MXPA02005452A

MXPA02005452A - Metodo de mejorar la calidad de masa y pan.

Info

Publication number: MXPA02005452A
Application number: MXPA02005452A
Authority: MX
Inventors: Borch Soe Jorn
Original assignee: Danisco
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2002-11-29
Also published as: CN1407856A; NZ518687A; BR0016068A; EP1108360A9; EP1108360A1; JP2003515332A; AU1723801A; EP1233676A1; CA2392116A1; WO2001039602A1

Abstract

La invencion se refiere un metodo para preparar una masa, en donde dicho metodo comprende la adicion de una enzima, capaz de hidrolizar simultaneamente un lipido no polar, un glicolipido y un fosfolipido, a la masa; uno o mas sustratos para la enzima pueden anadirse, por ejemplo, galactolipidos, como digalactodiglicerido (DGDG) o fosfolipidos, v.g., fosfatidilcolina (PC); los sustratos lipidos pueden agregarse a la masa en forma de lipidos de cereales, como el aceite de avena; el metodo provee masas con una mayor extensibilidad y menor pegajosidad y productos horneados con un alto volumen especifico, mejor suavidad y una excelente estructura del migajon.

Description

MÉTODO DE MEJORAR LA CALIDAD DE MASA Y PAN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de fabricación de masas de harina y productos hechos a base de masa de harina y, en particular, al mejoramiento de la resistencia y maquinabilidad de masas y el volumen y la estructura del migajón del pan y otros productos horneados. Específicamente, la invención provee un método para preparar masas y pan mediante enzimas que pueden hidrolizar lípidos tanto polares como no polares presentes en la masa, mejorando la calidad de la masa y los productos horneados finales.

ANTECEDENTES TÉCNICOS Y TÉCNICA ANTERIOR En el ámbito de la industria de panificación es una práctica común utilizar enzimas, como amilasas, xilanasas, oxidasas y proteasas para el mejoramiento de la masa y las propiedades de manejabilidad de masas y/o el mejoramiento del producto horneado para obtener mayor volumen, suavidad y endurecimiento retardado. También se conoce el uso de lipasas como aditivos de horneado. Las lipasas (EC 3.1.1.3), que pueden definirse como carboxilesterasas que catalizan la hidrólisis de los acilgliceroles, son enzimas fisiológicamente muy *ifripsrfantes como una de las tres enzimas digestivas principales junto con las amilasas y proteasas. Estas hidrolizan los lípidos de los acilgliceroles a glicerol y ácidos grasos, pero también pueden actuar en reacciones de esterificación y transesterificación. Por lo tanto, el documento US 3,368,903 describe preparaciones de lipasa purificada aislada de semillas vegetales que, cuando se añaden a una mezcla de masa de pan, presentan un efecto de retardo significativo en el endurecimiento del pan. El documento JP-62-285749-A describe un método de preparación de pan en el cual se añade la lipasa a la masa mezclada con gluten vital y lecitina. Sin embargo, se afirma que esta lipasa deteriora las propiedades de calidad, como el volumen del pan y la elasticidad del migajón. Mohsen et al. (Egypt. J. Food Sci., 1986, 14:175-182) describen que una lipasa producida por Rhizopus delemar puede mejorar la suavidad del pan. Una composición que mejora el pan que comprende glucosa oxidasa en combinación con oxidasas o hidrolasas, como la lipasa, se describe en el documento EP 468 731 A1. Se obtiene pan con un volumen suficiente. Sin embargo, de conformidad con este documento de la técnica anterior, el uso de la lipasa por sí sola no produce un pan con una calidad satisfactoria. El documento WO-94/04035 describe un método para mejorar las propiedades de una masa (con y sin grasa agregada) y/o un producto p?tn4ado hecho de la masa añadiendo una lipasa (EC 3.1.1.3) de origen microbiano a la masa. El uso de lipasa microbiana produjo un mayor volumen y mejora suavidad del producto horneado. Además, se observó un efecto antiendurecimiento. El documento EP 585 988 A1 describe una composición que mejora el pan que comprende por lo menos una lipasa, por lo menos una hemicelulasa y por lo menos una amilasa. Los experimentos de horneado mostraron que el uso de la lipasa sola en una masa sin grasa agregada produjo un volumen reducido del producto horneado, mientras que no se observó ningún efecto cuando la lipasa se utilizó en una masa que comprendía grasa agregada. El documento WO98/45453 describe el uso de una forma de lipasa, Aspergillus niger, para el mejoramiento de la estructura de miga del pan. Sin embargo, esta enzima no tuvo efectos significativos de mejoramiento en el volumen y la suavidad del pan. Por lo tanto, de la técnica anterior se puede derivar que los efectos de las lipasas, cuando se utilizan como aditivos del pan, son altamente variables con respecto al anti-endurecimiento o al retardo de la firmeza de miga y al mejoramiento del volumen del pan. Un efecto significativo de la lipasa que se describe en el documento WO98/45453 es que, además de su efecto hidrolizante de triglicérido, es capaz de hidrolizar glicolípidos polares presentes en la harina, como por ejemplo digalatosildiglicérido (DGDG). Se creó la hipótesis de que el ll?l ^i.idáú. efecto que mejora la estructura del migajón del pan podría asociarse con este último efecto. Asimismo, se mostró que la lipasa Aspergillus niger no ejerce un efecto hidrolizante en los fosfolípidos. Es una práctica usual utilizar las fosfolipasas para mejorar la calidad del pan. Por lo tanto, el documento JP-82-66213 describe el uso de la fosfolipasa C y la lisofosfolipasa para el mejoramiento de masas congeladas, el documento EP 575 133 A describe el uso de la fosfolipasa A1 para mejorar las propiedades de manejabilidad de las masas, el documento JP-60-078529 describe el uso de una fosfolipasa A para mejorar tas propiedades mecánicas de masas y fideos de harina de trigo y el documento EP 109 244 A describe que la fosfolipasa A puede utilizarse para mejorar las propiedades de las masas. A pesar de que la adición de lipasas o fosfolipasas a las masas de harina para mejorar las propiedades mecánicas de las masas y/o la calidad de los productos horneados finales se conoce en la técnica, es un problema importante que se limite la cantidad de sustratos de lípidos para las respectivas enzimas presentes en la harina. El sustrato para lipasas en una masa de harina de trigo son los lípidos endógenos de los cuales aproximadamente el 50% son lípidos no polares y el 50% son glicolípidos y fosfolípidos polares. Varias de las lipasas que se emplean actualmente en la industria de la panificación, incluyendo aquellas que se describen en el documento EP 585 998 y WO94/04035 son solamente activas contra la fracción de lípidos no * pdlí s, produciendo la formación de ácidos grasos libres y glicerol y, en menor grado, mono o diglicéridos. Sin embargo, los efectos benéficos en la calidad de la masa o pan son bastante limitados, ya que los ácidos grasos libres pueden tener un efecto adverso en la calidad del pan. La lipasa fungal que se describe en el documento WO98/45453 tiene, además de su efecto en los acilgliceroles, cierto efecto hidrolizante en los glicolípidos polares. Además, como se menciona con anterioridad, el uso de las fosfolipasas A y C se ha sugerido como aditivos de mejoramiento de masa y/o pan. El efecto enzimático de tales fosfolipasas es que los fosfolípidos presentes en la masa se convierten en los lisofosfolípidos correspondientes que se consideran agentes emulsificantes eficaces. Sin embargo, la cantidad de fosfolípidos endógenos en masas de pan es relativamente pequeña y, por lo tanto, se limitará el efecto de mejoramiento de la masa y el pan por la adición de enzimas que son selectivamente activas contra los fosfolípidos. Por lo tanto, existe la necesidad de una enzima de mejoramiento de masa y/o pan capaz de hidrolizar sustancialmente todos los tipos de lípidos presentes en masas de harina, es decir, los acilgliceroles no polares y los fosfolípidos y glicolípidos polares. La presente invención se basa en el descubrimiento de enzimas con actividad lipolítica que pueden utilizar todos estos lípidos simultáneamente como sustratos y se ha encontrado que la adición de tales enzimas a una masa produce mejoras significativas con respecto a la estabilidad y resistencia de la masa, las propiedades de manejo de masas y una mayor calidad de los productos horneados de pan en t__uli _LÍ&_U_sÍ_*_¿_tÜ_-_ ¿^¿¿2 .-j-_tatefcfc-¿.wa_--- ¿i términos de un aumento importante del volumen del pan, la estructura y el aspecto del migajón y el color y la suavidad del pan. Un aspecto particularmente interesante e importante de estas enzimas novedosas es que pueden tener preferencia por lípidos polares que implica que los efectos adversos que se han observado para lipasas hidrolizantes de acilgliceroles pueden ser controlados seleccionando las enzimas, de preferencia lípidos polares hidrohzantes. Otro aspecto interesante e importante de estas enzimas novedosas es que pueden tener preferencia por ácidos grasos de cadena larga, como ácidos grasos de C?2 a C2o, en comparación con ácidos grasos de cadena corta, como ácidos grasos de C4 a Cío- En la técnica anterior se ha demostrado que la selectividad de la longitud de cadena es afectada por sustituciones de aminoácidos en una lipasa de Rhizopus delemar. R.D. Joerger et al. (Lipids, 29 (6) 377-384 (1994)) indican que las variantes F95D, F112W y V209W tienen una preferencia alterada por ácidos de C4 a C8. R.R. Klein et al. (JAOCS, 74 (11 ) 1401-1407 (1997)) describen que la variante V206T+F95D tiene una mayor selectividad por ácidos grasos de C8. R.R. Klein et al. (Lipids, 32 (2) 123-130 (1997)) muestran que las variantes V209W+F112W, V94W y F95D+F214R tienen una mayor actividad hidrolítica hacia ácidos grasos de C a C8, y sugieren que los determinantes estructurales para la especificidad de cadena mediana pueden residir en el extremo distal de la ranura de enlace de acilo. Asimismo, se ha encontrado que los efectos de mejoramiento de masa y pan de las enzimas de conformidad con la invención pueden incrementarse aún más añadiendo glicolípidos y/o fosfolípidos a la masa, por ejemplo, en forma de lípidos de cereales que incluyen aceite de avena.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION En consecuencia, la invención se refiere a un cebador aspecto de un método para preparar una masa de harina. Dicho método comprende la adición a los componentes de la masa de una enzima que, bajo condiciones de masa, es capaz de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido o una composición que contiene tal enzima, mezclando los componentes para obtener la masa. Cualquiera de los sustratos lípidos para la enzima puede ser un lípido presente naturalmente en la harina o puede añadirse a la masa. En otro aspecto, se provee una composición de mejoramiento de la masa que comprende una enzima que, bajo condiciones de masa, es capaz de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido y opcionalmente por lo menos un componente de masa adicional. El componente de masa adicional puede ser, por ejemplo, otra enzima que tenga un efecto de mejoramiento en las propiedades de la masa y/o la calidad de un producto horneado elaborado a partir de la masa. En otro aspecto aún, la invención se refiere a una masa que se obtiene mediante el método para la invención y productos horneados obtenidos a través del horneado tal masa, y productos de fideo y pasta preparados de conformidad con la ¡nvención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee convenientemente un método para mejorar las propiedades de masas hechas a base de harina y productos elaborados a partir de tales masas. Esto se logra, con respecto a los productos horneados, proveyendo un método para preparar productos horneados que presentan características altamente deseables con respecto al volumen del pan, la estructura y el aspecto del migajón y que, adicionalmente, tienen una vida de estante prolongada que se refleja en una mayor suavidad, es decir, el endurecimiento de los productos horneados se retarda en relación con un producto horneado elaborado sin utilizar la enzima de la invención. A pesar de que actualmente es preferible utilizar el método para la fabricación de productos de pan leudados con levadura, como barras y bollos de pan o pan tostado, también se contempla el uso del método para otros tipos de masas o productos hechos a base de masa, como productos de fideo o pasta y pasteles, cuya calidad puede mejorarse añadiendo las enzimas de la invención. El presente método comprende como un paso esencial que una cantidad eficaz de una enzima que, bajo condiciones de masa, es capaz de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido, o una composición que comprende dicha enzima, se añade a la masa, ya sea directamente a una masa ya mezclada o como un componente de uno o más componentes de la masa. En el presente contexto, la expresión "una cantidad eficaz" se utiliza generalmente para describir una cantidad de la enzima que es suficiente para realizar, bajo condiciones de masa, la hidrólisis detectable de triglicéridos, fosfolípidos y gliclípidos presentes en la masa. Los ejemplos de métodos analíticos que permiten la detección de estas actividades hidrolítícas se proporcionan en los ejemplos que se presentan más adelante. Más específicamente, la expresión puede referirse a una cantidad que no sólo origina una hidrólisis detectable de los sustratos de lípidos anteriores, sino que además produce la formación de productos finales enzimáticos a un nivel que mejora las propiedades de la masa, como una pegajosidad y/o extensibilídad significativamente mejoradas, que pueden atribuirse a la adición de la enzima o, si la masa es horneada, una mayor calidad del producto horneado, como mayor volumen del pan, mayor suavidad o mejor estructura del migajón. La enzima de la presente invención puede poseer cierto efecto hidrolizante de triglicéridos. Además de la actividad hidrolizante de triglicéridos, la enzima puede presentar también actividad hidrolizante en fosfolípidos y glicolípidos. Alternativamente, la enzima de la invención puede presentar actividad hidrolítica significativa en fosfolípidos y glicolípidos, pero un efecto hidrolizante de triglicéridos menos importante.

La enzima de la invención puede describirse como una enzima multifuncional que es capaz de hidrolizar acilgliceroles (glicéridos) simultáneamente (es decir, presenta actividad de esterasa asociada generalmente con la clase de enzimas denominadas lipasas (EC 3.1.1.3)), fosfolípidos y glicolípidos, como los galactolípidos. En consecuencia, la enzima presenta actividad hidrolizante que se asocia con toda una variedad de enzimas que generalmente se denominan fosfolipasas. Los fosfolípidos se dividen de dos modos diferentes por dos grupos de enzimas, uno de los cuales se incluye en el grupo de lipasas y que comprende la fosfolipasa Ai y la fosfolipasa A2 y fosfodiesterasas (fosfolipasas C y D). La enzima de la invención puede presentar cualquiera de estas actividades de fosfolipasa. Se ha encontrado que las enzimas que presentan características hidrolíticas de la enzima de conformidad con la invención pueden tener diferentes afinidades con porciones de ácidos grasos en el sustrato del lípido, incluyendo que la enzima de la invención puede, de preferencia, hidrolizar lípidos que contienen ácidos grasos de cadena corta, como ácidos grasos de C4 a C10, o puede hidrolizar, de preferencia, lípidos que comprenden grupos ácidos de cadena larga, como ácidos grasos de C?2 a C20. Las enzimas con preferencia por grupos de ácidos grasos de cadena larga pueden ser, por ejemplo, particularmente útiles en masas en donde la grasa de la mantequilla u otros lípidos comprenden grupos del ácido butírico, ya que es un problema conocido que el ácido butírico libre puede originar un sabor y aroma desagradables. ¿¿ ^ fj¿|^ g f ^ ^ gf^g^g En un aspecto particularmente preferido, la enzima de la invención hidroliza de preferencia lípidos que contienen ácidos grasos de cadena larga, como ácidos grasos de C?2 a C2o, en comparación con los ácidos grasos de cadena corta, como ácidos grasos de C4 a C?0. En otras palabras, la enzima tiene, de preferencia, una actividad relativamente baja en ácidos grasos de cadena corta, pero es particularmente activa en los glicéridos con ácidos grasos de cadena larga. De particular preferencia, la enzima de la presente invención no ejerce actividad en ácidos grasos de cadena corta. El uso de una enzima con relativamente poca actividad en ácidos grasos de cadena corta puede evitar o suprimir el desarrollo de un sabor desagradable, el cual podría desarrollarse debido a la liberación de ácidos grasos de cadena corta. Una implicación de este perfil del sustrato selectivo es que puede seleccionarse una enzima que ejerce actividad particularmente en una masa determinada, dependiendo de la receta y el contenido lípido de la misma. La enzima con las propiedades definidas en la presente puede derivarse de toda una variedad de fuentes, incluyendo plantas, animales y microorganismos como especies bacterianas y fungosas que comprenden especies de levaduras. La enzima de la invención puede derivarse de un organismo que produce la enzima de forma natural o puede producirse de modo recombinante a través de la transformación de una célula huésped apropiada con una codificación genética para la enzima. La enzima puede ser una enzima que comprenda dentro de sí misma sitios activos para todas sus actividades enzimáticas, pero también es posible construir enzimas híbridas con actividad enzimática, según se define en la presente, mediante síntesis o utilizando tecnología de ADN recombinante. Alternativamente, una enzima que no tiene las propiedades específicas, por lo menos no al principio, según se definen en la presente, puede modificarse, por ejemplo alterando la secuencia de aminoácidos de la misma, para proveer una enzima con las propiedades según la presente y una especificidad del sustrato deseada. Es una práctica conocida en la técnica modificar las enzimas mediante mutagénesis aleatoria (US 4,814,331; WO 93/01285 y WO 95/22615) y modificar enzimas apolíticas mediante mutagénesis específica de sitios (WO 97/04079) para obtener un rendimiento mejorado de las mismas. El concepto de uso general ha sido insertar, eliminar o sustituir los aminoácidos dentro de la parte estructural de la cadena del aminoácido de una enzima lipolítica en cuestión. Una enzima adecuada para la modificación es una que puede hidrolizar enlaces de éster. Tales enzimas incluyen, por ejemplo, lipasas, como la lipasa de triacilglicerol (EC 3.1.1.3), lipasa de lipoproteína (EC 3.1.1.34), lipasa de monoglicéridos (EC 3.1.1.23), lisofosfolipasa, esterasa de ácido ferúlico y esterasa (EC 3.1.1.1 , EC 3.1.1.2). Las enzimas apropiadas para la modificación pueden derivarse de una variedad de fuentes, incluyendo plantas, animales y microorganismos, tales como especies bacterianas y fungosas, incluyendo especies de levaduras. Los ejemplos de enzimas apropiadas para la modificación son las Z,E a. A í *_-,-_Á? ,. é^?^.,,áá?¡ á^il^m^? .i¿^^^^^' lipasas de Pseudomonas, por ejemplo de P. cepacia (US 5,290,694), P. glumae (Frenken et al. (1992) Appl. Envir. Microbiol. 58 3787-3791), P. pseudoalcaligenes (EP 0 334 462) o cepa SD 705 de Pseudomonas sp. (WO95/06720, EP 0 721 981 , WO 96/27002, EP 0 812 910). Alternativamente, las enzimas apropiadas para la modificación pueden ser, por ejemplo, enzimas lipolíticas fungosas, como las enzimas lipolíticas de la familia de Humicola y la familia Zygomycetes y cutinasas fúngales. La familia de Humicola de las enzimas lipolíticas consiste en la lipasa de la cepa DSM 4109 de H. lanuginosa y las lipasas con una homología de más del 50% con esta lipasa. La lipasa de H. lanuginosa (sinónimo Thermomyces lanuginosus) se describe en los documentos EP 0 258 068 y EP 0 305 21 , y tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en las posiciones 1-269 de SEQ ID NO. 2 del documento US 5,869,438. Las enzimas actualmente preferidas para utilizarse en ta invención son Lipasa SP 972 y Lipasa SP 979, cuyo efecto se describe en mayor detalle en los ejemplos que se presentan a continuación. La mayoría de las harinas de cereales comprenden lípidos, incluyendo triglicéridos y lípidos no polares, incluyendo fosfolípidos y glicolípidos, que pueden servir como sustratos para la enzima de la invención. En consecuencia, en una modalidad del método, por lo menos el lípido no polar, el glicolípido, como el galactolípido, incluyendo el digalactosil diglicérido (DGDG) y el fosfolípido, como la fosfatidilcolina (PC) es un componente lípfcto natural (o endógeno) presente en la harina que se utiliza para la masa.

Sin embargo, una masa de harina puede no contener cantidades suficientes de todos los sustratos de lípidos para la enzima de la invención. Por lo tanto, se encuentra en el alcance de la invención complementar la masa con por lo menos un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido para proporcionar suficientes sustratos para la enzima. Se comprenderá que la expresión "sustrato suficiente" implica que ninguno de los tres tipos principales de sustratos de lípidos es limitativo para obtener un efecto de mejoramiento de la masa o el producto horneado según se describe con anterioridad. El sustrato de lípido complementario para la enzima de la invención puede ser un lípido no polar, como un acilglicerol. De conformidad con la invención, puede emplearse una variedad de dichos lípidos, tales como aceites vegetales, grasas vegetales, aceites animales, grasas animales, como grasa de mantequilla y manteca. En este contexto, un lípido particularmente útil es un aceite o grasa derivadas de cereales como el aceite de avena. El aceite de avena contiene típicamente, además de los triglicéridos, 5-25% de fosfolípidos y 5-12% de glicolípidos. El aceite de avena puede fraccionarse para producir fracciones con un alto contenido de lípidos polares. Por lo tanto, es un aspecto del método de la invención que pueden añadirse uno o más fosfolípidos a la masa. En este contexto, los fosfolípidos útiles incluyen fosfatidilinositol (Pl), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina (PC, lecitina y fosfatidiletanolamina (PE). De conformidad con la invención, la enzima se añade a una cantidad en la escala de 10 a 100,000 LUT/kg de harina o en la escala de 10 a 100,000 PLU/kg de harina. Las designaciones de unidades son aquellas que se definen en los ejemplos que se presentan a continuación, como una escala de 50 a 50,000 LUT o PLU/kg de harina, incluyendo una escala de 100 a 10,000 LUT/kg de harina o 100 a 10,000 PLU/kg de harina. Asimismo, la presente invención puede proveer convenientemente un método para obtener un producto horneado con características de calidad mejoradas según se definen con anterioridad. En consecuencia, en una modalidad, la masa preparada mediante el método de la invención es una masa de pan y el método comprende como un paso adicional que la masa se hornea para producir un producto horneado. Una propiedad particularmente deseada de los productos de pan horneados es un alto volumen específico según se define en los ejemplos. En consecuencia, la adición de la enzima de la invención origina de preferencia un aumento del volumen específico del producto horneado que es por lo menos del 10%, en relación con un producto horneado elaborado bajo condiciones idénticas excepto que no se agrega la enzima. De mayor preferencia, el aumento del volumen específico es de por lo menos 20%, como por lo menos 30%, por ejemplo, por lo menos 40%. La presente invención puede proveer además masas de pasta, masas de fideo y masas o pastas de pasteles y productos acabados elaborados a partir de tales masas o pastas. Es bien sabido en la técnica que las enzimas, que no sean lipasas, pueden contribuir al mejoramiento de las propiedades de la masa y de la calidad de los productos horneados. Se encuentra dentro del alcance de la invención que, además de la enzima de la invención, se añade por lo menos una enzima adicional a la masa. Tales enzimas adicionales incluyen enzimas de degradan almidón, como endo o exoamilasas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas, incluyendo xilanasas, celulasas y oxidoreductasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, lipasas, fosfolipasas y hexosa oxidasa. Se ha encontrado que la enzima de la invención puede ser particularmente activa contra ciertos glicolípidos, tales como galactolípidos, incluyendo digalactodiglicérido (DGDG) que se convierte en digalactomonoglicérido (DGMG) que es un agente tensoactivo eficaz. En las modalidades útiles, la enzima de la invención es, por lo tanto, una enzima capaz de hidrolizar por lo menos el 25% de DGDG presente en la masa y, de preferencia, por lo menos el 50% de DGDG se hidroliza, como por lo menos el 60% o por lo menos el 75% del mismo. Otro sustrato de lípidos útil para la presente enzima es el fosfolípido fosfatid ¡Icol ina (PC). Por lo tanto, en las modalidades útiles la enzima es capaz de degradar por lo menos el 25%, de preferencia por lo menos et 50%, incluyendo por lo menos el 60%, como por lo menos el 75% de PC inicialmente presente en la masa. Un aspecto conveniente de las presentes enzimas es que presentan más actividad hidrolítica contra algunos de los tipos de sustratos de lípidos, según se definen con anterioridad, que aquella que presentan contra otros tipos. Por ende, las enzimas pueden ser relativamente más activas contra lípidos polares que lo que lo son contra triglicéridos no polares. Esto puede ilustrarse mediante el análisis de la cantidad de cualquiera de los tipos de sustratos de lípidos hidrolizados, construyendo una curva que describe la relación entre la hidrólisis de un par de sustratos de lípidos, por ejemplo, triglicéridos con glicolípidos o triglicéridos con fosfolípidos. En las modalidades específicas, la enzima de la invención se caracteriza porque la relación entre la capacidad de la enzima de hidrolizar los triglicéridos y la capacidad de hidrolizar los glicolípidos puede describirse como una curva con una pendiente de por lo menos 1.0, como por lo menos 1.5 o por lo menos 2.0, o en donde la relación entre la capacidad de la enzima de hidrolizar los triglicéridos y la capacidad de hidrolizar los fosfolípidos pueden describirse como una curva con una pendiente de por lo menos 0.1 , como, por ejemplo, un mínimo de 0.2, incluyendo un mínimo de 0.5 o un mínimo de 1.0. En otro aspecto, la invención provee una composición para el mejoramiento de la masa que comprende una enzima que, bajo condiciones de masa, es capaz de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido y, opcionalmente, por lo menos un componente de masa adicional. Tal componente de masa adicional puede ser, por ejemplo, otra enzima, según se define con anterioridad, incluyendo lipasas o fosfolipasas que no tienen el perfil de sustrato de la presente enzima. Otros componentes de masa adecuados que pueden incorporarse en la composición incluyen harinas de cereales como harina de trigo, harina de arroz y harina de maíz, levadura, agentes de fermentación química, agentes fortalecedores de la masa, tales como oxidoreductasas y ascorbatos, emulsificantes, azúcares, acilgliceroles de los tipos que ya se mencionaron, fosfolípidos, como lecitina de soya y lecitina de huevo, glicolípidos y sales. En otros aspectos de la invención se provee un método para preparar una masa, según se define con anterioridad, en donde la enzima se añade a una composición que ya se mencionó y se obtiene una masa de conformidad con los métodos de la invención. Este tipo de masa puede ser una masa fresca, opcionalmente empacada en una atmósfera controlada para mantenerla fresca, o puede ser una masa congelada. A pesar de que algunas enzimas con las propiedades específicas, según se definen en la presente, pueden ser fácilmente identificadas por los expertos en la técnica, la presente invención provee también un método para identificar las enzimas capaces de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido o para identificar las enzimas elegibles para el desarrollo en enzimas capaces de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido. Una de tales enzimas elegibles para desarrollarse en una enzima de conformidad con la presente invención es la lipasa de Aspergillus niger, la cual se describe en el documento WO98/45453 (incluido en la presente por referencia).

La presente invención provee además un método para desarrollar las enzimas capaces de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido.

Clonación de una secuencia de nucleótidos codificando una enzima Una secuencia de nucleótidos que codifica, ya sea una enzima que consta de las propiedades específicas, según se definen en la presente, o una enzima que es adecuada para la modificación, puede aislarse de cualquier célula u organismo que produce dicha enzima. Existen varios métodos conocidos en la técnica para el aislamiento de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, una librería genómica de ADN y/o cADN puede construirse mediante ADN cromosomal o RNA mensajero del organismo que produce la enzima. Si se conoce la secuencia de aminoácidos de la enzima, pueden sintetizarse las sondas de oligonucléotidos marcados y utilizarse para identificar los clones de codificación de enzimas de la librería genómica preparada del organismo. Alternativamente, una sonda de oligonucléotidos marcados que contiene secuencias homologas a otro gen de enzima conocido podría utilizarse para identificar los clones de codificación de enzimas. En este último caso, se emplean condiciones de hibridación y lavado de menor severidad.

Alternativamente, los clones de codificación de enzimas podrían identificarse al insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, como un plásmido que transforma bacterias enzima-negativas con la librería de ADN genómico resultante, y después colocar la bacteria transformada en agar que contenga un sustrato para la enzima (es decir, maltosa), permitiendo así la identificación de los clones que expresan la enzima. En aún otra alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima puede prepararse sintéticamente mediante métodos estándar, por ejemplo, el método de fosforamidita que describen Beucage S.L. et al. (1981( Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, o el método que describen Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p. 801-805. En el método de fosforamidita, se sintetizan los oligonucléotidos, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, recuecen, ligan y clonan en vectores apropiados. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico y sintético combinado, origen sintético y de cADN combinado o de origen genómico y de cADN combinado, preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de cADN (según sea apropiado) de conformidad con técnicas estándar. Cada fragmento ligado corresponde a diferentes partes de la secuencia completa de nucleótidos. La secuencia de ADN puede prepararse también mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos, por ejemplo aquellos que se describen en el documento US 4,683,202 o en Saiki R K et al. (Science (1988) 239, pp.487-491).

Secuencia de nucleótidos La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican enzimas con las propiedades específicas que se definen en la presente. El término "secuencia de nucleótidos" según se emplea en la presente se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o secuencia de polinucleótidos y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de las mismas (o porciones de las mismas). La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, sintético o recombinante que pueden ser de doble hebra o de una sola hebra dependiendo de si representan la hebra con sentido o de antí- sentido. El término "secuencia de nucleótidos" en relación con la presente invención incluye ADN genómico, cADN, ADN sintético y ARN. De preferencia significa ADN, de mayor preferencia cADN para la secuencia codificadora de la presente invención. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos per se de la presente invención no cubre la secuencia de nucleótidos nativa de conformidad con la presente invención en su ambiente natural cuando se encuentra ligada a su(s) secuencia(s) naturalmente asociada(s) que se encuentra(n) también en su ambiente natural. Con propósitos de referencia, esta modalidad preferida debe denominarse la "secuencia de nucleótidos no nativa". A este respecto, el término "secuencia de nucleótidos nativa" se refiere a una secuencia de nucleótidos completa que se encuentra en su ambiente nativo y, que está vinculada operativamente a un promotor completo al que se encuentra asociada de modo natural y que también se encuentra en su ambiente nativo. Por lo tanto, la enzima de la presente invención puede expresarse mediante una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo pero en donde la secuencia de nucleótidos no está bajo el control del promotor que está asociado de modo natural dentro de aquel organismo. La enzima de la presente invención puede utilizarse en conjunto con otras enzimas. Por lo tanto, la presente invención cubre también una combinación de enzimas, en donde la combinación comprende la enzima de la presente invención y otra enzima que puede ser otra enzima de conformidad con la presente invención. De preferencia, la enzima no es una enzima nativa. A este respecto, el término "enzima nativa" se refiere a una enzima completa que se encuentra en su ambiente nativo cuando la expresa su secuencia de nucleótidos nativa. Típicamente, la secuencia de nucleótidos de la presente invención se prepara mediante técnicas de ADN recombinante (es decir, ADN recombinante). Sin embargo, en una modalidad alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos podría sintetizarse, por completo o en parte, mediante métodos químicos conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al (1980) Nuc Acíds Res Symp Ser 225-232).

Secuencias de aminoácidos La presente ¡nvención comprende también secuencias de aminoácidos de enzimas con las propiedades específicas según se definen en la presente. Como se emplea en la presente, el término "secuencia de aminoácidos" es un sinónimo del término "polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es un sinónimo del término "péptido". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es un sinónimo del término "enzima". La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse de una fuente adecuada o puede elaborarse sintéticamente o prepararse mediante técnicas de ADN recombinante.

Variantes/homólogos/derivados La presente invención también comprende el uso de variantes, homólogos y derivados de cualquier secuencia de aminoácidos de una enzima de la presente invención o de una secuencia de nucleótidos que codifica dicha enzima. Aquí, el término "homólogo" se refiere a una entidad con cierta homología con las secuencias de aminoácidos referidas y las secuencias de nucleótidos referidas. Aquí, el término "homología" es equivalente a "identidad". En el presente contexto, una secuencia homologa se toma para incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser en por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica a la secuencia referida. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos etc. como la secuencia de aminoácidos referida. A pesar de que la homología puede considerarse también en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos con propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencias. En el presente contexto, una secuencia homologa se toma para incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser en por lo menos 75, 85 ó 90%, de preferencia en por lo menos 95 ó 98% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de la presente invención (la secuencia referida). Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican para los sitios activos etc. como la secuencia referida. A pesar de que la homología puede considerarse también en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos con propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente ¡nvención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencias. Las comparaciones de homología pueden realizarse visualmente o, más usualmente, mediante programas de comparación de secuencias disponibles. Estos programas de cómputo comercialmente disponibles pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias. El porcentaje de homología puede calcularse en secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se denomina una alineación "sin huecos". Típicamente, tales alineaciones sin huecos se realizan únicamente en un número relativamente corto de residuos. A pesar de que es un método muy sencillo y consistente, no toma en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias de otra forma idéntica, una inserción o eliminación causará que los residuos de aminoácidos se desalineen, potencialmente originando así una gran reducción en el porcentaje de homología cuando se efectúa una alineación global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias son diseñados para producir alineaciones óptimas que toman en consideración las posibles inserciones o eliminaciones, sin perjudicar inadecuadamente el resultado global de homología. Esto se logra al insertar "huecos" en la alineación de secuencias para intentar maximizar la homología local. Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de huecos" a cada hueco que se presenta en la alineación, de tal modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencias con el menor número de huecos posible - reflejando una mayor relación entre las dos secuencias comparadas - logrará un resultado mayor •t que una con muchos huecos. Típicamente se emplean "costos de huecos afines" que cobran un costo relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización menor para cada residuo subsecuente en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más comúnmente utilizado. Las penalizaciones altas de huecos producirán naturalmente alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten la modificación de las penalizaciones de huecos. Sin embargo, es preferible utilizar los valores predeterminados cuando se emplea dicho software para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de huecos predeterminada para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión. Por lo tanto, el cálculo del porcentaje máximo de homología requiere primero una alineación óptima, tomando en cuenta las penalizaciones de huecos. Un programa de cómputo adecuado para realizar este tipo de alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12, p. 387). Los ejemplos de otro software que puede efectuar las comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitarse a ellos, el paquete BLAST (véase Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a edición - capítulo 18), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403- 410) y la serie de GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al 1999 páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones es preferible utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, también está disponible para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana(a.ncbi.nim.nih.gov). A pesar de que el porcentaje de homología final puede medirse en términos de identidad, el procedimiento de alineación mismo no se basa típicamente en una comparación de pares de "todo o nada". En lugar de ello, se utiliza generalmente una matriz de puntuación de similitud escalada que asigna puntos a cada comparación por pares con base en la similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de este tipo de matriz comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62 - la matriz predeterminada para la serie de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin emplean generalmente, ya sea los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación con símbolos personalizados, si se suministra (véase el manual de usuario para mayores detalles). Para algunas aplicaciones, es preferible utilizar los valores predeterminados públicos para el paquete GCG o, en el caso de otro tipo de software, la matriz predeterminada, como BLOSUM62. Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el porcentaje de homología, de preferencia el porcentaje de identidad de la secuencia. Típicamente, el software lo realiza como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Las secuencias pueden incluir también eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y originan una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden hacerse con base en la similitud con respecto a la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos, con tal que se retenga la actividad de enlace secundario de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos de carga negativa incluyen el ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos de carga positiva incluyen lisina y arginina y los aminoácidos con grupos principales polares sin carga con valores de hidrofilicidad similar incluyen la leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Pueden realizarse sustituciones convencionales de acuerdo con el cuadro que se presenta a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y de preferencia en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí: La presente invención comprende también la sustitución homologa (sustitución y reemplazo se refieren ambos al intercambio de un residuo de aminoácido existentes con un residuo alternativo) que puede ocurrir, es decir, la sustitución entre similares como básico con básico, ácido con ácido, polar con polar, etc. Asimismo, puede ocurrir la sustitución no homologa, es decir, de una clase de residuo a otro o, alternativamente, implicando la inclusión de aminoácidos no naturales, como la ornitina (en lo sucesivo denominado Z), ornitina de ácido diaminobutírico (en lo sucesivo denominado B), ornitina de norleucina (en lo sucesivo denominado O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina. Los reemplazos pueden realizarse también mediante aminoácidos no naturales que incluyen: aminoácidos alfa* y alfa disustituidos*, aminoácidos N-alquilo, derivados de haluro de aminoácidos naturales como trifluorotirosina*, p-CI-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-l-fenilalanina*, L-alil- glicina*, ß-alanina*. ácido butírico de L-a-amino*, ácido butírico de L-?-amino*, ácido isobutírico de L-a-amino*, ácido caproico de L-e-amino#, ácido heptanoico de 7-amino*, L-metionin-sulfona#\ L-norleucina*, L-norvalina*, p- nitro-L-fenilalanina*. L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados de metilo de fenilalanina (Phe) como 4-metil-Phe*. pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-tir (metilo)*, L-Phe (4-isopropilo)*, L-tic (ácido 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolina«3- carboxílico)*, ácido L-diaminopropiónico# y L-Phe (4-benzilo)*. El símbolo * se ha utilizado con el propósito de las explicaciones anteriores (en relación con la sustitución homologa o no homologa) para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado, mientras que # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrófila del derivado; #* indica características anfipáticas. Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre dos residuos de aminoácidos de la secuencia que incluye grupos alquilo, como grupos metilo, etilo o propilo, además de espaciadores de aminoácidos como residuos de la glicina o ß-alanina. Otra forma de variación incluye la presencia de uno o varios residuos de aminoácidos en la forma de peptídeos que se comprenderá fácilmente por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, "forma de peptídeo" se utiliza para indicar residuos de aminoácidos variantes en donde el grupo sustituyente de a-carbono se encuentra en el átomo de nitrógeno del residuo y no en el a-carbono. Los procedimientos para preparar péptidos en forma de peptídeos son conocidos en la técnica, véase por ejemplo, Simón RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134. Las secuencias de nucleótidos para utilizarse en la presente invención pueden incluir, dentro de ellas, nucleótidos sintéticos o modificados. Varios tipos diferentes de modificación a los oligonucleótidos son conocidos en la técnica. Estos incluyen estructuras de base de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los terminales 3' y/o 5' de la molécula. Por propósitos de la presente invención, debe comprenderse que las secuencias de nucleótidos, que se describen en la presente, pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la t**¿??a*¡A* . . : ?ft¿, técnica. Tales modificaciones pueden realizarse para aumentar la actividad in vivo o la vida de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. La presente invención incluye también el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias de las secuencias que se presentan aquí, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de la misma, entonces esta secuencia puede utilizarse como una sonda para identificar secuencias codificadoras similares en otros organismos, etc. Los polinucleótidos, que no son 100% homólogos con las secuencias de la presente invención, pero que entran en el alcance de la invención, pueden obtenerse de diferentes maneras. Otras variantes de secuencias que se describen en la presente pueden obtenerse, por ejemplo, al examinar las librerías de ADN elaboradas de varios individuos, por ejemplo, individuos de diferentes poblaciones. Además, pueden obtenerse otros homólogos virales/bacterianos o celulares, particularmente homólogos celulares que se encuentran en células mamíferas (v.g., células de rata, ratón, bovino y primates) y tales homólogos y fragmentos de los mismos serán generalmente capaces de hibridar selectivamente las secuencias que se muestran en la lista de secuencias, incluida en la presente. Tales secuencias pueden obtenerse al examinar las librerías de cADN elaboradas de (...) o librerías de ADN genómico de otras especies animales, y analizar dichas librerías con sondas que comprenden la totalidad o parte de una de las secuencias en las listas de secuencias anexas bajo condiciones de severidad _|ff ii -&is ^ moderada a alta. Aplican consideraciones similares a la obtención de homólogos de especies y variantes alélicas de las secuencias de polipéptídos o nucleótidos de la invención. Las variantes y homólogos de cepas/especies pueden obtenerse también mediante PCR degenerado que utilizará cebadores diseñados para ubicar secuencias dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas pueden predecirse, por ejemplo, al alinear las secuencias de aminoácidos de diferentes variantes/homólogos. Las alineaciones de secuencias pueden realizarse mediante software de cómputo conocido en la técnica. Se utiliza ampliamente, por ejemplo, el programa GCG Wisconsin PileUp. Los cebadores utilizados en PCR degenerado comprenderán una o más posiciones degeneradas y se emplearán bajo condiciones menos estrictas que aquellas que se utilizan para la clonación de secuencias con cebadores de una sola secuencia contra secuencias conocidas. Alternativamente, tales polinucleótidos pueden obtenerse mediante la mutagénesis sitio-dirigida de las secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil en donde, por ejemplo, se requieren cambios silenciosos de la secuencia del codón para optimizar las preferencias de codón para una célula huésped particular, en donde se están expresando las secuencias de polinucleótidos. Otros cambios de secuencias pueden requerirse para introducir los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) de la invención pueden utilizarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda marcada con una etiqueta reveladora a través de medios convencionales, utilizando etiquetas radioactivas o no radioactivas, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de por lo menos 15, de preferencia por lo menos 20, por ejemplo, por lo menos 25, 30 ó 40 nucleótidos, y son comprendidos también bajo el término polinucleótidos de la invención, según se emplea en la presente. Los polinucleótidos, como los polinucleótidos de ADN y las sondas de conformidad con la invención, pueden producirse de modo recombinante, sintético o a través de medios disponibles para los expertos en la técnica. Asimismo, pueden clonarse mediante técnicas estándar. Por lo general, los cebadores se producirán a través de medios sintéticos, incluyendo una fabricación por pasos de un nucleótido a la vez de la secuencia de ácido nucleico deseada. Técnicas para lograrlo mediante técnicas automatizadas están disponibles en la técnica. Los polinucleótidos más largos se producirán generalmente a través de medios recombinantes, por ejemplo, con técnicas de clonación de PCR (reacción en cadena de polimerasa). Esto implicará la elaboración de un par de cebadores (v.g., de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos), lindando con una región dé la secuencia objetivo de lípidos que se desea clonar, haciendo que los cebadores entren en contacto con mARN o cADN obtenido de una célula animal o humana, realizando una reacción en cadena de polimerasa bajo condiciones que producen la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (v.g., al purificar la mezcla de reacción sobre un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para obtener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados para que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación apropiado.

Hibridación La presente invención abarca también secuencias que son complementarias de las secuencias de la presente invención o secuencias que son capaces de hibridar, ya sea en las secuencias de la presente invención o en secuencias que son complementarias a éstas. El término "hibridación", como se emplea en la presente, debe incluir "el procedimiento por el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través del apareamiento de bases", así como el procedimiento de amplificación como se lleva a cabo en las tecnologías de reacción en cadena de polimerasa (PCR). La presente invención también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar las secuencias que son complementarias de las secuencias incluidas en la presente, o cualquier derivado, fragmento o derivado del mismo. El término "variante" comprende también las secuencias que son complementarias de las secuencias que son capaces de hibridar las secuencias de nucleótidos incluidas en la presente. De preferencia, el término "variante" comprende secuencias que son complementarias de las secuencias capaces de hibridar las secuencias de nucleótidos incluidas en la presente bajo condiciones severas (v.g., 50°C y 0.2xSSC { 1xSSC = 0.15 M NaCI, 0.015 M Na3citrato pH 7.0 }). De mayor preferencia, el término "variante" comprende secuencias que son complementarias de las secuencias capaces de hibridar las secuencias de nucleótidos incluidas en la presente bajo condiciones severas (v.g., 65°C y 0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCI, 0.015 M Na3citrato pH 7.0 }). La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que pueden hibridar las secuencias de nucleótidos de la presente invención (incluyendo secuencias complementarias de aquellas incluidas en la presente). La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias de las secuencias que pueden hibridar las secuencias de nucleótidos de la presente invención (incluyendo secuencias complementarias de aquellas incluidas en la presente). 1 i- * i ' ^ ^jg Asimismo, se incluyen en el alcance de la presente invención las secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridar las secuencias de nucleótidos incluidas en la presente bajo condiciones de severidad intermedia a máxima. En un aspecto preferido, la presente invención cubre las secuencias de nucleótidos que pueden hibridar las secuencias de nucleótidos de la presente invención, o el complemento de la misma, bajo condiciones severas (v.g., 50°C y 0.2xSSC). En un aspecto de mayor preferencia, la presente invención cubre las secuencias de nucleótidos que pueden hibridar la secuencias de nucleótidos de la presente invención, o el complemento de la misma, bajo condiciones altamente severas (v.g., 65°C y O.lxSSC).

Mutaqénesis sitio-dirigida Una vez que una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas se ha aislado, puede ser deseable mutar la secuencia para preparar una enzima de la presente invención. Las mutaciones pueden introducirse mediante oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos comprenden secuencias de nucleótidos que lindan con los sitios de mutación deseados. Un método apropiado se describe en Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p. 646-649), en donde un hueco de una sola hebra de ADN, la secuencia codificadora de enzimas, se crea en un vector que lleva ri_a_ti-ü-a ^.<_8__-A,¿---fl--a. Í.**M J*¿h*ái?£¿Í *.Jii el gen de la enzima. El nucleótido sintético, llevando la mutación deseada, se fija entonces a la porción homologa del ADN de una sola hebra. El hueco restante se llena con polimerasa de ADN I (fragmento de Klenow) y la construcción se liga mediante ligasa T4. El documento US 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante alteraciones menores del cassette. Sin embargo, puede introducirse, incluso, una variedad aún más grande de mutaciones en cualquier momento mediante el método Morinaga que ya se mencionó, porque es posible introducir una multitud de oligonucleótidos de diferente longitud. Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos codificadoras de enzimas se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p. 147-151). Este método incluye la generación en tres pasos de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida mediante una hebra de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. A partir del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN que lleva la mutación, puede aislarse mediante disociación con endonucleasas de restricción y reinsertarse en un plásmido de expresión. Además, Sierks et al (Protein Eng (1989) 2, 621-625 y Protein Eng (1990) 3, 193-198) describen la mutagénesis sitio-dirigida en glucoamilasa de Aspergillus.

Expresión de enzimas La secuencia de nucleótidos para utilizarse en la presente invención puede incorporarse en un vector replicable recombinante. El vector puede emplearse para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de enzima, dentro y/o a partir de una célula huésped compatible. La expresión puede controlarse mediante secuencias de control que incluyen promotores/intensificadores y otras señales reguladoras de expresión. Pueden utilizarse promotores procarióticos y promotores que son funcionales en células eucarióticas. Asimismo, pueden emplearse promotores específicos de tejido o de estímulos. También pueden emplearse promotores quiméricos, que comprenden elementos de secuencias de dos o más promotores que se describen con anterioridad. La enzima producida por una célula recombinante de huésped mediante la expresión de la secuencia de nucleótidos pueden secretarse o contenerse intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o el vector utilizado. Las secuencias codificadoras pueden diseñarse con secuencias de señales que dirigen la secreción de las secuencias codificadoras de sustancias a través de una membrana celular procariótica o eucariótica particular.

Vector de expresión El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de realizar la expresión ¡n vivo o in vitro.

De preferencia, el vector de expresión se incorpora en el genoma del organismo. El término "incorporado" cubre de preferencia la incorporación estable en el genoma. De preferencia, el vector de la presente invención comprende una construcción de conformidad con la presente invención. En otras palabras, la secuencia de nucleótidos de la presente invención está, de preferencia, presente en un vector en donde la secuencia de nucleótidos se encuentra operativamente vinculada a secuencias reguladoras, de tal modo que las secuencias reguladoras sean capaces de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos mediante un organismo huésped apropiado, es decir, el vector es un vector de expresión. Los vectores de la presente invención pueden transformarse en una célula huésped adecuada, como se describirá a continuación, para facilitar la expresión de un polipéptido de la presente invención. Por lo tanto, en otro aspecto la invención provee un procedimiento para preparar polipéptidos para el uso subsecuente de conformidad con la presente invención, que comprende la cultivación de una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión, según se describe con anterioridad, bajo condiciones que facilitan la expresión mediante el vector de una secuencia codificadora que codifica los polipéptidos y recupera los polipéptidos expresados. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmido, virus o fagos provistos con un origen de replicación, opcionalmente un -tif •i?fÉrt?itttt M •*>*•&* promotor para la expresión de dicho polinucleótído y opcionalmente un regulador del promotor. La elección del vector dependerá con frecuencia de la célula huésped en la que debe introducirse. Los vectores de la presente invención pueden comprender uno o varios genes marcadores seleccionables. Los sistemas de selección más apropiados para microorganismos industriales son aquellos formados por el grupo de marcadores de selección que no requieren una mutación en el organismo huésped. Los marcadores de selección apropiados pueden ser tos genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica como la resistencia a ampicilina, kanamicina, cloramfenicol y tetracilina. Los marcadores de selección alternativos pueden ser los marcadores de selección de Aspergillus como amdS, argB, niaD y sC o un marcador que origina resistencia a higromicina. Los ejemplos de otros marcadores de selección fungosa son los genes para la resistencia a sintetasa ATP, subunidad 9 (oliC), orotidin-5'-fosfato-decarboxilasa (pvrA), fleomicina y benomilo (benA). Los ejemplos de marcadores de selección no fungosa son el gen de resistencia G418 bacteriano (este puede utilizarse también en la levadura, pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) y el gen de uidA E. coli, codificando ß-glucuronidasa (GUS). Otros marcadores de selección apropiados incluyen los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis. Alternativamente, la selección puede efectuarse mediante co-transformación (según se describe en el documento WO91/17243). .^.i^j^,.,^..^^ Los vectores pueden utilizarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula huésped. Por lo tanto, las secuencias de nucleótidos para utilizarse de conformidad con la presente invención pueden incorporarse en un vector recombinante (típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. En otra modalidad, la invención provee un método para elaborar secuencias de nucleótidos de la presente invención al introducir una secuencia de nucleótidos de la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped bajo condiciones que producen la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped. Las células huésped adecuadas se describen a continuación en relación con los vectores de expresión. Los procedimientos empleados para ligar una construcción de ADN de la invención que codifica una enzima que presenta las propiedades específicas, según se definen en la presente, y las secuencias reguladoras e insertarla en los vectores apropiados que contienen la información requerida para la replicación, son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición (1989)). El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que permiten que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de la replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y PIJ702.

Secuencias reguladoras En algunas aplicaciones, la secuencia de nucleótidos para utilizarse en la presente invención se encuentra operativamente vinculada a una secuencia reguladora capaz de facilitar la expresión de la secuencia de nucleótidos, como mediante la célula huésped elegida. Por medio de ejemplos, la presente invención comprende un vector que incluye la secuencia de nucleótidos de la presente invención vinculada operativamente a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión. El término "operativamente vinculado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación entre sí que les permite funcionar de la manera proyectada. Una secuencia reguladora "operativamente vinculada" a una secuencia codificadora se liga de tal modo que la expresión de la secuencia codificadora se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencias reguladoras" incluye promotores e intensificadores y otras señales reguladoras de expresión. El término "promotor" se utiliza en el sentido usual de la técnica, por ejemplo, un sitio de enlace de ARN polimerasa.

La expresión aumentada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de la presente invención puede lograrse también mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones del promotor, del conductor de secreción y terminadoras, que sirven para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del huésped de expresión elegido y/o para facilitar el control inducible de la expresión de la enzima de la presente invención. En eucariotas, las secuencias de poliadenilación pueden conectarse operativamente con la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima. De preferencia, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar operativamente vinculada a por lo menos un promotor. Además del promotor nativo al gen que codifica la secuencia de nucleótidos de la presente invención, pueden utilizarse otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención. El promotor puede seleccionarse por su eficacia en la conducción de la expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención en el huésped de expresión deseado. En otra modalidad, un promotor constitutivo puede seleccionarse para dirigir la expresión de la secuencia de nucleótídos de la presente invención. Este tipo de construcción de la expresión puede proporcionar ventajas adicionales debido a que evita la necesidad de cultivar los huéspedes de expresión en un medio que contiene un sustrato inducible. Los ejemplos de promotores altamente constitutivos y/o inducibles que son preferidos para utilizarse en huéspedes fúngales de expresión son aquellos que pueden obtenerse de los genes fúngales para promotores de xilanasa (xlnA) ?tasa, ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol dehidrogenasa (AdhA), a-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG- del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa (gpd). Otros ejemplos de promotores útiles para la transcripción en un huésped fungoso son aquellos derivados del gen que codifica A. oryzae TAKA amilasa, el promotor TPI (triosa fosfato isomerasa) de S. cerevisiae (Alber et al (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 , p. 419-434), proteinaza aspártica de Rhizomucor miehei, a-amilasa neutral de A. niger, a-amilasa ácido-estable de A. niger, glucamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A. nidulans. Los ejemplos de fuertes promotores de levadura son aquellos que pueden obtenerse de los genes para alcohol dehidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato kinasa y triofosfato isomerasa. Los ejemplos de fuertes promotores bacterianos son los promotores de a-amilasa y SP02, así como promotores de genes de proteasa extracelular. Los ejemplos de otros promotores apropiados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos, especialmente en un huésped bacteriano, son los promotores del operón lac de E. coli, los promotores dagA del gen de agarasa de Streptomyces coel ¡color, los promotores del gen a-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), los promotores del gen de amilasa maltogénico de Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores de a- ü¡áttÉtt_M!_f!MI yaití 4 amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xylA y xylB de Baciilus subtilis. Los promotores híbridos pueden utilizarse también para mejorar la regulación inducible de la construcción de expresión. El promotor pueden incluir también características para asegurar o incrementar la expresión en un huésped adecuado. Por ejemplo, las características pueden ser regiones conservadas como un caja Pribnow o una caja TATA. El promotor puede comprender incluso otras secuencias para afectar (como mantener, incrementar, disminuir) los niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente ¡nvención. Por ejemplo, otras secuencias apropiadas incluyen el Sh1-intrón o un intrón de ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles - como elementos inducibles por temperatura, químicos, luz o esfuerzo. Asimismo, pueden estar presentes elementos adecuados para incrementar la transcripción o traducción. Un ejemplo de este último elemento es la secuencia con señales 5' TMV (véase Sleat 1987 Gene 217, 217-225 y Dawson 1993 Plan Mol. Biol. 23: 97).

Construcciones El término "construcción" - que es un sinónimo de los términos "conjugado", "cassette" e "híbrido" - incluye una secuencia de nucleótidos para utilizarse de conformidad con la presente invención directa o indirectamente sujetada a un promotor. Un ejemplo de una sujeción indirecta es la provisión de un grupo espaciador apropiado como una secuencia de intrón, tal como el t^?^^ai^ts^áS?tk?.^.i?átUáAJü Sh1-intrón o el intrón de ADH, un intermediario entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo aplica para el término "fundido" en relación con la presente invención, que incluye la sujeción directa o indirecta. En algunos casos, los términos no cubren la combinación natural de la codificación de la secuencia de nucleótidos para fa proteína que se asocia normalmente con el promotor del gen de tipo salvaje y cuando ambos se encuentran en su ambiente natural. La construcción puede incluso comprender o expresar un marcador que facilita la selección de la_construcción genética en, por ejemplo, una bacteria, de preferencia del género Bacillus, como Bacillus subtilis, o plantas a las cuales ha sido transferido. Existen diferentes marcadores que pueden utilizarse, como por ejemplo aquellos que codifican manosa-6-fosfato- isomerasa (especialmente para plantas) o aquellos marcadores que proporcionan resistencia antibiótica, por ejemplo, resistencia a G418, higromicina, belomicina, kanamicina y gentamicina. Para algunas aplicaciones, la construcción de la presente invención comprende, de preferencia, por lo menos la secuencia de nucleótidos de la presente invención operativamente vinculada a un promotor.

Células huésped El término "célula huésped" - en relación con la presente invención incluye cualquier célula que comprende, ya sea la secuencia de nucleótidos o un vector de expresión, según se describe con anterioridad, y que se utiliza en la producción recombinante de una enzima con las propiedades específicas según se definen en la presente. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención provee células huésped transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos que expresa la enzima de la presente invención. De preferencia, dicha secuencia de nucleótidos se lleva en un vector para la replicación y expresión de la secuencia de nucleótidos. Las células se seleccionarán para ser compatibles con dicho vector y pueden, por ejemplo, ser células procarióticas (por ejemplo bacterianas), fúngales, de levadura o vegetales. La bacteria gram-negativa E. coli se utiliza ampliamente como un huésped para la expresión de genes heterólogos. Sin embargo, grandes cantidades de proteínas heterólogas tienden a acumularse dentro de la célula. La purificación posterior de la proteína deseada del volumen de proteínas intracelulares de E. coli puede ser difícil en algunos casos. En contraposición a E. coli, las bacterias gram-negativas del género Bacillus, como B. subtilis, B. licheniformis, B. lentis, B. brevis, B. stearothermophitus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium, B. thuringiensis, Streptomyces lividans o S. murinus, pueden ser altamente apropiadas como huéspedes heterólogos porque su capacidad de secretar proteínas en el medio cultivo. Otras bacterias que pueden ser adecuadas como huéspedes son aquellas de los géneros Streptomyces y Pseudomonas. _JA)l» .,rtWi., Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifican la enzima de la presente invención y/o la conveniencia de un procesamiento ulterior de la proteína expresada, se prefieren huéspedes eucarióticos como levaduras u otros hongos. Por lo general, las células de levadura se prefieren sobre las células fúngales porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son, ya sea poco secretadas de la célula de levadura o, en algunos casos, no procesadas de forma adecuada (v.g., hiperglicosilación en levadura). En estos casos, debe seleccionarse otro organismo de huésped fungal. Los organismos de levadura apropiados pueden seleccionarse de las especies de Kluyveromyces, Saccharomyces o Schizosaccharomyces, v.g., Saccharomyces cerevisiae o Hansenula (descritas en la Solicitud de la Patente del Reino Unido No. 9927801.2). Los hongos filamentosos adecuados pueden ser, por ejemplo, una cepa que pertenece a una especie de Aspergillus, como Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, o una cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto denominado Gribberella zeae, anteriormente Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseum f. sp. Cerealis) o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto denominado Gibberella puricaris, sinónimo de Fusarium trichothercioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum y Fusarium roseum var. Graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo de Fusarium crokkwellnse) o Fusarium venenatum.

Como ejemplo, los huéspedes de expresión típicos pueden seleccionarse de Aspergillus niger, Aspergillus niger var. Tubigenis, Aspergillus niger var. Awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, 5 Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae. El uso de células huésped apropiadas - como células huésped de levadura, fúngales y vegetales - pueden facilitar modificaciones post- traduccionales (v.g., miristoilación, glicolización, truncación, lapidación y fosforilización de tirosina, serina o treonina) según se requieran para conferir 10 actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinante de la presente invención. La célula huésped puede ser una cepa deficiente de proteasa o negativa de proteasa. Esta puede ser, por ejemplo, la cepa deficiente de proteasa Aspergillus oryzae JaL 125 que tiene eliminado el gen de proteasa 15 alcalina denominada "alp". Esta cepa se describe en el documento WO97/35956.

Organismo El término "organismo" en relación con la presente invención 20 incluye cualquier organismo que podría comprender la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima de conformidad con la presente invención y/o productos obtenidos a partir de ella, y/o en donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de conformidad con la presente invención cuando esté presente en el organismo. Los organismos apropiados pueden incluir una procariota, hongos, levadura o una planta. El término "organismo transgénico" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima de conformidad con la presente invención y/o productos obtenidos a partir de ella, y/o en donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de conformidad con la presente invención dentro del organismo. De preferencia, la secuencia de nucleótidos se encuentra incorporada en el genoma del organismo. El término "organismo transgénico" no cubre las secuencias codificadoras de nucleótidos nativos en su ambiente natural cuando están bajo el control de su promotor nativo que también se encuentra en su ambiente natural. Por lo tanto, el organismo de la presente invención incluye un organismo que comprende cualquiera, o combinaciones de la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima de conformidad con la presente invención, construcciones de conformidad con la presente invención, vectores de conformidad con la presente invención, plásmidos de conformidad con la presente invención, células de conformidad con la presente invención, tejidos de conformidad con la presente invención o los productos de los mismos. Por ejemplo, el organismo transgénico pueden comprender también la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima de la presente invención bajo el control de un promotor heterólogo.

Transformación de células/organismo huésped Como ya se mencionó, el organismo huésped puede ser un organismo procariótico o eucariótico. Los ejemplos de huéspedes procarióticos apropiados incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Las enseñanzas sobre la transformación de huéspedes procarióticos se encuentra ampliamente documentado en la técnica, véase por ejemplo Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc. Si se utiliza un huésped procariótico, entonces la secuencia de nucleótidos puede requerir una modificación apropiada antes de la transformación, por ejemplo, a través de la eliminación de intrones. En otra modalidad, el organismo transgénico puede ser una levadura. En este respecto, las levaduras se han utilizado ampliamente como un vehículo para la expresión de genes heterólogos. La especie Saccharomyces cerevisiae presenta una larga historia con respecto al uso industrial, incluyendo su uso para la expresión de genes heterólogos. La expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae la han revisado Goodey et al (1987, Yeast Biotechnology, D R. Berry et al, editores, pp. 401- 429, Alien and Unwin, Londres) y King et al (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton y G T Yarronton, editores, pp. 107-133, Blackie, Glasgow). Por varios razones, Saccharomyces cerevisíae es apropiado para la expresión de genes heterólogos. Primero, no es patogénico para humanos y es capaz de producir ciertas endotoxinas. Segundo, tiene una larga historia de uso seguro después de siglos de explotación comercial por diferentes propósitos. Esto ha conducido a una amplia aceptación pública. Tercero, el extenso uso comercial e investigaciones dedicadas al organismo han originado una abundancia de conocimientos acerca de la genética y fisiología, así como las características de fermentación a gran escala de Saccharomyces cerevisiae. Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de productos genéticos se proporciona en E Hinchcliffe E Kenny (1993, ?east as a vehicle for the expression of heterologous genes"; Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, editores, 2a edición, Academic Press Ltd.). Diversos tipos de vectores de levadura están disponibles, incluyendo vectores integrativos, que requieren una recombinación con el genoma huésped para su mantenimiento, y vectores de plásmido de replicación autónoma. Para preparar las Saccharomyces transgénicas, las construcciones de expresión se preparan mediante la inserción de la secuencia de nucleótidos de la presente invención en una construcción diseñada para la expresión en levadura. Se han desarrollado varios tipos de construcciones utilizadas para la expresión heteróloga. Las construcciones comprenden un promotor activo en la levadura fundido a la secuencia de nucleótidos de la presente invención, generalmente se utiliza un promotor de origen de levadura, como el promotor GAL1. Por lo general se emplea una secuencia de señales de origen de levadura, como la secuencia codificadora del péptido señal del SUC2. Un terminador activo en levadura finaliza el sistema de expresión. Para la transformación de levadura se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, una Saccharomyces transgénica de conformidad con la presente invención puede prepararse de acuerdo con las enseñanzas de Hinnen et al (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168). Las células de levadura transformadas se seleccionan mediante diferentes marcadores selectivos. Entre los marcadores utilizados para la transformación se encuentran varios marcadores auxotrópicoSi tales como LEU2, HIS4 y TRP1 , y marcadores de resistencia antibiótica dominantes como marcadores antibióticos de aminoglicosida, v.g., G418. Las células de hongos filamentosos pueden transformafse mediante un procedimiento que incluye la formación y transformación de protoplastos seguido por la regeneración de la pared celular de una manera conocida. El uso de Aspergillus como microorganismo huésped se describe en el documento EP 0 238 023. Otro organismo huésped es una planta. El principio fundamental en la construcción de plantas genéticamente modificadas es la inserción de información genética en el genoma de la planta para obtener un mantenimiento estable del material genético insertado. Existen vanas técnicas para insertar la información genética, siendo los dos principios más importantes la introducción directa de la información genética y la introducción de la información genética mediante un sistema de vector. Una revisión de las técnicas generates puede encontrarse en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.

[1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food- Industry Hi-Tech marzo/abril de 1994 17-27). Enseñanzas adicionales sobre la transformación de plantas pueden encontrarse en el documento EP-A- 0449375. Las células huésped transformadas con la secuencia de nucleótidos pueden cultivarse bajo condiciones que conducen a la producción de la enzima codificada y que facilitan la recuperación de la enzima de las células y/o el medio de cultivo. El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la enzima. Los medios apropiados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de conformidad con las recetas publicadas (v.g., según se describe en catálogos de American Type Culture Collection). La proteína producida por una célula recombinante puede desplegarse en la superficie de la célula. Si se desea, y como lo comprenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión, que contienen secuencias codificadoras, pueden ser diseñados con secuencias de señales con secreción directa de las secuencias codificadoras a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Otras construcciones recombinantes pueden unir la secuencia codificadora a la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptidos que facilitará la purificación de proteínas solubles (Kroll DJ et al (1993) DNA Cell Biol. 12:441- 53). La enzima puede ser secretada de las células huésped y recuperada convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos conocidos, incluyendo la separación de células del medio a través de centrifugación o filtración, y la precipitación de componentes proteináceos del medio mediante una sal, como el sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos, tales como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares.

Secreción Con frecuencia, es deseable que la enzima sea secretada del huésped de expresión al medio de cultivo desde donde es más fácil recuperar t_ _i.-i.t-i-i-_-ü-iili, , fijir *, ......^^^«^.^^.. ^ la enzima. De conformidad con la presente invención, la secuencia líder de secreción puede seleccionarse con base en el huésped de expresión deseado. Las secuencias de señales híbridas pueden utilizarse también en el contexto de la presente invención. Los ejemplos típicos de secuencias líder de secreción heteróloga son aquellas que provienen del gen de amiloglucosidasa fungal (AG) (glaA -tanto las versiones de 18 como de 24 aminoácidos, v.g., de Aspergillus), el gen de factor a (levaduras, v.g., Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de a-amilasa (Bacillus).

Proteínas de fusión Las secuencia de aminoácidos de la presente invención puede producirse como una proteína de fusión, por ejemplo, para facilitar la extracción y purificación. Los ejemplos de parejas de proteínas de fusión incluyen glutation-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de enlace de ADN y/o activación transcripcional) y ß-galactosidasa. Asimismo, puede ser conveniente incluir un sitio de división proteolítica entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia proteínica de interés para permitir la eliminación de las secuencias de proteínas de fusión. De preferencia, la proteína de fusión no impedirá la actividad de la secuencia de proteínas. La proteína de fusión puede comprender un antígeno o un determinante antigénico fundido a la sustancia de la presente invención. En esta modalidad, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión natural i*~>M.>*?tH0n¡ ?JLt¿>m*m**. t^i Éi i^ que comprende una sustancia que puede fungir como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunológico. Et antígeno o determinante antigénico puede sujetarse a la terminal amino o carboxi de la sustancia. En otra modalidad de la invención, la secuencia de aminoácidos puede ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para monitorear las librerías de péptidos a través de agentes capaces de influir en la actividad de la sustancia, puede ser útil codificar una sustancia quimérica que expresa un epítope heterólogo que es reconocido por un anticuerpo comercialmente disponible. La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos en donde: La figura 1 ilustra el efecto de una lipasa comercial en la estructura del migajón del pan, GRINDAMYL™EXEL 16 (200 ppm) (rollo de pan del lado izquierdo), Lipasa SP 972 (1000, 2500 y 5000 LUT/kg de harina respectivamente) (bollos 2-4) en comparación con un control sin adición de lipasa (bollos del lado derecho); La figura 2 muestra el efecto en el volumen del pan y la estructura del migajón de la adición de un lípido de avena solo (pan del lado izquierdo), lípido de avena + 1010 ppm de SP 979 (pan en el centro) y lípido de avena + 200 ppm de GRINDAMYL™EXEL 16 (pan del lado derecho). Ú** *» ?^* , ,^M^^ t. ^m^^b i?¿ ^ La figura 3 ilustra la relación entre la capacidad de Lipasa SP 972 y Lipasa SP 979 con respecto a la hidrolización de triglicéridos y su capacidad de hidrolizar glicolípidos y La figura 4 ilustra la relación entre la capacidad de Lipasa SP 972 y Lipasa SP 979 con respecto a la hidrolización de triglicéridos y su capacidad de hidrolizar fosfolípidos.

EJEMPLOS Materiales v métodos 1. Enzimas utilizadas Las preparaciones de enzimas, denominadas SP 972, y SP 979, cuyas enzimas son enzimas lipolíticas modificadas capaces de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido, se obtuvieron de Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca. Las designaciones de las enzimas son aquellas utilizadas por Novo Nordisk. Además, una preparación de enzimas comercialmente disponible se obtuvo de Fluka Chemie AG, Suiza (número de catálogo designado 62299). Esta enzima proviene de Candida antárctica. Las siguientes lipasas se utilizaron como referencias: GRINDAMYL™EXEL 16 (Danisco Ingredients, Brabrand, Dinamarca) y Stalingase™ (Gist-brocades, Delfts, Países Bajos). a_y_ttM¡*a ¿ -JB?¿?, ¿*á?jáÍáÍÍ 2. Actividad de tipasa utilizando tributirina como sustrato La actividad de lipasa con base en el uso de tributirina como sustrato se midió según se describe en Food Chemical Codex, 4a edición, National Academy Press, 1996, p. 803, con la modificación de que las muestras se disolvieron en agua desionizada en lugar de en un amortiguador de glicina y que el punto de ajuste de pH-stat fue de 5.5 en lugar de 7. 1 LUT se define como la cantidad de la enzima que puede liberar ácido butírico 2 µmol por minuto bajo condiciones de prueba. 1 LIPU se define como la cantidad de la enzima que puede liberar ácido butírico 1 µmol por minuto, bajo condiciones de prueba. 3. Prueba de lipasa con base en el uso de un aceite de girasol como sustrato (Lusol. pH 6.5) Reactivos: 8.4 g de goma arábica se disuelve en 100 ml de agua desmineralizada y se añaden 100 ml de CaCI2 20 mM. Se agregan lentamente 36 ml de aceite de girasol bajo agitación mediante un agitador Ultra Turrax™ a 20,000 rpm para obtener una emulsión. Prueba: 20 ml de la emulsión de aceite de girasol en un cubilete se equilibran a 30°C durante 5 minutos y el pH se ajusta a 6.3-6.5 mediante un pH-stat. 2 ml de la preparación de enzima se agrega y NaOH 0.05 N se añade continuamente, manteniendo el pH a 6.5 durante 10 minutos. Se calcula la pendiente de la curva para la adición de NaOH 0.05 N como una función de tiempo. 1 LUSol se define como la cantidad de la enzima que puede liberar 1 µmol de ácido graso por minuto bajo condiciones de prueba. 4. Prueba de fosfolipasa (PLU. pH 8.0) Sustratos: 8 g de polvo de lecitina (Metarin P.074793) se disuelve en 150 ml de agua bajo calentamiento a 40-50°C. 40 ml de CaCI2 50 mM se agrega y agua se añade a 200 ml. La mezcla del sustrato se homogeniza durante 1 minuto mediante un agitador Ultra Turrax™ a 20,000 rpm. Prueba: 20. 0 ml del sustrato se transfieren a un cubilete y se equilibran a 30°C durante 5 minutos. El pH se ajusta a 8.0 y se añaden 2 ml de la preparación de enzima seguido por la adición continua de NaOH 0.05 N durante 10 minutos, manteniendo el pH a 8.0. Se calcula la pendiente de la curva para la adición de NaOH 0.05 N como una función de tiempo. 1 PLU se define como la cantidad de la enzima que puede librera 1 µmol de ácido graso por minuto bajo condiciones de prueba. 5. Prueba de horneado (pan tostado) 2000 g de harina dietética danesa, 30 g de levadura seca, 30 g de azúcar, 30 g de sal y agua a 400 unidades Brabender (BU) + 3% se amasaron mediante un agitador Hobart™ con gancho durante 2 minutos a baja velocidad y 10 minutos a alta velocidad. La temperatura de la masa tf^riiitihrT-^'iiiftlil después del mezclado fue de 25°C. El tiempo de reposo fue de 10 minutos a 30°C. La masa se pesó a 750 g por masa y se puso en reposo de nuevo por 5 minutos a 33°C y 85% HR. El moldeado se realizó mediante un moldeador Glimik™. Las masas se probaron en latas durante 50 minutos a 33°C y se hornearon en un horno Wachtel™ durante 40 minutos a 220°C y con inyección de vapor durante 16 segundos. Después del enfriamiento, el pan se pesó y el volumen del pan se midió mediante el método de desplazamiento de semillas de colza. Asimismo, se evaluó subjetivamente el migajón en una escala de 1 a 10, en donde 1 = estructura gruesa y 10 = estructura homogénea.

Tres barras de pan en latas provistas de tapas se almacenaron a 20°C y se utilizaron para las mediciones de firmeza. 6. Medición de firmeza La firmeza del pan se midió mediante un Instron™ UTM modelo 4301 conectado a una computadora. Las condiciones de las mediciones fueron las siguientes: Celda de carga Máx. 100 N Diámetro de pistón 50 mm Velocidad de cruceta del vastago 200 mm/min. Compresión 25% Grosor de rebanada de pan 11 mm La potencia se convierte en N/dm2. Los resultados se calcularon como un promedio de 10 rebanadas de pan por barra. 7. Prueba de horneado (bollos de corteza dura) 1500 g de harina dietética danesa, 90 g de levadura comprimida, 24 g de azúcar, 24 g de sal y agua a 400 unidades Brabender + 2% se amasaron mediante un agitador Hobart™ con gancho durante 2 minutos a baja velocidad y 6 minutos a alta velocidad. La temperatura de la masa fue de 26°C. La masa se pesó a 1350 g y se puso en reposo por 10 minutos a 30°C. El moldeado se realizó mediante un moldeador Fortuna™. La masa moldeada se probó durante 45 minutos a 34°C y se horneó en un horno Bago™ durante 18 minutos a 220°C y con vapor durante 12 segundos. Después del enfriamiento, los bollos se pesaron y el volumen de los bollos se midió mediante el método de desplazamiento de semillas de colza. El volumen específico de los bollos se calculó de la siguiente manera: Volumen específico = Volumen del pan, ml Peso del pan, g 8. Mini-prueba de horneado 50 g de harina dietética danesa, 10 g de levadura seca, 0.8 g de azúcar, 0.8 g de sal, 70 ppm de ácido ascórbico y agua a 400 unidades Brabender se amasaron en un recipiente de mezclado Brabender™ de 50 g durante 5 minutos a 30°C. El tiempo de reposo fue de 10 minutos a 34°C. La masa se pesó a 15 g por masa y se moldeó mediante un dispositivo en el que la masa se allana entre una placa de madera y un marco de plexiglás. Las masas se probaron en latas durante 45 minutos a 34°C y se hornearon en un horno doméstico Voss™ durante 8 minutos a 225°C. después del horneado, las barras pequeñas se enfriaron a temperatura ambiente y al cabo de 20 minutos, las barras se pesaron y el volumen se determinó mediante el método de desplazamiento de semillas de corza. Las barras se cortaron y se evaluaron el migajón y la corteza. 9. Extracción de lípidos y análisis de ácido graso 20 g de una masa completamente probada se congelaron de inmediato y se liofilizaron. La masa liofilizada se molió mediante un molino de granos de café y se pasaron a través de una pantalla de 800 µm. 2 g de la masa liofilizada se pesaron con un tubo de centrífuga de 15 ml con tapa roscada. Se añadieron 10 ml de butanol saturado de agua (WSB). El tubo de centrífuga se colocó en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Los tubos se colocaron en un aparato Rotamix™ y se voltearon a 45 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se colocaron en un baño de agua hirviendo y se voltearon en el aparato Rotamix™ durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 3,500 g durante 5 minutos. 5 ml del sobrenadante se transfirieron a un vial. WSB se evaporó hasta la sequedad bajo un chorro de nitrógeno. Los ácidos grasos libres en el extracto se analizaron como sales Cu en isooctano medidas a 715 nm y cuantificadas de conformidad con una curva de calibración basada en el ácido oleico (Kwon, D.Y. y J.S. Rhee » ^au^^*^á¡l^l? ÍtJ^!^Á^kx (1986), A Simple and Rapid Colourimetric Meted for Determination of Free Fatty Acids for Lipase Assay, JACOS 63:89). 10. Análisis de HPLC Columna: LiChrospher™ 100 DIOL 5 µm (Merck, art. 16152) 250 x 4.0 id con camisa de agua, 50°C. Fase móvil: A: heptano/isopropanol/butanol/tetrahidrofurano/isoocatno/H2O*, 64.5/17.5/7/5/5/1 B: isopropanol/butanol/tetrahidrofurano/isooctano/H2O*, 730/7/5/5/10 *Ácido trifluoroacético 1 mmol/l de fase móvil (pH = 6.6 ajustado con NH3) Bomba: Waters™ 510 + controlador de gradiente Gradiente: Detector: CUNOW™ DDL21 (dispersión luminosa evaporatoria) (temp: 100°C, voltaje: 600, flujo de aire: 6.0 l/min) Inyector: Hewlett Packard™ 1050, volumen de inyección 50 µl ^ * fft * i— ***.* **** ..^^^ ^s^m**^ Preparación de la muestra: El lípido de trigo se disolvió en 5 ml de CHCI:_/CH3OH (75:25), se sónico durante 10 minutos y se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0.45 µm. Cálculo: Curva de calibración para PC (estándar de lecitina de International Lecithin and Phospholipid Society). Referencia: Arnoldsson, K.C. y P. Kaufmann (1996), Chromatographia 38:317. 11. Cromatografía de gases Se utilizó un cromatógrafo de gas capilar Perkin Elmer™ 8420 equipado con una columna de sílice fundido WCOT, 12.5 x 0.25 mm ID y 0.1 µm de silicona de fenilmetilo al 5% (CP Sil 8 CB de Chrompack) con helio como transportador bajo las siguientes condiciones: Detector: FID, 385°C Programa del horno: Preparación de la muestra: 50 mg de lípido de trigo se disolvieron en 12 ml de heptano:piridina, 2:1 comprendiendo 2 mg/ml de heptadecano como estándar interno. 500 µl se transfirieron a un vial con tapón engargolado y 100 µl de MSTFA (N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida) se agregaron y se hicieron reaccionar durante 15 minutos a 90°C. Cálculo: Los factores de respuesta para mono-, di- y triglicéridos y ácidos grasos libres se determinaron de las mezclas de referencia de estos componentes. Con base en estos factores de respuesta, se calculó el contenido de mono-, di- y triglicéridos y ácidos grasos libres en lípidos de trigo. 12. Actividades enzimáticas de las enzimas utilizadas en tos siguientes ejemplos EJEMPLO 1 El efecto de SP 972 v GRINDAMYL™ EXEL 16 en bollos de corteza dura Los bollos se hornearon y se examinaron de conformidad con los procedimientos que se describen con anterioridad. Los resultados se resumen en el siguiente cuadro 1.1 : • ' I i I I j *faM,"-ib -"** CUADRO 1.1 Volumen específico y puntuación de miga (1-10) Las masas completamente probadas de esta prueba de horneado se extrajeron y se midió el contenido de ácidos grasos libres. Los resultados se resumen en el cuadro 1.2: CUADRO 1.2 Contenido de ácido graso libre en masas probadas Estos resultados indican un efecto evidente de la Lipasa SP 972 en la formación de ácidos grasos en masas. « * e i 1 *i ú ' í _ü«Í_ái * i "" 4, Además, el volumen del pan mejora significativamente con la adición de Lipasa 972 y esta enzima proporciona una estructura de miga más blanca y homogénea, como puede observarse en la figura 1.

EJEMPLO 2 El contenido de ácidos grasos y lípidos polares en masas probadas complementadas con lipasa Cinco masas de prueba (1-5) se mezclaron con un farinógrafo Brabender™ de 50 g a 30°C durante 5 minutos y se probó a 34°C durante 60 minutos, seguido de inmediato por el congelamiento y la liofilización. Las composiciones de las masas de prueba se resumen en el cuadro 2.1.: CUADRO 2.1 Composición de masas de prueba El contenido de ácidos grasos se analizó mediante GC. Los resultados de estos análisis se resumen en el cuadro 2.2: CUADRO 2.2 Contenido de ácidos grasos en masas de prueba 1 -5 Además, el contenido de lípidos polares en la masa de control (masa de prueba 1) y la masa de prueba 5 se analizaron mediante HPLC según se describe con anterioridad. Los resultados se resumen en el cuadro 2.3: CUADRO 2.3 Contenido de lípidos polares en masas de prueba gue contienen 0 v 8943 LUT de lipasa respectivamente Los resultados anteriores indican un efecto evidente de la Lipasa SP 972 en la formación de los ácidos grasos. Incluso a la dosis más baja de 894 LUT/kg de harina, se observó un aumento significativo del contenido de ácido graso en la masa de prueba. Los análisis de HPLC indican un efecto notable con respecto a la hidrólisis de fosfolípidos y glicolípidos. En consecuencia, estos experimentos demuestran que la Lipasa SP 972 puede utilizar glicéridos, fosfolípidos y glicolípidos como sustrato.

EJEMPLO 3 El efecto de Lipasa SP 972 sola y en combinación con lecitina de sova en el contenido de ácidos grasos v lípidos polares en masa de bollos de corteza dura y la calidad de los bollos horneados La Lipasa SP 972 se examinó por su actividad sola y en combinación con lecitina de soya en la calidad de bollos de corteza dura. Un producto de lipasa comercial, GRINDAMYL™ EXEL 16 (EXEL 16) y un emulsificante DATEM comercial, Panodan™ A 2020 se analizaron por propósitos de comparación. Las cantidades utilizadas de aditivos de enzima y emulsificante y las características de calidad de los respectivos bollos horneados se resumen en el cuadro 3.1 : * í i te-A-a , mribm- ...MJ ******»**- ^..^?ÉJt?á?A.

CUADRO 3.1 Adiciones de enzima v emulsificante y calidad del pan 1 No determinado. Los experimentos que utilizan Lipasa SP 972 Los experimentos de horneado que utilizan Lipasa SP 972 en comparación con GRINDAMYL™ EXEL 16 o el emulsificante Panodan A 2020 mostraron un excelentes resultados de horneado de SP 972 sola o en combinación con lecitina de soya. Este efecto es significativamente mejor que aquel de la lipasa comercial, GRUNDAMYL™ EXEL 16. Los lípidos extraídos de la masa se analizaron por ácidos grasos libres y lípidos polares según se describe con anterioridad. Los resultados de estos análisis se resumen en los cuadros 3.2 y 3.3: * i f 1 ^ * M £¿ % CUADRO 3.2 Contenido de ácidos grasos libres en masas gue contienen un emulsificante. Lipasa SP 972 sola o en combinación con lecitina. o GRUNDAMYL™ EXEL 26 solo o en combinación con lecitina CUADRO 3.3 El contenido de lípidos polares (% en peso) en masas complementadas con Lipasa 972 sola o en combinación con lecitina o GRINDAMYL™ EXEL 16 solo o en combinación con lecitina Los resultados anteriores indican que GRINDAMYL™ EXEL 16 no tiene ningún efecto en la hidrólisis de DGDG y PC. Por lo tanto, puede concluirse que la modificación de tanto los fosfolípidos como los glicolípidos ,#&* * ** &*, . •MUíuí?M t^?? ???iU^tá en la masa producida por 972 es importante para el efecto de mejoramiento del pan de Lipasa 972 en comparación con la Wpasa comercial, GRINDAMYL™ EXEL 16.

EJEMPLO 4 La actividad enzimática de Lipasa SP 972 en una masa complementada con lípido de avena La Lipasa SP 972 se analizó en una masa modelo complementada con una fracción de lípido de avena, 2133-18-1. La receta de masa fue la siguiente: CUADRO 4.1 Composición de masas complementadas con lípido de avena La masa se mezcló a 30°C mediante un farinógrafo Brabender de 50 g. Después de 60 minutos de fermentación, la masa se congeló y liofilizó seguido por la extracción de lípidos de la masa liofilizada y el análisis por lípidos polares mediante HPLC. Los resultados se resumen en el cuadro 4.2: CUADRO 4.2 Contenido de lípidos polares en masas complementadas con lípidos de avena. Los valores son % en peso de la masa liofilizada.

Los resultados anteriores sugieren que la adición de lípidos de avena origina un nivel aumentado de tanto fosfolípidos como glicolípidos y que la lipasa SP 972 utiliza en gran medida DGDG y PC como sustratos. En consecuencia, la adición de la enzima tiene un efecto significativo en las masas con respecto a la formación de más componentes de lípidos polares. „y¿, y* t i '- 1 . ' ' ií*^,^...^^ mu¿. ?tái? j¿il M ké?li -ii&l EJEMPLO 5 Experimentos de horneado para evaluar el posible efecto sinergístico de agregar un lípido de cereal y Lipasa SP 979 a masas Se realizaron experimentos de horneado en los que el efecto de una preparación de lípidos de avena fraccionados (2133-18-1 ) solo y en combinación con Lipasa SP 979 o GRINDAMYL™ EXEL 16 en la calidad del pan se analizó para evaluar si se pudiera demostrar un efecto sinergístico de lípido de avena y lipasas. El procedimiento para elaborar la masa y hornear la masa fue como se describió con anterioridad para la "mini-prueba de horneado". La cantidad de aditivos utilizados y los resultados con respecto a la calidad del pan se resumen en el cuadro 5.1 : Estos experimentos de horneado indican un efecto muy fuerte en el volumen a través de la combinación de lípido de avena y Lipasa SP 979. La fracción de lípido de avena por sí sola no tuvo ningún efecto de mejoramiento en el volumen del pan. Asimismo, fue evidente que la lipasa comercial GRINDAMYL™ EXEL 16, aunque mostró un ligero efecto de mejoramiento del volumen, tuvo un efecto de mejoramiento del volumen del pan •í * . * *»; . fM^? ,*^a ?k á U significativamente menor que la lipasa SP 979, la cual, con respecto al control sin aditivos, proporcionó un mejoramiento del volumen específico del 43% y, con respecto a la lipasa comercial, un mejoramiento de aproximadamente el 22%.

Además del volumen del pan mejorado, la adición de Lípasa SP 979 produjo una mejor estructura del migajón y del aspecto del pan. Esto se ilustra en la figura 2 de la que puede inferirse que el pan horneado con SP 979 produjo una estructura de miga más agradable y suave y un esponjado al hornear significativo.

EJEMPLO 6 El efecto de Lipasa SP 979 sola o en combinación con acitgliceroles ert la calidad de masas y la calidad de pan tostado La Lipasa SP 972 se analizó sola y en combinación con aceite de soya en experimentos de horneado con pan tostado que se realizaron según se describe con anterioridad, y los efectos en las características de la masas y la calidad del pan se compararon con aquellas de GRINDAMYL™ EXEL 16 y DIMODAN™ SDM-T. Los resultados con respecto a los parámetros de calidad de la masa y la calidad del pan de estos experimentos se resumen en los siguientes cuadros: CUADRO 6.1 l efecto en la extensibilidad y pegajosidad de masa de Lipasa SF 972. aceite de sova. manteca. GRINDAMYL™ EXEL 16 v el emulsificante. DIMODAN™ SDM-T solos o combinados CUADRO 6.2 El efecto en el volumen específico, la calidad v suavidad del mioaión de Lipasa SP 972. aceite de sova. manteca. GRINDAMYL™ EXEL 16 v el emulsificante, DIMODAN™ SDM-T solo o en combinaciones Estos experimentos de horneado confirmaron que la adición de Lipasa SP 972 sola y en combinación con lípidos de acilglicerol produjo un mejoramiento significativo del volumen y la suavidad del pan y este efecto fue claramente mejor que aquel de la lipasa comercial, GRINDAMYL™ EXEL 16. Además, como puede inferirse de los cuadros anteriores, la adición de Lipasa SP 972 proporcionó una mayor extensibilidad de la masa y puntuación de miga. Asimismo, los resultados anteriores manifiestan que SP 972 proporcionó efectos muy positivos en combinación con el aceite de soy, así como con la manteca.

Por contraste al ef& tó de Lipasa SP 972, la adición de GRINDAMYL™ EXEL 16 no produjo un mejoramiento de la suavidad del pan.

EJEMPLO 7 El efecto en las características de la masa y la calidad del pan de Lipasa SP 979 La Lipasa SP 979, que ejerce relativamente poca actividad en triglicéridos de cadena corta, pero es particularmente activa en glicéridos con ácidos grasos de cadena larga (véase la sección 12 anterior) y en fosfolípidos, se analizó en experimentos de horneado de pan tostado. El procedimiento para preparar el pan tostado fue según se describe con anterioridad, pero con la adición de aditivos como se indica en el siguiente cuadro 7.1 que resume los resultados de los experimentos con respecto a la calidad de la masa y del pan. * í i ' CUADRO 7.1 El efecto de Lipasa SP 972 sola v en combinación con lecitina o aceite de sova en la calidad de la masa v el pan Estos experimentos de horneado muestran un efecto muy interesante de Lipasa SP 979 en términos de un mejoramiento del volumen del pan y la estructura del migajón. Este efecto es significativamente mejor que aquel del emulsificante comercial, DIMODAN™ SDM-T. Sin embargo, aún más interesante es el efecto de esta enzima en la suavidad del pan que indica claramente que Lipasa SP 979, tanto sola como en combinación con acilgliceroles y fosfolípidos tiene un efecto de mejoramiento de la suavidad significativo. Se observó que el migajón del pan elaborado en este experimento con adición de SP 979 fue húmedo y que la estructura del migajón de tal pan fue muy homogénea y tuvo una adherencia más corta que aquella del pan de control sin aditivos.

EJEMPLO 8 El efecto de Lipasa SP 979 sola v en combinación con lípidos de avena en la calidad del pan Se realizaron experimentos de horneado de panes pequeños de conformidad con los procedimientos que se describen con anterioridad, pero añadiendo los aditivos según se indica en el siguiente cuadro 8.1 en donde se resumen los efectos en el volumen específico y la formación de ácidos grasos libres (analizados mediante colonmetría) en las masas.

CUADRO 8.1 El efecto de Lipasa 979 en el volumen del pan v la formación de ácidos grasos libres Los resultados anteriores demuestran un efecto reforzante significativo de la masa de Lipasa SP 979 reflejado en un mayor volumen , ^.?í»***** . ***»*. ?, *. . n^ ^H^.****»^*^* ** ü& específico y una mejor estructura y apariencia del migajón. El efecto de SP 979 fue incluso más pronunciado cuando se combinó con aceite de avena. Las masas probadas de esta prueba de horneado se liofilizaron y los lípidos se extrajeron y se sometieron al análisis por HPLC. Los resultados de este análisis de muestran en el cuadro 8.2: CUADRO 8.2 El efecto de Lipasa SP 979 en la hidrólisis de glicolípidos v fosfolípidos en la masa (valores en % en peso) Estos resultados sugieren que Lipasa SP 979 es capaz de hidrolizar tanto los glicolípidos (DGDG) como los fosfolípidos (PC). De hecho, más del 50% de DGDG y PC presente se hidroliza mediante la adición de SP 979. , ¡¡^ «ttUt?^Í?^^???^^ EJEMPLO 9 Efectos de mejoramiento de la calidad de la masa v el pan de Lipasa 972 y Lipasa SP 979 en comparación con lipasas comerciales. GRINDAMYL™ EXEL 16 y Stalinqase™ Los efectos hidrolizantes lípidos de Lipasa SP 972 y Lipasa SP 979 se compararon con aquellos de dos lipasas comerciales, GRINDAMYL™ EXEL 16 y Stalingase™ (Gist-brocades) (esta última enzima también se denomina # 1867) en un sistema de masa muestra. Las masas se mantuvieron durante 1 hora a 32°C y se liofílizaron y los lípidos polares se analizaron mediante HPLC y los lípidos no polares mediante GLC. Las masas muestra tuvieron las siguientes composiciones: CUADRO 9.1 Composición de masas muestra I-_M-&¿_,.jZ£~*j~ji*>-J¿t?*áÁ máa El contenido de ácidos grasos libres y triglicéridos (análisis GLC) y los lípidos polares, DGDG y PC (análisis HPLC) en las masas se resumen en el cuadro 9.2.

CUADRO 9.2 Contenido de ácidos grasos libres, triglicéridos v lípidos polares en masas muestra fvalores en % en peso) Con base en estos valores, es posible calcular la cantidad de ácido graso libre (FFA) formado en la masa y las cantidades de triglicéridos, DGDG y PC, respectivamente, que se hidrolizan en las masas. Estos datos se muestran en el cuadro 9.3: .^^.ci^^^i i.^..,, - Js -•* '_t_? =2_«-_É-É -__ -Í£-__,l *i- t^ CUADRO 9.3 Formación de ácidos grasos libres y hidrólisis de triglicéridos. DGD0 y PC en masas muestra (% en peso) Cuando la actividad de una lipasa en una masa se expresa en términos de la cantidad de FFA formados en la masa, según se muestra en el cuadro anterior, se demuestra claramente que Lipasa SP 972 y Lipasa SP 979 son muy activas con respecto a la hidrólisis de glicolípidos (DGDG), así como de fosfolípidos (PC), en comparación con las lipasas comerciales analizadas, que no muestran ningún efecto en absoluto en estos sustratos. Con respecto al efecto en los triglicéridos, tanto Lipasa SP 972 como Lipasa SP 979 son activas, aunque a un grado menor que las lipasas comerciales analizadas. En consecuencia, estos resultados confirman que las dos lipasas de conformidad con la invención hidrolizan una amplia gama de sustratos lípidos, incluyendo lípidos no polares, como los triglicéridos, y lípidos polares como el glicolípido, DGDG, y el fosfolípido, PC.

Los datos resumidos en el cuadro 9.3 pueden ilustrarse también gráficamente para mostrar la relación entre la capacidad de las enzimas de hidrolizar triglicéridos y la capacidad de hidrolizar glicolípidos (figura 3) y la relación entre la capacidad de las enzimas de hidrolizar triglicéridos y la capacidad de hidrolizar fosfolípidos (figura 4). De estas figuras puede inferirse que esta relación para Lipasa SP 972 y Lipasa SP 979, respectivamente, con respecto a DGDG, puede describirse como una curva con pendientes de 1.3965 y 2.6405, respectivamente, y los valores correspondientes con respecto a PC son de 0.1648 y 0.7248 respectivamente. Estos datos ilustran claramente la actividad relativamente alta de Lipasa SP 972 y Lipasa SP 979 en glicolípidos y fosfolípidos en relación con su efecto en triglicéridos.

EJEMPLO 10 Efecto de Lipasa SP 979 v Lipasa SP 972 en diferentes ácidos grasos La actividad de las lipasas SP 979 y SP 972 en diferentes ácidos grasos se evaluó al preparar una masa de prueba que contenía grasa de mantequilla. Un producto de lipasa comercial, GRINDAMYL™ EXEL 16, se analizó para comparación. Las masas de prueba se prepararon de conformidad con las recetas indicadas en el cuadro 10.1 : CUADRO 10.1 Composición de masas de prueba con grasa de mantequilla Las cuatro masas de prueba (1-4) se mezclaron mediante un recipiente de mezclado Brabender™ y se probaron (según se detalla en la sección denominada "8. Mini-prueba de horneado" anterior). Después de la probación, las masas se congelaron y se liofilizaron. El total de lípidos en las masas se extrajeron con butanol saturado de agua. Los ácidos grasos libres en los lípidos de la masa se aislaron en una columna Elut-NH2 Bond y la composición de ácido graso libre se analizó mediante GLC como esteres metílicos de ácido graso (véase cuadro 10.2). La cantidad total de ácidos grasos libres en los lípidos de la masa (%, calculado sobre el peso seco de la masa) se analizó mediante el método espectrofotométrico como sales Cu (véase también el cuadro 10.2).

CUADRO 10.2 Acido graso libre en la masa y la composición de ácido graso del ácido graso libre Con base en la cantidad de ácido graso libre y la composición del ácido graso, es posible calcular la cantidad de ácido graso libre producido en la masa que contienen lipasa en relación con la masa a la que no se agregó lipasa (véase cuadro 10.3). Por ejemplo, la cantidad de ácido graso C16 (palmétieo) producido en la masa número 2 que contiene la lipasa GRINDAMYL EXEL 16, en comparación con la masa número 1 sin adición de lipasa, se calcula dé la siguiente manera: 0.252 x 35.8 . 0.0925 x 38.1 = 0.05497% 100 100 0.05497% = 549.7 ppm 549.7 ppm 2.144 mmoles por kg de masa seca %medio de ácido graso (es decir, 256.4) Con base en esta información es posible calcular la cantidad de ácidos grasos de cadena corta (número de carbonos < 10) en relación con la cantidad de ácidos grasos de cadena larga (número de carbonos > 12) producidos en la masa (véase cuadro 10.3).

CUADRO 10.3 Mmoles de ácido araso/kq de masa seca v actividad relativa en ácidos grasos de cadena corta Los resultados presentados en el cuadro 10.3 demuestran que las diferentes lipasas tuvieron diferente actividad hacia los ácidos grasos en el mismo sustrato y se muestra que las lipasas SP 972 y SP 979 presentan poca actividad hacia los ácidos grasos de cadena corta en comparación con Grindamyl EXEL 16. »**-irf*f-« «ÍI -Vi__lff.t ll. * U.t^r M¡H UI¡&.

EJEMPLO 11 La actividad de una lipasa comercialmente disponible hacia los lípidos polares Se evaluó la actividad de una lipasa comercialmente disponible en Fluka Chemie AG, Suiza, designada como número de catálogo 62299. Esta lipasa se examinó en un sistema de masa muestra y se comparó con una masa de control sin adición de lipasa. Las masas de prueba en 10 g se prepararon de conformidad con las recetas que se indican en el cuadro 11.1 : CUADRO 11.1 Composición de masas de prueba Las masas (1-2) se amasaron con un recipiente de mezclado Brabender™ de 50 g durante 5 minutos a 30°C y se probaron durante 45 minutos a 34°C. Después de la probación, las masas se congelaron y se liofilizaron. Las masas liofilizadas se extrajeron con butanol saturado de agua.

Los lípidos aislados de la masa se analizaron entonces por ácidos grasos ^?t OM^?^lß?i^l? ^i?^???.íétÉS^ -- & -«»- -*j»gjfrj?frfeJL| libres mediante un método colorímetrito como sales Cu y los lípidos de la masa se analizaron también mediante HPLC (véase cuadro 11.2).

CUADRO 11.2 Análisis HPLC de los lípidos de la masa Los resultados proporcionados en el cuadro 11.2 muestran que la lipasa No. 62299 de Fluka es activa en un sistema de masa durante la formación de ácidos grasos libres y que la lipasa No. 62299 de Fluka es activa en los glicolípidos (DGDG), así como hacia los fosfolípidos (PC). Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incluyen en la presente por referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas de la invención que se describen serán evidentes para los expertos en la técnica sin que esto implique una desviación del propósito y alcance de la invención. A pesar de que la invención se ha descrito en relación con modalidades preferidas específicas, debe comprenderse que la invención, según se reivindica, no deberá limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los procedimientos descritos de la invención, que son evidentes para los expertos en la técnica de la biología molecular o ámbitos relacionados, pretenden ser comprendidas en el alcance de las siguientes reivindicaciones. ?'? i ? í ? i •______! ^ * **__« i~i.** ^áÁÍ

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para preparar una masa de harina, caracterizado porque comprende la adición de una enzima que, bajo condiciones de masa, es capaz de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido, o una composición que contiene dicha enzima, a los componentes de la masa y la mezcla de los componentes de la masa para obtener la masa.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos el lípido no polar, el glicolípido o el fosfolípido es un componente lípido natural presente en la harina utilizada para la masa.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el lípido natural es un fosfolípido.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el fosfolípido es fosfatidilcolina (PC).

5.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el lípido natural es un glicolípido.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el glicolípido es digalactosil diglicérido (DGDG).

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque por lo menos el lípido no polar, el glicolípido o el fosfolípido se añade a la masa.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el lípido no polar añadido es un acilglicerol.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el acilglicerol añadido se selecciona del grupo que comprende un aceite vegetal, una grasa vegetal, un aceite animal, una grasa animal, manteca vegetal y mantequilla.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el aceite vegetal es un aceite de cereal natural incluyendo aceite de avena.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el lípido polar añadido es un fosfolípido seleccionado del grupo que comprende fosfatidilinositol (Pl), fofastidilglicerot (PG), fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE).

12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la masa en una masa fermentada con levadura.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la enzima se añade a una cantidad en la escala de 10 a 100,000 LUT/kg de harina o en la escala de 10 a 100,000 PLU/kg de harina.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la cantidad de la enzima es en la escala de 100 a 10,000 LUT/kg de harina o 100 a 10,000 PLU/kg de harina.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la masa es una masa de pan, en donde el método comprende como paso adicional que la masa se hornea para obtener un producto horneado.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la masa es una masa seleccionada del grupo que comprende una masa de pasta, una masa de fideo y una masa o pasta de pastel.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la enzima se añade a una cantidad que produce un aumento del volumen específico del producto horneado que es por lo menos del 10%, en relación con un producto horneado elaborado bajo condiciones idénticas, excepto que no se agrega la enzima.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se añade una enzima adicional a la masa.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la enzima adicional se selecciona del grupo que comprende una lipasa, una enzima degradante de almidón, una hemicelulasa, una celulasa y una oxidoreductasa.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque se hidroliza por lo menos el 25% de DGDG inicialmente presente en la masa. "Js, • ( 4*&

21.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 20, caracterizado además porque se hidroliza por lo menos el 25% de PC inicialmente presente en la masa.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la enzima se caracteriza porque la relación entre la capacidad de la enzima de hidrolizar triglicéridos y la capacidad de hidrolizar glicolípidos puede describirse como una curva con una pendiente que es por lo menos 1.0.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la enzima se caracteriza porque la relación entre la capacidad de la enzima de hidrolizar triglicéridos y la capacidad de hidrolizar fosfolípidos puede describirse como una curva con una pendiente que es por lo menos 0.1.

24.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el lípido no polar es un triglicérido que comprende ácido graso de C4 a C10 y un triglicérido que comprende ácido graso de C?2 a C20, y porque la enzima hidrotiza de preferencia dicho triglicérido que comprende un ácido graso de C?2 a C2o en comparación con un triglicérido que comprende un ácido graso de C4 a C10. *?^iltM^. UM!??^i ^^au?iáa£??tÁ

25.- Un método para preparar una masa, caracterizado porque dicho método comprende la adición a los componentes de la masa de una enzima que, bajo condiciones de masa, es capaz de hidrolizar un triglicérido que comprende un ácido graso de C4 a Cío, un triglicérido que comprende un ácido graso de C?2 a C2o, un glicolípido y un fosfolípido, y la cual hidrotiza, de preferencia, dicho triglicérido que comprende un ácido graso de C?2 a C2o en comparación con un triglicérido que comprende un ácido graso de C4 a C10, y la mezcla de los componentes de la masa para obtener la masa.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho glicolípido es digalactosil diglicérido.

27.- Un método para preparar una masa o un producto horneado preparado a partir de una masa, caracterizado porque comprende: a) la prueba de por lo menos una enzima por su actividad hidrolítica hacia un ácido graso de C4 a Cío en un triglicérido, un ácido graso de C?2 a C2o en un triglicérido, digalactosil diglicérido y un fosfolípido, b) la selección de una enzima con actividad hidrolítica hacia digalactosil diglicérido y el fosfolípido, y con mayor actividad hacia el ácido graso de C?2 a C2o en comparación con un ácido grasos de C4 a C-io y c) la adición de la enzima seleccionada a la masa.

28.- Una composición para mejorar la masa, caracterizada porque comprende una enzima que, bajo condiciones de masa, es capaz de hidrolizar un lípido no polar, un glicolípido y un fosfolípido y, opcionalmente, por lo menos un componente adicional de la masa.

29.- Una composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que comprende una lipasa, una enzima degradante de almidón, una hemicelulasa, una celulasa y una oxidoreductasa.

30.- Una composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el componente adicional de la masa se selecciona del grupo que comprende una harina de cereal, levadura, un agente de fermentación química, un agente para fortalecer la masa, un emulsificante, un azúcar, un acilglicerol, un fosfolípido, un glicolípido y una sal.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la enzima de añade en una composición de conformidad con cualquiera de los párrafos 28-30.

32.- Una masa obtenida mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-27 y 31.

33.- La masa de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque se congela o se empaca en una atmósfera controlada.

34.- Un producto horneado que se obtiene al hornear la masa del párrafo 32.

35.- Un producto de fideo preparado a partir de la masa del párrafo 32.

36.- Un producto de pata preparado a partir de la masa del párrafo 32.