272,071; las Patentes Europeas Nos. 9193051 y 505500; PCT/US90/07642 y Publicación PCT No. WO 91/09955) . Mediante recombinación homologa, la secuencia de ADN que se va a insertar en el genoma se puede dirigir a una región específica del gen de interés al unirlo a ADN dirigido. El ADN dirigido es una secuencia nucleotídica que es complementaria (homologa) a una región del ADN genómico. Se ponen en contacto piezas pequeñas de ADN dirigido que son complementarias a una región específica del genoma, con una cadena original, durante el proceso de replicación de ADN. Una propiedad general del ADN que se ha insertado en una célula es que hibridiza, y por lo tanto se recombina con otras piezas de ADN endógeno mediante regiones homologas compartidas. Si esta cadena complementaria se une a un oligonucleótido que contenga una mutación o una secuencia diferente o bien un nucleótido adicional, también se incorpora dentro de la cadena recién sintetizada como resultado de la recombinación. Como un resultado de la función de verificación de lectura, es posible que la nueva secuencia de ADN sirva como la plantilla. Así, el ADN transferido se incorpora en el genoma. Unido a estas piezas de ADN dirigido estas regiones de ADN que pueden interactuar o controlar la expresión de un polipéptido FGFR-L, por ejemplo secuencias flanqueantes. Por ejemplo, un elemento promotor/mejorador, un supresor o un elemento modulador de transcripción hexógena se inserta en el genoma de la célula huésped diseñada en proximidad y orientación suficiente para alterar la transcripción de ADN que codifica para el polipéptido FGFR-L deseado . El elemento de control controla una porción del ADN presente en el genoma de la célula huésped. De esta manera, se puede obtener la expresión del polipéptido FGFR-L deseado no por transfección del ADN que codifica el gen para FGFR-L mismo, sino más bien mediante el uso de ADN dirigido (que contiene regiones de homología con el gen endógeno de interés) acoplado con segmentos reguladores de ADN que proporcionan la secuencia del gen endógeno con señales reconocibles para transcripción de un gen para FGFR-L.

En un método ejemplar, la expresión de un gen dirigido deseado en una célula (es decir, un gen celular endógeno deseado) se altera por medio de recombinación homologa en el genoma celular en el sitio seleccionado previamente por la introducción de ADN el cual incluye por lo menos una secuencia reguladora, un exon y un sitio donador de maduración (corte y empalme) . Estos componentes se introducen en el ADN cromosómico (genómico) de manera tal que esto en efecto, resulta en la producción de una nueva unidad de transcripción (en la cual la secuencia reguladora, el exon y el sitio donador de maduración presente en el plásmido recombinante de ADN se unen operativamente al gen endógeno) . Como un resultado de la. introducción de estos componentes en el ADN cromosómico, se altera la expresión del gen endógeno deseado. La expresión del gen alterado, como se describe en la presente, abarca la activación (o se provoca que se exprese) un gen el cual normalmente no se expresa en la célula tal y como se obtiene, así como aumento de la expresión de un gen el cual no se expresa a niveles fisiológicamente significativos en la célula, como se obtiene. Las modalidades abarcan además cambio en el patrón de regulación o inducción de manera que es diferente del patrón de regulación o inducción que se presenta en la célula tal y como se obtiene, y reduce (e incluso elimina) la expresión de un gen el cual se expresa en la célula tal y como se obtiene. Un método mediante el cual se puede utilizar la recombinación homologa para aumentar o provocar la producción de polipéptido FGFR-L a partir del gen para FGFR-L endógeno de la célula involucra primero el utilizar recombinación homologa para colocar una secuencia de recombinación desde un sistema de recombinación específico de sitio (por ejemplo Cre/loxP, FLP/FRT) (Sauer, 1994, Curr, Opin . Biotechnol . , 5:521-27; Sauer, 1993, Methods Enzymol . , 225:890-900) hacia el extremo 5' de la región que codifica para el polipéptido FGFR-L genómico endógeno de la célula. Un plásmido que contiene un sitio de recombinación homólogo al sitio que se coloca justo hacia el extremo 5' de la región que codifica para el polipéptido FGFR-L genómico se introduce dentro de la línea de células modificadas junto con la enzima recombinasa apropiada. Esta recombinasa provoca que el plásmido se integre, por medio del sitio de recombinación del plásmido, dentro del sitio de recombinación justo hacia el extremo 5' de la región codificante del polipéptido FGFR-L genómico en la línea celular (Baubonis and Sauer, 1993, Nucleic Acids Res . 21:2025-29; O ' Gorman et al . , 1991, Science 251:1351-55). Cualquier secuencia flanqueante que se sepa que aumenta la transcripción (por ejemplo un mejorador/promotor, intrón, mejorador traduccional) , si se coloca apropiadamente en est plásmido, se integrará de manera tal que genera una unida transcripcional nueva o modificada qué resulte en un producción de novo o aumentada del polipéptido FGFR-L partir del gen FGFR-L endógeno de la célula. Un método adicional para utilizar la línea celula en la cual se ha colocado la secuencia de recombinació específica de sitio justo hacia el extremo 5' de la regió codificante para el polipéptido FGFR-L genómico endógeno d la célula es utilizar recombinación homologa para introduci un segundo sitio de recombinación en otra parte en el genom de la línea celular. Después se introduce la enzim recombinasa apropiada dentro de la línea celular con do sitios de recombinación, lo que provoca un fenómeno d recombinación (supresión, inversión y cambio de lugar (Sauer, 1994, Curr. Opin . Biotechnol . , 5:521-27; Sauer 1993, Methods Enzymol . , 225:890-900), que puede generar un unidad transcripcional nueva o modificada que resulta en l producción de novo o aumentada del polipéptido FGFR-L partir del gen endógeno de la célula para FGFR-L. Una solución adicional para aumentar o provocar l expresión del polipéptido FGFR-L a partir del gen endógen de la célula para FGFR-L involucra aumentar o provocar l expresión del gen o genes (por ejemplo factores d transcripción) o bien disminuir la expresión de un gen genes (por ejemplo represores transcripcionales) de una manera la cual resulta en la producción de novo o aumentada del polipéptido FGFR-L a partir del gen FGFR-L endógeno de la célula. Este método incluye la introducción de un polipéptido que no se presenta de manera natural. (por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de unión de ADN específico de sitio fusionado a un dominio de factor transcripcional) dentro de la célula de manera que resulta en la producción de novo o aumentada del polipéptido FGFR-L a partir del gen para FGFR-L endógeno de la célula. La presente invención se relaciona además con plásmidos recombinantes de ADN útiles en el método para alterar la expresión de un gen objetivo. En algunas modalidades, los plásmidos recombinantes de ADN ejemplares comprenden: (a) una o más secuencias dirigidas, (b) una secuencia reguladora, (c) un exon y (d) un sitio donador de maduración, no pareado. La secuencia objetivo en el plásmido recombinante de ADN dirige la integración de los elementos (a) - (d) en un gen objetivo en una célula de manera que los elementos (b) - (d) se unen operativamente a las secuencias del gen objetivo endógeno. En otra modalidad, los plásmidos recombinantes de ADN comprenden: (a) una o más secuencias dirigidas, (b) una secuencia reguladora, (c) un exon, (d) un sitio donador de maduración, (e) un intrón y (f) un sitio aceptor de maduración, en donde la secuencia objetivo dirige la integración de los elementos (a) - (f) , de modo que los elementos de (b) - (f) se unen operativamente al gen endógeno. La secuencia objetivo es homologa al sitio seleccionado previamente en el ADN cromosómico celular con el cual se va a producir la recombinación homologa. En el plásmido recombinante, el exon generalmente está 3 ' respecto a la secuencia reguladora del sitio donador de maduración que está 3' respecto al exon. Si se conoce la secuencia de un gen particular, tal como una secuencia de ácido nucleico del polipéptido FGFR-L que se presenta en la presente, se puede sintetizar u obtener de alguna otra manera una pieza de ADN que sea complementaria a una región seleccionada del gen, por ejemplo por restricción apropiada del ADN nativo en sitio de reconocimiento específicos que unan la región de interés. Esta pieza sirve como una secuencia objetivo ante la inserción en la célula e hibridizará con su región homologa dentro del genoma. Si la hibridación se produce durante la replicación de ADN, esta pieza de ADN y cualquier secuencia adicional adherida a la misma actuarán como un fragmento de Okazaki y se incorporarán en la cadena de ADN hija recién sintetizada. Por lo tanto, la presente invención incluye nucleótidos que codifican para un polipéptido FGFR-L, nucleótidos los cuales se pueden utilizar como secuencias dirigidas.

La terapia celular con polipéptido FGFR-L, po ejemplo la implantación de células que producen polipéptid FGFR-L, también se contempla. Esta modalidad involuc implantar células capaces de sintetizar y secretar una for biológicamente activa del polipéptido FGFR-L. Tales célula productoras del polipéptido FGFR-L pueden ser células q son productores naturales de polipéptido FGFR-L o pueden se células recombinantes cuya capacidad para produci polipéptido FGFR-L ha aumentado por transformación con gen que codifica para el polipéptido FGFR-L deseado o con gen que aumenta la expresión del polipéptido FGFR-L. T modificación se puede llevar a cabo por medio de un vect adecuado para suministrar el gen así como promover s expresión y secreción. Para minimizar la reacci inmunológica potencial en pacientes a los que se l administra un polipéptido FGFR-L, como puede suceder con l administración de un polipéptido de una especie extraña, prefiere que las células naturales que producen polipéptido FGFR-L sean de origen humano y produzcan polipéptido FGFR-L humano. De igual manera, se prefiere q las células recombinantes que producen el polipéptido FGFR-se transformen con un vector de expresión que contenga gen que codifique para un polipéptido FGFR-L humano. Las células implantadas pueden ser encapsulad para evitar la infiltración de tejidos circundante. L células animales humanas o no humanas se pueden implantar en pacientes en recintos poliméricos semipermeables biocompatibles o en membranas que permite la liberación del polipéptido FGFR-L, pero que impiden la descripción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores dañinos del tejido circundante. Alternativamente, se pueden implantar las células propias del paciente, transformadas para producir los polipéptido FGFR-L ex vivo, directamente en el paciente sin tal encapsulación. Las técnicas para encapsulación de células vivas se conoce en la técnica, y se puede llevar a cabo de manera habitual la preparación de células encapsuladas y su implantación en pacientes. Por ejemplo, Baetge et al . , (Publicación PCT No. WO 95/05452 y PCT/US94/09299) describen cápsulas de membrana que contienen células sometidas a ingeniería genética para el suministro eficaz de moléculas biológicamente activas. Las cápsulas son biocompatibles y son recuperables con facilidad. Las cápsulas encapsulan células transfectadas con moléculas de ADN recombinante que comprenden secuencias de ADN que codifican para moléculas biológicamente activas unidas operablemente a promotores que no se someten a regulación por disminución in vivo cuando se implantan en un huésped mamífero. Los dispositivos proporcionan el suministro de las moléculas de células vivas a sitios específicos dentro del receptor. Además, véanse las Patentes de E'.U.A. NOS. 4,892,538; 5,011,472 y 5,106,627. E la publicación PCT No. WO 91/10425 (Aebischer et al . ) s describe un sistema para encapsular células vivas. Véas también la publicación PCT No. WO 91/10470 (Aebischer e al . ) ; Winn et al . , 1991, Exper. Neurol . 113:322-29; Aebischer et al . , 1991, Exper. Neurol . 111:269-75 y Tresc et al . , 1992 , ASAIO 38:17-23. En la terapia de genes in vivo e in vi tro tambié se ha considerado el suministro de polipéptido FGFR-L. U ejemplo de una técnica de terapia de genes es utilizar e gen para FGFR-L (ya sea ADN genómico, ADNc o ADN sintético) que codifica para un polipéptido FGFR-L el cual se pued unir operablemente a un promotor constitutivo o inducibl para formar un "plásmido recombinante de ADN de terapia d gen" . El promotor puede ser homólogo o heterólogo al ge para FGFR-L endógeno, con la condición de que sea activo e la célula o tipo de tejido en el cual se va a insertar e plásmido recombinante. Otros componentes del plásmid recombinante de ADN de terapia de genes opcionalment incluyen moléculas de ADN diseñadas para integració específica en el sitio (por ejemplo secuencias endógena útiles para recombinación homologa) , promotores específico de tejido, mejoradores o sustancias que inhiben l expresión, moléculas de ADN capaces de proporcionar un ventaja selectiva sobre la célula original, moléculas de AD útiles como marcas para identificar células transformadas, sistemas negativos de selección, agentes de unión específicos de célula (tales como, por' ejemplo para direccionamiento de células) , factores de internalización específicos de célula, factores de transcripción que mejoran la expresión de un vector y factores que permiten la producción de vectores . Posteriormente se puede introducir en las células (ya sea ex vivo o in vivo) un plásmido recombinante de ADN de terapia de genes utilizando vectores virales o no virales. Un medio para introducir el plásmido recombinante de ADN de terapia de genes es por medio de vectores virales, como se describe en la presente. Algunos vectores, tales como los vectores retrovirales, suministrarán el plásmido recombinante de ADN al ADN cromosómico de las células, y el gen se puede integrar en el ADN cromosómico. Otros vectores funcionarán como episomas y el plásmido recombinante de ADN de terapia de genes permanecerá en el citoplasma. En otras modalidades adicionales, se pueden incluir elementos reguladores para la expresión controlada del gen para FGFR-L en la célula objetivo. Tales elementos se activan en respuesta a un efector apropiado. De esta manera, se puede expresar cuando se desee un polipéptido terapéutico. Un medio de control convencional involucra el uso de dimerizadores o rapálogos de moléculas pequeñas para dimerizar proteínas quiméricas que contienen un dominio de unión de molécula pequeño y un dominio capaz de iniciar un proceso biológico tales como proteínas que unen ADN o proteínas de activación transcripcional (véase la publicación PCT Nos WO 96/41865, WO 97/31898 y WO 97/31899) . Se puede utilizar la dimerización de las proteínas para iniciar la transcripción del transgen. Una tecnología de regulación alternativa utiliza un método para almacenar proteínas expresadas a partir del gen de interés dentro de la célula como un agregado o grupo. El gen de interés se expresa como una proteína de fusión que incluye un dominio de agregación condicional que resulta en la retención de la proteína agregada en el retículo endoplásmico. Las proteínas almacenadas son estables e inactivas dentro de la célula. Sin embargo, las proteínas se pueden liberar al administrar un medicamento (por ejemplo un ligando de molécula pequeña) que separa el dominio de agregación condicional y de esta manera separa específicamente los agregados o grupos de manera que las proteínas pueden ser secretadas de la célula. Véase Aridor et al . , 2000, Science 287:816-17 y Rivera et al . , 2000, Science 287:826-30. Otro medio de control adecuado o conmutadores de genes incluyen, pero no se limitan a los sistemas que se describen en la presente. Se utiliza Mifepristone (RU486) como un antagonista de progesterona. La unión de un dominio de unión de ligando de receptor de progesterona modificado al antagonista de progesterona activa la transcripción al formar un dímero de dos factores de transcripción que después pasan al núcleo para unir ADN. El dominio de unión de ligando se modifica para eliminar la capacidad del receptor para unirse al ligando natural . El sistema receptor de hormona esteroide modificado se describe adicionalmente en la Patente de E.U.A. No. 5,364,791 y en las Publicaciones PCT Nos. WO 96/40911 y WO 97/10337. Otro sistema de control adicional utiliza ecdisona (una hormona esteroide de la mosca de la fruta) la cual se une y activa un receptor de ecdisona (receptor citoplásmico) . El receptor después cambia de lugar y se desplaza al núcleo para unir un elemento de respuesta específico de ADN (promotor a partir del gen que responde a ecdisona) . El receptor de ecdisona incluye un dominio de transactivación, un dominio que une ADN y un dominio que une ligando para iniciar la transcripción. El sistema de ecdisona se describe adicionalmente en la Patente de E.U.A. No. 5,514,578 y en las Publicaciones PCT Nos. WO 97/38117, WO 96/37609 y WO 93/03162. Otro medio de control utiliza un transacti ador positivo controlable por tetraciclina. Este sistema involucra un dominio que une ADN a una proteína represora tet mutada (cambio de los aminoácidos R-4 de tet mutada que resultan en una proteína transactivadora regulada por tetraciclina inversa, es decir, se une a un operador tet en presencia de tetraciclina) unido a un polipéptido que activa la transcripción. Tales sistemas se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,464,758, 5,650,298 y 5,654,168. Los sistemas de .control de expresión adicionales y plásmidos recombinantes de ácido nucleico se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,741,679 y 5,834,186 para Innovir Laboratories Inc. La terapia de genes in vivo se puede llevar a cabo al introducir el gen que codifica para el polipéptido FGFR-L dentro de las células por medio de inyección local de una molécula de ácido nucleico para FGFR-L o por otros vectores de suministro virales o no virales apropiados. Hefti 1994, Neurobiology 25:1418-35. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido FGFR-L puede estar contenida en un vector de virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés) para el suministro a células objetivo (véase, por ejemplo Johnson, Publicación PCT No. WO 95/34670; Solicitud PCT No. PCT/US95/07178) . El genoma de AAV recombinante típicamente contiene secuencias repetidas terminales invertidas AAV que flanquean una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido FGFR-L unido operablemente a un promotor funcional y secuencias de poliadenilación.

Los vectores virales adecuados alternativos incluyen, pero no se limitan a retrovirus, adenovirus, virus de herpes simple, lentivirus, virus de hepatitis, parvovirus, papovavirus, poxvirus, alfavirus, coronavirus, rabdovirus, paramixovirus y vectores de virus de papiloma. La Patente de E.U.A. No. 5,672,344 describe un sistema de transferencia de genes mediada por virus in vivo que involucra un vector HSV-1 neutrófico recombinante. La Patente de E.U.A. No. 5,399,346 proporciona ejemplos de un proceso para proporcionar a un paciente con una proteína terapéutica por el suministro de células humanas que se han tratado in vi tro para insertar un segmento de ADN que codifica para una proteína terapéutica. Los métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia de genes se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,631,236 (que se relaciona con vectores adenovirales), 5,672,510 (que se relaciona con vectores retrovirales) y 5,635,399 (que se relaciona con vectores retrovirales que expresan citocinas) . Los métodos de suministro no virales incluyen, pero no se limitan a transferencia mediada por liposomas, suministro ADN desnudo (inyección directa) , transferencia mediada por receptor (complejo de ligando ADN), electroporación, precipitación con fosfato de calcio y bombardeo con icropartlculas (por ejemplo pistola de genes) . Los materiales y métodos de terapia de genes también pueden incluir promotores inducibles, mejoradores-promotores específicos de tejido, secuencias de ADN diseñadas para integración específica de sitio, secuencias de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula original, marcas para identificar las células transformadas, sistemas de selección negativos y sistemas de control de expresión (medidas de seguridad) , agentes de unión específicos de células (para direccionamiento de células) , factores de internalización específicos de célula y factores de transcripción para mejorar la expresión por un vector así como métodos de elaboración de vectores. Tales métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia.de genes se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,970,154 (que se relaciona con técnicas de elctroporación) , 5,679,559 (que describe un sistema que contiene lipoproteína para el suministro de genes), 5,676,954 (que se relaciona con portadores de liposomas), 5,593,875 (que describe métodos para la transfección con fosfato de calcio) y 4,945,050 (que describe un proceso en el que las partículas biológicamente activas son impulsadas en las células a una velocidad por la cual las partículas penetran la superficie de las células y se incorporan al interior de las células) , así como la publicación PCT No. WO 96/40958 (que se relaciona con ligandos nucleares) .

También se contempla que la terapia de genes de FGFR-L o la terapia celular pueda incluir además el suministro de uno o más polipéptidos adicionales en la misma célula o en células diferentes. Tales células se pueden introducir por separado en el paciente, o las células pueden estar contenidas como un dispositivo implantable único, por ejemplo como la membrana encapsulante descrita antes, o bien • las células se pueden modificar por separado, por medio de vectores virales. Un medio para aumentar la expresión de polipéptido FGFR-L endógeno en una célula por medio de terapia de genes es insertar uno o más elementos mejoradores dentro del promotor del polipéptido FGFR-L, en donde los elementos mejoradores pueden servir para aumentar la actividad transcripcional del gen para FGFR-L. Los elementos mejoradores utilizados se seleccionarán en base en el tejido en el cual se desea activar el gen (los elementos mejoradores que se sabe confieren activación de promotor en ese tejido serán los que se seleccionen. Por ejemplo, si un gen que codifica para un polipéptido FGFR-L va a ser "activado" en linfocitos T, se puede utilizar el elemento mejorador promotor de Ick. Aquí, la porción funcional del elemento de transcripción que se va a agregar se puede insertar dentro de un fragmento de ADN que contiene el promotor para el polipéptido FGFR-L (y opcionalmente se inserta en un vector o en secuencias flanqueantes 5 ' o 3 ' ) utilizando técnicas de clonación estándar. Este plásmido recombinante, conocido como "plásmido recombinante de recombinación homologa" después se puede introducir en las células deseadas ex vivo o in vivo . La terapia de genes también se puede utilizar para disminuir la expresión del polipéptido FGFR-L al modificar la secuencia de nucleótidos del promotor endógeno. Tal modificación típicamente se lleva a cabo por medio de métodos de recombinación homologa. Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene la totalidad o una porción del promotor del gen para FGFR-L seleccionado para inactivación se puede someter a ingeniería para eliminar o sustituir piezas del promotor que regulen la transcripción. Por ejemplo, la secuencia TATA (caja TATA) o el sitio de unión de un activador transcripcional del promotor se pueden suprimir utilizando técnicas de biología molecular estándar; tal supresión puede inhibir la actividad promotora por lo que reprime la transcripción del gen correspondiente para FGFR-L. La supresión de la secuencia TATA o del sitio de unión de activador de transcripción en el promotor se puede llevar a cabo al generar un plásmido recombinante de ADN que comprende la totalidad o la porción pertinente del promotor para el polipéptido FGFR-L (de la misma especie o de una especie relacionada con respecto al gen para FGFR-L que se va a regular) , en el cual uno o más de las secuencias TATA o los nucleótidos del s.itio de unión de activación transcripcional se mutan por medio de sustitución, supresión o inserción de uno o más nucleótidos. Como un resultado, la secuencia TATA o el sitio de unión de activador tienen actividad disminuida o se vuelven completamente inactivos. Este plásmido recombinante, el cual también típicamente contiene por lo menos aproximadamente 500 bases de ADN que corresponden a las secuencias de ADN 5 ' y 3 ' nativas (endógenas) adyacentes al segmento promotor que se ha modificado, se pueden introducir en las células apropiadas (ya sea ex vivo o in vivo) directamente o por medio de un vector viral, como se describe en la presente. Típicamente, la integración del plásmido recombinante en el ADN genómico de las células será por medio de recombinación homologa, en donde las secuencias de ADN 5 ' y 3 ' en el plásmido recombinante promotor pueden servir para ayudar a integrar la región promotora modificada por medio de hibridación al ADN cromosómico endógeno.

Usos Terapéuticos Las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L, los polipéptidos y agonistas o antagonistas de los mismos se pueden utilizar para tratar, diagnosticar, disminuir o evitar diversas enfermedades, desórdenes o condiciones que incluyen los que se mencionan en la presente. Los agonistas y antagonistas del polipéptido FGFR-L incluyen aquellas moléculas las cuales . regulan la actividad del polipéptido FGFR-L ya sea aumentando o disminuyendo por lo menos una actividad de la forma madura del polipéptido FGFR-L. Los agonistas o antagonistas pueden ser cofactores tales como una proteína, péptido, carbohidrato, lípido o molécula de peso molecular pequeño, que interactúa con el polipéptido FGFR-L y de esta manera regula su actividad. Los agonistas o antagonistas polipeptídicos potenciales incluyen anticuerpos que reaccionan ya sea con las formas solubles unidas a membrana de los polipéptido FGFR-L que comprenden parte o la totalidad de los dominios extracelulares de tales proteínas. Las moléculas que regulan la expresión del polipéptido FGFR-L típicamente incluyen ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido FGFR-L y que pueden actuar como reguladores de expresión antisentido. El dominio extracelular del polipéptido FGFR-L se ha encontrado que comparte identidad de secuencia con la familia de genes del receptor de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés) , moléculas de ácido nucleico para FGFR-L, polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos (que incluyen, pero que no se limitan a agentes de unión selectivos contra FGFR-L) que pueden ser útiles en la identificación de factores de crecimiento novedosos . La identidad de secuencia entre el polipéptido FGFR-L y la familia del receptor FGF también sugiere que los polipéptido FGFR-L pueden jugar un papel en la mitogénesis en fibroblastos, células endoteliales y células epiteliales. Tales células epiteliales incluyen células del ducto pancreático, las cuales se ha demostrado que se diferencian en respuesta a un FGF para formar células de islote ß productoras de insulina. Además del transcrito de FGFR-L de 3-4 kb, el páncreas también expresa un transcrito de 6 kb el cual puede codificar para una variante del polipéptido FGFR-L. Esta variante del polipéptido FGFR-L potencial puede tener actividades que difieren de las del transcrito FGFR-L. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L, los polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles en reparación de tejido, sanado de heridas, modulación de angiogénesis y en el diagnóstico y tratamiento de diabetes. En varias líneas de células tumorales, el dominio extracelular del polipéptido FGFR-L se esparce en el medio de cultivo. Esto sugiere que el dominio extracelular del polipéptido FGFR-L puede jugar un papel en el crecimiento o diferenciación de células tumorales. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L, los polipéptidos y agonistas y antagonista de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de cáncer. Se ha encontrado que el gen para FGFR-L puede ser regulado por aumento en líneas de células estromales de médula ósea que soportan el mantenimiento de hemocitoblastos hematopoyéticos. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L y los polipéptidos pueden ser útiles para la expansión ex vivo de hemocitoblastos, protocolos de terapia de genes o tratamiento de desórdenes hematopoyéticos. También se ha encontrado que el gen para FGFR-L son regulados por aumento bajo condiciones de osteoclastogénesis. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L los polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de desórdenes óseos que incluyen, pero que no se limitan a osteoporosis, osteopetrósis, osteogénesis imperfecta, osteítis deformante, enfermedad periodontal e hipercalcemia. La expresión de los polipéptido FGFR-L se ha detectado en el riñon. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L, los polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades que involucran al riñon. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a glomerulonefritis aguda y crónica. Otras enfermedades relacionadas con el riñon 'están abarcadas dentro del alcance de esta invención. El gen para FGFR-L se expresa de manera abundante en tejido adiposo, determinado por hibridación in si tu . En base en este patrón de expresión, los polipéptidos FGFR-L pueden jugar un papel en la adipogénesis o en la función de los adipositos que incluyen, pero que no se limitan a un control del equilibrio energético y lipólisis. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L, los polipéptidos y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles para obtener pérdida de peso por dieta, ganancia de peso o para tratar caquexia. Los agonistas o antagonistas de la función del polipéptido FGFR-L se pueden utilizar (simultánea o secuencialmente) en combinación con una o más citocinas, factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios o agentes quimioterapéuticos según sea apropiado, para la condición que va a ser tratada. Otras enfermedades causadas o mediadas por concentraciones indeseables de polipéptidos FGFR-L son abarcadas dentro del alcance de la invención. Las concentraciones indeseables incluyen concentraciones excesivas de polipéptidos FGFR-L y concentraciones subnormales de polipéptidos FGFR-L.

Usos de Ácidos Nucleicos y Polipéptidos de FGFR-L Las moléculas de ácido nucleico de la invención (que incluyen aquellas que en sí mismas no codifican para polipéptidos biológicamente activos) se pueden utilizar para establecer mapas de las posiciones del gen para FGFR-L y genes relacionados, en los cromosomas. El mapeo se puede realizar por técnicas conocidas en el arte tales como amplificación por PCR e hibridación in si tu . Las moléculas de ácido nucleico para FGFR-L (que incluyen aquellas que en sí mismas no codifican para polipéptidos biológicamente activos) pueden ser útiles como sondas de hibridación en ensayos de diagnóstico para probar, cualitativa o cuantitativamente, las presente de una molécula de ácido nucleico para FGFR-L en tejido de mamífero o en muestras de fluidos corporales. Se pueden utilizar otros métodos en donde sea deseable inhibir la actividad de uno o más polipéptidos FGFR-L. Tal inhibición puede ser llevada a cabo por moléculas de ácido nucleico que son complementarias y que hibridizan consecuencia de control de expresión (formación de hélice triple) o ARNm para FGFR-L. Por ejemplo, las moléculas antisentido de ADN o ARN, las cuales pueden tener una secuencia que es complementaria con por lo menos una porción de un gen para FGFR-L se pueden introducir dentro de la célula. Las sondas antisentido se pueden diseñar por técnicas disponibles utilizando la secuencia del gen para FGFR-L que se describe en la presente. Típicamente, cada una de tales moléculas antisentido será complementaria al sitio de inicio (extremo 5') de cada gen para FGFR-L seleccionado. Cuando la molécula antisentido después hibridiza al ARNm para FGFR-L correspondiente, se evita o se reduce la traducción de este ARNm. Los inhibidores antisentido proporcionan información en relación a la disminución o ausencia de un polipéptido FGFR-L en una célula u organismo. Alternativamente, se puede utilizar la terapia de genes para crear un inhibidor dominante negativo de uno o más polipéptidos FGFR-L. En esta situación, se puede preparar un ADN que codifique para un polipéptido mutante de cada polipéptido FGFR-L seleccionado y se puede introducir en las células de un paciente utilizando métodos virales o no virales, como se describe en la presente. Cada uno de tales mutantes típicamente se diseña para competir con el polipéptido endógeno en su papel biológico. Además, se puede utilizar un polipéptido FGFR-L, biológicamente activo o no, como un inmunógeno es decir, el polipéptido contiene por lo menos un epítopo para el cual se pueden generar anticuerpos. Los agentes de unión selectivos que se unen a un polipéptido FGFR-L (como se describe en la presente) se pueden utilizar para propósitos de diagnóstico in vivo e in vi tro que incluyen, pero que no se limitan al uso en forma marcada para detectar la presencia del polipéptido FGFR-L en un fluido corporal o en una muestra de células. Los anticuerpos también se pueden utilizar para evitar, tratar o diagnosticar diversas enfermedades y desórdenes que incluyen los que se mencionan en la presente. Los anticuerpos pueden unir un polipéptido FGFR-L de manera que disminuyan o bloqueen por lo menos una actividad característica de un polipéptido FGFR-L o se pueden unir a un polipéptido para aumentar por lo menos una característica de actividad de un polipéptido FGFR-L (incluida al aumentar la farmacocinética del polipéptido FGFR-L) . Los polipéptidos FGFR-L se pueden utilizar para clonar ligandos del polipéptido FGFR-L utilizando una estrategia de "clonación de expresión". Se pueden utilizar el polipéptido FGFR-L radiomarcado (125Yodo) o un polipéptido FGFR-L "de afinidad/actividad dirigida" (tal como una fusión con Fc o una fusión con fosfatasa alcalina) en ensayos de unión para identificar un tipo de célula, línea celular o tejido que exprese ligandos del polipéptido FGFR-L. El ARN aislado de tales células o tejidos se puede convertir después a ADNc, se puede clonar en un vector de expresión de mamífero y se puede transfectar a células de mamífero (por ejemplo COS o 293) para crear una biblioteca de expresión. El polipéptido FGFR-L radiomarcado o etiquetado después se puede utilizar como un reactivo de afinidad para identificar y aislar el subconjunto de células en esta biblioteca que expresen ligandos del polipéptido FGFR-L. El ADN después se aisla de estas células y se transfecta en células de mamífero para crear una biblioteca de expresión secundaria en la cual la fracción de células que expresan ligandos del polipéptido FGFR-L puede ser muchas veces superior en comparación con la biblioteca original. Este proceso de enriquecimiento se puede repetir continuamente hasta que se aisle un clon recombinante único que contenga un ligando del polipéptido FGFR-L. El aislamiento de los ligandos del polipéptido FGFR-L es útil para identificar o desarrollar agonistas y antagonistas novedosos de la vía de señalización del polipéptido FGFR-L. Tales agonistas y antagonistas incluyen ligandos del polipéptido FGFR-L, anticuerpos del ligando del polipéptido contra FGFR-L, moléculas pequeñas u oligonucleótidos antisentido. Los ácidos nucleicos para FGFR-L tanto murinos como humanos de la presente invención también son herramientas útiles para aislar los genes polipeptídicos para FGFR-L cromosómicos correspondientes. Por ejemplo, el ADN cromosómico de ratón que contiene secuencias de FGFR-L se puede utilizar para producir ratones con el gen inactivado y de esta manera se permite un examen del papel in vivo para el polipéptido FGFR-L. Se puede utilizar el ADN genómico para FGFR-L humano con el fin de identificar enfermedades heredables que degeneren tejido. Se ha realizado un depósito de ADNc que codifica para el polipéptido FGFR-L humano, que tiene número de acceso No. , ante la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 el 31 de Enero del 2000. Los siguientes ejemplos se diseñan únicamente con propósitos de ilustración y no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención de manera alguna.

Ejemplo 1: Clonación del Gen Murino para el Polipéptido FGFR-L _ _.

De manera general, los materiales y métodos son como se describen en Sambrook et al . supra, en donde se utilizan para clonar y analizar el gen que codifica para el polipéptido FGFR-L de rata. Se aislan secuencias que codifican para el polipéptido FGFR-L murino a partir de una biblioteca de ADNc de ratón derivados de una mezcla de dos líneas de células estromales de médula ósea que soportan a hemocitoblastos hematopoyéticos (F4 y FIO) . Las líneas de células de estroma de médula ósea murino D3, F4 y FIO se obtienen del doctor R Ploemacher (Erasmus Uníversity, Rotterdam, Países Bajos) se cultivan a 32°C y C02 5% en IMDM enriquecido con suer bovino fetal 10%, suero de caballo 5%, glutamina 2 mM, ß mercaptoetanol 0.1 M e hidrocortisona 1 µM (sal d succinato de sodio) . Se prepara una biblioteca de ADN estromal de médula ósea de ratón al aislar ARN de células F y FIO utilizando el método de trizol (LTI) . Se purifica AR poli-A utilizando esferas magnéticas oligo-dT (Dynal) y s mezclan cantidades iguales de ARN poli A (1.5 µg de cada un de ARN de F4 y FIO) . Se construye una biblioteca de ADNc d longitud completa cebada con oligo dT a partir de la mezcl de ARN de F4/F10 utilizando el sistema del plásmid Superscript para la síntesis de ADNc y Plasmid Clonin (LTI) . La biblioteca de ADNc estromal de médula ósea d ratón que contiene 6 x 10s transformantes, se colocan e placas y se seleccionan 3.4 x 104 colonias y se transfiere en paralelo a placas de 96 pozos y se colocan en punto sobre filtros. Los filtros después se sondean con la primer cadena de ADNc marcada con 32P-dCTP generada a partir de ARN poli-A aislado de la línea de células D3 estromales d médula ósea. De las 3.4 x 104 colonias que se colocaron e punto en los filtros, 11,232 no hibridizan con la sona D3 Se aisla el plásmido de estas colonias no hibridizantes y s secuencia el extremo 5 ' de sus insertos de ADNc . Un clon (smsf2- 00017-f4) muestra homología con diversos miembros de la familia del receptor de FGF, y se identifica en el análisis de secuencia. Se obtiene un clon de longitud completa (smsf2 -00017-f4-41.6) por cribado en transferencia Southern de 56 acumulados de ADNc estromal de médula ósea de ratón (cada acumulado comprende 1 x 104 clones de la biblioteca de ADNc estromal de médula ósea de ratón. El acumulado que posee el inserto más grande subsecuentemente se coloca en placas y se vuelve a cribar. El análisis de secuencia del ADNc de longitud completa para el polipéptido FGFR-L murino indica que el gen codifica para una proteína transmembranal tipo I (figura IB, dominio transmembranal predicho: L-P-W-P-V-V-I-G-I-P-A-G-A-V-F-I-L-G-T-V-L-L-W-L-C; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12) . El gen para el polipéptido FGFR-L murino comprende un marco de lectura abierta de 1587 pb que codifica para una proteína de 529 aminoácidos y que posee un péptido señal potencial en su parte aminoterminal (figura ÍA, péptido señal predicho: M-T-R-S-P-A-L-L-L-L-L-L-G-A-L-P-S-A-E-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) . Las figuras ÍA a ÍC ilustran la secuencia nucleotídica de la secuencia de ácido nucleico para FGFR-L murino y la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido FGFR-L murino. Una proteína de fusión del dominio extracelular murino-Fc tiene un peso molecular aparente, determinado por SDS-PAGE, de aproximadamente 55 kD. Aunque el dominio extracelular del polipéptido FGFR-L se relaciona más estrechamente con la familia del receptor FGF, el dominio citoplásmico de la proteína no contiene un dominio cinasa u otro dominio reconocible. Las figuras 2A a 2B ilustran la alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR-L murino y la proteína conocida para la cual el polipéptido FGFR-L comparte la homología más cercana, receptor-4 de FGF de gallipato (Pleurodeles wal tlii) . El análisis de computadora utilizando el programa BLAST también indica que el polipéptido FGFR-L murino se relaciona estrechamente con EST humano de 486 pb único (número de acceso GenBank AI245701) aislado de riñon humano. Una cadena de 379 pb de este EST muestra 87% de identidad con el polipéptido FGFR-L, lo que sugiere la existencia de un ortólogo humano.

Ejemplo 2: Clonación del Gen para el Polipéptido FGFR-L humano De manera general, se utilizan los materiales y métodos descritos en Sambrook et al . supra para clonar y analizar el gen que codifica para el polipéptido FGFR-L humano .

Se prepara como sigue una biblioteca de ADNc de bazo humano y de tejido mixto. Se extrae el ARN total de tejidos humanos utilizando procedimientos de extracción con Trizol (Gibco-BRL, Rockville, MD) y se selecciona poli-A+ ARN a partir de este ARN total utilizando Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. El ADNc cebado aleatoriamente o cebado con oligo (dT) se sintetiza a partir de este ARN poli-A+ utilizando el sistema del plásmido Superscript para la síntesis de ADNc y el equipo Plasmid Cloning (Gibco-BRL, Rockville, MD) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. El ADNc resultante se digiere con las enzimas de restricción apropiadas y se clona en el vector pSPORT 1. Los productos de ligación se transforman en E. coli utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica y se seleccionan transformantes en placas de medio bacteriano que contengan un antibiótico apropiado. La biblioteca de ADNc consiste de la totalidad o de un subconjunto de estos transformantes . El ADN plasmídico aislado de los acumulados de 1 x 104 colonias se utiliza como una plantilla en las amplificaciones por PCR realizadas con los cebadores 5 ' -C-G-C-T-G-A-C-C-A-T-G-T-G-G-A-C-C-A-A-G-G-A-T-G-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 13) y 5 ' -C-T-T-G-A-C-C-C-C-A-G-A-A-G-G-A-G-C-T-G-T-C-G-G-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 14) . Los cebadores de PCR se diseñan en base en la secuencia EST humana AI245701 descrita en el ejemplo 1. Varios acumulados proporcionan un fragmento de 234 pb el cual se subclona y se determina que tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde a las posiciones 208 a 441 de la secuencia de ácido nucleico para FGFR-L humana que se muestra en la figura 3A. Los acumulados de plásmidos que proporcionan un producto de PCR de 234 pb en las reacciones de amplificación anteriores después se colocan en placas para análisis de hibridación de colonia. Las colonias que se colocan en placas se criban utilizando el fragmento de PCR de 234 pb generado antes, como una sonda después de radiomarcado con el equipo de marcado de cebado aleatorio Rediprime II (Amersham, Piscataway, NJ) . Se determina que un inserto de ADNc de 1333 pb tiene una secuencia que corresponde a la posiciones 118 a 1450 de la secuencia de ácido nucleico para FGFR-L humano que se muestra en las figuras 3A a 3C. El montaje de esta secuencia de 1333 pb y la secuencia de 234 pb de AI245701 proporciona la secuencia de ácido nucleico para FGFR-L humana que se muestra en las figuras 3A a 3C. Baker et al . (Publicación PCT Número WO 99/63088) describen una secuencia polipeptídica de 504 aminoácidos (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 15) la cual ellos denominan PR0943 que comparte identidad de secuencia con el polipéptido FGFR-L humano. Rubén y Young (Publicación PCT No. WO 00/24756) describen una secuencia de ácido nucleico de 3112 pb (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 16) que codifica para un polipéptido de 504 aminoácidos (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17) la cual ellos denominan receptor- 5 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR5, por sus siglas en inglés) que comparte identidad de secuencia con el polipéptido FGFR-L humano. Finalmente, Wiedemann y Trueb, 2000, Genomics 69:275-79 describen una secuencia de ácido nucleico de 3080 pb (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 18) que codifica para un polipéptido de 504 aminoácidos (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19) la cual ellos denominan proteína 1 similar a receptor de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFRL1, por sus siglas en inglés) que comparte identidad de secuencia con el polipéptido FGFR-L humano.

Ejemplo 3: Expresión de ARNm para FGFR-L Se examina por medio de análisis de transferencia Northern la expresión del ARNm para FGFR-L. Se someten a sondeo muestras Northern de tejido murino y humano múltiple (Clontech) con un fragmento de PCR de 234 pb marcado con 32P-dCTP que corresponde a una porción del gen para FGFR-L humano (véase ejemplo 2) . También se criban con esta sonda puntos adicionales que contienen ARN aislado de diversas líneas celulares. Las manchas de transferencia Northern se prehibridizan durante 2 horas a 42 °C en 5X SSC, formamida desionizada 35%, pirofosfato de sodio 0.05% (p/v), fosfato de sodio 20 mM, pH 6.8, EDTA 5 mM, solución de Denhardt 5X, SDS 0.2% y 94 Dg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y después se hibridizan a 42 °C durante la noche en amortiguador de prehibridación fresco que contiene aproximadamente 1 ng/ml de la sonda marcada. Después de la hibridación, los filtros se lavan una vez en amortiguador de prehibridación durante 5 minutos a temperatura ambiente, una vez durante 5 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC y SDS 0.1%, y después dos veces durante 20 minutos a 42 °C en 2X SSC y SDS 0.1%. Las . manchas después se exponen a autoradiografía. El análisis de las manchas de transferencia Northern (figuras 5 a 7) indica que un solo transcrito que tiene una masa molecular de 2.9 kb se expresa en alto nivel en hígado murino, riñon, células estromales de médula ósea F4 y FIO, células NIH-3T3 y células estromales de médula ósea ST2 (después de exposición coir vitamina D3 y dexametasona) . La detección de un transcrito único en las muestras positivas sugiere que, en estos tejidos, no existe una variante de maduración (corte y empalme) obvia que codifique para un dominio citoplásmico más grande que pueda contener un dominio cinasa u otro dominio reconocible. La expresión débil del transcrito se detecta en corazón, cerebro, pulmones, músculo esquelético, testículos, células estromales de médula ósea FIO y células ST2 , murinas (antes de la exposición con vitamina D3 y dexametasona) . El análisis de transferencia Northern (figura 8 a 10) también indica que un transcrito que tiene una masa molecular de 3.2 kb se expresa en alto nivel entre tejidos humanos y que el transcrito que tiene una masa molecular de 6.0 kb se expresa en páncreas humano. La existencia del transcrito de 6.0 kb sugiere que puede existir una funcionalidad diferente de la variante de proteína FGFR-L. Se observa una expresión menor del transcrito de 3.2 kb en hígado, riñon, corazón, músculo esquelético, cerebro y líneas de células HeLa, K562, SW480, Molt4 y Raj i . El análisis de transferencia Northern (figura 11) también indica que se puede detectar un transcrito único en las siguientes líneas celulares: 266-6 (tumor pancreático acinar de ratón) , AR42J (tumor de páncreas de rata, exocrino) , CaPan I (adenocarcinoma pancreático humano) , HIG-82 (sinoviocito de conejo) , 0HS4 (osteoblasto humano) , SW 1353 (condrosarcoma humano, húmero) , SW 872 (liposarcoma humano) , K562 (leucemia mielógena crónica de pasaje antigua, es decir posterior; pasaje posterior), K562 (pasaje nuevo, es decir anterior) , Jurkat (línea de linfocitos T humanos) y F4 (línea de células estromales derivadas de médula ósea murina) . Las sondas derivadas de ADNc para FGFR-L humanas y murinas también es capaz de detectar ARNm para FGFR-L en tejido adiposo humano y murino, espectivamente (figuras 12A a 12B) . También se examinó la expresión de ARNm para FGFR-L en los ensayos de protección de ribonucleasa (figura 13) . Se detectó una señal en la mayor parte de los tejidos que fueron examinados, y se detectó una señal más fuerte en tejido adiposo pardo, tejido adiposo blanco y testículos. La expresión del ARNm para FGFR-L se localiza por hibridación in si tu utilizando técnicas estándar. Los niveles más altos de ARNm para FGFR-L se encuentran en tejido adiposo tanto blanco como pardo; la expresión de ARNm para FGFR-L se detecta en depósitos adiposos perirrenales adyacentes a la glándula suprarrenal y al riñon (figura 14) . En tejidos digestivos, se encontró la señal que corresponde a ARNm para FGFR-L en intestino delgado (duodeno e íleon) , pero no en intestino grueso (figura 15) . Específicamente, se encontró el ARNm para FGFR-L se expresa en la base de las criptas, y más probablemente células de Paneth. La expresión de ARNm para FGFR-L también se detectó en tráquea (se detectó una señal sobre células pericondreales adyacentes al anillo del cartílago hialino que rodea a la tráquea) y en el útero (se detectó una señal fuerte sobre células epiteliales que revisten la luz uterina; figura 16) . Los altos niveles de expresión de polipéptido FGFR-L detectados en cartílago hialino sugieren posible utilidad clínica del polipéptido FGFR-L en la modulación de osteoartritis dado que el fibrocartílago, que está presente característicamente en articulaciones osteoartríticas, recuerda al cartílago hialino. También se detectaron niveles menores de expresión de ARNm para FGFR-L en el cartílago articular y en la articulación de la rodilla y en el bazo -sobre la pulpa roja (hematopoyética) en oposición a la pulpa blanca (linfocitos, figura 16) . Se detectaron niveles de expresión menores en ovario, testículos e intestino delgado. El alto nivel de expresión de ARNm para FGFR-L en tej ido adiposo advierte que debe tenerse precaución en la interpretación de los datos de transferencia Northern como un resultado de la contaminación de algunos tejidos con tejido adiposo. Esto puede ser cierto en particular para el alto nivel de expresión que se observa en páncreas humano . Los niveles de expresión de ARNm para FGFR-L murino detectados en tres líneas de células estromales de médula ósea (es decir D3 , F4 y FIO) se correlaciona con la capacidad de estas células para soportar hemocitoblastos hematopoyéticos. La alta expresión del ARNm para FGFR-L murino se detecta en líneas de células estromales que proporcionan el mejor soporte (F4 y FIO; figura 7), mientras que niveles mucho menores se observan en la línea de células incapaces de soportar a hemocitoblastos hematopoyéticos (D3) . El ARNm para FGFR-L murino también es regulado por aumento en células ST2 osteoblásticas bajo condiciones de osteoclastogénesis (es decir, en respuesta a vitamina D3 y dexametasona; figura 17) un proceso que se sabe es inhibido por bFGF (Jimi et al . , 1996, J". Cell . Physiol . 168 -. 395 -402 ) . Además, el análisis de expresión muestra que el nivel de expresión de ARNm para el polipéptido FGFR-L murino aumenta durante el desarrollo fetal en donde la expresión más baja se detecta en el punto de tiempo más temprano analizado (por ejemplo, el día 7) y la expresión más alta se detecta en el punto de tiempo más posterior analizado (es decir, el día 17) (figura 5) . Finalmente, el análisis proteómico ha mostrado que el péptido con una secuencia idéntica a la del polipéptido FGFR-L murino y humano se secreta de células K562 y células AG2804 (fibroblasto humano) transformadas con SV40. En este enfoque, se aislan mezclas de proteína del medio de cultivo que se acondiciona por cualquiera de diversas líneas celulares y se somete a análisis de espectrometría de masas para identificar la presencia de secuencias peptídicas individuales. El análisis proteómico también muestra glucosilación unida a N en los residuos 231 (Asp) y 293 (Asp) en el polipéptido FGFR-L humano.

Ejemplo 4: Producción de Anticuerpos contra el Polipéptido FGFR-L Se obtienen anticuerpos contra el polipéptido FGFR-L al inmunizar conejos con un polipéptido que corresponde a una porción del dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) del polipéptido FGFR-L murino (Des7-FGFR-L/ECD; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20; que comprende los residuos 28 a 368 del polipéptido FGFR-L) . También se prepara un plásmido recombinante de fusión de polipéptido FGFR-L-Fc utilizando los residuos 1 a 366 del dominio extracelular (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21 y la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22) . Se utilizan procedimientos adecuados para generar anticuerpos (véase, por ejemplo, Hudson and Bay, Practical Immunology (2nd ed. , Blackwell Scientific Publications) ) . Se utiliza antisuero para el polipéptido FGFR-L en el análisis de transferencia Western de la proteínas separadas por SDS-PAGE derivadas de E. coli Des7-FGFR-L/ECD y derivadas de CHO FGFR-L/ECD-Fc. Se detectan bandas inmunorreactivas de 95-100 kD y de 40-45 kD en las muestras derivadas de CHO y de E. coli , respectivamente (figura 18) . También se detecta una banda inmunorreactiva de 60-70 kD en tejido adiposo murino (figura 19), células 266-6 (tumor pancreático acinar de ratón) , células AR42J (tumor exócrino de páncreas de rata) , células MRC5 (fibroblastos de pulmón diploide humano) , células 0HS4 (osteoblasto humano) , células SW1353 (condrosarcoma humano) y células K562 (sarcoma mielógeno crónico) después de inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western de lisados celulares y medio acondicionado recolectado de estos tejidos y líneas celulares. Se detecta una banda adicional de 100-120 kD en tejido adiposo, células 0HS4 y células K562. El antisuero crudo también se puede utilizar para inmunoprecipitar ambas proteínas. Utilizando el antisuero crudo en el análisis FACS, se detecta la tinción de la superficie de células del polipéptido FGFR-L en células estromales de médula ósea F4 (que muestran la expresión de altos niveles de ARN para FGFR-L) , pero no en células estromales de médula ósea D3 (que se muestra que expresan bajos niveles de ARN para FGFR-L; figura 20A-20B) .

Ejemplo 5: Caracterización in vi tro de los Polipéptidos FGFR-L Se ha demostrado que los plásmidos recombinantes que codifican para el polipéptido FGFR-L de longitud completa o el dominio extracelular del polipéptido FGFR-L son poco tolerados por células transfectadas (por ejemplo líneas de células CHO, 329 HEK y células estromales) , medido por el número disminuido y la velocidad de crecimiento disminuida de transfectantes estables versus células no transfectadas (figuras 21A-21D) o células transfectadas con un plásmido recombinante que codifica para un mutante puntual del polipéptido FGFR-L. Cuando se agrega Des7-FGFR-L/ECD derivado de E. coli a cultivos de células estromales de médula ósea, se inhibe el crecimiento mediado por FGF pero no mediado por suero (figura 22) . La observación de que FGFR-L/ECD inhibe el crecimiento inducido por proteínas FGF, pero que tiene menos de un efecto inhibidor en el crecimiento inducido por PDGF o suero, sugiere que el polipéptido FGFR-L pueda interactuar, sólo o con un coreceptor, con un ligando natural que tiene homología con la familia FGF. Sorprendentemente, este efecto no se ha observado cuando se utiliza la proteína de fusión FGFR-L/ECD-Fc derivada de CHO, en lugar de Des7-FGFR-L/ECD derivada de E. coli (figura 23) . Se obtienen resultados similares para el crecimiento mediado por FGF y VEGF de células endoteliales vasculares humanas (HUVEC, por sus siglas en inglés) . La diferencia en actividad entre los polipéptidos FGFR-L derivados de CHO y derivados de E. coli se puede deber a las diferencias en la secuencia de aminoácidos en sus partes C o N terminales.

Ejemplo 6: Caracterización in vivo de los Polipéptidos FGFR-L _ Las células de médula ósea murinas, sometidas a transducción con un vector retroviral que presenta un mensaje bicistrónico que codifica para FGFR-L murino de longitud completa y el gen de resistencia a neomicina (o el gen de resistencia a neomicina solo) se utilizan para transplantar 10 receptores irradiados mortalmente, como se ha descrito previamente (Yan et al . , 1999, Exp. Hematol . 27:1409-17) . En cinco de los ratones (seleccionados aleatoriamente para evaluación) , la sobreexpresión del polipéptido FGFR-L durante un período de cuatro meses provoca una disminución de 15% en el peso corporal total, una disminución de 14% en el colesterol sérico y una disminución de 35% en las concentraciones de triglicéridos en suero. Sin embargo, tres semanas después los cinco ratones remanentes fueron pesados y sangrados, y no se observaron cambios similares. -La caracterización in vitro (Ejemplo 5) del polipéptido FGFR-L indica que la proteína es poco tolerada por una variedad de tipos de células de manera que no es inesperada la selección contra la expresión del polipéptido FGFR-L. Como el plásmido recombinante retroviral descrit antes presenta el gen para FGFR-L y el gen de resistencia neomicina en un mensaje bicistrónico, la selección contra l expresión del polipéptido FGFR-L puede resultar en u selección correspondiente contra la expresión neo tambié ya sea por regulación por disminución o transcripción o bie por separación de las células sometidas a transducción. El análisis de transferencia Northern del ARN células mononucleares de sangre periférica (PBMN, por s siglas en inglés) a partir de ratones sometidos transducción FGFR-L/neo que muestran el fenotipo y d ratones control sometidos a transducción neo indica que l ratones control muestran expresión abundante de l transcritos neo del tamaño esperado y que los ratone sometidos a transducción de FGFR-L/neo no (figura 24) . Est sugiere que la expresión del polipéptido FGFR-L s selecciona activamente contra, y precede la desaparici final de un fenotipo transitorio. Aunque la presente invención se ha descrito términos de las modalidades preferidas, se entiende que le ocurrirán variaciones y modificaciones a los expertos la técnica. Por lo tanto, se pretende que l reivindicaciones anexas abarquen la totalidad de tal variaciones equivalentes que se encuentren dentro d alcance de la invención como se reivindica.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclamo como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia nucleotídica como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4; (b) la secuencia nucleotídica del inserto de ADN en ATCC, depósito No. ; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 5; (d) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada con el complemento de la secuencia de cualquiera de los incisos (a)-(c); y (e) una secuencia nucleotídica complementaria con las secuencias de cualquiera de los incisos (a)-(c) . 2. Una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia nucleotídica caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido el cual es por lo menos aproximadamente 70% idéntico al polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad de polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para una variante alélica o variante de maduración (corte y empalme) de la secuencia nucleotídica como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, la secuencia nucleotídica del inserto de ADN en_ ATCC, depósito No. , o (a) ; (c) una región de la secuencia nucleotídica de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, el inserto de ADN en ATCC, depósito No. ,___ (a) o (Jo) .que codifica para un fragmento polipeptídico de por lo menos 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento polipeptídico tiene una actividad del polipéptido codificado, como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, o es antigénico; (d) una región de la secuencia nucleotídica ya sea de la SECUENCIA DE IDEN IFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, el inserto de ADN en ATCC depósito No. __ , o cualquiera de los incisos (a)-(c) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; (e) una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada con el complemento de cualquiera de las secuencias de los incisos (a)-(d); y (f) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de las secuencias de los incisos (a)-(d). 3. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 con por lo menos una sustitución conservadora de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
NÚMERO: 5 con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 con por lo menos una supresión de aminoácido, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 5 ; (d) una secuencia nucleotídica que codifica para un polípéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE
IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, la cual tiene un corte en la parte C o N terminal, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (e) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos, cortes en la parte C terminal y N terminal, en donde el polipéptido codificado tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (f) una secuencia nucleotídica de cualquiera de los incisos (a)-(e) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 16 nucleótidos; (g) una secuencia nucleotídica que hibridiza bajo condiciones de rigurosidad moderada o elevada con el complemento de cualquiera de las secuencias de los incisos (a)-(f); y (h) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de las secuencias de los incisos (a)-(e) .
4. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
5. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 4.
6. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula eucariota.
7. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula procariota.
8. Un proceso para producir un polipéptido FGFR-L, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 5 bajo condiciones adecuadas para expresar el polipéptido, y opcionalmente aislar el polipéptido del cultivo.
9. Un polipéptido, caracterizado porque se produce por el proceso de conformidad con la reivindicación
10. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico comprende ADN promotor diferente del ADN promotor para el polipéptido FGFR-L nativo unido operablemente al ADN que codifica para el polipéptido FGFR-L.
11. La molécula aislada de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el por ciento de identidad se determina utilizando un programa de computadora que se selecciona del grupo que consiste de GAP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit y el algoritmo de Smith-Waterman.
12. Un proceso para determinar si un compuesto inhibe la actividad del polipéptido FGFR-L o la producción del polipéptido FGFR-L, caracterizado porque comprende exponer una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 ó 7 al compuesto, y medir la actividad del polipéptido FGFR-L o la producción del polipéptido FGFR-L en la célula.
13. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; y (b) la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADN en ATCC depósito No. .
14. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6, que opcionalmente comprende además una metionina amino terminal; (b) una secuencia de aminoácidos para un ortólogo ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (c) una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece en ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (d) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 que comprende por lo menos 25 residuos aminoácidos, en donde el fragmento tiene una actividad del polipéptido gue se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, o es antigénico; y (e) una secuencia de aminoácidos para una variante alélica o variante de maduración (corte y empalme) de la secuencia de aminoácidos, como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 5, la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de AD? en ATCC depósito ?o . , o en cualquiera de los lncisos (a)-(c) .
15. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 con por lo menos una sustitución conservadora de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (b) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 con por lo menos una inserción de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la_ SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (c) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 con por lo menos una supresión de aminoácido, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (d) la secuencia de aminoácidos como se establece en ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 la cual tiene un corte en la parte C o N terminal, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; y (e) la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 con por lo menos una modificación que se selecciona del grupo que consiste de sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos, cortes en la parte C o N terminal, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5.
16. Un polipéptido aislado, caracterizado porque es codificado por la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera_de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde el polipéptido tiene una actividad del polipéptido que se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5.
17. El polipéptido aislado, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el por ciento de identidad se determina utilizando un programa de computadora que se selecciona del grupo que consiste de GAP, BLASTP, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit, y el algoritmo de Smith-Waterman.
18. Un agente de unión selectivo o un fragmento del mismo el cual se une específicamente al polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15.
19. El agente de unión selectivo o un fragmento del mismo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se une específicamente al polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece ya sea en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, o un fragmento de la misma-.
20. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
21. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado.
22. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.
23. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo.
24. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.
25. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo.
26. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo injertado con CDR o un fragmento del mismo.
27. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porgue es un anticuerpo antiidiotípico o un fragmento del mismo.
28. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porgue es un fragmento de región variable.
29. El fragmento de región variable, de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque es un fragmento Fab o Fab1.
30. Un agente de unión selectivo o un fragmento del mismo, caracterizado porque comprende por lo menos una región 'determinante de complementariedad con especificidad para el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos ya sea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5.
31. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se une a una marca detectable.
32. El agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque antagoniza la actividad biológica del polipéptido FGFR-L.
33. Uso de un agente de unión selectivo, de conformidad con la reivindicación 18 para la manufactura de un medicamento para tratar, evitar o disminuir una enfermedad, condición o desorden relacionado con el polipéptido FGFR-L.
34. El agente de unión selectivo caracterizado porgue se produce al inmunizar un animal con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de ya sea la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5.
35. Un hibridoma caracterizado porque produce un agente de unión selectivo el cual es capaz de unir un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 6 3.
36. Un método para detectar o cuantificar la cantidad de polipéptido FGFR-L, caracterizado porque utiliza el agente de unión selectivo o el fragmento de conformidad con la reivindicación 18.
37. Una composición caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.
38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el agente de formulación farmacéuticamente aceptable es un portador, adyuvante, solubilizante, estabilizante o antioxidante.
39. La composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA TXE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6.
40. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un derivado del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15.
41. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque está modificado covalentemente con un polímero hidrosoluble.
42. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol, monometoxipolietilenglicol, dextrano, celulosa, poli- (N-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico.
43. Una composición caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.
44. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico está contenida en un vector viral.
45. Un vector viral, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 6 3.
46. Un polipéptido de fusión, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15 fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.
47. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos heteróloga es un dominio constante de IgG o un fragmento del mismo.
48. Uso del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 o 15, o el polipéptido codificado por el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para la manufactura de un medicamento para tratar, evitar o disminuir una condición médica.
49. Uso del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 o 15, o el polipéptido codificado por el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para la manufactura de un medicamento para tratar, prevenir o disminuir un desorden hematopoyético, osteoporosis, osteopetrosis, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad periodontal, hipercalcemia, glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis crónica, cáncer, diabetes, obesidad o caquexia.
50. Un dispositivo, caracterizado porque comprende : (a) una membrana adecuada para implantación; y (b) células encapsuladas dentro de la membrana, en donde las células secretan una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15; y la membrana es permeable a la proteína e impermeable a materiales dañinos a las células .
51. Un método para identificar un compuesto el cual se une a un polipéptido FGFR-L," caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15 con un compuesto; y (b) determinar el grado de unión del polipéptido FGFR-L al compuesto.
52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque comprende además determinar la actividad del polipéptido cuando se une al compuesto .
53. Un mamífero no humano, transgénico, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
54. Un proceso para determinar si un compuesto inhibe la actividad del polipéptido FGFR-L o la producción del polipéptido FGFR-L, caracterizado porque comprende exponer a un mamífero transgénico, de conformidad con la reivindicación 53, al compuesto y medir la actividad del polipéptido FGFR-L o la producción del polipéptido FGFR-L en el mamífero.