MXPA02009117A - Proceso para la preparacion de sales alcalino terreas de acido d-pantotenico. - Google Patents

Abstract

La invencion concierne a la preparacion de sales alcalino terreas de acido D-pantotenico, en la cual la fermentacion es llevada a cabo en la presencia de compuestos alcalino terreos.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACIÓN DE SALES ALCALINO TERREAS DE ACIDO D-PANTOTENICO La presente invención concierne a un proceso para la preparación de sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico desde caldos de fermentación.

Arte previo El ácido pantoténico es una vitamina comercialmente importante que se usa en cosméticos, medicina, nutrición humana y en nutrición animal . El ácido pantoténico puede prepararse por sintesis química o vía biotecnología por fermentación de microorganismos adecuados en soluciones del nutriente adecuado. La DL-pantolactona es un compuesto importante en la síntesis química, y se prepara en un proceso multi-etapas desde formaldehído, aldehido y cianuro isobutílico. Además las etapas del proceso la mezcla racémica se separa y-la D-pantolactona se condensa con ß-alanina para producir ácido D-pantoténico. La ventaja de una preparación fermentativa que usa microorganismos es la formación directa de las formas estereoisométricas correctas, es decir la forma D- de ácido pantoténico libre desde ácido L-pantoténico. Varios tipos de bacterias, por ejemplo Escherichia REF: 141682 coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium amoniagenes y también levaduras, por ejemplo Debaromyces castellii puede, como se demuestra en EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 y WO 97/10340, produce ácido D-pantoténico bajo condiciones de fermentación adecuadas. Particularmente los microorganismos adecuados son los derivados, descritos en las citas, de Escherichia coli IF03547, por ejemplo las cepas FV5069/pFV31 o FV5069/pFV202. En la preparación fermentativa del ácido D-pantoténico como se describe en EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 y WO 97/10340, un microorganismo capaz de producir ácido D-pantoténico se cultiva en un medio nutriente adecuado y el ácido D-pantoténico que se forma es entonces aislado de conformidad con un proceso complicado caro, es purificado, y se obtiene como la sal de calcio. El medio nutriente adecuado contiene una fuente de carbono tal como glucosa o hidrolizado de harina de almidón, precursores tales como ß-alanina, ácido D, -pantoic "o D,L-pantolactona, una fuente de nitrógeno tal como sulfato de amonio, una fuente de fósforo tal como fosfato de potasio, y sales adicionales, elementos en trazas, aminoácidos y vitaminas, y opcionalmente aditivos de medios complejos tales como extracto de levadura o licor de maíz remojado. Los microorganismos se incuban entonces en este medio a un valor de pH adecuado bajo aereación y agitación apropiadas, después de lo cual los microorganismos forman ácido D-pantoténico. EP-A-0 590 857 describe por ejemplo un proceso de alimentación discontinua para preparar ácido pantoténico en un reactor de 5 1 lleno con 2.3 1 o 2.5 1 de medio de cultivo. En este ejemplo experimental se añadió carbonato de calcio sólido presuntamente para regular el pH. La adición preliminar o la adición subsecuente de carbonato de calcio sólido es no obstante, extremadamente indeseable en un reactor a gran escala que tenga un volumen de muchos metros cúbicos, porque el material cargado aumenta por los depósitos de carbonato de calcio sobre las cuchillas agitadoras, superficies y sellos internos, y las propiedades de flujo de líquido de cultivo y las condiciones estériles son afectadas adversamente. De conformidad con el presente arte previo, que se compendia en WO 96/33283 y EP-A-0 590 857, la sal de calcio de ácido D-pantoténico se obtiene por medio de proceso de aislamiento y purificación complicado y costoso que inicia desde un caldo de fermentación rjue contiene ácido pantoténico. Después de una primera separación de la biomasa por filtración ó centrifugación, el filtrado es trabajado adicionalmente por medio de purificación por medio de carbón activado o por medio de cromatografía de columna. Después de añadir hidróxido de calcio al filtrado o eluato pre-tratado, el lote es entonces purificado por cristalización. El método de purificación descrito en WO 96/33283 se lleva a cabo como sigue. El filtrado es decolorado por medio de carbón activado en una primera columna. Se ajusta el pH a 3 con ácido clorhídrico concentrado y el líquido se purifica entonces continuamente a través de dos columna empacada con carbón activado. La elución del ácido D-pantoténico se efectúa con alcohol metílico. Una neutralización subsecuente, se lleva a cabo con Ca(OH)2 polvo mientras que se mezcla en el transcurso de la misma. El D-pantotenato de calcio se obtiene por cristalización subsecuente a 5 °C. El método de purificación descrito en EP-A 0 590 857 se lleva a cabo como sigue. El filtrado es antes de todo, purificado con la ayuda de columnas de intercambio catiónico e intercambio aniónico. La elución se efectúa con ácido clorhídrico. La fracción eluída es entones neutralizada con Ca(OH)2, después de lo cual se añade carbón activado y la mezcla se filtra. El filtrado resultante se extrae en un alcohol de bajo peso molecular (metanol, etanol, isopropanol) y se obtiene el D-pantotenato de calcio por cristalización. El D-pantotenato de calcio preparado de la manera anteriormente descrita se usa como un aditivo alimentario para la nutrición animal .

Objeto de la invención Los inventores proporcionan un proceso mejorado para preparar sales alcalino terreas, en particular las sales de calcio y de magnesio, de ácido D-pantoténico, las cuales son adecuadas para uso como aditivos alimentarios en nutrición animal . Descripción de la invención La vitamina, ácido D-pantoténico es un producto importante comercialmente que se usa en nutrición animal, medicina, nutrición humana y en cosméticos. Hay, por consiguiente, un interés general en proporcionar nuevos procesos para preparar ácido pantoténico o sus sales. La presente invención proporciona un proceso para preparar sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico o mezclas que contengan éste, desde caldos de fermentación, que se caracteriza porque a) la fermentación se lleva a cabo en la presencia de un compuesto alcalino terreo, b) después de completar la fermentación de la biomasa es removida opcionalmente ya sea total o parcialmente, c) el caldo de fermentación elaborado así, se concentra, y d) las sales alcalino terreas o sales del ácido D-pantoténico son obtenidas desde éste , en forma pura o como una mezcla que contenga los constituyentes del caldo de fermentación . La presente invención también proporciona un proceso que está caracterizado porque, una o más de varias sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico, se añaden en la cantidad deseada a los constituyentes del caldo de fermentación y a la mezcla que contiene una o más de las sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico. La invención proporciona además un proceso para preparar sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico, caracterizado porque a) la biomasa se separa desde un caldo de fermentación que contenga sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico, b) el caldo de fermentación libre de - células se concentra, c) un solvente orgánico hidrofílico, en particular etanol, metanol o acetona, se añaden al concentrado así obtenido, después de lo cual d) las sales alcalino terreas de ácido pantoténico se aislan, opcionalmente se lavan con un solvente orgánico hidrofílico y luego, si se desea, e) se recristaliza en una solución acuosa de solvente orgánico hidrofílico, opcionalmente con la adición de carbón activado, y se obtienen con un alto grado de pureza. Todos los microorganismo que son capaces de producir ácido D-pantoténico y que producen ácido D-pantoténico bajo condiciones de fermentación apropiadas son adecuadas para el proceso de conformidad con la invención. Los microorganismos pueden producir ácido pantoténico desde glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón, celulosa, o desde glicerol y etanol. Los microorganismos pueden ser hongos o levaduras, por ejemplo Debaromyces castellii , o Sacharomyces cerevisiae o bacterias Gram-positivas, por ejemplo del género Corynebacterium o pueden ser bacteria Gram-negativa, por ejemplo de la familia de Enterobacteriaceae . En la familia de Enterobacteriaceae, el género Escherichia como se ejemplifica por el tipo Escherichia coli debería ser mencionado en particular. En el tipo Escherichia coli se mencionaría la cepa denominada K-12, por ejemplo las cepas MG1655 o W3110 (Neidhard y colaboradores: Escherichia coli y Salmonella. Cellular and Molecular Biology ASM Press, Washington D.C.) o la cepa tipo salvaje de Escherichia coli IF03547 (Institute for Fermentation, Osaka, Japón) y mutantes derivados de las mismas. Entre las cepas obtenidas desde IF03547, se mencionaría a su vez FV5069/pFV31 (EP-A-0 590 857, US-A 5 518 906) y FV5069/pFV202 (WO 97/10340, US-A-5 932 457) . En el género Corynebacterium el tipo Corynebacterium glutamicum se mencionaría en particular. Los microorganismos anteriormente descritos pueden ser cultivados continua o discontinuamente en un proceso discontinuo o en una alimentación discontinua o proceso discontinuo con alimentación repetida a fin de producir sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico. Un sumario de los métodos de cultivo conocidos se describe en el manual por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Introduction to Biotechnology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el manual por Storhas (Bioreacktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994) . El medio de cultivo a ser usado debe de satisfacer adecuadamente los requerimientos de los microorganismos relevantes. Las descripciones de los medios de cultivo para varios microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., U.S.A., 1981). Los azúcares y carbohidratos, por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como aceite de semilla de " soya, aceite de girasol, aceite de maní y aceite de coco, ácidos grasos, por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol, y también ácidos orgánicos tales como ácido acético pueden usarse como fuentes de carbono. Estas substancias pueden ser usadas individualmente o como una mezcla. Como fuente de nitrógeno puede usarse por ejemplo compuestos orgánicos que contengan nitrógeno tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maíz remojado, harina de semilla de soya y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse individualmente o como una mezcla. Como fuente de fósforo puede usarse fosfato dihidrogenado de potasio o bifosfato dipotásico o las sales correspondientes de sodio. El medio de cultivo debe de contener también sales metálicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, factores esenciales para el crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas pueden ser usados adicionalmente junto con las substancias mencionadas anteriormente. Precursores tales como ß-alanina u opcionalmente sus sales, pueden añadirse adicionalmente al medio de cultivo. Las substancias anteriormente mencionadas pueden añadirse al cultivo en la forma de una sola adición o puede ser apropiadamente dosificada durante el cultivo. Pueden usarse, compuestos básicos tales como amoníaco o agua amoniacal o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico de una manera apropiada para controlar el pH del cultivo, en cuanto al proceso de conformidad con la invención, que no involucre cualquier otra medida. Agentes anti-espumantes tales como esteres poliglicólicos de ácido graso, pueden usarse para controlar la formación de espuma. Substancias que actúan selectivamente adecuadas, por ejemplo antibióticos, pueden añadirse para mantener la estabilidad de los plásmidos. Oxígeno o mezclas de gases que contengan oxígeno, por ejemplo aire, son introducidos en el cultivo a fin de mantener condiciones aeróbicas. La temperatura del cultivo está normalmente entre 20 °C y 50 °C, y preferiblemente 25 °C a 45 °C. El cultivo se continúa hasta que se ha formado una cantidad máxima de ácido D-pantoténico. Este objetivo se logra normalmente en 10 horas a 160 horas. Se encontró que las sales alcalino terreas, en particular la sal de calcio y la sal de magnesio del ácido D-pantoténico, pueden producirse de una manera simple, añadiendo durante la fermentación una solución o suspensión de un compuesto inorgánico que contenga alcalinotérreos, tales como por ejemplo hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio, en particular hidróxido de calcio óxido de magnesio, o también la sal alcalino terrea de un ácido orgánico, por ejemplo acetato de calcio, fumarato de calcio o aspartato de calcio, continuamente a la fermentación. Es también posible dosificar de manera discontinua el compuesto que contenga alcalino térreos. De esta manera el catión necesario para formar la sal alcalino terrea deseada de ácido D-pantoténico se introduce directamente en el caldo de fermentación. El proceso de fermentación de conformidad con la invención está caracterizado generalmente porque un microorganismo capaz de producir ácido D-pantoténico es antes que nada cultivado de una manera conocida utilizando amoníaco como regulador de pH y fuente de nitrógeno y en la etapa siguiente de producción el pH es ajustado preferiblemente utilizando una solución o suspensión de un compuesto que contenga alcalinotérreos, por ejemplo hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio, óxido de magnesio, acetato de calcio, fumarato de calcio o aspartato de calcio. Si se usan las sales de calcio de ácidos orgánicos, los radicales orgánicos se µtilizan generalmente como una fuente de carbono para los microorganismos. Las soluciones o suspensiones de los compuestos que contienen alcalino térreos que se usan, en particular hídróxido de calcio e hidróxido de magnesio, tienen una concentración de 5 - 50% en peso, preferiblemente 5 - 30% en peso, siendo más preferido mayormente el rango desde 10 -25% en peso. Es también posible, de conformidad con la invención, emplear mezclas de varios compuestos que contengan alcalino térreos en estos rangos de concentración.

El compuesto alcalino terreo es dosificado de una manera tal que la proporción molar de compuesto alcalino terreo al ácido D-pantoténico está en el rango de 1: 0.5 hasta 1: 20, preferiblemente en el rango de 1: 1.3 hasta 1: 10, más preferiblemente en el rango de 1: 1.3 hasta 1: 2.5, siendo mayormente preferido el rango estequiométrico desde 1: 1.8 hasta 1: 2.2. Si es necesario, durante el transcurso de la fermentación el pH, puede ser ajustado dosificando amoníaco en forma acuosa o como un gas, habría una formación excesiva de subproductos que contengan grupos carboxilos, a fin de mantener la proporción de compuesto alcalino terreo a ácido D-pantoténico formado en el rango deseado. La dosificación del compuesto alcalino terreo puede tener lugar después de un tiempo de fermentación de 1 - 70 horas, preferiblemente 10 - 40 horas y mayormente se prefiere 20 - 25 horas. La concentración de ácido D-pantoténico al principio de la dosificación del compuesto alcalino terreo es generalmente 0.5 - 70 g/l, preferiblemente 5 - 35 g/l y particularmente se prefiere 20 - 25 g/l . La concentración de biomasa en el momento que el compuesto alcalino terreo es dosificado es generalmente 1 -30 g de peso seco/ 1., preferiblemente 10- 23 g de peso seco/1, y particularmente se prefiere 17- 21 g de peso seco/1. La presente invención, también proporciona un proceso para producir polvos de aditivos alimentarios que contengan sales alcalino terreas, en particular la sal de calcio o la sal de magnesio de ácido D-pantoténico, de una manera rápida y efectividad de costo. Para este fin un caldo de fermentación preparado de conformidad con el proceso de la invención y que contenga en particular D-pantotenato de magnesio o de calcio, es concentrado utilizando métodos conocidos, por ejemplo con la ayuda de un evaporador rotatorio o evaporador de película fina o evaporador de película descendente. El caldo de fermentación que ha sido concentrado de esta manera es entonces convertido por técnicas de secado por atomización o por congelación, tales como las descritas por ejemplo en el manual por M. L. Shuler y F. Kargi "Bioprocess Engineering, Basic Concepts" (Prentice Hall Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1992) , o por otros métodos apropiados, preferiblemente en un polvo que fluye libremente o aditivo alimentario. Una substancia o preparación que contiene D-pantotenato de calcio o de magnesio puede opcionalmente añadirse en una etapa del proceso adecuada a fin de lograr un nivel de concentración adecuado. La concentración de D-pantotenato de calcio o de magnesio - expresada como ácido D-pantoténico- en el producto resultante es 20 - 80 % en peso, preferiblemente 30 a 75 % en peso. El producto es adecuado como aditivo alimenticio para uso en nutrición animal. Los inventores encontraron también un método adicional de producir polvos o aditivos alimentarios que contengan D-pantotenato de calcio o de magnesio. Para este fin un caldo de fermentación preparado como se describió anteriormente y que contenga en particular D-pantotenato de calcio o de magnesio es antes que nada liberado, ya sea total o parcialmente _ de la biomasa por métodos de separación conocidos, por ejemplo centrifugación, filtración, decantación o una combinación de éstos. El caldo de fermentación libre de células es entonces concentrado utilizando métodos conocidos, por ejemplo con la ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de película fina o evaporador de película descendente. La suspensión concentrada de esta manera es entonces trabajada por métodos que involucran secado por atomización o secado por congelación o por otros procesos adecuados en un polvo de flujo libre preferiblemente. Una substancia o preparación que contenga D-pantotenato de calcio o de magnesio se añade opcionalmente en una etapa del proceso adecuada a fin de lograr un valor de concentración adecuado. La concentración de D-pantotenato de calcio o de magnesio - expresada como ácido D-pantoténico - en el producto resultante, es 20 a 80 % en peso, preferiblemente 30 - 75 % en peso. El producto es adecuado para uso como un aditivo alimentario en nutrición animal . Los inventores han descubierto igualmente un método para producir cristales que contengan D-pantotenato de calcio o de magnesio de una manera rápida y efectiva en costo. Para este fin un caldo de fermentación preparado como se describió anteriormente y que__contenga D-pantotenato de calcio o de magnesio, es antes que nada liberado como se describió anteriormente, de la biomasa. El caldo de fermentación celular es entonces concentrado, utilizando métodos conocidos, por ejemplo con la ayuda de evaporador rotatorio, evaporador de película fina o evaporador de película descendente. Un solvente orgánico, hidrofílico, por ejemplo etanol, metanol o acetona se añade entonces a la suspensión que se ha concentrado de esta manera. El material sólido residual es separado por precipitación al enfriar la suspensión a 0 - 8 °C, preferiblemente 0 - 5 °C. La sal deseada es . entonces cristalizada inoculando con D-pantotenato de calcio o de magnesio o substancias que contengan D-pantotenato de calcio o de magnesio cristalino.

La cristalización tiene lugar a 0 - 8 °C, preferiblemente 0 °C, y termina desde 1 hora hasta 12 días, preferiblemente 1 hora a 10 días, y particularmente preferiblemente 1 hora a 8 días. La cosecha cristalina obtenida de esta manera es preferiblemente lavada con metanol y luego secada. Si un producto de pureza más alta se requiere, la cosecha cristalina es tomada en una solución de metanol que contenga agua y es cristalizada, opcionalmente bajo la adición de carbón activado. La solución de metanol que contiene agua tiene un contenido de metanol de 70 a 99 % en volumen, preferiblemente 80 a 99 % en volumen, y particularmente preferible 90 a 99 % en volumen. La concentración de D-pantotenato de calcio o de magnesio en el producto cristalino obtenido de esta manera es 60 a 99 % en peso, preferiblemente 70 a 99 % en peso, y particularmente preferible de 80 a 99 % en peso. El producto es adecuado para uso como un aditivo alimentario en nutrición animal . La concentración de ácido D-pantoténico puede determinarse por métodos conocidos (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)). El D-pantotenato de calcio puro (> 99 % en peso) tiene un contenido de 91.16 % en peso de ácido pantoténico. El D-pantotenato de magnesio puro (> 99 % en peso) tiene un contenido de 94.73 % en peso de ácido D-pantoténico . Ejemplos La presente invención se describe con más detalle- en lo sucesivo con la ayuda de ejemplos de implementación. Para este propósito se llevaron a cabo experimentos con la cepa Escherichia coli 5069/pFV31 que produce ácido D-pantoténico, el cual es registrado como FERM-BP 4395 de conformidad con el Acuerdo de Budapest en el Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology en 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki (Japón) US-A-5 518 906) . Se llevaron a cabo también experimentos de fermentación, en los cuales la sal de calcio de ácido fumárico o de ácido aspártico se añadieron al caldo de fermentación a fin de formar directamente el D-pantotenato de calcio. Ejemplo 1 Preparación de la sal de calcio de D-pantotenato que involucra la dosificación de una suspensión de hidróxido de calcio 1. Preparación del inoculo (banco de células madres) Una muestra de Escherichia coli FV5069/pFV31 se plaqueó sobre agar LBG que había sido suplementado con 50 µg por ml de ampicilina. Este cultivo en placa de agar se incubó por 17 horas a 37 °C y luego se conservó en un recinto refrigerado a +40°C. Las colonias individuales seleccionadas se propagaron entonces en caldo LBG. El caldo LBG tiene la siguiente composición: 10 g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 1 g/l de -glucosa. El agar LBG contenía además 12 g/l de agar. Las preparaciones listas para su uso fueron obtenidas de Gibco/BRL (Paisley, Scotland, UK) como Caldo LB Base o agar LBE el medio especificado se obtuvo entonces por adición de 1 g/l de glucosa. Cultivos de 10 ml que se obtuvieron en matraces Erlenmeyer, se incubaron por 16 horas a 37 °C y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza) . La suspensión celular fue entonces separada por centrifugación por 15 minutos a 4000 rpm en una centrífuga J-6B de Beckmann (Hanover, Alemania) . El compactado celular fue resuspendido en 10 ml de medio LBG que había sido suplementado con 20 % de glicerol, se llenó en 10 alícuotas de 1 ml cada una [sic] bajo condiciones estériles y se congelaron a -70 °C. Estos cultivos se usaron como banco de células madres. A fin de preparar un banco de células de trabajo, el medio LBG que había sido suplementado con 50 µg/ml de ampicilina se añadió en porciones de 10 ml a matraces Erlenmeyer de 100 ml y luego se inocularon con 100 µl del banco de células madres anteriormente descrito. La incubación se llevó a cabo por 16 horas a 37 °C y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza) . Después de la incubación, la densidad óptica (OD) de la suspensión del cultivo se determinó con un fotómetro LP2W de Dr Lange Company (Berlin, Alemania) a una medida de longitud de onda de 660 nm. La densidad óptica fue 3.5. La suspensión celular se añadió entonces bajo condiciones estériles a tubos de ensayo de polietileno de 30 ml estériles de Greiner (Frickenhausen, Alemania) y se centrifugó a 2500 rpm por 15 minutos en una centrífuga tipo J-6B de Beckman (Hanover, Alemania) . La biomasa separada se resuspendió en 10 ml de medio LBG que había sido suplementado con glicerol al 20 %. La suspensión celular fue después añadida en porciones de 500 µl bajo condiciones estériles a tubos de ensayo estériles de 1 ml de Nalgene (New York, U.S.A.) y se congelaron a -70 °C. Las suspensiones celulares congeladas preparadas de esta manera se usaron como banco celular de trabajo. 2. Preparación de un caldo de fermentación que contenga D-pantotenato de calcio A fin de preparar un caldo de fermentación que contenga D-pantotenato de calcio el banco de células de trabajo se propagó antes que nada en una incubadora con matraz agitador y fue usada luego para inocular un fermentador preliminar. El cultivo del fermentador preliminar se usó para inocular el fermentador de producción. El medio SK se usó para el cultivo en matraz agitador (Tabla 1) . El medio SKA se preparó como sigue: 7 JO g de (NH4)2S04, 0.5 g de KH2P04, 1.0 g de K2HP04, 0.5 g de MgS04.7H20, 0.01 g de MnS04.H20, 0.01 g de ZnS04.7H20, 0.005 g de Fe2(S0 )3 y 20 g de licor de maíz remojado que había sido previamente ajustado a pH 6.8 con solución amoniacal al 25%, fue pesado en un vaso de precipitados de 1 1, que fue aforado a 825 g con agua destilada. Esta solución de sales que contenía el licor de maíz remojado se esterilizó en una autoclave por 20 minutos a 121 °C. Una solución que consiste de 24 g de glucosa y 0.002 g de Tiamina HCl, que había sido aforada a 125 g con agua destilada, se esterilizó por filtración. Se pesaron 10 g de CaC03 en un matraz de 100 ml y se esterilizaron en una autoclave por 20 minutos a 123°C. El medio SKA se obtuvo al combinar los dos componentes anteriormente mencionados con la solución de sales que contenía el licor de maíz remojado. El medio SKA se añadió en porciones de 12.5 ml a un matraz Erlenmeyer de lOOml y luego se inoculó con 0.5 ml de suspensión celular. Una muestra congelada de cultivo de células de trabajo que había sido diluida 1:100 con solución salina fisiológica estéril se usó como suspensión celular. La incubación se llevó a cabo por 20 horas a 32 °C y 150 rpm en una incubadora RC-l-TK de Infors AG (Bottmingen, Suiza) . La densidad óptica determinada subsecuentemente a una longitud de onda medida de 660 nm (OD 660) fue de 12.5. A fin de inocular 20 kg del medio de pre-cultivo Al-102 que había sido obtenido en un reactor fermentador con agitación de 42 1 de capacidad de Bioengineering (Wald, Suiza, Modelo LP-42) , 0.5 ml de medios SKA se diluyeron 1:100 y 50 ml de la suspensión resultante se añadieron al fermentador. El medio de pre-cultivo Al-102 contuvo los constituyentes enlistados en la Tabla 2. El cultivo fue cultivado por 15.5 horas a temperatura de 37 °C, se alcanzó una aereación específica en volumen de 0.5 vvm, una presión parcial de oxígeno de 20 % de saturación atmosférica, y un pH de 6.5 hasta OD660 de 11.3. Para la inoculación de 5830 g del medio de cultivo principal Ml-425 que había sido obtenido en fermentadores reactores con agitación de 14 1 de capacidad de B. Braun (BBI, Alemania, Melsungen, Biostat Modelo E/ED) , 423 ml del segundo precultivo se añadieron al medio Al-102. El medio de cultivo principal Ml-425 contuvo los constituyentes enlistados en la Tabla 3. El cultivo fue antes que nada cultivado por 6.5 horas a una temperatura de 37 °C, se alcanzó una aereación en volumen de 0.75 wm, una velocidad de agitación mínima de 400 rpm, a pH de 6.5 hasta un OD660 de 18.6, y una presión parcial de oxígeno de 2 % de saturación atmosférica. El cultivo fue entonces cultivado por unas 41 horas adicionales a una temperatura de 37 °C, se alcanzó una presión parcial de oxígeno de 2 % de saturación atmosférica y un pH de 6.0, hasta un OD660 de 66.8. Después de un tiempo de fermentación de 13 horas se añadió ß-alanina en una concentración de 152.7 g en 570 ml de H20 durante un período de 34.5 horas. Después de un tiempo de fermentación de 21.5 horas, una solución al 10 % de Ca (OH) 2 se añadió durante un período de 26 horas a fin de estabilizar el pH.

Se dosificaron en 41 horas 3.43 kg del medio M2-257 que tenía una concentración de glucosa de 650.8 g/l y una concentración de tiamina HCl de 35.7 mg/ml. Se determinó la densidad óptica (OD) con un fotómetro digital tipo LP1W de Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Alemania) a una longitud de onda medida de 660 nm, y la concentración del ácido D-pantoténico formado se determinó por medio de HPLC (Hypersil APS 2 5 µm, 250 x 5 mm, detección IR) . En la muestra de fermentación después de 47.5 horas se determinó una concentración de D-pantotenato de calcio de 49.8 g/l medida como ácido D-pantoténico.

Tabla 1 Composición del medio SKA Componente Concentración (por litro) Glucosa 25 g Licor de maíz remojado 20 g (NH4)2S04 V g KH2P?4 0.5 g K2HP04 1 9 MgS04.7H20 0.5 g FeS04.7H20 5 mg MnS04.H20 10 g ZnS04.7H20 1 mg CaC03 10 g Cloruro de tiamina. HCl 2 mg Estructol 0.7 g Tabla 2 Composición del medio Al -102 Componente Concentración (por litro) Glucosa 25 g Licor de maí z remoj ado 20 g (NH4) 2S04 7 g KH2P04 0.5 g K2HP04 i g MgS04 . 7H20 0.5 g FeS04 . 7H20 10 mg MnS04 . H20 10 g Cloruro de tiamina. HCl 3 mg Estructol 0.6 g Tabla 3 Composición del medio Ml-425 Componente Concentración (por litro) Glucosa 18 g Licor de maíz remoj ado 40 g ß-alanina 15 g NH4C1 6 . .8 g (NH4) 2S04 3. .3 g KH2P04 0. .6 g K2HP04 1. .2 g MgS04 . 7H20 0, .67 g MnS04 . H20 10 g Cloruro de tiamina.HCl 1. .6 mg Estructol 0. .6 g Ej emplo 2 Preparación de la sal de calcio del ácido D-pantoténico que involucra la dosificación de una solución de acetato de calcio La cepa de Escherichia coli FV5069/pFV31 fue cultivada en el medio SKA del matraz agitador como se describió en el Ejemplo 1 (Tabla 1) . La suspensión se diluyó entonces 1:100 y 17.5 ml de esta suspensión en esta dilución se usaron para inocular 7 kg de medio Al-102 (Tabla 2) en un fermentador con agitación de 14 1 de capacidad (BBI, Alemania, Melsungen, Biostat Modelo E) . El cultivo se cultivó por 15.5 horas a una temperatura de 37 °C, se alcanzó una aereación específica en volumen de 0.5 vvm, una presión parcial de oxígeno de 20 % de saturación atmosférica y un pH de 6.5 hasta un OD660 de 11.6. Después de inoculación en el fermentador de producción (fermentador reactor con agitación de 14 1, BBI, Alemania, Melsungen, Biostat Modelo ED) se establecieron las mismas condiciones de cultivo que se describieron en el Ejemplo 1.

Una solución al 25 % en peso de acetato de calcio se usó para ajustar el pH. El reemplazo del agua amoniacal por acetato de calcio fue total después de 24 horas. El tiempo total de proceso de la fermentación fue de 52 horas. La dosificación de 3.4 kg de medio M2 se efectuó en un período de 40 horas. Al final de la fermentación se determinó una concentración de D-pantotenato de calcio de 43.7 g/l", medida como ácido D-pantoténico. Ejemplo 3 Preparación de un producto que contiene D-pantotenato de calcio 1.0 1 del caldo de fermentación preparado de conformidad con el método descrito en el ejemplo 1 y que contenía D-pantotenato de calcio fue antes que nada evaporado al vacío a 60 °C en un evaporador rotatorio (evaporador rotatorio de laboratorio Rotavapor Büchi RE-120 , Büchi-Labortechnik GmbH, Constance, Alemania) para reducir la fracción líquida hasta aproximadamente 50 % de contenido seco. El caldo concentrado de esta manera fue entonces secado por atomización para obtener la sal de calcio del ácido pantoténico (secador por atomización de laboratorio Büchi-190, temperatura de entrada de 107 °C, temperatura de salida de 78 °C, -40 mbares, 600 NL/h, Büchi-Labortechnik GmbH, Constance, Alemania) . El producto preparado de esta manera tuvo un contenido de 42 % en peso medido como ácido D-pantoténico. Ejemplo 4 Preparación de un producto libre de biomasa que contiene D-pantotenato de calcio Antes que nada, se separó la biomasa por centrifugación (centrífuga de laboratorio Biofuge-Stratos, Heraus, Dusseldorf, Alemania; 20 minutos, 4000 rpm) en 1.0 1 del caldo de fermentación que contenía D-pantotenato de calcio, preparado de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 1. El caldo tratado de esta manera fue entonces procesado al vacío a 60°C, en un evaporador rotatorio (Büchi-Labortechnik GmbH, Constance, Alemania) para reducir la fracción líquida hasta aproximadamente 50 % de contenido seco. El caldo concentrado de esta manera fue entonces secado por atomización para formar la sal de calcio de ácido pantoténico (secador por atomización de laboratorio Büchi-190, temperatura de entrada 107°C, temperatura de salida 78°C, -40 mbares, 600 NL/h, Büchi-Labortechnik GmbH, Constance, Alemania) . El producto preparado como se describió anteriormente tuvo un contenido de 64% en peso, medido como ácido pantoténico. Ejemplo 5 Preparación de D-pantotenato de calcio cristalino 3,600 g del caldo de fermentación preparado de conformidad con el Ejemplo 1 y que contenía D-pantotenato de calcio fueron separados de la biomasa por filtración y el filtrado resultante fue reducido a 700 g por evaporación a 60°C en un evaporador rotatorio (evaporador rotatorio de laboratorio Büchi Rotavapor RE-151 , Büchi -Labortechnik GmbH, Constance, Alemania) . El residuo se tomó y se disolvió en 3,200 g de metanol. Después de enfriar la solución a temperatura ambiente se separaron los constituyentes insolubles por centrifugación (centrífuga de laboratorio Biofuge-Stratos, Heraus, Dusseldorf, Alemania; 20 minutos, 4,000 rpm). El sobrenadante clarificado de esta manera fue entonces concentrado a sequedad una vez más en un evaporador rotatorio y el residuo fue tomado otra vez en 950 g de metanol . Después de enfriamiento a una temperatura de 2 °C la cristalización de la sal de calcio del ácido pantoténico desde la solución concentrada así obtenida fue iniciada por inoculación con 2.5 g de D-pantotenato de calcio cristalino. Después de separar la fase orgánica al vacío se obtuvo un producto cristalino, que tuvo un contenido de D-pantotenato de calcio de 84 % en peso. En una etapa de recristalización adicional la concentración se aumentó exitosamente a 96 % en peso. Ejemplo 6 Preparación de la sal de magnesio de ácido D-pantoténico que involucra la dosificación de una suspensión de hidróxido de magnesio La preparación del inoculo para el cultivo primario se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 1. Para la inoculación de 5830 g de medio de cultivo primario Ml-425 que había sido obtenido en un reactor fermentador " agitado con capacidad de 14 1 de B . Braun (BBI, Alemania, Melsungen, Biostat Modelo E/ED) se añadieron 846 ml del segundo precultivo en medio Al-102. El medio de cultivo primario Ml-425 contuvo los constituyentes enlistados en la Tabla 3. El cultivo antes que nada fue cultivado por 6.5 horas a una temperatura de 37°C, se alcanzó una aereación específica en volumen de 0.75 wm, una velocidad de agitación mínima de 400 rpm y un pH de 6.5 hasta un OD660 de 22.0, y una presión parcial de oxígeno de 2% de saturación atmosférica. El cultivo fue entonces cultivado por unas 48 horas adicionales a una temperatura de 37°C, se alcanzó una presión parcial de oxígeno de 2% de saturación atmosférica, y un pH de 6.0 hasta un OD660 de 67.6. Después de un tiempo de fermentación de 23.0 horas, se dosificó una suspensión al 15% de Mg(OH)2, durante un período de 31.5 horas para estabilizar el pH. Se dosificaron en 48 horas, 4.28 kg del medio M2-261 que tenía una concentración de glucosa de 584.7 g/l, una concentración de ß-alanina de 50.7 g/l y una concentración de tiamina HCl de 35.7 mg/l. La densidad óptica (OD) se midió con un fotómetro digital tipo LP1W de Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Alemania) a una medida de longitud de onda de 660 nm y la concentración de ácido D-pantoténico formado se determinó por medio de HPLC (Hypersil APS 2 5 µm, 250 x 5 mm, detección IR) . Una concentración de D-pantotenato de magnesio de 48.2 g/l medida como ácido D-pantoténico se determinó en una muestra final de fermentación después .de 54.5 horas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Proceso para preparar sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico o mezclas que contengan éste, desde caldos de fermentación, caracterizado porque: a) la fermentación se lleva a cabo en la presencia de compuestos alcalino térreos b) después de completar la fermentación la biomasa se remueve opcionalmente total o parcialmente, c) el caldo de fermentación así preparado se concentra, y d) la sal o sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico es o son obtenidas desde ahí en forma pura o como una mezcla que contiene los constituyentes del caldo de fermentación .
2. 2. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el comienzo de la adición del compuesto alcalino terreo empieza cuando la concentración de ácido D-pantoténico es 0.5 a 70 g/l, preferiblemente 5 a 35 g/l.
3. 3. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto alcalino terreo es añadido al caldo de fermentación en una proporción molar de 1:0.5 hasta 1: 20, en particular 1: 1.3 hasta 1: 10, en relación al ácido D-pantoténico.
4. 4. Proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque los compuestos que contienen alcalino térreos se añaden durante la fermentación al caldo de fermentación, continuamente o de manera discontinua, individualmente o en una mezcla, al menos en la misma proporción estequiométrica que se forma el ácido D-pantoténico.
5. 5. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado porque se añade una sal de calcio de uno o más ácidos orgánicos, en particular de ácido fumárico o ácido aspártico.
6. 6. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado porque hidróxido de calcio, óxido de calcio, óxido de magnesio o hidróxido de magnesio son usados como compuestos alcalino térreos.
7. 7. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) se separa la biomasa del caldo de fermentación que contiene las sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico. b) el caldo de fermentación libre de células se concentra, c) se añade al concentrado así obtenido, un solvente orgánico hidrofilico, y luego d) las sales alcalino terreas de ácido pantoténico son cristalizadas y si es necesario purificadas adicionalmente.
8. 8. Proceso de conformidad con una o más de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque una o más de varias sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico son añadidas a los constituyentes del caldo de fermentación y a la mezcla que contiene una o más sales alcalino terreas de ácido D-pantoténico.