MXPA01009773A

MXPA01009773A - Metodo para la amplificacion de alelos hla de clase i.

Info

Publication number: MXPA01009773A
Application number: MXPA01009773A
Authority: MX
Inventors: Canck Ilse De
Original assignee: Innogenetics Nv
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-05
Publication date: 2002-05-14
Also published as: AU3558900A; EP2319942B1; WO2000061795A2; EP2314715A2; ES2351686T3; EP2319942A3; US20020197613A1; EP2314715B1; EP1173610A2; ES2430418T3; ES2430420T3; EP1173610B1; DE60044867D1; EP2314715A3; ATE478961T1; WO2000061795A3; EP2319942A2; CA2365924A1

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo y a los cebadores especificos para la amplificacion separada, especifica del locus, del exon 2, del exon 3 y/o del exon 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C, haciendo uso de al menos un grupo de cebadores en donde: para la amplificacion del exon 2, el cebador inverso se hibrida especificamente a la secuencia objetivo especifica del locus en el intron 2 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; para la amplificacion del exon 3, el cebador delantero se hibrida especificamente a una secuencia objetivo especifica del locus en el intron 2 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; y/o el cebador inverso se hibrida especificamente a una secuencia objetivo especifica del locus en el intron 3 respectivamente de HLA~A, HLA-B o HLA-C; para la amplificacion del exon 4, el cebador delantero se hibrida especificamente a una secuencia objetivo especifica del locus en el intron 3 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA~C. De acuerdo con la presente invencion esta proporciona un metodo mejorado para la tipificacion o subtipificacion de alelos de la clase I de HLA haciendo uso del metodo de amplificacion de la invencion.

Description

MÉTODO PARA LA AMPLIFICACIÓN DE ALELOS HLA DE CLASE I CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para la tipificación o subtipificación de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada, específica del locus, del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El complejo mayor de histocompatibilidad, humano (MHC) está contenido dentro de aproximadamente 4 Mbp de ADN sobre el brazo corto del cromosoma 6 en 6p21.3 (Campbell y Trowsdale, 1993) . El MEÓ humano está dividido en las regiones de la clase I, clase II y clase III. Los genes de la clase I y clase II codifican para las moléculas de la superficie celular altamente polimórfica que se enlazan y presentan antígenos procesados en la forma de péptidos para los linfocitos T, iniciando las respuestas inmunes celular y humoral . Las moléculas de la clase I de los MHC, HLA-A, -B y -C humanas, son encontradas sobre la mayoría de las FEF: 132520 - - ?...? , J 1H . 1. H l am mlir r - - r -pi ? t ? mnl tt ir -11 1 t ,. - . r «trpj? . prtt — . i .11 .m u ' f flflfifll células nucleadas. Éstas son glucoproteínas de la superficie celular que se enlazan y presentan péptidos procesados derivados de proteínas endógenamente sintetizadas para las células T CD8+. Estos heterodímeros consisten de una cadena a codificada por HLA, asociada con un polipéptido monomórfico no codificado por MHC, la ß2-microglobulina (Townsend y Bodmer, 1989; Spencer y Parham, 1996) . Las moléculas de la clase II del MHC humano son codificadas en la región HLA-D. Estas glucoproteínas de la superficie celular consisten de las cadenas a y ß codificadas por HLA, asociadas como heterodímeros sobre la superficie celular de las células que presentan antígenos tales como las células B y los macrófagos. Las moléculas de la clase II sirven como receptores para los péptidos procesados. No obstante, estos péptidos son derivados predominantemente de las proteínas membranales y extracelulares y son presentados a las células T CD+ . La región HLA-D contiene varios genes de la clase II y tiene tres subregiones principales: HLA-DR, -DQ, y -DP. Las regiones HLA-D1 y -DP contienen un gen funcional para cada una de sus cadenas a y ß. La subregión HLA-DR contiene un gen funcional para la cadena a; el número de genes funcionales para la cadena ß varía de uno a dos de acuerdo al haplotipo (.Andersson et al., 1987; Apple and Erlich, 1996) . . s * - * - *? t* ; -»- - t^«»W Existe extenso polimorfismo en la mayoría de los loci . En vista de la importancia biológica y médica de estos antígenos, se requiere una técnica altamente sensible y rápida para la tipificación de HLA. Son actualmente utilizadas una variedad de técnicas para detectar el polimorfismo de HLA, incluyendo el reconocimiento serológico, bioquímico, de células T, y, más recientemente, los métodos biológicos moleculares. La serología permanece siendo el método principal para la tipificación de HLA -especialmente para la clase I-para muchos laboratorios de histocompatibilidad rutinaria. El ensayo de micro-linfocitotoxicidad (Kissmeyer et al., 1969; Terasaki y McClelland, 1964) es el procedimiento estándar: células mononucleares de sangre periférica viables (clase I) o células B separadas (clase II) son mezcladas con antisuero (policlonal o monoclonal) de especificidad conocida de HLA. La detección del polimorfismo puede ser lograda mediante la observación de la diferente composición de aminoácidos de las moléculas HLA a través de técnicas bioquímicas tales como el enfoque isoeléctrico unidimensional (IEF; Yang, 1987) . Este método confía en las sustituciones de aminoácidos que contribuyen a cambios en la carga de la molécula de HLA. i t.. , . .14 . . . - - O-JOUJ- Otro método de tipificación de HLA es la reacción de linfocitos mixtos (MLR) . Concurrente a las observaciones que se realizan utilizando los antisueros específicos para HLA, se notó que los linfocitos provenientes de dos fuentes no relacionadas, cuando se mezclan en cultivo, podrían proliferar (Hirschorn et al., 1963) . El análisis de las especificidades de HLA a partir del ADN, proporcionó un nuevo enfoque para definir sus diferencias polimórficas. En vez de buscar las diferencias en la molécula expresada, el polimorfismo es caracterizado al nivel de los nucleótidos. Un desarrollo importante y poderoso en el campo de la biología molecular ha sido la reacción en cadena de polimerasa (PCR; Mullís et al., 1986; Mullís y Faloona, 1987) . En la tipificación de tejidos, se utiliza PCR para amplificar las regiones polimórficas de los genes de HLA. Este producto de PCR de HLA puede luego ser analizado para las diferencias polimórficas, para establecer el tipo de tejido. Ha sido desarrollado un número de tales procedimientos, incluyendo el análisis de hetero dúplex de los productos de PCR (Clay et al., 1994), el análisis de polimorfismo conformacional de una sola hebra del producto de PCR (PCR-SSCP; Yoshida et al., 1992), la tipificación basada en la secuencia (SBT; Santamaría et al., 1992 y 1993), el uso de cebadores específicos de la secuencia en la reacción de PCR (PCR-SSP; Olerup y Zetterquist, 1991), el uso de PCR en combinación con el sondeo de oligonucleótido específico de la secuencia (PCR-SSOP; Saiki et al., 1986) o el sondeo mediante manchado por puntos, inverso (Saiki et al., 1989). Estos procedimientos, utilizados solos o en combinación, han sido aplicados todos como métodos basados en ADN para la tipificación del tejido de las especificidades de HLA de la clase I y de la clase II. Los métodos de tipificación de ADN deben ser preferidos sobre los métodos serológicos con la condición de que esté disponible un método de tipificación de ADN fácil, rápido y confiable. Algunas diferencias al nivel de subtipo que son detectables por los métodos de ADN pueden permanecer no detectadas por los métodos actuales de tipificación serológica, aunque estas diferencias pueden provocar rechazo de aloinjerto (Fleischhauer et al., 1990). El sistema HLA es el sistema genético humano más polimórfico todavía conocido. Los genes de la clase I de HLA comparten una estructura similar (de 5' a 3'): una región flanqueante 5' no traducida, un primer exón (exón 1) que tiene una longitud de aproximadamente 73 pares de bases, un primer intrón (intrón 1) que tiene una longitud de aproximadamente 130- pares de bases, un segundo exón (exón 2) , que tiene una longitud de aproximadamente 250 -»•**<* >» pares de bases, un segundo intrón (intrón 2) , que tiene una longitud de aproximadamente 272 pares de bases, un tercer exón (exón 3), que tiene una longitud de aproximadamente 276 pares de bases, un tercer intrón (intrón 3) , que tiene una longitud de aproximadamente 588 pares de bases y un cuarto exón (exón 4) , que tiene una longitud de aproximadamente 276 pares de bases. Las sustituciones polimórficas dentro de los alelos de HLA de la clase I están principalmente localizados en el exón 2 y en el exón 3, que codifican para la muesca de enlace al péptido de la molécula de la clase I. Estos polimorfismos realizan la diferenciación entre alelos logrables a través de una variedad de técnicas biológicas moleculares tales como el secuenciamiento o la hibridación con sondas relevantes. En los equipos de diagnóstico actuales el exón 2 y el exón 3 son amplificados conjuntamente, dando como resultado amplicones de aproximadamente 1 kb que consisten de al menos el exón 2, el intrón 2 y el exón 3. Los cebadores específicos del locus son disponibles para la amplificación de estos amplicones de 1 kb. No obstante, tales amplicones grandes son difíciles de amplificar y muestran formación de estructura secundaria dando como resultado hibridación ineficiente de algunas sondas. Además, debido a la aparición de nuevos alelos de HLA de la Clase I, ciertas combinaciones de alelos ya no pueden ser distinguidas por la detección de los polimorfismos únicamente en el exón 2 y en el exón 3, y es requerida la tipificación adicional en el exón 4. Esto eleva la necesidad para la amplificación adicional del exón 4, dando como resultado un amplicón 5 todavía más grande. Por lo tanto, una amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 podría ser deseada, dando como resultado productos de amplificación que hacen posible una tipificación más eficiente de los alelos HLA de la clase I. No obstante, ya que los sitios 10 de recocido con cebador específico de locus son escasos y no pueden ser encontrados en el exón 2, el exón 3 o el exón 4, la amplificación separada y específica del locus del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C no es evidente . 15 OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la amplificación específica del 20 locus y separada, del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C. Un objetivo más específico de la presente invención es proporcionar un método para la amplificación separada, específica de locus, de un solo paso, del exón 2 25 y el exón 3 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C.

Un objetivo más específico de la presente invención es proporcionar un método para la amplificación separada, específica de locus, de un solo paso, del exón 2 y el exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. 5 Un objetivo más específico de la presente invención es proporcionar un método para la amplificación separada, específica de locus, de un solo paso, del exón 3 y el exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Un objetivo más específico de la presente 10 invención es proporcionar un método para la amplificación separada, específica de locus, de un solo paso, de los tres exones, el exón 2, el exón 3 y el exón 4, de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más de la presente invención es 15 proporcionar un cebador para el uso en un método para la amplificación separada, específica de locus, del exón 2 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un cebador para el uso en un método para la 20 amplificación separada, específica de locus, del exón 3 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un cebador para el uso en un método para la amplificación separada, específica de locus, del exón 4 de 25 los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C.

Un objetivo más específico de la presente invención es proporcionar un grupo de cebadores para el uso en un método para la amplificación separada, específica del locus, del exón 2 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más específico de la presente invención es proporcionar un grupo de cebadores para el uso en un método para la amplificación separada, específica del locus, del exón 3 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más específico de la presente invención es proporcionar un grupo de cebadores para el uso en un método para la amplificación separada, específica del locus, del exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más específico de la presente invención es proporcionar una mezcla de cebadores múltiples para el uso en un método para la amplificación separada, específica de locus, de un solo paso, del exón 2 y del exón 3, de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más específico de la presente invención es proporcionar una mezcla de cebadores múltiples para el uso en un método para la amplificación separada, específica de locus, de un solo paso, del exón 2 y del exón 4, de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más específico de la presente invención es proporcionar una mezcla de cebadores múltiples para el uso en un método para la amplificación separada, ?. i , * específica de locus, de un solo paso, del exón 2 y del exón 3 y el exón 4, de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo más específico de la presente invención es proporcionar una mezcla de cebadores múltiples 5 para el uso en un método para la amplificación separada, específica de locus, de un solo paso, del exón 2 y del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método mejorado para la tipificación o 10 subtipificación de uno o más alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un equipo de diagnóstico mejorado para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos de HLA- 15 A, HLA-B o HLA-C en una muestra. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un Ensayo de Sonda en Línea mejorado, para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos de HLA- A, HLA-B o HLA-C en una muestra. 20 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para la amplificación separada, específica del locus, del exón 25 2, el exón 3 y/o el exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o ^¿^g ^ HLA-C, haciendo uso de al menos un grupo de cebadores en donde : para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus, en el intrón 2 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; para la amplificación del exón 3, el cebador delantero se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica de locus en el intrón 2 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 3 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; para la amplificación del exón 4, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus, en el intrón 3 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; El método de amplificación de la presente invención hace uso de este modo de un grupo de cebadores, del cual al menos uno de los cebadores se está hibridando a una secuencia específica de locus en el intrón 2 o en el intrón 3 del gen HLA de la Clase I, con el fin de obtener la amplificación separada del exón 2 (sin el exón 3 o el exón 4) , el exón 3 (sin el exón 2 o el exón 4) y/o el exón 4 (sin el exón 2 o el exón 3) .

En el caso donde el exón 2 es amplificado, el cebador inverso se hibrida a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2, mientras que el cebador delantero puede ser elegido para hibridarse a una 5 región corriente arriba (5') del exón 2 (por ejemplo en el intrón 1 o en el exón 1) o a los nucleótidos iniciales del exón 2. En una modalidad preferida, el cebador delantero se hibrida a una región específica del locus corriente arriba del exón 2 (por ejemplo en el intrón 1 o en el exón 10 1) o a los nucleótidos iniciales específicos del locus del exón 2, y el cebador inverso se hibrida a una secuencia objetivo específica del locus, en el intrón 2. En el caso donde el exón 3 es amplificado, el cebador delantero se está hibridando a una secuencia 15 objetivo específica del locus en el intrón 2, mientras que el cebador inverso puede ser elegido para hibridarse a los nucleótidos finales del exón 3 o corriente abajo (3') del exón 3 (por ejemplo en el intrón 3) o el cebador inverso se está hibridando a una secuencia objetivo específica del 20 locus en el intrón 3, mientras que el cebador delantero puede ser elegido para hibridarse a una región corriente arriba (5') al exón 3 (por ejemplo intrón 2) o a los nucleótidos iniciales del exón 3. En una modalidad preferida, el exón 3 es amplificado mediante el uso de un 25 grupo de cebadores del cual el cebador delantero se está - .l ....iM;*i.---í»*£Ííl¡tÁ-i*&*ir?&' hibridando a una secuencia objetiva específica del locus en el intrón 2, y el cebador inverso se está hibridando a una secuencia objetivo específica del locus, en el intrón 3. En el caso donde el exón 4 es amplificado, el cebador delantero se está hibridando a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 3, mientras que el cebador inverso puede ser elegido para hibridarse a los nucleótidos finales del exón 4 o corriente abajo (3') del exón 4 (por ejemplo en el intrón 4) . En una modalidad preferida, el cebador delantero se está hibridando a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 3, mientras que el cebador inverso se hibrida a las secuencias objetivo específicas del locus en el extremo del exón 4 o corriente abajo (3') del exón 4 (por ejemplo en el intrón 4) . Este nuevo método de amplificación dará como resultado la amplificación de fragmentos más cortos de .ADN, que contienen únicamente el exón 2, únicamente el exón 3 o únicamente el exón 4, que son mucho más fáciles de amplificar y mucho más fáciles para utilizarse en diferentes métodos de tipificación tales como el secuenciamiento o hibridación con diferentes sondas específicas de alelo. A partir de la sección de ejemplos, es claro que los grupos de cebadores que contienen un cebador que se hibrida a una secuencia objetivo en el intrón 2 o en el intrón 3, proporcionan una amplificación mucho mejor y más fácil del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de los alelos HLA de la Clase I, y un patrón de hibridación más claro y pronunciado con las sondas de tipificación de alelos. Ha sido el mérito de los presentes inventores el definir los cebadores específicos que hacen posible está amplificación separada del exón 2, el exón 3 o el exón 4 únicamente de un locus HLA, mientras que los exones de otros loci HLA (por ejemplo otros genes HLA clásicos, genes HLA no clásicos o pseudogenes) no son co-amplificados . Ya que los amplicones específicos de a en el producto de amplificación pueden dar como resultado una tipificación fallida, el método de amplificación de la invención ciertamente mejorará la seguridad de los métodos de tipificación actuales. El término "específico del locus" significa de este modo que el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 únicamente de un locus (por ejemplo HLA-A, HLA-B o HLA-C) es amplificado, mientras que el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de los otros loci de HLA (otros genes HLA clásicos, genes HLA no clásicos o pseudogenes) no es amplificado. De este modo, cuando los cebadores específicos para la amplificación del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-son utilizados, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-B, HLA-C o de otros loci de HLA no son amplificados.

,U.J Similarmente, cuando los cebadores específicos para la amplificación del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-B son utilizados, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-A, HLA-C o de otros loci de HLA no son amplificados. Similarmente, cuando son utilizados los cebadores específicos para la amplificación del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-C, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-A, HLA-B o de otros loci de HLA no son amplificados. A partir de esto, es claro que el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de 2 , 3 o más diferentes loci de HLA, no pueden nunca ser amplificados conjuntamente. De este modo, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-A nunca pueden ser amplificados en el mismo tubo de reacción, con el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-B. Similarmente, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA nunca pueden ser amplificados en el mismo tubo de reacción con el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-C. Similarmente el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-B nunca pueden ser amplificados en el mismo tubo de reacción con el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-C. Similarmente, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-A nunca pueden ser amplificados en el mismo tubo de reacción con el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-B y el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-C. Como consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada, específica del locus, del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Esto significa que la invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-A, la invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-B y la invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-C. El término "cebador" se refiere a una secuencia oligonucleotídica de una sola hebra capaz de actuar como un punto de inicio para la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a la hebra de ácido nucleico que va a ser copiada. La longitud y la secuencia del cebador deben ser tal que éstos permitan cebar la síntesis de los productos de extensión. En una modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 5-50 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 10-30 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 20-25 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad del ADN o del ARN objetivo, requeridos, así como de las condiciones en las cuales se utiliza el cebador, tales como la temperatura y la fuerza iónica .

La expresión "grupo de cebadores" o "par de cebadores" se refiere a un par de cebadores que permiten la amplificación de parte o todo del exón 2, el exón 3 o el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Un grupo de cebadores 5 consiste siempre de un cebador delantero (o cebador 5') y un cebador inverso (o cebador 3'). Los términos "para hibridarse específicamente" y "se hibrida específicamente" significan que durante el paso de amplificación, el cebador forma un dúplex con parte de 10 su secuencia objetivo o con la secuencia objetivo completa bajo las condiciones experimentales utilizadas, y que bajo estas condiciones dicho cebador no forma un dúplex con otras secuencias de los ácidos polinucleicos presentes en la muestra que va a ser analizada. Se debe entender que 15 los cebadores que son diseñados para hibridarse específicamente a una secuencia objetivo de un ácido nucleico pueden caer dentro de la secuencia objetivo, o pueden, a un grado mayor, traslaparse con la secuencia objetivo (por ejemplo forman un dúplex con los nucleótidos 20 exteriores, así como dentro de la secuencia objetivo) . El término "secuencia objetivo" de un cebador de acuerdo a la presente invención es una secuencia dentro del intrón 2 o el intrón 3 de los alelos de HLA de la Clase I para los cuales el cebador es completamente complementario 25 o parcialmente complementario (por ejemplo con malos -aifc acoplamientos de hasta 20%, 15%, 10% ó 5%) . Se debe entender que el complemento de la secuencia objetivo es también una secuencia objetivo adecuada en algunos casos. El hecho de que los cebadores de amplificación no tengan que ajustarse o concordar exactamente con la secuencia objetivo correspondiente en la plantilla para garantizar la amplificación adecuada, es ampliamente documentado en la literatura (Kwok et al., 1990). No obstante, cuando los cebadores no son completamente complementarios a su secuencia objetivo, se debe tomar en cuenta que los fragmentos amplificados tendrán la secuencia de los cebadores y no de la secuencia objetivo. En una modalidad, la amplificación es realizada en un tubo de reacción con un grupo de cebadores para la amplificación del exón 2, como se describe anteriormente (el cebador inverso se hibrida con una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2) y consecuentemente únicamente es amplificado el exón 2. En otra modalidad, la amplificación es realizada en un tubo de reacción con un grupo de cebadores para la amplificación del exón 3, como se describe anteriormente (el cebador delantero se hibrida con una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2) , y en consecuencia únicamente es amplificado el exón 3.

JLL En otra modalidad, la amplificación es realizada en un tubo de reacción con un grupo de cebadores para la amplificación del exón 3, como se describe anteriormente (el cebador inverso se hibrida con una secuencia objetivo 5 específica del locus en el intrón 3) y consecuentemente únicamente es amplificado el exón 3. En otra modalidad, la amplificación es realizada en un tubo de reacción con un grupo de cebadores para la amplificación del exón 3, como se describe anteriormente 10 (el cebador delantero se hibrida con una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2 y el cebador inverso se híbrida con una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 3) y consecuentemente únicamente es amplificado el exón 3. 15 En otra modalidad, la amplificación es realizada en un tubo de reacción con un grupo de cebadores para la amplificación del exón 4, como se describe anteriormente (el cebador delantero se hibrida con una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 3) y consecuentemente 20 únicamente es amplificado el exón 4. En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 o el exón 4 de los alelos HLA de la Clase I. En otra modalidad más, los grupos de cebadores 25 diferentes involucrados en la amplificación del exón 2 y la amplificación del exón 3 son mezclaos y la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 es realizada en un tubo de reacción simple. De este modo, la presente invención también se refiere a un método como se describe 5 anteriormente caracterizado además porque el exón 2 y el exón 3 de HLA-A, HLA-B o HLA-C son amplificados mediante el uso de una mezcla de cebadores múltiples que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2, y al menos un par de cebadores para la amplificación del 10 exón 3. En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2 y_ el exón 3 de los alelos HLA de la Clase I. En otra modalidad más, los diferentes grupos de cebadores involucrados en la amplificación del exón 2 y la 15 amplificación del exón 4 son mezclados, y la amplificación separada del exón 2 y el exón 4 es realizada en un tubo de reacción simple. De este modo, la presente invención también se refiere a un método como se describe anteriormente, caracterizado además porque el exón 2 y el 20 exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C son amplificados mediante el uso de una mezcla de cebadores múltiples que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 4. En consecuencia, la presente invención se refiere 25 a un método para la amplificación separada del exón 2 el exón 4 de los alelos HLA de la Clase I. En otra modalidad más, los grupos de cebadores diferentes involucrados en la amplificación del exón 3 y la amplificación del exón 4 son mezclados, y la amplificación separada del exón 3 y el exón 4 es realizada en un tubo de reacción simple. De este modo, la presente invención también se refiere a un método como se describe anteriormente, caracterizado además porque el exón 3 y el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C son amplificados mediante el uso de una mezcla de cebadores múltiples que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3, y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 4. En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 3 y el exón 4 de los alelos HLA de la Clase I. En otra modalidad más, los diferentes grupos de cebadores involucrados en la amplificación del exón 2, la amplificación del exón 3 y la amplificación del exón 4 son mezclados, y la amplificación separada de los tres exones, el exón 2, el exón 3 y el exón 4, es realizada en un tubo de reacción único. De este modo, la presente invención también se refiere a un método como se describe anteriormente, caracterizado además porque los tres exones, a saber, el exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C son amplificados mediante el uso de una mezcla de cebadores múltiples que contiene al menos un par de f i* t '-• •••.-«-"— - • „ - ^"^ cebadores para la amplificación del exón 2, al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 4. En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 ^ el exón 4 de los alelos HLA de la Clase I. El método de amplificación utilizado puede ser ya sea la reacción en cadena de polimerasa (PCR; Saiki et al., 1988) , la reacción en cadena de ligasa (LCR; Landgren et al., 1988; Wu y Wallace, 1989; Barany, 1991), la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS; Kwoh et al., 1989), la amplificación de desplazamiento de hebra (SDA; Duck, 1990) o la amplificación por medio de la Qß-replicasa (Lomeli et al., 1989) o cualquier otro método adecuado para amplificar las moléculas de ácido nucleico conocidos en la técnica. También pueden ser utilizadas las técnicas de TMA (Guatelli et al., 1990) o bADN (Sánchez-Pescador et al., 1988, Urdea et al., 1991) en el método de la presente invención. En una modalidad específica, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C son amplificados mediante PCR. En una modalidad específica, la presente invención se refiere a un método como se describe i ' ' anteriormente, caracterizado además porque la secuencia objetivo específica del locus está situada en una de las siguientes posiciones: 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A (Figura 1) y/o 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150, 501, 525, 561 ó 571 (Figura 4) del intrón 3 de HLA-A; o 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B (Figura 2) y/o 42, 46, 65, 68, 96, 438, 502, 524, 547 ó 571 del intrón 3 de HLA-B (Figura 5) ; o 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C (Figura 3) y/o 461, 477, 527, 545 ó 561 del intrón 3 de HLA-C (Figura 6) . Ya que estas posiciones contienen todas los nucleótidos específicos del locus, estas posiciones son particularmente adecuadas para el diseño de un cebador eficiente para la amplificación específica del locus del exón 2, el exón 3 o el exón 4. Los cebadores pueden ser de longitud diferente. En una modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 5-50 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 10-30 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 10-25 nucleótidos. La longitud específica y la secuencia específica dependerán de la complejidad del ADN o ARN objetivo, requeridos, así como de las condiciones en las cuales se utiliza el cebador, tales como la temperatura y la fuerza iónica. En una modalidad específica, la presente invención se refiere a un método como se describe anteriormente, caracterizado además porque dichas posiciones constituyen el extremo 3' del cebador que es utilizado para la amplificación del exón 2, el exón 3 o el exón 4. De este modo, a partir de las posiciones anteriormente descritas, los cebadores delanteros así como inversos pueden ser diseñados, los cuales tienen su extremo 3' en estas posiciones específicas. El cebador inverso que tiene su extremo 3' en una de las posiciones específicas anteriormente mencionadas del intrón 2, será capaz de realizar la amplificación específica del locus, del exón 2 del respectivo alelo de HLA-A, HLA-B o HLA-C. El cebador delantero que tiene su extremo 3' en una de las posiciones específicas anteriormente mencionadas del intrón 2, hará posible la amplificación específica del locus, del exón 3 del respectivo alelo de HLA-A, HLA-B o HLA-C. El cebador inverso que tiene su extremo 3' en una de las posiciones específicas anteriormente mencionadas del intrón 3, hará posible la amplificación específica del locus del exón 3 del alelo respectivo HLA-A, HLA-B o HLA-C. El cebador delantero que tiene su extremo 3' en una de las posiciones _1 específicas anteriormente mencionadas del intrón 3, hará posible la amplificación específica del locus del exón 4 del alelo HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivo. Los cebadores pueden ser de diferente longitud. En una modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 5-50 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 10-30 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es de aproximadamente 20-25 nucleótidos. La longitud específica y la secuencia específica dependerán de la complejidad del ADN o ARN objetivo requeridos, así como de las condiciones en las cuales se utiliza el cebador, tales como la temperatura y la fuerza iónica. En otra modalidad más, la presente invención se refiere a un método como se describe anteriormente, caracterizado además porque el cebador es elegido de la siguiente lista: para la amplificación del exón 2 de HLA-A (Tabla 1) : 5 'ATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 1) 5 ' GATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 2) 5 ' GGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 3) 5 'YGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO . 4) 5 ' GYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 5) 5 ' GGYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 6) 5 ' GGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 7) t.., . - - - - - -^-mTiJa 5 ' GGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 8) 5 'AGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 9) 5 'AAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 10) 5 ' CAAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 11) 5 5 ' CTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 12) 5 ' TCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 13) 5 ' CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 14) 5 ' CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 15) 5 ' GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 16) 10 5 ' GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 17) 5 ' TCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 18) 5 ' CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 19) 5 ' CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 20) 5 ' GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 21) 15 5 ' GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 22) 5 ' GGGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 23) 5 ' CCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO . 30) 5 ' GCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO . 31) 5 ' CGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO . 32) 20 5 ' GCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO. 33) 5 ' GGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO . 34) 5 'AGGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO . 35) 5 'AGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 36) 5 'AAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO . 37) 25 5 ' WAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 38) ,., -BaA«Ma*.....JM,MM ...LL.,... „...-.. ^, ,-., . *. « , -, * ,.„ ,„. , s « ? \- , - t- ^? 5 ' TWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 39) 5 ' GTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 40) 5 ' GGTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 41) 5 ' CCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 42) 5 'ACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 43) 5 'AACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 44) 5 'AAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 45) 5 ' GAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 46) 5 ' TGAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 47) 5 'YCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 48) 5 ' GYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 49) 5 ' YGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO . 50) 5 ' CYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 51) 5 ' CCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 52) 5 ' CCCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 53) para la amplificación del exón 3 de HLA-A (Tabla 2; Tabla 3) : 5 ' CGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 54) 5 'ACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 55) 5 ' CACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 56) 5 ' CCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 57) 5 ' CCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 58) 5 ' CCCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 59) 5 ' GGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 60) 5 ' GGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 61) LJ- 5 ' CGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO . 62) 5 ' CCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 63) 5 ' TCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 64) 5 ' CTCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 65) 5 5 ' CCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 66 ) 5 ' RCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 67) 5 ' CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 68) 5 ' CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 69) 5 ' TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO . 70) 10 5 'ATCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 71) 5 ' CCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 72) 5 ' CCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 73) 5 ' RCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 74) 5 ' CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO . 75) 15 5 ' CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 76) 5 ' TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 77) 5 ' CGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 84) 5 ' CCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 85) 5 ' GCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 86) 20 5 'AGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO . 87) 5 ' AAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 88) 5 ' GAAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 89) 5 ' GACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 90) 5 ' GGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 91) 25 5 ' GGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 92) 5 ' CGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 93) 5 ' GCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 94) 5 ' CGCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 95) 5 ' GACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 96) 5 'AGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 97) 5 ' GAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 98) 5 ' CGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO . 99) 5 ' CCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO . 100) 5 'YCCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO . 101) 5 ' GTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 102) 5 'AGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 103) 5 ' CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 104) 5 ' TCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 105) 5 ' TTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 106) 5 ' TTTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 107) 5 'AGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 150) 5 ' CAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 151) 5 ' CCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 152) 5 ' GCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 153) 5 ' GGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 154) 5 'AGGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 155) 5 ' CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 156) 5 ' CCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 157) 5 ' TCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 158) 5 ' CTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 159) * . * > » , . . . - y> a¡ktl , . . * ¡ -. . . . * . .». . ¡ iumiáah i 5 ' TCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 160) 5 ' GTCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO . 161) 5 ' CCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 162) 5 ' TCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 163) 5 ' GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 164) 5 ' GGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 165) 5 ' TGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 166) 5 ' TTGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 167) 5 ' CTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 168) 5 ' TCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 169) 5 ' TTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 170) 5 'ATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 171) 5 ' TATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 172) 5 'ATATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 173) 5 ' GGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 174) 5 'AGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 175) 5 ' GAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 176) 5 ' GGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 177) 5 ' GGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 178) 5 'AGGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 179) 5 ' GGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 180) 5 ' GGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 181) 5 'AGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 182) 5 ' GAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO . 183) 5 'AGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 184) .-.t ... - . í. c-.* i l» . - » - j ,, .a-, -, r - • mfWWft ^A^ 5 ' CAGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 185) 5 ' CCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 186) 5 ' ACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 187) 5 'AACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 188) 5 5 'AAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO . 189) 5 ' GAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 190) 5 ' GGAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 191) 5 'AGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 192) 5 ' CAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 193) 10 5 'ACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 194) 5 ' TACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 195) 5 ' GTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 196) 5 ' GGTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 197) 5 ' TCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 198) 15 5 ' CTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 199) 5 ' CCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 200) 5 'ACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 201) 5 'AACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 202) 5 ' GAACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 203) 20 - para la amplificación del exón 4 de HLA-A (Tabla 4) 5 ' TTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO . 204) 5 ' GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 205) 5 ' GGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 206) 5 ' GGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO . 207) 25 5 ' TGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 208) ^^¡ggg^^ iglj 5 ' CTGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 209) 5 ' GGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 24) 5 ' RGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 25) 5 ' CRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO . 26) 5 5 ' CCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO . 27) 5 ' CCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 28) 5 ' TCCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 29) ¡ 5 ' CTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 210) I ¡ 5 ' GCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 211) ! 10 5 ' TGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 212) ! | 5 ' RTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 213) i | 5 'YRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 214) i ! 5 ' GYRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 215) j 5 ' GTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 216) í 15 5 ' TGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 217) 5 ' GTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 218) 5 'AGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 219) 5 ' GAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 220) 5 ' GGAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 221) 20 - para la amplificación del exón 2 de HLA-B (Tabla 5] 5 'ACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 108) 5 'AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 109) 5 ' CAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO . 110) 5'CCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (SEQ ID NO. 111) 25 5 ' MCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 112) 5 ' GMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 113) 5 ' YGMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 314) para la amplificación del exón 3 de HLA-B (Tabla 6; Tabla 7) : 5 ' CYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 114) 5 ' CCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO . 115) 5 ' GCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 116) 5 ' GGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 117) 5 ' CGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 118) 5 ' CCGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 119) 5 ' CCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 120) 5 'ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 121) 5 ' TACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 122) 5 ' TTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 123) 5 ' TTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 124) 5 ' GTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 125) 5 ' CGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 222) 5 ' GCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 223) 5 ' CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 224) 5 ' CGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 225) 5'TCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (SEQ ID NO. 226) 5'CTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (SEQ ID NO. 227) 5 ' TCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 228) 5 ' TTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 229) 5 ' CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 230) 5'TCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (SEQ ID NO. 231) 5 ' TTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3 ' (SEQ ID NO . 232) 5'CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (SEQ ID NO. 233) 5'TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (SEQ ID NO. 234) 5?TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (SEQ ID NO. 235) 5 ' CYTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3 ' (SEQ ID NO. 236) 5 ' GATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 237) 5 ' TGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 238) 5 ' CTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 239) 5 ' GCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO . 240) 5 ' CGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 241) 5 ' GCGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 242) 5 ' GCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 243) 5 ' CGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 244) 5 ' GCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 245) 5 'AGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 246) 5 ' TAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 247) 5 ' CTAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 248) 5 ' TCCATTCAAGGGAGGGCGAC3 ' (SEQ ID NO. 249) 5 ' CTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3 ' (SEQ ID NO. 250) 5 ' TCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3 ' (SEQ ID NO. 251) 5 ' TTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3 ' (SEQ ID NO. 252) 5 'ATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3 ' (SEQ ID NO. 253) 5 ' CATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3 ' (SEQ ID NO. 254) - para la amplificación del exón 4 de HLA-B (Tabla 8] 5 ' AGATTATCCCAGGTGCCTGC3 ' (SEQ ID NO. 255) 5 ' GAGATTATCCCAGGTGCCTGC3 ' (SEQ ID NO . 256) 5 ' GGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3 ' (SEQ ID NO. 257) 5 'AGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3 ' (SEQ ID NO. 258) 5 ' TAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3 ' (SEQ ID NO. 259) 5 'ATAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3 ' (SEQ ID NO. 260) 5 ' TGTCCTGYCCATTCTCAGKC3 ' (SEQ ID NO. 261) 5 ' GTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3 ' (SEQ ID NO. 262) 5 ' GGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3 ' (SEQ ID NO. 263) 5 'AGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3 ' (SEQ ID NO. 264) 5 ' CAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3 ' (SEQ ID NO. 265) 5 ' CCAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3 ' (SEQ ID NO. 266) 5 ' TCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 267) 5 ' GTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 268) 5 ' GGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 269) 5 ' TGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 270) 5 ' CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO . 271) 5 ' KCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 272) 5 ' GKCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 273) 5 ' TSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 274) 5 ' GTSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 275) 5'TGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (SEQ ID NO. 276) 5 ' GTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 277) 5 ' GGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 278) 5'GGGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (SEQ ID NO. 279) *-*&-« •* - ?l.. .. ...... .- - . . . * ?M.,^.-.^iA 5 ' GWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 280) 5 ' TGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 281) 5 ' CTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 282) 5 ' CCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 283) 5 ' GCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 284) 5 ' CGCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 285) para la amplificación del exón 2 de HLA-C (Tabla 9) 5 ' GTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 126) 5 ' GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 127) 5 ' CGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 128) 5 ' CCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT ' (SEQ ID NO. 129) 5 'YCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 130) 5 ' CYCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 131) para la amplificación del exón 3 de HLA-C (Tabla 10] 5'CGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (SEQ ID NO. 132) 5 ' TCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 133) 5 ' GTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 134) 5 ' GGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 135) 5 ' GGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 136) 5 ' CGGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 137) 5 ' CGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 138) 5 ' TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO . 139) 5 ' CTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 140) 5 ' CCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 141) 5 ' CCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 142) 5 'ACCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 143) para la amplificación del exón 4 de HLA-C (Tabla 11) 5 ' GTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 286) 5 ' GGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 287) 5 'AGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 288) 5 ' CAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 289) 5 ' CCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 290) 5 ' CCCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 291) 5 ' TGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO . 292) 5 ' CTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 293) 5 ' GCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 294) 5 ' GGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 295) 5 'AGGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 296) 5 ' CAGGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 297) 5 ' CTCAGGATRGTCACATGGSC3 ' (SEQ ID NO. 298) 5 ' TCTCAGGATRGTCACATGGSC3 ' (SEQ ID NO. 299) 5 ' TTCTCAGGATRGTCACATGGSC3 ' (SEQ ID NO. 300) 5 ' RTTCTCAGGATRGTCACATGGSC3 ' (SEQ ID NO. 301) 5 ' CRTTCTCAGGATRGTCACATGGSC3 ' (SEQ ID NO . 302) 5 ' CCRTTCTCAGGATRGTCACATGGSC3 ' (SEQ ID NO. 303) 5 ' GCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3 ' (SEQ ID NO. 78) 5 ' GGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3 ' (SEQ ID NO. 79) 5 ' GGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3 ' (SEQ ID NO. 80) 5 ' TGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3 ' (SEQ ID NO. 81) 5 'ATGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3 ' (SEQ ID NO. 82) 5 ' CATGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3 ' (SEQ ID NO. 83) 5'SCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (SEQ ID NO. 304) 5 ' CSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 305) 5 ' TCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 306) 5 5'GTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (SEQ ID NO. 307) 5'TGTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (SEQ ID NO. 308) 5 ' GTGTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 309) En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a cualquier método como se describe 10 anteriormente, caracterizado además porque la amplificación del exón 2 es llevada a cabo con al menos uno de los siguientes cebadores delanteros: para HLA-A: 5APBÍO: B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC (SEQ ID NO. 144) ; 15 • para HLA-B: IBPinl : B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG (SEQ ID NO. 145) ; para HLA-C: 5CIN1 : B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA (SEQ ID NO. 146) . En otra modalidad preferida, la presente 20 invención se refiere a cualquier método como se describe anteriormente, caracterizado además porque la amplificación del exón 4 es llevada a cabo con al menos uno de los siguientes cebadores inversos: para HLA-A: 3ex4APbi?: B-TTGGGCAGACCCTCATGCTGC (SEQ ID 25 NO. 311) ; para HLA-B: 3ex4IBb??: B-TCGGCAGCCCCTCATGCTGT (SEQ ID NO. 312) ; para HLA-C: 3ex4ICbiO: B-CATCTCAGGGTGMRGGGCTT (SEQ ID NO. 313) . En una modalidad muy específica, la presente invención se refiere a cualquier método como se describe anteriormente, caracterizado además porque: la amplificación del exón 2 es llevada a cabo con al menos uno de los siguientes grupos de cebadores: • para HLA-A: 5APbio (B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC; SEQ ID NO. 144) y 3ex2APbio (B-ATCTCGGACCCGGAGACTGT; SEQ ID NO. 1) ; para HLA-B: IBPinl (B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG; SEQ ID NO. 145) e IB3Pín2bi? (B-AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC; SEQ ID NO. 109) ; para HLA-C: 5CIN1 (B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA; SEQ ID NO. 146) e IC3Pín2bÍO (B-GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT; SEQ ID NO. 127) ; la amplificación del exón 3 es llevada a cabo con al menos uno de los siguientes grupos de cebadores: para HLA-A: 5ex3APbi? (B-CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC; SEQ ID NO. 104) y 3ex3APbi? (B-CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG; SEQ ID NO. 156) ; para HLA-B: IB5Pin 2bio (B- CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG; SEQ ID NO. 224) e ° * * * -"• * » y IB3Pin3bio (B-TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC; SEQ ID NO. 234) ; para HLA-C: IC5PÍn2bí? (B-TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT; SEQ ID NO. 139) y 3CIN3 (B-GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT; SEQ ID NO. 149) ; la amplificación del exón es llevada a cabo con al menos uno de los siguientes grupos de cebadores: para HLA-A: 5ex4APbi? (B-GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT; SEQ ID NO. 205) y 3ex4APbio (B-TTGGGCAGACCCTCATGCTGC; SEQ ID NO. 311) ; para HLA-B: 5ex4IBbi? (B-TCACATGGGTGGTCCTAGG; SEQ ID NO. 267) y 3ex4IBbi? (B-TCGGCAGCCCTCATGCTGT; SEQ ID NO. 312) ; para HLA-C: 5ex4ICbio (B-TCTCAGGATRGTCACATGGSC; SEQ ID NO. 299) y 3ex4ICbio (B-CATCTCAGGGTGMRGGGCTT; SEQ ID NO. 313) . La persona experta en la técnica entenderá que estos cebadores (SEQ ID NOs. 1 al 314) pueden ser adaptados por la adición o supresión de uno o más nucleótidos en sus extremos. Tales adaptaciones pueden ser requeridas, por ejemplo, si las condiciones de amplificación son cambiadas, si el material amplificado es ARN en vez de ADN, como es el caso, por ejemplo, en el sistema NASBA. La presente invención se refiere además a un cebador como se describe anteriormente, para el uso en la ?J "--*^i? amplificación del exón 2 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C, dicho cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; más específicamente, el cebador que se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus, situada en la posición: 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A (Figura 1) ; o - 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B (Figura 2) ; o 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C (Figura 3 ) ; más específicamente, el cebador es elegido de la Tabla 1 (para la amplificación del exón 2 de HLA-A) , a partir de la Tabla 5 (para la amplificación del exón 2 de HLA-B) o a partir de la Tabla 9 (para la amplificación del exón de HLA-C) . La presente invención se refiere además también a un cebador como se describe anteriormente, para el uso en la amplificación del exón 3 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C, dicho cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2 (cebador delantero) o a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 3 (cebador inverso) respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; más específicamente, el cebador se JJ hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus, situada en la posición: 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A (Figura 1) ó 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150 del intrón 3 de HLA-A (Figura 4) ; o 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B (Figura 2) ó 42, 46, 65, 68, 96, del intrón 3 de HLA-B (Figura 5); o 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C (Figura 3), más específicamente, el cebador es elegido de la Tabla 2 o de la Tabla 3 (para la amplificación del exón 3 de HLA-A) o a partir de la Tabla 6 o la Tabla 7 (para la amplificación del exón 3 de HLA-B) . La presente invención se refiere además también a un cebador como se describe anteriormente, para el uso en la amplificación del exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C, dicho cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 3 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; más específicamente, el cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus situada en la posición: 501, 525, 561 ó 571 del intrón 3 de HLA-A (Figura 4); o 438, 502, 524, 547 ó 571 del intrón 3 de HLA-B (figura 5) ; o .kl . - - * ~Arf«* 461, 477, 527, 545 ó 561 del intrón 3 de HLA-C (Figura 6) , más específicamente, el cebador se elige de la Tabla 4 (para la amplificación del exón 4 de HLA-A) , a partir de la Tabla 8 (para la amplificación del exón 4 de HLA-B) o a partir de la Tabla 11 (para la amplificación del exón 4 de HLA-C) . La presente invención se refiere además a un grupo de cebadores que consisten de una combinación de un cebador delantero y un inverso como se describe anteriormente, para el uso en la amplificación del exón 2 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. En una modalidad específica, la presente invención se refiere a la combinación del cebador delantero 5APBio (SEQ ID NO. 144) para HLA-A, IBPinl (SEQ ID NO. 145) para HLA-B o 5CIN1 (SEQ ID NO. 146) para HLA-C y un cebador inverso que se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA- C; más específicamente, dicho cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus, situada en la posición: 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A; o 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B; o - 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C; más específicamente, el cebador inverso se elige de la Tabla 1 (para la amplificación del exón 2 de HLA-A) , a partir de la Tabla 5 (para la amplificación del exón 2 de HLA-B) o a partir de la Tabla 9 (para la amplificación del exón de HLA-C) . La presente invención también se refiere a un grupo de cebadores que consiste de una combinación de un cebador delantero y uno inverso, como se describe anteriormente, para el uso en la amplificación del exón 3 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. En una modalidad específica, la presente invención se refiere a la combinación de un cebador delantero que se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus en el intrón 2 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; más específicamente, el cebador delantero que se hibrida específicamente a las secuencias objetivo específicas de un locus, situadas en la posición: 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón de HLA-A; o - 35 ó 170 del intrón de HLA-B; o 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C; más específicamente, el cebador delantero que es elegido de la Tabla 2 (para la amplificación del exón 3 de HLA-A) , a partir de la Tabla 6 (para la amplificación del exón 3 de HLA-B) o a partir de la Tabla 10 (para la amplificación del U-exón 3 de HLA-C) y un cebador inverso que se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del lucs en el intrón 3 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C; más específicamente, el cebador inverso que se hibrida específicamente a las secuencias objetivo específicas de un locus situadas en la posición: 35, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150 (Figura 4) del intrón 3 de HLA-A, o 42, 46, 65, 68, 96 del intrón 3 de HLA-B (Figura 5) ; más específicamente, el cebador inverso que es elegido de la Tabla 3 (para la amplificación del exón 3 de HLA-A) , a partir de la Tabla 7 (para la amplificación del exón 3 de HLA-B) o a partir de 3CIN3 (SEQ ID NO. 149) (para la amplificación del exón 3 de HLA-C) . La presente invención se refiere también a un grupo de cebadores que consisten de una combinación de un cebador delantero y uno inverso, como se describe anteriormente, para el uso en la amplificación del exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. En una modalidad específica, la presente invención se refiere a una combinación de un cebador delantero que se hibrida específicamente a una secuencia objetivo específica del locus, en el intrón 3 de HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivamente; más específicamente, el cebador delantero que se hibrida específicamente a las secuencias objetivo específicas de un locus situadas en la posición: 501, 525, 561 ó 571 del intrón 3 de HLA-A (Figura 4); o 5 - 438, 502, 524, 547 ó 571 del intrón 3 de HLA-B (Figura 5) ; o 461, 477, 527, 545 ó 561 del intrón 3 de HLA-C (Figura 6), más específicamente, el cebador delantero que es elegido de 10 la Tabla 4 (para la amplificación del exón 4 de HLA-A) , a partir de la Tabla 8 (para la amplificación del exón 4 de HLA-B) o a partir de la Tabla 11 (para la amplificación del exón 4 de HLA-C) y un cebador inverso 3ex4APbio (SEQ ID NO. 311) para HLA-A, 3ex4IBbio (SEQ ID NO. 312) para HLA-B o 15 3exrICbio (SEQ ID NO. 313) para HLA-C. En una modalidad específica, los cebadores son utilizados en una mezcla que permite la amplificación separada del exón 2 y el exón 3. En consecuencia, la presente invención se refiere a una mezcla de cebadores 20 múltiples que contiene al menos un par de cebadores como se describe anteriormente, para la amplificación del exón 2 y un par de cebadores como se describe anteriormente para la amplificación del exón 3. ^^¡¡gg ^-Jj-, En una modalidad específica, la mezcla de cebadores múltiples para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 comprende los siguientes grupos de cebadores: para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-A: para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-B: para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-C: ,. «*-»«"*»^ En una modalidad específica, los cebadores son utilizados en una mezcla que permite la amplificación 10 separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4. En consecuencia, la presente invención se refiere a una mezcla de cebadores múltiples que contiene al menos un par de cebadores como se describe anteriormente, para la amplificación del exón 2, un par de cebadores como se 15 describe anteriormente, para la amplificación del exón 3 y un par de cebadores como se describe anteriormente, para la amplificación del exón 4. En una modalidad específica, la mezcla de cebadores múltiples para la amplificación del exón 2, el 20 exón 3 y el exón 4 comprende los siguientes grupos de cebadores : para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A: ' -f-fi'ffir r-ri-'fr ^jj^j^gg¡^ftg^*¡ para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-B: para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-C: LL, ¡M***l¿ Los cebadores de la invención pueden ser marcados. La marcación puede ser llevada a cabo mediante cualquier método conocido para la persona experta en la técnica. La naturaleza del marcador puede ser isotópica (32P, 35S, etc.) o no isotópica (biotina, digoxigenina, etc . ) . Los oligonucleótidos utilizados como cebadores pueden también comprender análogos de nucleótido tales como fosforotiatos (Matsukura et al., 1987), alquilfosforotiatos (Miller et al., 1979) o ácidos nucleicos peptídicos (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993) o pueden contener agentes de intercalación (Asseline et al., 1984). Como la mayoría de las otras variaciones o modificaciones introducidas dentro de las secuencias de ADN original de la invención, estas variaciones necesitarán adaptaciones con respecto a las condiciones bajo las cuales el oligonucleótido debe ser utilizado para tener la especificidad y sensibilidad requeridas. No obstante, los resultados eventuales de la hibridación serán esencialmente los mismos que aquellos obtenidos con los oligonucleótidos 5 no modificados. La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa con el fin de influenciar positivamente las características tales como las cinéticas de hibridación, la reversibilidad de la formación del híbrido, la estabilidad biológica de las moléculas de 10 oligonucleótidos, etc. La presente invención también se refiere al uso de los cebadores, los grupos de cebadores y/o las mezclas de cebadores de la invención, en un método para la amplificación específica del locus y separada del exón 2, 15 el exón 3 y/o el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C. La presente invención también se refiere a un método para la tipificación o subtipificación de uno o más de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra que comprende los siguientes pasos: 20 i) si es necesario, la liberación, el aislamiento y/o la concentración de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra; ii) la amplificación de los ácidos nucleicos de acuerdo a la invención; . I r trm^ affltrMMM iii) la tipificación de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C específicos, presentes en dicha muestra. La liberación, concentración y aislamiento de los ácidos nucleicos provenientes de la muestra, pueden ser realizadas mediante cualquier método conocido en la técnica. Actualmente, son disponibles diversos equipos comerciales tales como el Equipo Sanguíneo QIAamp Blood Kit de Qiagen (Hilden, Alemania) para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras sanguíneas o el "Equipo de Preparación de Plantilla de PCR de Alta Pureza" (Roche Diagnostics, Bruselas, Bélgica) . Otros procedimientos bien conocidos para el aislamiento del ADN o el ARN a partir de una muestra biológica son también disponibles (Sambrook et al., 1989). Los ácidos nucleicos son subsecuentemente amplificados mediante el método de la invención descrita anteriormente. Los productos de este paso de amplificación son luego idealmente adecuados para la tipificación del alelo específico presente en la muestra. Actualmente son conocidos 169 diferentes alelos de HLA-A, 332 diferentes alelos de HLA-B y 87 diferentes alelos de HLA-C. La tipificación de estos alelos puede ser realizada mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como el análisis dúplex de los productos de PCR (Clay et al., 1994) , el análisis de polimorfismo conformacional de una sola hebra del producto de PCR (PCR-SSCP; Yoshida et al., si-n» 1992), la tipificación basada en la secuencia (SBT; Santamaría et al., 1992 y 1993), el uso de los cebadores específicos de la secuencia en la reacción de PCR (PCR-SSP; Olerup y Zetterquist, 1991) , el uso de PCR en combinación con el sondeo de oligonucleótido específico de la secuencia (PCR-SSOP; Saiki et al., 1986), el manchado por puntos convencional. El manchado de southern, el emparedado o sondeo mediante manchado por puntos inverso (Saiki et al., 1989) . Con el fin de obtener resultados rápidos y fáciles si está involucrada una multitud de sondas, puede ser conveniente un formato de hibridación inversa. En consecuencia, en una modalidad preferida las sondas seleccionadas son movilizadas para ciertas localizaciones sobre un soporte sólido y los ácidos polinucleicos amplificados son marcados con el fin de hacer posible la detección de los híbridos formados. El término "soporte sólido" puede referirse a cualquier sustrato al cual puede ser acoplada una sonda de oligonucleótido, con la condición de que éste conserve las características de hibridación y con la condición de que el nivel antecedente de la hibridación permanezca bajo. Usualmente, el sustrato sólido será una placa de microtitulación (por ejemplo en la técnica de DEIA) , una membrana (por ejemplo nailon o nitrocelulosa) o una microesfera (pelotilla) o una lasca o microplaca. .Antes de la aplicación a la membrana o la fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico con el fin de facilitar la fijación o mejorar la eficiencia de hibridación. Tales modificaciones pueden abarcar la formación de cola homopolimérica, el acoplamiento con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH2, grupos SH, grupos carboxílicos, o el acoplamiento con biotina, haptenos o proteínas . La presente invención se refiere además a un equipo de diagnóstico para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra que comprende los siguientes componentes: i) cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en la muestra; ii) un grupo de cebadores o una mezcla de cebadores de acuerdo a la invención; iv) un medio para la tipificación de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C específicos, presentes en la muestra. Un equipo de diagnóstico específico y muy amigable con el usuario es el Ensayo de Sonda en Línea para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra que comprende los siguientes componentes: J ^t?M tSk i) cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácido nucleicos presentes en la muestra; ii) un par de cebadores o una mezcla de 5 cebadores de acuerdo a la invención; iii) al menos una sonda que se hibrida específicamente con uno de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C, fijados a un soporte sólido; iv) un amortiguador de hibridación, o los 10 componentes necesarios para la producción de dicho amortiguador; v) una solución de lavado, o los componentes necesarios para la producción de dicha solución; vi) cuando sea apropiado, un medio para detectar 15 los híbridos resultantes de la hibridación precedente. En esta modalidad, el grupo seleccionado de sondas es inmovilizado a una tira de membrana de una manera lineal. Las sondas pueden ser inmovilizadas individualmente o como mezclas a los sitios delineados. 20 Los ácidos polinucleicos de HLA-A, HLA-B o HLA-C amplificados pueden ser marcados con biotina, y el híbrido puede ser luego detectado, vía un acoplamiento de biotina- estreptavidina con un sistema de revelado de color no radioactivo.

El término "amortiguador de hibridación" significa un amortiguador que permite una reacción de hibridación entre las sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los productos amplificados, bajo las condiciones de exigencia apropiadas. El término "solución de lavado" significa una solución que hace posible el lavado de los híbridos formados bajo las condiciones de exigencia apropiadas. La presente invención también se refiere al uso de los cebadores, los grupos de cebadores y/o las mezclas de cebadores de la invención para la fabricación de un equipo de diagnóstico o Ensayo de Sonda en Línea para la tipificación de HLA de la Clase I. A todo lo largo de la especificación y las reivindicaciones siguientes, a no ser que el contexto lo requiera de otro modo, la palabra "comprenden", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero establecido o un paso o grupo de números enteros establecidos o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o paso o grupo de números enteros o pasos .

LEYENDAS DE LAS FIGURAS Las figuras IÍV-IF. Alineamiento de las 29 secuencias del intrón 2 de HLA-A. La secuencia de consenso es mostrada sobre la parte superior de la figura. Los nucleótidos que se conforman a la secuencia de consenso son indicados con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso, son indicados. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. El secuenciamiento fue llevado a cabo de acuerdo al Ejemplo 1. Las figuras 2A-2F. Alineamiento de las 38 secuencias del intrón 2 de HLA-B. La secuencia de consenso es mostrada sobre la parte superior de la figura. Los nucleótidos que se conforman a la secuencia de consenso son indicados con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso, son indicados. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. El secuenciamiento fue llevado a cabo de acuerdo al Ejemplo 1. Las figuras 3A-3F. Alineamiento de las 13 secuencias del intrón 2 de HLA-C. La secuencia de consenso es mostrada sobre la parte superior de la figura. Los nucleótidos que se conforman a la secuencia de consenso son indicados con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso, son indicados. N indica la ausencia .1J de un nucleótido en esa posición. El secuenciamiento fue llevado a cabo de acuerdo al Ejemplo 1. Las figuras 4A-4J. Alineamiento de las 12 secuencias del intrón 3 de HLA-A. La secuencia de consenso es mostrada sobre la parte superior de la figura. Los nucleótidos que se conforman a la secuencia de consenso son indicados con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso, son indicados. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. Las figura 5A-5J. Alineamiento de las 22 secuencias del intrón 3 de HLA-B. La secuencia de consenso es mostrada sobre la parte superior de la figura. Los nucleótidos que se conforman a la secuencia de consenso son indicados con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso, son indicados. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. Las figuras 6A-6J. Alineamiento de las 12 secuencias del intrón 3 de HLA-C. La secuencia de consenso es mostrada sobre la parte superior de la figura. Los nucleótidos que se conforman a la secuencia de consenso son indicados con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso, son indicados. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. Figura 7. Resultados de un Ensayo de Sonda en Línea para la tipificación de HLA-A como se indica en el Ejemplo 5. Los ácidos nucleicos fueron amplificados mediante el uso de: (A) 5APBio (cebador delantero; SEQ ID NO. 144) y 3APBio (cebador inverso; SEQ ID NO. 147) para la amplificación del exón 2 y el exón 3 de HLA-A en un amplicón simple; (B) la mezcla de cebadores múltiples para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A. Las sondas con los números 1, 4, 9, 10, 12 y 13 muestran claramente una señal más fuerte después de la hibridación con los amplicones obtenidos mediante el uso de la mezcla de cebadores múltiples (tira B) . Figura 8. Resultados de un Ensayo de Sonda en Línea para la tipificación de HLA-B como se indica en el Ejemplo 6. Los ácidos nucleicos fueron amplificados mediante el uso de: (B) IBPinl (cebador delantero; SEQ ID NO. 145) e IBPin3 (cebador inverso; SEQ ID NO. 148) para la amplificación del exón 2 y el exón 3 de HLA-B en un amplicón simple; (B) la mezcla de cebadores múltiples para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-B. Las sondas con los números 9, 10, 18, 19, 20, 34 y 35 muestran claramente una señal más fuerte después de la hibridación con los amplicones obtenidos mediante el uso de la mezcla de cebadores múltiples (tira B) .

TABLAS Tabla 1. Cebadores inversos utilizados para la amplificación del exón 2 de HLA-A. . y, I.J..

??. Tabla 2. Cebadores delanteros utilizados para la amplificación del exón 3 de HLA-A. .¿ n *"*-- ?* *. M, m^^s i^ Tabla 3. Cebadores inversos utilizados para la amplificación del exón 3 de HLA-A. 10 15 20 ¿¿¿¿¿¿^j^^ . t ^ZsJ&s&á Tabla 4. Cebadores delanteros utilizados para la amplificación del exón 4 de HLA-A.

Tabla 5. Cebadores inversos utilizados para la amplificación del exón 2 de HLA-B. k .„ Tabla 6. Cebadores delanteros utilizados para la amplificación del exón 3 de HLA-B. y. , Tabla 7. Cebadores inversos utilizados para la amplificación del exón 3 de HLA-B. li- 10 Tabla 8. Cebadores delanteros utilizados para la 15 amplificación del exón 4 de HLA-B. 20 .1. Lím, ,1 j^ Tabla 9. Cebadores inversos utilizados para la amplificación del exón 2 de HLA-C.

Tabla 10. Cebadores delanteros utilizados para la amplificación del exón 3 de HLA-C.

Tabla 11. Cebadores delanteros utilizados para la amplificación del exón 4 de HLA-C. 10 15 20 vitWBr -t-fi»ñát ? ?-* ... ,..Ll - .

' -* »--**- Jj. -* - * •* * EJEMPLOS Ejemplo 1 Determinación de la secuencia del nitron 2 de diversos alelos de HLA-A, HLA-B y HLA-C Fueron preparados los ácidos nucleicos a partir de diferentes muestras de sangre mediante el uso del equipo sanguíneo QIAamp Blood Kit (Quiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante. Parte del exón 1, del intrón 2, del exón 2, intrón 2 y del exón 3 de HLA-A fueron amplificados mediante el uso del siguiente grupo de cebadores : B = biotina.

Fueron amplificados el exón 2, el intrón 2 y el exón 3 de HLA-B mediante el uso del siguiente grupo de cebadores : B = biotina.

Fueron amplificados el exón 2, el intrón 2 y el exón 3 de HLA-C mediante el uso del siguiente grupo de cebadores : B = biotina, El ciclo de reacción de PCR estuvo compuesto de los siguientes pasos: 1 min a 96°C 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 64°C; 50 seg a 72°C) ; 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 62°C; 50 seg a 72°C) ; 10 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 60°C; 50 seg a 72°C) ; 15 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 55°C; 50 seg a 72°C) ; 5 min a 72°C. La reacción de amplificación fue llevada a cabo en Tris-HCl 50 mM, pH 9.2, sulfato de amonio 16 mM, dNTPs 200 µM, 2.5 U de polimerasa Taq, cloruro de magnesio 1.5 mM 15 pmol de cada cebador y 0.1 a 0.5 µg de .ADN.

I i., El amplicón resultante fue clonado en el vector pGEMTt (Promega, Madison, Wl , EUA) . El análisis de la secuencia de nucleótidos fue realizado mediante el uso de un secuenciador automático de ADN Modelo 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) con los didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia (Equipo de Secuenciamiento de Ciclo Terminador con Colorante de Reacción PrismRM Ready; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) . Los cebadores utilizados para la reacción de secuenciamiento fueron los mismos para el paso de amplificación. 29 secuencias del intrón 2 fueron obtenidas para HLA-A, 38 para HLA-B, y 13 para HLA-C. Las secuencias son mostradas en las figuras 1, 2 y 3, respectivamente.

Ejemplo 2: Amplificación del exón 2 y del exón 3 de HLA-A Los ácidos nucleicos fueron preparados a partir de diferentes muestras sanguíneas mediante el uso del equipo sanguíneo QIAamp Blood Kit (Quigen, Hilden, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante. Con base en el alineamiento de la secuencia de las secuencias del intrón-2 de HLA-A (figura 1) , se diseñó un cebador inverso y uno delantero, específico del locus, para la amplificación específica del exón 2 y del exón 3 de HLA-A, respectivamente. Con estos cebadores, se construyó una mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 de HLA-A consistiendo de los siguientes 2 grupos de cebadores : 5 - para el exón 2: 5APBio (SEQ ID NO. 144) como cebador delantero y 5 'ATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 1) como cebador inverso; para el exón 3: 5 ' CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID No. 104) como cebador delantero y 3APBio (SEQ ID No. 10 147) como el cebador inverso. El ciclo de reacción de PCR estuvo compuesto de los siguientes pasos: 5 min a 96°C 35 veces (30 seg a 96°C; 20 seg a 58°C; 30 seg a 15 72°C) ; 10 min a 72°C La reacción de PCR se llevó a cabo en Tris-HCl a 10 mM, pH 8.3, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1.5 mM, 0.001% (p/v) de gelatina, 200 µM de los 20 dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmol de cada cebador y una unidad de AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) . La longitud de los productos de PCR obtenidos fue verificado sobre un gel de agarosa de acuerdo a Sambrook y colaboradores (1989) . 25 Í-.?fat¿S* ¡aB«m& i&íá' fá?M,*..

Ejemplo 3: Amplificación del exón 2 y exón 3 de HLA-B Fueron preparados ácidos nucleicos a partir de diferentes muestras sanguíneas mediante el uso del equipo sanguíneo QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante. Con base en el alineamiento secuencial de las secuencias del intrón 2 de HLA-B (figura 2), se diseñaron un cebador inverso y un cebador delantero, específicos del locus, para la amplificación específica del exón 2 y del exón 3, de HLA-B respectivamente. Con estos cebadores, se construyó una mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 de HLA-B consistente de los siguientes 2 grupos de cebadores : - para el exón 2: IBPinl (SEQ ID No. 145) como cebador delantero y 5 'ACCCGCGGGGATTTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID No. 310) como cebador inverso; para el exón 3: 5 'ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID No. 121) como cebador delantero e IBPin3 (SEQ ID No. 148) como cebador inverso. El ciclo de reacción de PCR estuvo compuesto de los siguientes pasos: 5 min a 96°C 35 veces (30 seg a 96°C; 20 seg a 58°C; 30 seg a 72°C) ; 10 min a 72°C. La reacción de PCR se llevó a cabo en Tris-HCl a 10 mM, pH 8.3, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1.5 M, 0.001% (p/v) de gelatina, 200 µM de lo dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmol de cada cebador y 1 U de AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) . La longitud de los productos de PCR obtenidos fue verificada sobre un gel de agarosa de acuerdo a Sambrook y colaboradores (1989) .

Ejemplo 4: Amplificación del exón 2 y del exón 3 de HLA-C Fueron preparados ácidos nucleicos a partir de diferentes muestras sanguíneas mediante el uso del equipo sanguíneo QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante. Con base en el alineamiento secuencial de las secuencias del intrón 2 de HLA-C (figura 3), se diseñaron un cebador inverso y un cebador delantero, específicos del locus, para la amplificación específica del exón 2 y del exón 3, de HLA-C respectivamente. Con estos cebadores, se construyó una mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 de HLA-C consistente de los siguientes 2 grupos de cebadores : Ljy. para el exón 2: 5CIN1 (SEQ ID No. 146) como cebador delantero y 5 ' GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID No. 127) como cebador inverso; para el exón 3: 5' -TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID No. 139) como el cebador delantero y 3CIN3 (SEQ ID No. 149) como cebador inverso. El ciclo de reacción de PCR estuvo compuesto de los siguientes pasos: 5 min a 96°C 35 veces (30 seg a 96°C; 20 seg a 58°C; 30 seg a 72°C) ; 10 min a 72°C La reacción de PCR se llevó a cabo en Tris-HCl a 10 mM, pH 8.3, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1.5 mM, 0.001% (p/v) de gelatina, 200 µM de los dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmol de cada cebador y una unidad de AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) . La longitud de los productos de PCR obtenidos fue verificado sobre un gel de agarosa de acuerdo a Sambrook y colaboradores (1989) .

Ejemplo 5: Amplificación del exón , del exón 3 y del exón 4 de HLA-A Se recolectaron muestras sanguíneas de un donador Caucásico de B.A. R.C. (Gent, Bélgica) . Los ácidos nucleicos fueron preparados a partir de muestras sanguíneas mediante el uso del equipo sanguíneo QIAmp Blook Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante. 5.1 Mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2, del exón 3 y del exón 4 de HLA-A Se utilizó una mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2, del exón 3 y del exón 4 de HLA-A consistente de los siguientes grupos de cebadores: B = biotina li -, El ciclo de reacción de PCR estuvo compuesto de los siguientes pasos: 1 min a 96°C 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 64°C; 50 seg a 72°C) ; 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 62°C; 50 seg a 72°C); 10 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 60°C; 50 seg a 72°C) ; 15 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 55°C; 50 seg a 72°C) ; 5 min a 72°C. 4°C. La reacción de PCR se llevó a cabo en Tris-HCl a 50 mM, pH 9.2, sulfato de amonio 16 mM, cloruro de magnesio 1.5 mM, 200 µM de los dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5 U de polimerasa Taq (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA) , 20 pmol del cebador 5Apbio, 20 pmol del cebador 3x2Apbio, 40 pmol del cebador 5ex4Apbio, 40 pmol del cebador 3ex3Apbio, 15 pmol del cebador 5ex4Apbio, 15 pmol del cebador 3ex4Apbio y 0.1-0.5 µg de ADN. La longitud de los productos de amplificación obtenidos fue verificada sobre un gel de agarosa al 3% de acuerdo a Sambrook y colaboradores (1989) . Se obtuvieron 3 bandas de longitud diferente con relación respectivamente al exón 2 (559 pares de bases) , el exón 3 (439 pares de bases) y el exón 4 (380 pares de bases) de HLA-A. Mediante el uso de este protocolo, fueron amplificados los exones de HLA-A suficientemente fuertes para la tipificación subsecuente en un ensayo de hibridización. 5.2 Prueba de los productos de amplificación obtenidos en un ensayo de tipificación HLA-A Los amplicones HLA-A fueron subsecuentemente tipificados en un ensayo de hibridación inversa con base en la tecnología de LiPA (Stuyver y colaboradores, 1993) . Después del paso de amplificación como se describe anteriormente, los ácidos nucleicos amplificados fueron hibridizados a un panel de 36 sondas mediante el uso del equipo HLA-A LiPA (Innogenetics , Geng, Bélgica) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los resultados de esta hibridación inversa se muestran en la figura 7. Por comparación, también se obtuvo un producto de amplificación que comprendía el exón 2 y el exón 3 en un amplicón simple, mediante el uso de 5 APBio (cebador delantero; SEQ ID No. 144) y 3APBio (cebador inverso; SEQ ID No. 147) . La hibridación de este amplicón más grande a las sondas sobre la tira de LiPA se muestra también en la figura 7. la figura 7 ilustra claramente que los amplicones obtenidos mediante amplificación separada del » * » » - ------ ¡4y_ exón 2 y del exón 3 hacen posible una tipificación más clara y más pronunciada que el amplicón más grande obtenido por la amplificación del exón 2 y el exón 3 en un amplicón único.

Ejemplo 6: Amplificación del exón 2, del exón 3 y del exón 4 de HLA-B Se recolectaron muestras sanguíneas de un donador Caucásico de B.A. R.C. (Gent, Bélgica). Los ácidos nucleicos fueron preparados a partir de muestras sanguíneas mediante el uso del equipo sanguíneo QIAmp Blook Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante . 6.1 Mezcla de cebadores para la amplificación separada de exón 2, de exón 3 y de exón 4 de HLA-B Se utilizó una mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2, del exón 3 y del exón 4 de HLA-A consistente de los siguientes grupos de cebadores: tuivt l ir l B = biotina El ciclo de reacción de PCR estuvo compuesto de los siguientes pasos: 1 min a 96°C 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 64°C; 50 seg a 72°C) ; 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 62°C; 50 seg a 72°C) ; 10 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 60°C; 50 seg a 72°C) ; 15 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 55°C; 50 seg a 72°C) ; 5 min a 72°C. 4°C. La reacción de PCR se llevó a cabo en Tris-HCl a 50 mM, pH 9.2, sulfato de amonio 16 mM, cloruro de magnesio 1.5 mM, 200 µM de los dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5 U de polimerasa Taq (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA) 35 pmol del cebador IBPinlbio, 35 pmol del cebador IBPin2bio, 50 pmol del cebador IB5Pin2bio, 50 pmol del cebador IB3Pin3bio, 10 pmol del cebador 5ex4IBbio, 10 pmol del cebador 3ex4IBbio, y 0.1-0.5 µg de ADN. La longitud de los productos de amplificación obtenidos fue verificada sobre un gel de agarosa al 3% de acuerdo a Sambrook y colaboradores (1989) . Se obtuvieron 3 bandas de longitud diferente con relación respectivamente al exón 2 de HLA-B (555 pares de bases) , el exón 3 (446 pares de bases) y el exón 4 (323 pares de base) . Mediante el uso de este protocolo, fueron amplificados los exónes de HLA-A suficientemente fuertes para la tipificación subsecuente en un ensayo de sonda en línea. 6.2 Prueba de los productos de amplificación obtenidos en el ensayo de tipificación de HLA-B Los amplicones HLA-B fueron subsecuentemente tipificados en un ensayo de hibridación inversa con base en la tecnología de LiPA (Stuyver y colaboradores, 1993) . Después del paso de amplificación como se describe anteriormente, los ácidos nucleicos amplificados fueron hibridizados a un panel de 60 sondas mediante el uso del equipo HLA-B LiPA (Innogenetics , Geng, Bélgica) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los resultados de esta hibridación inversa se muestran en la figura 8. Para comparación, también se obtuvo un producto de amplificación que comprendía el exón 2 y el exón 3 en un amplicón único mediante el uso de de IBPinl (cebador delantero; SEQ ID No. 145) y IBPin3 (cebador inverso; SEQ ID No. 148) . La hibridización de este amplicón más grande a las sondas sobre la tira de LiPA se muestra también en la figura 8. La figura 8 ilustra claramente que los amplicones obtenidos mediante amplificación separada del exón 2 y del exón 3 hacen posible una tipificación más clara y más pronunciada que el amplicón más grande obtenido mediante la amplificación del exón 2 y el exón 3 en un amplicón único.

Ejemplo 7: Amplificación del exón 2, el exón 3 y el exón 4 del HLA-C Los ácidos nucleicos son preparados a partir de muestras sanguíneas mediante el uso del equipo sanguíneo QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante. Se utilizó una mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2, del exón 3 y el exón 4 del HLA-A consistente de los siguientes grupos de cebadores : ¿^^^¡^^^^^^¿^^^ ...-.

B = biotina El ciclo de reacción de PCR estuvo compuesto de los siguientes pasos: 1 min a 96°C 10 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 64°C; 50 seg a 72°C) ; 5 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 62°C; 50 seg a 72°C) ; 10 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 60°C; 50 seg a 72°C) ; 15 veces (30 seg a 96°C; 50 seg a 55°C; 50 seg a 15 72°C) ; 5 min a 72°C. 4°C. La reacción de PCR se llevó a cabo en Tris-HCl a 50 mM, pH 9.2, sulfato de amonio 16 mM, cloruro de magnesio 20 1.5 mM, 200 µM de los dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5 U de polimerasa Taq (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA) , 20 pmol de cada cebador y 0.1-0.5 µg de ADN. La longitud de los productos de amplificación 25 obtenidos fue verificada sobre un gel de agarosa al 3% de -. -feySC=.E¿_aaj^^^y^¿S^_ acuerdo a Sambrook y colaboradores (1989) . Se obtuvieron 3 bandas de longitud diferente con relación respectivamente al exón 2, al exón 3 y al exón 4 de HLA-C. Mediante el uso de este protocolo, son amplificados los exónes de HLA-C lo suficientemente fuertes para la tipificación subsecuente en un ensayo de sonda en línea.

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Claims

REIVINDICACIONES objetivo específica del locus en el intrón 3 respectivamente de HLA-A, HLA-B o HLA-C. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la secuencia 5 objetivo específica del locus está situada en: la posición 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A (figura 1) y/o la posición 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150, 501, 525, 561 ó 571 del intrón 3 de HLA-A (figura 4) ; o 10 - la posición 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B (figura 2) y/o la posición 42, 46, 65, 68, 96, 438, 502, 524, 547 o 571 del intrón 3 de HLA-B (figura 5); o la posición 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C (figura 3) y/o la posición 461, 477, 527, 545 ó 561 15 del intrón 3 de HLA-C (figura 6) . 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las posiciones constituyen el extremo 3' del cebador que es utilizado para la amplificación del exón 2, del exón 3 ó 20 del exón 4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el cebador es elegido de la siguiente lista: para la amplificación del exón 2 de HLA-A 25 (tabla 1) : 5 ' ATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 1) 5 ' GATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 2) 5 ' GGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 3) 5 ' YGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 4) 5 ' GYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 5) 5 ' GGYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3 ' (SEQ ID NO. 6) 5 ' GGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 7) 5 ' GGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 8) 5 ' AGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 9) 5 ' AAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO . 10) 5 ' CAAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3 ' (SEQ ID NO. 11) 5 ' CTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 12) 5 ' TCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 13) 5 ' CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 14) 5 ' CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 15) 5 ' GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 16) 5 ' GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3 ' (SEQ ID NO. 17) 5 ' TCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 18) 5 ' CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 19) 5 ' CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 20) 5 ' GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 21) 5 ' GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO. 22) 5 ' GGGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3 ' (SEQ ID NO . 23) 5 ' CCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO . 30) 5 ' GCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO. 31) 5 ' CGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO. 32) 5 ' GCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO. 33) 5 ' GGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO. 34) 5 ' AGGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3 ' (SEQ ID NO. 35) 5 ' AGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 36) 5 ' AAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 37) 5 ' WAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 38) 5 ' TWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 39) 5 ' GTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 40) 5 ' GGTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3 ' (SEQ ID NO. 41) 5 ' CCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 42) 5 'ACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 43) 5 ' AACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 44) 5?AACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3' (SEQ ID NO . 45) 5 ' GAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO. 46) 5 ' TGAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3 ' (SEQ ID NO . 47) 5 'YCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 48) 5 ' GYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO . 49) 5 ' YGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 50) 5 ' CYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO . 51) 5 ' CCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 52) 5 ' CCCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3 ' (SEQ ID NO. 53) para la amplificación del exón 3 de HLA-A (Tabla 2; Tabla 3) : 5 ' CGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 54) ij^^?^^^^^^^^^^^^^^^^j^^^^^^^^^ ,^1^.4^,^,^,»^^.^^^^*^,*.^.»fc.. . .. . . .. , . . . * .. A. M^m . Cm. , .... - tfat-ai&jM 5 ' ACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 55) 5 ' CACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 56) 5 ' CCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 57) 5 ' CCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 58) 5 ' CCCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3 ' (SEQ ID NO. 59) 5 ' GGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 60) 5 ' GGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 61) 5 ' CGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 62) 5 ' CCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO . 63) 5 ' TCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 64) 5 ' CTCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3 ' (SEQ ID NO. 65) 5 ' CCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 66) 5 ' RCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 67) 5 ' CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 68) 5 ' CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 69) 5 ' TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3 ' (SEQ ID NO. 70) 5?TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3' (SEQ ID NO. 71) 5 ' CCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 72) 5 ' CCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 73) 5 ' RCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 74) 5 ' CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 75) 5 ' CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO . 76) 5 ' TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3 ' (SEQ ID NO. 77) 5 ' CGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 84) 5 ' CCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 85) 5 ' GCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 86) 5 'AGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO . 87) 5 ' AAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 88) 5 ' GAAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3 ' (SEQ ID NO. 89) 5 5 ' GACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 90) 5 ' GGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 91) 5 ' GGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 92) 5 ' CGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 93) 5 ' GCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 94) 10 5 ' CGCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3 ' (SEQ ID NO. 95) 5 ' GACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 96) 5 ' AGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 97) 5 ' GAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 98) 5 ' CGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 99) 15 5 ' CCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 100) 5 ' YCCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3 ' (SEQ ID NO. 101) 5 ' GTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 102) 5 ' AGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 103) 5 ' CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 104) 20 5 ' TCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO . 105) 5 ' TTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 106) 5 ' TTTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3 ' (SEQ ID NO. 107) 5 'AGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 150) 5 ' CAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 151) 25 5 ' CCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 152) iáí-ííS a-n-ít»T-l*fr-»ftl»l.- * - •— - - - . . 5 ' GCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 153) 5 ' GGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 154) 5 ' AGGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3 ' (SEQ ID NO. 155) 5 ' CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 156) 5 5 ' CCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 157) 5 ' TCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 158) 5 ' CTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 159) 5 ' TCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 160) 5 ' GTCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3 ' (SEQ ID NO. 161) 10 5 ' CCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 162) 5 ' TCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 163) 5 ' GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 164) 5 ' GGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 165) 5 ' TGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 166) 15 5 ' TTGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3 ' (SEQ ID NO. 167) 5 ' CTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 168) 5 ' TCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 169) 5 ' TTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 170) 5 ' ATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 171) 20 5 ' TATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 172) 5 ' ATATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3 ' (SEQ ID NO. 173) 5 ' GGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 174) 5 ' AGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 175) 5 ' GAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 176) 25 5 ' GGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 177) 5 ' GGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 178) 5 ' AGGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3 ' (SEQ ID NO. 179) 5 ' GGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 180) 5 ' GGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 181) 5 5 ' AGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 182) 5 ' GAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 183) 5 ' AGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 184) 5 ' CAGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3 ' (SEQ ID NO. 185) 5 ' CCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 186) 10 5 ' ACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 187) 5 'AACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO. 188) 5?AACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3' (SEQ ID NO . 189) 5 ' GAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO . 190) 5 ' GGAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (SEQ ID NO . 191) 15 5 'AGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 192) 5 ' CAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 193) 5 ' ACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 194) 5 ' TACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 195) 5 ' GTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO. 196) 20 5 ' GGTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3 ' (SEQ ID NO . 197) 5 ' TCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 198) 5 ' CTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' ( SEQ ID NO . 199) 5 ' CCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 200) 5 'ACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 201) 25 5 'AACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO. 202) *JI*?Í»**~* A~ ... .... .? Ll.. 5 ' GAACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3 ' (SEQ ID NO . 203) para la amplificación del exón 4 de HLA-A (Tabla 4) : 5 ' TTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 204) 5 ' GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 205) 5 ' GGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 206) 5 ' GGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 207) 5 ' TGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO . 208) 5 ' CTGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3 ' (SEQ ID NO. 209) 5 ' GGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 24) 5 ' RGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 25) 5 ' CRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 26) 5 ' CCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 27) 5 ' CCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO . 28) 5 ' TCCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3 ' (SEQ ID NO. 29) 5 ' CTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 210) 5 ' GCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 211) 5 ' TGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 212) 5'RTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3' (SEQ ID NO. 213) 5 ' YRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 214) 5 ' GYRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3 ' (SEQ ID NO. 215) 5 ' GTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 216) 5 ' TGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO . 217) 5 ' GTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 218) 5 'AGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 219) « » . .1 ttjt» , I.J - . I . -. J^.Z<ré¿k'? 5 ' GAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 220) 5 ' GGAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3 ' (SEQ ID NO. 221) para la amplificación del exón 2 de HLA-B (Tabla 5) : 5 ' ACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 108) 5 ' AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 109) 5 ' CAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO . 110) 5 ' CCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO . 111) 5 ' CCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 112) 5 ' GMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 113) 5 ' YGMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3 ' (SEQ ID NO. 314) para la amplificación del exón 3 de HLA-B (Tabla 6; Tabla 7) : 5 ' CYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 114) 5 ' CCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 115) 5 ' GCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 116) 5 ' GGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 117) 5 ' CGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 118) 5 ' CCGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3 ' (SEQ ID NO. 119) 5 ' CCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 120) 5 ' ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 121) 5 ' TACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 122) 5 ' TTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 123) 5 ' TTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 124) 5 ' GTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 125) L,y.->.. _^ , • —• - >. ^aw-i-Bá- 5 ' CGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 222) 5 ' GCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 223) 5 ' CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3 ' (SEQ ID NO. 224) 5 ' CGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 225) 5 ' TCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 226) 5 ' CTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 227) 5 ' TCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 228) 5 ' TTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO . 229) 5 ' CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3 ' (SEQ ID NO. 230) 5 ' TCTCGTKGGAGSCCATCCCC3 ' (SEQ ID NO . 231) 5 ' TTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3 ' (SEQ ID NO. 232) 5 ' CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3 ' (SEQ ID NO. 233) 5 ' TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3 ' (SEQ ID NO. 234) 5 ' YTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3 ' (SEQ ID NO. 235) 5'CYTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (SEQ ID NO. 236) 5 ' GATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 237) 5 ' TGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 238) 5 ' CTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 239) 5 ' GCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 240) 5 ' CGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 241) 5 ' GCGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3 ' (SEQ ID NO. 242) 5 ' GCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 243) 5 ' CGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 244) 5 ' GCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 245) 5 ' AGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3 ' (SEQ ID NO. 246) t t taaa ,. *-« 5 ' TGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 270) 5 ' CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 271) 5 ' KCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 272) 5 ' GKCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3 ' (SEQ ID NO. 273) 5 ' TSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 274) 5 ' GTSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 275) 5'TGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (SEQ ID NO. 276) 5 ' GTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 277) 5 ' GGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 278) 5 ' GGGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3 ' (SEQ ID NO. 279) 5 ' GWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 280) 5 ' TGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 281) 5 ' CTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 282) 5 ' CCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 283) 5 ' GCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 284) 5 ' CGCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3 ' (SEQ ID NO. 285) para la amplificación del exón 2 de HLA-C (Tabla 9) : 5 ' GTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 126) 5 ' GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 127) 5 ' CGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 128) 5 ' CCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 129) 5 ' YCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 130) 5 ' CYCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3 ' (SEQ ID NO. 131) J£^|£ 'fot tr'ií *~ A- '••-¿~*- - ' •* para la amplificación del exón 3 de HLA-C (Tabla 10) : 5 ' CGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 132) 5'TCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (SEQ ID NO. 133) 5 ' GTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 134) 5'GGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (SEQ ID NO. 135) 5'GGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (SEQ ID NO. 136) 5 ' CGGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3 ' (SEQ ID NO. 137) 5 ' CGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 138) 5 ' TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO . 139) 5 ' CTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 140) 5 ' CCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 141) 5 ' CCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 142) 5 ' ACCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (SEQ ID NO. 143) - para la amplificación del exón 4 de HLA-C (Tabla 11) : 5 ' GTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 286) 5 ' GGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 287) 5 ' AGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 288) 5 ' CAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 289) 5 ' CCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 290) 5 ' CCCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3 ' (SEQ ID NO. 291) 5 ' TGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 292) 5 ' CTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 293) 5 ' GCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3 ' (SEQ ID NO. 294) --Ü-- • para HLA-A; 5APBÍO: B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC (SEQ ID No. 144); o • para HLA-B; IBPinl : B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG (SEQ ID NO. 145) ; O • para HLA-C; 5CIN1 : B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA (SEQ ID NO. 146) . 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes cebadores inversos: • para HLA-A; 3ex4APBio: B-TTGGGCAGACCCTCATGCTGC (SEQ ID Np. 311); o • para HLA-B; 3ex4IBbio: B-TCGGCAGCCCCTCATGCTGT (SEQ ID No . 312); o • para HLA-C; 3ex4ICbio* B- CATCTCAGGGTGMRGGGCTT (SEQ ID No . 313) . 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque: la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes grupos de cebadores: • para HLA-A; 5APBio: (B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC; SEQ ID No. 144) y 3ex2Apbi? (B-ATCTCGGACCCGGAGACTGT; SEQ ID No. 1); • para HLA-B; IBPinl : (B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG; SEQ ID No. 145) y IB3Pin2bi? (B-AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC; SEQ ID No . 109); • para HLA-C; 5CIN1 : (B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA; SEQ ID No. 146) e IC3Pin2bi? (B-GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT; SEQ ID NO. 127) ; la amplificación del exón 3 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes grupos de cebadores: • para HLA-A; 5ex3APBio (B-CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC; SEQ ID No. 104) y 3ex3APbi? (B-CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG; SEQ ID No . 156); • para HLA-B; IB5Pin2bio (B-CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG; SEQ ID NO. 224) y IB3Pin3bí? (B-TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC; SEQ ID NO. 234); • para HLA-C; IC5Pin2bio (B-TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT; SEQ ID NO. 139) y 3CIN3 (B-GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT; SEQ ID No. 149); la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes grupos de cebadores: • para HLA-A; 5ex4APbio (B-GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT; SEQ ID No. 205) y 3ex2APbio (B-TTGGGCAGACCCTCATGCTGC; SEQ ID No. 311); • para HLA-B; 5ex4IBbi? (B- TCACATGGGTGGTCCTAGG; SEQ ID No. 267) y 3ex4IBbio (B- TCGGCAGCCCCTCATGCTGT; SEQ ID No . 312); • para HLA-C; 5ex4ICbio y > ^*.»t.a- ¡Éi l iií I ffiíll tn-- *^-- - ... J » *.? . ........ ..... y-.^..-,.. „ , -.„ .,>,,.' , »,,-,, ***t c.. (B-TCTCAGGATRGTCACATGGSC; SEQ ID No. 299) y 3ex4ICbÍ? (B-CATCTCAGGGTGMRGGGCTT; SEQ ID No. 313); 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque el exón 2 y el exón 3 de HLA-A, HLA-B o HLA-C son amplificados mediante el uso de una mezcla de cebadores múltiples que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque los tres exones, el exón 2, el exón 3 y el exón 4, de HLA-A, HLA-B o HLA-C son amplificados mediante el uso de una mezcla de cebadores múltiples que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2, al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 4. 10. Un cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 2 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. 11. Un cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 3 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. - -li 12. Un cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. 13. Un grupo de cebadores consistente de una combinación de un cebador delantero y un cebador inverso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 2 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. 14. Un grupo de cebadores consistente de una combinación de un cebador delantero y un cebador inverso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 3 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. 15. Un grupo de cebadores consistente de una combinación de un cebador delantero y un cebador inverso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 4 de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C. 16. Una mezcla de cebadores múltiples, caracterizada porque contiene al menos un grupo de cebadores de conformidad con la reivindicación 13, para la amplificación del exón 2 y un grupo de cebadores de conformidad con la reivindicación 14 para la amplificación del exón 3. Í 17. Una mezcla de cebadores múltiples, caracterizada porque contiene al menos un grupo de cebadores de conformidad con la reivindicación 13, para la amplificación del exón 2, un grupo de cebadores de conformidad con la reivindicación 14 para la amplificación del exón 3 y un grupo de cebadores de conformidad con la reivindicación 15 para la amplificación del exón 4. 18. Un método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra, caracterizado el método porque comprende los pasos de : (i) si es necesario, la liberación, aislamiento y/o concentración de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra; (ii) la amplificación de los ácidos nucleicos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; (iii) la tipificación de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C específicos, presentes en la muestra. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el paso de tipificación se lleva a cabo mediante hibridación con una o más sondas adecuadas . 20. Un equipo de diagnóstico para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra, caracterizado el equipo porque comprende los siguientes componentes: (i) cuando sea apropiado, un medio para la liberación, aislamiento o concentración de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra; (ii) un grupo de cebadores o una mezcla de cebadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17; (iii) un medio para la tipificación del alelo de HLA-A, HLA-B o HLA-C específico, presente en dicha muestra. 21. Un ensayo de sonda en línea para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos de HLA-, HLA-B o HLA-C en una muestra, caracterizado el ensayo porque comprende los siguientes componentes: (i) cuando sea apropiado, un medio para la liberación, aislamiento o concentración de los ácidos nucleicos presentes en la muestra; (ii) un par de cebadores o una mezcla de cebadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17; (iii) al menos una sonda que se hibrida específicamente con el exón 2, el exón 3 o el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C, fijado a un soporte sólido; (iv) un amortiguador de hibridación, o los componentes necesarios para la producción del amortiguador; (v) una solución de lavado, o los componentes necesarios para la producción de la solución; (vi) cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos resultantes de la hibridación precedente. iyy^fí^fft