MXPA01004469A - Prueba de diagnostico para la tuberculosis. - Google Patents

Abstract

Un metodo de diagnostico en una infeccion de un huesped por o mediante la exposicion a una micobacteria que exprese el ESAT-6, que comprende (i) poner en contacto una poblacion de celulas T del huesped, con uno o mas peptidos o analogos seleccionados de los peptidos representados por las SEC. ID Numeros 1 a 11 y analogos de los mismos, que pueden enlazarse a un receptor de las celulas T que reconoce cualesquiera de los peptidos, e (ii) determinar si las celulas T de la poblacion de celulas T reconocen el (los) peptido (s) y/o analogo (s) El metodo puede llevarse a cabo in vivo. Se proporcionan los peptidos y un estuche que permite llevar a cabo el metodo.

Description

PRUEBA DE DIAGNOSTICO PARA LA TUBERCULOSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método de diagnosis de la infección micobacteriana, particularmente a la infección por la Mycobacterium tuberculosis . Se refiere también a péptidos y a un estuche que se puede usar para llevara a cabo el método de diagnóstico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las pruebas de diagnósticos actuales para la enfermedad tuberculosis, son lentas o no confiables. Las pruebas que se basan en la identificación de la micobacteria que causa la tuberculosis son lentas debido a que el cultivo de la micobacteria puede tomar un tiempo de hasta 8 semanas. En algunos casos es imposible cultivar las bacterias. Además, la obtención de muestras para detectar la presencia de la micobacteria, requiere a menudo de procedimientos invasivos . Una prueba alternativa es la prueba dérmica de tuberculina (TST) o prueba de Mantoux que se basa en la detección de una respuesta a la hipersensibilidad del tipo retardada (DTH) a una administración intradérmica de un Derivado Proteinico Purificado de la micobacteria. Aunque R?F. : 129136 esta prueba toma menos tiempo que las pruebas que se basan en la identificación de la micobacteria, es menos confiable debido al uso diseminado de la BCG como una vacuna contra la tuberculosis. La BCG está estrechamente relacionada con la M. tuberculosis y por lo tanto los individuos que han sido vacunados con la BCG pueden reacción positivamente a una TST. Además, una gran proporción de personas con tuberculosis activa no son detectadas por una TST, debido a la anergia inmune cutánea. De esta manera, la TST tiene una baja especificidad y sensibilidad. Usando un ensayo que detecte la liberación de IFN-? de las células T los inventores han descubierto 8 péptidos de la proteina ESAT-6 de la M. tuberculosis que son reconocidos por las células T de una gran proporción de pacientes con tuberculosis y en particular el péptido representado por la SEC. ID No. 1 es reconocido por el 57% de pacientes sometidos a prueba y 68% de contactos saludables sometidos a la prueba. Estos contactos han sido expuestos a la tuberculosis pulmonar abierta. Los inventores han combinado estos péptidos en un panel de péptidos que cuando se usan junto con una prueba de diagnóstico proporcionan una especificidad de 91.5% y una sensibilidad de 96%. Los inventores han encontrado también otros tres péptidos de la ESAT-6 que son reconocidos por las células T de pacientes con tuberculosis que pueden usarse para incrementar la sensibilidad de la prueba de diagnóstico. Ventajosamente la BCG no tiene el gen de la ESAT-6 y por lo tanto, a diferencia de las pruebas previas, incluyendo la TST, la prueba de diagnóstico puede distinguir entre pacientes con tuberculosis y pacientes que han sido vacunados con la BCG. Brandt et al. (1996), Journal of Immunology, 157,3527-33 describe epitopos de la ESAT-6 que son reconocidos por los ratones. Sin embargo no es posible predecir, en base a los epitopos que son reconocidos en ratones, qué epitopos serán reconocidos en humanos. Asi como otras diferencias en el procesado, presentación y reconocimiento de epitopos, los ratones tienen diferentes moléculas MHC que la de los humanos, y por lo tanto se espera que reconozcan diferentes epitopos a los de humanos. Esto se demuestra por el hecho de que Brandt et al encuentra el reconocimiento de epítopos en ratones que no se encuentran reconocidos en humanos por los inventores de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método de diagnóstico de la infección en un huésped, o la exposición de un huésped a la micobacteria que expresa la ESAT-6 que comprende (i) poner en contacto una población de células T del huésped, con uno o más péptidos o análogos seleccionados de los péptidos representados por la SEC. ID No. : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, y análogos de los mismos, que puedan enlazarse a un receptor de las células T que reconozca cualesquiera de los péptidos, pero no (a) la SEC. ID No.: 3 ó 5 o un análogo de la misma, solamente, ni (b) una combinación de péptidos y/o análogos seleccionados de la SEC. ID No.: 3 y 5 y análogos de los mismos; e (ii) determinar si la células T de la población de células T reconocen el (los) péptido (s) y/o análogo (s). Preferentemente se usa al menos el péptido representado por la SEC. ID No.:l o un análogo del mismo. En otras modalidades preferidas se usan al menos todos los péptidos representados por: las SEC. ID No.:l, 5, 6 y 8; o por las SEC. ID Números: 1 a 8. La invención proporciona también un estuche para llevar a cabo el método, que contiene uno o más de los péptidos o análogos y opcionalmente un medio para detectar el reconocimiento del péptido por la célula T. La invención proporciona adicionalmente un péptido con la secuencia de la SEC. ID No. : 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, o un análogo del mismo, y un polinucleótido que sea capaz de ser expresado para proporcionar el péptido o análogo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las secuencias de las SEC. ID Números: 1 a 11 se presentan a continuación: SEC. ID No. 1: MTEQQ NFAGIEAAA (ESI) SEC. ID No. 2: SAIQGNVTSIHSLLD (ES4) SEC. ID No. 3: QK DATATELNNALQ (ES12) SEC. ID No. 4 NNALQNLARTISEAG (ESI4) SEC. ID No. 5: NLAR ISEAGQAMAS (ES15) SEC. ID No. 6: NFAGIEAAAS IQG (ES2) SEC. ID No. 7 EGKQSLTKLAAA GG (ES7) SEC. ID No. 8 YQGVQQK DATATEL (ES11) SEC. ID No. 9: NVTSIHSLLDEGKQS (ES5) SEC. ID No. 10: IEAAASAIQGNVTSI (ES3) SEC. ID No. 11: TATELNNALQNLART (ES13) El huésped es generalmente un humano pero puede ser un animal, típicamente uno que pueda ser infectado natural o artificialmente por una micobacteria. El huésped puede ser un mamífero, tal como un primate, vaca, oveja, cerdo, tejón o roedor, por ejemplo un ratón o rata. El huésped tiene típicamente una infección micobacteriana activa o latente, o ha tenido esa infección recientemente. El huésped puede ser positivo o negativo a la prueba en una prueba de Mantoux. El huésped puede estar en riesgo de una infección micobacteriana, típicamente por razones socioeconómicas o puede tener una predisposición genética o adquirida a la infección micobacteriana. El huésped puede ser un contacto saludable que haya estado expuesto a una micobacteria. Típicamente la exposición es a la tuberculosis pulmonar, tal como la tuberculosis pulmonar "abierta" que es positiva al frotis de a.f.b. (bacilo ácido-fijo) de esputo. De esta manera, el método se puede usar para localizar los contactos saludables de individuos con esas infecciones por tuberculosis. El método se puede usar también para llevar a cabo encuestas poblacionales para medir el número de individuos en una población, que tienen una infección micobacteriana o que son contactos saludables. La micobacteria expresa la ESAT-6.

Generalmente, la ESAT-6 tiene una secuencia que comprende una o más de las secuencias representadas por la SEC. ID No.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 o uno o más homólogos de estas secuencias. Esos homólogos pueden enlazarse a un receptor de células T que reconozca el péptido equivalente representado por la SEC. ID No. : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 y/o puede inhibir el enlazamiento a un receptor de células T del péptido equivalente. La micobacteria es generalmente la M. tuberculosis . La micobacteria puede ser la M. marinum o M. kansasii . Se puede usar el patrón de los síntomas clínicos para distinguir entre estos dos organismos y la M. tuberculosis. La micobacteria puede ser la M. bovis . Esta puede infectar a los humanos. Las células T que reconocen el péptido en el método son generalmente células T que han sido sensibilizadas previamente in vivo al antígeno de una micobacteria. Estas células T que han tenido experiencia con el antígeno se encuentran generalmente presentes en la sangre periférica de un huésped que ha sido expuesto a la micobacteria, a una frecuencia de 1 en 106 a 1 en 103 células monbnucleares de la sangre periférica (PBMC) . Las células T pueden ser las células T CD4 y/o CD8. Se comprende que el término "péptido" tal como se usa en la presente incluye también el análogo de ese péptido (que puede no ser un péptido como se define por el término de uso ordinario) al menos que el contexto lo requiera de otra manera. En el método de las células T pueden ponerse en contacto con los péptidos in vi tro o in vivo, y la determinación respecto a si las células T reconocen el péptido o no, puede realizarse in vitro o in vivo. De esta manera, la invención proporciona un método de diagnosis que se lleva a la práctica en el cuerpo humano o animal. La invención proporciona también uno o más de los péptidos o análogos seleccionados de los péptidos representados por la SEC. ID No,: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 y análogos de los mismos que pueden enlazarse a un receptor de células T que reconozca cualesquiera de los péptidos, pero no (a) la SEC. ID No.:3 ó 5 o un análogo del mismo solamente, ni (b) una combinación de péptidos y/o análogos seleccionados de la SEC. ID No.: 3 y 5 y análogos de los mismos para el uso en el diagnóstico de una infección del huésped por o la exposición a una micobacteria que exprese la ESAT-6, el método comprende determinar si las células T del huésped reconocen el (los) péptido (s) y/o análogo (s). La determinación respecto a sí las células T reconocen o no el péptido, se realiza generalmente detectando un cambio en el estado de las células T en la presencia del péptido o por la determinación respecto a si las células T se enlazan o no al péptido. El cambio en el estado es causado generalmente por la actividad funcional específica para el antígeno, de la célula T después de que el receptor de las células T se enlazan al péptido. Generalmente, cuando se enlaza al receptor de células T, el péptido se enlaza a una molécula MHC clase II, que se encuentra típicamente presente sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC) . El cambio del estado de las células T puede ser el inicio o incremento de la secreción de una sustancia de la célula T, tal como una citocina, especialmente IFN-?, IL-2 o TNF-a. Se prefiere particularmente la determinación de la secreción IFN-?. La sustancia puede ser detectada típicamente permitiéndole que se enlace a un agente de enlazamiento específico y luego midiendo la presencia del complejo de agente de enlazamiento específico/sustancia. El agente de enlazamiento específico es típicamente un anticuerpo, tal como anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos para las citocinas se encuentran disponibles comercialmente o pueden producirse usando técnicas estándares. Típicamente el agente de enlazamiento específico se inmoviliza sobre un soporte sólido. Después de que se deja enlazar la sustancia, el soporte sólido se puede lavar opcionalmente para retirar el material que no se haya enlazado específicamente al agente. El complejo de agente/sustancia puede detectarse usando un segundo agente de enlazamiento que se enlazará al complejo. Típicamente el segundo agente se enlaza a la sustancia en un sitio que es diferente del sitio que enlaza al primer agente. El segundo agente es preferentemente un anticuerpo y es marcado directa o indirectamente por un marcador detectable. De esta manera, el segundo agente puede ser detectado por un tercer agente que sea marcado, típicamente, de manera directa o indirecta por un marcador detectable. Por ejemplo, el segundo agente puede comprender una porción biotina, que permita la detección por un tercer agente que comprenda una porción estreptavidina y típicamente fosfatasa alcalina como un marcador detectable. En una modalidad el sistema de detección que se usa es el ensayo ELISPOT ex-vivo descrito en la WO98/23960. En ese ensayo la IFN-? secretada de la célula T es enlazada por un primer anticuerpo específico de la IFN-?, que es inmovilizado sobre un soporte sólido. La IFN-? se detecta luego usando un segundo anticuerpo específico para la IFN-? el cual es marcado con un marcador detectable. Ese anticuerpo marcado se puede obtener de MABTECH (Estocolmo, Suecia) . Otros marcadores detectables que pueden usarse se analizan posteriormente. El cambio en el estado de la célula T que puede ser medido mediante el incremento de la captación de sustancias por parte de la célula T, tal como la captación de timidina. El cambio en el estado puede ser un incremento en el tamaño de las células T, o la proliferación de las células T, o un cambio en los marcadores de la superficie celular sobre la célula T. Generalmente las células T con las que se hace contacto en el método, son tomadas del huésped en una muestra de sangre, aunque se pueden usar otros tipos de muestras que contengan células T. La muestra se puede adicionar directamente al ensayo o se puede procesar primero. Típicamente el procesado puede comprender la dilución de la muestra, por ejemplo con agua o solución reguladora. Típicamente la muestra se diluye de 1.5 a 100 veces, por ejemplo de 2 a 50 o de 5 a 10 veces. El procesado puede comprender la separación de los componentes de la muestra. Típicamente las células mononucleares (MC) se separan de las muestras. Las MC comprenderán las células T y las APC. De esta manera, en el método las APC presentes en las MC separadas pueden presentar el péptido a las células T. En otra modalidad únicamente las células T, tales como las células T, CD4 o únicamente las CD8 pueden purificarse a partir de la muestra. Las PBMC, MC y las células T se pueden separar de la muestra usando técnicas conocidas tales como las descritas en Lalvani et al (1997) J. Exp. Med. 186, p. 859-865. Preferentemente las células T usadas en el ensayo se encuentran en la forma de muestras no procesadas o diluidas, o son células T recientemente aisladas (tales como en la forma de MC o PBMC recientemente aisladas) que se usan directamente . ex vivo, es decir no se cultivan antes de ser usadas en el método. Sin embargo, las células T se pueden cultivar antes de su uso, por ejemplo en la presencia de uno o más de los péptidos, y generalmente también de citocinas que promueven el crecimiento exógeno. Durante el cultivo los péptidos están típicamente presentes sobre las superficies de las APC, tal como la APC usada en el método. El cultivo previo de las células T puede conducir a un incremento en la sensibilidad del método. De esta manera las células T pueden convertirse en líneas celulares, tales como líneas celulares a corto plazo (por ejemplo como se describe en Ota et al (1990) Na ture 346, p. 183-187) . La APC que está típicamente presente en el método puede ser del mismo huésped que el de la célula T o de diferente huésped. La APC puede ser una APC natural o una APC artificial. La APC es una célula que es capaz de presentar el péptido a una célula T. Es típicamente una célula B, una célula dendrítica o un macrófago. Típicamente se separa de la misma muestra que la célula T y típicamente se purifica de manera conjunta con la célula T. De esta manera, la APC puede estar presente en MC o PBMC. La APC es típicamente una célula ex vivo recientemente aislada o una célula cultivada. Puede estar en la forma de una línea celular, tal como una línea celular a corto plazo o una línea celular inmortalizada. La APC puede expresar moléculas MHC clase II vacías, sobre su superficie. Típicamente en el método las células T derivadas de la muestra puede colocarse en un ensayo con todos los péptidos (es decir una recolección de los péptidos) que sirva para probar (el panel relevante) o las células T se pueden dividir y colocar en ensayos separados cada uno de los cuales contenga uno o más de los péptidos. Preferentemente, en las formas in vi tro o in vivo, del método, se usa al menos el péptido representado por la SEC. ID No. 1 o un análogo del mismo. Típicamente uno o más o todos los péptidos representados por las SEC. ID Números: 2, 3, 4, 5 y 6, preferentemente también 7 y/u 8, y en una modalidad también 9 y/o 10 y/u 11 se usan también en el método, conduciendo a que el método tenga una sensibilidad incrementada. En otra modalidad, en el método se usan únicamente los péptidos representados por las SEC. ID Números: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 9. La invención proporciona los péptidos tales como dos o más de cualesquiera de los péptidos mencionados en la presente (por ejemplo en cualesquiera de las combinaciones mencionadas en la presente) para el uso simultáneo, separado o secuencial (por ejemplo para el uso in vivo) . En una modalidad el péptido per se, se adiciona directamente a un ensayo que contiene células T y APC. Como se analizó anteriormente las células T y las APC en ese ensayo, podrían encontrarse en la forma de MC. Cuando se usan péptidos que pueden ser reconocidos por la célula T sin la necesidad de la presentación por las APC, entonces no se requiere de las APC. Análogos que pueden imitar el péptido original enlazado a una molécula MHC son un ejemplo de ese péptido. En una modalidad el péptido se proporciona a la APC en la ausencia de la célula T. Posteriormente se proporciona la APC a la célula T, típicamente después de permitir que presente el péptido sobre su superficie. El péptído puede haber sido captado dentro de la APC y presentado, o simplemente ser captado sobre la superficie sin entrar dentro de la APC. La duración durante la cual se pone en contacto el péptido con las células T variará dependiendo del método usado para determinar el reconocimiento del péptido. Típicamente se adicionan de 105 a 107, preferentemente de 5xl05 a 106 PBMC, a cada ensayo. En el caso en donde el péptido se adicione directamente al ensayo, su concentración es desde 10"1 a 103 µgramos/mililitro, preferentemente de 0.5 a 50 µgramos/mililitro o de 1 a 10 µgramos/mililitro. Típicamente el tiempo por el cual se incuban las células T, con el péptido es de 4 a 24 horas, preferentemente de 6 a 16 horas. Cuando se usan PBMC ex vivo se ha encontrado que se pueden incubar 0.3xl06 PBMC en 10 µgramos/mililitro de péptido por 12 horas a 37 °C.

La determinación del reconocimiento del péptido por parte de las células T se puede realizar midiendo el enlazamiento del péptido a las células T. Típicamente las células T que se enlazan al péptido pueden clasificarse en base este enlazamiento, por ejemplo usando una máquina FACS. Se considerará que ocurre la presencia de células T que reconocen el péptido, si la frecuencia de células clasificadas, que usan el péptido, se encuentra por arriba de un valor de "control". La frecuencia de células T que han tenido experiencia con el antígeno, es generalmente de 1 en 106 a 1 en 103, y por lo tanto se puede determinar si las células clasificadas son o no células T con experiencia con el antígeno. La determinación del reconocimiento del péptido por parte de las células T puede medirse in vivo. Típicamente el péptido se administra al huésped y luego se puede medir una respuesta que indique el reconocimiento del péptido. En una modalidad el péptido se administra intradérmicamente, típicamente en una manera similar a la prueba de Mantoux. El péptido se puede administrar epidérmicamente. El péptido se administra típicamente mediante aguja, tal como mediante inyección, pero se puede administrar a través de otros métodos tales como mediante balística, por ejemplo las. técnicas de balística que se han usado para suministrar ácidos nucleicos. La EP-A-0693119 describe técnicas que se pueden usar típicamente para administrar el péptido. Típicamente se administran de 0.001 a 1000 µgramos, por ejemplo de 0.01 a 100 µgra os o de 0.1 a 10 µgramos de péptido. Alternativamente se puede administrar un agente que sea capaz de proporcionar los péptidos in vivo . De esta manera, un polinucleótido capaz de expresar el péptido puede administrarse, típicamente en cualesquiera de las formas descritas anteriormente para la administración del péptido. El polinucleótido tiene típicamente cualesquiera de las características del polinucleótido proporcionado por la invención, lo cual se analiza posteriormente. El péptido se expresa a partir del polinucleótido in vivo y se mide el reconocimiento del péptido in vivo . Típicamente se administran de 0.001 a 1000 µgramos, por ejemplo de 0.01 a 100 µgramos o de 0.1 a 10 µgramos del polinucleótido. El reconocimiento del péptido in vivo se indica típicamente por la presencia de una respuesta DTH. Esta se mide generalmente mediante el examen visual del sitio de administración del péptido, para determinar la presencia de inflamación, tal como por la presencia de endurecimiento, eritema o edema. El análogo que se puede usar en el método puede enlazarse a un receptor de células T que reconozca el péptido equivalente representado por la SEC. ID No. : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Por lo tanto, generalmente cuando el análogo se adiciona a las células T en la presencia del equivalente del péptido, típicamente también en la presencia de una APC, el análogo inhibe el reconocimiento del péptido equivalente. El enlazamiento del análogo para esos receptores de células T puede analizarse a través de técnicas estándares. Por ejemplo, los receptores de células T pueden aislarse a partir de las células T que hayan exhibido reconocer el péptido (por ejemplo, usando el método de la invención) . La demostración del enlazamiento del análogo a los receptores de células T puede demostrarse posteriormente mediante la determinación de si los receptores de células T inhiben el enlazamiento del análogo para una sustancia que se enlace al análogo, por ejemplo un anticuerpo para el análogo. Típicamente el análogo se enlaza en una molécula MHC en tal inhibición del ensayo del enlazamiento . Típicamente el análogo inhibe el enlazamiento del péptido a un receptor de células T. En este caso se reduce la cantidad de péptido que puede enlazarse al receptor de células T en la presencia del análogo. Esto se debe a que e.l análogo es capaz de enlazarse al receptor de células T y por lo tanto compite con el péptido por el enlazamiento al receptor de células T.

Las células T para el uso en los experimentos de enlazamiento, anteriores, se pueden aislar de pacientes con infección micobacteriana, por ejemplo con el auxilio del método de la invención. Dado que la ESAT-6 no es capaz de enlazarse al receptor de las células T que reconoce el péptido, no está comprendida por el término "análogo". Otras características de enlazamiento del análogo son también las mismas que del péptido, y por lo tanto el análogo se enlaza típicamente a la misma molécula MHC clase II a la que se enlaza el péptido. El análogo del péptido representado por la SEC. ID No.l se enlaza típicamente al HLA-DR1 y/o HLA-DR7. El análogo se enlaza típicamente a anticuerpos específicos para el péptido, y de esta manera inhibe el enlazamiento del péptido a ese anticuerpo. El análogo es típicamente un péptido. Puede tener homología con el péptido original equivalente representado por una de la SEC. ID No.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Un péptido que es homólogo con otro péptido es típicamente al menos 70% homólogo con el péptido, preferentemente al menos 80 o 90% y de manera más preferente al menos 95, 97% o 99% de homólogo con el mismo, por ejemplo a través de una región de al menos 15, preferentemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 o más aminoácidos contiguos. Métodos de medición de la homología de proteínas son bien conocidos en la técnica y será comprendido por los experimentados en la técnica, que en el contexto de la presente, la homología se calcula en base a la identidad de los aminoácidos (a la que a veces se hace referencia como "homología dura") . Por ejemplo el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular homología (por ejemplo usado en sus ajustes por omisión) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p. 387-395) . Los péptidos homólogos difieren típicamente por la sustitución, inserción o deleción, por ejemplo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más sustituciones, deleciones o inserciones, que pueden ser en la terminal N o C o en cualquier otra posición en la secuencia. Las sustituciones son preferentemente, "conservadoras". Estas se definen de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna, pueden estar sustituidos unos por otros: El análogo tiene típicamente una longitud de 8 a 80 aminoácidos, tal como de 10 a 60 o de 12 a 50, preferentemente de 15 a 30 o de 20 a 25. Típicamente los aminoácidos en el análogo en las posiciones equivalentes para los aminoácidos en el péptido original que contribuyen al enlazamiento de la molécula MHC, o son responsables del reconocimiento por el receptor de células T, son los mismos o están conservados. Típicamente el péptido análogo comprende una o más modificaciones que pueden ser modificaciones naturales posteriores a la traducción o modificaciones artificiales.

La modificación puede proporcionar una porción química (típicamente por la sustitución de un hidrógeno, por ejemplo de un enlace C-H) , tal como un grupo amino, acetilo, hidroxi o halógeno (por ejemplo, flúor) o un grupo carbohidrato. Típicamente la modificación está presente en el término N o C.

El análogo puede comprender uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo aminoácidos con una cadena lateral diferente a los aminoácidos naturales. Generalmente, el aminoácido no natural tendrá un término N y/o un término C. El aminoácido no natural puede ser un aminoácido L. El análogo tiene típicamente una forma, tamaño, flexibilidad o configuración electrónica que es sustancialmente similar a la del péptido original. Típicamente es un derivado del péptido original. En una modalidad el análogo es o imita al péptido original enlazado a una molécula MHC clase II. El análogo puede ser o puede imitar al péptido original enlazado a 2, 3, 4 o más moléculas MHC clase II asociadas o enlazadas entre sí. Estas moléculas MHC pueden enlazarse entre sí usando un sistema basado en biotina/estreptavidina, en el que típicamente 2, 3 ó 4 moléculas MHC marcadas con biotina, se enlazan a una porción estreptavidina. Este análogo inhibe típicamente el enlazamiento del complejo de péptido/MHC Clase II, a un receptor de las células T o anticuerpo que sea específico para el complejo. El análogo es típicamente un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, tal como un fragmento Fab o (Fab)2. El análogo puede estar inmovilizado sobre un soporte sólido, particularmente un análogo que imite al péptido enlazado a una molécula MHC. El análogo se diseña típicamente a través de medios de cómputo y luego se sintetiza usando métodos conocidos en la técnica. Alternativamente el análogo puede seleccionarse de una biblioteca de compuestos. La biblioteca puede ser una biblioteca combinatoria o una biblioteca de exhibición, tal como una biblioteca de exhibición de fagos. La biblioteca de compuestos se puede expresar en la biblioteca de exhibición en la forma enlazada a moléculas MHC clase II, tal como la molécula MHC a la cual se enlaza el péptido original. Los análogos se seleccionan generalmente a partir de la librería en base a su capacidad para imitar las características de enlazamiento de los péptidos originales. De esta manera, se pueden seleccionar en base a su capacidad para enlazarse a un receptor de células T o anticuerpo que reconozca el péptido original. La invención proporciona también un estuche para llevar a cabo el método, que comprende uno o más de los péptidos o análogos y opcionalmente un medio para detectar el reconocimiento del péptido por parte de la célula T. Típicamente los péptidos se proporcionan para el uso simultáneo, separado o secuencial. Típicamente el medio para detectar el reconocimiento permite o ayuda a la detección en base a las técnicas analizadas anteriormente. De esta manera, el medio puede permitir la detección de una sustancia secretada por las células T después del reconocimiento. El estuche puede incluir así, adicionalmente, un agente de enlazamiento específico para la sustancia, tal como un anticuerpo. El agente es típicamente específico para la IFN-?. El agente se inmoviliza típicamente sobre un soporte sólido. Esto significa que después del enlazamiento del agente, la sustancia permanecerá en la vecindad de la células T que la secreta. De esta manera se forman "manchas" del complejo de sustancia/agente sobre el soporte y cada mancha representa una célula T que está secretando la sustancia. La cuantificación de las manchas y típicamente la comparación contra un control, permite la determinación del reconocimiento del péptido. El estuche puede comprender también un medio para detectar el complejo de sustancia/agente. Puede ocurrir un cambio detectable en el agente mismo después del enlazamiento de la sustancia, tal como un cambio de color. Alternativamente se puede permitir un segundo agente marcado directa o indirectamente, para la detección, a fin de enlazar el complejo de sustancia/agente a fin de permitir la determinación de las manchas. Como se analizó anteriormente, el segundo agente puede ser específico para la sustancia, pero se enlaza a un sitio diferente sobre la sustancia, que el primer agente.

El soporte inmovilizado puede ser una placa con pozos, tal como una placa de microtitulación. Por lo tanto cada ensayo se puede llevar a cabo en un pozo separado en la placa. El estuche puede comprender adicionalmente medio para las células T, agentes de detección o soluciones reguladoras de lavado para usarse en las etapas de detección. El estuche puede comprender adicionalmente reactivos apropiados para la separación de la muestra, tales como para la separación de PBMC o células T de la muestra. El estuche puede estar diseñado para permitir la detección de células T directamente en la muestra sin requerir de alguna separación de los componentes de la muestra. El estuche puede comprender un instrumento que permita la administración del péptido, tal como la administración intradérmica o epidérmica. Típicamente ese instrumento comprende una o más agujas. El instrumento puede permitir la administración balística del péptido. El péptido en el estuche puede encontrarse en la forma de una composición farmacéutica. El estuche puede comprender también controles, tales como controles positivos o negativos. El control positivo puede permitir probar el sistema de detección. De esta manera, el control positivo típicamente imita el reconocimiento del péptido en algunos de los métodos anteriores. Típicamente en los estuches diseñados para determinar el reconocimiento in vitro, el control positivo es una citocina. En el estuche diseñado para detectar el reconocimiento in vivo del péptido, el control positivo puede ser un antígeno al cual respondería la mayoría de los individuos . . . El estuche también puede comprender un medio para tomar una muestra que contenga células T del huésped, tal como una muestra de sangre. El estuche puede comprender un medio para separar las células mononucleares o células T de una muestra del huésped. La invención proporciona también un péptido con la secuencia de la SEC. ID No.: 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 o un análogo del mismo. La invención proporciona un producto o panel de diagnóstico, que comprende uno o más de los péptidos, típicamente en las combinaciones analizadas anteriormente. El producto es típicamente una composición tal como una composición farmacéutica. La invención proporciona también un polinucleótido que es capaz de permitir la expresión para proporcionar un péptido con la secuencia SEC. ID No.:l, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 o un análogo del mismo. Típicamente el polinucleótido es ADN o ARN, y es de una sola hebra o de doble hebra. El polinucleótido comprende por lo tanto la secuencia que codifica la secuencia SEC. ID No.:l, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Para el 5' y 3' de esta secuencia codificadora el polinucleótido, de la invención tiene secuencia o codones que son diferentes de la secuencia o codones 5' y 3' para estas secuencias en el gen ESAT-6. Por lo tanto el polinucleótido de la invención no comprende la secuencia que codifica todo el ESAT-6 o fragmentos del ESAT-6, diferente a la secuencia que codifica los fragmentos representados por la SEC. ID No.:l, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10 u 11. El 5' y 3' para la secuencia que codifica el péptido, el polinucleótido tiene secuencia codificadora o no codificadora. La secuencia 5' y/o 3' para la secuencia codificadora puede comprender secuencias con la expresión auxiliar, tal como la transcripción y/o la traducción, de la secuencia que codifica el péptido. El polinucleótido puede ser capaz de expresar el péptido en una célula procariótica o eucariótica. En una modalidad el polinucleótido es capaz de expresar el péptido en una célula de mamífero, tal como una célula de humano, primate o roedor. El polinucleótido se puede incorporar en un vector replicable. Ese vector es capaz de replicarse en una célula apropiada. El vector puede ser un vector de expresión. En ese vector el polinucleótido de la invención está enlazado operativamente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión del polinucleótido. El vector puede contener un marcador seleccionable, tal como el gen de resistencia a la ampicilina. El polinucleótido, péptido o anticuerpo (ver más adelante) de la invención, o los agentes usados en el método (por ejemplo en la detección de sustancias secretadas por las células T) pueden portar una marca detectable. Se prefieren las marcas detectables que permiten la detección de las sustancias secretadas mediante inspección visual, opcionalmente con la ayuda de un medio de aumento óptico. Ese sistema se basa típicamente en una marca de encima que causa un cambio de color en un sustrato, por ejemplo la fosfatasa alcalina que causa un cambio de color en un sustrato. Esos sustratos se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo de BioRad. Otras marcas adecuadas incluyen otras encimas tales como la peroxidasa o marcas proteínicas tales como la biotina; o radioisótopos, tal como el 32P o 35S . Las marcas anteriores se pueden detectar usando técnicas conocidas. Los polinucleótidos, péptidos o anticuerpos (ver más adelante) de la invención, pueden estar en una forma sustancialmente purificada. Pueden estar en una forma sustancialmente aislada, caso en el cual comprenderán generalmente (por ejemplo, aproximadamente o al menos) 90%, tal como (por ejemplo, aproximadamente o al menos) 95, 97 o 99% del polinucleótido, péptido o anticuerpo que se encuentra en la preparación. Los péptidos sustancialmente aislados, que no son péptidos (como se define en el sentido normal de la palabra) comprenden generalmente (por ejemplo aproximadamente o al menos) 90%, tal como (por ejemplo aproximadamente o al menos) 95, 97 o 99% de la masa seca de la preparación. El polinucleótido o péptido se encuentran típicamente de manera sustancialmente libre de otros componentes celulares o sustancialmente libre de otros componentes celulares micobacterianos. El polinucleótido o péptido puede usarse en una forma sustancialmente aislada, purificada o libre, o puede estar presente en esas formas en el estuche. El péptido o cualquier combinación de los péptidos (por ejemplo como se mencionó en la presente) se proporciona para el uso en un método de diagnosis llevado a la práctica en el cuerpo humano o animal. Las combinaciones de péptidos se proporcionan para el uso simultáneo, separado o secuencial, en ese método. El péptido o polinucleótido puede estar en la forma de una composición farmacéutica que comprende el péptido o polinucleótido y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen las soluciones salinas isotónicas, por ejemplo la solución salina regulada con fosfatos. Típicamente la composición se formula para la administración intradérmica o epidérmica o para la aplicación mediante técnicas balísticas. De esta manera el péptido o polinucleótido puede estar asociado con una partícula portadora para la administración balística. El péptido de la invención puede fabricarse usando técnicas de química de síntesis estándares, tal como mediante el uso de un sintetizador automatizado. El péptido se produce típicamente a partir de un polipéptido más largo, por ejemplo una proteína de fusión, polipéptido que comprende típicamente la secuencia del péptido. El péptido puede derivarse a partir del polipéptido, por ejemplo mediante la hidrólisis del polipéptido, tal como mediante el uso de una proteasa; o rompiendo físicamente el polipéptido. El polipéptido es típicamente el ESAT-6, que puede haber sido expresado recombinantemente . EL péptido puede producirse en un proceso que comprenda la expresión de un polinucleótido, tal como mediante la expresión del polinucleótido de la invención. El polipéptido expresado puede procesarse adicionalmente para producir el péptido de la invención. De esta manera, el péptido puede producirse en un proceso que comprenda cultivar una célula transformada o transfectada con un vector de expresión como el descrito anteriormente, bajo condiciones que proporcionan la expresión del péptido o un polipéptido a partir del cual se pueda producir el péptido. El polinucleótido de la invención se puede producir usando técnicas estándares, tales como mediante el uso de un sintetizador. La invención proporciona también el uso de un péptido o análogo de la invención, para producir un anticuerpo específico para el péptido. Este anticuerpo o cualesquiera de los anticuerpos mencionados en la presente se pueden producir criando un anticuerpo en un animal huésped. Esos anticuerpos serán específicos para el péptido o para las sustancias mencionadas anteriormente que enlazan los anticuerpos. Al péptido o a las sustancias se hace referencia, posteriormente como el "inmunógeno". Los métodos para producir anticuerpos monoclonales y policlonales son bien conocidos. Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende inmunizar un animal huésped apropiado, por ejemplo un animal experimental, con el inmunógeno y aislar las inmunoglobulinas a partir del suero. Por lo tanto el animal puede inocularse con el inmunógeno, se puede retirar subsecuentemente sangre del animal y se puede purificar la fracción IgG. Un método para producir un anticuerpo monoclonal comprende inmortalizar células que produzcan el anticuerpo deseado. Se pueden producir células del hibridoma, fusionando células de bazo de un animal experimental inoculado, con células de tumor (Kohler and Milstein (1975) Na ture 256, 495-497). Una célula inmortalizada que produzca el anticuerpo deseado puede seleccionarse a través de un procedimiento convencional. Los hibridomas pueden criarse en cultivo o inyectarse intraperitonealmente para la formación de fluido de ascites o en la corriente sanguínea de un huésped alogénico o de un huésped inmunocomprometido. El anticuerpo humano se puede preparar mediante la inmunización in vi tro de linfocitos humanos, seguido de la transformación de los linfocitos con el virus de Epstein-Barr. Para la producción, tanto de anticuerpos monoclonales como policlonales, el animal experimental es convenientemente una cabra, conejo, rata o ratón. Si se desea, el inmunógeno se puede administrar como un conjugado en el cual se acopla el inmunógeno, por ejemplo a través de una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos, en un portador apropiado. La molécula portadora es típicamente un portador fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido se puede aislar y, si se desea, purificar. La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos: Ejemplo 1 Los sujetos estudiados Pacientes y controles se reclutaron de manera prospectiva en el Fideicomiso del Sistema Nacional de Salud (NHS) en Northwic Park y St Mark, Londres, y los hospitales del Fideicomiso del NHS de Oxford Radcliffe, Oxford, en un período de 16 meses a partir de Octubre de 1997. Se extrajo, de cada sujeto, una sola muestra de sangre tratada con heparina. Los pacientes con hallazgos clínicos y radiográficos compatibles quienes habían resultado positivos mediante confirmación bacteriológica para cultivos con M. tuberculosis de uno o más especímenes clínicos, se reclutaron como casos de tuberculosis. 29 de 47 pacientes (62%) no habían sido tratados al momento de la sangría o habían recibido menos de una terapia al mes; el resto se encontraban en el puntos finales de su tratamiento. Los pacientes de control fueron seleccionados en grupos respecto a la etnia, edad (dentro de 4 años) y sexo, y comprendieron individuos con una amplia variedad de condiciones infecciosas, inflamatorias, granulomatosas, autoinmunes y neoplásticas (tabla 4). Estas incluyeron enfermedades que podrían ser clínicamente difíciles de diferenciar de la tuberculosis y otras que, al igual que la tuberculosis, pueden presentarse como pirexia de origen desconocido. Los pacientes con un historial pasado de tuberculosis y los que reportaron contacto reciente con un caso conocido de tuberculosis fueron excluidos. Ninguno de los pacientes con tuberculosis o de los pacientes de control tuvo alguna característica clínica que sugiriese infección por VIH.

Ejemplo 2 Resultados usando el ensayo ELISPOT El ensayo ELISPOT se usó para detectar células T, CD4, experimentadas con el antígeno, específicas para la ESAT-6, ex vivo. Se sintetizaron 17 péptidos que abarcaban la longitud de la molécula de ESAT-6, mediante química f-moc en fase sólida (Research Genetics, Alabama, Estados Unidos de Norteamérica y Zinsser Analytical Frankfurt, Alemania) . Cada péptido tenía una longitud de 15 aminoácidos y tenía traslapados sus péptidos adyacentes por 10 residuos. La identidad se confirmó mediante espectrometría de masas y la pureza mediante la cromatografía de líquidos de alta resolución. Ocho péptidos fueron epítopos frecuentemente reconocidos; cada sujeto que respondió a algunos de los 17 péptidos derivados de ESAT-6 respondió también a al menos uno del panel de 8 péptidos representados por las SEC. ID Números 1 a 8. Las investigaciones de la homología de secuencias de las bases de datos S issProt y Gen-Bank traducida, de todas las secuencias de proteínas, confirmaron que las secuencias de estos péptidos están restringidas singularmente a la proteína ESAT-6 del complejo de M. tuberculosis. Una respuesta a uno o más de los péptidos en este panel, analizado individualmente, se clasificó como indicadora de infección por M. tuberculosis. También se encontró que los pacientes respondieron a los péptidos representados por las SEC. ID Números 9 a 11.

Ensayo ELISPOT ex vivo para liberación de IFN-? en una sola célula: enumeración de células T específicas para el péptido de ESAT-6 de la circulación, de la sangre periférica En base al principio de un ELISA de captura intercalada, el ensayo ELISPOT captura y detecta moléculas de IFN-? en la vecindad inmediata de la célula T de la cual son secretadas, todavía a una concentración relativamente alta. Seguido al desarrollo, cada mancha resultante representa así la "huella" de una célula T secretora de IFN-? específica para el antígeno, individual, o una célula formadora de manchas (SFC) . El ensayo ELISPOT ex vivo para la IFN-? es lo suficientemente sensible para detectar células T específicas para el antígeno, directamente de la sangre periférica, sin necesidad de una etapa previa de estimulación in vitro (Lalvani et al (1997) J. Exp. Med 186 p. 859-865) . Además, dado que el ensayo ELISP0T ex vivo enumera las células T específicas para el antígeno, con una función efectora rápida, se requieren únicamente períodos de incubación cortos. Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se separaron de 12 mililitros de sangre a través de medios estándares tal como se describe en Lalvani et al (ver arriba) y se suspendieron en RPMI complementada con L-glutamina 2mM, penicilina 100 ui/ml y 10% de suero de ternero fetal inactivado térmicamente (Sigma, San Luis, MO, Estados Unidos de Norteamérica) (RIO) . Se lavaron placas con soporte de difluoruro de polivinilideno de noventa y seis pozos (PVDF) (Millipore) recubiertas previamente como mAB 1-D1K anti-IFN-? a 15 µg/ml (MABTECH, Estocolmo) con medio RPMI 1640 y se bloqueó con RIO por una hora a temperatura ambiente. Se adicionaron 3 x 105 PBMC en 100 µl de RlO/pozo a las placas recubiertas previamente y se adicionaron los péptidos individualmente a cada pozo, a una concentración final de 10 µg/ml. También se adicionaron PPD (Lote RT49, Staatens Seruminstitut, Copenhagen, Dinamarca) a 20 µg/ml. Se adicionó fitohemaglutinina (ICN Biomedicals, Aurora, OH, Estados Unidos de Norteamérica) a 5 µg/ml a los pozos de control positivo y no se adicionó péptido alguno a los pozos de control negativo. Adicionalmente, se adicionó ESAT-6 recombinante entera a 10 µg/ml para 17 pacientes con tuberculosis y para todos los controles. Los ensayos se incubaron por un tiempo de 6 a 12 horas a 37 °C, 5% de C02 y se arrestaron lavando 6 veces con PBS al 0.05% Tween-20 (Sigma, San Luis, MO, Estados Unidos de Norteamérica) . Posteriormente, se adicionaron 100 µl de 1 µg/ml de mAB 7-B6-l-biotina anti-IFN-? tratado con biotina (Mabtech, Estocolmo, Suecia) . Después de dos horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron nuevamente 6 veces y se adicionó una dilución de 1:1000 de conjugado de estreptavidina-fosfato alcalino (Mabtech, Estocolmo, Suecia) a los pozos y las placas se incubaron por una hora adicional. Posteriormente los pozos se lavaron nuevamente 6 veces y se adicionaron 100 µl de substrato de fosfatasa alcalina cromogénica (Biorad, Hercules, CA, Estados Unidos de Norteamérica), diluido en proporción 1:25 con agua desionizada. Después de 30 minutos la reacción colorimétrica se finalizó mediante el lavado con agua de la llave y se dejaron secar las placas. Las respuestas se clasificaron como positivas únicamente si el pozo de prueba contenía al menos 5 SFC de IFN-? más que los pozos de control negativo y adicionalmente este número fue al menos dos veces que el de los pozos de control negativo. Este punto de corte (5 SFC de IFN-? por 3 x 105 PBMC) se traduce en un menor umbral de detección de 17 células T específicas para el péptido, por millón de PBMC o 1/59,000 de PBMC. Aunque la persona que lleva a cabo los ensayos no ignoraba el estado de tuberculosis de los pacientes, la lectura en los SFC es cuantitativa, nuestros criterios para una respuesta positiva fueron rigurosos y los números de fondo de los SFC en los pozos de control negativo estuvieron siempre por debajo de 3, de manera tal que las respuestas positivas fueron objetivas y de corte claro. En todos los casos, las respuestas positivas y negativas fueron reconocibles inmediatamente a través de la inspección directa de la placa, antes de la enumeración precisa con una lupa. La exactitud de la prueba basada en el péptido ESAT-6, tal como se aplicó a la diagnosis de tuberculosis activa, se cálculo y expresó como sensibilidad, especificidad (intervalos de confianza calculados a partir del binomio estándar) y como relaciones de probabilidad. Las últimas se . aplicaron posteriormente a un escenario clínico típico en donde la .tuberculosis se considera una posibilidad diagnóstica con una probabilidad, previa a la prueba, de 20%. También se usaron recolecciones de péptidos en los ensayos anteriores y se encontraron efectivas para detectar respuestas al igual que los mismos péptidos analizados individualmente en ensayos separados.

Ejemplo 3 Características demográficas y clínicas de pacientes y controles Los pacientes con tuberculosis representan la amplia característica mixta, étnica, de la tuberculosis en el Reino Unido, con una gran prevalecencia de la enfermedad entre personas del Subcontinente Indio (ISC) y en los negros (tabla 2) . Los pacientes de control fueron seleccionados estrechamente por su origen étnico, edad y proporción de sexo (tabla 2) y sus diagnósticos se listan en la tabla 4. Los pacientes con tuberculosis son representativos del amplio espectro clínico de la enfermedad causada por la M. tuberculosis y 22 de 47 tuvieron tuberculosis extrapulmonar (tabla 3) . De esas personas con tuberculosis pulmonar, 6 de 25 fueron negativos al frotis de esputo para bacilos ácido-fijos. Por lo tanto, la diagnosis probable inmediata mediante microscopía del esputo no fue posible en 28 de 47 (60%) de los pacientes.

Diagnosis pronta de la infección por M. tuberculosis mediante la detección de células T específicas para la ESAT-6, en la sangre 45 de 47 (96%) pacientes con tuberculosis respondieron a uno o más del panel de 8 péptidos, mostrados en la tabla 1 en el ensayo ELISPOT ex vivo para la IFN-? (tabla 5) . Una proporción inusualmente alta de pacientes respondió a la ESI. Los inventores han demostrado que este péptido se enlaza al HLA DR1 y DR7. Las frecuencias de las células T que secretan IFN-? específico para el péptido ESAT-6, fueron generalmente altas, con una mediana de 200 células T específicas para el péptido ESAT-6, por millón de PBMC (rango entre cuartiles 105-596) . Las SFC de IFN-? específicas para cada uno de los 8 péptidos en la tabla 1 son principalmente células T CD4 debido a que las líneas de células T han sido generadas contra cada uno de estos péptidos in vitro y respuestas específicas para el péptido fueron anuladas por el agotamiento inmunomagnético específico de células T CD4. Las células T CD8 específicas para la ESAT-CI se detectan también mediante los péptidos en el panel (por ejemplo la ES14) que contiene epítopos CD8. Únicamente 4 de 47 (8.5%) controles sin enfermedad en el tubérculo, respondieron a uno o más del panel de péptidos derivados de la ESAT-6; las frecuencias de células T secretoras de IFM-? específicas para el péptido, en estos 4 responsores, fueron similares a aquellas observadas en pacientes con tuberculosis. En todos los controles restantes había una completa carencia de respuesta a todos los péptidos. El uso del conjunto expandido de 17 péptidos que abarcan toda la longitud de la ESAT-6 dio resultados idénticos a los observados con el panel de 8 epítopos ampliamente inmunogénicos. Los dos no responsores fueron pacientes con tuberculosis pulmonar, con enfermedad avanzada y ambos fueron analizados antes del tratamiento. Sus detalles clínicos se revisan en el análisis. De los 4 controles que respondieron dos tenían neumonía aguda, uno tenía bronquitis aguda y el cuarto tenía celulitis. Todos los cuatro pacientes tenían también una fuerte respuesta ex vivo al PPD en el ensayo ELISPOT para la IFN-?, indicando- que estaban sensibilizados a la tuberculina.

Comparación de las respuestas de células T específicas al ESAT-6 con respuestas al PPD 26 pacientes con tuberculosis sufrieron la prueba dérmica de tuberculina con la inoculación intradérmica de 1 TU de PPD (fuente NHS) . El endurecimiento cutáneo a las 72 horas se midió con una regla, y el endurecimiento de 5 milímetros o más de diámetro se tomó como positivo por convención. De estos pacientes únicamente 18 (69%) tuvieron un resultado positivo en la TST. En comparación, un tercio más, 24 de 26 (92%) fueron positivos, mediante el ELISPOT ex vivo para la IFN-?, y, de manera global, 45 de 47 (96%) tuvieron una respuesta positiva mediante ELISPOT ex vivo (p=0.002 prueba exacta de Fisher). Aunque los pacientes de control no sufrieron la prueba dérmica con tuberculina, 26 de 47 (55%) tuvieron respuestas positivas al PPD en el ensayo ELISPOT ex vivo para la IFN-?, indicando sensibilización previa in vivo de sus células " T CD4 a los antígenos en PPD.

Utilidad clínica del ensayo ELISPOT basado en el péptido ESAT-6, para la IFN-? Las características operativas de este ensayo, en este estudio, se presentan en la tabla 5. Estas relaciones de probabilidad generan grandes cambios de la probabilidad antes de la prueba respecto a la probabilidad después de la misma. Por ejemplo, si se aplica a un paciente hipotético en donde la tuberculosis se considera una posibilidad de diagnóstico con una probabilidad, antes de la prueba, de 20%, un resultado de prueba positivo conferiría un valor predictivo positivo de 74%, mientras que un resultado de prueba negativo daría un valor predictivo negativo de 1%.

Análisis En la presente se ha desarrollado una prueba de sangre altamente exacta para la detección rápida de la infección por M. tuberculosis. El éxito de este ensayo ex vivo se basa en la detección sensible de células T específicas para el antígeno, usando un antígeno altamente inmunogénico, que es altamente específico para la M. tuberculosis . Cuando se aplicó como una prueba de diagnóstico para la tuberculosis activa confirmada bacteriológicamente, este ensayo produce una sensibilidad del 96% y una especificidad del 91.5% en los estudios en la población de pacientes (tabla 5) . Los pacientes con tuberculosis representan una amplia mezcla étnica, reflejando la epidemiología de la tuberculosis en el Reino Unido y, entre los pacientes de control seleccionados étnicamente, hubo muchas enfermedades comunes que podían ser difíciles de distinguir de la tuberculosis. Las características operativas (tabla 5) de ese ensayo podrán ser probablemente aplicables, en forma general, a la práctica clínica en el Reino Unido. La prueba requiere de una sola muestra de sangre venosa, se puede llevar a cabo de manera fácil y rápida, no necesita de instalaciones de laboratorio especializadas y genera resultados el día siguiente; por lo tanto es potencialmente muy apropiada para laboratorios de rutina en hospitales y podría automatizarse fácilmente. La TST y la microscopía de esputo para AFB son las únicas pruebas para la diagnosis probable inmediata de la tuberculosis en uso general. La sensibilidad de la TST entre los 26 pacientes con tuberculosis que fueron analizados mediante este método, fueron únicamente de 69%, significativamente menor que la sensibilidad de 96% del ELISPOT ex vivo basado en ESAT-6 (p=0.002). Dada las múltiples limitaciones principales o la TST, el ensayo ELISPOT ex vivo parece ser un medio superior para detectar rápidamente la infección por M. tuberculosis . En nuestra serie de pacientes, la microscopía del esputo hubiese detectado únicamente el 40% de los casos, comparado con el 96% para el ELISPOT ex vivo, que detectó también todos los 6 casos de tuberculosis pulmonar negativa al frotis del esputo. Además, la microscopía no puede diferenciar entre la M. tuberculosis y la micobacteria atípica. Dado que el gen ESAT-6 está restringido al complejo de M. tuberculosis, M. kansasii , M.marinum y M. szulgei (de éstas únicamente la M. kansasii puede causar una enfermedad clínicamente similar a la tuberculosis) nuestra prueba basada en la ESAT-6 puede probar ser más específica que la microscopía del esputo. En el pasado se ha desarrollado una variedad de pruebas sanguíneas para diagnosticar la tuberculosis, pero ninguna ha probado ser lo suficientemente sensible, específica y conveniente para formar parte del uso de rutina. Los ensayos serológicos han sufrido de la carencia de un antígeno blanco que sea tan específico para la especie como el ESAT-6 y la sensibilidad de estos ensayos se encuentra generalmente en desacuerdo, especialmente en las formas agudas de tuberculosis (pulmonar, miliar y pleural) . La PCR del ADN complejo circulante de la M. tuberculosis en PBMC ha sido investigada como un método para diagnosticar la tuberculosis. Para la tuberculosis pulmonar, la sensibilidad varía de 33% a 95% para diferentes investigadores; en la serie más grande de pacientes negativos al VIH confirmado bacteriológicamente, la sensibilidad fue de 41% a 27%. Para la tuberculosis extrapulmonar, la PCR basada en la sangre tuvo una sensibilidad únicamente de 4 a 27 %. 2 de 47 pacientes con tuberculosis no respondieron en el ensayo ELISPOT ex vivo. Ambos eran pacientes con tuberculosis pulmonar, con la enfermedad avanzada y habían sido severamente sintomáticos por varios meses antes de la diagnosis y ambos eran caquécticos. Uno era un hombre asiático de 20 años de edad, tenía una extensiva enfermedad cavitatoria positiva al frotis del esputo, con complicación pleural y fue anérgico en la TST; el otro, una mujer africana de 22 años de edad fue negativa al frotis del esputo, tenía en patrón bronqueoneumónico, radiográficamente, y fue positivo en la TST. De manera interesante, ambos pacientes eran linfopénicos, pero ambos eran negativos al VIH y respondieron bien a la terapia. La tuberculosis avanzada, crónica, causa inmunosupresión no especifica que podría explicar concebiblemente la carencia de células T que secreten IFN-? específicas para la ESAT-6, detectables, en estos pacientes, pero para todos los cuatro pacientes con enfermedad miliar severa, a menudo asociada con anergia cutánea, respondieron no obstante en el ensayo ELISPOT ex vivo. Actualmente no está claro por qué estos dos pacientes no respondieron y estos representan verdaderos negativos falsos. Aunque 33 de 47 pacientes de control (70%) con enfermedades que no eran la tuberculosis, estaban vacunados con la BCG (como se indica por la presencia de una cicatriz) , únicamente 4 de 47 respondieron en el ensayo ELISPOT ex vivo y tres de estos no estaban vacunados con BCG. Por lo tanto, este ensayo es el primero para distinguir exitosamente entre pacientes vacunados con BCG y pacientes infectados con la M. tuberculosis . Ninguno de los cuatro pacientes de control que respondieron tenían características clínicas o radiográficas que sugirieran la tuberculosis; dos tenían neumonía aguda, uno tenía bronquitis aguda y uno celulitis. Todos respondieron a los antibióticos de primera línea. Todos los cuatro pacientes tuvieron también una fuerte respuesta ex vivo al PPD en el ensayo ELISPOT para IFN-?, indicando que estaban sensibilizados a la tuberculina. De manera importante, todos los cuatros fueron de países con alto potencial endémico por la tuberculosis, tres fueron inmigrantes asiáticos al Reino Unido provenientes de Kenia (y todos regresaban allí con regularidad) y el cuarto fue un visitante de Etiopía. Por lo tanto, los cuatro tenían factores de riesgo significativos • para la exposición a la M. tuberculosis . En contraste, ninguno de los 22 pacientes de control nacidos en el Reino Unido dieron una respuesta positiva. Probablemente es que los cuatro responsores estaban, en efecto, infectados con la M. tuberculosis pero claramente no tuvieron una enfermedad activa. De esta manera, aunque estos responsores representan positivos falsos, si el ensayo se aplica como una prueba de diagnóstico de la tuberculosis activa, se cree que son, en términos biológicos, positivos verdaderos, dado que la prueba ha detectado correctamente la infección por M. tuberculosis. Desafortunadamente, esta conclusión no puede probarse formalmente dado que no existe un medio definitivo para confirmar la infección subclínica por M. tuberculosis, en contactos expuestos, asintomáticos. En contraste a los péptidos ESAT-6, las respuestas al ELISPOT ex vivo, al PPD, fueron comunes, (26 de 47) a través del grupo de control, indicando la sensibilización previa in vivo de sus células T CD4 a antígenos en PPD, probablemente como resultado de la vacunación con BCG o de la exposición a las micobacterias ambientales. Se necesitarán estudios adicionales para contestar si el ELISPOT ex vivo basado en la ESAT-6 mantiene o no su alta sensibilidad y especificidad en otros escenarios. En países endémicos de tuberculosis, en donde una proporción significativa de individuos saludables se encuentran latentemente infectados con M. tuberculosis, la especificidad de un ensayo basado en la detección de un sistema inmune celular sensibilizado a la M. tuberculosis, podría ser inferior que en este estudio. Sin embargo, a la alta sensibilidad del ELISPOT ex vivo significa que podría usarse todavía para descartar una diagnosis de la tuberculosis. El ensayo necesitará también ser validado en niños, en donde la tuberculosis es usualmente una infección primaria y se presenta agudamente; estudios en animales de respuestas inmunes celulares específicas al ESAT-6, indican que el ESAT-6 es especialmente reconocido de manera fuerte en la fase inicial de la infección primaria, sugiriendo que nuestro ensayo debería demostrar ser efectivo en niños tal como lo es en adultos. Finalmente, el ELISPOT ex vivo necesita ser evaluado en un estudio separado de pacientes con tuberculosis infectados con VIH.

Ejemplo 4 Detección de respuestas de células T CD4 en contactos saludables Se uso el panel consistente de los péptidos mostrados por las SEC. ID Números: 1 a 8, para detectar respuestas en 26 contactos caseros saludables de casos índice con tuberculosis pulmonar positiva al frotis del esputo. Se detectaron respuestas en 22 de los contactos, indicando que el panel fue lo suficientemente sensible para detectar la infección por M. tuberculosis, asintomática. 26 voluntarios saludables (22 de los cuales habían sido vacunados con la BCG) se analizaron también y ninguno respondió a alguno de los péptidos. De esta manera, el panel fue capaz de distinguir exitosamente entre los contactos infectados, asintomáticos, y los vacunados con BCG, saludables.

Ejemplo 5 Detección de respuestas de las células T CD4, en contactos saludables, usando un panel diferente Se usó un panel diferente al que se usó en los ejemplos previos, para detectar respuestas en contactos saludables usando el ensayo ELISPOT. El panel consistió de los péptidos mostrados por las SEC. ID Números 1 a 6, 8 y 9. Todos los contactos tienen una exposición prolongada a un caso índice con tuberculosis pulmonar abierta, positiva al frotis, y tienen una prueba Heaf positiva de grado 3 o 4. Uno de los contactos trabaja en el mismo cuarto (y en el mismo turno) que un índice en una fabrica. Un contacto estuvo en la misma sala del hospital que el índice, por varios días. Todos los otros contactos eran de la misma casa que el índice. 20 de los 22 contactos resultaron positivos a la prueba con el panel. 15 de los contactos resultaron positivos a la prueba con ESI.

Ejemplo 6 Sensibilidad del panel en comparación con el uso de ESAT-6 entero Se encontró que un número de pacientes con tuberculosis tenían únicamente respuestas de las células T CD8, específicas para el ESAT-6, y ninguna respuesta de las células T CD4 para este antígeno. Dado que en una prueba de diagnóstico el ESAT-6 entero producirá únicamente una respuesta de las células T CD4 y no de las células T CD8, esos pacientes (quienes tienen únicamente respuestas de las células T CD8) podrían no ser detectados usando una prueba diagnóstica basada en ESAT-6 entero. Sin embargo los péptidos son capaces de producir una respuesta de ambas células T CD4 y CD8 y por lo tanto esos pacientes podrían detectarse usando los péptidos de la invención. De esta manera, el uso de esos péptidos conduce a una mayor sensibilidad de la prueba de diagnóstico.

Tabla 1 Pacientes con Controles con tuberculosis (%) enfermedades diferentes a la TB (%) Etnicidad: ISC* 24 (51) 24 (48) Negro 14 (30) 14 (28) Blanco 8(17) 9(19) Oriental 1(2) 0(0) Total: 47 47 Sexo (M/F) 30/17 27/20 Edad: media 35(18-74) 39(17-75) (rango) ISC*= Subcontinente indio Tabla 2: Características demográficas de pacientes con tuberculosis y controles con enfermedades diferentes a la tuberculosis.

Número de pacientes (%) TB Pulmonar (PTB) 25 Negativa al frotis del esputo 6(13) Positiva al frotis del esputo 19(40) TST Positiva/Número total de 9/14 pacientes con PTB sometidas a la prueba TB Extrapulmonar (EPTB) 22 Linfadenitis 6(13) Músculoesquelética 6(13) Miliar 3(6) Gastrointestinal 3(6) Pleural 3(6) Meníngea y miliar 1(2) TST Positiva/Número total de 9/12 pacientes con EPTB sometidos a la prueba TST positiva total/todos los 18/26 (69%) pacientes con PTB y EPTB sometidos a la prueba Tabla 3: Características clínicas de pacientes con tuberculosis (todos confirmaron ser positivos al cultivo para la M. tuberculosis) Diagnosis Número de pacientes Pneumonía 6 Sarcoidosis 3 Endocarditis infecciosa 3 Linfoma 2 Cáncer de pulmón 2 Osteomielitis crónica 2 Colitis ulcerativa 2 Enfermedad de Crohn 2 Enterocolitis infecciosa 2 Malaria ( P. falciparum, P. vivax) 2 Enfermedad crónica del hígado 2 Celulitis 2 Hemaglobinopatías (SS, HbH) 2 Infección pulmonar por A. lumbridoides 1 Pancreatitis aguda 1 Fiebre dengue 1 Esquistosomiasis de la vejiga 1 SLE 1 Bronquitis aguda 1 Meningococemia 1 Amigdalitis 1 Crisis de las células falciformes 1 Úlcera gástrica 1 Dermatitis herpetiformis 1 Trombosis venosa 1 Síndrome nefrótico 1 Insuficiencia cardiaca por congestión venosa Tabla 4: Diagnosis de controles con enfermedades diferentes a la TB Proporciones de respuesta Pacientes con TB 45/47 Controles con enfermedad 4/47 diferente a la TB Sensibilidad (Cl* de 95% ) 96% (92%-100%) Especificidad (Cl* de 95%) 91.5% (86%-97%) Proporciones de Probabilidad (LR) LR positivas 11.25 LR negativas 0.05 Cl*= Intervalo de confianza Tabla 5: Utilidad clínica proyectada del ELISPOT ex vivo con péptidos ESAT-6 para la diagnosis de la tuberculosis activa, en base a sus características operativas en este estudio Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes rei indicaciones:

1. Un método para determinar la infección en un humano por, o la exposición de un humano a, una micobacteria que exprese el ESAT-6, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto una población de células T del humano, con el péptido representado por la SEC. ID No. : 1 y, opcionalmente, uno o más péptidos adicionales representados por las SEC. ID Números 2 a 11 e (ii) determinar, in vi tro, si las células T de esa población de células T, reconocen el (los) péptido (s).

2. El uso del péptido representado por la SEC. ID No. : 1 y, opcionalmente, uno o más péptidos adicionales representados por las SEC. ID Números 2 a 11, para la preparación de un medio para el uso en la determinación de una infección de un humano por, o la exposición a, una micobacteria que exprese el ESAT-6, el método comprende determinar si las células T del humano reconocen o no el (los) péptido (s).

3. Un método o uso de conformidad con la 7 reivindicación 1 o 2, caracterizado porque se emplea un panel peptídico que consiste de, además del péptido representado por la SEC. ID No. : 1, uno o más péptidos seleccionados de los péptidos representados por las SEC. ID Números 2 a 11.

4. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se emplean al menos los péptidos representados por las SEC. ID Números 1 a 8.

5. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se emplean uno o más péptidos adicionales seleccionados de los péptidos representados por las SEC. ID. Números 9, 10 y 11.

6. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado porque alguno de los péptidos está substituido por un análogo que puede enlazar un receptor de células T, que reconozca el péptido.

7. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado porque alguno de los péptidos está substituido por un análogo de péptido que es al menos 70% homólogo, preferentemente al menos 80% homólogo, de manera más preferentemente al menos 90% homólogo, a todo el péptido substituido, correspondiente, y que conserva la capacidad de ser reconocido por células T de una población de células T que reconoce el péptido substituido, correspondiente.

8. Un método o uso de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado porque alguno de los péptidos está substituido por un análogo de péptido que tiene una o más deleciones en el término N y/o en el término C, y que conserva la capacidad de ser reconocido por las células T de una población de células T que reconoce el péptido substituido, correspondiente.

9. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8, caracterizado porque alguno de los péptidos está substituido por un análogo de péptido que tiene una o más substituciones conservadoras, comparado con el péptido substituido, correspondiente, y que conserva la capacidad de ser reconocido por las células T de una población de células T que reconoce el péptido substituido, correspondiente.

10. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el reconocimiento del (de los) péptido (s) por las células T está determinado por la determinación de la secreción de una citocina de las células T.

11. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se determina la secreción de IFN-? de las células T.

12. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la secreción de IFN-? de las células T se determina permitiendo que la IFN-? secretada se enlace a un anticuerpo inmovilizado, específico para la citocina, y luego determinando la presencia del complejo de anticuerpo/citocina.

13. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células T son células recientemente aisladas ex vivo, de la sangre periférica.

14. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizado porque las células T se cultivan previamente in vitro con el(los) péptido(s).

15. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la micobacteria es la M. tuberculosis o la M. bovis.

16. Un estuche para llevar a cabo un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende un panel peptídico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o con cualesquiera de las reivindicaciones 6 a 9 como dependientes de las reivindicaciones 3 a 5, y opcionalmente un medio para detectar el reconocimiento de un péptido por parte de las células T.

17. Un estuche de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque incluye un anticuerpo para la IFN-?.

18. Un estuche de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo está inmovilizado sobre un soporte sólido y porque incluye también, opcionalmente, un medio para detectar cualquier complejo de anticuerpo/IFN-?.

19. El uso de uno o más polinucleótidos capaces de expresar en células humanas, un péptido o péptidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, para la preparación de un medio para el uso en la determinación de la infección de un humano por, o la exposición a, una micobacteria que expresa el ESAT-6, el método está caracterizado porque comprende determinar si las células T del humano reconocen o no el (los) péptido (s).

20. Un estuche para llevar a cabo un uso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende uno o más polinucleótidos capaces de expresar en células humanas un panel peptídico como se define en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o en las reivindicaciones 6 a 9 como dependientes de las reivindicaciones 3 a 5.

21. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un panel peptídico de conformidad con la definición de cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o reivindicaciones 6 a 9 como dependientes de las reivindicaciones 3 a 5, o uno o más polinucléotidos capaces de expresar los péptidos del panel en células humanas, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

22. Un método para diagnosticar una infección en un humano por, o la exposición de un humano a, una micobacteria que expresa el ESAT-6, caracterizado porque comprende : (i) poner en contacto una población de células T del humano, con un panel de péptidos representados por las SEC. ID Números: 1 a 8, en donde las células T son células aisladas recientemente ex vivo, de la sangre periférica, e (ii) determinar, in vi tro, si las células T de esa población de células T, muestran una respuesta de reconocimiento a esos péptidos, determinando la secreción de IFN-? de las células T.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el panel se expande para incluir adicionalmente uno o más péptidos adicionales seleccionados de los péptidos de las SEC. ID Números 9 a 11.

24. Un método de conformidad con la reivindicación 22 o con la reivindicación 23, caracterizado porque uno o más de los péptidos está substituido por un análogo como se define en cualesquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 9.

25. Un método o uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 9 y 22 a 24, caracterizado porque los péptidos se encuentran recolectados .

26. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9 y 22 a 25, caracterizado porque la presencia de una bacteria que expresa el ESAT-6 se determina en un contacto saludable, sospechoso, que ha estado expuesto a la micobacteria.