MXPA00005708A - Nuevos metodos de purificacion de proteina tgf-beta - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para la purificación de proteínas de la superfamilia TGF- , incluyendo proteínas osteogénicas tales como las proteínas morfogenéticas (BMPs).

Description

NUEVOS MÉTODOS PARA LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA TGF-ß Campo de la Invención Esta invención se refiere generalmente a nuevos métodos para la recuperación y purificación de proteínas de la superfamilia de proteínas del factor ß de crecimiento de transformación (TGF-ß). Más particularmente, esta invención se refiere a nuevos métodos de purificación de tales proteínas, incluyendo proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs).

Antecedentes de la Invención La superfamilia de proteínas del factor ß de crecimiento de transformación, incluyendo a las BMPs y otras proteínas osteogénicas pueden ser producidas en cultivos (por ejemplo, células de levadura, E. Coli y de mamífero) transformadas con un vector de expresión conteniendo el ADN correspondiente. Previamente ha sido descrita la clonación y la expresión de la superfamilia de proteínas del factor ß de crecimiento de transformación, incluyendo las proteínas morfogenéticas de hueso (también llamadas proteínas osteogénicas). Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,877,864; 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; 5,141 ,905; 5,688,678; 5,661 ,007; 5,637,480; 5,639,638; 5,658,882 y 5,635,372. Otras composiciones que también pueden ser útiles incluyen Vgr-2 y cualesquiera de los factores de crecimiento y diferenciación (GDFs), incluyendo aquellos descritos en las publicaciones PCT WO94/15965; WO94/15949; WO95/01801; WO95/01802; W094/21681 ; W094/15966 y otras. También pueden ser útiles en la presente invención la BIP, descrita en WO94/01557; y la MP52, descrita en la publicación PCT WO93/16099. Las descripciones de la totalidad de las publicaciones mencionadas son incorporadas a la presente como referencias. El uso de células hospederas adecuadamente transformadas permite la producción recombinante de altos niveles de proteína. Para proteínas que son secretadas a partir de la célula hospedera, la purificación de la proteína de interés generalmente involucra el aislamiento y purificación del medio de cultivo de la célula hospedera. Típicamente, el medio de cultivo contiene nutrientes seleccionados (por ejemplo, vitaminas, aminoácidos, co-factores, minerales) y puede contener factores de crecimiento/complementos adicionales, incluyendo insulina y posiblemente proteínas exógenas adicionales. Además, el medio acondicionado frecuentemente contiene no solamente la proteína secretada de interés, sino también cantidades importantes de proteínas secretadas adicionales de célula hospedera y otras substancias de la célula hospedera (por ejemplo, ácidos nucleicos, vesículas de membrana). Así, aún cuando se expresa en altos niveles, el producto de interés puede representar solo una minoría de to jas las proteínas presentes en el medio acondicionado. No en forma inesperada, las proteínas secretadas por células hospederas transformadas poseen características bastante similares a aquellas del producto de interés (por ejemplo, carga, tamaño de molécula, composición de aminoácidos), complicando de manera importante el proceso utilizado para la purificación. Ciertas condiciones de purificación que son efectivas en evitar la desnaturalización del producto de interés no son efectivas en distinguir diferencias menores entre las proteínas secretadas, haciendo de esta forma extraordinariamente difícil la separación del producto de interés de todas las otras proteínas presentes de la célula hospedera. Además de las proteína de célula hospedera secretadas que no se desean como se describió anteriormente, el medio acondicionado también puede contener productos derivados del gene expresado en forma heteróloga y que codifica para el producto de interés. Estos no son deseables para la substancia del fármaco final e incluyen, por ejemplo, formas de producto que carecen de ciertas modificaciones post-traduccionales tales como la glicosilación, sulfatación, carboxilación gamma, u otras modificaciones potencialmente necesarias para la actividad biológica (tales como el procesamiento de formas precursoras). Además, formas degradadas proteolíticamente del producto de interés pueden estar presentes en el medio acondicionado y que también requieren de ser retiradas durante la purificación, pero que se asemejan muy estrechamente al producto de interés. Desafortunadamente, la mayoría de los planteamientos, tales como la cromatografía de intercambio ¡ónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de exclusión por tamaño no proveen el grado de resolución necesario para distinguir el producto de interés de las formas no deseadas del producto. Para aprovechar totalmente las diferencias menores entre el producto deseado y los contaminantes (por ejemplo, pequeñas diferencias de carga, pequeñas diferencias del tamaño de la molécula), con frecuencia se requiere del uso de desnaturalizadores fuertes. Dichos desnaturalizadores, sin embargo, pueden conducir a la pérdida de la actividad biológica, expresión de sitios neo-antigénicos, y pueden potencialmente mejorar la descomposición química de las modificaciones post-traduccionales seleccionadas. Típicamente, los investigadores han utilizado combinaciones de técnicas cromatográficas tradicionales para purificar los productos deseados. A menudo, tales técnicas son insuficientes para la purificación de un producto al nivel de pureza y consistencia que se desea para un producto terapéutico humano. Los investigadores han intentado superar esta dificultad mediante el uso de la cromatografía de afinidad en donde una proteína de interés es unida a un ligando inmovilizado con el que actúa específicamente. Enseguida a un lavado apropiado, el producto deseado puede ser sometido a elución mediante rompimiento de la interacción ligando-proteína, resultando a menudo un eluato significativamente más puro. Sin embargo, en la instancia de separación de un producto deseado a partir de formas modificadas presentes en el medio acondicionado, las técnicas de cromatografía de afinidad de una sola etapa son frecuentemente ineficaces, y deben ser utilizadas en conjunto con otras técnicas de resinas de afinidad y/o de separación tradicional. Desafortunadamente, el empleo de múltiples etapas para lograr mayor resolución puede también resultar en rendimientos inaceptablemente bajos. Aún etapas de cromatografía de afinidad de alta resolución (por ejemplo, purificación de inmunoafinidad usando anticuerpo monoclonal inmovilizado) pueden no aportar una resolución suficiente del producto deseado de los otros componentes presentes en el medio de cultivo debido a sitios comunes de interacción. Por ejemplo, en donde un epitopo que está presente en el producto de interés, también está presente en una forma degradada en forma proteolitíca del producto o una forma precursora del producto deseado, ambos competirán por el mismo sitio. Además, para separar el producto de interés de entre moléculas con propiedades similares (por ejemplo, formas modificadas del gene expresado) es también importante separar el producto deseado a partir de los componentes presentes en el medio acondicionado con los que específicamente interactúa. En donde la proteína de interés está cargada en forma positiva, ésta tenderá a unirse a cualesquiera moléculas cargadas en forma negativa y que estén presentes, haciendo de esta forma muy difícil la purificación de la proteína mediante métodos tradicionales. Por ejemplo, ciertas proteínas, una vez expresadas y secretadas realmente se "aferran" a la célula hospedera y permanecen asociadas en forma recalcitrante con la célula hospedera, haciendo virtualmente imposible la purificación sin una desnaturalización concomitante. En consecuencia, continúa existiendo en la técnica actual una necesidad de métodos de purificación de proteína que superen en forma efectiva todas estas dificultades.

Sumario de la Invención Los métodos de la presente invención están dirigidos a ia purificación de proteína, la cual comprende los pasos de aplicación de medio de cultivo celular a una resina de heparina o similar a heparina, elución con sal para desplazar la proteína de interés, aplicación del primer eluato a una resina de interacción hidrofóbica, elución con disolventes con fuerza iónica disminuida o no polares para disminuir las interacciones hidrofóbicas, y posterior y opcionalmente aplicar el segundo eluato a una resina de intercambio aniónico, usada en el modo no adsorbente, y usada en tándem con una resina de intercambio catiónico y sometida a elución con sal. También, opcionalmente, este tercer eluato es diafiltrado y/o concentrado usando, por ejemplo, un cartucho de membrana enrollada en espiral u otro dispositivo adecuado.

Más específicamente, medio acondicionado conteniendo cultivo celular es filtrado a través de un filtro y cargado dentro de una columna de cromatografía Cellufine Sulfate. Las resinas de heparina o similares a heparina incluyen aquellas resinas que tienen un grupo cargado negativamente tal como heparina, esteres sulfatados de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo, y carboximetilo e incluyen Matrex Cellufine Sulfate, Heparin Sepharose, Heparin Toyopearl, Carboxy Sulfon, Fractogel EMD-SO3 y Fractogel-EMD COO, siendo la preferida la Matrex Cellufine Sulfate. La columna es lavada y posteriormente eluida para recolectar, por ejemplo, BMP. Un primer lavado adecuado comprende una solución salina tal como cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, fosfato de sodio, o fosfato de potasio, y opcionalmente, puede contener un agente regulador adecuado. Los rangos de concentración adecuados son aquellos que son efectivos para lavar sin eluir la BMP e incluyen, por ejemplo, sal 5 mM a 600 mM, y preferiblemente es Tris 50 mM, cloruro de sodio 500 mM. El primer eluyente comprende Tris 50 mM, NaCI 0.5 M, arginina 0.5 M; los rangos de concentración adecuados son aquellos que son efectivos en eluir BMP, incluyendo por ejemplo una solución conteniendo un agente regulador a un pH de 8.0, tal como Tris, en el rango de 5 a 100 mM, preferiblemente aproximadamente 50 mM, una sal tal como NaCI en el rango de 200 a 1000 mM, preferiblemente 500 mM, y arginina en el rango de 0 a 1000 mM, preferiblemente 500 mM. El primer eluato es aplicado a una columna de Butil Sefarosa (Butyl Sepharose) que es lavada con una segundo lavado apropiado y que comprende una solución salina tal como de cloruro de sodio, sulfato de amonio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio y, opcionalmente, puede contener un agente regulador adecuado. Los rangos de concentración adecuados son aquellos que son efectivos para lavar la columna sin eluir la BMP, e incluyen, por ejemplo, sal 750 mM a 1,250 mM, y preferiblemente es Tris 50 mM, cloruro de sodio 1000 mM. El segundo eluyente es uno que sea suficiente para eluir la proteína de interés, por ejemplo, uno que comprende Tris 50 mM, arginina 0.5 M, propilenglicol al 20%; los rangos de concentración adecuados son aquellos que son efectivos en eluir BMP, e incluyen, por ejemplo, una solución conteniendo un agente regulador a un pH de aproximadamente 7.0, tal como Tris o sus equivalente, en el rango de concentración de 5 a 100 mM, preferiblemente aproximadamente 50 mM, arginina o su equivalente en el rango de 250 mM a 1000 mM, preferiblemente aproximadamente 500 mM, y un disolvente no polar, tal como propilenglicol o su equivalente, en el rango de 10% a 50%, preferiblemente aproximadamente 20%. El eluato de la columna de Butyl Sepharose (referido aquí como la segunda columna) es opcionalmente bombeado a través de una resina de intercambio aniónica de DEAE; el flujo no ligado es bombeado dentro de una resina de intercambio catiónica de Carboxy Sulfon conectada en tándem a la resina de DEAE.

Las columnas de DEAE y Carboxy Sulfon son lavadas, desconectadas, y posteriormente la columna de Carboxy Sulfon es eluida con sal para recolectar la i BMP (referida aquí como el tercer eluato). Las resinas de intercambio aniónico adecuadas incluyen aquellas resinas que tienen un grupo con carga positiva tal como dietilaminoetano (DEAE), polietilenoimina (PEÍ) y aminoetano cuaternario (QAE) e incluyen Q-Sepharose Fast Flow, DEAE-Sepharose Fast Flow, POROS-Q, Fractogel-TMAE. Fractogel-DMAE, QAE-Toyopearl y DEAE-Toyopearl, siendo la resina preferida la DEAE-Toyopearl (Tosohaas). Las resinas de intercambio catiónico apropiadas incluyen aquellas que poseen un grupo cargado en forma negativa, tal como heparina, esteres sulfatados de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo, y carboximetilo e incluyen Matrex Cellufine Sulfate, SP-Sepharose Fast Flow, Mono S, Resource-S, Source S, Carboxy Sulfon, Fractogel EMD-SO3 y Fractogel-EMD COO, siendo la preferida la Carboxy Sulfon. Un tercer lavado apropiado comprende una solución salina tal como cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio o sulfato de amonio, y puede contener un agente regulador adecuado y, opcionalmente, arginina. Los rangos de concentración adecuados son aquellos que son efectivos en lavar sin eluir la BMP, e incluyen, por ejemplo, sal de 0 mM a 250 mM y, preferiblemente es fosfato de potasio 50 mM, arginina 250 mM. El tercer eluyente comprende fosfato de potasio 50 mM, NaCI 400 mM y arginina 500 mM; los rangos de concentración adecuados son aquellos que son efectivos para eluir la BMP, incluyendo, por ejemplo, una solución conteniendo un agente regulador a un pH de aproximadamente 7.5, tal como fosfato de potasio, en el rango de concentración de 5 a 100 mM, preferiblemente aproximadamente 50 mM, una sal tal como NaCI en el rango de 200 mM a 1000 mM, preferiblemente 400 mM o más alta, y arginina en el rango de 0 a 1000 mM, preferiblemente 500 mM. Opcionalmente, se emplea un cartucho de membrana enrollada en espiral para intercambiar el regulador de elución de Carboxy Sulfon dentro de un regulador de formulación adecuada. Inmediatamente después de esta etapa de diafiltración, la BMP puede ser concentrada a >2.4 unidades de absorbencia/mL (a 280 nm) usando el cartucho enrollado en espiral, si es necesario. La BMP concentrada es entonces filtrada, muestreada, etiquetada y almacenada a -80 °C. La efectividad del proceso en la purificación de la BMP se demuestra mediante análisis SDS-PAGE. Después de la etapa del Cellufine Sulfate, la BMP es claramente visible como dos bandas principales en la región de los 15-20 kd en un gel reducido, aunque todavía están presentes también otras proteínas contaminantes. Estas proteínas contaminantes son extensamente eliminadas mediante la Butyl Sepharose y son adicionalmente eliminadas por la etapa de DEAE/Carboxy Sulfon. También se proveen por la presente invención composiciones de BMP purificadas y producidas por los métodos de la invención.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un diagrama a bloques que ilustra las etapas del proceso de purificación de la presente invención.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Como se emplea aquí, el término "BMP" incluye, pero no se limita a proteínas de la superfamilia de proteínas del factor ß de crecimiento de transformación, incluyendo BMPs, aisladas de una variedad de fuentes de tejido (incluyendo, pero no limitándose a, epidermis, tendón, hueso, cartílago, sangre, tejido fetal, tejido neuronal, hígado, ligamento, músculo, páncreas, pulmón, corazón, bazo, riñon), procedentes de líneas celulares transformadas, y proteínas recombinantemente producidas que están aisladas del medio de cultivo de célula hospedera o fuentes microbianas (incluyendo, pero no limitándose a caldo de fermentación, lisato de E. Coli, lisato de levadura y similares). Como se emplea aquí, los términos resina de "heparina" y resina "similar a heparina" se utilizan en forma intercambiable e incluyen, pero no se limitan a, resinas conteniendo una fracción inmovilizada y cargada negativamente tal como la heparina, esteres sulfatados de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo, y carboximetilo e incluyen Fractogel EMD-SO3, Carboxi Sulfon, Fractogel-EMD-COO, Heparin Sepharose, Matrex Cellufine Sulfate y equivalentes de ellos, siendo actualmente la más preferida la Matrex Cellufine Sulfate. Alguien capacitado en la técnica fácilmente apreciará que el "primer lavado" puede ser con cualquier solución salina e incluir, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio, y puede ser regulada en forma adecuada. Típicamente, las concentraciones van desde bajas (sal 5 mM) hasta altas (sal 600 mM), siendo actualmente lo que se prefiere cloruro de sodio 500 mM. Como se emplea aquí, el término "primer eluyente" incluye, pero no se limita a, soluciones compuestas de un agente regulador (por ejemplo, Tris) a una concentración de aproximadamente 50 mM, sal (por ejemplo, NaCI) a una concentración que sea suficiente para la elución de la resina (por ejemplo, aproximadamente 500 mM), a aproximadamente pH 8.0, y aproximadamente arginina 500 mM; los rangos de concentración adecuados son aquellos que son efectivos en la elución de la BMP, incluyendo por ejemplo una solución conteniendo un agente regulador a un pH de aproximadamente 8.0 tal como Tris, en el rango de 5 a 100 mM, preferiblemente aproximadamente 50 mM, una sal tal como NaCI en el rango de 200 a 1000 mM, preferiblemente 500 mM, y arginina en el rango de 0 a 1000 mM, preferiblemente 500 mM.

Como se emplea aquí, el término "similar a Butyl Sepharose" incluye, pero no se limita a, Butyl Sepharose 4B, Butyl Sepharose Fast Flow, Butyl-Toyopearl, y otros medios de interacción hidrofóbica que incluyen Phenyl Sepharose Fast Flow, Phenyl Toyopearl, Phenyl Fractogel, Butyl Fractogel y equivalentes adecuados, siendo actualmente el que más se prefiere el de Butyl Sepharose 4B. Como se emplea aquí, el "segundo lavado" puede ser cualquier solución salina e incluye, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, fosfato de sodio o fosfato de potasio, y puede estar adecuadamente regulada. Típicamente, las concentraciones varían desde baja (sal 750 mM) hasta alta (sal 1250 mM), siendo actualmente la preferida Tris 50 mM, cloruro de sodio 1000 mM. Como se emplea aquí, el término "segundo eiuyente" incluye, pero no se limita a soluciones que comprenden un agente regulador (por ejemplo Tris) a una concentración de aproximadamente 5 a 100 mM, preferiblemente 50 mM, un agente promotor de la solubilidad (por ejemplo, arginina, urea u otro agente caotrópico equivalente), preferiblemente arginina a un rango de concentración de aproximadamente 250 mM a 1000 mM, preferiblemente aproximadamente 500 mM, y un disolvente no polar (por ejemplo, propilenglicol, etilenglicol, glicerol y equivalentes) a una concentración suficiente para romper la interacción de la BMP con la Butyl Sepharose, a aproximadamente un pH de 7.0, a un rango de concentración de aproximadamente 10% a 50%, y preferiblemente propilenglicol o su equivalente, a aproximadamente 20%. Como se emplea en este proceso, el segundo eluyente es preferiblemente compatible con la etapa de proceso subsecuente, incluyendo la dilución o diafiltración previa a la carga dentro de la etapa siguiente. Como se emplea aquí, el término "resina de intercambio aniónico" incluye, pero no se limita a resinas que tienen una fracción con carga positiva (a pH neutro), tal como dietilaminoetano (DEAE), polietilenoimina (PEÍ) y aminoetano cuaternario (QAE) e incluyen, por ejemplo, Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), DEAE-Sepharose Fast Flow, DEAE-Toyopearl, QAE-Toyopearl, POROS-Q, Fractogel- DMAE, Fractogel EEMD-TMAE, Matrex Cellufine DEAE y similares, siendo actualmente la preferida la DEAE. Como se emplea aquí, el término "resina de intercambio catiónico" incluye, pero no se limita a resinas que tienen un grupo con carga negativa tal como heparina, esteres sulfatados de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo y carboximetilo, e incluyen Matrex Cellufine Sulfate, SP-Sepharose Fast Flow, Mono S, Resource-S, Source S, Carboxi Sulfon, Fractogel EMD-SO3 y Fractogel-EMD COO, siendo actualmente la preferida la Carboxy Sulfon. Como se emplea aquí, el término "tercer lavado" puede ser cualquier solución salina e incluye, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio o sulfato de amonio, y puede estar adecuadamente regulada (por ejemplo, Tris, fosfato o sulfato) y opcionalmente puede contener arginina. Típicamente, las concentraciones de sal varían desde baja (sal 0 mM) hasta alta (sal 250 mM), siendo actualmente la preferida cloruro de sodio 0 mM. El "tercer lavado" que actualmente se prefiere comprende regulador de fosfato de aproximadamente 50 mM y arginina aproximadamente 250 mM. Como se emplea aquí, el término "tercer eluyente" incluye, pero no se limita a soluciones que comprenden un agente regulador (por ejemplo Tris, fosfato o sulfato) a un rango de concentración de aproximadamente 5 a 100 mM, preferiblemente 50 mM, un agente promotor de la solubilidad (por ejemplo, arginina, urea u otro agente caotrópico), preferiblemente arginina a un rango de concentración de 0 mM a 1000 mM, preferiblemente una concentración de aproximadamente 500 mM, y sal (por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio) a una concentración suficiente para romper la interacción de la BMP con la resina (por ejemplo en el rango de 200 a 1000 mM, y preferiblemente, aproximadamente 400 mM o más alta. La Figura 1 provee una vista global del proceso. Si bien el orden establecido de las etapas es el de la modalidad actualmente preferida, se apreciará por alguien capacitado en la técnica que numerosas variaciones y modificaciones son posibles y que tales modificaciones están dentro de la presente invención. Por ejemplo, si se desea el orden puede ser re-configurado y algunas etapas pueden ser omitidas.

Genes que codifican para proteínas osteogénicas recombinantes pueden ser expresadas en líneas celulares de mamífero tales como CHO (Ovario de Hámster Chino), COS, BHK, Balb/c 3T3, 293, y líneas celulares similares que se conocen en la técnica. Las células de mamífero pueden ser hechas crecer en cualquier medio adecuado que se conoce en la técnica. Los medios de cultivo apropiados para células pueden contener aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, glucosa, piruvato de sodio, ácido tioctico, ácido linoleico, hidrocortisona, putrescina, insulina recombinante, sulfato de dextrano y metotrexato. Por ejemplo, un medio adecuado es un medio de cultivo de células, basado en DME/F12 (50:50), complementado con hidrocortisona, putrescina, insulina recombinante, sulfato de dextrano y metotrexato. Otros medios, tales como a-MEM, MEM de Dulbecco, RPMI 1640, también pueden ser apropiados, con complementos adecuados, según resulte necesario. (Freshney, R.l. Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York (1983)). Las células pueden ser hechas crecer en la presencia o ausencia de un suero complementado tal como suero fetal de bovino (FBS). Las células pueden ser hechas crecer en cultivo de suspensión o monocapa y, adicionalmente, pueden ser hechas crecer en lotes de producción a gran escala. Incorporadas como referencias se tienen a las descripciones de WO 95/12664 (Gl 5217-PCT) relacionada con métodos y medios nutrientes útiles para la adaptación de líneas celulares de mamífero a densidades de cultivo, y de la solicitud de patente en trámite USSN 08/481,774 (Gl 5233) relacionada con un medio de cultivo de células para la producción de proteínas diméricas. Cualquier célula capaz de producir una proteína de la superfamilia de proteínas TGF-ß puede ser usada en el método de la presente invención. Células CHO transformadas son las células hospederas preferidas que se utilizan para producir una proteína osteogénica, tal como ias BMP, particularmente la BMP-2, de acuerdo con la presente invención. El medio de crecimiento de células puede estar complementado con FBS para mejorar el crecimiento de las células CHO transformadas en el cultivo. Si se desea adicionar FBS, pueden agregarse concentraciones del FBS tan bajas como 0.5% (v/v). Sin embargo, la adición de proteínas de origen animal siempre presenta el riesgo de albergar virus y otros agentes perjudiciales. La adición de FBS no es necesaria para la práctica de la presente invención. Se prefieren medios libres de suero para usarse en la producción de proteínas osteogénicas recombinantes de acuerdo con la presente invención. Se sabe que las células CHO liberan lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y partículas tipo C (similares de retrovirales defectuosas) dentro del medio acondicionado. Por lo tanto, la capacidad de un proceso de purificación para eliminar y/o inactivar contaminantes derivados del hospedero y que pueden estar presentes, es un aspecto importante del proceso. La remoción de proteína de células CHO es confirmada mezclando intencionalmente proteína de células CHO radiomarcada con material de carga y cuantificando la reducción en cada etapa. Un factor de reducción para contaminantes de la proteína de la célula hospedera en cada etapa de purificación, y uno global, son estimados introduciendo concentraciones de proteína de células CHO que sean más altas que aquella esperada durante la producción normal. Nunca se ha demostrado que las partículas tipo C presentes en las células CHO sean infecciosas. Sin embargo, ia eliminación o inactivación de estas partículas durante el proceso de purificación todavía es considerada como deseable. Un grupo de consenso de virus se utiliza para estimar el potencial de remoción/inactivación de las etapas de purificación. Estos virus han sido escogidos para representar diferentes tipos y rangos de tamaño (por ejemplo, encapsulado/no encapsulado, conteniendo ADN/conteniendo ARN). Se incluye un retrovirus de murino (virus de Leucemia de Murino Xenotrópico) y otros que son patógenos humanos para los cuales las células CHO son permisivas (Parafluenza 3 y Retrovirus 3). El virus 40 de Simio también es incluido para investigar un virus más resistente. En estos estudios, el virus es introducido dentro del proceso en cada etapa cromatográfica y se determina la remoción/inactivación. La mayoría de los componentes del medio son productos químicos menores, incluyendo sales, aminoácidos y azucares que generalmente no se purifican conjuntamente con la proteína de interés en las columnas cromatográficas y generalmente no son retenidos por una membrana de diafiltración. Sin embargo, polímeros grandes, tales como el sulfato de dextrano y el alcohol de polivinilo, que son aditivos útiles para el medio, pueden interactuar de manera específica con el producto de interés y frecuentemente ser purificados conjuntamente. Estos componentes deben por lo tanto ser purificados y eliminados de la proteína de interés. Por ejemplo, un sulfato de dextrano útil en el medio para producir proteínas recombinantes tales como las BMP tiene un peso molecular de 5,000 y un contenido de azufre del 18% (catálogo Sigma # D-7037). Otro sulfato de dextrano tiene un peso molecular de 500,000 y un contenido de azufre del 17% (Pharmacia). Incorporada aquí como referencia se tiene a la patente de los E.U.A: No. 5,516,654 (Gl 5180A), la cual se refiere a un método para la producción de proteína en donde se agrega sulfato de dextrano al medio de cultivo. De acuerdo con la presente invención, el sulfato de dextrano puede ser agregado al medio de crecimiento en un rango de concentraciones de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 µg/mL, preferiblemente aproximadamente 200 µg/mL de sulfato de dextrano. El metotrexato y otros marcadores susceptibles de selección, los cuales se usan frecuentemente en un volumen pequeño en la producción temprana de cultivos celulares, pueden ser tóxicos. Su remoción de la preparación de proteína es una etapa importante (por ejemplo, la Etapa del Matrex Cellufine Sulfate que provee una remoción de 3,540 veces) del proceso de purificación (Ver Tabla 8). La expresión de una proteína osteogénica, tal como la BMP-2, puede lograrse insertando un gene adecuado dentro de un vector de expresión, insertando este vector dentro de una célula de mamífero y seleccionando células que expresen la proteína osteogénica. Por ejemplo, los vectores que codifican para BMP-2 son descritos en la patente de los E.U.A. No. 5,013,649, cuyo contenido se incorpora a la presente como referencia. La producción de proteína osteogénica recombinante, tal como BMP-2, de las células de mamífero que expresan el gene de BMP-2 puede ser medida por métodos conocidos tales como el marcado radioactivo de células con [35S]-metionina y analizando las proteínas secretadas mediante electroforesia de gel de poliacrilamida (PAGE) y autoradiografía. Para la medición de la expresión de la BMP-2 a partir de la producción por lotes, la cantidad de BMP-2 funcional secretada puede ser cuantificada por metodologías de bioensayo o cromatográficas. Puede emplearse cualquier ensayo apropiado, por ejemplo, el ensayo de la inducción de la actividad de la fosfatasa alcalina en una línea celular que responde a la BMP-2, o el ensayo de ia formación de hueso ectópico en un mamífero tal como la rata, conejo, gato o perro. Puede emplearse cualquier ensayo cromatográfico que separe el producto de interés de íos contaminantes, incluyendo la RP-HPLC. Si bien los ejemplos siguientes describen la presente invención siendo llevada a cabo con una línea celular que codifica para BMP-2, estos ejemplos no son limitativos. La presente invención también puede ser utilizada con resultados similares para otros miembros de proteínas de la superfamilia del factor beta de crecimiento de transformación, particularmente las proteínas morfogenéticas de hueso, incluyendo BMP-1 a BMP-15. Las proteínas osteogénicas de la familia BMP son un desarrollo promisorio en el campo óseo y del cartílago. La familia BMP de proteínas incluye BMPs 1 a 15, y proteínas que son codificadas por secuencias de ADN que las hibridan bajo condiciones astringentes. Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la invención. Estos ejemplos son para propósitos ilustrativos únicamente y no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la invención reivindicada. El Ejemplo 1 describe la etapa de afinidad de heparina/similar a heparina; el Ejemplo 2 se refiere a la etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica; el Ejemplo 3 describe las etapas de purificación usando un tándem de intercambio aniónico-catiónico en Matrex Cellufine Sulfate; el Ejemplo 4 se refiere a una purificación adicional usando la etapa de diafiltración/concentración; y el Ejemplo 5 describe la prueba de pureza.

Ejemplo 1 : Etapa de Afinidad de Heparina/Similar a Heparina Al secretarse de la célula hospedera, la proteína secretada está positivamente cargada y se une fuertemente a la superficie exterior de la célula hospedera que está cargada negativamente. Una forma preferida para romper esta unión al exterior de la célula hospedera, sin destruir la proteína de interés y/o sin rompimiento y posterior fuga del contenido de la célula hospedera dentro del medio de cultivo, consiste en agregar sulfato de dextrano al medio de cultivo. Aunque esto tiene el efecto deseado de romper la interacción con la célula hospedera, crea otro problema, que consiste en la unión de la proteína de interés al sulfato de dextrano, lo cual complica adicionalmente el proceso de purificación. Sorpresivamente, se ha encontrado que la heparina o resina similar a heparina competirá efectivamente con el sulfato de dextrano por unirse a la BMP de manera que la resina puede emplearse de manera efectiva para separar la BMP del sulfato de dextrano. Se usa Matrex Cellufine Sulfate (Amicon) como una matriz de afinidad para la purificación de la rhBMP-2 del medio acondicionado. Esta resina está compuesta de perlas de celulosa esferoidal activadas con esteres de sulfato y que funcionan como un análogo de la heparina para la purificación de las proteínas de unión a heparina.

La resina compite de manera eficiente con el sulfato de dextrano presente en el medio de cultivo para unirse a rhBMP-2 a un pH de 8.0. La elución de la rhBMP-2 unida es logrado usando L-arginina 0.5 M agregada a Tris 50 mM más NaCI 0.5 M. Una columna cromatográfica de Cellufine Sulfate, o una equivalente, es la primera etapa en la purificación de la BMP. El medio acondicionado es filtrado titulado a un pH de 8.0 ± 0.2. El material titulado es cargado dentro de una columna equilibrada de Cellufine Sulfate a una proporción de flujo lineal < 3 cm/min. La columna es entonces lavada (Tris 50 mM, NaCI 0.5 M, pH 8.0) y puede ser eluida en forma inversa (Tris 50 mM, NaCI 0.5 M, L-arginina -HCl 0.5 M, pH 8.0). El eluato de la columna es recolectado como un solo pico de elución, aproximadamente un volumen de columna. Los parámetros de operación adecuados son descritos en la Tabla 1.

Tabla 1 Ejemplo 2: Etapa de Cromatografía de Interacción Hidrofóbica La etapa de similar a heparina elimina en forma efectiva varias especies de contaminantes de proteína, metotrexato, sulfato de dextrano y ADN. Todavía presentes en el primer eluato, conjuntamente con la proteína de interés, se encuentran varias formas de BMP en diversas etapas del proceso proteolítico, incluyendo las formas precursoras de elevado peso molecular (aproximadamente 110 kD y 80 kD en análisis SDS-PAGE no reductor) así como el producto deseado (15 kD - 20 kD en análisis SDS-PAGE reductor). Debido a que estas diversas especies difieren solo ligeramente en su hidrofobicidad, es difícil purificar estas especies de las otras por métodos convencionales. Sorprendentemente, se ha encontrado que la Butyl Sepharose permite la separación de varias formas de BMP-2 mediante un uso no convencional de la cromatografía de desplazamiento. La especie precursora de la BMP-2 compite con el producto deseado por la unión a la resina. Debido a las ligeras diferencias en la hidrofobicidad, el producto deseado, el cual es más hidrofóbico, se une más ligeramente a la resina; esto permite que la otra especie sea retirada en la carga de la columna y el lavado. La Butyl Sepharose 4B (Pharmacia) es una resina usada para la purificación de la BMP en un modo de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Esta resina está compuesta de butilamina acoplada a Sefarosa 4B activada con CNBr. La Butyl Sepharose, o una columna equivalente, es la segunda etapa de la presente invención. Las proteínas son unidas a resinas HIC en conductividades altas, lo cual promueve las interacciones hidrofóbicas. "Conductividad alta" es un valor mínimo de aproximadamente 50 mS/cm. La elución se lleva a cabo disminuyendo la intensidad iónica y/o mediante la adición de disolventes no polares para reducir las interacciones hidrofóbicas. Se define a la intensidad iónica disminuida como la disminución de la conductividad a un valor de por debajo de aproximadamente 20 mS/cm. Los disolventes no polares incluyen propilenglicol, etilenglicol, glicerol y equivalentes de ellos. El pico de elución del Matrex Cellufine Sulfate es ajustado a pH 7.0 ± 0.2 y NaCI 1000 mM con MES 200 mM, NaCI 4000 mM, L-arginina HCl 500 mM, pH 6.8. El MES es ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico. Este material es posteriormente cargado en el Butyl Sepharose equilibrado, o una columna equivalente, a una velocidad de flujo de < 30 cm/hr. La columna es entonces lavada (Tris 50 mM, NaCI 1000 mM, L-arginina-HCI 500 mM, pH 7.0) y la rhBMP-2 unida es opcionalmente eluida en forma inversa con Tris 50 mM, propilenglicol al 20%, L-arginina-HCI 500 mM, pH 7.0. El eluato de la columna es recolectado como un único pico de la elución, aproximadamente 1.5 volúmenes de columna. Los parámetros de operación apropiados de la columna se detallan en la Tabla 2. Tabla 2 Ejemplo 3: Intercambio Anión-Catión en Tándem La etapa de la Butyl Sepharose muestra la remoción de los contaminantes d la proteína de CHO, ADN y especies relacionadas con la BMP, distintas al product definido. Se ha encontrado que la inclusión de una etapa de cromatografía d intercambio aniónico resulta en una remoción incrementada de ADN y otro contaminantes no proteináceos. Una etapa adicional de cromatografía d intercambio catiónico provee remoción adicional de los contaminantes de la proteín de CHO y la concentración de la BMP. La Toyopearl-DEAE (TosoHaas) es una resina de intercambio aniónico débi que se une a proteínas con carga negativa y otros contaminantes en base a s carga. Se utiliza en el modo no adsorbente para la purificación de BMP, tal que no s une a la resina, pero los contaminantes cargados negativamente son capaces d unirse a la resina DEAE. La Carboxy Sulfon (J.T. Baker, Inc.) es una matriz a base de sílic funcionalizada con grupos de intercambio catiónico débiles y fuertes mezclados (po ejemplo, grupos carboxi y sulfona) La BMP se une a la Carboxy Sulfon ví interacciones de carga y es eluida por el rompimiento de estas interacciones usand reguladores con intensidad iónica incrementada. La etapa de cromatografía final en la purificación de la BMP está compuest por estas dos columnas de intercambio iónico, o sus equivalentes, operadas e tándem: columna de intercambio aniónico Toyopearl-DEAE (o sus equivalentes seguida de una columna de intercambio catiónico Carboxy Sulfon (o su equivalentes). La entrada al sistema de DEAE/Carboxy Sulfon penetra a la columna de DEAE primero. La salida de la columna DEAE es entonces instalada hacia l entrada de la columna Carboxy Sulfon. El pico de la Butyl Sepharose es diluido con 9-11 volúmenes de (fosfato d potasio 50 mM, L-arginina-HCI 0.25 M, pH 7.6). Esta solución es bombeada a travé de la columna de DEAE y sobre la columna Carboxy Sulfon a una velocidad de fluj < 300 cm/hr. Las columnas son entonces lavadas (fosfato de potasio 50 mM, L arginina-HCI 0.25 M, pH 7.6). Las dos columnas son desconectadas y la BMP unid a la columna Carboxy Sulfon es eluida con fosfato de potasio 50 mM, L-arginina-HCI 0.5 M, NaCI 0.4 M, pH 7.5. El eluato de la columna es recolectado como un solo pico de elución, aproximadamente 1 volumen de columna. Los parámetros de operación apropiados para estas columnas se detallan en la Tabla 3.

Tabla 3 Ejemplo 4: Etapa de Diafiltración/Concentración Esta es una etapa opcional de "acabado." Se emplea filtración de flujo tangencial para concentración e intercambio de regulador de las soluciones de proteínas. Se utiliza membrana de cortes de peso molecular especificado para retener componentes de gran peso molecular (por ejemplo, BMPs) mientras que los componentes de bajo peso molecular son eliminados (por ejemplo, sales). Agregando continuamente regulador nuevo al retentado, a una velocidad similar a la que la solución está pasando a través del filtro, los componentes del regulador original gradualmente irán diluyéndose. En este modo de diafiltración continua, el reemplazo de 5 volúmenes de retentado de un nuevo regulador reemplazarán efectivamente > 98% del regulador original. Sin la adición de un nuevo regulador, una solución de proteína es concentrada sin alterar la composición del regulador. La etapa final en el proceso de purificación involucra el intercambio del regulador de la elución del Carboxy Sulfon dentro de un regulador de formulación adecuada para la BMP. Esta es seguida de la concentración del material a > 2.4 unidades de absorbencia (a 280 nm), según sea necesario. Esta etapa puede ser realizada usando una membrana de un corte de 10,000 de peso molecular, enrollada en espiral, o equivalente. El eluato del Carboxy Sulfone es colocado en un recipiente limpio, sometido a autoclave y sellado. El material en el recipiente es entonces bombeado a través de la membrana, a una presión de transmembrana positiva y recirculada de regreso dentro del recipiente. La presión de transmembrana positiva fuerza a los solutos de bajo peso molecular a través de la membrana. La solución reguladora (L-histidina 0.01 M, L-arginina-HCL 0.5M u otra solución reguladora adecuada) penetra al recipiente a aproximadamente la misma velocidad que el material fluye a través de la membrana, diluyendo de esta forma el regulador de elución del Carboxy Sulfon. Este proceso de dialfiltración es continuado hasta que cuando menos 5 volúmenes de la solución reguladora hayan fluido dentro de recipiente. Después de que la diafiltración ha sido completada se cierra la válvula que permite que la solución reguladora penetre al recipiente. Para concentrar la BMP, la bomba del sistema es reiniciada y el material es filtrado hasta que se obtenga una concentración > 2.4 unidades de absorbencia (a 280 nm). El regulador de BMP es bombeado fuera del recipiente a través de un filtro de 0.2 µm y dentro de botellas de Teflon de dimensiones apropiadas. El material es muestreado, pesado, etiquetado y almacenado a -80 °C. Los parámetros de operación apropiados para este proceso son detallados en la Tabla 4.

Tabla 4 Ejemplo 5: Prueba de Pureza Se llevaron a cabo estudios que investigaran la efectividad del proceso de purificación referido anteriormente para eliminar ADN, virus, sulfato de dextrano y metotrexato, con los resultados descritos en las tablas siguientes: Tabla 5 Estudios de eliminación de ADN Tabla 6 Eliminación de Virus MuLV/Estudios de Inactivación Tabla 7 Estudios de Eliminación de Sulfato de Dextrano Tabla 8 Estudios de Eliminación de Metotrexato Si bien los ejemplos anteriores no son limitativos, puede apreciarse que el proceso anterior resulta en una remoción elevada de contaminantes potenciales, incluyendo AND, virus, sulfato de dextrano y metotrexato, de la proteína osteogénica recombinante producida a partir de células CHO transfectadas. Aunque el presente método de la invención es ejemplificado mediante la purificación de BMP producida en forma recombinante a partir de células hospederas transformadas, también es aplicable el método a la purificación de BMP que ocurre en forma natural dentro de una célula y puede usarse para purificar proteínas a partir de una solución o a partir de varios tipos de tejidos, homogenatos de célula, sobrenadantes de cultivos de células, o sub-fracciones celulares aisladas. No obstante que la presente invención ha sido descrita en términos de métodos y composiciones específicas, se comprenderá que se le ocurrirán variaciones y modificaciones a aquellos capacitados en la técnica al considerar la presente invención.

Se espera que numerosas modificaciones y variaciones en la invención, según se describe en los ejemplos ilustrativos anteriores, se les ocurra a aquellos capacitados en la técnica y en consecuencia, solo las limitaciones que aparecen en las reivindicaciones dependientes deberán ser colocadas sobre ellas. En consecuencia, se pretende que en las reivindicaciones anexas cubran todas las variaciones equivalentes que caigan dentro del alcance de la invención según se reivindica.

Claims (23)

1. Novedad de la Invención i 1. . Un método para la purificación de una proteína de la superfamilia TGF-ß en una solución, el cual comprende las etapas de: aplicar dicha solución a una resina similar a heparina, eluir dicha resina similar a heparina con un primer eluyente para forma un primer eluato, aplicar dicho primer eluato a una resina similar a Butyl Sepharose, . eluir dicha resina similar a Butyl Sepharose con un segundo eluyente para formar un segundo eluato conteniendo dicha proteína de la superfamilia TGF-ß .
2. 2. E=ll método de la reivindicación 1 , comprendiendo además las etapas de: aplicar dicho segundo eluato a una resina de intercambio ¡ónico, y eluir dicha resina de intercambio iónico con un tercer eluyente para formar un tercer eluato.
3. 3. El método de la reivindicación 2., en donde dicha resina de intercambio iónico es una resina seleccionada del grupo consistente en una resina de -intercambio aniónico y una resina de intercarribio catiónico.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde dicha resina similar a heparina tiene un grupo cargado negativamente, que es un miembro seleccionado del grupo consistente en heparina, esteres sulfatados de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo y carboximetilo.
5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde dicha resina similar a heparina es Matrex Cellufine Sulfate.
6. 6. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho primer eluyente comprende una sal.
7. 7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho primer eluyente comprende Tris 50 mM, NaCI 0.5 M y L-arginina 0.5 M.
8. 8. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha resina similar a Butyl Sepharose es un miembro seleccionado del grupo consistente en Butyl Sepharose 4B, Butyl Sepharose Fast Flow y Butyl-Toyopearl.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha resina similar a Butyl Sepharose es Butyl Sepharose 4B.
10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde dicho segundo eluyente comprende un agente regulador, un agente caotrópico y un disolvente no polar.
11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde dicho segundo eluyente es aproximadamente Tris 50 mM, arginina 500 mM y propilenglicol al 20%.
12. 12. El método de la reivindicación 3, en donde dicha resina de intercambio aniónico tiene un grupo cargado positivamente, que es un miembro seleccionado del grupo consistente en dietilaminoetano (DEAE), polietilenoimina (PEÍ) y aminoetano cuaternario (QAE).
13. 13. El método de al reivindicación 12, en donde dicha resina de intercambio aniónico es DEAE.
14. 14. El método de la reivindicación 3, en donde dicha resina de intercambio catiónico tiene un grupo cargado negativamente, que es un miembro seleccionado del grupo consistente en heparina, esteres sulfatados de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo y carboximetilo.
15. 15. El método de la reivindicación 14, en donde dicha resina de intercambio catiónico es Carboxy Sulfon.
16. 16. El método de la reivindicación 1, en donde dicho tercer eluyente comprende un agente regulador, un agente promotor de la solubilidad y una sal.
17. 17. El método de la reivindicación 16, en donde dicho tercer eluyente comprende aproximadamente Tris 50 mM, arginina 500 mM y cloruro de sodio 400 mM.
18. 18. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha proteína de la superfamilia TGF-ß es una BMP.
19. 19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha BMP es BMP-2.
20. 20. Una BMP producida por el método de la reivindicación 18.
21. 21. Un método de purificación de BMP-2 en una solución que comprende las etapas de: aplicar dicha solución a una resina de Celiufine Sulfate, eluir dicha resina de Cellufine Sulfate con un primer eluyente para formar un primer eluato, aplicar dicho primer eluato a resina Butyl Sepharose 4B, eluir dicha resina Butyl Sepharose 4B con un segundo eluyente para formar un segundo eluato conteniendo la BMP-2.
22. 22. El método de la reivindicación 21 , comprendiendo además las etapas • de: aplicar dicho segundo eluato conteniendo dicha BMP-2 a una resina DEAE, y lavar dicha resina DEAE para formar un tercer lavado, aplicar dicho lavado a una resina Carboxy Sulfon, y eluir dicha resina Carboxy Sulfon con un tercer eluyente para formar un tercer eluato conteniendo dicha BMP-2.
23. 23. El método de la reivindicación 22, en donde: dicho primer eluyente comprende aproximadamente Tris 50 mM, NaCI 500 mM y arginina 500 mM; dicho segundo eluyente comprende aproximadamente Tris 50 mM, arginina 500 mM y propilenglicol al 20%; dicho tercer lavado comprende aproximadamente fosfato de potasio 50 mM y arginina 250 mM; y dicho tercer eluyente comprende aproximadamente Tris 50 mM, arginina 500 mM y cloruro de sodio 400 mM.