MXPA01010302A

MXPA01010302A - Polipeptidos derivados de endostatina que presenta actividad antiangiogenica.

Info

Publication number: MXPA01010302A
Application number: MXPA01010302A
Authority: MX
Inventors: Francesco Chillemi
Original assignee: Univ Degli Studi Milano
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2002-09-18
Also published as: CA2369961A1; US6921749B1; WO2000063249A1; JP2002544124A; IT1312077B1; EP1169351A1; AU4547300A; ITMI990777A1

Abstract

Los polipeptidos con secuencia correspondiente u homologa a la endostatina que tienen una actividad de inhibicion en angiogenesis, son utiles en el tratamiento de tumores que dependen de angiogenesis.

Description

POLIPEPTIDOS DERIVADOS DE ENDOSTATINA QUE PRESENTA ACTIVIDAD ANTIANGIOGENICA La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad antiangiogénica.

ANTECEDENTES TECNOLÓGICOS La angiogénesis, el resultado de nuevos capilares a partir de vasos pre-existentes es esencial para las condiciones fisiológicas y patológicas que incluyen crecimiento de tumores y metástasis (1-3). La angiogénesis es un proceso complejo de pasos múltiples que incluye la proliferación, emigración y diferenciación de células endoteliales, degradación de la matriz extracelular, formación de microtúbulos y brote de nuevas ramas capilares (3,4). La endostatina es un fragmento C-terminal de 22 KDa de colágeno XVIII que inhibe de manera específica la proliferación endotelial in vitro e inhibe potencialmente la angiogénesis y el crecimiento de tumores in vivo (5). La administración sistémica de proteína precipitada no replegada expresada en E. coli provocó regresión de crecimiento de tumores experimentales en ratones (5,6). Se informó que la endostatina de longitud completa humana producida por el sistema de expresión de E. coli tiene la capacidad de bloquear el factor-2 de crecimiento de fibroblastos (FGF-2), y el r de crecimiento endotelial vascular (VEGF) indujo proliferación y emigración de células endoteliales microvasculares (7). La producción de una gran cantidad de endostatina puede ser difícil. De esta manera, la disponibilidad de una molécula más pequeña con 5 homología de secuencia con la endostatina que posee actividad biológica puede ser útil. La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden de diez a sesenta residuos de aminoácidos con una secuencia correspondiente u homologa a la de endostatina, que tiene actividad de 10 inhibición de angiogénesis, útil para el tratamiento de tumores que dependen de la angiogénesis. La presente invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de dichos polipéptidos. La invención también se refiere a formulaciones farmacéuticas 15 que contienen uno o más de dichos polipéptidos. La endostatina es una proteína que tiene actividad antiangiogénica, aislada por J. Folkman y M. O'Reilly (EP 0 857210). Los ejemplos de los polipéptidos preparados de conformidad con la invención son los siguientes. 20 (I) nonatriacontapéptido: His-Thr-His-GIn-Asp-Phe-GIn-Pro-Val- Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Thr-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-lle-Arg- Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-(tBu)-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala (") pentacontapéptido: Val-Gly-Leu-Ser-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala- Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-GIn-Asp-Leu-Tyr-Ser-lle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg- Gly-Ser-Val-Pro-lle-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Trp-Asp- Ser-Leu-Phe-Ser-Gly 5 (lll) pentatetracontapéptido: Ser-Gln-Gly-Gln-Val-Gln-Pro-Gly- Ala-Arg-lle-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Arg-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Ala-Trp-Pro- Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Ser-Gly-Arg-Arg-Leu-Met-Glu-Ser- Tyr (IV) pentacontapéptido: Cys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Thr-Thr- 10 Gly-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Ser-Gly-Arg-Leu-Leu-Glu-Gln-Lys- Ala-Ala-Ser-Cys-His-Asn-Ser-Tyr-lle-Val-Leu-Cys (tBu)-lle-Glu-Asn-Ser-Phe- Met-Thr-Ser-Phe-Ser-Lys. Estos polipéptidos tienen una actividad antiangiogénica notable en la prueba de inhibición in vitro en la proliferación y emigración de células 15 endoteliales (16). De manera más particular, el nonatriacontapéptido I resultó ser equipotencial a la endostatina. El procedimiento para la preparación de los polipéptidos de la invención se basa en los métodos y reacciones generales siguientes que se emplean en la síntesis de péptidos. 20 Los grupos amino de los aminoácidos pueden protegerse mediante el uso de los grupos 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), ter- butoxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z), tritilo (Trt) y otros grupos utilizados por lo común en la química de péptidos. • -' "8P El grupo carboxílico puede protegerse mediante el éster terbutílico, éster bencílico, éster p-metoxibencílico y otros utilizados convencionalmente para dichos propósitos. Estos grupos protectores, como se ilustrará con detalle en los 5 ejemplos, pueden eliminarse de conformidad con los procedimientos conocidos en la literatura, tales como mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético, ácido hidrofluórico anhidro, piperidina y similares, según las circunstancias. Los aminoácidos pueden condensarse utilizando esteres activos, 10 tales como éster pentafluorofenílico (OPfp), éster de 3-hidroxi-4-oxo-3,4- dihidro-1 ,2,3-benzotriazolina (ODhbT), o carboxi-activadores, tales como hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBop), tetrafluoroborato 2-(1 H-benzotriazol-1-il-1 ,1 ,3,3-tetrametil)-uronio (TBTU) y los otros activadores utilizados convencionalmente para este tipo de reacciones. 15 La purificación de los polipéptidos descritos en esta invención también puede llevarse a cabo de conformidad con técnicas conocidas de química de proteínas, tales como HPLC de fase inversa, filtración de gel, cromatografía por intercambio de iones y electroforesis de preparación. Por ejemplo, el procedimiento de la presente invención puede 20 efectuarse de la manera siguiente, utilizando la síntesis de péptidos de fase sólida y el sintetizador automático Biolynx plus, mod. 4170 por Novabiochem (Nottingham, Gran Bretaña) (17).

La protección de los grupos a-amino en los aminoácidos se realiza mediante el uso de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Los grupos funcionales de las cadenas laterales de aminoácidos se protegen utilizando los siguientes grupos protectores: ter-butilo para ácido aspártico, ácido 5 glutámico, serina, treonina y tirosina; ter-butoxicarbonilo para lisina y triptofán; tritilo para histidina; 2,2,4,6,7-pentametil-dihidro-benzofuran-5-sulfonilo para arginina; ter-butilo para cisteína de polipéptido I y para la tercera cisteína de polipéptido IV; tritilo para las otras dos cisteínas del polipéptido IV. La síntesis se realiza gradualmente comenzando a partir del 10 aminoácido C terminal de Fmoc, unido a una resina mediante un enlace de éster, que consiste en óxido de polietileno injertado a una matriz de poliestireno y funcionalizado mediante un residuo de ácido 4-hidroximetil- fenoxiacético (18). Fmoc se elimina utilizando una solución de piperidina en dimetilformamida (DMF). Los esteres pentafluorofenílicos de Fmoc- 15 aminoácidos en general se utilizan para las reacciones de condensación. En el caso de serina y treonina se prefirió el uso de esteres de ODhbt, mientras que en el caso de arginina e histidina, el grupo carboxílico fue activado por PyBop en presencia de diisopropiletilamina, con tiempos de reacción de tres horas. Para optimizar los productos de reacción se utiliza un exceso de Fmoc- 20 aminoácido cinco equivalente. Los tiempos de desprotección y reacciones de condensación se determinan automáticamente con el sintetizador. El técnico seleccionará los tiempos de acilación únicamente en el caso de activación con PyBop.

El péptido es cortado de la resina, retirando al mismo tiempo todos los grupos protectores mediante acidólisis con ácido trifluoroacético en presencia de 5% anisol y 1 % etanoditiol. Los polipéptidos crudos resultantes se purifican mediante HPLC, de semipreparación de fase inversa, utilizando una columna (250 x 10 mm) llena con Source TM 15 RPC (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Los polipéptidos son eluidos con un gradiente lineal de 0% a 60% de acetonitrilo en 0.1% de TFA acuoso, a una velocidad de flujo de 5 ml/min con detección a 226 nm, se cargan 10-15 mg de producto para cada operación. 10 Las fracciones principales se recogen y se secan por congelamiento. Los polipéptidos purificados se caracterizan por análisis de aminoácidos y espectrometría de masas de electrodispersión con un aparato Finningan Mat mod. LCQ. 15 La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de la invención o una sal no tóxica de los mismos en mezcla con un diluyente o vehículo adecuado. Los siguientes ejemplos también ilustran la invención sin limitarla. * -* w - EJEMPLO 1 Resina His(Trt)-Thr (tBu)-His-(Trt)-Gln-Asp OtBu)-Phe-Gln-Pro-Val-Leu- His (TrT)-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Thr (tBU)-Pro-Leu-Ser ftBu)-Glv-Glv-Met- Arq (Pbfl-Glv-lle-Arq (Pbfl-Glv-Ala-Asp (OtBu)-Phe-Gln-Cvs (tBu)-Phe- Gln-Gln-Ala-Arq (Pbfi-Ala 500 mg (0.1 mmol) de resina Fmoc-Ala se suspendieron en 20 ml de DMF y después de 2 horas se cargaron en la columna de reacción. La resina de Fmoc-aminoácidos entonces se sometió a los siguientes tratamientos: a) lavados con DMF; b) eliminación de Fmoc por tratamiento con una solución de 20% piperidina en DMF; c) lavados con DMF; d) condensación con el éster activo de Fmoc-aminoácido adecuado (5 equivalentes) en presencia de N-hidroxi-benzotriazol (5 equivalentes) como catalizador, con la adición de un colorante aniónico (Novachrome, Calbiochem-Novabiochem AG, Laufelfingen, Suiza) para monitorear automáticamente el tiempo de reacción. El carboxilo se activó utilizando PyBop, sin adición decolorante, sólo en el caso de Fmoc-Arg (Pbf) y Fmoc-His (Trt). Este ciclo de operaciones se repitió treinta y ocho veces con el Fmoc-animoácido adecuado para obtener por último resina- nonatriacontapéptido protegido. El producto entonces se colocó en un embudo de vidrio sinterizado y se lavó después con DMF, alcohol ter-amílico, ácido acético, ácido ter-amílico, cloruro de metileno y éter etílico. Después de secar bajo vacío se obtuvieron 760 mg de resina-nonatriacontapéptido protegido.

EJEMPLO 2 5 His-Thr-His-Gln-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Thr- Pro-Leu-Ser-GIv-GIv-Met-Arq-GIv-lle-Arq-GIv-Ala-Asp-Phe-GIn-Cvs (tBu - Phe-GIn-GIn-Ala-Ar -Ala (nonatriacontapéptido I). 760 mg de resina-nonatriacontapéptido protegido se 10 suspendieron en 141 ml de TFA y se agregaron con 7.5 ml de anisol y 1.5 ml de etanoditiol y la mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas con agitación ocasional. Después de la filtración bajo vacío, la resina se lavó con TFA (2 x 50 ml). El filtrado se agregó con éter etílico seco para precipitar el polipéptido. El producto se filtró, se lavó repetidas veces con éter etílico seco y por último 15 se secó bajo vacío sobre KOH. Nonatriacontapéptido I se purificó mediante HPLC de semiseparación como se describió con anterioridad para obtener 195 mg de nonatriacontapéptido puro. [a] - 3.0°(c = 0.5, agua). 20 Espectro de masa: pico molecular (M+1 ) = 4376 Da. Análisis de aminoácidos: Asp = 3.1 (3); Thr = 1.98 (2); Ser = 0.99 (1 ); Glu = 5.2(5); Pro = 1.8 (2); Gly = 3.95(4); Ala = 3.98(4); Cys = 1.1 (1 ); Val 'XiX Ar ^; Afe , ^j- = 1.97(2); Met = 0.96(1 ); lie = 1.2(2); Leu = 4.2(4); Phe = 2.98(3); His = 3.1(3); Arg = 2.96(3).

EJEMPLO 3 Resina Val-GIv-Leu-Ser (tBu)-Glv-Thr (tBu)-Phe-Arq (Pbfl-Ala-Phe-Leu- Ser (tBu)-Ser(tBu)-Arq ÍPbfi-Leu-GIn-Asp (OtBu)-Leu-Tyr (tBu)-Ser (tBu)- lle-Val-Ar (Pbfl-Arq (Pbfl-Ala-Asp (OtBu)-Arq (Pbf)-Glv-Ser (tBu)-Val- Pro-lle-Val-Asn-Leu-Lvs (Boc)-Asp (OtBu)-Glu (OtBu)-Val-Leu-Ser (tBu)- Pro-Ser (tBu)-Trp (Boc) -Asp (OtBu)-Ser (tBu)-Leu-Phe-Ser (tBu)-Glv 10 770 mg (0.1 mmol) de resina Fmoc-Gly se suspendieron en 30 ml de DMF y después de dos horas se cargaron en la columna de reacción. Las operaciones descritas en el ejemplo 1 se repitieron entonces durante 49 veces utilizando el Fmoc-aminoácido adecuado en cada operación. 15 En esta síntesis también, los grupos carboxílicos Fmoc-Arg(Pbf) y Fmoc-Hís(Trt) se activaron con PyBop, aquéllos de Fmoc-Ser(tBu) y Fmoc- Thr(tBu) con éster Dhbt, mientras que para el resto de Fmoc-aminoácidos se utilizó el éster de Pfp. Después de ensamblar todos los aminoácidos, el " producto se lavó como se describió en el ejemplo 1 y se secó bajo vacío. Se 20 obtuvieron 1200 mg de resina-pentacontapéptido protegido.

**££? . EJEMPLO 4 Val-Glv-Leu-Ser-Glv-Thr-Phe*Arq-Ala'Phe-Leu-Ser-Ser-Arq-Leu-Gln-Asp- Leu-Tyr-Ser-lle-Val-Arq-Arq-Ala-Asp-Arq-GIv-Ser-Val-Pro-lle-Val-Asn-Leu- Lvs-Asp-Gíu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Trp-Asp-Ser-Leu-Phe-Ser-Glv 5 (pentacontapéptido II) 1200 mg de resina-pentacontapéptido protegido se trataron con 188 ml de TFA, 10 ml de anisol y 2 ml de etanoditiol. Entonces se siguió el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Se obtuvieron 140 mg de 10 pentacontapéptido puro. [a] -12.5° (c=0.04, agua). Espectro de masa: pico molecular (M+1) = 5514 Da. Análisis de aminoácidos: Asp = 4.89 (5); Thr = 1.02 (1 ); Ser = 8.91 (9); Glu = 1.97 (2); Pro = 2.1 (2); Gly = 3.91 (4); Ala = 1.97 (2); Val = 4.88 15 (5); lie = 2.0 (2); Leu = 6.87 (7); Tyr = 1.11 (1 ); Phe = 3.2 (3); Lys = 0.97 (1 ); Arg = 4.88 (5); Trp = 0.96 (1).

•*» ' EJEMPLO 5 Resina Ser (tBu)-Gln-Glv-Gln-Val-Gln-Pro-Glv-Ala-Arq-(Pbf)-lle-Phe-Ser * (tBu)-Phe-Asp-(OtBu)-Glv-Arq (Pbf)-Asp-(OtBu)-Val-Leu-Arq (Pbf)-His- (Trt)-Pro-Ala-Trp (Boc)-Pro-Gln-Lvs (Boc)-Ser (tBu)-Val-Trp (Boc)-His- (Trt)-Glv-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Pro-Ser (tBu)-Glv-Arq (Pbf)-Arq (Pbf)-Leu- Met-Glu (OtBu)-Ser (tBu)-Tyr (tBu) 555 mg (0.1 mmol) de resina Fmoc-Tyr (tBu) se suspendieron en 25 ml de DMF y después de dos horas se cargaron en la columna de reacción. Entonces, el ciclo de operaciones descrito en el ejemplo 1 se repitió cuarenta y cuatro veces utilizando el Fmoc-aminoácido activado de manera adecuada en cada operación, en el orden indicado en la secuencia reportada con anterioridad. El resina-pentatetracontapéptido protegido así preparado se lavó con los solventes usuales (véase ejemplo 1 ) y se secó bajo vacío. Rendimiento: 808 mg. & t< EJEMPLO 6 Ser-Gln-Glv-Gln>Val-Gln-Pr ^ -Ala-Arq-lle-Phe-Ser-Phe-Asp-Glv-Arq- Asp-Val-Leu-Arq'His-Pro-Ala-Trp-Pro-GIn-Lvs-Ser-Val-Trp-His-GIv-Ser- Asp-Pro-Ser-Gly-Arq-Arq-Leu-Met-Glu-Ser-Tyr 5 (pentatetracontapéptido III) 888 mg de resina-pentatetracontapéptido protegido se suspendieron en 141 ml de TFA agregado con anterioridad con 7.5 ml de anisol y 1.5 ml de etanoditiol. Entonces se siguió el procedimiento descrito en 10 el ejemplo 2 para obtener 98 mg de pentatetracontapéptido lll puro. [a] -60.5° (c=0.06, agua). Espectro de masa: pico molecular (M+1 ) = 5125 Da. Análisis de aminoácidos: Asp = 3.04 (3); Ser = 5.88 (6); Glu =4.91 (5); Pro = 3.93 (4); Gly = 5.05 (5); Ala = 2.07 (2); Val = 2.89 (3); Met = 15 0.91 (1 ); lie = 0.95 (1 ); Leu = 1.93 (2); Tyr = 0.93 (1 ); Phe = 2.11 (2); Lys = 0.97 (1 ); His = 1.89 (2); Arg = 4.84 (5); Trp = 2.03 (2).

EJEMPLO 7 Resina Cvs (Trt)-Glu (OtBu)-Thr (tBu)-Trp (Boc)-Arq (Pbf)-Thr (tBu)-Glu (OtBu)-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Glv-Ala-Thr (tBu)-Glv-Gln-Ala-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Leu-Leu-Ser (tBu)-Glv-Arq (Pbf)-Leu-Leu-Glu (OtBu)-Gln-Lvs (Boc)- 5 Ala-Ala-Ser (tBu)-Cvs (Trt)-His (Trt)-Asn-Ser (tBu)-Tyr (tBu)-lle-Val-Leu- Cvs (tBu)-lle-Glu (OtBu)-Asn-Ser (tBu)-Phe-Met-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Phe- Ser (tBu)-Lvs (Boc) 770 mg (0.1 mmol) de resina Fmoc-Lys (Boc) se suspendieron 10 en 30 ml de DMF y después de 2 horas se cargaron en la columna de reacción. El resto de los Fmoc-aminoácidos se ensamblaron en el orden indicado en la secuencia reportada con anterioridad utilizando para cada uno el ciclo de operación reportado en el ejemplo 1. Se obtuvieron 1340 mg de resina-pentracontapéptido protegido. 15 EJEMPLO 8 Cvs-Glu-Thr-Trp-Arq-Thr-Glu-Thr-Thr-Glv-Ala-Thr-Glv-Gln-Ala-Ser-Ser- Leu-Leu-Ser-GIv-Arg-Leu-Leu-Glu-GIn-Lys-Ala-Ala-Ser-Cys-His-Asn-Ser- Tyr-lle-Val-Leu-Cvs (tBu)-lle-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ser-Phe-Ser-Lvs 20 (pentacontapéptido IV) 1340 mg de resina-pentacontapéptido protegido se trataron con una mezcla de 188 ml de TFA, 10 ml de anisol y 2 ml de etanoditiol. Entonces, %A *w' & frJtiOiSi .it* &> a a . ?.. ...sj l ciclo de operaciones descrito en el ejemplo 2 se repitió para obtener 342 mg de pentacontapéptido IV. Se disolvieron 335 mg de dicho péptido en 300 ml de 75% metanol y luego se añadieron gota a gota y bajo agitación con una solución de 25 mg de yodo en 80 ml de 75% metanol. Después de hacer reaccionar la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente se agregó una solución de 10% ácido ascórbico hasta finalizar la decoloración de yodo. El metanol se evaporó muy bien bajo vacío y la solución acuosa restante se secó por congelamiento. El péptido crudo resultante se purificó por último mediante HPLC de semiseparación en las condiciones descritas con anterioridad. Se obtuvieron 67 mg de pentacontapéptido puro. [a] -14.5° (c=0.2, ácido acético 80%). Espectro de masa: pico molecular (M+1 ) = 5502 Da. Análisis de aminoácidos: Asp = 2.03 (2); Thr = 5.87 (6); Ser = 7.79 (8); Glu = 6.03 (6); Gly = 2.87 (3); Ala = 4.04 (4); Cys = 2.86 (3); Val = 0.97 (1 ); Met = 0.89 (1 ); lie = 2.11 (2); Leu = 4.92 (5); Tyr = 1.05 (1 ); Phe = 2.11 (2); Lys = 1.93 (2); His = 1.04 (1 ); Arg = 1.87 (2); Trp = 0.93 (1 ). La actividad biológica de los polipéptidos de la invención se ¡lustra en la siguiente sección experimental. .. &aartfeihaiÉiÉyflfcfcfaM»--» --**- ?~ -•- ea¿?»«< ENSAYOS FARMACOLÓGICOS Líneas celulares y condiciones de cultivo Las células endoteliales venulares de coronaria (CVEC) se 5 aislaron y cultivaron como se describió con anterioridad (8). Las células 22106 endoteliales aórticas de ratón BALB/c (MAE) se hicieron crecer como se describió con anterioridad (9). Las células de músculo liso aórticas bovinas (BASM) se aislaron e hicieron crecer como se describió con anterioridad (10). 10 Las células NIH-3T3 y A-431 de fibroblasto se obtuvieron a partir de recolección de cultivo tipo americano (Rockville, MD) y se hicieron crecer de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Citotoxicidad 15 El efecto citotóxico de péptidos se estudió mediante exclusión de azul tripán (11).

Ensayo de emigración La emigración celular se evaluó en cámaras de microquimiotaxis 20 de 48 cavidades (NeuroProbe, Biomap, Milán, Italia) en un filtro de policarbonato como se describió con anterioridad (12, 13).

Cimoqrafía de gelatina Los medios acondicionados de células expuestas durante 24 horas a los compuestos de prueba fueron sometidos a electroforesis en SDS- PAGE conteniendo 1 mg/ml de gelatina, como ya se describió (14). La actividad de la gelatinasa se valuó por densitometría cuantitativa de las bandas.

Estudios de proliferación La proliferación celular se cuantificó por número total de células, según se reporta (12, 13).

Brote vascular in vitro El brote vascular de anillos de aorta de ratón se evaluó en preparaciones de geles de fibrina tridimensionales de conformidad con el método descrito por Brown et al (15), con modificaciones menores. La evaluación cuantitativa de estructuras recién formadas se llevó a cabo en el día 3. El área cubierta por brotes vasculares se cuantificó en unidades microscópicas (0.21 mm2).

Angioqénesis in vivo: ensayo de córnea de conejo La angiogénesis se estudio en la córnea de conejos albinos, según se describió con anterioridad (11 , 12, 13).

». £ RESULT IS Efectos citotóxicos en células cultivadas Se utilizaron líneas celulares endoteliales y no endoteliales, y entre estas últimas, líneas celulares de tumores y de estroma no neoplásicas. Para evaluar la citotoxicidad todas las suspensiones celulares se expusieron durante 30 minutos a 37°C a 10 y 300 ng/ml de los péptidos. No se detectó ningún incremento importante de muerte celular con la prueba de exclusión con azul tripán. 10 Efecto en la emigración de células endoteliales La emigración celular se evaluó en cámaras de microquimiotaxis de 48 cavidades. Todos los péptidos inhibieron la emigración inducida por FGF-2 y VEGF y presentaron diferente potencia de acuerdo con la 15 concentración. Un ejemplo del efecto inhibidor ejercido por los fragmentos en la concentración de 10 ng/ml aparece en la figura 1A-B. De manera sorprendente, los péptidos de endostatina podrían inducir emigración de células endoteliales en células no estimuladas. 20 Efecto en actividad de metaloproteasas No se detectó ninguna modificación de actividad de metaloproteasas básales y estimuladas por cimografía de gelatina en el medio acondicionado de células endoteliales tratadas con los péptidos de endostatina.

Efecto en la proliferación celular 5 La proliferación celular se cuantificó por conteo de número total de células después de 48 horas de tratamiento. Las células endoteliales aisladas a partir de vénulas postcapilares se utilizaron para probar el efecto en angiogénesis. Los fragmentos de endostatina no inhibieron la proliferación cuando se sometieron a prueba en una concentración entre 1 y 1000 ng/ml, 10 mientras que los fragmentos finales pudieron inhibir el crecimiento celular inducido por FGF-2 y VEGF al someterse a prueba en concentraciones que varían entre 10 y 1000 ng/ml. El efecto resultó más pronunciado en crecimiento inducido por FGF-2. De manera interesante, el fragmento IV fue el más potente en la inhibición de proliferación de células endoteliales (figura 1C- 15 D). Se obtuvieron efectos similares en las líneas de células endoteliales probadas (figura 1E). La selectividad de los péptidos para endotelio se evaluó en líneas celulares no endoteliales de origen vascular y no vascular y en células de tumores a partir de diversas fuentes (murino y humano). Las células no 20 endoteliales no se vieron afectadas por los péptidos de endostatina (figura 2).

Efectos en angiogénesis in vitro La formación de estructuras similares a capilares en anillos vasculares cultivados en geles de fibrina 3D se utilizaron para probar la angiogénesis in vitro. Los fragmentos I y IV inhibieron el crecimiento espontáneo de capilares y el inducido por FGF-2 y VEGF. Como un ejemplo aparece el efecto de concentración a 100 ng/ml de cualquier fragmento (figura 3A).

Efecto en angiogénesis in vivo El efecto angiostático de fragmentos de endostatina in vivo se evaluó en el ensayo de córnea de conejo avascular. VEGF indujo una neovascularización eficiente y persistente del estroma de la córnea. Cuando VEGF se sometió a prueba en presencia de fragmentos de endostatina se produjo una inhibición consistente de angiogénesis. En la figura 3B aparece un ejemplo del efecto ejercido por fragmentos I y IV a 200 ng/pella. Al someterse a prueba como agentes sencillos, los péptidos no presentaron propiedades pro-inflamatorias graves.

Comparación con endostatina de longitud completa recombinante El efecto de fragmentos de endostatina se comparó con endostatina de longitud completa humana recombinante producida por Dr. M. Rehn (La Jolla Cáncer Research Center, La Jolla, USA).

De manera sorprendente, los péptidos de endostatina resultaron más eficientes que la endostatina de longitud completa en la inhibición de angiogénesis inducida por VEGF (figura 3B).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : efectos de fragmentos de endostatina en emigración (A, B) y proliferación (C-E) de células endoteliales. A, B: Se agregaron fragmentos (10 ng/ml) junto con los factores angiogénicos (20 ng/ml cada uno) en los compartimentos inferiores de la cámara de microquimiotaxis NeuroProbe. La ¡ncubación se realizó durante 4 horas y las células emigradas se contaron microscópicamente de manera ciega. Los datos se expresan como número total de células conteo/cavidad. Los números son media ± SEM de 6 experimentos realizados por triplicado. C-E: Efectos de fragmentos de endostatina en proliferación de células endoteliales. La proliferación de células endoteliales (C, D: CVEC; E, MAE) se estimuló con FGF-2 y VEGF (20 ng/ml cada uno). Los datos se expresaron como número de células contadas/cavidad después de 48 horas de incubación con sustancias de prueba. Los números son media ± SEM de 6 y 2 experimentos realizados por triplicado para CVEC y MAE, respectivamente. *P<0.05 contra FGF-2 y VEGF solos. (Prueba t de Student) Figura 2: Efecto de fragmentos de endostatina en líneas de células endoteliales. La proliferación de células de músculo liso aórticas bovinas (BASM, panel superior), fibroblastos de murino (NIH-3T3, panel intermedio) y células de tumores (A431 , panel inferior) se evaluó como se describió en la figura 2. El crecimiento celular se estimuló con 5% FCS. Los fragmentos se evaluaron en la concentración de 300 ng/ml. Los números son media ± SEM de 2 experimentos realizados por triplicado. Figura 3: Efecto de fragmentos de endostatina en angiogénesis in vitro (A) e in vivo (B). A. Brote de vasos in vitro a partir de anillo de aortas de ratón se indujo por FGF-2 (10 ng/ml). Los fragmentos I y IV se utilizaron a 100 µg/ml. Los datos se reportaron como área promedio ocupada por estructuras similares a túbulos después de tres días a partir de estimulación. Los números son la media de un experimento representativo de dos operaciones realizadas por triplicado. B. Efecto de fragmentos de endostatina en angiogénesis in vivo en el modelo de córnea de conejo avascular. Los fragmentos de endostatina (200 ng) o endostatina de longitud completa (3 ug) se incorporaron en la misma preparación de pellas junto con VEGF (200 ng). La actividad angiogénica se comparó con VEGF solo. Los datos se reportaron como puntuación angiogénica durante tiempo (días) y son las medias de 5 implantes.

Conclusiones Los péptidos estudiados ejercieron un efecto antiangiogénico potente y directo in vitro e in vivo. Los péptidos actúan por inhibición selectiva de crecimiento y emigración de células endoteliales que se inducen por factores angiogénicos. Los péptidos de endostatina resultaron más eficientes que la endostatina de longitud completa en la inhibición de angiogénesis in vivo.

REFERENCIAS 1.- Folkman J. Angiogenesis in Cáncer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine 1995; 1 : 27-31. 5 2.- Hanahan D y Folkman J. Patterns and emerging mechanism of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 1996; 86: 353-364. 3.- Folkman J. Clinical applications of research on angiogenesis. N. Engl J Med 1995; 333: 1757-1763.2. 4.- Risau W. Mechanism of angiogenesis. Nature 1997; 386: 671- 10 674. 5.- O'Really MS et al. Endotastin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997; 88: 277-285. 6.- Boehm T, et al. Anti angiogenic therapy of experimental cáncer does not induce acquired drug resistance. Natura 1997; 390: 404-407. 15 7.- Taddei L, et al. Inhibitory effect of full-length human endostatin on in vitro angiogenesis. Biochem Biophys Res Commun 1999; 263:340-345. 8.- Schelling ME, et al. Venular endothelial cells from bovine heart. Am J. Physiol 1998, 254, H1211-H1217. 20 9.- Gualandris A, et al. Basic fibroblast growth factor overexpression in mouse endothelial cells: an autocrine model of angiogenesis and angioproliferative diseases. Cell Growth differ, 1996, 7: 147-160. 10.- Catalioto RM, et al. Roel of calcium in angiotensin ll-induced prostaglandin reléase and DNA synthesis in rat vascular smooth muscle cells. J. cardiovascular Pahramcol. 1996, 27: 195-200. 11.- Presta M, et al. Purine analog 6-methylmercaptopurine ribose inhibits early and late phases of the angiogenesis process. Cáncer Res. 1999, 59 (10): 2417-2424. 12.- Ziche M, et al. Nitric oxide mediates angiogenesis in vivo and endothelial cell growth and migration in vitro promoted by substance P. J. Clin Inves 1994; 94, 2036-2044. 13.- Ziche M, et al. Nitric oxide-synthase lies downstream of vascular endothelial growth factor but not basic fibroblast growth factor induced angiogenesis. J. Clin. Invest. 1997; 99, 2625-2634. 14.- Qian X, et al. Thrombospondin-1 modulates angiogenesis in vitro by up-regulation of matrix metalloproteinase-9 in endothelial cells. Exp Cell Res 1997, 235, 403-412. 15.- Brown KJ, et al. A novel ¡n vitro assay for human angiogenesis, Lab. Invest. 1996, 75 (4): 539-555. 16.- J. Folkman, O. C. Haudenschild y B. R. Zetter, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76, 5217, 1979. M. Ziche, L. Morbidelli, S. Donnini y F. Ledda, J. Cardiovas. Pharmacol., 26 (Suppl. 3), S284, 1995. 17.- A. Dryland y R. C. Sheppard, J. Chem. Soc, Perkin 1 , 125, 1986. 18.- E. Bayer, Angew. Chem., 103, 117, 1991.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI MILANO UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI FIRENZE <120> POLIPEPTIDOS CON ACTIVIDAD ANTIANGIOGENICA <130> UNIVERSITA' <140> <141> <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> () ..) <223> T-BUTILO <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: polipéptidos homólogos a endostatina <220> <221> M0D_RES <222> (33) <223> T-BUTILO <400> 1 His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 1 5 10 15 Thr Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe Gln 20 25 30 Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala 35 <210> 2 <211> 50 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: polipéptidos homólogos a endostatma <400> 2 Val Gly Leu Ser Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln 1 5 10 15 Asp Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg Ala Asp Arg Gly Ser Val Pro lie 20 25 30 Val Asn Leu Lys Asp Glu Val Leu Ser Pro Ser Trp Asp Ser Leu Phe 35 40 45 Ser Gly 50 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: polipéptidos homólogos a endostatina <400> 3 Ser Gln Gly Gln Val Gln Pro Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe Asp Gly 1 5 10 15 Arg Asp Val Leu Arg His Pro Ala Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His 20 25 30 Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg Arg Leu Met Glu Ser Tyr 35 40 45 <210> 4 <211> 50 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <221> M0D_RES <222> (39) <223> T-BUTILO <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: polipéptidos homólogos a endostatina <220> <221> DISULFURO <222> (1) .. (31) <223> enlace disulfuro intramolecular <400> 4 Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gln Ala Ser 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ser Gly Arg Leu Leu Glu Gln Lys Ala Ala Ser Cys His 20 25 30 Asn Ser Tyr lie Val Leu Cys lie Glu Asn Ser Phe Met Thr Ser Phe 35 40 45 Ser Lys 50

Claims

» NOVEDAD DE LA INVENCIÓN **„
REIVINDICACIONES 5 1.- Poliéptidos que comprenden diez a sesenta aminoácidos con una secuencia correspondiente u homologa a la de endostatina, caracterizados porque tienen actividad antiangiogénica. 2.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es nonatriacontapéptido I, con secuencia His- 10 Thr-His-Gln-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Thr-Pro-Leu- Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-lle-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-(tBu)-Phe-Gln-Gln- Ala-Arg-Ala.
3.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es pentacontapéptido II, con secuencia Val-Gly- 15 Leu-Ser-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser- lle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Gly-Ser-Val-Pro-lle-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Val- Leu-Ser-Pro-Ser-Trp-Asp-Ser-Leu-Phe-Ser-Gly.
4.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es pentatetracontapéptido lll, con secuencia 20 Ser-Gln-Gly-GIn-Val-GIn-Pro-Gly-Ala-Arg-lle-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Arg-Asp- Val-Leu-Arg-His-Pro-Ala-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro- Ser-Gly-Arg-Arg-Leu-Met-Glu-Ser-Tyr.
5.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es pentacontapéptido IV^ con secuencia Cys- Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Thr-Thr-Gly-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu- Ser-Gly-Arg-Leu-Leu-Glu-GIn-Lys-Ala-Ala-Ser-Cys-His-Asn-Ser-Tyr-lle-Val- 5 Leu-Cys (tBu)-lle-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ser-Phe-Ser-Lys.
6.- Un procedimiento para la preparación de los polipéptidos como se reclaman en las reivindicaciones 1-5 mediante síntesis de fase sólida.
7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, 10 caracterizado además porque se utiliza un sintetizador automático.
8.- Formulaciones farmacéuticas con actividad antiangiogénica, caracterizadas porque consisten en uno o más polipéptidos como se reclaman en las reivindicaciones 1-5.
9.- Las formulaciones farmacéuticas con actividad 15 antiangiogénica que contienen como el ingrediente activo uno o más polipéptidos como se reclaman en las reivindicaciones 1-5, opcionalmente en combinación con otros principios activos.
10.- El uso de los polipéptidos como se reclaman en las reivindicaciones 1-5 para la preparación de medicamentos con actividad 20 antiangiogénica.