MX2014013989A - Metodos y usos para inhibidores de proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (pcsk9). - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para tratar una respuesta inflamatoria a la infección y complicaciones asociadas con la misma, al administrar un inhibido de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) a un sujeto, en necesidad del mismo. También se proporciona un método para tratar o prevenir insuficiencia renal; disfunción renal; insuficiencia respiratoria; disfunción respiratoria; o lesión pulmonar aguda. Se proporcionan en la presente usos, composiciones farmacéuticas, y paquetes comerciales asociados con los mismos.

Description

MÉTODOS Y USOS PARA INHIBIDORES DE PROPROTEÍNA CONVERTASA SUBTILISINA KEXINA 9 (PCSK9) CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de inhibidores de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9, por sus siglas en inglés), para el uso en la mejora o tratamiento de una respuesta inflamatoria a la infección y para tratar complicaciones asociadas con la misma. En particular, la invención se refiere al tratamiento de una respuesta inflamatoria a la infección y complicaciones asociadas con la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) es un miembro de la familia de proproteína convertasa de proteasas que se cree que se implican en la regulación del metabolismo de lípidos. Las mutaciones de pérdida de función (LOE) en PCSK9 se asocian con reducciones en colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C). Similarmente, las mutaciones de ganancia de función (GOF) en PCSK9 se asocian con incrementos en el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C). El LDL-C en plasma elevado es un factor de riesgo para el desarrollo de aterosclerosis y enfermedad cardiovascular isquémica asociada (CVD), tal como infarto al miocardio y apoplejía. El LDL-C en plasma se liga por el receptor LDL (LDLR) y una vez ligado el complejo LDL-C/LDLR se somete a la endocitosís. El LDL-C se somete a la degradación lisosomal, mientras que el LDLR luego se reciela de nuevo a la membrana plasmática donde se puede ligar más LDL. La ligación de LDL-C por LDLR, la degradación de LDL-C subsecuente y el reciclado del receptor a la membrana plasmática es de una manera continua. Sin embargo, PCSK9 promueve la degradación del LDLR y por consiguiente evita que el receptor se recicle a la membrana 22. Como resultado, la PCSK9 es un objetivo para terapias de reducción de LDL-C.

Las estatinas reducen el colesterol al inhibir la enzima HMG-CoA reductasa. La HMG-CoA es importante en la reducción de colesterol en el hígado. El tratamiento con estatinas se ha reportado que reduce la incidencia de neumonía y reduce la mortalidad de neumonía hospitalaria2. La HDL también ha probado que es protectora en la sepsis3. Sin embargo, la evidencia para el efecto protector de la HDL no es conclusiva4. Por ejemplo, una continuación de terapia con estatinas pre-hospitalización no mejoró los resultados en los pacientes hospitalizados con sepsis5 e incrementa activamente la HDL en plasma utilizando inhibidores de proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP) tal que el torcetrapib pareció que dio por resultado muertes por sepsis en exceso6. No ha habido ensayos controlados aleatorios esenciales hasta la fecha de estatinas en la sepsis. De esta manera, parece que hay una interacción clínicamente importante entre el metabolismo de lípidos y las rutas inflamatorias, aunque observaciones evidentemente contradictorias indican que el entendimiento de los inventores es muy incompleto.

Los mecanismos implicados en la interacción entre el metabolismo y la respuesta inflamatoria séptica son similarmente poco claros. La lipoproteinas ricas en triglicéridos contribuyen a la ligación a los fragmentos de lipopolisacáridos (LPS) y ácido lipoteicoico (LTA) de patógenos Gram-positivos y Gram-negativos, respectivamente, que luego se internalizan a través del receptor LDL y se eliminan por el hígado, reduciendo de esta manera de manera potencial la activación de los macrófagos 7_1°. una variedad de receptores expresados en macrófagos que modulan la respuesta inflamatoria, incluyendo PPAR y LXR, se activan por el colesterol 11. La HDL se reporta que aumenta las respuestas de monocitos humanos a LPS al suprimir la actividad inhibidora de altas concentraciones de la proteína de ligación a LPS (LBP), donde la apolipoproteína A-II parece que es el componente activo12. Las estatinas tienen múltiples efectos que pueden provocar modulación inmunitaria incluyendo reducción de los niveles de proteínas C-reactiva13, la reducción y la activación de NF-kB14, y mejorando las respuestas e-NOS endoteliales reduciendo de esta manera la adhesión de leucocitos dentro de la microcirculación15 y el reclutamiento de leucocitos al sitio infectado 16. Las estatinas también inhiben la isoprenilación, de proteínas, incluyendo farnesilación, que anula los efectos pro-apoptóticos de la sepsis en los linfocitos esplénicos17.

Se reporta que ratones genéticamente desactivados de receptor LDL están protegidos contra la endotoxemia letal e infecciones gram-negativas graves18. Sin embargo, se han hecho observaciones potencialmente contradictorias, mediante lo cual ratones deficientes del receptor LDL se ha reportador que son más susceptibles a la sepsis inducida por ligación y punción cecal (CLP) que los ratones antecedentes genéticos correspondientes 19. En los ratones genéticamente inactivados de LDL receptor se alteró un número de mediadores inflamatorios antes de la CLP, los ratones genéticamente inactivados del receptor LDL tuvieron una elevación en la proteína A amiloide en suero, la proteína de ligación a lipopolisacáridos (LBP), y CD14 soluble (sCD14). Después la CLP IL-Ib se incrementó más en los ratones genéticamente inactivados de receptores LDL que los controles. En los modelos experimentales de tratamiento con estatinas de sepsis de murino20 y tratamiento con una proteina mi ética a apolipoproteína A-l21 pareció que es benéfica.

En resumen, las rutas de metabolismos de lípidos han mostrado que interactúan con la respuesta inflamatoria, potencialmente con consecuencias clínicas importantes. Sin embargo, los mecanismos exactos y si este efecto impacta el resultado del paciente son inciertos.

Los inhibidores de Proproteina Convertasa Subtilisina Kexina 9 (PCSK9) se han sugerido principalmente para el tratamiento de hipercolesterolemia y aterosclerosis asociada. Sin embargo, los inhibidores/silenciadores de PCSK9 también se han sugerido para el uso en tratamientos de metástasis de cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se basa en parte en el descubrimiento de una reducción de la actividad de la proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) reduce la respuesta inflamatoria y mejora el resultado fisiológico en ratones y en sujetos humanos que tiene una respuesta inflamatoria a la infección. En particular, los pacientes sometidos a prueba tuvieron una o más de las siguientes respuestas inflamatorias a la infección: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis. Adicionalmente, también se descubrió que la inhibición de PCSK9 dio por resultado insuficiencia renal reducida, disfunción renal, insuficiencia respiratoria, disfunción respiratoria, o lesión pulmonar aguda en sujetos humanos. En particular, la inhibición de PCSK9 puede dar por resultado insuficiencia renal reducida, disfunción renal, insuficiencia respiratoria, disfunción respiratoria, o lesión pulmonar aguda en sujetos humanos quienes tienen sepsis y choque séptico.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar una respuesta inflamatoria a la infección, el método que incluye: administrar un inhibidor de proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) a un sujeto en necesidad del mismo.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para tragar una respuesta inflamatoria a la infección, incluyendo un inhibidor de PCSK9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un inhibidor de PCSK9 para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de un inhibidor de PCSK9 para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PCSK9 y un portador farmacéuticamente aceptable para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de un inhibidor de PCSK9 en la fabricación de un medicamento para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un paquete comercial que incluye (a) un inhibidor PCSK9; y (b) instrucciones para el uso del mismo para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un paquete comercial que incluye (a) una composición farmacéutica que comprende un inhibidor PCSK9 y un portador farmacéuticamente aceptable; y (b) instrucciones para el uso del mismo para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

El inhibidor PCSK9 puede ser un anticuerpo o fragmento de ligación a antigeno del mismo. El inhibidor PCSK9 puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento de ligación a antigeno del mismo. El inhibidor PCSK9 puede ser: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652. El inhibidor PCSK9 puede ser un mimético de péptido. El inhibidor PCSK9 puede ser un mimético de dominio EGFA, péptido EGF-A, unas proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante de PCSK9 neutralizante. El inhibidor de PCSK9 puede ser un oligonucleótido anti-sentido. El inhibidor de PCSK9 puede ser BMS-PCSK9Rx. El inhibidor de PCSK9 puede ser una molécula de ARNi. El inhibidor de PCSK9 puede ser LNA ASO o ALN-PCS. El inhibidor de PCSK9 puede ser cualquier inhibidor de PCSK9 conocido por una persona de experiencia en el campo.

El sujeto puede ser un humano. La respuesta inflamatoria a la infección, puede ser una o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección del tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección por enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis. El sujeto puede tener choque séptico. El sujeto puede tener sepsis.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar o prevenir insuficiencia renal, disfunción renal, insuficiencia respiratoria, disfunción respiratoria o lesión pulmonar aguda, el método incluye: administrar un inhibidor de proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) a un sujeto en necesidad del mismo.

El sujeto puede tener una respuesta inflamatoria a la infección. El inhibidor de PCSK9 se puede seleccionar de uno o más de lo siguiente: un anticuerpo o fragmento de ligación a antigeno del mismo; un mimético de péptido; un oligonucleótido anti-sentido; una molécula de ARNi. El inhibidor de PCSK9 puede ser un anticuerpo onoclonal o fragmento de ligación a antigeno del mismo. El inhibidor de PCSK9 puede ser: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652. El inhibidor de PCSK9 puede ser un mimético ce dominio EGFA, péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante PCSK9 neutralizante. El inhibidor de PCSK9 puede ser BMS-PCSK9RX. El inhibidor de PCSK9 puede ser LNA ASO o ALN-PCS. El sujeto puede ser un humano. La respuesta inflamatoria a la infección, puede ser una o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, abdominal absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

Adicionalmente, una persona experta en el campo apreciaría que el sujeto también se puede evaluar para determinar si tiene uno o más alelos de PCSK9 GOF o LOF, como se describe en la presente que puede incluir en la urgencia con la cual un sujeto se le administra un inhibidor de PCSK9. Por ejemplo, un sujeto que tiene uno o más alelo(s) GOF PCSK9 se puede considerar para manejo temprano y más agresivo que un sujeto que tiene un alelo PCSK9 LOF. Por ejemplo, un sujeto que tiene un alelo rs644000 G (LOF) sería menor en riesgo de un resultado no favorable como es comparado con un sujeto que tiene un alelo rs644000 A (GOF). Por consiguiente, un sujeto que tiene un alelo rs644000 A (GOF) o cualquier otro alelo PCSK9 GOF se puede tratar con un inhibidor de PCSK9 más pronto que un sujeto que tiene un alelo rs644000 G (LOF) o cualquier otro alelo PCSK9 LOF. No obstante, los resultados proporcionados en la presente muestran que ambos sujetos que tienen un GOF y un alelo LOF PCSK9 se pueden beneficiar de la inhibición de PCSK9 y el sujeto tiene una respuesta inflamatoria a la infección.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En las figuras que ilustran modalidades de la invención: Las FIGURAS 1A, IB, 1C y ID muestran una comparación de (FIGURA 1A) el indice de actividad, (FIGURA IB) temperatura corporal (°C), (FIGURA 1C)-presión arterial media (mmHg), y fenotipos de fracción de cyección (%) entre los ratones de cepa de fondo (C57BL/6 - tipo silvestre) y ratones genéticamente inactivados PCSK9 (PCSK9-/-), después de la administración de LPS; la FIGURA 2 muestra curvas de supervivencia para pacientes SPH y VASST por el genotipo rs644000; la FIGURA 3 muestra una tabla de haplotipos como es resuelto en VASST utilizando PHASE28 y se muestran haplotipos con MAP³0.5%, donde el alelo menor se sombrea para cada SNP, donde de los 1324 haplotipos observados o tales, o un alelo LOF se observó 442 veces dentro de 309 haplotipos y 83.5% de estos alelos LOF estuvieron contenidos dentro de los haplotipos que también contuvieron el alelo menor rs644000 (Haplotipos 6-9) y solo 15.5% de los alelos LOF estuvieron contenidos dentro de los haplotipos de alelos principales rs644000 (Haplotipos 3 y 4), que muestra que el alelo menor es un marcador de las variantes genéticas PCSK9 LOF más comunes (haplotipos 8 y 9 contienen 2 alelos LOF, en contraste con la variante PCSK9 GOF es observó dentro de un haplotipo que contuvo el alelo principal rs644000 (Haplotipo 2)); la FIGURA 4A muestra curvas de supervivencia LOF KM para pacientes VASST, en donde teniendo por lo menos un alelo PCSK9 LOF se había disminuido la mortalidad durante 28 días (LOFall = 1, línea superior, total n = 306 con 89 muertes, 29.1% mortalidad a los 28 días) comparados con los pacientes sin un alelo LOF (línea de fondo, total n = 326 con 129 muertes, 39.6% de mortalidad a los 28 días) (p=0.0037 para la prueba de Mantel-Haenszel); la FIGURA 4B muestra curvas de supervivencia GOF KM en pacientes VASST, en donde tiene por lo menos un alelo PCSK9 GOF (GOFall = 1, línea de fondo, total n= 57 con 25 muertes, 43.9% de mortalidad a los 28 días) se había incrementado la mortalidad durante 28 días comparado con los pacientes que tienen por lo menos un alelo PCSK9 LOF pero no alelos GOF (línea superior, total n = 293 con 83 muertes, 28.3% de mortalidad a los 28 días) (p=0.011 por la prueba de Mantel- Haenszel); y la FIGURA 5 muestra las curvas de supervivencia LOF KM en pacientes VASST quienes fueron heterocigotos para rs644000 para tratar el problema de si el alelo menor de rs644000 (u otro SNP en desequilibrio de ligación alto) fue el SNP de función probable que conduce directamente al resultado mejorado, o alternativamente, si rs644000 marcó simplemente una preponderancia de los alelos LOF, el efecto de los alelos LOF dentro de los heterocigotos rs644000 (n=478) se detectó, y los pacientes heterocigotos rs644000 en VASST que tienen por lo menos un alelo PCSK9 LOF (LOF = 1, linea superior, total n = 253 con 73 muertes, 71.1% de supervivencia a los 28 dias) tubo mortalidad disminuida durante 28 dias comparados con pacientes con un alelo LOF (linea de fondo, total n = 225 con 85 muertes, 62.2% de supervivencia a los 28 dias) (p=0.029 por la prueba de Mantel-Haenszel).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente varias modalidades y ejemplo alternativos. Estas modalidades y ejemplos se ilustran y no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención.

En vista de la interacción del metabolismo de lipidos y las rutas inflamatorias, la presente solicitud examinó si PCSK9 altera la respuesta inflamatoria sistémica a la inyección de LPS en ratones. Se descubrió que ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tuvieron una respuesta inflamatoria disminuida a LPS y se protegieron contra aspectos adversos del fenotipo fisiológico de una respuesta inflamatoria grave, comparados con los ratones de control de fondo. Para determinar si esta observación podría tener consecuencias clínicamente significativas, los inventores examinaron los polimorfismos genéticos de PCSK9 en la sepsis humana. Las variantes genéticas de PCSK9 han sido bien caracterizadas, de modo que fue posible analizar y clasificar diversas variantes comunes en las variantes de pérdida de función (LOF) conocidas y comparar esta con una variante de ganancia de función (GOF) conocida. Las variantes de PCSK9 se genotipificaron en dos cohortes de pacientes con sepsis grave y choque séptico. De acuerdo con los resultados de LPS de murino, los humanos con variantes de LOF que llevan choque séptico de PCSK9 tuvieron una respuesta a citoquinas inflamatorias reducidas y disminuyeron la mortalidad mientras que las variantes de GOF tuvieron el efecto opuesto.

Como se utiliza en la presente, "proproteína convertasa subtilisina kexina 9” o "PCSK9" se proponen para referirse a una proteína importante en el metabolismo del colesterol LDL (LDL-C). PCSK9 desempeña una función importante en la degradación del receptor de LDL (LDLR). En el metabolismo de LDL el LDLR se liga a LDL en sangre circulante y esteriliza la LDL en las cavidades recubiertas con clatrina para la degradación lisosomal. Después de la internalización de la LDL, la LDLR luego se reciela de nuevo a la membrana plasmática donde puede ligarse a más LDL. Este proceso se repite continuamente. Sin embargo, la degradación de PCSK9 del LDLR previene el reciclaje de LDLR a la membrana y reduce de esta manera la eliminación de LDL de la sangre. Por consiguiente, PCSK9 tiene un objetivo importante para la inhibición de la promoción del LDL-C reducido y de esta manera un agente terapéutico para el tratamiento de hipercolesterolemia y enfermedades cardiovasculares asociadas. La estructura de cristal de PCSK9 se describió en PCT/US2008/056316. Adicionalmente, el PCT/IB2004/001686 describe mutaciones en el gen PCSK9 humano asociado con hipercolesterolemia. PCSK9 es una parte de la ruta de metabolismo LDL-C.

El gen PCSK9 codifica una pro-proteína, que también es llamada Narc 1, una proteinasa que se relaciona con la proteinasa K38. La PCSK9 se sintetiza como una pro-proteina de 74 kDa que se somete a la escisión en el retículo endoplásmico dando por resultado la secreción de un fragmento ~14 kDa y un fragmento ~60 kDa mantenidos juntos por ligaciones no covalentes 39' 40. La escisión auto-catalítica adicional del fragmento de ~14 kDa vuelve la pro-proteína activa. La proteína PCSK9 activa que circula en el plasma se liga al receptor LDL y, después de la internalización, evita el recielaje del receptor de nuevo a la superficie celular y promueve la degradación del receptor en el lisosoma41, 42. La inhibición de PCSK9 da por resultado niveles de colesterol LDL disminuidos en humanos43.

Como se utiliza en la presente, "inhibidor de proproteína convertasa subtilisina kexina 9" o "inhibidor de PCSK9" se propone para referirse a cualquier molécula que sea capaz de reducir la actividad normal de la PCSK9 dentro de un sujeto en o después de la administración del inhibidor. Tales inhibidores pueden ser anticuerpos (incluyendo los anticuerpos monoclonales), otros péptidos (por ejemplo, un mimético de dominio EGFA, y un péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante PCSK9 de neutralización (por ejemplo, con un dominio Pro/Cat). Alternativamente, el inhibidor de PCSK9 puede ser una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN de interferencia pequeño (ARNsi), un ARN merodúplex (ARNmd), un oligonucleótido anti sentido de ácido nucleico bloqueado (LNA) etcétera). Adicionalmente, el inhibidor de PCSK9 puede ser un inhibidor de molécula pequeña de PCSK9.

"ARNi" como se utiliza en la presente se propone para incluir cualquiera de los métodos de silenciamiento génico conocidos en el campo, incluyendo métodos de silenciamiento génico pos-transcripcional (PTGS). Estos pueden incluir, pero no se limitan a cualquiera de uno o más de lo siguiente: microARN (ARNmi); ARN de interferencia pequeño (ARNsi); SARN de horquilla corto (ARNsh); microARN primario (pri-ARNmi); ARN de interferencia asimétrico (ARNai); ARN internamente segmentado pequeño (ARNsisi); ARN merodúplex (ARNmd); dúplex quimérico de ARN-ADN; ARN de reino trans (ARNtk); ARNt-ARNsh; ARNsi en tándem (ARNtsi); ARN de horquilla en tándem NA (ARNth); agrupamiento mimético de pri-ARNmi; y silenciamiento génico transcripcional (TGS).

Como se utiliza en la presente, "anticuerpo monoclonal" o "MAb" se propone para referirse a un anticuerpo de una población de anticuerpo sustancialmente homogénea (es decir donde los anticuerpos individuales son idénticos entre si, con la posible excepción de algunas mutaciones de origen natural). Los MAbs son altamente específicos, se dirigen contra un sitio antigénico individual y se dirigen frecuentemente contra un determinante individual o un antígeno.

Como se utiliza en la presente, anticuerpo "humanizado" se propone para referirse a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras secuencias de ligación a antigeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Muchos anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en los cales los residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del recipiente se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.

INHIBIDORES de PCSK9 Inhibidores de PCSK9 ejemplares se describen a continuación.

Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales (MAbs) que se ligan específicamente a PCSK9 son capaces de inhibir la actividad de PCSK9. En algunos casos, los MAbs se ligan cerca del dominio catalítico, el cual interactúa con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) inhibiendo de esta manea la actividad catalítica de PCSK9 en LDLR. Una variedad de estos MAbs están en ensayos clínicos (por ejemplo, AMG145 (A gen), lD05-IgG2 (Merck & Co.), y SAR236553/REGN727/Alirocumab (Aventis/Regeneron)).

Similarmente, los MAbs adicionales que fijan como objetivo PCSK9 también están en desarrollo (por ejemplo, RN-316 (Pfizer); LGT209 (Novartis); RG7652 (Roche/Genentech)). Una variedad de anticuerpos inhibidores de PCSK9 y fragmentos de los mismos se describen en la literatura de patente como sigue: MERCK/SCHERING CORP. (PCT/US2008/O81311); SCHERING CORP. (PCT/US2011/056649); REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. (PCT/US2012/O54756; PCT/US2012/048574; PCT/US2009/068013); SANOFI (PCT/EP2012/051318; PCT/EP2012/O51320; PCT/EP2012/051321); ELI LILLY AND COMPANY (PCT/US2012/O54737); AFFIRIS AG (PCT/EP2012/067950); PFIZER (PCT/IB2012/053534; PCT/IB2012/050924; PCT/IB2010/053784); NOVARTIS AG (PCT/EP2012/061045; PCT/US2012/041214; PCT/EP2008/054417); IRM LLC and NOVARTIS AG (PCT/US2012/024633; PCT/US2010/059959); GENENTECH INC. and HOFFMANN LA ROCHE (PCT/US2011/024633); MERCK SHARP & DOHME (PCT/US2010/054714; PCT/US2010/054640; PCT/US2010/048849); RINAT NEUROSCIENCE CORP/PFIZER (PCT/IB2009/053990); MERCK & CO INC. (PCT/US2009/033369; PCT/US2009/033341; PCT/US2007/023223; PCT/US2007/023213; PCT/US2007/023212; PCT/US2007/023169); and AMGEN INC. (PCT/US2008/074097).

La actividad mediada por PCSK9 en los LDLRs de superficie celular se ha revisado utilizando anticuerpos que reconocen epitopos en PCSK9. En particular, donde aquellos epitopos se asocian con el dominio catalítico. La infusión intravenosa de un anticuerpo monoclonal (AMG145) específico para el dominio catalítico de PCSK9 dio por resultado una reducción significativa de niveles de LDL-C circulantes tan pronto como 8 horas después de la inyección en primate no humanos. El anticuerpo monoclonal de Merck & Co. (lD05-IgG2) limita estructuralmente el dominio EGFA del LDLR. Una inyección individual de lD05-IgG2 también se descubrió que antagoniza la función de PCSK9 en primates no humanos, dando por resultado niveles de LDL-C en plasma reducidos por hasta 50%. Pfizer-Rinat y Sanofi-Aventis/Regeneron también tienen anticuerpos monoclonales (RN316 y SAR236553/REGN727, respectivamente), que también están en ensayos clínicos.

Péptidos Los péptidos que indican el dominio EGFA de, LDLR que se liga a PCSK9 se ha desarrollado para inhibir la PCSK9. Similarmente, los péptidos EGF-A, las proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, que se ligan a PCSK9, y neutralizan variantes de PCSK9 (por ejemplo, con un dominio Pro/Cat), se han desarrollado y todos de los cuales han mostrado que inhiben la actividad de PCSK9.

Una variedad de péptidos inhibidores PCSK9 se describen en la literatura de patente como sigue: SCHERING CORP. (PCT/US2009/044883); GENENTECH INC. and HOFFMANN LA ROCHE (PCT/US2012/043315); SQUIBB BRISTOL MYERS CO. (PCT/US2011/032231; PCT/US2007/015298); ANGELETTI p IST RICHERCHE BIO (PCT/EP2011/05646); and AMGEN INC. (PCT/US2009/034775).

Oligonucleótidos El oligonucleótido anti-sentido PCSK9 de Isis Pharmaceutícals/Bristol-Myers Squibb (BMS-PCSK9Rx) ha mostrado que incrementa la expresión del LDLR y disminuye los niveles de colesterol total circulantes en ratones.

Similarmente, un ácido nucleico bloqueado de Santaris Pharma (LNA ASO) redujo los niveles de ARN de PCSK9 en ratones. LNA ASO es complementario al ARNm de PCSK9 de humano y ratón (acceso # NM174936 y NM153565) es un gapmero largo de 13 nucleótidos con la siguiente secuencia: GTctgtggaaGCG (LNA en mayúsculas, ADN en minúsculas) y ligaciones de internucleósido de fos-forotioato.

Alnylam Pharmaceuticals ha mostrado resultados positivos en ensayos clínicos para un ARNsi (ALN-PCS) para la inhibición de PCSK9. El ARNsi se incorporó en nanopartículas lipidoides para minimizar la toxicidad de infundir intravenosamente en ratas, ratones u monos, dando por resultado niveles de LDL-C reducidos después de la administración.

Una variedad de oligonucleótidos inhibidores de PCSK9 se describen en la literatura de patente como sigue: SANTARIS PHARMA A/S (PCT/EP2007/060703; PCT/EP2009/054499; PCT/EP2010/059257); ISIS PHARMACEUTICAL INC. (PCT/US2007/068404); ARNSI THERAPEUTICS INC. (PCT/US2007/073723); ALNYLAM PHARMACEUTICALS INC. (PCT/US2011/058682; PCT/US2010/07726; PCT/US2010/038707; PCT/US2009/032743; PCT/US2007/068655); RXI PHARMACEUTICALS CORP. (PCT/US2010/000019) INTRADIGM CORP. (PCT/US2009/036550); and NASTECH PHARM CO. (PCT/US2008/055554).

Moléculas Pequeñas Serometrix ha reportado un inhibidor de moléculas pequeñas de PCSK9 (SX-PCSK9)53. Similarmente, la berberina como se describe en los ejemplos se puede utilizar como un inhibidor de PCSK9.

Inflamación Sistémica Una "respuesta inflamatoria a la infección", como se utiliza en la presente, se puede seleccionar de uno o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, abdominal absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

Las "complicaciones asociadas con la respuesta inflamatoria a la infección" se pueden seleccionar de insuficiente renal; disfunción renal; insuficiencia respiratoria; disfunción respiratoria; o lesión pulmonar aguda. Un inhibidor de PCSK9 se puede utilizar para el tratamiento de o prevención de o mejora de cualquier complicación asociada con la respuesta inflamatoria a la infección, por ejemplo, por ejemplo, insuficiencia renal; disfunción renal; insuficiencia respiratoria; disfunción respiratoria; o lesión pulmonar aguda.

Como se utiliza en la presente "tratamiento" se propone para incluir el tratamiento de o la prevención de o la mejora de una enfermedad o afección o síntoma.

Como se utiliza en la presente "síndrome de respuesta inflamatoria sistémica" o "SIRS" se define por incluir tanto una respuesta inflamatoria sistémica séptica (es decir, sepsis o choque séptico) y no séptica (es decir posoperativa). "SIRS" se define adicionalmente de acuerdo con las directrices ACCP (American College of Chest Physicians) como la presencia de dos o más de A) temperatura >38°C o <36°C, B) ritmo cardíaco >90 latidos por minuto, C) frecuencia respiratoria >20 respiraciones por minuto, y D) conteo de glóbulos blancos >12,000 mm3 o <4,000 mm3.

"Sepsis" se define como la presencia de por lo menos dos criterios de "SIRS" y una fuente conocida sospechosa de infección. El choque séptico se definió como sepsis más una insuficiencia de órganos nueva por criterios Brussels más la necesidad por medicamentos vasopresores.

Un prefijo "rs" designa un SNP en la base de datos y se encuentra en la base de datos NCBI SNP. Los números "rs" son la forma NCBI|rsSNP ID.

Métodos y Materiales Ratones Todos los estudios de animales se aprobaron por el comité de ética de animales de University of British Columbia y se conformaron a N1H y la Guia para las directrices de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Ratones machos C57BL/6 (cepa de control de fondo) y genéticamente inactivados de PCSK9 (B6:129S6-Pcsk9tmlJdh/J), peso corporal 25-30 gramos, 10-14 semanas de edad se obtuvieron de Jackson LabsMR. Comparados con los controles de fondo, los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tuvieron concentraciones de colesterol en plasma reducidas con concentraciones de colesterol LDL no detectadles23. No hubo otras alteraciones fenotipicas obvias reportadas. Inflamación sistémica inducida por lipopolisacáridos Ratones sanos tuvieron un nivel de actividad, temperatura corporal, presión sanguínea y función cardíaca (ecocardiografía) evaluados en la línea base (tiempo 0) como se detalla a continuación. Los ratones luego se inyectaron intra-peritonealmente con LPS (20 mg/kg, cepa de E. coli 01 II: B4, SigmaMR, St. Louis, MO). Esta dosis se determinó de experimentos previos donde, en la cepa de fondo de ratones C57BL/6, 20 mg/kg de LPS administrados intra-peritonealmente fue la dosis más baja, que fue leal en todo los casos dentro de 12 horas24. Luego el nivel de actividad y temperatura se midieron cada hora durante seis horas. A las seis horas la presión sanguínea se midió por canulación arterial invasiva y la función cardíaca (ecocardiografía) se evaluó nuevamente. Evaluación fisiológica de los ratones índice de actividad: Los ratones se observaron durante 2 minutos para postura y actividad. 0 (normal) indica que no hay tiempos con una postura encorvada, y el ratón tuvo movimientos rápidos espontáneos intercalados con comida y bebida. 1 (leve) es una postura encorvada breve ocasional (5-20 segundos) que se revirtió espontáneamente anormal con movimientos rápidos espontáneos en curso intercalados con vida y bebida. 2 (leve-moderado) fue más prolongado (>20 segundos) en la postura encorvada con reversión espontánea anormal con movimientos rápidos espontáneos en curso intercalados con comida y bebida.3 (moderado-grave) fue una postura encorvada casi continua con movimientos solo cando se sometió a estímulos externos potentes. 4 (grave) fue una postura encorvada continua sin movimiento. Intervalos de 0.5 se utilizaron si el ratón mostró ambos niveles dentro de un periodo de observación.

Temperatura: La temperatura se midió cada hora utilizando un termómetro infrarrojo (IR-101 La Crosse Technology, La Crosse USA)) mantenido 2-3 m del abdomen.

Presión Sanguínea: Se midió una presión sanguínea arterial media de línea base (tiempo 0) utilizando un corte de cola no invasivo (CODA 2MR, Kent Scientific, Torrington, USA). Seis horas después de la inyección de LPS, los ratones se anestesiaron utilizando isofluorano inhalado (1-3%). Después de una laparatomía pequeña, la aorta abdominal se perforó utilizando una aguja de calibre 27 luego un catéter de micromanómetro Francés del número 2 (Mikro-tip SPR-838MR, Millar Instruments Inc., Houston, TX) se insertó en la aorta. La presión arterial media se derivó utilizando software de análisis (PVAN 2.9MR, Millar Instruments Inc.).

Ecocardiografía: Los ratones se anestesiaron ligeramente utilizando isofluorano inhalado (1-3%) y se colocaron sobre una manta térmica. Los ecocardiogramas de modo M (ECHO) se orientaron de 2D ecos obtenidos utilizando Vevo 770 ECHO (VisualsonicsMR, Toronto, ON, Canadá) operando a una velocidad de cuadro de 120 Hz. Se obtuvieron imágenes ecocardiográficas de sección transversal ventriculares izquierdas 2D pares pernales izquierdas. La posición y ángulo del transductor de eco se mantiene al dirigir el haz justo fuera de la punta de la valva anterior de la válvula mitral y al mantener los puntos de referencia anatómicos internos constantes. Todas las mediciones se tomaron de trazas de modo M en la expiración final. La dimensiones internas ventriculares izquierdas se midieron en la diástole final (definida como el inicio del complejo QRS en la terminal II del electrocardiograma simultáneamente obtenido) y la sístole final (definida como la dimensión ventricular interna mínima).

Ensayo de citoquinas multiplex: El plasma se diluyó 0-50X para asegurar que todas las dimensiones estuvieron dentro del intervalo de prueba y 50 mL por pocilio de microplaca se agregaron a pocilios duplicados a la microplaca de kit base de ratón LU 000 (R&D SystemsMR, Minneapolis, MN), y el protocolo se siguió de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada muestra se midió en duplicado. Las microplaca se analizaron utilizando el LuminexlOOMR con el Software 1.7 acompañante (Luminex CorporationMr, Austin, TX). Las citoquinas se seleccionaron para representar la inflamación temprana (TNFa), un marcador inflamatorio integrado (IL-6), un marcador anti-inflamatorio (IL-10), y quimiocínas CC representativas (JE como un homólogo de murino de MCP-1 humano) y quimiocínas CXC (MIP-2 y KC, que son homólogos de murino de IL-8 humana).

Estudio de asociación genética humana St Paul's Hospital (SPH) Derivation Cohort. Todos los pacientes admitidos al ICU en el St. Paul's Hospital en Vancouver, Canadá entre Julio de 2000 y Enero del 2004 se clasificaron y de estos, 601 pacientes se clasificaron por tener choque séptico y tuvieron ADN disponible. El choque séptico se definió por la presencia de dos o más criterios de diagnóstico para el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, infección probada sospechada, disfunción nueva de por lo menos un órgano, hipotensión a pesar de resucitación de fluido adecuada 25. Doce pacientes excluyeron ya que se habían incluido en el cohorte VASST (ver a continuación), dejando el resto de los 589 pacientes para estudio adicional. Los criterios de inclusión y la formación de fenotipo clínico se describen en cualquier lugar26. Institutional Review Board en el St. Paul's Hospital y la University of British Columbra aprobaron el estudio.

Adicionalmente, a cada uno de los pacientes evaluados en el estudio tuvo una respuesta inflamatoria a la infección. Por consiguiente, cada uno de los pacientes tenía que tener uno o más de lo siguiente: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, abdominal absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocistica, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

El cohorte de validación de Ensayo de Vasopresina y Choque Séptico (VASST). VASST fue un ensayo multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, controlado que evalúa la eficacia de la vasopresina versus norepinefriña en 779 pacientes quienes tuvieron choque séptico, como se define en lo anterior25, e infusión vasopresora de por lo menos 5 pg/minutos de norepinefriña, o equivalente27. Los criterios de infusión y la formación de fenotipo clínico se describen en cualquier lugar27. El ADN fue disponible de 616. La junta de ética de investigación de todas las instituciones participantes aprobó este ensayo y se obtuvo un consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o sus representantes autorizados. La junta de ética de investigación en el centro de coordinación (The University of British Columbia) aprobó el análisis genético.

La formación de genotipo y Selección de SNP: El ADN se extrajo de la capa leucocitaria de muestras de sangre eliminadas utilizando un kit maxi QIAamp DNAMR (QiagenMR, Mississauga, ON, Canadá) (cohorte SPH) o QIAamp DNA Blood Midi KitMR (QiagenMR) (cohorte VASST). La formación de fenotipo SNP se llevó a cabo utilizando el ensayo Illumina Golden GateMR (Illumina Inc., San Diego, CA). Para seleccionar las SNPs de etiqueta PCSK9 para la formación de genotipo primero los inventores resolvieron haplotipos utilizando PHASE28 aplicado a la formación de genotipo de CEU denso de PCSK9 disponible de SeattleSNPs. Un evento de cruza es evidente en aproximadamente la mitad de los genes dando por resultado el requisito para un gran número de SNPs de etiqueta para resolver todos los haplotipos posibles. Para simplificar el la formación de genotipo, los inventores limitaron las elecciones de SNP de etiqueta a tres depósitos dentro del extremo 3' del gen y un depósito adicional 5' al evento de cruza. Los inventores ponderaron la elección de SNP de etiqueta dentro de cada depósito por la probabilidad de la formación de genotipo del éxito suministrado por Illumina for the Golden GateMR. Por consiguiente, los PCSK9 de etiqueta SNPs se genotiparon en ambos cohortes de choque séptico fueron rs644000, rs2479408, rs2479409 y rs572512. Subsecuentemente, los SNP de pérdida de función conocida adicional (LOF) (rsll591147 R46L, rsll583680 A53V, rs562556 V474I) y un SNP de ganancia de función conocida (GOF) (rs505151 G670E) se formaron en genotipo en el cohorte VASST como parte de la formación de genotipo de genoma completo utilizando la plataforma de la formación de genotipo Illumina Human 1M-DUOMR (Illumina Inc.)· Resultados Primarios y Secundarios: El resultado primario fue una mortalidad de 28 dias. Los resultados secundarios incluyeron medidas de disfunción de órganos, que se calcularon como dias vivos y sin disfunción de órganos29. Los inventores evaluaron a disfunción cardiovascular, respiratoria, renal, hematológica, hepática, y neurológica asi como la necesidad de vasopresores, ventilación mecánica y terapia de reemplazo renal. Los inventores también evaluaron la respuesta inflamatoria sistémica al medir los niveles de citoquinas de plasma en 278 pacientes del cohorte VASST en la linea base y a 24 horas después de la inclusión en VASST.

Mediciones de citoquinas: Kits multiplex humano (EMD MilliporeMR) se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con modificaciones como se describe a continuación. Brevemente, las muestras se mezclaron con puertas magnéticas de anticuerpos ligados en una placa de 96 pocilios y se incubaron durante la noche a 4°C con agitación. Las placas se lavaron dos veces con solución amortiguadora de lavado en una lavadora ELx405MR. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente con anticuerpo de detección biotinilado, se agregó estreptavidina-PE durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como en lo anterior y se agregó PBS a los pocilios para lectura utilizando un Luminex 200MR (Illumina Inc.) con una ligación menor de 100 cuentas por muestra por citoquina. A cada muestra se midió en duplicado. Para corresponder a las mediciones de la citoquinas de ratón se seleccionaron citoquinas para representar la inflamación temprana (TNFa), un marcado inflamatorio integrado (IL-6), un marcador anti-inflamatorio (IL-10), y una quimiocina CC representativa (MCP-1) y quimiocina CXC (IL-8).

Análisis Estadístico Los inventores utilizaron análisis de mediciones repetidas de varianza para someter a prueba las diferencias en el nivel de actividad, temperatura y fracción de cyección entre ratones genéticamente inactivados de PCSK9 y de control de fondo a través del tiempo. Los inventores utilizaron pruebas t no pareadas para someter a prueba las diferencias en la presión arterial media debido a que esta variable se midió utilizando dos instrumentos diferentes en la linea base y a las 6 hora después de la administración de LPS.

Para el choque séptico humano los análisis primarios de los inventores utilizaron regresión logística para determinar el riesgo de mortalidad por el genotipo PCSK9, incluyendo lo covariable de edad, género, ascendencia caucásica, y una diagnosis primaria quirúrgica versus médica en el modelo estadístico. Los inventores probaron las diferencias en las concentraciones de citoquinas por el la formación de genotipo utilizando un análisis de mediciones repetidas de varianza. Los análisis uni-variados se llevaron a cabo utilizando pruebas de chi al cuadrado para datos categóricos y ya sea pruebas de Kruskal-Wallis ANOVA de una via para datos continuos. Las poblaciones de sometieron a prueba para el equilibrio de Hardy-Weinberg utilizando una prueba de chi al cuadrado. Todas las prueba fueron de dos lados las diferencias se consideraron significativas si P<0.05. Todo los análisis se llevaron a cabo utilizando paquetes de software estadísticos R (versión 2.8.1, www.R-project.org) y SPSSMR versión 16.0 (SPSS Inc, Chicago, IL).

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tienen una respuesta leve a LPS Durante seis horas después de la inyección de LPS los 10 ratones de control de fondo C57BL/6 mostraron continuamente una postura encorvada y no se movieron a pesar de un estimulo potente (índice de actividad de 4/4). En contraste, los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tuvieron un índice de actividad medio de 2.40 ± 0.90 (ratones p<0.05 vs. C57) que corresponden a casi 20-30 segundos de postura encorvada con reversión espontánea a normal por movimientos rápidos espontáneos en curso intercalados con comida y bebida (FIGURA 1A). Una comparación de las medias de los grupos muestra un efecto estadísticamente significativo (* p<0.05) en 3-6 horas, en típicamente un indice de actividad mayor que 3.5 representa un estado terminal.

Ratones de tipo de control de fondo (C57BL/6) mostraron una pérdida progresiva de temperatura corporal durante las seis horas después de la administración de LPS tal que 6 de los 10 ratones tuvieron una temperatura corporal < 32’C y la temperatura media de grupo de seis hora fue 30.5 ± 2.8°C (FIGURA IB), mientras que ninguno de los 10 ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tuvieron su pérdida de temperatura por debajo de 32°C y la temperatura media de grupo fue 35.2 + 1.8°C (genéticamente inactivados PCSK9 versus control de fondo p<0.05). Una comparación de la media de grupo muestra un efecto estadísticamente significativo (p<0.05) en 5 y 6 horas, con típicamente una temperatura sostenida menor que 32°C representa un estado terminal.

LPS indujo una disminución aguda en la presión arterial media y fracción de cyección ventricular izquierda dentro de horas en los ratones de control de fondo C57BL/624'30. Como se muestra en la TABLA 1A y la FIGURA 1C, en los ratones de control de fondo la presión arterial disminuyó de 120 ± 5 mHg a 63 ± 11 mmHg en seis horas después de la administración de LPS. Los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tuvieron una presión arterial media similar en el tiempo de línea base 0 (110 ± 6 mmHg), pero mostraron una disminución mucho menor en la presión arterial media a 6 horas después de la administración de LPS (75 ± 15 mmHg) comparados con los ratones de control de fondo (P<0.05) (TABLA 1A). Se obtuvieron resultados similares cuando la fracción de eyección (%) se comparó (ver FIGURA ID).

Cuando se compararon los resultados con los ratones LDLR-/- tratados con LPS también se trataron con ya sea solución salina o berberina, tuvieron diferencias mínimas entre los ratones tratados con solución salina y berberina (TABLA IB). Esto es consistente con la hipótesis de que el beneficio derivado de la inhibición de PCSK9 es el resultado de la disponibilidad incrementada de LDLR y una reducción subsecuente en el LDL en plasma.

TABLA 1A Respuesta hemodinámica de ratón después de 20 mg/kg de LPS o solución estéril, n > 6 por grupo. Los datos son desviación media ± estándar.

• P<0.05 ínactivado genéticamente de PCSK9 comparado con el control de fondo.

TABLA IB Respuestas al tratamiento de LPS en ratones LDLR-/-también tratados con ya sea solución salina o berberina.

(Los datos son medía (95% de CI) y todo los grupos fueron n=4) Como es evaluado por la ecocardiografía trans-torácica la fracción de inyección ventricular izquierda disminuyó significativamente de la linea base (57 ± 6.2%) a seis horas después de la administración de LPS (32 ± 4.9%, p<0.05) en los ratones de control de fondo. En contraste, en los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 la fracción de inyección ventricular izquierda fue similar a los ratones de control de fondo en la linea base (54 ± 6.8%), pero tuvo mucho menos disminución seis horas después de la administración de LPS (44 ± 8.8%, p<0.05 comparado con los ratones de control de fondo).

Los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tuvieron una respuesta de citoquinas inflamatorias leves a LPS.

De acuerdo con las observaciones del fenotipo inflamatorio, los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 knock-out también mostraron una respuesta de citoquinas pro inflamatorias atenuadas medidas en el plasma a 6 horas después de la infusión de LPS (TABLA 2). Más específicamente, los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 tuvieron concentraciones en plasma de JE medía estadísticamente más bajas de 25000 ± 11000 mg/ml comparados con los ratones de control de fondo (37000 ± 9200 mg/ml) a 6 horas después de la administración de LPS (P<0.05). MIP-2 también se redujo en los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 con una concentración media de 54000 ± 13000 vs 63000 ± 6500 pg/ml en los controles de fondo (P<0.05). No hubo diferencia en MFI entre los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 y los de control de fondo con respecto al JE y MIP-2 en los ratones tratados con solución salina (TABLA 2).

TABLA 2 Análisis de citoquinas multiplex de plasma de ratón 6 horas después de 20 mg/kg de LPS. n=8 por grupo. Los datos son concentración media en pg/ml con desviación estándar (P < 0.05 vs LPS de la cepa de fondo) EJEMPLO 2: El genotipo de PCSK9 se asocia con mortalidad en humanos Utilizando los cuatro SNPs de etiqueta de haplotipo seleccionados, se descubrió que el genotipo PCSK9 en humanos se asoció significativamente con mortalidad (TABLA 3). No se identificaron diferencias significativas consistentes en las características de línea base en estos dos cohortes que podrían confundir potencialmente este resultado (TABLA 4). En particular, el alelo G menor de rs644000 A/G se asoció en gran medida con la mortalidad disminuida durante 28 días en tanto el cohorte SPH (p<0.0045) como en el cohorte VASST (0.0044) (TABLA 5 y FIGURA 2). De acuerdo con esta observación, también se descubrió que el alelo G rs644000 se asoció con la disfunción disminuida de los sistemas cardiovasculares, respiratorios, renales y de órganos hepáticos y tendencias a disfunción más neurológica y hematológica (como es expresado por números disminuidos de días vivos y libre de disfunción de órganos en la TABLA 6). También hubo una necesidad significativamente incrementada por el uso de vasopresores, ventilación mecánica y terapia de reemplazo renal (TABLA 6). Los resultados en la TABLA 6 muestran la insuficiencia respiratoria dio por resultado sujetos con infección grave y correlacionada con el genotipo rs644000.

TABLA 3 Asociaciones de SNPs de etiqueta de haplotipo con mortalidad de 28 dias en SPH.

TABLA 4 Características de línea base de pacientes en los cohortes SPH y VASST por el genotipo PCSK9 rs644000.

CohorteSPH CohorteVASST Genotipo PCSK9 GG GA AA GG GA AA rs644000genotipo (n=60) (n=234) (n=295) P (n=77) (n=273) (n=266) P Edad (años) 63(51-72) 62(49-72) 62(46-73) 0.89 65(52-73) 63(49-73) 63(50-73) 0.55 Genero-%hombres 73.3 62.4 61.4 0.21 63.6 57.9 59.4 0.66 Caucásico-n (%) 48(80.0) 194(82.9) 211(71.5) 0.80 74(96.1) 236(86.4) 207(77.8) 0.66 APACHEII 24(18-29) 26(21-31) 27(20-33) 0.16 26(20-31) 26(21-32) 27(23-32) 0.19 Quirúrgico-% 25.0 29.1 31.5 0.67 00 Condiciones preexistentes-n (%) Insuficiencia cardiacacrónica 4(6.7) 20(8.5) 13(4.4) 0.15 8(10.4) 14(5.1) 25(9.4) 0.11 Enfermedad pulmonar crónica 10(16.7) 41(17.5) 49(16.6) 0.96 11(14.3) 45(16.5) 52(19.5) 0.47 Enfermedad hepática crónica 6(10.0) 18(7.7) 34(11.5) 0.34 10(13.0) 31(11.4) 27(10.2) 0.76 Insuficiencia renal crónica 5(8.3) 12(5.1) 22(7.5) 0.48 8(10.4) 23(8.4) 37(13.9) 0.13 Uso de corticosteroides crónico 5(8.3) 13(5.6) 20(6.8) 0.70 13(16.9) 49(17.9) 67(25.2) 0.077 Variables cardiovasculares Día 1 5 Ritmocardiaco -bpm 106(95-120) 110(95-130) 115(96-135) 0.061 120(108-134) 125(112-140) 130(110-140) 0.11 Presión arterial media-mmHg 54 (50-58) 55(50-59) 55(49-59) 0.45 56(50-62) 56(50-62) 55(50-60) 0.40 Presión venosa central -mmHg 11(6-13) 11(7-15) 12(8-15) 0.22 14(12-18) 14(11-18) 14(11-18) 0.78 Norepinefrina 0.074 mg/min 10(6-23) 15(7-25) 15(8-29) 0.59 16(10-27) 14(8-25) 16(10-29) 10 Dobutamina pg/kg/min 5(3-10) 7(5-10) 8(5-12) 0.40 5(4-7) 4(3-8) 4(2-6) 0.61 Variables de laboratorio- Día 1 Conteo de glóbulos 15.6(10.4- 14.1(9.3- 13.9(7.5- 12.5(7.0- blancos -103/mm3 14.6(10.2-21.6) 21.3) 19.0) 0.22 14.5(9.2-20.6) 21.1) 19.8) 0.38 Conteo de plaquetas -loVmm3 206(85-300) 162(95-243) 161(90-240) 0.19 145(88-235) 157(91-242) 147(60-259) 0.63 15 Pa<¾/Fi¾ -torr 160(91-216) 142 (93-220) 145(89-214) 0.91 200(155-255) 188(131-253) 188(132-263) 0.59 Creatinina en la sangre -pmol/L 142(80-271) 145(83-283) 150(90-272) 0.69 147(87-245) 150(90-240) 154(97-272) 0.23 Lactato en la sangre -mmol/L 2.0(1. -5.9) 2.3(1.4-4.4) 2.3(1.4-5.1) 0.89 2.1(1.4-4.4) 2.3(1.4-4.1) 2.3(1.4-4.6) 0.66 TABLA 5 5 Regresión logística del genotipo rs644000 con mortalidad a los 28 días en los cohortes SPH y VASST.

Cohorte SPH Cohorte VASST Relación odds P Relación odds P (95% de intervalo de (95% de intervalo de confianza) confianza) 10 en Edad -por año 1.028 (1.016-1.038) 1.1x10 1.019 (!.0080-1.030) 6.2x10 " Mujer 0.87 (0.61-1.23) 0.43 0.93 (0.66- .32) 0.71 Caucásica 0.87 (0.58-1.30) 0.49 0.81 (0.51- .29) 0.37 Quirúrgica 0.78 (0.54-1.14) 0.20 0.76 (0.50- .17) 0.21 Alelo PCSK9 rs644000 A 1.46 (1.12-1.88) 0.0045 1.46 (1.12-1.89) 0.0044 15 TABLA 6 Disfunción de órganos ( DAF) en los cohortes SPH y VASST por el genotipo rs644000 Cohorte SPH Cohorte VASST Genotipo PCSK9 rs644000 GG GA AA GG GA AA (n=60) (n=234) (n=295) (n=77) (n=273) (n=266) Dias vivo y sin disfuncióndeórganos Cardiovascular 18(5-25) 15(1-24) 8(0-23) 0.0086 21(2-24) 19 (0-24) 14 (0-23) 0.028 Respiratorio 18(1-25) 10(0-24) 4(0-22) 0.0091 10(1-15) 3 (0-16) 2 (0-15) 0.11 Renal 22(3-28) 17(2-28) 11(1-27) 0.062 26(12-28) 23 (6-28) 18 (2-28) 0.0028 Hematológico 27(6-28) 24(6-28) 20(3-28) 0.068 27(10-28) 26 (9-28) 22 (2-28) 0.0050 Hepático 28(6-28) 24(4-28) 17(2-28) 0.041 28(8-28) 27 (7-28) 22 (4-28) 0.026 10 Neurológico 26(8-28) 24(5-28) 20(3-27) 0.084 19(5-26) 15 (0-24) 15 (0-23) 0.029 05 Vasopresorde soportede 24(9-27) 21(2-26) 17(1-26) 0.019 22(2-25) 20 (0-24) 16 (0-24) 0.028 órganosartificia] Ventilador 17(0-23) 8(0-22) 2(0-21) 0.019 13(0-22) 8 (0-20) 8 (0-20) 0.26 Terapia de reemplazo renal 28 (4-28) 23 (3-28) 12 ( 1-28) 0.0082 28 (11-28) 27 (9-28) 20 (3-28) 0.0074 15 Variantes de pérdida de función y ganancia de función de PCSK9 humanas El gen PCSK9 humano se ha caracterizado en gran medida y se han identificado diversas variantes erróneas relativamente comunes31 (Frecuencia de Alelo Menor [MAF] >0.5%) y muchas variantes erróneas y sin sentido raras32 que se asocian con los niveles de LDL disminuidos3234, como un indicador de Pérdida de Función (LOF) de PCSK9 (FIGURA 3). La relación entre los niveles de LDL y el genotipo de PCSK9 también se han identificado utilizando un procedimiento GWAS sesgado35. Una variante errónea bastante común36 y muchas variantes erróneas raras31, 37 se ha descubierto que se asocian con los niveles de LDL incrementados y, basado en esto, se consideran variantes de Ganancia de Función (GOF) (FIGURA 3). Por consiguiente, los inventores formaron en genotipo las variantes PCSK9 LOF relativamente comunes (MAP³0.5%, rsll591147 R46L, rsll583680 A53V, rs562556 V474I) y la variante PCSK9 GOF relativamente comunes (rs505151 G670E) en el cohorte VASST.

Se descubrió que los alelos LOF de rsll591147, rsll583680, y rs562556 se segregaron de manera preferente con el alelo G menor del SNP de etiqueta de los inventores, rs644000 (FIGURA 3). D 1324 haplotipos observados totales un alelo LOF se observó 442 veces dentro de 309 haplotipos. 83.5% de estos alelos LOF se contuvieron dentro de los haplotipos que también contuvieron el alelo G menor rs644000. Solamente 15.5% de los alelos LOF estuvieron contenidos dentro de los haplotipos de alelo A principales rs644000. De esta manera, el alelo menor de rs644000 es un marcador de las variantes genéticas PCSK9 LOF más comunes. A la inversa, la variante GOF relativamente común se segregó de manera preferente con el alelo A principal de rs644000 (FIGURA 3). 95.2% de estos alelos GOF estuvieron contenidos dentro de los haplotipos que también contuvieron el alelo A principal rs644000. Solamente 4.8% de los alelos GOF estuvieron contenidos dentro de los haplotipos del alelo G menor rs644000. De esta manera, en general el alelo menor de rs644000 se asocia de manera preferente con los alelos LOF y el alelo mayor de rs644000 se asocia de manera preferente con los alelos GOF de las variantes genéticas relativamente comunes conocidas de PCSK9. Para entender si PCSK9 rs644000 se asoció en gran medida con el resultado del paciente debido a él o un SNP en el desequilibrio de ligación alto (LD) con él fue un SNP o, a la inversa, si las variantes LOF y GOF asociadas fueron los SNPs probablemente funcionales, las variantes LOF y GOF primero se examinaron por separado.

Se descubrió que los pacientes en VASST que tienen por lo menos un alelo PCSK9 LOF tuvieron mortalidad disminuida durante 28 dias (29.1% de mortalidad de 28 dias, FIGURA 4A) comparados con los pacientes sin un alelo LOF (39.6% de mortalidad de 28 días, FIGURA 4A) (p=0.0037 por la prueba de Mantel-Haenzel). Utilizando la regresión logística para identificar y ajustar las co-variables potencialmente importantes, se descubrió que teniendo por lo menos un alelo PCSK9 LOF permaneció estadísticamente significativo (P<0.009) (TABLA 7).

TABLA 7 Prueba de regresión logística para los efectos de LOF y GOF en mortalidad de 28 días en VASST.

Pacientes LOF tuvieron por lo menos un alelo LOF. Pacientes GOF tuvieron por lo menos un alelo GOF Pérdida de Función Gananciade Función Relación odds P Relación odds P (95% de intervalo de (95% de intervalo de confianza) confianza) Edad-por año 1.017 ( 1.007-1.029) 0.001 1.007 ( 0.997-1.027 ) 0.11 Mujer 0.99 (0.71-1.40) 0. 97 0.81 (0.50-1.29) 0.37 Caucásica 0.80 (0 .51-1 .26) 0 .33 0.91 (0.46-1.77 ) 0.77 Quirúrgica 0.75 (0.50-1. 14 ) 0. 18 0.64 (0.51-1.52 ) 0.63 Efecto de la variante genética 0. 64 ( 0.46-0.89) 0.009 1.92 ( 1.06-3.48 ) 0.031 El número de haplotipos que contienen una variante GOF (n=59+3 raro=62 en la FIGURA 3) fue menor que el número que contiene por lo menos una de las tres variantes de LOF (n total 108+136+54+6+5 raro=309 en la FIGURA 3). Por lo tanto, no hubo expectación de que un efecto estadísticamente significativo de la variante GOF se encontraría, sino hubo interés en determinar si los efectos de GOF fueron direccionalmente opuestos a los efectos de LOF. De hecho, se descubrió que los pacientes en VASST que tienen la variante GOF tuvieron un efecto direccionalmente opuesto a las variantes LOF; teniendo una mortalidad incrementada por más de 28 días (43.9% de mortalidad de 28 días, FIGURA 4B) comparados con los pacientes con una variante LOF (28.3% de mortalidad de 28 días, FIGURA 4B) (p=0.011 mediante la prueba de Mantel-Haenszel). La regresión logística, el ajuste para las covariables potencialmente importantes, identificó similarmente la mortalidad incrementada en pacientes que tienen una variante PCSK9 GOF (p=0.031) (TABLA 7).

Para distinguir adicionalmente entre un efecto primario de rs644000 (o un SNP en LD) versus un efecto primario de las variantes LOF, se razonó que si el efecto primario fue debido a rs644000, y no debido a las variantes LOF, entonces un análisis que seleccionó solo los heterocigotos para rs644000 (manteniendo de esta manera la constante de fondo genética rs644000 eliminaría el efecto LOF. Sin embargo, se descubrió que las variantes LOF retuvieron una disminución estadísticamente significativa en el efecto de mortalidad a un en esos pacientes seleccionados (FIGURA 5). Estos pacientes heterocigotos rs644000 en VASST que tienen por lo menos un alelo PCSK9 LOF tuvieron mortalidad disminuida (28.9% de mortalidad de 28 días) comparado con los pacientes con un alelo LOF (37.8% de mortalidad de 28 días) (p=0.029 mediante la prueba de Mantel-Haenszel). De esta manera, pereció que el efecto o en la mortalidad fue más probable conferido por las variantes LOF (y las variantes GOF) antes que por un efecto primario de rs644000. De manera más probable, rs644000 fue simplemente un marcador de preponderancia de las variantes LOF asociadas con el alelo G menor de rs644000 y la variante GOF asociada casi exclusivamente con el alelo A mayor de rs644000.

Los ratones genéticamente inactivados de PCSK9 cuando se compararon con los controles de fondo genéticos, se protegieron contra los efectos adversos de la administración de LPS, que es un modelo pre-clínico importante de la respuesta inflamatoria sistémica relevante a la sepsis y choque séptico. Los ratones genéticamente inactivados PCSK9 mostraron una mejora benéfica del efecto adverso de LPS en la actividad y temperatura corporal, así como en los fenotipos cardiovasculares inducidos por LPS adversos de hipotensión y fracción de cyección ventricular izquierda disminuida. Los ratones genéticamente inactivados PCSK9 también mostraron una disminución en la respuesta de citoquinas inflamatorias en el plasma en respuesta a LPS. La inactivación genética de PCSK9 probó que es protectora de los efectos adversos importantes y comunes del LPS. Adicionalmente, para determinar si el impacto de PCSK9 fue relevante en los sujetos humanos se utilizó un procedimiento de SNP de etiqueta, mediante lo cual las variantes genéticas de Pérdida de Función (LOF) y Ganancia de Función (GOF) de PCSK9 y caracterizadas se utilizaron similares a los ratones genéticamente inactivados de PCSK9. Se muestra en la presente que el genotipo del PCSK9 de etiqueta de SNP, rs644000, se asoció en gran medida con la mortalidad de 28 días en el cohorte del choque séptico SPH y este resultado se replicó en el cohorte de choque séptico VASST. También se mostró en la presente que las variantes erróneas LOF se asociaron con la mortalidad de 28 días disminuida mientras que las variantes erróneas GOF se asociaron con la mortalidad de 28 días incrementada. Las tres variantes LOF relativamente comunes (MAF³0.5%) se encontraron predominantemente dentro de los haplotipos etiquetador por el alelo menor de rs644000 y la variante GOF relativamente común se descubrió casi exclusivamente dentro de los haplotipos etiquetados por el alelo mayor de rs644000, representando probablemente la asociación potente del alelo G menor de rs644000 con la mortalidad de 28 días disminuida.

Adicionalmente, se descubrió que las concentraciones en plasma de la citoquinas inflamatorias y quimiocinas se elevaron en pacientes que tienen variantes GOF comparados con aquellos con variantes LOF. Estos resultados de choque séptico humano se alinean bien con el modelo de ratón de inflamación sistémica indicando que la actividad PCSK9 disminuida da por resultado una respuesta de citoquinas inflamatorias disminuida y supervivencia incrementada. Estos resultados apoyan la conclusión de que la reducción de la actividad de PCSK9 reduce la respuesta inflamatoria y mejora el resultado fisiológico en los ratones después de la administración de LPS y también incrementa la supervivencia y reduce la insuficiencia renal o disfunción renal en sujetos humanos con sepsis y choque séptico grave.

Mutaciones de LOF y GOF en PCSK9 Muchas mutaciones en el gen de PCSK9 ya han sido bien documentado31 y los efectos funcionales caracterizados40' 44. Las mutaciones LOF dan por resultado un secuestro reducido del receptor LDL y, como resultado, disminuyeron las concentraciones de colesterol LDL en plasma. Presumiblemente las mutaciones LOF impactarian similarmente otros receptores regulados por PCSK9 incluyendo el receptor de lipoproteina de densidad muy baja, ApoER2, y CD81. Tres variantes LOF se ha descubierto que son relativamente comunes (MAF>0.5%). La variante errónea rsll591147 da por resultado una sustitución de R46L, que se asocia consistentemente con los niveles de colesterol LDL bajos y, por consiguiente es una variante LOF31' 3 ' 45. Esta variante da por resultado resultados de pacientes mejorados en la enfermedad aterosclerótica46. Similarmente, rsll583680 A53V es común y se reporta que es una variante LOF31. La variante errónea rs562556 da por resultado una sustitución de V474I, que da por resultado colesterol total y colesterol LDL disminuidos 47. A la inversa, las variantes GOF conducen a una variedad disminuida de los receptores LDL en la superficie celular de los hepatocitos y, como resultado, los niveles de colesterol LDL en plasma incrementados con un incremento concomitante en la aterosclerosis y la enfermedad cardiovascular48. Algunas variantes genéticas en PCSK9 pueden dar por resultado LOF o GOF al afectar la afinidad con lo cual la PCSK9 se liga al receptor LDL, con algunas variantes que muestran un incremento de muchas veces en la afinidad sobre la PCSK9 de tipo natural40. Otras variantes genéticas pueden afectar la degradación de la proteina PCSK9, ya sea incrementando o disminuyendo la vida media de la PCSK949.

PCSK9 en la Inflamación e Infección La PCSK9 da por resultado la regulación por incremento de genes implicados en la biosintesis de esterol y regulación por decremento de los genes de respuesta al estrés y rutas de inflamación especificas50. La PCSK9 tiene efectos pro-apoptóticos51. Las concentraciones de PCSK9 se incrementan en pacientes quienes tienen infecciones periodontales; concentraciones de PCSK9 en pacientes con periodontitis fueron significativamente más altas que los controles sanos en un estudio52. Labonte y colaboradores descubrieron un efecto antiviral derivada de hígado circulante en PCSK9 en HCV en células y mostraron que la PCSK9 regula por decremento el nivel de la expresión de CD81 de hígado de ratón in vivo. Las células que expresan PCSK9 se mostraron que son resistentes a la infección por HCV. También, la adición de la PCSK9 soluble purificada al sobrenadante del cultivo celular impidió la infección por HCV en una manera dependiente de dosis.

Los resultados del choque séptico humano se alinean en muchas formas con el modelo de ratón de la inflamación sistémica. Por lo tanto, se concluye que la actividad de PCSK9 disminuida da por resultado la mejora de consecuencias adversas de la inflamación sistémica incluyendo efectos cardiovasculares adversos (hipotensión, fracción de cyección ventricular izquierda disminuida en ratones; disfunción de órganos cardiovasculares y necesidad por agentes vasoactivos en humanos), fenotipos globales adversos (actividad y temperatura corporal en los ratones; disfunción de órganos múltiples en humanos), mejora de la respuesta de citoquina inflamatorias (patrón similar en los ratones y humanos), y reducción en la mortalidad (puntos finales de mortalidad sustitutos en ratones, mortalidad de 28 dias en humanos). Existe una variedad de inhibidores de PCSK9 en desarrollo para el tratamiento de trastornos de lipidos, pero ninguno se enfoca en la sepsis o choque séptico u otras afecciones inflamatorias relacionadas. Una reducción en la actividad de PCSK9 utilizando la inhibición de PCSK9 podría mejorar los resultados de la sepsis humana, choque séptico, y muchas otras respuestas inflamatorias a la infección, o podrían reduci /prevenir el tratamiento o prevención de la insuficiencia renal; disfunción renal; insuficiencia respiratoria; disfunción respiratoria; o lesión pulmonar aguda.

Aunque varias modalidades de la invención se describen en la presente, muchas adaptaciones y modificaciones se pueden hacer dentro del alcance de la invención de acuerdo con el conocimiento general común de aquellas personas expertas en este campo. Tales modificaciones incluyen la sustitución de equivalentes conocidos por cualquier aspecto de la invención a fin de lograr el mismo resultado en sustancialmente la misma forma. Intervalos numéricos son exclusivos de los números que definen el intervalo. La palabra "que comprende" se utiliza en la presente como un término indefinido, sustancialmente equivalente a la frase "que incluye, pero no se limita a", y la palabra "comprende" tiene un significado correspondiente. Como se utiliza en la presente, las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyen referentes plurales al menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De esta manera, la referencia a "una cosa" incluye más de una tal cosa. La cita de referencia en la presente no es una misión de que tales referencias son téenica previa a una modalidad de la presente invención. Cualquier documento(s) de prioridad y todas las solicitudes, incluyendo pero no limitado a patentes y solicitudes de patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorpora en la presente a manera de referencia como si tal publicación individual se indicó especifica e individualmente a ser incorporada por referencia en la presente y como si se hubiera establecido en la presente. La invención incluye todas las modalidades y variaciones sustancialmente como se describe a partir de ahora y con referencia a los ejemplos y figuras.

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Claims (64)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar una respuesta inflamatoria a la infección, el método caracterizado porque comprende: administrar un inhibidor de proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) a un sujeto en necesidad del mismo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo o fragmento de ligación a antigeno del mismo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo monoclonal o fragmento de ligación a antigeno del mismo.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un mimético de péptido.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 5, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un mimético de dominio EGFA, péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fíbronectina, o una variante PCSK9 neutralizante.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un oligonucleótido anti-sentido.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 7, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es BMS-PCSK9RX.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es una molécula de ARNi.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 9, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es LNA ASO o ALN-PCS.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el sujeto es un humano.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque la respuesta inflamatoria a la infección, es uno o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el sujeto tiene choque séptico.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el sujeto tiene sepsis.

15. Una composición farmacéutica para tratar una respuesta inflamatoria a la infección, caracterizada porque comprende un inhibidor de PCSK9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el inhibidor de PCSK9 se selecciona de uno o más de lo siguiente: se selecciona de uno o más de lo siguiente: un anticuerpo o fragmento de ligación a antigeno del mismo; un mimético de péptido; un oligonucleótido anti-sentido; una molécula de ARNi.

17. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizada porque el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo monoclonal o fragmento de ligación a antigeno del mismo.

18. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, 16, o 17, caracterizada porque el inhibidor de PCSK9 es: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652.

19. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizada porque el inhibidor de PCSK9 es un mimético de dominio EGFA, péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante PCSK9 neutralizante.

20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, 16, o 19, caracterizada porque el inhibidor de PCSK9 es BMS-PCSK9Rx.

21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizada porque el inhibidor de PCSK9 es LNA ASO o ALN-PCS.

22. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-21, caracterizada porque el sujeto es un humano.

23. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-22, caracterizada porque la respuesta inflamatoria a la infección, es uno o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sisté ica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

24. Un inhibidor de PCSK9, caracterizado porque es para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

25. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 se selecciona de uno o más de los siguiente: un anticuerpo o fragmento de ligación a antigeno del mismo; un mimético de péptido; un oligonucleótido anti-sentido; una molécula de ARNi.

26. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo monoclonal o fragmento de ligación a antigeno del mismo.

27. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con la reivindicación 24, 25, o 26, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652.

28. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un mimético de dominio EGFA, un péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante PCSK9 neutralizante.

29. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con la reivindicación 24, 25, o 28, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es BMS-PCSK9Rx.

30. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es LNA ASO o ALN-PCS.

31. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-21, caracterizado porque el sujeto es un humano.

32. El inhibidor de PCSK9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-31, caracterizado porque la repuesta inflamatoria a la infección, es una o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

33. Uso de un inhibidor PCSK9 para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

34. Uso de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor PCSK9 y un portador farmacéuticamente aceptable para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

35. Uso de un inhibidor PCSK9 en la preparación de un medicamento para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

36. El uso de conformidad con la reivindicación 33, 34, o 35, en donde el inhibidor de PCSK9 se selecciona de uno o más de lo siguiente. Un anticuerpo o fragmento de ligación a antigeno del mismo; un mimético de péptido; un oligonucleótido anti-sentido; una molécula de ARNi.

37. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-36, en donde el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo monoclonal o fragmento de ligación a antigeno del mismo.

38. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-37, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652.

39. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-36, en donde el inhibidor de PCSK9 es un mimético de dominio EGFA, péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante PCSK9 neutralizante.

40. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-36, y 39, en donde el inhibidor de PCSK9 es BMS-PCSK9RX.

41. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-36, en donde el inhibidor de PCSK9 es LNA ASO o ALN-PCS.

42. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-41, en donde el sujeto es un humano.

43. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-42, en donde la repuesta inflamatoria a la infección, es una o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritís, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

44. Un paquete comercial, caracterizado porque comprende (a) un inhibidor PCSK9; y (b) instrucciones para el uso del mismo para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

45. Un paquete comercial, caracterizado porque comprende (a) una composición farmacéutica que comprende un inhibidor PCSK9 y un portador farmacéuticamente aceptable; y (b) instrucciones para el uso del mismo para tratar una respuesta inflamatoria a la infección.

46. El paquete comercial de conformidad con la reivindicación 44 o 45, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 se selecciona de uno o más de lo siguiente: un antígeno o fragmento de ligación a antigeno del mismo; un mimético de péptido; un oligonucleótido anti-sentido; una molécula de ARNi.

47. El paquete comercial de conformidad con la reivindicación 44, 45, o 46, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo monoclonal o fragmento de ligación a antígeno del mismo.

48. El paquete comercial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-47, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652.

49. El paquete comercial de conformidad con la reivindicación 44, 45, o 46, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un mimético de dominio EGFA, un péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante PCSK9 neutralizante.

50. El paquete comercial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-46, y 49, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es BMS-PCSK9Rx.

51. El paquete comercial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-46, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es LNA ASO o ALN-PCS.

52. El paquete comercial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-51, caracterizado porque el sujeto es un humano.

53. El paquete comercial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-52, caracterizado porque la repuesta inflamatoria a la infección, es una o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocística, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis.

54. Un método para tratar insuficiencia renal, disfunción renal, insuficiencia respiratoria, disfunción respiratoria, o lesión pulmonar aguda, el método caracterizado porque comprende: administrar un inhibidor de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) a un sujeto en necesidad del mismo.

55. Un método para prevenir insuficiencia renal, disfunción renal, insuficiencia respiratoria, disfunción respiratoria, o lesión pulmonar aguda, el método caracterizado porque comprende: administrar un inhibidor de proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) a un sujeto en necesidad del mismo.

56. El método de conformidad con la reivindicación 54 o 55r caracterizado porque el sujeto tiene una respuesta inflamatoria a la infección.

57. El método de conformidad con la reivindicación 54, 55 o 56, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 se selecciona de uno o más de lo siguiente: un anticuerpo o fragmenro de ligación a antigeno del mismo; un mimético de péptido; un oligonucleótido anti-sentido; una molécula de ARNi.

58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo monoclonal o fragmento de ligación a antigeno del mismo.

59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-58, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; o RG7652.

60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es un mimético de dominio EGFA, un péptido EGF-A, proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina, o una variante PCSK9 neutralizante.

61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, y 60, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es BMS-PCSK9Rx.

62. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizado porque el inhibidor de PCSK9 es LNA ASO o ALN-PCS.

63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-62, caracterizado porque el sujeto es un humano.

64. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-63, caracterizado porque la repuesta inflamatoria a la infección, es una o más de: sepsis, septicemia, neumonía, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda, infección, pancreatitis, bacteriemia, peritonitis, absceso abdominal, infección intestinal, infecciones oportunistas, V1H/SIDA, endocarditis, bronquiectasis, bronquitis crónica, meningitis, artritis séptica, infección de tracto urinario, pielonefritis, fasciitis necrotizante, Infección por estreptococo Grupo A, infección de enterococo, sepsis Gram-positiva, sepsis Gram-negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngica, meningococcemia, epiglotitis, infección por E. coli 0157:H7, gangrena gaseosa, síndrome de choque tóxico, tuberculosis micobacteriana, infección por carinii neumocistica, enfermedad inflamatoria pélvica, infección por Legionella, infección por Influenza A, infección por virus Epstein-Barr, o encefalitis