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MX2014009864A - Polipeptidos de union a cx3cr1. - Google Patents

Polipeptidos de union a cx3cr1.

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MX2014009864A
MX2014009864A MX2014009864A MX2014009864A MX2014009864A MX 2014009864 A MX2014009864 A MX 2014009864A MX 2014009864 A MX2014009864 A MX 2014009864A MX 2014009864 A MX2014009864 A MX 2014009864A MX 2014009864 A MX2014009864 A MX 2014009864A
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seq
polypeptide
amino acid
immunoglobulin
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MX2014009864A
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Diane Van Hoorick
Sanjaya Singh
Toon Laeremans
Erik Depla
Alisa K Waterman
Cedric Jozef Néotère Ververken
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Boehringer Ingelheim Int
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Publication date
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Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
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Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos de unión a CX3CR1, en particular polipéptidos que comprenden dominios de inmunoglobulinas específicos. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos; a métodos para la preparación de tales polipéptidos; a células huésped que expresan o son capaces de expresar tales polipéptidos; a composiciones que comprenden tales polipéptidos; y a usos de tales polipéptidos o tales composiciones, en particular para propósitos profilácticos, terapéuticos y de diagnóstico.

Description

POLIPEPTIDOS DE UNION A CX3CR1 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos de unión a CX3CR1, en particular polipéptidos que comprenden dominios de inmunoglobulinas específicos. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos; a métodos para la preparación de tales polipéptidos; a células huésped que expresan o son capaces de expresar tales polipéptidos; a composiciones que comprenden tales polipéptidos; y a usos de tales polipéptidos o tales composiciones, en particular para propósitos profilácticos, terapéuticos y de diagnóstico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La CX3CR1 es una proteina de membrana integral acoplada a la proteina G, que es un receptor de quimiocina. Está expresado en forma predominante en los tipos de células tales como monocitos, células dendriticas y células T que se han asociado a la iniciación y progresión de placas ateroscleróticas . Está regulado por aumento en monocitos por medio de lipidos oxidados y media la migración de estas células hacia adentro y la supervivencia dentro de las placas. Su único ligando fractalquina (FKN) está expresado en la superficie de células vasculares endoteliales y suaves musculares en lesiones en las que modula la adhesión de leucocitos. La fractalquina también se libera en la circulación por medio de escisión proteolitica donde funciona como un agente quimiotáctico.
En los seres humanos, se ha demostrado que una variante de CX3CR1 (V249I/T280M) con actividad disminuida está asociado a un menor riesgo de enfermedad cardiovascular (enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad cerebrovascular o enfermedad vascular periférica) (McDermott, 2001; Circ Res 89:401), enfermedad arterial coronaria (evidencia angiográfica de estenosis) (McDermott, 2003; J. Clin. Invest. 111:1241), y enfermedad oclusiva de la arteria carótida (Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276). La CX3CR1 estaba colocalizada con la fractalquina que mostró una inmunotinción potenciada por medio de anticuerpos policlonales dentro de placas ateroscleróticas ( ong, 2002 Cardiovasc. Path. 11:332). No se observó tinción alguna de fractalquina en las regiones arteriales no plaquetarias .
Varios estudios independientes genéticos sobre ratones han demostrado un efecto beneficioso de deficiencia de CX3CR1 sobre aterosclerosis . Se observa una reducción en un área de lesión en el arco aórtico y aorta torácica asi como también una disminución en la acumulación de monocitos/macrófagos en placas en dos cepas derivadas en forma independiente de CX3CRl_ ~ apoE_/~ con ratones alimentados con una dieta alta en grasas (Combadiére, 2003; Circulation, 107:1009, Lesnik, 2003; J. Clin. Invest. 111 : 333) .
Esto muestra que la CX3CR1 está implicada en enfermedades cardiovasculares y la modulación de su actividad podría proporcionar terapias prometedoras. Por lo tanto, existe una necesidad de moléculas antagonistas contra CX3CR1 con propiedades farmacológicas beneficiosas, que se puedan utilizar como agentes terapéuticos para tratar enfermedades, en particular enfermedades cardiovasculares en humanos.
Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar moléculas antagonistas anti- CX3CR1, en particular moléculas antagonistas anti-CX3CRl, que tienen alta afinidad de unión a CX3CR1.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar moléculas antagonistas anti-CX3CRl, que tienen alta especificidad para CX3CR1.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar antagonistas anti-CX3CRl, que tienen una actividad potente.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar antagonistas anti-CX3CRl, que tienen una biodisponibilidad y vida media favorables.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar antagonistas anti-CX3CRl, que tienen propiedades biofísicas favorables.
Los objetivos adicionales de la presente invención incluyen combinaciones de cualquiera de los objetivos establecidos con anterioridad.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La invención proporciona polipéptidos que se unen a CX3CR1 humana y son capaces de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana. En un aspecto, el polipéptido es una inmunoglobulina que comprende un dominio de unión a antígenos que comprende tres regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3, donde dicha inmunoglobulina se une a CX3CR1 humana y es capaz de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana. En un aspecto adicional, el polipéptido comprende uno o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl, donde dicho polipéptido es capaz de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención está caracterizado por una o más de las siguientes propiedades : • Se une con alta afinidad a CX3CR1 humana; • Bloquea la unión de fractalquina soluble a CX3CR1 humana ; • Inhibe la quimiotaxis inducida por fractalquina; • Inhibe internalización de receptores CX3CR1 humanos inducida por fractalquina; • Reacciona en forma cruzada con CX3CR1 de cynomolgus dentro de 10 veces de E/IC50 para CX3CR1 humana para la unión e inhibición funcional.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención comprende un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl y además comprende un resto de extensión de la vida media, por ejemplo un resto de unión a albúmina, una molécula de polietilenglicol o un dominio Fe. En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención comprende dos o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl. En un aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl están vinculados en forma covalente por medio de un péptido vinculador. En un aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl en un polipéptido de la presente invención tienen la misma secuencia de aminoácido. En otro aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl en un polipéptido de la presente invención tienen diferentes secuencias de aminoácido. En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti—CX3CR1 y además comprende un resto de extensión de la vida media, por ejemplo un resto de unión a albúmina, una molécula de polietilenglicol o un dominio Fe.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl vinculado en forma covalente a un resto de unión a albúmina por medio de un primer péptido vinculador, donde dicho resto de unión a albúmina está además vinculado en forma covalente a un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl por medio de un segundo péptido vinculador.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl vinculado en forma covalente a un dominio Fe por medio de un péptido vinculador. En un aspecto, tal polipéptido que comprende un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl vinculado en forma covalente a un dominio Fe por medio de un péptido vinculador está proporcionado como un dimero, por ejemplo a través de puentes de disulfuro.
Los polipéptidos de la presente invención se utilizan para la prevención, el tratamiento, alivio y/o diagnóstico de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas a CX3CR1, en particular enfermedades cardiovasculares, tales como aterosclerosis .
En- un aspecto adicional, la presente invención proporciona: Realización 1: Una inmunoglobulina que comprende un dominio de unión a antigenos que comprende tres regiones determinantes de complementariedad CDRl, CDR2 y CDR3, donde dicha inmunoglobulina se une a CX3CR1 humana y es capaz de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana.
Realización 2: Un polipéptido que comprende uno o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CR1, donde dicho polipéptido es capaz de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana.
Realización 3: Un polipéptido de acuerdo con la realización 2, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl consiste esencialmente en cuatro regiones estructurales (FR1, FR2, FR3 y FR4 ) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) .
Realización 4: Un polipéptido de acuerdo con la realización 3, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl tiene la estructura FR1 - CDR1 -FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.
Realización 5: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 4, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un dominio de anticuerpos.
Realización 6: Un polipéptido de acuerdo con la realización 5, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un VH, VL, VHH, VH camelizado, o VHH que está optimizado para estabilidad, potencia, fabricabilidad y/o similitud a regiones estructurales humanas.
Realización 7: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 6, donde dicho polipéptido tiene una afinidad a CX3CR1 humana en: a) un EC50 de menos que o igual a ????, menos que o igual a 5nM, menos que o igual a 2,5n o menos que o igual a InM, de acuerdo con lo determinado por FACS de unión a células; o b) un IC50 de menos que o igual a ????, menos que o igual a 5nM, menos que o igual a 2,5nM o menos que o igual a InM, de acuerdo con lo determinado por FACS de competición.
Realización 8: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 7, donde dicho polipéptido bloquea la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana en un IC50 de menos que o igual a 300nM, o menos que o igual a ?????, o menos que o igual a 20nM, o menos que o igual a ????, o menos que o igual a 5nM, o menos que o igual a 2.5nM o menos que o igual a InM.
Realización 9: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 8, donde dicho polipéptido inhibe la quimiotaxis inducida por fractalquina mediada por CX3CR1 humana en un IC5o de menos que o igual a 500 nM, o de menos que o igual a 100 nM, o de menos que o igual a 75 nM, o de menos que o igual a 50 nM, o menos que o igual a 10 nM o menos que o igual a 5nM.
Realización 10: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 9, donde dicho polipéptido inhibe la internalización de fractalquínas mediada por CX3CR1 humana en un IC50 de menos que o igual a 10 nM, o menos que o igual a 5nM o menos que o igual a InM.
Realización 11: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 10, donde dicha CDR3 tiene la secuencia de aminoácido de Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO: 197), donde: Xaal es Pro, Ala o Gly; Xaa2 es Asp o Asn; Xaa3 es Thr o Ser; Xaa4 es Arg, Lys, Ala o Gly; y Xaa5 es Tyr o Phe.
Realización 12: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 11, donde: a) Xaal es Pro, Ala o Gly; Xaa2 es Asp o Asn; Xaa3 es Thr; Xaa4 es Arg o Lys; y Xaa5 es Tyr, y/o b) donde dicha CDR3 se selecciona de cualquiera de -las SEQ ID NOS: 186 a 190.
Realización 13: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 12, donde dicha CDR3 tiene la secuencia de aminoácido de Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 186) .
Realización 14: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 10, donde: i) dicha CDR1: a) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 141; b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 141; c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 2, o 1 aminoácido ( s) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 141, donde en la posición 2 la S se ha cambiado a T, o G; en la posición 6 la S se ha cambiado a Ríen la posición 7 la N se ha cambiado a T; y/o en la posición 9 la M se ha cambiado a K; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 141 a 145 y 213; ii) dicha CDR2: a) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 164; b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 70% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 164; c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 4, 3, 2, o 1 aminoácido (s) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 164, donde en la posición 1 la G se ha cambiado a A, L, V o S; en la posición 3 la N se ha cambiado a D, S, Q, G o T; en la posición 4 la S se ha cambiado a T, K, G o P; - en la posición 5 la V se ha cambiado a A; en la posición 6 la G se ha cambiado a D; en la posición 7 la I se ha cambiado a T, o V; en la posición 8 la T se ha cambiado a A; y/o en la posición 9 la K se ha cambiado a R; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 162 a 175 y 214 a 221; y iii) dicha CDR3: a) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 186; b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 70% identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 186; c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 3, 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 186, donde - en la posición 2 la P se ha cambiado a A, o G; en la posición 7 la D se ha cambiado a N; y/o en la posición 9 la R se ha cambiado a K; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 186 a 190.
Realización 15: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 10, donde i) dicha CDR1 tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 146; ii) dicha CDR2 tiene una secuencia de aminoácido que a) tiene al menos 90% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 176 o b) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 176 o 177; y iii) dicha CDR3 tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 191.
Realización 16: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 10, donde i) dicha CDR1: a) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 147; o b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 147, donde en la posición 1 la G se ha cambiado a K, R, o A; en la posición 2 la T se ha cambiado a l, P, S o L; en la posición 3 la I se ha cambiado a V, o T; en la posición 4 la F se ha cambiado a L; en la posición 5 la S se ha cambiado a R, o D; en la posición 6 la N se ha cambiado a S, T, o D; y/o en la posición 7 la N se ha cambiado a T, o Y; o c) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 147 a 161; ii) dicha CDR2: a) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 179; o b) tiene una secuencias de aminoácido que tiene 4, 3, 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 179, donde en la posición 3 la S se ha cambiado a T, o G; en la posición 4 la N se ha cambiado a S, o I; - en la posición 5 la S se ha cambiado a T; en la posición 6 la G se ha cambiado a Y; y/o en la posición 8 la T se ha cambiado a A; o c) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 178 a 185; y iii) dicha CDR3: a) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 192; o b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 192; o c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 192, donde en la posición 2 la A se ha cambiado a G; - en la posición 8 la T se ha cambiado a S; en la posición 9 la A se ha cambiado a G; y/o en la posición 10 la Y se ha cambiado a F; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 192 a 196.
Realización 17: Un polipéptido de acuerdo con la realización 3, donde las secuencias de aminoácido de dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están establecidas en: - SEQ ID NO: 141, 162 y 186, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 141, 163 y 187, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 164 y 186, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 141, 166 y 186, respectivamente; 0 - SEQ ID NO: 141, 167 y 186, respectivamente ; 0 - SEQ ID NO: 141, 167 y 189, respectivamente; o - SEQ ID NO: 141, 168 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 168 y 187, respectivamente; o - SEQ ID NO: 141, 169 y 190, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 141, 170 y 186, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 141, 171 y 186, respectivamente; o - SEQ ID NO: 141, 174 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 175 y 187, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 142, 165 y 188, respecti amente ; o - SEQ ID NO: 142, 173 y 188, respectivamente; 0 - SEQ ID NO: 143, 164 y 186, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 144, 172 y 187, respectivamente ; 0 SEQ ID NO: 145, 172 y 187, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 214 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 215 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 216 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 217 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 218 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 219 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 220 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 213, 221 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 213, 214 y 186, respectivamente .
Realización 18: Un polipéptido de acuerdo con la realización 3, donde las secuencias de aminoácido de dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están establecidas en: SEQ ID NO: 146, 176 y 191, respectivamente; o SEQ ID NO: 146, 177 y 191, respectivamente.
Realización 19: Un polipéptido de acuerdo con la realización 3, donde las secuencias de aminoácido de dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están establecidas en: — SEQ ID NO: 147, 178 y 192, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 147, 179 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 147, 179 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 148, 179 y 193, respectivamente; o - SEQ ID NO: 149, 179 y 192, respectivamente; o - SEQ ID NO: 149, 180 y 192, respectivamente; o - SEQ ID NO: 149, 181 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 149, 183 y 192, respectivamente; o — SEQ ID NO: 149, 185 y 192, respectivamente; o - SEQ ID NO: 150, 179 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 150, 182 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 151, 179 y 193, respectivamente; 0 SEQ ID NO: 151, 182 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 151, 184 y 196, respectivamente; o - SEQ ID NO: 152, 179 y 195, respectivamente; o - SEQ ID NO: 153, 179 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 154, 182 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 155, 179 y 195, respectivamente; o - SEQ ID NO: 156, 181 y 192, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 157, 179 y 194, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 158, 179 y 192, respectivamente; o - SEQ ID NO: 159, 178 y 192, respectivamente ; o SEQ ID NO: 160, 179 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 161, 179 y 194, respectivamente .
Realización 20: Un polipéptido de acuerdo con la realización 3, donde las secuencias de aminoácido de dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están establecidas en: las SEQ ID NOS: 141, 164 y 186, respectivamente, o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186, respectivamente.
Realización 21: Un pelipéptido de acuerdo con la realización 3, donde las secuencias de aminoácido de dichas CDR1, CDR2 y CDR3 están establecidas en: las SEQ ID NOS: 213, 214 y 186 respectivamente, las SEQ ID NOS: 213, 221 y 186 respectivamente, o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186 respectivamente .
Realización 22: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 10, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; b) las secuencias de aminoácido que tienen al menos 90% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 3 ; c) las secuencias de aminoácido que tienen 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; o d) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 48, 121 a 140 o 222 a 224.
Realización 23: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 10, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; b) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; c) una secuencia de aminoácido que tiene b, 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; o d) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 49 a 52.
Realización 24: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 10, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; b) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 90% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; c) una secuencia de aminoácido que tiene 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; o d) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 53 a 120.
Realización 25: Un polipéptido de acuerdo con la realización 2, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.
Realización 26: Un polipéptido de acuerdo con la realización 2, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl comprende la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 121 a 140 o las SEQ ID NO: 222 a 224.
Realización 27: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, que está humanizado y/u optimizado para estabilidad, potencia, fabricabilidad y/o similitud a regiones estructurales humanas .
Realización 28: Un polipéptido de acuerdo con la realización 27, que está humanizado y/u optimizado por secuencias en una o más de las siguientes posiciones (de acuerdo con la numeración de Kabat) : 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108.
Realización 29: Un polipéptido de acuerdo con la realización 28, que comprende una o más de las siguientes mutaciones: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.
Realización 30: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 29, en el que: i) FR1 se selecciona de las SEQ ID NOS: 198 a 204; ii) FR2 se selecciona de las SEQ ID NOS: 205 a 208; iii) FR3 se selecciona de las SEQ ID NOS: 209 a 210; y/o iv) FR4 se selecciona de las SEQ ID NOS: 211 a 212.
Realización 31: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 30, que está humanizado y/u optimizado por secuencias en una o más de las siguientes posiciones (de acuerdo con la numeración de Kabat) : 52, 53.
Realización 32: Un polipéptido de acuerdo con la realización 31, que comprende una o más de las siguientes mutaciones: N52S, S53T.
Realización 33: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 32, en el que la CDR2 se selecciona de las SEQ ID NOS: 214 a 221.
Realización 34: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 33, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl comprende la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 138 a 140 o 222 a 224.
Realización 35: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22 a 26, donde dicho dominio VHH consiste en cualquiera de dichas secuencias de aminoácido .
Realización 36: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 35, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina bloquea en forma cruzada la unión de al menos uno de los dominios variables simples de inmunoglobulina de las SEQ ID NOS: 1 a 120, 121 a 140 y 222 a 224 a CX3CR1.
Realización 37: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 35, donde dicho dominio variable simple de inmunoglobulina está bloqueado en forma cruzada de la unión a CX3CR1 por medio de al menos una de las secuencias de aminoácido de las SEQ ID NOS: 1 a 120, 121 a 140 y 222 a 224.
Realización 38: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 37, donde el polipéptido además comprende un resto de extensión de la vida media.
Realización 39: Un polipéptido de acuerdo con la realización 38, donde dicho resto de extensión de la vida media está vinculado en forma covalente a dicho polipéptido y se selecciona del grupo que consiste en un resto de unión a albúmina, tal como un dominio de inmunoglobulinas antialbúmina, un resto de unión a transferrina, tal como un dominio de inmunoglobulinas anti-transferrina, una molécula de polietilenglicol , una molécula de polietilenglicol recombinante, albúmina de suero humana, un fragmento de albúmina de suero humana, un péptido de unión a albúmina o un dominio Fe.
Realización 40: Un polipéptido de acuerdo con la realización 38 o 39, donde dicho resto de extensión de la vida media consiste en un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina .
Realización 41: Un polipéptido de acuerdo con la realización 40, donde el dominio variable simple de inmunoglobulina se selecciona de un dominio VHH, un dominio VHH humanizado, un dominio VH camelizado, un- anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio único y/o "dAb".
Realización 42: Un polipéptido de acuerdo con la realización 41, donde el dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina se selecciona de las SEQ ID NOS: 230 a 232.
Realización 43: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 39, donde dicho polipéptido está unido a una porción Fe (tales como una Fe humana, por ejemplo de acuerdo con lo establecido en la SEQ ID NO: 252), en forma opcional a través de un vinculador o una región de articulación adecuada.
Realización 44: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 39, donde dicho polipéptido está vinculado además a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que se pueden utilizar como parte de/para formar una porción Fe) , para una porción Fe y/o para una o más partes de anticuerpos, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención y/o pueden conferir la capacidad para unirse a uno o más receptores Fe, en forma opcional a través de un vinculador o una región de articulación adecuada.
Realización 45: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 37, donde dicho polipéptido además comprende un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina, con preferencia un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl.
Realización 46: Un polipéptido de acuerdo con la realización 45, donde dicho primer y dicho segundo dominios variables simples de inmunoglobulina están vinculados en forma covalente por medio de un péptido vinculador.
Realización 47: Un polipéptido de acuerdo con la realización 45 o 46, donde dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina esencialmente consiste en cuatro regiones estructurales (FRl a FR4) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3) .
Realización 48: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 47, donde dicho primer y dicho segundo dominios variables simples de inmunoglobulina son dominios de anticuerpos.
Realización 49: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 48, donde dicho primer y segundo dominios variables simples de inmunoglobulina son un VH, VL, VHH, VH camelizado, o VHH que está optimizado para estabilidad, potencia, fabricabilidad y/o similitud a regiones estructurales humanas.
Realización 50: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 49, donde dichas CDR1 a CDR3 de dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina están establecidos en cualquiera de las realizaciones 11 a 21.
Realización 51: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 50, donde dicho primer y dicho segundo dominios variables simples de inmunoglobulina comprenden la misma CDR3.
Realización 52: Un polipéptido de acuerdo con la realización 51, donde dicha CDR3 está establecido en cualquiera de las realizaciones 11 a 13.
Realización 53: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 53, donde dicho primer y dicho segundo dominios variables simples de inmunoglobulina comprenden las mismas CDRl, CDR2 y CDR3.
Realización 54: Un polipéptido de acuerdo con la realización 53, donde dichas CDRl a CDR3 están establecidos en cualquiera de las realizaciones 11 a 21.
Realización 55: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 54, donde dicho primer y dicho segundo dominios variables simples de inmunoglobulina comprenden el mismo dominio VHH.
Realización 56: El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 55, donde dicho dominio VHH está establecido en cualquiera de las realizaciones 22 a 37.
Realización 57: Un polipéptido que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina que comprenden las CDRl, CDR2 y CDR3 establecidas en las SEQ ID NOS: 141, 164 y 186 o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186 y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina de acuerdo con lo establecido en cualquiera de las realizaciones 2 a 37.
Tal polipéptido puede ser en particular un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 56.
Realización 58: Un polipéptido de acuerdo con la realización 57, donde dicho primer dominio variable simple de inmunoglobulina comprende las CDRl, CDR2 y CDR3 establecidas en las SEQ ID NOS: 213, 214 y 186, las SEQ ID NOS: 213, 221 y 186 o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
Realización 59: Un polipéptido de acuerdo con la realización 57 o 58, donde dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina comprende las CDRl, CDR2 y CDR3 establecidas en las SEQ ID NOS: 141, 164 y 186 o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
Realización 60: Un polipéptido de acuerdo con la realización 57 o 58, donde dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina comprende las CDRl, CDR2 y CDR3 establecidas en: las SEQ ID NOS: 213, 214 y 186, las SEQ ID NOS: 213, 221 y 186 o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
Realización 61: Un polipéptido que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina, donde dicho primer dominio variable simple de inmunoglobulina es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2 a 37.
Tal polipéptido puede ser en particular un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 60.
Realización 62: Un polipéptido de acuerdo con la realización 61, donde dicho primer dominio variable simple de inmunoglobulina es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 121 a 140 o 222 a 224.
Realización 63: Un polipéptido de acuerdo con la realización 61 o 62, donde dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.
Realización 64: Un polipéptido de acuerdo con la realización 63, donde dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 121 a 140 o 222 a 224.
Realización 65: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 64, donde el polipéptido además comprende un resto de extensión de la-vida media.
Realización 66: Un polipéptido de acuerdo con la realización 65, donde dicho resto de extensión de la vida media está vinculado en forma covalente a dicho polipéptido y se selecciona del grupo gue consiste en un resto de unión a albúmina, tal como un dominio de inmunoglobulinas antialbúmina, un resto de unión a transíerrina, tal como un dominio de inmunoglobulinas anti-transferrina, una molécula de polietilenglicol , una molécula de polietilenglicol recombinante, albúmina de suero humana, un fragmento de albúmina de suero humana, un péptido de unión a albúmina o un dominio Fe.
Realización 67: Un polipéptido de acuerdo con la realización 66, donde dicho resto de extensión de la vida media consiste en un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina .
Realización 68: Un polipéptido de acuerdo con la realización 67, donde el dominio variable simple de inmunoglobulina se selecciona de un dominio VHH, un dominio VHH humanizado, un dominio VH camelizado, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio único y/o "dAb" .
Realización 69: Un polipéptido de acuerdo con la realización 68, donde el dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina se selecciona de las SEQ ID NOS: 230 a 232.
Realización 70: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 64, donde dicho polipéptido está unido a una porción Fe (tales como una Fe humana, por ejemplo de acuerdo con lo establecido en la SEQ ID NO: 252), en forma opcional a través de un vinculador o una región de articulación adecuada.
Realización 71: Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 45 a 66, donde dicho polipéptido está vinculado además a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que se pueden utilizar como parte de/para forma una porción Fe) , para una porción Fe y/o para una o más partes de anticuerpos, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención y/o pueden conferir la capacidad para unirse a uno o más receptores Fe, en forma opcional a través de un vinculador o una región de articulación adecuada.
Realización 72: Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 225 a 227.
Realización 73: Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 249 o 277 a 281.
Realización 74: Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 257 a 262.
Realización 75: Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 253 o 254.
Realización 76: Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 263 0 266.
Realización 77: Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 267 a 276 y 282.
Realización 78: Una molécula de ácido nucleico que comprende una región que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77.
Realización 79: Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la realización 78.
Realización 80: Una célula huésped que porta un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico, dicha molécula de ácido nucleico comprende una región que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, donde dicha célula huésped es capaz de expresar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, y donde dicha célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota.
Realización 81: Una composición farmacéutica que comprende (i) como el componente activo, uno o más polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, y (ii) un portador aceptable para uso farmacéutico, y en forma opcional (iii) un diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante.
Realización 82: un método de elaboración de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, que comprende los pasos de cultivar una célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, donde dicha célula huésped que porta un vector de expresión comprenden una molécula de ácido nucleico , dicha molécula de ácido nucleico comprenden una región que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, y donde dicha célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota; recuperar dicho polipéptido; y purificar dicho polipéptido.
Realización 83: Un método para el uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77 para el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o afección, en particular en un ser humano .
Realización 84: El método de realización 83, donde dicha enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad, trastorno o afección asociada a CX3CR1.
Realización 85: El método de realización 83, donde dicha enfermedad, trastorno o afección es aterosclerosis .
Realización 86: Una composición farmacéutica inyectable que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, dicha composición es adecuada para inyección intravenosa o subcutánea en un ser humano .
Realización 87: Un método para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno que está asociado a CX3CR1, donde dicho método comprende la administración a un sujeto que necesita del mismo de una cantidad activa para uso farmacéutico de al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77.
Realización 88: Un método de la realización 85, que además comprende la administración de un agente terapéutico adicional seleccionado del grupo que consiste en una estatina, un antiagregante plaquetario, un anticoagulante, un antidiabético y un antihipertensivo .
Realización 89: Un método para la inhibición de la unión de CX3CR1 a fractalquina en una célula de un mamífero, que comprende la administración a la célula de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, por medio de la cual se inhibe la señalización mediada por la fractalquina.
Realización 90: Un método para la detección y/o cuantificación de los niveles de CX3CR1 en una muestra biológica por medio del contacto de la muestra con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77 y la detección de la unión del polipéptido a CX3CR1.
Realización 91: Un método para el diagnóstico de un trastorno asociado a CX3CR1 o para la determinación de si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno asociado a CX3CR1, donde el método comprende poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77 y detectar la unión del polipéptido a CX3CR1 para determinar la expresión o concentración de CX3CR1.
Realización 92. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77 para su uso en el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o afección, en un ser humano.
Realización 93. El polipéptido para su uso de acuerdo con la realización 92, donde la enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad, trastorno o afección asociada a CX3CR1.
Realización 94. El polipéptido para su uso de acuerdo con la realización 92, donde la enfermedad, trastorno o afección se selecciona de trastornos ateroscleróticos cardio y cerebrovasculares , enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatía diabética, glomerulonefritis, glomerulonefritis crescéntica humana, nefropatia de IgA, nefropatia membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schónlein-Henoch y granulomatosis de Wegener, artritis reumatoide, osteoartritis , rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer.
Realización 95. El polipéptido para su uso de acuerdo con la realización 92, donde la enfermedad, trastorno o afección es aterosclerosis .
Realización 96. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o afección, en un ser humano.
Realización 97. El método de acuerdo con la realización 87, donde la enfermedad o trastorno se selecciona de trastornos ateroscleróticos cardio y cerebrovasculares , enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatia diabética, * glomerulonefritis , glomerulonefritis crescéntica humana, nefropatia de IgA, nefropatia membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schónlein-Henoch y granulomatosis de egener, artritis reumatoide, osteoartritis , rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer.
Realización 98. El método de acuerdo con la realización 87, donde la enfermedad, trastorno o afección es aterosclerosis .
Realización 99. Un kit de diagnóstico o un método de diagnóstico que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 77, o el uso del mismo.
Realización 100. Un kit de diagnóstico o un método de diagnóstico de acuerdo con la realización 99, para el diagnóstico de al menos uno de trastornos ateroscleróticos cardio y cerebrovasculares , enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatia diabética, glomerulonefritis , glomerulonefritis crescéntica humana, nefropatia de IgA, nefropatia membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schónlein-Henoch y granulomatosis de Wegener, artritis reumatoide, osteoartritis, rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los aspectos anteriores y otros y las realizaciones de la invención serán claros a partir de la siguiente descripción adicional en la presente, en la que: a) A menos que se indique o se defina lo contrario, todos los términos utilizados tiene su significado usual en la técnica, que será clara para aquellos con experiencia. Por ejemplo, se hace referencia a los manuales estándares, tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2da Ed. ) , Volúms. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), y Roitt et al., "Immunology" (2da Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), asi como también a la técnica anterior citada en la presente; Además, a menos que se indique lo contrario, todos los métodos, pasos, técnicas y manipulaciones que no se describen en forma especifica en detalle se pueden llevar a cabo y se han llevado a cabo en una manera conocida per se, como será claro para aquellos con -experiencia . Por ejemplo, se hace referencia nuevamente a los manuales estándares, a la técnica anterior general referenciada con anterioridad y a las referencias citadas en las mismas; b) A menos que se indique lo contrario, los términos " inmunoglobulina" y "secuencia de inmuno-globulina" - ya sea utilizada en la presente para referirse a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo de 4 cadenas convencional - se utilizan como términos generales para incluir tanto el tamaño completo del anticuerpo, las cadenas individuales del mismo, asi como también toda las partes, dominios o fragmentos del mismo (que incluye pero no se limita a dominios de unión a antígenos o fragmentos tales como dominios VHH o dominios VH/VL, respectivamente) . En adición, el término "secuencia" de acuerdo con lo utilizado en la presente (por ejemplo en términos como "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia de anticuerpo", "secuencia de dominio variable (único)", "secuencia VHH" o "secuencia de proteina "), por lo general se debe comprender que incluye tanto la secuencia de aminoácido relevante asi como también las secuencias de ácido nucleico o secuencias de nucleótidos que codifican los mismos, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada; c) El término "dominio" (de un polipéptido o proteina) de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a una estructura de proteina plegada que tiene la capacidad de retener su estructura terciaria independientemente del resto de la proteina. Por lo general, los dominios son responsables por las propiedades funcionales discretas de las proteínas, y en muchos casos se pueden agregar, eliminar o transferir a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. d) El término "dominio de inmunoglobulinas" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a una región globular de una cadena de anticuerpo (tas como por ej . , una cadena de un anticuerpo de 4 cadenas convencional o de un anticuerpo de cadena pesada) , o a un polipéptido que esencialmente consiste en tal región globular. Los dominios de inmunoglobulinas están caracterizados por que retienen la característica de plegado de inmunoglobulina de las moléculas de anticuerpo, que consiste en un sándwich de 2 capas de aproximadamente 7 hilos beta antiparalelos dispuestos en dos láminas beta, en forma opcional estabilizados por un enlace disulfuro conservado. e) El término "dominio variable de inmunoglobulina" de acuerdo con lo utilizado en la presente significa un dominio de inmunoglobulinas que esencialmente consiste en cuatro "regiones estructurales" que se denominan en la técnica y en la presente a continuación como "región estructural 1" o "FR1"; como "región estructural 2" o"FR2"; como "región estructural 3" o "FR3"; y como "región estructural 4" o "FR4", respectivamente; dichas regiones estructurales están interrumpidas por tres "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR", que se denominan en la técnica y en la presente a continuación como "región determinante de complementariedad 1" o "CDR1"; como "región determinante de complementariedad 2" o "CDR2"; y como "región determinante de complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Por lo tanto, la estructura o secuencia general de un dominio variable de inmunoglobulina se puede indicar de acuerdo con lo presentado a continuación: FR1 -CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. El dominio variable de inmunoglobulinas es el que confiere especificidad a un anticuerpo para el antigeno al portar el sitio de unión a antigeno . f) Los términos "dominio variable simple de inmunoglobulina" y "dominio variable simple" de acuerdo con lo utilizado en la presente significan una dominio variable de inmunoglobulina que es capaz de unirse en forma especifica a un epitopo del antigeno sin parearse con un dominio variable de inmunoglobulinas adicional. Un ejemplo de dominios variables simples de inmunoglobulina en el significado de la presente invención son los "anticuerpos de dominio" , tales como los dominios variables simples de inmunoglobulina VH y VL (dominios VH y dominios VL) . Otro ejemplo de dominios variables simples de inmunoglobulina son los "dominios VHH" (o simplemente "VHH") de camélidos, de acuerdo con lo definido de aquí en adelante.
En vista de la definición anterior, el dominio de unión a antigenos de un anticuerpo de 4 cadenas convencional (tal como una molécula de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE; conocidas en la técnica) o de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv tal como un Fv vinculado a disulfuro o un fragmento scFv, o un diacuerpo (todos conocidos en la técnica) derivados de tal anticuerpo de 4 cadenas convencional, normalmente no se considerarían como un dominio variable simple de inmunoglobulina, dado que, en estos casos, la unión al epítopo respectivo de un antígeno normalmente no ocurriría por medio de uno dominio (simple) de inmunoglobulinas sino por medio de un par de dominios (de asociación) de inmunoglobulinas tales como dominios variables de cadena ligera y pesada, es decir, por medio de un par VH-VL de dominios de inmunoglobulinas, que se unen en forma conjunta a un epítopo del antígeno respectivo. fl) Los "dominios VHH" , también conocidos como VHH, dominios VHH, fragmentos de anticuerpos VHH, y anticuerpos VHH, originalmente se han descripto como el dominio (variable) de inmunoglobulina de unión a antígeno de los "anticuerpos de cadena pesada" (es decir, de "anticuerpos que carecen de cadenas ligeras"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R. : "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446 a 448 (1993)). El término "dominio VHH" se ha elegido con el fin de distinguir estos dominios variables de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominan en la presente como "VH dominios" o "VH dominios") y a partir de los dominios variables de cadena ligera que están presentes en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominan en la presente como "dominios VL" o "dominios VL"). Los dominios VHH se pueden unir en forma especifica a un epitopo sin un dominio de unión a antigeno adicional (en oposición a los dominios VH o VL en un anticuerpo de 4 cadenas convencional, en cuyo caso el epitopo está reconocido por un dominio VL junto con un dominio VH) . Los dominios VHH son unidades de reconocimiento de antigenos pequeñas, robustas y eficientes formadas por un dominio simple de inmunoglobulinas .
En el contexto de la presente invención, los términos dominio VHH, VHH, dominio VHH, fragmento de anticuerpo VHH, anticuerpo VHH, asi como también " Nanobody®" y " dominio de Nanobody® " (siendo "Nanobody" una marca registrada de la compañía Ablynx N.V.; Ghent; Bélgica) se utilizan en forma intercambiable y son representativos de dominios variables* simples de inmunoglobulina (que tienen la estructura: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y se unen en forma específica a un epitopo sin requerir la presencia de un segundo dominio variable de inmunoglobulina) , y que se distingue de los dominios VH por medio de los denominados "residuos distintivos", de acuerdo con lo definido en por ej., WO2009/109635, Fig. 1.
Los residuos de aminoácido de un dominio VHH se enumeran de acuerdo con la numeración general para los dominios VH presentada por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicación N.°. 91), de acuerdo con lo aplicado a dominios VHH de Camélidos, de acuerdo con lo mostrado en por ej . , la Figura 2 de Riechmann y uyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25 a 38 (1999). De acuerdo con esta numeración, FR1 comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 1 a 30, - CDR1 comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 31 a 35, - FR2 comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 36 a 49, CDR2 comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 50 a 65, FR3 comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 66 a 94, - CDR3 comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 95 a 102, y - FR4 comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 103 a 113.
Sin embargo, se debe mencionar que, como es muy conocido en la técnica para los dominios VH y para los dominios VHH, el número total de residuos de aminoácido en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de residuos de aminoácido indicado por la numeración de Kabat (esto es, una o más posiciones de acuerdo con la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia actual, o la secuencia actual puede contener más residuos de aminoácido que el número permitido por la numeración de Kabat) . Esto significa que, por lo general, la numeración de acuerdo con Kabat puede o no corresponder a la numeración actual de los residuos de aminoácido en la secuencia actual.
Los métodos alternativos para la numeración los residuos de aminoácido de dominios VH son conocidos en la técnica, dichos métodos también se pueden aplicar en una manera análoga a los dominios VHH. Sin embargo, en la presente descripción, reivindicaciones y figuras, se seguirá la numeración de acuerdo con Kabat y aplicada a los dominios VHH de acuerdo con lo descripto con anterioridad, a menos que se indique lo contrario.
El número total de residuos de aminoácido en un dominio VHH normalmente estará en el intervalo de 110 a 120, a menudo entre 112 y 115. Sin embargo, se debe mencionar que algunas secuencias más cortas y más largas también pueden ser adecuadas para los propósitos que se describen en la presente .
Las características estructurales y propiedades funcionales adicionales de los dominios VHH y polipéptidos que contienen los mismos se pueden sintetizar de acuerdo con lo presentado a continuación: Los dominios VHH (que han sido "diseñados" por naturaleza para unirse en forma funcional a un antígeno sin la presencia de, y sin cualquier interacción con, un dominio variable de cadena ligera) pueden funcionar como una única unidad, dominio o polipéptido estructural de unión a antígeno funcional, relativamente pequeño. Esto distingue los dominios VHH de los dominios VH y VL de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, que por sí solos por lo general no son adecuados para la aplicación práctica como proteínas simples de unión a antígeno o dominios variables simples de inmunoglobulina, sino que se necesitan combinar de alguna forma u otra para proporcionar una unidad funcional de unión a antígeno (como por ejemplo en fragmentos de anticuerpos convencionales tales como fragmentos Fab; en scFv, que consisten en un dominio VH vinculado en forma covalente a un dominio VL) .
Debido a estas propiedades únicas, el uso de dominios VHH, ya sea solos o como parte de un polipéptido más grande, ofrece un número de ventajas significativas sobre el uso de dominios VH y VL convencionales, scFv o fragmentos de anticuerpos convencionales (tales como fragmentos Fab- o F(ab')2-): - únicamente se requiere un dominio simple para unir un antigeno con alta afinidad y con alta selectividad, de manera tal que no existe necesidad de tener dos dominios separados presentes, ni asegurar que estos dos dominios estén presentes en la conformación espacial y configuración correctas (es decir, a través del uso de vinculadores diseñados en forma especial, como con los scFv) ; Los dominios VHH se pueden expresar desde un único gen y no requieren plagados modificaciones post-traduccionales ; Los dominios VHH se pueden manipular con facilidad en formatos multivalentes y multiespecíf LCOS (de acuerdo con lo discutido en forma adicional en la presente) ; Los dominios VHH son altamente solubles y no tienen una tendencia a aglomerarse (como con los dominios de unión a antigenos derivados de ratón descriptos por Ward et al., Nature 341: 544 a 546 (1989)); Los dominios VHH son altamente estables al calor, pH, proteasas y otros agentes o condiciones desnaturalizantes y, por lo tanto, se pueden preparar, se almacenaron o transportaron sin el uso de equipamientos de refrigeración, que conllevan un ahorro de costo, tiempo y medioambiental; Los dominios VHH son fáciles y relativamente económicos de preparar, incluso en una escala requerida para la producción. Por ejemplo, los dominios VHH y polipéptidos que contienen los mismos se pueden producir por el uso de fermentación microbiana (por ej . , de acuerdo con lo descripto en forma adicional a continuación) y no requieren el uso de sistemas de expresión de mamíferos, como por ejemplo con los fragmentos de anticuerpos convencionales; Los dominios VHH son relativamente pequeños (aproximadamente 15 kDa, o 10 veces más pequeños que una IgG convencional) en comparación con los anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y por lo tanto muestran una mayor penetración en los tejidos y — se pueden administrar en mayores dosis que tal anticuerpo de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos; - Los dominios VHH pueden demostrar las propiedades denominadas de unión a cavidad (inter alia debido a su bucle de CDR3 extendido, en comparación con dominios VH convencionales) y por lo tanto también pueden acceder blancos y epítopos no accesibles- a anticuerpos de 4 cadenas convencional y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Los métodos para obtener los dominios VHH que se unen a un antígeno o epítopo específico se han descripto con anterioridad, por ej . , en WO2006/040153 y WO2006/122786. De acuerdo con lo descripto también en las mismas en detalle, los dominios VHH derivados de camélidos se pueden "humanizar" por medio del reemplazo de uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la secuencia VHH original por medio de uno o más de los residuos de aminoácido que ocurren en las posiciones correspondientes en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano. Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de regiones estructurales humanas completas, y, en una realización incluso más especifica, puede contener secuencias de regiones estructurales humanas derivadas de DP-29, DP-47, DP-51, o partes de las mismas, en forma opcional combinadas con secuencias JH, tales como JH5. f2) Los "Anticuerpos de dominio", también conocidos como "Dab", "Anticuerpos de dominio", y "dAb" (los términos "Anticuerpos de dominio" y "dAb" se utilizan como marcas comerciales por el grupo de compañías GlaxoSmithKline ) se han descripto en por ej . , Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature -341: 544 a 546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS en Biotechnology 21(11): 484 a 490 (2003); y WO2003/002609.
Los anticuerpos de dominio esencialmente corresponden a los dominios VH o VL de mamíferos no camélidos, en particular anticuerpos humanos de 4 cadenas. Con el fin de unir un epítopo como un dominio simple de unión a antígeno, es decir, sin estar pareado con un dominio VL o VH, respectivamente, se requiere la selección especifica para tales propiedades de unión a antígeno, por ej . , por el uso de librerías de secuencias de dominio simple VH o VL humanas.
Los anticuerpos de dominio tienen, al igual que los VHH, un peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa y, si se derivan de secuencias humanas completas, no requieren humanización para por ej . , uso terapéutico en humanos. Como en el caso de dominios VHH, también están bien expresados en sistemas de expresión procariotas, lo que proporciona una reducción significativa en el costo de elaboración global.
Los anticuerpos de dominio, así como también los dominios VHH, se pueden someter a una maduración de afinidad por medio de la introducción de una o más alteraciones en la secuencia de aminoácido de una o más CDR, dichas alteraciones dan lugar a una afinidad mejorada del dominio variable simple de inmunoglobulina resultante para su antígeno respectivo, en comparación con la molécula madre respectiva. Las moléculas de dominio variable simple de inmunoglobulina maduradas por afinidad de la invención se pueden preparar por medio de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, de acuerdo con lo descripto por Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779 a 783, o Barbas, et al., 1994, Proc. Nat . Acad. Sci, EE.UU. 91: 3809 a 3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147 a 155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994 a 2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol . 154(7):3310 a 3319; y Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889 a 896; KS Johnson y RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996. f3) Además, también será claro para aquellos con experiencia que es posible "injertar" una o más de las CDR mencionadas con anterioridad en otros "soportes", que incluye pero no se limita a soportes humanos o soportes no de inmunoglobulina . Los soportes adecuados y las técnicas para tal injerto de CDR son conocidos en la técnica. g) Los términos " epítopo" y "determinante antigénico" , que se pueden utilizar en forma intercambiable, se refieren a la parte de una macromolécula, tal como un polipéptido, que es reconocida por moléculas de unión a antigeno, tales como anticuerpos convencionales o los polipéptidos de la invención, y más en particular por el sitio de unión a antigeno de dichas moléculas. Los epitopos definen el sitio de unión mínimo para una inmunoglobulina, y por lo tanto representan el blanco de la especificidad de una inmunoglobulina .
La parte de una molécula de unión a antigeno (tal como un anticuerpo o un polipéptido convencional de la invención) que reconoce el epitopo se denomina un paratopo . h) El término "biparatópico" molécula de unión (a antigeno) o polipéptido "biparatópico" de acuerdo con lo utilizado en la presente significará un polipéptido que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina de acuerdo con lo definido en la presente, donde estos dos dominios variables son capaces de unirse a dos epitopos diferentes de un antigeno, dichos epitopos normalmente no están unidos al mismo tiempo por una inmunoglobulina monoespecifica, tal como por ej . , un anticuerpo convencional o un dominio variable simple de inmunoglobulina. Los polipéptidos diparatópicos pueden estar compuestos por dominios variables que tienen diferentes especificidades de epitopo, y no contienen pares de dominio variable mutualmente complementarios que se unen al mismo epitopo. Por lo tanto, los dos dominios variables no compiten entre si para unirse al blanco. i) Un polipéptido (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable simple de inmunoglobulina, un polipéptido de la invención, o por lo general una molécula de unión a antigeno o un fragmento de la misma) que se puede "unir" o "unir en forma específica ", que "tiene afinidad por" y/o que "tiene especificidad por" un cierto epitopo, antigeno o proteina (o por al menos una parte, fragmento o epitopo de la misma) se dice que está "contra" o "dirigida contra " dicho epitopo, antigeno o proteina o es una molécula "de unión" con respecto a tal epitopo, antigeno o proteina, o se dice que es un "anti"-epitopo, "anti"-antigeno o "anti"-proteina (por ej . , anti-CX3CR1) . k) Por lo general, el término "especificidad" se refiere al número de diferentes tipos de antigenos o epitopos a los cuales se puede unir una molécula de unión a antigeno o una proteina de unión a antigeno particular (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable simple de inmunoglobulina, o un polipéptido de la invención) . La especificidad de una proteina de unión a antigeno se puede determinar con base en su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antigeno con una proteina de unión a antigeno (KD) , es una medida para la resistencia de unión entre un epitopo y un sitio de unión a antigeno en la proteina de unión a antigeno: cuento menor es el valor del KD, mayor será la resistencia de unión entre un epitopo y la molécula de unión a antigeno (en forma alternativa, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (KA) , que es 1/KD) . Como será claro para aquellos con experiencia (por ejemplo con base en la revelación adicional en la presente) , la afinidad se puede determinar en una manera conocidas per se, dependiendo del antigeno de interés especifico. La avidez es la medida de la resistencia de unión entre una molécula de unión a antigeno (tal como una inmunoglobuli na , un anticuerpo, un dominio variable simple de inmunoglobulina, o un polipéptido de la invención) y el antigeno pertinente. La avidez está relacionada taño con la afinidad entre un epitopo y su sitio de unión a antigeno en la molécula de unión a antigeno como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antigeno. 1) Los residuos de aminoácido se indicarán de acuerdo con el código de aminoácidos estándar de tres letras o de una letras, de acuerdo con lo generalmente conocido y acordado en la técnica. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácido, el término "diferencia de aminoácido" se refiere a inserciones, supresiones o sustituciones del número de residuos de aminoácido indicados en una posición de la secuencia de referencia, en comparación con una segunda secuencia. En el caso de las sustitución/es, tales sustitución/es con preferencia serán sustitución/es de aminoácido conservadoras, lo que significa que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de estructura química similar y que tiene una influencia pequeña o esencialmente nula en la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Tales sustituciones de aminoácido conservadoras son muy conocidas en la técnica, por ejemplo de WO 98/49185, donde las sustituciones de aminoácido conservadoras con preferencia son sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (i) a (v) está sustituido por otro residuo de aminoácido dentro de los mismos grupos: (i) residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (ii) residuos polares, cargados en forma negativa y sus amidas (no cargadas) : Asp, Asn, GIu y GIn; (iii) residuos polares, cargados en forma positiva: His, Arg y Lys; (iv) residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, lie, Val y Cys; y (v) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Las sustituciones de aminoácido conservadoras preferidas en particular están de acuerdo con lo presentado a continuación: Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en GIn o en His; Asp en GIu; · Cys en Ser; GIn en Asn; GIu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en GIn; lie en Leu o en Val; Leu en lie o en Val; Lys en Arg, en GIn o en GIu; Met en Leu, en Tyr o en lie; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp o en Phe; Val en lie o en Leu. m) Se considera que una molécula de ácido nucleico o polipéptido está "(en forma) esencialmente aislada", por ejemplo, cuando se compara con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o el medio de cultivación del cual se ha obtenido, cuando se ha separado de al menos un otro componente con el cual se asocia normalmente en dicha fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteina/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente menor. En particular, una molécula de ácido nucleico o polipéptido se considera "esencialmente aislada" cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces, y hasta 1000 veces o más. Una molécula de ácido nucleico o polipéptido que está "en forma esencialmente aislada" con preferencia es esencialmente homogéneo, de acuerdo con lo determinado por el uso de una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como poliacrilamida-electroforesis en gel; n) Una "identidad de secuencia" entre por ej . , dos secuencias de dominio variable simple de inmunoglobulina indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre estas dos secuencias. Se pueden calcular o determinar de acuerdo con lo descripto en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 de WO08/020079. Una "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son ya sea idénticos o que representan sustituciones de aminoácido conservadoras.
Especificidad blanco Los polipéptidos de la invención tienen especificidad para CX3CR1 humana. Por lo tanto, los polipéptidos de la invención con preferencia se unen a CX3CR1 humana (SEQ ID NO: 255) . En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención también se unen a CX3CR1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 256) .
Polipéptidos de la invención La invención proporciona agentes activos para uso farmacéutico novedosos para la prevención, el tratamiento, alivio y/o diagnóstico de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas a CX3CR1, tales como enfermedades cardiovasculares. En particular, la invención proporciona polipéptidos que se unen a CX3CR1 humana y son capaces de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana. En un aspecto, el polipéptido es una inmunoglobulina que comprende un dominio de unión a antigenos que comprende tres regiones determinantes de complementariedad CDRl, CDR2 y CDR3, donde dicha inmunoglobulina se une a CX3CR1 humana y es capaz de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana. En un aspecto adicional, el polipéptido comprende uno o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl, donde dicho polipéptido es capaz de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana .
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención está caracterizado por una o más de las siguientes propiedades : • Se une con alta afinidad a CX3CR1 humana, por ejemplo en un EC5o de menos que o igual a ????, menos que o igual a 5nM, menos que o igual a 2,5nM o menos que o igual a lnM, de acuerdo con lo determinado por FACS de unión a células; • Bloquea la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana, por ejemplo en un IC50 de menos que o igual a 300nM, o menos que o igual a ?????, o menos que o igual a 20nM, o menos que o igual a ????, o menos que o igual a 5n , o menos que o igual a 2.5nM o menos que o igual a InM; • Inhibe la quimiotaxis inducida por fractalquina mediada por CX3CR1 humana, por ejemplo en un IC50 de menos que o igual a 500 nM, o menos que o igual a 100 nM, o de menos que o igual a 75 nM, o menos que o igual a 50 nM, o menos que o igual a 10 nM o menos que o igual a 5nM; la eficacia de inhibición obtenida es mayor que o igual a 15%, o mayor que o igual a 50%, o mayor que o igual a 80%, o mayor que o igual a 95%; • Inhibe la internalización inducida por fractalquina mediada por CX3CR1 humana, por ejemplo en un IC50 de menos que o igual a 10 nM o menos que o igual a 5nM; • Reacciona en forma cruzada con la CX3CR1 de cynomolgus, por ejemplo dentro de 10 veces de E/IC50 para CX3CR1 humana para la unión e inhibición funcional.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención además comprende un resto de extensión de la vida media, por ejemplo un resto de unión a albúmina, una molécula de polietilenglicol o un dominio Fe. En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención comprende dos o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl. En un aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl están vinculados en forma covalente por medio de un péptido vinculador. En un aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl en un polipéptido de la presente invención tienen la misma secuencia de aminoácido. En otro aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl en un polipéptido de la presente invención tienen diferentes secuencias de aminoácido. En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CR1 y además comprende un resto de extensión de la vida media, por ejemplo un resto de unión a albúmina, una molécula de polietilenglicol o un dominio Fe.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl vinculado en forma covalente a un resto de unión a albúmina por medio de un primer péptido vinculador, donde dicho resto de unión a albúmina está además vinculado en forma covalente a un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl por medio de un segundo péptido vinculador.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl vinculado en forma covalente a un dominio Fe por medio -de un péptido vinculador. En un aspecto, tal polipéptido que comprende un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl vinculado en forma covalente a un dominio Fe por medio de un péptido vinculador está proporcionado como un dímero, por ejemplo a través de puentes de disulfuro.
Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención se obtienen de acuerdo con lo descripto en la presente a continuación. En resumen, los dominios variables simples de la presente invención se identificaron a partir de una librería que expresa dominios variables simples (VHH) derivados de una llama inmunizada con ADN que codifican CX3CR1 humana. La librería de fagos se cribó en lipopartículas virales hCX3CRl y el fago de unión se observó por su capacidad para competir por la unión por receptores con la fractalquina marcada con flúor Alexa (AF-FKN) . Los dominios variables simples representativos de la presente invención se describen en la presente en mayor detalle.
En un aspecto, un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención consiste esencialmente en cuatro regiones estructurales (FR1, FR2, FR3 y FR4 ) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) . En particular, el dominio variable simple de inmunoglobulina tiene la estructura FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. En un aspecto,- el dominio variable simple de inmunoglobulina es un dominio de anticuerpos.
En un aspecto, la CDR3 de un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención tiene la secuencia de aminoácido de Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 de acuerdo con lo establecido en la SEQ ID NO: 197, donde : Xaal es Pro, Ala o Gly; Xaa2 es Asp o Asn; Xaa3 es Thr o Ser; Xaa4 es Arg, Lys, Ala o Gly; y Xaa5 es Tyr o Phe.
En un aspecto, la CDR3 de un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene la secuencia de aminoácido de Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 de acuerdo con lo establecido en la SEQ ID NO: 197, donde: Xaal es Pro, Ala o Gly; Xaa2 es Asp o Asn; Xaa3 es Thr; Xaa4 es Arg o Lys; y Xaa5 es Tyr.
En un aspecto, la CDR3 de un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene la secuencia de aminoácido de Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr de acuerdo con lo establecido en la SEQ ID NO: 186.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las siguientes CDRl, CDR2 y CDR3: CDRl: a) tiene la secuencia de aminoácido de GSIFSSNAMA (SEQ ID NO: 141) ; o b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 141; o c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 2, o 1 aminoácido (s) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 141, donde en la posición 2 la S se ha cambiado a T, o G; en la posición 6 la S se ha cambiado a R; en la posición 7 la N se ha cambiado a T; y/o en la posición 9 la M se ha cambiado a K; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 141 a 145 y 213; CDR2: a) tiene la secuencia de aminoácido de GINSVGITK (SEQ ID NO: 164) ; o b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 70% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 164; o c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 4, 3, 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 164, donde en la posición 1 la G se ha cambiado a A, L, V o S; - en la posición 3 la N se ha cambiado a D, S, Q, G o T; en la posición 4 la S se ha cambiado a T, K, G o P; en la posición 5 la V se ha cambiado a A; en la posición 6 la G se ha cambiado a D; en la posición 7 la I se ha cambiado a T, o V; - en la posición 8 la T se ha cambiado a A; y/o en la posición 9 la K se ha cambiado a R; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 162 a 175 y 214 a 221; y CDR3: a) tiene la secuencia de aminoácido de DPRRGWDTRY (SEQ ID NO : 186); o b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 70% identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 186; o c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 3, 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 186, donde en la posición 2 la P se ha cambiado a A, o G; en la posición 7 la D se ha cambiado a N; y/o - en la posición 9 la R se ha cambiado a K; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 186 a 190.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las siguientes CDR1, CDR2 y CDR3, donde: dicha CDR1 tiene la secuencia de aminoácido de GRTFSSYAMG (SEQ ID NO: 146); dicha CDR2 tiene una secuencia de aminoácido que a) tiene al menos 90% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de GISGSASRKY (SEQ ID NO: 176) o b) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 176 o 177; Y dicha CDR3 tiene la secuencia de aminoácido de SNSYPKVQFDY (SEQ ID NO: 191) .
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las siguientes CDR1, CDR2 y CDR3 : dicha CDR1: a) tiene la secuencia de aminoácido de GTIFSNNAMG (SEQ ID NO : 147); o b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 147, donde en la posición 1 la G se ha cambiado a K, R, o A; en la posición 2 la T se ha cambiado a I, P, S o L; en la posición 3 la I se ha cambiado a V, o T; en la posición 4 la F se ha cambiado a L; en la posición 5 la S se ha cambiado a R, o D; en la posición 6 la N se ha cambiado a S, T, o D; y/o en la posición 7 la N se ha cambiado a T, o Y; o c) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 147 a 161; dicha CDR2: a) tiene la secuencia de aminoácido de SISNSGSTN (SEQ ID NO: 179) ; o b) tiene una secuencias de aminoácido que tiene 4, 3, 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 179, donde en la posición 3 la S se ha cambiado a T, o G; en la posición 4 la N se ha cambiado a S, o í; en la posición 5 la S se ha cambiado a T; en la posición 6 la G se ha cambiado a Y; y/o en la posición 8 la T se ha cambiado a A; o c) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ I-D NOS: 178 a 185; y dicha CDR3: a) tiene la secuencia de aminoácido de DARRGWNTAY (SEQ ID NO: 192); o b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 192; o c) tiene una secuencia de aminoácido que tiene 2, o 1 aminoácido ( s ) de diferencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 192, donde en la posición 2 la A se ha cambiado a G; en la posición 8 la T se ha cambiado a S; en la posición 9 la A se ha cambiado a G; y/o en la posición 10 la Y se ha cambiado a F; o d) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 192 a 196.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las siguientes CDR1, CDR2 y CDR3: SEQ ID NO: 141, 162 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 163 y 187, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 164 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 166 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 167 y 186, respectivamente ,· o -SEQ ID NO: 141, 167 y 189, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 168 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 168 y 187, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 169 y 190, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 170 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 171 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 174 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 175 y 187, respectivamente; o SEQ ID NO: 142, 165 y 188, respectivamente; o SEQ ID NO: 142, 173 y 188, respectivamente; o SEQ ID NO: 143, 164 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 144, 172 y 187, respectivamente ; o SEQ ID NO: 145, 172 y 187, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 214 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 215 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 216 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 217 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 218 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 219 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 220 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 213, 221 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 213, 214 y 186, respectivamente .
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las siguientes CDRl, CDR2 y CDR3 : SEQ ID NO: 146, 176 y 191, respectivamente; o SEQ ID NO: 146, 177 y 191, respectivamente.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las siguientes CDRl, CDR2 y CDR3 : — SEQ ID NO: 147, 178 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 147, 179 y 192, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 147, 179 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 148, 179 y 193, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 149, 179 y 192, respectivamente; o - SEQ ID NO: 149, 180 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 149, 181 y 192, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 149, 183 y 192, respectivamente; o - SEQ ID NO: 149, 185 y 192, respectivamente; o - SEQ ID NO: 150, 179 y 194, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 150, 182 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 151, 179 y 193, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 151, 182 y 194, respectivamente; o - SEQ ID NO: 151, 184 y 196, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 152, 179 y 195, respecti amente ; o - SEQ ID NO: 153, 179 y 194, respectivamente ; o SEQ ID NO: 154, 182 y 194, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 155, 179 y 195, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 156, 181 y 192, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 157, 179 y 194, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 158, 179 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 159, 178 y 192, respectivamente ; o SEQ ID NO: 160, 179 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 161, 179 y 194, respectivamente.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las CDRl, CDR2 y CDR3 establecidas en: SEQ ID NOS: 141, 164 y 186; o SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención, en particular un dominio único de inmunoglobulinas de la presente invención, tiene las CDRl, CDR2 y CDR3 establecidas en: SEQ ID NOS: 213, 214 y 186; o SEQ ID NOS: 213, 221 y 186; o SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
Los polipéptidos representativos de la presente invención que tienen las CDR descriptas con anterioridad se muestran en las Tablas 1, 2, 3 (polipéptidos representativos de las familias 101, 9 y 13, respectivamente) y 4 (polipéptidos representativos de las variantes optimizadas de la familia 101.
Tabla 1: Familia 101 *Las secuencias de CDR se determinaron de acuerdo con Antibody Engineering, vol. 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlín, 2010. Los números de secuencia en la tabla (SEQ) se refieren a las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud.
Tabla 2: Familia 9 *Las secuencias de CDR se determinaron de acuerdo con Antibody Engineering, vol. 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlín, 2010. Los números de secuencia en la tabla (SEQ) se refieren a las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud.
Tabla 3: Familia 13 *Las secuencias de CDR se determinaron de acuerdo con Antibody Engineering, vol . 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlín, 2010. Los números de secuencia en la tabla (SEQ) se refieren a las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud.
Tabla 4 : Variantes optimizadas *Las secuencias de CDR se determinaron de acuerdo con Antibody Engineering, vol . 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlín, 2010. Los números de secuencia en la tabla (SEQ) se refieren a las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen uno o más dominios VHH.
En un aspecto, un dominio VHH de la presente invención comprende o esencialmente consiste en la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; o b) las secuencias de aminoácido que tienen al menos 90% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 3;^ o c) las secuencias de aminoácido que tienen 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 3 o d) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 48, o la SEQ ID NO: 121 a 140, o la SEQ ID NO: 222 a 224.
En un aspecto adicional, un dominio VHH de la presente invención comprende o esencialmente consiste en la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; o b) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; o c) una secuencia de aminoácido que tiene 5, 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; o d) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 49 a 52.
En un aspecto adicional, un dominio VHH de la presente invención comprende o esencialmente consiste en la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; o b) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 90% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; o c) una secuencia de aminoácido que tiene 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; o d) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 53 a 120.
En un aspecto adicional, un dominio VHH de la presente invención comprende o esencialmente consiste en la secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 121 a 140, o la SEQ ID NO: 222 a 224.
En un aspecto adicional, un dominio VHH de la presente invención comprende o esencialmente consiste en la secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 138 a 140.
En un aspecto adicional, un dominio VHH de la presente invención comprende o esencialmente consiste en la secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 222 a 224.
Los dominios VHH representativos de la presente invención se muestran en la Tabla 5 y los dominios VHH optimizados representativos de la presente invención se muestran en la Tabla 6 a continuación: Tabla 5: dominios VHH Las SEQ ID NO: 1 a 48 son dominios VHH de la familia 101. Las SEQ ID NO: 49 a 52 son dominios VHH de la familia 9. Las SEQ ID NO: 53 a 120 son dominios VHH de la familia 13.
CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGASLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP61F4 A YRQAPGKQRDLVAVINTVGITKYADSVKGRFTI NO: SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGW DTRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVESRGGSVQAGESLRLSCAASGSI FSSNAM SEQ ID IPMP61A1 A YRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTI NO: 1 SGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRG DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESRGGSVQAGASLRLSCAASGSI FSSNAM SEQ ID IPMP61B2 AWYRQAPGKQRDLVAVINTVGITKYADSVKGRFTI NO: SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP61C9 AWYRQALGKQRDLVALIDSAGITKYADSVKGRFTIS NO: RDNAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCASDARRGW NTKYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP65H0 AWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRF I NO: 2 SRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP65E1 AWYRQAPGKQRDLVAGINSVGIAKYADS KGRF I NO: 1 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAKA SEQ ID IPMP65E1 WYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTIS NO: 0 RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD TRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSI FSSNAM SEQ ID IPMP65E0 AWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTI NO: 5 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP65B1 AWYRQAPGKQRDLVAVINKVGITKYADSVKGRFTI NO: 1 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP65B0 AWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTI NO: 7 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTLVTVSS ·_ CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSRNAM SEQ ID IPMP65B0 AWYRQAPGKQRDLVASINSVGITKYGDSVKGRFTI NO: 9 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGW DTRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGGIFSRNAM SEQ ID IPMP65H0 AWYRQAPGKQRDLVASINSVGITKYGDSVKGRFTI NO: 1 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAM SEQ ID IPMP65G0 AWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITRYADSVKGRFTI NO: 7 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW NTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSI FSSNAM SEQ ID IPMP66H0 AWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTI NO: 8 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSI FSSNAM SEQ ID IPMP66H0 AWYRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTI NO: 4 SRDNAKNTVYLQMMSLKPEDTAVYYCTSDPRRG WDTRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP66F0 AWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYAGSVKGRFTI NO: 2 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP66E1 AWYRQAPGKQRDLVAAINSVGTTKYADSVKGRFTI NO: 1 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSI FSSNAM SEQ ID IPMP66D1 AWYRQALGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTIS NO: 0 RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD TRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLMESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP66D0 AWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTI NO: 8 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP66A0 AWYRQALGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTIS NO: 4 RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD TRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASG IFSSNAM SEQ ID IPMP66D0 AWYRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTI NO: 4 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGW NTRYWGQGTLVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSI FSSNAM SEQ ID IPMP66D0 AWYRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTT NO: 2 SGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGW DTRYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAM SEQ ID IPMP66D0 AWYRQAPGKQRDLVASIDSVGITKYRDSVKGRFTI NO: 6 SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGW DTRYWGQGTQVTVSS VSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNSGYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAM SEQ ID 60 ?????e ?9 GWYRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFT NO: VSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1 ?? EVQLMESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAM SEQ ID 61 IPMP1S C6 GWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFT NO: VSRDNDKNTGYLQ NSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNA G SEQ ID 62 IPMP18 C9 WYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTV NO: SRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMG SEQ ID 63 IPMP18 DI WYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTV NO: SRDNDKSTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGLVQPGGSLGLSCATSGTIFSNNAM SEQ ID 64 IPMP18 DI GWYRQAPGKKRDLVASISNSGST YADSVKGRFT NO: 0 VSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAM SEQ ID 65 IPMP18 DI GWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFT NO: 2 VSRDNDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAM SEQ ID 66 IPMP18 Fl GWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFT NO: VSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAM SEQ ID 67 IPMP18 F5 GWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFT NO: VSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1 BI EVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAM SEQ ID 68 IPMP18 F6 GWYRQAPGKKRDLVASISNSGST YADSVKGRFT NO: VSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTAYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRTNAM SEQ ID 69 IPMP18 F9 GWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFT NO: VSRDNDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRG WNTGYWGQGTQVTVSS CX3CR1BI EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAM SEQ ID 70 IPMP18 G5 GWYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFT NO: VSRDNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRG WNTGYWGQGTQVTVSS Tabla 6 : Dominios VHH optimizados aspecto adicional, un polipéptido de acuerdo con la presente invención, en particular un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención, está humanizado y/u optimizado para estabilidad, potencia, fabricabilidad y/o similitud a regiones estructurales humanas. Por ejemplo, el polipéptido está humanizado y/u optimizado por secuencias en una o más de las siguientes posiciones (de acuerdo con la numeración de Kabat): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108. En un aspecto, el polipéptido comprende una o más de las siguientes mutaciones: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.
En un aspecto, una o más regiones estructurales de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, en particular un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención, está humanizado y/u optimizado por secuencias. En un aspecto, un polipéptido de acuerdo con la presente invención, en particular un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención, comprende regiones estructurales (FR) por ejemplo de acuerdo con lo establecido a continuación: i) FR1 se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NOS: 198 a 204; ii) FR2 se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NOS: 205 a 208; iii) FR3 se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NOS: 209 a 210; y/o iv) FR4 se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NOS: 211 a 212.
Las secuencias de regiones estructurales de inmunoglobulinas humanas (FR) que también se pueden utilizar como secuencias de regiones estructurales para los dominios variables simples de inmunoglobulina de acuerdo con lo descripto con anterioridad son conocidas en la técnica. También son conocidas en la técnica los métodos para humanizar las regiones estructurales de los dominios variables simples de inmunoglobulina derivados de especies distintas a los humanos.
En un aspecto adicional, una o más regiones CDR de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, en particular un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención, está humanizado y/u optimizado por secuencias. En un aspecto, un polipéptido de acuerdo con la presente invención, en particular un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención, está humanizado y/u optimizado por secuencias in una o más de las siguientes posiciones (de acuerdo con la numeración de Kabat) : 52, 53.
En un aspecto adicional, un polipéptido de acuerdo con la presente invención, en particular un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención, comprende una o más de las siguientes mutaciones: N52S, S53T.
En un aspecto adicional, un polipéptido de acuerdo con la presente invención, en particular un dominio variable simple de inmunoglobulina de la presente invención, comprende una CDR2 seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 214 a 221.
Las secuencias humanizadas y/u optimizadas representativas de la presente invención se muestran en las Tablas 4 y 6 con anterioridad en la presente y en la Tabla 7 a continuación en la presente.
Tabla 7 : Variantes optimizadas por secuencias La Tabla 7a muestra las FR1-CDR1-FR2-CRD2 de las variantes optimizadas por secuencia, la tabla 7b muestra las FR3-CDR3-FR4-CDR4 de dichas variantes. Los números de secuencia en las tablas (SEQ) se refieren a las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud.
Tabla 7a: Variantes optimizadas por secuencias (FRl-CDRl- FR2-CDR2) Nano SEQ FR1 SEQ CDR1 SEQ FR2 SEQ CDR2 SEQ cuerpo FR1 CDR FR2 CDR 1 2 CAAS CX3CR1 140 DVQLVES 204 GSIFS 141 YRQA 205 AINS 162 BII308 GGGLVQP SNAMA PGKRR VGVT GGSLRLS DLVA K CAAS Nano SEQ FR3 SEQ CDR3 SEQ FR4 SEQ cuerpo FR3 CDR3 FR4 CX3CR1 1 YADSVKGRFTI 209 DPRRG D 186 WGQGTQV 211 BIIPMP SRDNAKNTVYL TRY TVSS 66B02 QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 121 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII043 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 122 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII045 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 123 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII047 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 124 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII048 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 125 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII049 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 126 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII050 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA YYCTS CX3CR1 127 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII061 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 128 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII056 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS Nano SEQ FR1 SEQ CDR1 SEQ FR2 SEQ cuerpo FR1 CDR CDR 1 2 CX3CR1 129 YADSVKGRFTI 210 DPRRG D 186 WGQGTLV 212 BII057 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 130 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII060 I SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 131 YADSVKGRFTI 209 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII065 SRDNAKNTVYL TRY TVSS QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 132 YADSVKGRFTI 209 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII067 SRDNAKNTVYL TRY TVSS QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 133 YADSVKGRFTI 209 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII068 SRDNAKNTVYL TRY TVSS QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 134 YADSVKGRFTI 209 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII074 SRDNAKNTVYL TRY TVSS QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 135 YADSVKGRFTI 209 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII118 SRDNAKNTVYL TRY TVSS QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 136 YADSVKGRFTI 209 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII129 SRDNAKNTVYL TRY VSS QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 137 YADSVKGRFTI 209 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII158 SRDNAKNTVYL TRY TVSS QMNSLKPEDTA VYYCTS CX3CR1 138 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 2-12 BII306 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA VYYCTS CX3CR1 139 YADSVKGRFTI 210 DPRRGWD 186 WGQGTLV 212 BII307 SRDNSKNTVYL TRY TVSS QMNSLRPEDTA En un aspecto de la presente invención, un polipéptido de la invención puede contener en forma adicional modificaciones tales como residuos de glicosil, cadenas laterales de aminoácido modificadas, y similares.
Será claro para aquellos con experiencia que para usos farmacéuticos en humanos, los polipéptidos de la invención con preferencia están dirigidos contra CX3CR1 humana, mientras que para propósitos veterinarios, los polipéptidos de la invención con preferencia están dirigidos contra CX3CR1 de las especies a tratar.
También será claro para aquellos con experiencia que cuando se utiliza como un agente terapéutico en humanos, los dominios variables simples de inmunoglobulina comprendidos en los polipéptidos de acuerdo con la invención con preferencia son dominios variables simples de inmunoglobulina humanizados.
De acuerdo con la invención, un dominio variable simple de inmunoglobulina puede ser un anticuerpo de dominio, es decir, un anticuerpo VL o VH, y/o dominios VHH de acuerdo con lo descripto con anterioridad, y/o cualquier otro tipo de dominio variable simple de inmunoglobulina, por ejemplo VH camelizado, con la condición de que estos dominios variables simples de inmunoglobulina sean dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl.
En un aspecto de la invención, el dominio variable simple de inmunoglobulina esencialmente consiste en ya sea una secuencia de anticuerpo de dominio o una secuencia de dominio VHH de acuerdo con lo descripto con anterioridad. En particular, el dominio variable simple de inmunoglobulina esencialmente consiste en una secuencia de dominio VHH.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención comprende dos o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl. En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención comprende dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CR1, por ejemplo VHH anti-CX3CRl. En un aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl en un polipéptido de la presente invención tienen la misma secuencia de aminoácido. En otro aspecto, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl en un polipéptido de la presente invención tienen diferentes secuencias de aminoácido.
De acuerdo- con otra realización de la invención, los al menos dos dominios variables simples de inmunoglobulina presentes en un polipéptido de la invención pueden estar vinculados entre si directamente (es decir, sin el uso de un vinculador) o a través de un vinculador. El vinculador con preferencia es un péptido vinculador y se seleccionará, de acuerdo con la invención, de manera tal permita la unión de los al menos dos dominios variables simples de inmunoglobulina a CX3CR1, ya sea dentro de una y la misma molécula de CX3CR1, o dentro de dos moléculas diferentes .
Los vinculadores adecuados dependerán ínter alia de los epitopos y, en forma especifica, la distancia entre los epitopos en CX3CR1 a los cuales se unen los dominios variables simples de inmunoglobulina, y será claro para aquellos con experiencia con base en la revelación en la presente, en forma opcional después de algún grado limitado de experimentación de rutina.
También, cuando los dos o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl son anticuerpos de dominio o dominios VHH, también pueden estar ligados entre si a través de un tercer anticuerpo de dominio o dominio VHH (en el que los dos o más dominios variables simples de inmunoglobulina pueden estar ligados directamente al tercer anticuerpo de dominio o dominio VHH o a través de vin-culadores adecuados) . Tal tercer anticuerpo de dominio o dominio VHH puede ser por ejemplo un anticuerpo de dominio o dominio VHH que proporciona una vida media aumentada, de acuerdo con lo descripto en forma adicional en la presente.
Por ejemplo, el último anticuerpo de dominio o dominio VHH puede ser un anticuerpo de dominio o dominio VHH que es capaz de unirse a una proteina de suero (humana) tal como albúmina de suero (humana) o transferrina (humana) , de acuerdo con lo descripto en forma adicional en la presente.
En forma alternativa, los dos o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl pueden estar vinculados en serie (ya sea directamente o a través de un vinculador adecuado) y el tercer (único) anticuerpo de dominio o dominio VHH (que puede proporcionar una vida media aumentada, de acuerdo con lo descripto con anterioridad) pueden estar conectado directamente o a través de un vinculador a una de estas dos o más secuencias de inmunoglobulina mencionadas con anterioridad.
Los vinculadores adecuados se describen en la presente en conexión con polipéptidos específicos de la invención y pueden (por ejemplo y sin limitación) comprender una secuencia de aminoácido, dicha secuencia de aminoácido con preferencia tiene una longitud de 5 o más aminoácidos, 7 o más aminoácidos, 9 o más aminoácidos, 11 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos o al menos 17 aminoácidos, tales como aproximadamente 20 a 40 aminoácidos. Sin embargo, el límite superior no es crítico pero se elige por razones de conveniencia con respecto a por ej . , la producción biofarmacéutica de tales polipéptidos.
La secuencia de vinculador puede ser una secuencia natural o una secuencia no natural. Si se utiliza para propósitos terapéuticos, el vinculador con preferencia es no inmunogénico en el sujeto al cual se administra el polipéptido de la invención.
Un grupo de secuencias de vinculador útiles son vinculadores derivados de la región de articulación de anticuerpos de cadena pesada de acuerdo con lo descripto en O 96/34103 y WO 94/04678.
Otros ejemplos son secuencias de vinculador de poli-alanina tales como Ala-Ala-Ala.
Los ejemplos preferidos en forma adicional de secuencias de vinculador son vinculadores Gly/Ser de diferente longitud tales como vinculadores (glyxsery)z, que incluye (gly4ser)3 , (gly4ser)4, (gly4ser) , (gly3ser) , gly3, y (gly3ser2) 3- Si el polipéptido de la invención se modifica por medio de la adjunción de un polímero, por ejemplo un resto de polietilenglicol (PEG), la secuencia de vinculador con preferencia incluye un residuo de aminoácido, tal como una cisteina o una lisina, lo que permite tal modificación, por ej . , PEGilación, en la región del vinculador.
Los ejemplos de vinculadores son: GGGGS (vinculador 5 GS, SEQ ID NO: 233) SGGSGGS (vinculador 7GS, SEQ ID NO: 234) GGGGCGGGS (vinculador 8GS, SEQ ID NO: 235) GGGGSGGGS (vinculador 9GS, SEQ ID NO: 236) GGGGSGGGGS (vinculador 10GS, SEQ ID NO: 237) GGGGSGGGGSGGGGS (vinculador 15GS, SEQ ID NO: 238) GGGGSGGGGSGGGGGGGS (vinculador 18GS, SEQ ID NO: 239) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (vinculador 20GS, SEQ ID NO: 240) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (vinculador 25GS, SEQ ID NO: 241) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (vinculador 30GS, SEQ ID NO: 242) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (vinculador 35GS, SEQ ID NO: 243) EPKSCDKTHTCPPCP (vinculador de articulación Gl, SEQ ID NO: 244) GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (vinculador de articulación 9GS-G1, SEQ ID NO: 245) EPKTPKPQPAAA (región de articulación larga superior de llama, SEQ ID NO: 246) ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPR CP (vinculador de articulación G3, SEQ ID NO: 247) AAA (vinculador Ala, SEQ ID NO: 248) Además, el vinculador también puede ser un resto de poli (etilenglicol ) , de acuerdo con lo mostrado - en por ej . , WO04/081026.
Los ejemplos no limitantes de polipéptidos que comprenden o consisten en dos o más dominios variables simples de inmunoglobulina anti-CX3CRl se presentan en la Tabla 8a.
Tabla 8a: Polipéptidos anti-CX3CRl bivalentes otra realización, los al menos dos dominios variables simples de inmunoglobulina del polipéptido de la invención están ligados entre si a través de otro resto (en forma opcional a través de uno o dos vinculadores ) , tal como otro polipéptido que, en una realización preferida pero no limitante, puede ser un dominio variable simple de inmunoglobulina adicional de acuerdo con lo ya descripto con anterioridad. Tal resto puede estar esencialmente inactivo o puede tener un efecto biológico tal como mejorar las propiedades del polipéptido deseadas o pueden conferir una o más propiedades adicionales deseadas al polipéptido. Por ejemplo, y sin limitación, el resto puede mejorar la vida media de la proteina o polipéptido, y/o puede reducir su inmunogenicidad o mejorar cualquier otra propiedad deseada.
En un aspecto, un polipéptido de la invención incluye, en especial cuando se utiliza como un agente terapéutico, un resto que extiende la vida media del polipéptido de la invención en suero u otros fluidos corporales de un paciente. El término "vida media" significa el tiempo que le toma a la concentración en suero del 'polipéptido (modificado) reducirse al 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del polipéptido y/o depuración y/o retención por medio de mecanismos naturales.
De acuerdo con una realización adicional de la invención, los dos dominios variables simples de inmunoglobulina se pueden fusionar en una molécula de albúmina de suero, tal como se describe por ej . , en O01/79271 y WO03/59934.
En forma alternativa, tal resto de extensión de la vida media puede estar ligado en forma covalente o fusionado a dicho polipéptido y puede ser, sin limitación, una porción Fe, un resto de albúmina, un fragmento de un resto de albúmina, un resto de unión a albúmina, tal como un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina , un resto de unión a transíerrina, tales como un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-transferrina, una molécula de polioxialquileno, tal como una molécula de polietilenglicol , un péptido de unión a albúmina, o derivados de hidroxietil almidón (HES) .
En otro aspecto, el polipéptido de la invención comprende un resto que se une a un antigeno hallado en la sangre, tal como albúmina de suero, inmunoglobulinas de suero, proteina de unión a tiroxina, fibrinógeno o transferrina , para conferir de ese modo una vida media aumentada in vivo al polipéptido de la invención resultante. De acuerdo con una realización, tal resto es una inmunoglobulina de unión a albúmina y, en particular, un dominio variable simple de inmunoglobulina de unión a albúmina tal como un dominio VHH de unión a albúmina.
En otra realización, el polipéptido de la invención comprende un resto que se une a albúmina de suero, donde tal resto es un péptido de unión a albúmina, de acuerdo con lo descripto por ej . , en las publicaciones de patente internacionales WO2008/068280 y WO2009/127691.
Si se pretende para su uso en seres humanos, tal dominio variable simple de inmunoglobulina de unión a albúmina (también denominado dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina) con preferencia se unirá a la albúmina de suero humana y con preferencia será un dominio VHH de unión a albúmina humanizado.
Los dominios variables simples de inmunoglobulina que se unen a la albúmina de suero humana son conocidos en la técnica y se describen en mayor detalle en por ej . , O2006/122786. Un dominio VHH de unión a albúmina útil en forma especifica consiste en o contiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con lo establecido en cualquiera de las SEQ ID NO: 230 a 232: Tabla 8b RTWHSELWGQGTQVTVSS De acuerdo con una realización, un polipéptido de la invención puede estar ligado a una o más partes de anticuerpos, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención y/o pueden conferir la capacidad para unirse a uno o más receptores Fe. Por ejemplo, para este propósito, y sin limitarse al mismo, las partes de anticuerpos pueden ser o pueden comprender dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tal como de un anticuerpo de cadena pesada (de acuerdo con lo descripto con anterioridad en la presente) y con mayor preferencia de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; en forma especifica, el polipéptido de la invención puede estar ligado a una región Fe, por ejemplo a partir de IgG humana, a partir de IgE humana o a partir de otra Ig humana. Por ejemplo, WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio VHH de Camélido o una derivado humanizado del mismo, en el que el dominio CH2 y/o CH3 de Camelidae se ha reemplazado por dominios CH2 y/o CH3 humanos, de manera tal proporcionen una inmunoglobulina que consiste en 2 cadenas pesadas donde cada una comprende un dominio VHH (humanizado en forma opcional) y dominios CH2 y CH3 humanos (pero no un dominio CH1) , dicha inmunoglobulina tiene la función efectora proporcionada por los dominios CH2 y CH3, puede funcionar sin la presencia de cualquier cadena ligera, y tiene una vida media aumentada en comparación con los dominios VHH correspondientes sin tal modificación .
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende dos VHH anti-CX3CRl y un VHH capaz de unirse a la albúmina de suero. En un aspecto, los VHH se fusionan por el uso de péptidos vinculadores . Los ejemplos representativos de tales polipéptidos de la presente invención se muestran en la presente a continuación.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende un primer VHH anti-CX3CRl fusionado a un primer péptido vinculador, que a su vez está fusionado a un VHH capaz de unirse a albúmina de suero, que a su vez está fusionado a un segundo péptido vinculador, que a su vez está fusionado a un segundo VHH anti-CX3CRl. En un aspecto, el primer o el segundo péptido vinculador es un vinculador 9GS, en un aspecto, el primer y el segundo péptido vinculador es un vinculador 9GS. En un aspecto, el VHH capaz de unirse a albúmina de suero es capaz de unirse a la albúmina de suero humana. En un aspecto, el VHH capaz de unirse a la albúmina de suero tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 231. En un aspecto, - el primer y el segundo VHH anti-CX3CRl tienen la misma secuencia de aminoácido. En un aspecto, el primer o el segundo VHH anti-CX3CRl tiene las CDR1, CDR2 y CDR3 establecidas en: SEQ ID NOS: 213, 214 y 186; o SEQ ID NOS: 213, 221 y 186; o SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
En un aspecto, el primer y el segundo VHH anti- CX3CR1 tienen las CDR1, CDR2 y CDR3 establecidas en: SEQ ID NOS: 213, 214 y 186; o SEQ ID NOS: 213, 221 y 186; o SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
En un aspecto, el primer o el segundo VHH anti- CX3CR1 tiene la secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 138 a 140 o la SEQ ID NO: 222 a 224. En un aspecto, el primer y el segundo VHH anti-CX3CRl tienen la misma secuencia de aminoácido, donde dicha secuencia de aminoácido es la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 138 a 140 o la SEQ ID NO: 222 a 224.
Los ejemplos no limitantes de los polipéptidos de la presente invención son los polipéptidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 225 a 227, 249 o 277 a 281.
Tabla 9 En otro aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende un VHH anti-CX3CRl y un dominio Fe. En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comprende un VHH anti-CX3CRl fusionado a un péptido vinculador, que a su vez está fusionado a un dominio Fe. En un aspecto, el péptido vinculador es un vinculador 15GS. En un aspecto, el dominio Fe tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 250 o 252. En un aspecto, el VHH tiene las CDR1, CDR2 y CDR3 establecidas en: SEQ ID NOS: 213, 214 y 186; o SEQ ID NOS: 213, 221 y 186; o SEQ ID NOS: 141, 162 y 186.
En un aspecto, el VHH tiene la secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 138 a 140 o la SEQ ID NO: 222 a 224. En un aspecto el polipéptido es en la forma de un dimero, por ejemplo donde el dimero está formado por uno o más puentes de disulfuro.
Los ejemplos no limitantes de los polipéptidos de la presente invención son los polipéptidos de las SEQ ID NO: 251, 253 o 254.
Tabla 10 307D-hFc DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTA SEQ ID 254 MAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGR NO: FTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPR RGWDTRY GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE E MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Un polipéptido de la invención se puede modificar para mejorar sus propiedades. En un aspecto, un polipéptido de la presente invención se puede modificar para aumentar su estabilidad tras el almacenamiento. En un aspecto, un polipéptido de la presente invención se puede modificar para facilitar su expresión en un sistema huésped particular. Por ejemplo, se puede modificar el primer codón de un polipéptido de la presente invención. En un aspecto, un polipéptido de la presente invención comienza con un ácido glutámico (glu) como su primer aminoácido. En otro aspecto, un polipéptido de la presente invención comienza con un ácido aspártico (asp) como su primer aminoácido, por ejemplo para reducir la formación de piroglutamato en la terminal N durante el almacenamiento y de ese modo aumentar la estabilidad del producto. En otro aspecto, un polipéptido de la presente invención comienza con una alanina (ala) o una valina (val) como su primer aminoácido, por ejemplo para facilitar la expresión del polipéptido en un sistema de expresión procariota, tal como Escherichia coli. Tal modificación de un polipéptido de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo por el uso de técnicas conocidas en la técnica.
Los ejemplos representativos de los polipéptidos de acuerdo con la presente invención con un primer codón modificado están establecidos en cualquiera de las SEQ ID NO: 257 a 262 y 263 a 266 y se muestran en las Tablas 11 y 12 a continuación: Tabla 11 Tabla 12 En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención está caracterizado por una o más de las siguientes propiedades: • Se une con alta afinidad a CX3CR1 humana; • Inhibe la unión de fractalquina soluble a CX3CR1 humana; • Inhibe la quimiotaxis inducida por fractalquina; • Inhibe la internalización de receptores CX3CR1 humanos inducida por fractalquina; • Reacciona en forma cruzada con CX3CR1 de cynomolgus dentro de 10 veces de E/IC50 para CX3CR1 humana para la unión e inhibición funcional.
Por consiguiente, en un aspecto, un polipéptido de la presente invención tiene una afinidad a CX3CR1 humana en un IC50 menos que o igual a ????, o menos que o igual a 5nM, o menos que o igual a 2.5nM o menos que o igual a lnM, de acuerdo con lo determinado por los FACS de competición.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención tiene una afinidad a CX3CR1 humana en un EC50 de menos que o igual a ????, o menos que o igual a 5nM, o menos que o igual a 2.5nM o menos que o igual a lnM, de acuerdo con lo determinado por FACS de unión a células.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención bloquea la unión de CX3CR1 humana a fractalquina humana at o por encima de 50%, o en o por encima de 60%, o en o por encima de 70%, o en o por encima de 80%, o en o por encima de 90%, o en o por encima de 95% de acuerdo con lo determinado por los FACS de competición con fractalquina humana.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención bloquea la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana en un IC50 de menos que o igual a 300nM, o menos que o igual a ?????, o menos que o igual a 20nM, o menos que o igual a ????, menos que o igual a 5nM, menos que o igual a 2.5nM o menos que o igual a InM de acuerdo con lo determinado por los FACS de competición con fractalquina humana .
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención inhibe la quimiotaxis inducida por fractalquina mediada por CX3CR1 humana en o por encima de 10%, o en o por encima de 30%, o en o por encima de 40%, o en o por encima de 50%, o en o por encima de 60%, o en o por encima de 70%, o en o por encima de 80%, o en o por encima de 90%.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención inhibe la quimiotaxis inducida por fractalquina mediada por CX3CR1 humana en un IC50 de menos que o igual a 500 nM, o de menos que o igual a 100 nM, o menos que o igual a 75 nM, o menos que o igual a 50 nM, o menos que o igual a 10 nM o menos que o igual a 5nM.
En un aspecto adicional, un polipéptido de la presente invención inhibe la internalización de receptores CX3CR1 humanos inducidos por fractalquina en un IC50 de menos que o iguales a 10 nM, o menos que o igual a 5nM o menos que o igual a InM.
De acuerdo con aún otra realización, una modificación para la extensión de la vida media de un polipéptido de la invención (tal modificación también reduce la inmunogenicidad del polipéptido) comprende la adjunción de un polímero aceptable para uso farmacológico adecuado, tal como un poli (etilenglicol ) (PEG) de cadena recta o ramificada o derivados de los mismos (tales como metoxipoli (etilenglicol) o mPEG) . Por lo general, se puede utilizar cualquier forma de PEGilación adecuada, tal como la PEGilación utilizada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (que incluye no se limita a anticuerpos de dominio y scFv's); se hace referencia a, por ejemplo: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531 a 545 (2002); Veronese y Harris, Adv. - Drug Deliv. Rev. 54, 453 a 456 (2003); Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); WO 04/060965; y US6.875.841.
También están disponibles comercialmente varios reactivos para la PEGilación de polipéptidos, por ejemplo de Nektar Therapeutics, EE.UU., o NOF Corporation, Japón, tal como la Sunbright® EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, y ME Series, tal como Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, y Sunbright® ME-400MA.
Con preferencia, se utiliza la PEGilación dirigida al sitio, en particular a través de un residuo de cisteina (véase por ejemplo Yang et al., Protein Engineering 16, 761 a 770 (2003) ) . Por ejemplo, para este propósito, el PEG puede estar adjunto a un residuo de cisteina que aparece en forma natural en un polipéptido de la invención, un polipéptido de la invención se puede modificar de manera tal se pueda introducir en forma adecuada uno o más residuos de cisteina para la adjunción de PEG, o una secuencia de aminoácido que comprende uno o más residuos de cisteina para la adjunción de PEG se pueden fusionar a la terminal N y/o C y/o el PEG puede estar adjunto a un región de vinculador que une dos o más dominios funcionales de un polipéptido de la invención, todo por el uso de técnicas de manipulación de proteínas conocidas per se para aquellos con experiencia.
Con preferencia, para los polipéptidos de la invención, se utiliza un PEG con un peso molecular de más de 5 kDa, tal como más de 10 kDa y menos de 200 kDa, tal como menos de 100 kDa; por ejemplo en el intervalo de 20 kDa a 80 kDa.
Con respecto a la PEGilación, se debe mencionar que por lo general, la invención también abarca cualquier polipéptido de la invención que se ha PEGilado en una o más posiciones de aminoácido, con preferencia de manera tal que dicha PEGilación ya sea (1) aumenta la vida media in vivo; (2) reduce la inmunogenicidad; (3) proporciona una o más propiedades beneficiosas adicionales conocidas per se para la PEGilación; (4) esencialmente no afecta la afinidad del polipéptido para CX3CR1 (por ej . , no reduce dicha afinidad en más de 50 %, y con mayor preferencia en más de 10%, de acuerdo con lo determinado por un ensayo adecuado, tal como aquellos que se describen en los Ejemplos a continuación); y/o (4) no afecta cualquiera de las otras propiedades deseadas de los polipéptidos de la invención. Los grupos PEG adecuados y los métodos para adjuntarlos, ya sea en forma especifica o en forma no especifica, serán claros para aquellos con experiencia.
De acuerdo con una realización preferida en forma especifica de la invención, un polipéptido PEGilado de la invención incluye un resto PEG de PEG lineal que tiene un peso molecular de 40 kDa o 60 kDa, donde el resto PEG está adjunto al polipéptido en una región de vinculador y, en forma especifica, en un residuo Cys, por ejemplo en la posición 5 de un péptido vinculador GS8 de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 235.
Los ejemplos preferidos de polipéptidos PEGilados de la invención están PEGilados con preferencia con uno de los reactivos PEG de acuerdo con lo mencionado con anterioridad, tales como "Sunbright® ME-400MA" de acuerdo con lo mostrado en la siguiente fórmula química: que tiene un peso molecular promedio de 40 kDa.
Usos terapéuticos En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido para su uso como un medicamento.
En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido para el tratamiento o profilaxis de trastornos ateroscleróticos cardio y cerebrovasculares , enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatía diabética, glomerulonefritis , glomerulonefritis crescéntica humana, nefropatía de IgA, nefropatía membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schonlein-Henoch y granulomatosis de egener, artritis reumatoide, osteoartritis , rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido para el tratamiento o profilaxis de aterosclerosis .
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido para el tratamiento o profilaxis de aterosclerosis por medio de la prevención y/o reducción de la formación de nuevas lesiones o placas ateroscleróticas y/o por medio de la prevención o ralentización de la progresión de lesiones y placas existentes.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido para el tratamiento o profilaxis de aterosclerosis por medio de la modificación de la composición de las placas para reducir el riesgo de la ruptura de placas y eventos aterotrombóticos .
En un aspecto, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento de, o la reducción del riesgo de, trastornos ateroscleróticos cardio y cerebrovasculares, enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatia diabética, glomerulonefritis , glomerulonefritis crescéntica humana, nefropatia de IgA, nefropatia membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schónlein-Henoch y granulomatosis de Wegener, artritis reumatoide, osteoartritis, rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer, en una persona que sufre de o está en riesgo de, dicha enfermedad o afección, donde el método comprende la administración de una cantidad efectiva para uso terapéutico a la persona de un polipéptido de acuerdo con la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido.
En un aspecto, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento de, o la reducción del riesgo de aterosclerosis en una persona que sufre de o está en riesgo de, dicha enfermedad o afección, donde el método comprende la administración a la persona de una cantidad efectiva para uso terapéutico del polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido.
En un aspecto, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento de, o la reducción del riesgo de aterosclerosis por medio de la prevención y/o reducción de la formación de nuevas lesiones o placas ateroscleróticas y/o por medio de la prevención o ralentización de la progresión de lesiones y placas existentes en una persona que sufre de o está en riesgo de, dicha enfermedad o afección, donde el método comprende la administración a la persona de una cantidad efectiva para uso terapéutico del polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido .
En un aspecto, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento de, o la reducción del riesgo de aterosclerosis por medio de la modificación de la composición de las placas de manera tal se reduzca el riesgo de la ruptura de placas y eventos aterotrombóticos en una persona que sufre de o está en riesgo de, dicha enfermedad o afección, donde el método comprende la administración a la persona de una cantidad efectiva para uso terapéutico de un polipéptido de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención está indicado para su uso en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o trastorno que está asociado a CX3CR1.
En un aspecto, un polipéptido de la presente invención está indicado para su uso en el tratamiento o profilaxis de enfermedades o afecciones en las que es deseable la modulación de la actividad del receptor CX3CR1. En un aspecto, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento de, o la reducción del riesgo de, enfermedades o afecciones en el que el antagonismo del receptor CX3CR1 es beneficioso y comprende la administración a una persona que sufre de o está en riesgo de, dicha enfermedad o afección, de un polipéptido de la presente invención .
Se espera que la profilaxis se relevante en particular para el tratamiento de personas que han sufrido un episodio previo de, o de lo contrario se consideran en riesgo aumentado de, la enfermedad o afección en cuestión.
Las personas en riesgo de desarrollar una enfermedad o afección particular por lo general incluyen aquellas que tienen una historia familiar de la enfermedad o afección, o aquellas que se han identificado por medio de ensayos genéticos o visuali zación como susceptibles en particular al desarrollo de la enfermedad o afección.
En el contexto de la presente invención, el término "prevención, tratamiento y/o alivio" no comprende únicamente la prevención y/o el tratamiento y/o alivio de la enfermedad, sino también por lo general comprende la prevención del inicio de la enfermedad, la ralentización o inversión del progreso de la enfermedad, la prevención o la ralentización del inicio de uno o más síntomas asociados a la enfermedad, la reducción y/o alivio de uno o más síntomas asociados a la enfermedad, la reducción de la severidad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado a la misma y/o la prevención de un aumento adicional en la severidad de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado a la misma, la prevención, reducción o inversión de cualquier daño fisiológico provocado por la enfermedad, y por lo general cualquier acción farmacológica que es beneficiosa para el paciente que se trate.
El sujeto a tratar será un mamífero, y más en particular un ser humano. Como será claro para aquellos con experiencia, el sujeto a tratar en particular será una persona que sufre de, o en riesgo de, las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas en la presente.
También será claro para aquellos con experiencia que los métodos anteriores de tratamiento de una enfermedad incluyen la preparación de un medicamento para el tratamiento de dicha enfermedad. Además, es claro que los polipéptidos de la invención se pueden utilizar como un componente activo en un medicamento o composición farmacéutica pretendida para el tratamiento de las enfermedades anteriores. Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de un polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, el tratamiento y/o alivio de cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas en la presente con anterioridad. La invención además se refiere a un polipéptido de la invención para uso terapéutico o profiláctico y, en forma específica, para la prevención, el tratamiento y/o alivio de cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas en la presente con anterioridad. La invención además se refiere a una composición farmacéutica para la prevención, el tratamiento y/o alivio de las enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas en la presente con anterioridad, donde tal composición comprende al menos un polipéptido de la invención .
Los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos se pueden administrar a un paciente que necesita de los mismos de cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica a utilizar. Por lo tanto, los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos por ejemplo se pueden administrar por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, oral, sublingual (por ej . , en la forma de un comprimido sublingual, pulverización o gota colocada debajo de la lengua y adsorbida a través de las membranas de mucus en la red capilar debajo de la lengua), ( intra- ) nasal (por ej . , en la forma de un pulverizador nasal y/o como un aerosol) , tópica, por medio de un supositorio, por inhalación, intravitrea (en especial para el tratamiento de DMAE seca o glaucoma) , o cualquier otra manera adecuada en un cantidad o dosis efectiva.
Los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que es adecuado para la prevención, el tratamiento de y/o alivio la enfermedad, trastorno o afección a prevenir, tratar o aliviar. El profesional a cargo por lo general será capaz de determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad, trastorno o afección a prevenir, tratar o aliviar, la severidad de la enfermedad, la severidad de los síntomas de la misma, el polipéptido específico de la invención a utilizar, la vía específica de administración y la formulación o composición farmacéutica a utilizar, la edad, el sexo, el peso, la dieta, la condición general del paciente, y factores similares muy conocidos para el profesional a cargo. Por lo general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de uno o más polipéptidos de la invención, o de una o más composiciones que comprenden los mismos, en cantidad o dosis efectivas para uso terapéutico y/o profiláctico.
Por lo general, para la prevención, el tratamiento y/o alivio de las enfermedades, trastornos y condiciones mencionadas en la presente y dependiendo de la enfermedad, trastorno o afección especifica a tratar, la potencia del polipéptido especifico de la invención a utilizar, la vía especifica de administración y la formulación o composición farmacéutica especifica utilizada, los polipéptidos de la invención por lo general se administrarán en una cantidad entre 0.005 y 20.0 mg por kilogramo de peso corporal y dosis, con preferencia entre 0.05 y 10.0 mg/kg/dosis, y con mayor preferencia entre 0.5 y 10 mg/kg/dosis, ya sea en forma continua (por ej . , por medio de infusión) o como dosis únicas (tales como por ej . , dosis diarias, semanales, o mensuales; compárese a continuación) , pero pueden variar en forma significativa, en especial, dependiendo de los parámetros mencionados con anterioridad.
Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los polipéptidos de la invención también se pueden administrar en dosificaciones* similares o ligeramente menores. La dosificación también puede ser ajustada por parte de profesional a cargo individual en el caso de cualquier complicación.
Dependiendo del polipéptido especifico de la invención y su farmacocinética especifica y otras propiedades, se puede administrar a diario, cada dos, tres, cuatro, cinco o seis días, semanalmente, mensualmente, y similares. Un régimen de administración podría incluir un tratamiento a largo término, semanalmente. Por "a largo término" se pretende significar al menos dos semanas y con preferencia meses, o años de duración.
La eficacia de los polipéptidos de la invención, y de composiciones que comprenden los mismos, se puede ensayar por el uso de cualquier adecuada in vitro ensayo, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o de modelo animal conocidos per se, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad específica implicada. Los ensayos adecuados y modelos animales serán claros para aquellos con experiencia, y por ejemplo incluyen los ensayos y modelos animales utilizados en los Ejemplos a continuación .
Para uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención pueden estar formulados como una preparación farmacéutica que comprende (i) al menos un polipéptido de la invención y (ii) al menos un portador aceptable para uso farmacéutico, diluyente, excipiente, adyuvante, y/o estabilizante, y (iii) en forma opcional uno o más polipéptidos y/o compuestos activos para uso farmacéutico adicionales. Por "aceptable para uso farmacéutico" se pretende significar que el material respectivo no muestra efecto biológico o de lo contrario no deseable alguno cuando se administra a un individuo y no interactúa en una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica (tales como por ej . , el componente activo para uso farmacéutico) en el que está contenido. Los ejemplos específicos se pueden hallar en manuales estándares, tales como por ej . , Remington's Pharmaceutical Sciences, 18va Ed., Mack Publishing Company, EE.UU. (1990). Por ejemplo, los polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar en cualquier manera conocida per se para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos convencionales y otras proteínas activas para uso farmacéutico. Por lo tanto, de acuerdo con una realización adicional, la invención se refiere a una composición o preparación farmacéutica que contiene al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador aceptable para uso farmacéutico, diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante, y en forma opcional una o más sustancias activas para uso farmacéutico adicionales.
Por medio de ejemplos no limitantes, tal formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intracavernosa o intraperitoneal o infusión intravenosa), para administración tópica, para administración sublingual, para administración por inhalación, por medio de un parche sobre la piel, por medio de un implante, por medio de un supositorio, para administración transdérmica, nasal, intravitrea, rectal o vaginal, y similares. Tales formas de administración adecuadas, que pueden ser sólidas, semisólidas o liquidas, dependiendo en la manera de administración, asi como también métodos y portadores para su uso en la preparación de los mismos, será claro para aquellos con experiencia.
Las preparaciones farmacéuticas para administración parenteral, tales como inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea o infusión intravenosa por ejemplo pueden ser soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, o polvos estériles que comprenden el componente activo y que son adecuados, en forma opcional después de un paso de disolución o dilución adicional, para infusión o inyección. Los Adecuada portadores o diluyentes para tales preparaciones por ejemplo incluyen, sin limitación, agua estéril y soluciones tampón acuosas aceptables para uso farmacéutico y tales como solución salina con tampón de fosfato fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank; aceites en agua; glicerol; etanol; glicoles tales como propilenglicol, asi como también aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo aceite de maní, aceites de soja, asi como también mezclas adecuadas de las mismas.
Las soluciones del compuesto activo o sus sales también pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos, tales como agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, thimerosal ( thiomersal ) , y similares. en muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro de sodio. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, por medio de la formación de liposomas, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o por el uso de tensioactivos . También se pueden agregar otros agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina .
En todos los casos, la forma de dosificación última debe ser estéril, fluida y estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. Las soluciones inyectables estériles se preparan por medio de la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros componentes enumerados con anterioridad, de acuerdo con lo requerido, seguidos de esterilización con filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacio y liofilización, que dan un polvo del componente activo además de cualquier componente adicional deseado presente en las soluciones estériles filtradas previamente.
Normalmente, se preferirán las soluciones o suspensiones acuosas. Por lo general, las formulaciones adecuadas para proteínas terapéuticas tales como los polipéptidos de la invención son soluciones de proteínas tamponadas, tales como las soluciones que incluyen las proteínas en una concentración adecuada (tal como de 0.001 a 400 mg/ml, con preferencia de 0.005 a 200 mg/ml, con mayor preferencia de 0.01 a 200 mg/ml, con mayor preferencia de 1.0 a 100 mg/ml, tales como 1.0 mg/ml (administración i.v.) o 100 mg/ml (administración s.c.) y un tampón acuoso tales como : - solución salina con tampón de fosfato, pH 7.4, otras soluciones con tampón de fosfato, pH 6.2 a 8.2, soluciones con tampón de histidina, pH 5.5 a 7.0, - soluciones con tampón succinato, pH 3.2 a 6.6, y soluciones con tampón de citrato, pH 2.1 a 6.2; y, en forma opcional, sales (por ej . , NaCl) y/o azúcares o polialcoholes (tales como trehalosa, manitol, o glicerol) para proporcionar isotonicidad de la solución.
Las soluciones con tampón de proteínas preferidas son soluciones que incluye aproximadamente 0.05 mg/ml del polipéptido de la invención disuelto en 25 mM de tampón de fosfato, pH 6.5, ajustado para su isotonicidad por medio de la adición de 220 mM de trehalosa. En adición, se pueden incluir otros agentes tales como un detergente, por ej . , 0.02 % de Tween-20 o Tween-80, en tales soluciones. Las formulaciones para aplicación subcutánea pueden incluir en forma significativa mayores concentraciones del polipéptido de la invención, tales como hasta 100 mg/ml o incluso por encima de 100 mg/ml. Sin embargo, será claro para aquellos con experiencia en la técnica que los componentes y las cantidades de los mismos de acuerdo con lo presentado con anterioridad únicamente representar una opción preferida. Las alternativas y variaciones de las mismas serán evidentes en forma inmediata para aquellos con experiencia, o se pueden concebir con facilidad a partir de la revelación anterior .
Los polipéptidos de la invención también se pueden administrar por el uso de adecuada formulaciones de depósito, de liberación lenta o de liberación sostenida, por ej . , adecuadas para inyección, po¾: el uso de dispositivos de liberación controlada para implantación debajo de la piel, y/o por el uso de una bomba de dosificación u otros dispositivos conocidos per se para la administración de sustancias o principios activos para uso farmacéutico. En adición, los polipéptidos de la invención se pueden formular en la forma de un gel, crema, pulverización, gota, parche o película que si se coloca sobre la piel, pasas a través de la piel.
También, en comparación con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos convencionales, una ventaja principal del uso de los polipéptidos de la invención es que también se pueden administrar con facilidad a través de otras vías distintas a la administración parenteral y se pueden formular con facilidad para tal administración. Por ejemplo, de acuerdo con lo descripto en a solicitud internacional WO2004/041867 , tales polipéptidos se pueden formular para administración oral, intranasal, intrapulmonar y transdérmica .
De acuerdo con otra realización de la invención se proporciona una combinación farmacéutica que comprende al menos un polipéptido de la invención de acuerdo con lo revelado en la presente y al menos otro agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en estatinas, antiagregantes plaquetarios, anticoagulantes, antidiabéticos y antihipertensivos .
Tal combinación farmacéutica puede comprender en forma opcional y adicional un diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante.
Cuando se han de utilizar dos o más sustancias o principios como parte de un régimen de tratamiento combinado, se pueden administrar a través de la misma via de administración o a través de diferentes vías de administración, esencialmente al mismo tiempo o en diferentes tiempos (por ej . , esencialmente en forma simultánea, consecutiva, o de acuerdo con un régimen de alternancia) . Cuando las sustancias o principios se han de administrar en forma simultánea a través de la misma via de administración, se pueden administrar como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas o parte de una formulación o composición farmacéutica combinada. También, cuando dos o más sustancias o principios activos se han de utilizar como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios se pueden administrar en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen de acuerdo con lo utilizado cuando el compuesto o principio se utiliza por si solo, y tal uso combinado puede o no dar lugar a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o más sustancias o principios activos da lugar a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de uno, más o todas las sustancias o principios a administrarse, mientras que aún se alcanza la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil por ejemplo para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario no deseado que está asociado al uso de una o más de las sustancias o principios cuando se utilizan en sus cantidades usuales, mientras que aún se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
Incluso, una realización adicional de la invención es un método para el tratamiento de las enfermedades y trastornos de acuerdo con lo establecido con anterioridad, que comprende la administración a un individuo, en forma simultánea, separada o secuencial, de una cantidad efectiva de al menos un polipéptido de la invención y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en una estatina, un antiagregante plaquetario, un anticoagulante, un antidiabético y un antihipertensivo .
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, el polipéptido de la invención se prepara para administrarse en combinación con otros fármacos utilizados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos establecido con anterioridad, tales otros fármacos se seleccionan del grupo que consiste en una estatina, un antiagregante plaquetario, un anticoagulante, un antidiabético y un antihipertensivo.
De acuerdo con aún otro aspecto de la invención, los fármacos utilizados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos establecido con anterioridad, tales fármacos se seleccionan del grupo que consiste en una estatina, un antiagregante plaquetario, un anticoagulante, un antidiabético y un antihipertensivo y se preparan para administrarse en combinación con el polipéptido de la invención .
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, el polipéptido de la invención se utiliza en combinación con un dispositivo útil para la administración del polipéptido, tal como una jeringa, un lápiz inyector, u otro dispositivo.
De acuerdo con aún otra realización de la invención, se proporciona un método para el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección mediada por una disfunción de CX3CR1 que comprende los pasos de: a) obtener una muestra de un sujeto, y b) poner en contacto, in vitro, la muestra con un polipéptido de la invención de acuerdo con lo definido con anterioridad, y c) detectar la unión de dicho polipéptido a dicha muestra, y d) comparar la unión detectada en el paso (c) con una estándar, donde una diferencia en la unión con relación a dicha muestra es el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección caracterizada por una disfunción de CX3CR1. üe acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un método para el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección mediada por una disfunción de CX3CRlque comprende los pasos de: a) obtener una muestra de un sujeto, y b) poner en contacto la muestra con un polipéptido de la invención de acuerdo con lo definido con anterioridad; c) determinar la cantidad de CX3CR1 en la muestra; y d) comparar la cantidad determinada en el paso (c) con una estándar, donde una diferencia en la cantidad con relación a dicha muestra es el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección caracterizada por una disfunción de CX3CR1.
Los métodos de diagnóstico anteriores también se pueden utilizar para el monitoreo de la efectividad de un tratamiento terapéutico de un sujeto.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un kit para el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección mediada por una disfunción de CX3CR1, para su uso en un método de acuerdo con lo definido con anterioridad, tal kit comprende al menos un polipéptido de la invención y, en forma opcional, uno o más medios, medios de detección y/o agentes de imagen in vitro o in vivo, y, en forma opcional y adicional, la instrucciones de uso. Los agentes de imagen in vivo adecuados incl-uyen 99mTc, llllndio, 123lodina, y, para imágenes de resonancia magnética, compuestos paramagnéticos .
La invención además proporciona un kit que comprende al menos un polipéptido de la invención y, en forma adicional, uno o más otros componentes seleccionados del grupo que consiste en otros fármacos utilizados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos de acuerdo con lo descripto con anterioridad, y dispositivos de acuerdo con lo descripto con anterioridad.
La invención además proporciona métodos para la elaboración de un polipéptido de la invención, tales métodos por lo general comprenden los pasos de: _ cultivar células huésped que comprenden un ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido de la invención (de aquí en adelante: "ácido nucleico de la invención") bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido de la invención; y, - recuperar o aislar el polipéptido expresado por las células huésped del cultivo; y en forma opcional y adicional purificar y/o modificar y/o formular el polipéptido de la invención.
Un ácido nucleico de la invención puede ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con un uso de codones que se ha adaptado en forma especifica para la expresión en la célula huésped o el organismo huésped pretendido) . De acuerdo con una realización de la invención, el ácido nucleico de la invención está esencialmente en forma aislada, de acuerdo con lo definido con anterioridad en la presente.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en la forma de, estar presente en y/o ser parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido o YAC, que nuevamente pueden estar esencialmente en forma aislada. El vector puede ser en especial un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresión del polipéptido in vitro y/o in vivo (por ej . , en una célula huésped adecuada, organismo huésped y/o sistema de expresión) . Tal vector de expresión por lo general comprende al menos un ácido nucleico de la invención que está ligado en forma operable a uno o más elementos regulatorios adecuados, tales como promotores, potenciadores , terminadores, y similares. Los ejemplos específicos de tales elementos regulatorios y otros elementos, tales como factores de integración, marcadores de selección, secuencias de señal o líderes, genes indicadores, y similares, útiles o necesarios para los polipéptidos de expresión de la invención, se revelan por ej . , en las pp. 131 a 133 de WO2006/040153.
Los ácidos nucleicos de la invención se puede preparar u obtener en una manera conocida per se (por ej . , por medio de síntesis de ADN automatizada y/o tecnología de ADN recombinante ) , con base en la información en las secuencias de aminoácido para los polipéptidos de la invención que se presenta en la presente, y/o se puede aislar de una fuente natural adecuada.
De acuerdo con otra realización, la invención se refiere a un huésped o célula huésped que expresa o es capaz de expresar un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. De acuerdo con una realización preferida en particular, dichas células huésped son células bacterianas, células de levadora, células fúngicas o células de mamíferos .
Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas gram negativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus, y Pseudomonas, y cepas bacterianas gram positivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Stafilococcus, y Lactococcus . Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma , Neurospora , y Aspergillus . Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) , Schizosaccharomyces (por ejemplo Schizosaccharomyces pombe) , Pichia (por ejemplo Pichia pastoris y Pichia methanolica) , y Hansenula .
Las células de mamíferos adecuadas incluyen por ejemplo células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, células NSO, células HEK, y similares. Sin embargo, también se pueden utilizar células anfibias, células de insectos, células de plantas, y cualquier otra célula utilizada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas.
Para la producción a escala industrial, los huéspedes heterólogos preferidos para la producción (industrial) de polipéptidos de dominio variable simple de inmunoglobulina y los terapéuticos de proteína que los contienen incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris, y S. cerevisiae que son adecuados para la expresión, producción y fermentación a gran escala, y en particular para la expresión, producción y fermentación (bio-) farmacéutica a gran escala.
La elección del sistema de expresión específico dependerá en parte del requerimiento de ciertas modificaciones post-traduccionales , en forma más específica glicosilación . La producción de un polipéptido de la invención para el cual se desea o requiere una glicosilación necesitaría el uso de huéspedes de expresión de mamíferos que tienen la capacidad de glicosilar la proteína expresada. En este aspecto, será claro para aquellos con experiencia que el patrón de glicosilación obtenido (es decir, el tipo, número y posición de residuos adjuntos) dependerá de la célula o línea celular que se utiliza para la expresión.
Los polipéptidos de la invención producidos en una célula de acuerdo con lo establecido con anterioridad se puede producir ya sea en forma intracelular (por ej . , en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y luego aislarse de las células huésped y purificarse en forma opcional y adicional; o se puede producir en forma extracelular (secretado en el medio en el que se cultivan las células huésped) y luego aislarse de las medio de cultivo y purificarse en forma opcional y adicional.
Los métodos y reactivos adicionales que se utilizan para la producción recombinante de polipéptidos , tales como vectores de expresión adecuados, métodos de transformación o transfección, marcadores de selección, métodos de inducción de expresión de proteina, condiciones de cultivo, y similares, son conocidas en la técnica. En forma similar, las técnicas de aislación y purificación de proteínas útiles en un método de elaboración de un polipéptido de la invención son muy conocidas para aquellos con experiencia.
La producción de los polipéptidos de la invención a través de la fermentación en organismos huéspedes recombinantes convenientes tales como E. coli y levadura es rentable, en comparación con los anticuerpos convencionales que también requieren instalaciones de cultivo de células de mamíferos costosas. Además, los niveles de expresión alcanzables son altos y los rendimientos de los polipéptidos de la invención están en el intervalo de 1 a 10 g/1 (E. coli) y hasta 10 g/1 (levadura) y más.
EJEMPLOS Generación de lineas celulares CEO, Baf/3, Caki y HEK293 que sobreexpresan CX3CR1 humana o CX3CR1 de cynomolgus Se generaron células CHO y Baf/3 que sobreexpresan CX3CR1 humana o de cynomolgus por el uso de técnicas conocidas en la técnica. También se generaron células que expresan CCR2 o CCR5 humana por el uso de técnicas conocidas en la técnica.
El ADNc se clonó en pCDNA3, 1 ( +) -neo para CX3CR1 humana mientras que se utilizó pADNc-DEST40-neo para CX3CR1 de ratón.
Las secuencias de aminoácido de CX3CR1 humana y CX3CR1 de cynomolgus están representadas en las SEQ ID NO: 255 y 256, respectivamente.
Para establecer células de Riñon de Camello (Caki) que sobreexpresan CX3CR1 humana o CX3CR1 de ratón, células parentales de Caki se electroporaron con pCDNA3 , 1 ( + ) -neo-hCX3CRl o pADNc-DEST40-neo-mCX3CRl, respectivamente. Para todas las condiciones, los transfectantes se seleccionaron por medio de la adición de 1 mg/ml de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.).
Se generaron células de Riñon Embrionario Humano (HEK293) que sobreexpresan CX3CR1 humana o CX3CR1 de cynomolgus por medio de transfeccxon mediada por lipidos con Fugene (Roche) de pCDNA3, 1 (+) -neo-hCX3CRl o plásmidos de cyCX3CRl, respectivamente, en la linea celular parental de HEK293. Estas células se utilizaron como transíectantes transitorios y como tales no se colocaron bajo la selección. En resumen, se sembraron 2*10E6 células por T75 y se incubaron hasta el día siguiente antes de la transfección. Después de la eliminación del medio de cultivo, las células se transfectaron con los plásmidos respectivos (9 µ?) y Fugene (27 µ?) de acuerdo con las instrucciones del elaborador. 48 horas después de la transfección, las células se cosecharon y se congelaron para uso adicional.
Ejemplo 1 : Inmunización con CX3CR1 induce una respuesta inmune humoral en llama 1.1. Inmunizaciones Después de la aprobación del Ethical Committee (University Antwerp, Bélgica, UA2008A1, 2008/096, 2007/068), se inmunizaron 9 llamas (designadas N.°. 368, 369, 370, 381, 382, 384, 312, 313 y 314) .
Seis llamas (312, 313, 314, 381, 382 y 384) se inmunizaron con 4 inyecciones intramusculares (2mg/dosis en intervalos semanales o bisemanales) de vector plásmido de pVAXl-huCX3CRl ( Invitrogen-, Carlsbad, CA, EE.UU. ). Tres llamas (381, 382 y 384) posteriormente recibieron 4 inyecciones subcutáneas de CX3CR1 humana que sobreexpresan células de Caki que se establecieron de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Las células se resuspendieron en D-PBS y se mantuvieron en hielo antes de la inyección.
Tres llamas adicionales (designadas N.°. 368, 369 y 370) se inmunizaron de acuerdo con los protocolos estándares con 4 inyecciones subcutáneas de CX3CR1 humana que sobreexpresan células de Caki que se establecieron de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Las células se resuspendieron en D-PBS y se mantuvieron en hielo antes de inyección. Posteriormente, se administraron a estas llamas dos inyecciones con un fragmento de CX3CR1 NT/EC3 recombinante acoplado a BSA (Tabla 13) . Los péptidos se ordenaron en NeoMPS ( Polypeptidegroup, Strasbourg, Francia) y se acoplaron a BSA de acuerdo con los protocolos estándares .
Tabla 13 Secuencia de fragmentos de péptidos utilizados para estimulo con inmunización La primera inyección se formuló en Adyuvante de Freund Completo (Difco, Detroit, MI, EE.UU.), mientras que las inyección posterior se formuló en Adyuvante de Freund Incompleto (Difco, Detroit, MI, EE.UU.). 1.2. Evaluación de respuestas inmunes inducidas en llamas Para evaluar la inducción de respuestas inmunes en los animales contra CX3CR1 humana por medio de ELISA o FACS, se recolectaron sueros de las llamas 312, 313 y 314 en el día 0 (pre-inmune) , y diferentes puntos de tiempo en el cronograma de inmunización (momento de recolección de linfocito de sangre periférica [PBL]).
En resumen, se inmovilizó Neutravidina (2µg/ml) hasta el día siguiente a 4°C en una placa axisorb de 96 pocilios (Nunc, iesbaden, Alemania) . Los pocilios se bloquearon con una solución caseína (1%) en PBS . Posteriormente se capturaron fragmentos de NT recombinante biotinilados (Polypeptide, Strasbourg, Francia) o fragmentos de CX3CR1 EC3 biotinilados (Polypeptide, Strasbourg, Francia) a 2 g/ml. Después de la adición de diluciones de suero, se detectaron inmunoglobulinas unidas en forma específica por el uso de una inmunoglobulina de cabra antillama conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Betil Laboratories Inc., Montgomery, TX, EE.UU.) y una posterior reacción enzimática en la presencia del sustrato TMB One (3, 3' , 5, 5' -tetramentilbencidina ) (Promega, Mannheim, Alemania), lo que muestra que se indujo una respuesta inmune dependiente de anticuerpo significativa contra CX3CR1 después de las inmunizaciones de péptidos.
En forma adicional, los títulos de suero de animales inmunizados con células se confirmaron por medio de un análisis FACS en CX3CR1 humana de en crecimiento activo que sobreexpresan células de CHO. Las respuestas de título de suero de CX3CR1 para las llamas 368, 369 y 370 se determinaron con suero muestreado después de 4 inmunizaciones con células (día 49), 4 inmunizaciones con células y 1 estímulo con péptidos (día 77) y 4 inmunizaciones con células y 2 estímulos con péptidos (día 81) . Las células se cosecharon y se lavaron antes de la incubación con las diluciones de suero. La detección se llevó a cabo con IgG de cabra anti-llama (Betil, Montgomery, TX, EE.UU.) seguido por burro anti-cabra acoplado a PE (Jackson Laboratories, Suffolk, UK) y se leyeron por medio de un análisis en FACSArray (BD Biosciences) . En la Tabla 14 y Tabla 15 se muestra una síntesis de las respuestas de suero obtenidas de acuerdo con lo determinado ya sea por ELISA o FACS.
Tabla 14 Análisis de título de suero para los animales inmunizados con células /péptidos Tabla 15 Análisis de titulo de suero para los animales inmunizados con ADN/células (312, 313 y 314) no se determinó titulo de suero.
Ejemplo 2: Clonación de los repertorios de fragmentos de anticuerpo únicamente de cadena pesada y preparación de fago Luego de la inyección final de inmunógeno de cada subconjunto, se recolectaron tejidos inmunes como la fuente de células B que producen los anticuerpos de cadena pesada a partir de las llamas inmunizadas. Para las llamas 312, 313 y 314, se recolectaron dos muestras de sangre de 150 mi, recolectadas 4 y 8 días después de la última inyección de antígeno por animal. Para las llamas 368, 369 y 370 se recolectaron cuatro muestras de sangre de 150 mi, 5 y 7 días después de la última inmunización con células y en forma adicional 4 y 8 días después de la última inmunización con péptidos. Después de aquellas, se tomaron dos biopsias del nodo linfático, 12 días después de la última inmunización con células y 12 días después de la última inmunización con péptidos. Para las llamas 381, 382 y 384 se recolectaron cinco muestras de sangre de 150 mi, 8 días después de la última inmunización con ADN y en forma adicional 4 días después del primer estímulo con células, 8 y 11 días después del segundo estímulo con células y 8 días después de la última inmunización con células. Después de aquellas, se tomó una biopsia del nodo linfático, 8 días después de la segunda inmunización con células.
A partir de las muestras de sangre, linfocitos de sangre periférica (PBL) se prepararon por el uso de Ficoll-Hypaque de acuerdo con las instrucciones del elaborador (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.). A partir de los PBLsy la biopsia del nodo linfático -(LN) , se extrajo el ARN total, que se utilizó como material de inicio para RT-PCR para amplificar el VHH que codifican los segmentos de ADN.
Para cada llama inmunizada, se construyeron librerías por medio de la reunión del ARN total aislado de las muestras que se originan de un cierto subconjunto del cronograma de inmunización es decir, después de un tipo de antígeno de inmunización, y para algunas llamas se reunieron las muestras de los diferentes animales en una librería (Tabla 16) .
Tabla 16 Reunión de las diferentes muestra para la construcción de la librería En resumen, el repertorio de VHH amplificado por PCR se clonó a través de sitios de restricción específicos en un vector designado para facilitar la visuali zación de fagos de la librería de VHH. El vector se derivó de pUC119 y contiene el promotor LacZ, una secuencia de codificación de proteina de gilí de fago M13, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder de glII-pelB híbrido (pAX050) . En conjunto con la secuencia de codificación de VHH, el vector codifica una etiqueta c-myc de terminal C-y una etiqueta de His6. Se prepararon fagos de acuerdo con los protocolos estándares y se almacenaron después de la esterilización por filtro a 4°C o a -80°C en 20 % de glicerol para uso adicional.
Ejemplo 3: Selección de VHH especificas de CX3CR1 a través de visualización de fago Los repertorios de VHH obtenidos de todas las llamas y clonados como librerías de fagos se utilizaron en diferentes estrategias de selección, por medio de la aplicación de una multiplicidad de condiciones de selección. Las variables incluyen i) la forma de presentación de la proteína CX3CR1 (en diferentes trasfondos celulares o en liposomas/VLP) , ii) el método de presentación del antígeno (en solución cuando se utilizan células o recubiertas en placas cuando se utilizan VLP) , iii) la concentración del antígeno iv) el ortólogo utilizado (humano o de cynomolgus) v) el número de rondas de selección y vi) los diferentes métodos de elución (no específicos a través de tripsina o específicos a través del ligando Fractalquina) . Todas las selecciones sólidas recubiertas de fase se llevaron a cabo en placas de 96 pocilios Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania) .
Las selecciones se llevaron a cabo de acuerdo con lo presentado a continuación: las preparaciones de antigeno de CX3CR1 para formatos de selección en fase sólida y en solución se presentaron de acuerdo con lo descripto con anterioridad en concentraciones múltiples. Después de 2 horas de incubación con las librerías de fagos seguidas por un lavado extensivo, los fagos unidos se eluyeron con tripsina (1 mg/ml) durante 15 minutos. Cuando se utilizó tripsina para la elución de fago, la actividad de proteasa se neutralizó en forma inmediata por medio de la aplicación de 0.8 mM de inhibidor de proteasa ABSF. Como un control, se llevaron a cabo selecciones sin antígeno en paralelo.
Las salidas de fago se utilizaron para infectar E. coli que a su vez se utilizaron para preparar fagos para la siguiente ronda de selección (rescate de fagos) Después de la segunda ronda de selección las salidas de fago se utilizaron para infectar E. coli que luego se colocaron en placas de agar (LB+carb+glucosa2%) para el análisis de los clones de VHH individuales . Con el fin de una salida selección para aglutinantes específicos, se eligieron colonias únicas de las placas de agar y se cultivaron en 1 mi placas de 96 pocilios profundos. Se indujo una expresión de VHH controlada por LacZ por medio de la adición de IPTG ( lmM final) en la ausencia de glucosa. Se prepararon extractos periplásmicos (en un volumen de ~ 80 ul) de acuerdo con los protocolos estándares.
Ejemplo 4 : Visualización de extractos periplásmicos en ensayo de FACS de competición de CX3CR1-Fractalquina Se visualizaron extractos periplásmicos en un ensayo de FACS de competición de CX3CR1 humana/fractalquina humana para evaluar la capacidad de bloqueo de los VHH expresados. Se presentó CX3CR1 humana en células de CHO que sobreexpresan CX3CR1. Se utilizó tanto un ajuste por el uso de células cosechadas a partir de un cultivo en crecimiento activo como un ajuste por el uso de células congeladas. Se utilizó como un reactivo de detección una fractalquina labelada (R&D Systems, inneapolis, MN, EE.UU.) labelada con alexa647 (A647-Fractalquina) en un grado de labelado de 1. Para ajustar el ensayo, primero se llevó a cabo una serie de titulación de la fractalquina labelada en las células de CHO-huCX3CRl con el fin de determinar el valor de EC50 para la unión. En forma inicial se llevó a cabo una visualización a una concentración más alta de fractalquina (3 nM) para aumentar la robustez del ensayo. Para aumentar la sensibilidad de la visualización al máximo, se eligió la concentración EC30 (1 nM) para su posterior visualización. En resumen, se agregó 50 µ? de extracto periplásmico a 6 nM de fractalquina labelada (50µ1) y 200.000 células CHO-huCX3CRl . Después de una hora de incubación a 4°C, las células se lavaron tres veces antes de que se llevara a cabo una lectura en un Arreglo de FACS (Becton Dickinson) . Primero se colocó una rejilla sobre las células intactas de acuerdo con lo determinado a partir de un perfil de dispersión. A continuación, se separaron las células muertas por su perfil de fluorescencia a partir de la mancha de PI (Sigma, St Louis, EE.UU.). Se determinó el perfil de fluorescencia de la etiqueta alexa647 para cada muestra y se utilizó para el cálculo de la capacidad de bloqueo. Como controles, se tomaron las condiciones a lo largo donde no había VHH presente en el extracto peri o una VHH irrelevante conocida y se incluyeron muestras donde se incluyó la fractalquina fría en exceso. Se determinó el bloque de porcentaje para cada muestra por el uso de las muestras de control para determinar la ventana de ensayo.
A partir de esta visualización, se seleccionaron las VHH y el análisis de secuencia reveló 120 VHH únicas que pertenecían a 3 linajes celulares B diferentes. El número total de variantes hallado para cada linaje celular B está representado en la Tabla 17.
Tabla 17 Parámetros de selección utilizados para la identificación de los linajes celulares B de VHH específica y CX3CR1 humana En la Tabla 18 se presenta un resumen del procedimiento de selección y rendimiento durante visualización inicial para todos los VHH.
Tabla 18 Condiciones de selección y resultado visualización primaria para la VHH especifica de huCX3CRl Las secuencias de aminoácido de todas las VHH únicas obtenidas se muestran en el listado de secuencias y con anterioridad (se indicaron las CDR y regiones estructurales) .
Ejemplo 5 : Caracterización de VHH purificadas Las VHH anti-CX3CRl inhibitorias seleccionadas de la visualización descripta en el Ejemplo 4 se purificaron y caracterizaron en forma adicional. Las VHH seleccionadas se expresaron en E. coli TG1 como c-myc, proteínas etiquetadas con His6. La expresión se indujo por medio de la adición de 1 mM de IPTG y se dejó continuar durante 4 horas a 37 °C. Después de girar los cultivos celulares, se prepararon extractos periplásmicos por medio del congelamiento y descongelamiento de los pélets. Estos extractos se utilizaron como material de inicio y los VHH se purificaron a través de IMAC y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) lo que dio lugar a un 95% de pureza de acuerdo con lo evaluado a través de SDS-PAGE.
Inhibición por medio de VHH anti-CX3CRl de fractalquina humana que se une a CX3CR1 humana expresada en las células BA/F3 Se evaluó la capacidad de bloqueo hacia la fractalquina de ligando de las VHH en una FACS de competición de CX3CR1 humana de acuerdo con lo esbozado en el Ejemplo 4. Se utilizaron ya sea células CH0-huCX3CRl, células BA/F3-huCX3CRl o células HEK293T transfectadas en forma transitoria. La cantidad de ligando labelado que se utilizó en los diferentes ajustes de competición también era variado. Los valores de IC5o para las VHH que bloqueaban la interacción de fractalquina humana a CX3CR1 humana están representados en la Tabla 19.
Tabla 19 Potencia y eficacia de la VHH en un FACS de competición de ligando Inhibición por medio de VHH anti-CX3CRl de quimiotaxis inducida por fractalquina humana de células de BA/F3 que sobreexpresan CX3CR1 humana Para evaluar la inhibición de Quimiotaxis inducida or fractalquina, se ajustó un ensayo de quimiotaxis por el uso de la cámara desechable ChemoTx con tamaño de poro de 5 µp? (Neuroprobe, Gaithersburg, EE.UU.)- Las células se cosecharon a partir de un cultivo de crecimiento activo y se lavaron antes del uso en el medio de ensayo, RPMI (Gibco, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con 0.1% de BSA. La cámara inferior se rellenó con 320 pM de fractalquina humana en un volumen total de 300 µ?. Tras la aplicación de la membrana, se depositaron 0.13E6 células en la parte superior de la membrana en un volumen total de 70 µ?. Se permitió una quimiotaxis durante 3 horas a 37 °C en una cámara humidificada con C02. Después de este periodo de incubación, se retiró la membrana y se resuspendieron las células en la cámara inferior. La cantidad de ATP presente en los pocilios se determinó por el uso del kit CellTiter-Glo (Promega, Madison WI, EE.UU.). La lectura se llevó a cabo en un Envision (Perkin Elmer, Massachusetts , EE.UU.) con los ajustes estándares para la lectura de luminiscencia. Se llevaron a cabo series de titulación por triplicado y cada placa contenia muestras de control también por triplicado. Como un control, se incluyó una muestra sin VHH asi como también una muestra donde no se agregó fractalquina humana a la cámara inferior. En la Tabla 20 se muestra una síntesis de los resultados.
Tabla 20 Potencia y eficacia de la VHH en el bloqueo de la quimiotaxis inducida por fractalquina Evaluación de la reactividad cruzada de las VHH anti-CX3CRl contra CX3CR1 de cynomolgus En forma inicial, se utilizó un ajuste de unión con base en FACS para evaluar la reactividad cruzada de cynomolgus. Para esto, las VHH se incubaron con las células respectivas durante 30 minutos a 4°C seguido por tres pasos de lavado y posteriormente se incubaron con los reactivos de detección. Como detección, se utilizó un anticuerpo anti- cmyc de ratón (Serotec, MCA2200) seguido por un anticuerpo de cabra anti-ratón acoplado a PE (Jackson 115-116-071), cada incubación durante 30 minutos a 4°C, seguido por tres pasos de lavado. Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 21.
Tabla 21 Valor de EC50 para la unión de las VHH respectivas en CX3CR1 humana o en CX3CR1 de cynomolgus Para las VHH identificadas más tarde, se ajustó un FACS de competición de fractalquina humana por el uso de CX3CR1 humana o de cynomolgus expresada en células de HEK293T. Tanto el receptor humano como el de cynomolgus se transfectó en forma transitoria en células de HEK293T y las transfecciones se igualaron por medio de la unión del ligando labelado, la fractalquina humana. La competición se evaluó por el uso de la concentración de EC30 de fractalquina y como tales valores de IC50 obtenidos son una buena estimación del valor de Ki, una medida para la afinidad (Tabla 22) . El experimento se llevó a cabo de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 4. La proporción de los valores de IC50 en CX3CR1 de mono cynomolgus y humanos se utilizó para evaluar las diferencias potenciales en la afinidad a CX3CR1 en ambas especies.
Tabla 22 Eficacia y potencia de las VHH en FACS de competición de ligandos hacia CX3CR1 humana y de cynomolgus Unión de la VHH CX3CR1 anti-humana a CCR2 humana, CCR5 humana o CX3CR1 de ratón Se evaluó la especificidad a los receptores huCX3CRl por medio de la puesta en práctica de un experimento de unión a FACS en células parentales de CH0-K1 o células de CHO que expresan huCCR2, huCCR5 o msCX3CRl . Las VHH se incubaron con las lineas celulares respectivas durante 30 minutos a 4°C seguido por tres pasos de lavado y posteriormente se incubaron con los reactivos de detección. Como detección, se utilizó un anticuerpo anti-cmyc de ratón (Serotec, MCA2200) seguido por un anticuerpo de cabra antiratón acoplado a PE (Jackson 115-116-071), cada incubación durante 30 minutos a 4°C, seguido por tres pasos de lavado. Para cada linea celular se incluyó un control de calidad con anticuerpo de receptores específicos. En adición, la concentración más alta de cada VHH también se incubó con células de CHO que expresan huCX3CRl como un control positivo. No se pudo observar unión a msCX3CRl, huCCR2 o huCCR5 alguna.
Determinación de la unión a epítopos Se ajustó un experimento de unión competitivo con el fin de determinar si las VHH se unían a epítopos superpuestos en CX3CR1. Para esto, se utilizó la VHH 66B02 labelada con alexa647 en un FACS de competición en las células de BA/F3 que expresan huCX3CRl . Se utilizaron las VHH representativas de las tres familias funcionales como competidoras para la unión de la 66B02 labelada. Los valores de IC50 obtenidos se muestran en la Tabla 23.
Tabla 23 FACS de competición con base en la unión a epítopos Como se pudo obtener una inhibición completa de la unión a 66B02 por parte de todas las VHH representativas de las diferentes familias de bloqueo de ligandos, se puede concluir que todas las familias funcionales se unen en una proximidad lo suficientemente cercana entre si de manera tal que compiten con la unión de 66B02.
E emplo 6 : Forma eado de las VHH para bivalencia Construcción de bivalentes Con el fin de aumentar la potencia y/o eficacia a partir de una selección de las VHH obtenida, se construyeron moléculas bivalentes por medio de manipulación genética. Se ligaron dos VHH en forma genética entre si a un vinculador 35GS entre los dos bloques de construcción y posteriormente se expresaron en E. Coli de acuerdo con lo descripto con anterioridad para las VHH monovalentes. Los diferentes constructos bivalentes se llevaron a cabo de acuerdo con lo enumerado en la Tabla 24.
Tabla 24 Formatos bivalentes representativos Inhibición por medio de VHH anti-CX3CRl de fractalquina humana que se une a CX3CR1 humana expresada en las células de BA/F3 Se investigó la inhibición de la unión de ligando a CX3CR1 humana para los diferentes formatos de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 4. Para esta caracterización se utilizó la linea celular BA/F3-huCX3CRl que muestra la expresión estable del receptor de CX3CR1 humana. Se utilizó la fractalquina de ligando labelada con alexa647 en su concentración EC30 y de ese modo los valores de IC50 obtenidos reflejan los valores de Ki . En la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. 25 se muestra un resumen de los datos obtenidos.
Tabla 25 Potencia de formatos bivalentes en competición de ligandos Inhibición por medio de VHH anti-CX3CRl de quimiotaxis inducida por fractalquina humana de células de BA/F3 que sobreexpresan CX3CR1 humana En forma similar a lo se describió para las VHH anti-CX3CRl monovalentes, se evaluó la inhibición de quimiotaxis inducida por fractalquina en las células de BA/F3- huCX3CRl para los constructos bivalentes. Se utilizó un ajuste de ensayo idéntico de acuerdo con lo descripto con anterioridad y los resultados obtenidos se sintetizan en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. 26.
Tabla 26 Inhibición de quimiotaxis inducida por fractalquina por medio de constructos bivalentes VHH Evaluación de la reactividad cruzada de las VHH anti-CX3CRl contra CX3CR1 de cynomolgus También se evaluó para los constructos bivalentes la reactividad cruzada hacia CX3CR1 de cynomolgus y se comparó con la reactividad humana. De acuerdo con lo descripto con anterioridad, se aplicaron ya sea un ajuste de unión ( i Error! No se encuentra el origen de la referencia. 27) o un ajuste de competición de ligando (Tabla 28) por el uso de células HEK293T transfectadas en forma transitoria. Los lotes de células transfectadas en forma transitoria se igualaron por su nivel de expresión al receptor.
Tabla 27 Unión de constructos bivalentes para CX3CR1 humana o de cynomolgus Tabla 28 Competición de ligandos de constructos bivalentes en CX3CR1 humana o de cynomolgus Ejemplo 7: Exploración de longitud del vinculador y extensión de la vida media Evaluación de la longitud del vinculador y posicionamiento de la VHH de albll Dado que la longitud del vinculador utilizado en un formato bivalente puede impactar en forma drástica en la potencia obtenida, se evaluaron diferentes longitudes del vinculador .
En adición, Albll, se incluyó un Nanocuerpo que se une a la albúmina de suero humana para aumentar la vida media in vivo de las moléculas formateadas (WO 06/122787). Se llevaron a cabo diferentes formatos que incluyen variaciones en las longitudes del vinculador utilizado, pero también el posicionamiento de los diferentes VHH componentes. En la Tabla 29 se muestra una síntesis de los formatos explorados.
Tabla 29 Exploración de la extensión de la vida media y la longitud del vinculador clonaron las secuencias de codificación para las VHH formateadas en un plásmido construido en forma interna lo que permite la expresión en Pichia pastoris y secreción en el medio de cultivación. El vector de expresión se derivó de pPICZa (Invitrogen) y contenia el promotor A0X1 para la expresión regulada firmemente, inducida por metanol, un gen de resistencia para Zeocin™, un sitio de multiclonación y la señal de secreción del factor a. Tras la transformación, se cultivaron los cultivos de expresión y se indujo la expresión de VHH por medio de la adición de metanol y se dejó continuar durante 48 horas a 30°C.
La potencia de estos formatos diferentes se evaluó por el uso del ensayo de competición de ligandos de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Al ver que la concentración de ligandos utilizada está por debajo del valor de EC50, los valores de IC50 obtenidos son equivalentes a los valores de Ki . El Ki obtenido para los diferentes formatos se sintetiza en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. 30.
Tabla 30 Potencia de formatos extendidos de vida media en competición de ligandos Impacto de la albúmina de suero humana en la potencia La unión de albúmina de suero humana (HSA) a la VHH de albll podría impactar en la potencia del formato y por lo tanto la competición de ligando se repitió en presencia de HSA. En forma breve, para permitir la unión de HSA a la VHH de albll, los constructos bajo evaluación y fractalquina se preincubaron con HSA durante 30 minutos antes de la adición a las células. También las células se resuspendieron en un tampón de FACS suplementado con HSA. La concentración final de HSA utilizada fue un exceso de 50 veces por encima de la concentración más alta de VHH utilizada. Posteriormente, se permitió una competición durante 2 horas y el procesamiento adicional fue de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 4.
La interferencia potencial de HSA también se evaluó en un ajuste de quimiotaxis adaptado, que incluye HSA en los diferentes compartimientos del ensayo. La concentración de HSA utilizada fue nuevamente un exceso de 50 veces por encima de la concentración más alta de constructo utilizada y los constructos se cargaron con HSA durante 30 minutos antes del comienzo del ensayo. El tampón de ensayo también se suplemento con HSA de manera tal que HSA estuviera presente durante toda la duración del experimento. De acuerdo con lo descripto con anterioridad, se utilizó la cámara desechable ChemoTx con 5 µp? tamaño de poro (Neuroprobe, Gaithersburg, MD, EE.UU.)- Las células se cosecharon a partir de un cultivo de crecimiento activo y se lavaron antes del uso en medio de ensayo, RP I (Gibco, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con 0.1% BSA y 62.5 µ? HSA (Sigma, A8763) . La cámara inferior se rellenó con 320 pM de fractalquina humana en un volumen total de 300 µ? . Tras la aplicación de la membrana, se depositaron 0.13E6 células en la parte superior de la membrana en un volumen total de 70 µ?. Se permitió una quimiotaxis durante 3 horas a 37 °C en una cámara humidificada con C02. Después de este periodo de incubación, se retiró la membrana y se resuspendieron las células en la cámara inferior. La cantidad de ATP presente en los pocilios se determinó por el uso del kit CellTiter-Glo (Promega, Madison WI, EE.UU.). La lectura se llevó a cabo en un Envision (Perkin Elmer, Massachusetts , EE.UU.) con los ajustes estándares para la lectura de luminiscencia. Se llevaron a cabo series de titulación por triplicado y cada placa contenia muestras de control también por triplicado. Como un control, se incluyó una muestra sin VHH asi como también una muestra donde no se agregó fractalquina humana a la cámara inferior. Los valores de IC50 obtenidos se enumeran en la Tabla 31.
Tabla 31 Quimiotaxis inducida por fractalquina en la presencia de HSA Inhibición de la internalización de fractalquinas por medio de los polipéptidos formateados bivalentes con vida media extendida Se llevaron a cabo ensayos funcionales adicionales para demostrar la actividad antagonista de los polipéptidos bivalentes con vida media extendida. Los polipéptidos se evaluaron por su capacidad de inhibir la internalización de A647-Fractalquina en células de CHO huCX3CRl . En forma breve, 1E4 células/pocilio se colocaron en placas en placas de 96 pocilios de fondo negro claro (BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se cultivaron hasta el dia siguiente. Las células se lavaron una vez y luego se equilibraron en un tampón de ensayo (HBSS con calcio y magnesio (Gibco) suplementados con 10 mM de HEPES y 0.1% de BSA) . Se agregaron los constructos de polipéptidos formateados y las placas se incubaron durante 15 minutos a 37°C. Luego se agregó A647-Fractalquina a una concentración final de 8 nM y las células se incubaron durante 60 minutos a 37°C. Los medios se eliminaron y las células se fijaron durante 10 minutos con 3.7% de solución de formaldehido ( Polysciences, arrington, PA, EE.UU.) . Las células se enjuagaron con PBS y los núcleo se labelaron con tinte Hoechst (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) . Para cuantificar la fractalquina labelada internalizada, las células se fotografiaron por el uso del sistema de bioimágenes BD Pathway. La segmentación de imágenes se llevó a cabo por medio de la identificación del núcleo celular labelado y por medio del trazado de un anillo de 3 pixeles alrededor de esa máscara. Se midió la intensidad medio de A647 en el anillo citoplásmico . Los polipéptidos formateados inhibieron en forma potencial la internalización de fractalquinas de acuerdo con lo sintetizado en la Tabla 32: Tabla 32 Inhibición de A647-Internalización de fractalquinas Un polipéptido formateado bivalente anti-CX3CRl con vida media extendida carece de actividad agonista Con el fin de confirmar que un polipéptido bivalente anti-CX3CRl con vida media extendida no tenia actividad agonista, se evaluó CX3CR1BII036 para la inducción de influjo de calcio en las células de CHO huCX3CRl . Los aumentos mediados por fractalquina en los niveles de calcio citosólico en estas células en una manera dependiente de CX3CR1 y CX3CR1BII036 inhibieron esta respuesta.
Las células de CHO huCX3CRl se colocaron en placas a 5E4 células/pocilio en placas de 96 pocilios de fondo negro claro (BD) y se cultivaron hasta el día siguiente. Las células se incubaron con Calcio-4 tinte/2 mM de probenecid (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) en HBSS suplementado con 20 mM de HEPES durante 60 minutos a 37°C. Para demostrar el antagonismo de polipéptidos , se preincubó CX3CR1BII036 con las células durante 15 minutos antes de la adición de Fractalquina en su valor EC80. Se monitoreó la movilización de calcio en un sistema FLIPR Tetra (Molecular Devices) de acuerdo con las instrucciones del elaborador. Para la determinación del agonismo, no hubo preincubación* con el polipéptido y en cambio, se utilizó CX3CR1BII036 en lugar de estimulación con Fractalquina. Si bien CX3CR1BII036 inhibió el influjo de calcio mediado por Fractalquina con un IC50 de 1.3 nM, no se observó aumento alguno en los niveles de calcio citosólico cuando el polipéptido solo se agregó en concentraciones de hasta 1 µ?.
Ejemplo 8 : Exploración de formatos de extensión de la vida media por el uso de Fe de ratón Para investigar modalidades de extensión de la vida media alternativas, el dominio VHH de 66B02 se produjo como una proteina de fusión con un dominio Fe IgG2 de ratón (66B02-mFc). Se incorporó un ácido aspártico para la mutación de alanina (D265A) en el dominio CH2 para abrogar una función efectora potencial mediada por Fe en este constructo (Baudino, J. Immunol., 181, 6664 a 6669 (2008)). Se expresó 66B02-mFc en células de HEK293T o células de NSO y se purificó por medio de cromatografía de afinidad a Proteína A seguido por cromatografía de intercambio iones.
Esta molécula se evaluó por su actividad por el uso de los formatos de ensayo que se describen en el Ejemplo 7. Los resultados se sintetizan en la Tabla 33: bien 66B02-mFc inhibió en forma potente activación de CX3CR1 mediada por Fractalquina, no mostró una actividad agonista. No se observó aumento alguno en los niveles de calcio citosólico con el tratamiento con hasta 1 µ? de esta molécula.
E emplo 9 : Inhibición de la progresión de placas en polipéptidos bivalentes con vida media extendida de un modelo de aterosclerosis de ratón Generación de ratones knock-in Apo E ~ ~ con CX3CR1 humana Dada la falta de reactividad cruzada de los VHH identificados para CX3CR1 de ratón (Ejemplo 5), se generó una linea de ratón knock-in (hu CX3CR1 KI) CX3CR1 humana en TaconicArtemis (Koeln, Alemania) para permitir las pruebas de estas moléculas en modelos de enfermedad de ratón. Se empleó una estrategia que permitió la expresión del receptor de quimiocina humana bajo el control del promotor de ratón correspondiente mientras que se interrumpía la expresión de la proteína de ratón endógena. En forma breve, se construyó un vector blanco donde la región de codificación de CX3CR1 de ratón en el exón 2 fue reemplazada con el marco de lectura abierto de CX3CR1 humana completo y se flanqueó por medio de los marcadores de selección y sitios loxP. El vector blanco se introdujo en células de ratón ES y se utilizaron clones que se-habían sometido a una recombinación homologa en forma exitosa para generar ratones quiméricos. Estos ratones se criaron hasta ratones Flp-deleter altamente eficientes para alcanzar la eliminación del marcador de selección y la transmisión de la linea germinal. Los ratones hu CX3CR1 KI resultantes en un fondo C57BL/6 luego se cruzaron con ratones Apo E _/~ (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EE.UU.) para generar ratones hu CX3CR1 KI Apo E_ ~. El modelo de ratón Apo E~ _ proporciona un método robusto para obtener la formación de una placa aterosclerótica extensiva que es muy similar a la enfermedad humana con respecto a la localización especifica de sitio de la formación de placas, composición histológica, y los factores de riesgo conocidos (colesterol, inflamación, hipertensión, etc.).
Evaluación de los polipéptidos bivalentes con vida media extendida anti-CX3CRl en el modelo de aterosclerosis de ratón Apo E' ' Se alimentaron ratones hembras hu CX3CR1KI ApoE _ ~ con una dieta alta en grasas/alta en colesterol que contenia 1.5% de colesterol durante 16 semanas comenzando a las cuatro semanas de edad. Después de 10 semanas, los animales se administraron por medio de un vehículo de inyección i.p. (20 mM de NaCitrato pH 6.0, 115 mM de NaCl) , 10 mg/kg de 66B02-mFc una o dos veces por semana o 30 mg/kg de CX3CR1BII036 dos veces por semana durante 6 semanas. Los animales se anestesiaron por medio de anestesia de gas y se perfusionaron con 0.9% de solución salina. Se retiró la aorta descendente con cuidado para la bifurcación ilíaca y se fijó en formalina. Luego se abrió en forma longitudinal, y se tiñó con Sudan IV durante 15 minutos, seguido por 70% de metanol durante 2 minutos. Los recipientes se lavaron bajo agua corriente y se cubrieron con PBS . Los tejidos se fotografiaron con una cámara digital por el uso de software SPOT Advanced (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI, EE.UU.). El porcentaje de tinción de lipidos se determinó con software de análisis de imágenes (Image-Pro Plus, MediaCybernetics, Rockville, MD, EE.UU.) y se expresó como un porcentaje de tinción positivo del recipiente. Los resultados de este estudio se sintetizan en la Tabla 34: Tabla 34 Cuantificación de Tamaño de Placa en la Aorta Descendente en Ratones hembras hu CX3CR1 KI Apo E Ambos 66B02-mFc y CX3CR1BII036 inhibieron en forma significativa la progresión de placa cuando se dosificaron dos veces por semana. Esto se correlacionó con la cobertura dado que se pudo confirmar que los niveles de plasma de estas moléculas se mantuvieron a lo largo del estudio. Para las dosificaciones una vez por semana de 66B02-mFc, no se mantuvieron niveles de plasma detectables y esto se correlacionó con la falta de eficacia significativa observada después de 6 semanas de tratamiento. Ninguna molécula afectó en forma significativa los niveles de colesterol o triglicéridos en plasma.
Ejemplo 10 : Optimización por secuencia de la VHH parental En general, durante la optimización por secuencia de VHH, las secuencias de VHH de tipo salvaje parental mutan para dar secuencias de VHH que son más idénticas a las secuencias de consenso de linea germinal VH3-JH humana. Los aminoácidos específicos en las regiones estructurales que difieren entre el consenso de línea germinal VH3-JH y VHH humana se alteró a la contraparte humana de manera tal que la estructura, actividad y estabilidad de la proteína se mantienen intactas. Para investigar esto, se compararon todas las variantes de optimización por secuencia con la VHH parental en tres ensayos diferentes: (i) determinación de la temperatura de fusión (Tm) en un Ensayo de Cambio Térmico (TSA) , (ii) análisis de potencia in vitro en FACS de competición de fractalquina, y para algunos constructos (iii) análisis de potencia in vitro en el ensayo de quimiotaxis inducida por fractalquina .
Mutación de residuos estructurales Para la optimización por secuencia, se investigaron las siguientes mutaciones: E1D, SllL, A14P, E16G, R44Q, D46E, A74S, K83R y Q108L. Los mutantes individuales que se generaron en la secuencia parental de CX3CR1BII66B02 están representados en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. 35: Tabla 35 Mutaciones investigadas durante la optimización por secuencia de 66B02 Todos los constructos se clonaron en un vector de expresión de E. coli, y se expresaron en E. coli como proteínas etiquetadas con myc/His en un volumen de cultivo de 0.25L a 0.5L de medio TB . La expresión se indujo por medio de la adición de lmM IPTG y se dejaron continuar durante 4 horas a 37°C y 250 rpm. Las células se extrusaron, y se prepararon extractos periplásmicos por medio _ de congelamiento y descongelamiento y resuspensión en dPBS . Estos extractos se utilizaron como material de inicio para una cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) por el uso de columnas crudas Histrap FF (GE healthcare) . Los nanocuerpos se eluyeron de la columna con 250mM de imidazol y posteriormente se desalaron hacia dPBS. La pureza e integridad de los Nanocuerpos se verificó por medio de reducción SDS-PAGE.
De acuerdo con lo sintetizado en la Tabla 36, A14P, A74S, K83R y Q108L las mutaciones no tuvieron un efecto claro en la potencia de acuerdo con lo determinado a partir de FACS de competición. En forma similar, las mutaciones adicionales E1D, S11L y E16G no afectaron la potencia. La introducción ya sea de R44Q o D46E por el otro lado dio lugar a una calda significativa en la potencia que fue incluso más pronunciada si se introducían ambas mutaciones .
Tabla 36 Potencia de los constructos de optimización por secuencia determinada por medio de FACS de competición de ligandos También se evaluó la temperatura de fusión, predictiva para la estabilidad de la VHH. La mayoría de las mutaciones individuales tuvieron un efecto limitado a nulo excepto por la mutación D46E que elevó la temperatura de fusión en aproximadamente 6°C. La introducción de las mutaciones combinadas también potenciaron la estabilidad térmica, compárese 057 y 060.
Debido a los principales efectos en la potencia en FACS de competición de ligandos, las mutaciones R44Q y D46E no se incluyeron en la secuencia final.
Mutación de residuos CDR Con base en el análisis in silico de la secuencia parental, se predijo un sitio de glicosilación en la posición 52. Por lo tanto se construyeron dos librerías; una para la posición 52 y uno para la posición 53, que se diseñó para incluir todos los aminoácidos posibles en la posición respectiva. Las librerías se visualizaron como extractos periplásmicos en un FACS de competición de ligandos. Primero, se llevó a cabo una serie de dilución de material periplásmico de la secuencia parental y se seleccionaron tres diluciones para visualización adicional. Se eligió un primer punto de dilución (dos veces) para dar un bloqueo completo de la interacción de ligandos mientras que los otros dos puntos de dilución (vez 128 y 512) deberían resultar en 70 % y 40% de bloqueo respectivamente. Tras la producción de los extractos periplásmicos de la librería, todas las muestras se dividieron en dos y una de ellas se sometió a un tratamiento con calor. Tanto las muestras no tratadas como las tratadas con calor se analizaron posteriormente en los FACS de competición de ligandos en los tres puntos de dilución. El impacto de la mutación se podría estimar por medio de la comparación del bloqueo obtenido con el de la secuencia parental. El análisis de las muestras tratadas con calor proporciona una medida para un impacto potencial en la estabilidad de la mutación.
Con base en los resultados de visualización inicial, se seleccionaron siete mutaciones para caracterización adicional. La potencia obtenida en los FACS de competición de ligandos se muestra en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. 37.
Tabla 37 Eliminación del sitio de glicosilación en la posición 52 A partir de este análisis, la alineación de secuencia con la secuencia de referencia humana y con base en el programa de predicción de reconocimiento de epítopos de células T in silico, se decidió incluir las mutaciones N52S y S53T en la secuencia.
Dadas las razones de estabilidad se llevó a cabo una librería adicional para la posición 32. La visualización de competición de ligandos se estableció en una forma similar de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Nuevamente se visualizaron tres diluciones de los extractos periplásmicos y él % de bloqueo obtenido se comparó con el obtenido para la secuencia parental. Tras el análisis de los varios mutantes, se eligió la sustitución de N32T y se incluyó en la variante optimizada por secuencias final.
Ejemplo 11: Análisis de las variantes optimizadas En una ronda de caracterización final se caracterizaron los constructos enumerados en la Tabla 38. Tabla 38 Variantes optimizadas por secuencias de la VHH 66B02 líder llevó a cabo un experimento de FACS de competición de acuerdo con lo descripto con anterioridad asi como también una determinación de la temperatura de fusión. Los valores obtenidos se representan en la Tabla 39.
Tabla 39 FACS de competición y Tm de las variantes optimizadas por secuencia Estos constructos también se caracterizaron en quimiotaxis inducida por fractalquina de acuerdo con lo descripto con anterioridad (Tabla 40).
Tabla 40 Quimiotaxis inducida por ligandos con variantes optimizado por secuencias Los constructos seleccionados se evaluaron por la inhibición de la internalización inducida por A647-Fractalquina en células de CHO huCX3CRl . Los resultados se sintetizan en la Tabla 41: Tabla 41 Internalización inducida por ligandos con variantes optimizadas por secuencias Un polipéptido optimizado por secuencias bivalente anti-CX3CR1 con vida media extendida carece de actividad agonista Con el fin de confirmar que un polipéptido optimizado por secuencias anti-CX3CRl con vida media extendida no tiene actividad agonista, se evaluó CX3CR1BII00313 para la inducción de influjo de calcio en las células de CHO huCX3CRl. Si bien la preincubación con CX3CR1BII00313 inhibió el influjo de calcio mediado por Fractalquina con un IC50 de 1.3 nM, no se observó aumento alguno en los niveles de calcio citosólico cuando el polipéptido solo se agregó en concentraciones de hasta 1 µ?. Ejemplo 12 : Exploración de formatos de extensión de la vida media por el uso de Fe humana Para investigar modalidades de extensión de la vida media alternativas, se produjeron los dominio VHH optimizado por secuencias CX3CR1BII00306 y CX3CR1BI 100307 como proteínas de fusión con un dominio Fe IgGl humana (306D-hFc y 307D-hFc) . Se incorporaron dos mutaciones de en el dominio CH2 para abrogar una función efectora potencial mediada por Fe en este constructo. Se expresaron 306D-hFc y 307D-hFc en células de HEK293T o células de NSO y se purificó por medio de cromatografía de afinidad a Proteína A seguido por cromatografía de intercambio iones. Estas moléculas se evaluaron por su actividad funcional por el uso de los formatos de ensayo gue se describen en el Ejemplo 7. Los resultados se sintetizan en la Tabla 42: Tabla 42 Actividad de Proteínas de Fusión hFc Si bien estas moléculas inhibieron en forma potente la activación de CX3CR1 mediada por Fractalquina, no mostraron una actividad agonista. No se observó aumento alguno en los niveles de calcio citosólico con el tratamiento con hasta 1 µ? de estos "Nanocuerpos solos.
Ejemplo 13: Inhibición de la progresión de placa en un modelo de aterosclerosis de ratón por medio de un Nanocuerpo anti-CX3CRl optimizado por secuencias Se alimentaron ratones hembras hu CX3CR1KI ApoE _ ~ con una dieta alta en grasas/alta en colesterol que contenía 1.5% de colesterol durante 16 semanas comenzando a las cuatro semanas de edad. Después de 10 semanas, los animales se administraron por medio de un vehículo de inyección i.p. (20 mM de NaCitrato pH 6.0, 115 mM de NaCl) , 30 mg/kg de CX3CR1BII00313 una o dos veces por semana o 30 mg/kg de CX3CR1BII036 dos veces por semana durante 6 semanas. Los animales se sacrificaron y se cuantificó el porcentaje de área de placa en la aorta descendente de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Los resultados de este estudio se sintetizan en la Tabla 43: Tabla 43 Cuantificación de Tamaño de Placa en la Aorta Descendente en Ratones hembras hu CX3CR1 KI Apo E Ambos CX3CR1BII00313 y CX3CR1BII036 inhibieron en forma significativa la progresión de placa cuando se dosificaron dos veces por semana. Esto se correlacionó con la cobertura dado que se pudo confirmar que los niveles de plasma de estas moléculas se mantuvieron a lo largo del estudio. Para las dosificaciones una vez por semana de CX3CR1BII00313, no se mantuvieron niveles de plasma detectables y esto se correlacionó con la falta de eficacia significativa observada después de 6 semanas de tratamiento. Ninguna molécula afectó en forma significativa los niveles de colesterol o triglicéridos en plasma.
Ejemplo 14 : Nanocuerpo que se une a células CD14+ primarlas humanas y de mono cynomolgus en sangre entera FACS de competición con Nanocuerpo formateado optimizado por secuencias anti-CX3CRl Para confirmar la unión del Nanocuerpo formateado optimizado por secuencias anti-CX3CRl a células primarias humanas, se demostró que CX3CR1BII00313 compite por la unión de A647 labelado CX3CR1BII018 (A647-018) a células CD14+ en un ensayo de FACS de competición en sangre entera. En forma breve, un ratón anticuerpo CD14 anti-humano conjugado con eFluor 450 (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.) se diluyó 1:10 en sangre entera tratada con EDTA de un donante humano sano. Se agregaron 40 µ?/pocillo a una placa de fondo redondo de poliestireno de 96 pocilios seguido por 10 -ul/pocillo de CX3CR1BII00313 diluido en Stain Buffer con BSA (BD Pharmingen) a una concentración final que oscila entre 100 nM y 0.002 pM y las muestras se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregaron 10 µ?/pocillo de A647-018 en Stain Buffer para dar una concentración final de 1 nM (el EC80 de la unión a A647-018) y las muestras se incubaron durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Luego se agregaron 220 µ?/pocillo de solución Fix/Lyse de un paso (eBioscience) . Después de una incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente las células se extrusaron, se lavaron dos veces en Stain Buffer y se resuspendieron en este tampón. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo BD LSR II. Se cuantificó la intensidad de fluorescencia media para AlexaFluor 647 para la población celular positiva CD14 de rejilla. CX3CR1BII00313 inhibió en forma potente la unión de A647-018 a células positivas CD14 en sangre humana con un IC50 de 0.35 nM (n=8) .
Para confirmar la unión del Nanocuerpo formateado optimizado por secuencias anti-CX3CRl a células primarias de mono cynomolgus, se demostró que CX3CR1BII00313 compite por la unión de A647 labelado CX3CR1BII018 (A647-018) a células CD14+ en un ensayo de FACS de competición en sangre entera de mono cynomolgus. El método utilizado fue análogo a aquél esbozado con anterioridad excepto que la concentración final de A647-018 fue de 3 nM (el EC80 de la unión a A647-018) y se utilizó un tampón de lisina ACK (Life Technologies) en lugar de la solución Fix/Lyse de un paso. Las células se resuspendieron en Stain Buffer suplementado con 1% de formaldehído antes del análisis. CX3CR1BII00313 inhibió en forma potente la unión de A647-018 a células positivas CD14 en sangre de mono cynomolgus con un IC50 de 0.43 nM (n=4) . Ejemplo 15: Farmacocinética (PK) en monos cynomolgus Se llevó a cabo un estudio farmacocinético en monos cynomolgus machos naif {Macaca fascicularis) de 2 a 5 años de edad con un intervalo de peso corporal entre 2.4 y 3.5 kg. Los monos se dividieron en cuatro grupos de tratamiento. El Grupo 1 (n=3) recibieron 0.2 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v.; el Grupo 2 (n=3) recibieron 2 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v.; el Grupo 3 (n=3) recibió 2 mg/kg de CX3CR1BII00313 s.c. y el Grupo 4 (n=3) recibió 5 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v. CX3CR1BII00313 se administró como una solución de 2 mg/ml en tampón de citrato (20 mM citrato de sodio /115 mM de cloruro de sodio, pH 6.0) . Se recolectaron muestras de sangre durante 6 semanas a partir de una vena periférica en tubos de separador de suero para análisis de PK.
Las muestras de suero se analizaron por el uso de un formato MSD (Meso Scale Discovery) . En forma breve, un anticuerpo anti-Nanocuerpo biotinilado se unió a una placa de estreptavidina MSD estándar (Meso Scale Discovery, Rockville, MD, EE.UU.). Las placas se lavaron con 0.05% de Tween 20 en una solución salina con tampón de fosfato y se bloqueó con 5% p/v de SeraCare BSA (SeraCare Life Sciences, Milford, MA, EE.UU.) antes de la incubación con muestras de suero. CX3CR1BII00313 se detectó por el uso de un Nanocuerpo anti-Nanocuerpo labelado con sulfuro y las placas se analizaron en un Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery) . Se utilizaron concentraciones variables de CX3CR1BII0313 de 5000 a 0.5 ng/ml en 5% de suero de mono como estándares. Se evaluó la unión blanco por medio del monitoreo de los niveles de CX3CR1 libre en monocitos con rejilla de CD14+. Este ensayo fue análogo al ensayo de FACS de competición sintetizado en el Ejemplo 14 excepto que no se agregó CX3CR1BII00313 adicional. Las muestras de suero también se monitorearon por la presencia de anticuerpos anti-humano de primates (PARA.) dado que pueden impactar la evaluación de PK y CX3CR1 libre.
Se utilizó ForteBio RED96 para la detección de PAHA. En forma breve, se capturó CX3CR1BII0313 biotinilado sobre sensores de estreptavidina . Luego se utilizó el suero de mono naif reunido como un control negativo para calcular el valor de corte (definido como dos veces por encima de la señal de unión promedio de sueros naif) . Todas las muestras de suero se diluyeron 20 veces en el tampón y se determinó que la respuesta PAHA era positiva si la señal de- unión era mayor que el valor de corte.
Los datos para los puntos de tiempo luego de la detección de PAHA se excluyeron del análisis PK/PD. Los datos de PK se sintetizan en la Tabla 44 a continuación.
Tabla 44 Parámetros farmacocinéticos de CX3CR1BII00313 ** datos insuficientes para la caracterización de la fase terminal La depuración y vida media a 2.0 mg/kg i.v. fue de 9.4 ml/d/kg y 9.6 días, respectivamente. A 0.2 mg/kg de i.v., la depuración fue sustancialmente mayor (113 ml/d/kg), lo cual es consistente con la farmacocinética de disposición mediada por blancos saturable (T D) . El AUC(0 a 14 d) ajustada por la dosis fue comparable entre las dosis de 2 y 5 mg/kg i.v. lo que sugiere la saturación de TMD en la dosis de 2 mg/kg. La exposición a 2 semanas luego de la administración del Nanocuerpo ya sea i.v. o s.c. fue > 70 nM y la biodisponibilidad después de la administración s.c. fue de 54 %. El receptor libre se rastreó con una exposición con mayor que el 90 % de la cobertura blanco mantenida en las explosiones > 10 nM.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. - Un polipéptido que comprende un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl, caracterizado porque dicho polipéptido es capaz de bloquear la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana. 2. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl consiste esencialmente en cuatro regiones estructurales (FR1, FR2, FR3 y FR4 ) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) . 3. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un VH, VL, VHH, VH camelizado, o VHH que está optimizado para estabilidad, potencia, fabricabilidad y/o similitud a regiones estructurales humanas. 4. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho polipéptido tiene una afinidad con CX3CR1 humana en: c) un EC50 de menos que o igual a ????, menos que o igual a 5nM, menos que o igual a 2.5nM o menos que o igual a ln , de acuerdo con lo determinado por FACS de unión a células; o d) un IC50 de menos que o igual a ????, menos que o igual a 5nM, menos que o igual a 2.5nM o menos que o igual a InM, de acuerdo con lo determinado por FACS de competición. 5. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 4, caracterizado porque dicho polipéptido bloquea la unión de fractalquina humana a CX3CR1 humana en un IC50 de menos que o igual a 300nM, o menos que o igual a ?????, o menos que o igual a 20nM, o menos que o igual a ????, o menos que o igual a 5nM, o menos que o igual a 2.5n o menos que o igual a InM. 6. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho polipéptido comprende una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácido de Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO: 197), donde: Xaal es Pro, Ala o Gly; Xaa2 es Asp o Asn; Xaa3 es Thr o Ser; Xaa4 es Arg, Lys, Ala o Gly; y Xaa5 es Tyr o Phe. 7. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque dicha CDR3 tiene la secuencia de aminoácido de Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 186) . 8. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho polipéptido comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene las secuencias de aminoácido establecidas en: SEQ ID NO: 213, 221 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 162 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 163 y 187, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 164 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 166 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 167 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 167 y 189, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 168 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 168 y 187, respectivamente; o - SEQ ID NO: 141, 169 y 190, respectivamente; o - SEQ ID NO: 141, 170 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 171 y 186, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 141, 174 y 186, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 141, 175 y 187, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 142, 165 y 188, respectivamente; o - SEQ ID NO: 142, 173 y 188, respectivamente ; o SEQ ID NO: 143, 164 y 186, respectivamente; o - SEQ ID NO: 144, 172 y 187, respectivamente; o - SEQ ID NO: 145, 172 y 187, respectivamente ; o - SEQ ID NO: 141, 214 y 186, respectivamente; o - SEQ ID NO: 141, 215 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 216 y 186, respectivamente ; o SEQ ID NO: 141, 217 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 218 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 219 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 141, 220 y 186, respectivamente; o SEQ ID NO: 213, 214 y 186, respectivamente. 9. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho polipéptido comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene las secuencias de aminoácido establecidas en: SEQ ID NO: 146, 176 y 191, respectivamente; o SEQ ID NO: 146, 177 y 191, respectivamente. 10. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho polipéptido comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene las secuencias de aminoácido establecidas en: SEQ ID NO: 147, 178 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 147, 179 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 147, 179 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 148, 179 y 193, respectivamente; o SEQ ID NO: 149, 179 y 192, respectivamente ; o SEQ ID NO: 149, 180 y 192, respecti amente; o SEQ ID NO: 149, 181 y 192, respectivamente ; o SEQ ID NO: 149, 183 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 149, 185 y 192, respectivamente ; o SEQ ID NO: 150, 179 y 194, respectivamente ; o SEQ ID NO: 150, 182 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 151, 179 y 193, respectivamente; o SEQ ID NO: 151, 182 y 194, respectivamente; o - * SEQ ID NO: 151, 184 y 196, respectivamente; o SEQ ID NO: 152, 179 y 195, respectivamente; o SEQ ID NO: 153, 179 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 154, 182 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 155, 179 y 195, respectivamente ; o SEQ ID NO: 156, 181 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 157, 179 y 194, respectivamente; o SEQ ID NO: 158, 179 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 159, 178 y 192, respectivamente; o SEQ ID NO: 160, 179 y 194, respectivamente ; o SEQ ID NO: 161, 179 y 194, respectivamente . 11.- El polipéptido de conformidad ( :on reivindicación 1, caracterizado porque el polipépt comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene secuencias de aminoácido establecidas en: las SEQ ID NOS: 141, 164 y 186, respectivamente, las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186, respectivamente, las SEQ ID NOS: 213, 214 y 186 respectivamente, o las SEQ ID NOS: 213, 221 y 186 respectivamente. 12.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; b) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 90% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; o c) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 48, 121 a 140 o 222 a 224. 13. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; b) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 49; o c) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 49 a 52. 14. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en: a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; b) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 90% de identidad de aminoácido con las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NO: 67; o c) una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 53 a 120. 15. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CRl comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 121 a 140 o la SEQ ID NO*: 222 a 224. 16. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque dicho dominio variable simple de inmunoglobulina ya sea a) bloquea en forma cruzada la unión de, o b) se bloquea en forma cruzada de la unión por medio de al menos uno de los dominios variables simples de inmunoglobulina de las SEQ ID NOS: 1 a 120, 121 a 140 y 222 a 224 para CX3CR1. 17. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el polipéptido además comprende un resto de extensión de la vida media. 18. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque dicho resto de extensión de la vida media está vinculado en forma covalente a dicho polipéptido y se selecciona del grupo que consiste en un resto de unión a albúmina, tal como un dominio de inmunoglobulinas anti-albúmina, un resto de unión a transferrina, tal como un dominio de inmunoglobulinas anti-transferrina, una molécula de polietilenglicol , una molécula de polietilenglicol recombinante, albúmina de suero humana, un fragmento de albúmina de suero humana, un péptido de unión a albúmina o un dominio Fe. 19. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17 o 18, caracterizado porque dicho resto de extensión de la vida media consiste en un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina . 20. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el dominio variable simple de inmunoglobulina se selecciona de un dominio VHH, un dominio VHH humanizado, un dominio VH camelizado, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio único y/o "dAb". 21. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 230 a 232. 22. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 18, caracterizado porque dicho polipéptido está unido a una porción Fe, en forma opcional a través de un vinculador o una región de articulación adecuada . 23. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque dicho polipéptido además comprende un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina. 24. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina comprende un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina anti-CX3CR1. 25. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23 o 24, caracterizado porque dicho primer y segundo dominio variable simple de inmunoglobulina son un VH, VL, VHH, VH camelizado, o VHH. 26. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina comprende secuencias de aminoácido establecidas CDR1, CDR2 y CDR3 en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11. 27. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque dicho primer y dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina comprenden las mismas CDR1, CDR2 y CDR3. 28. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque dichos primer y segundo dominios variables simples de inmunoglobulina comprenden un dominio VHH que tiene una secuencia de aminoácido establecida en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15. 29. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque dicho primer y dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina comprenden el mismo dominio VHH. 30. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprenden un primer dominio variable simple de inmunoglobulina que comprenden CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOS: 141, 164 y 186, o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186, o las SEQ ID NOS: 213, 214 y 186, o las SEQ ID NOS: 213, 221 y 186, y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina de acuerdo con lo establecido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 31. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOS: 141, 164 y 186, o las SEQ ID NOS: 141, 162 y 186, o las SEQ ID NOS: 213, 214 y 186, o las SEQ ID NOS: 213, 221 y 186. 32. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina, donde dicho -primer dominio variable simple de inmunoglobulina es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, o cualquiera de las SEQ ID NO: 121 a 140 o 222 a 224 y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 33. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque dicho segundo dominio variable simple de inmunoglobulina es un dominio VHH que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, o cualquiera de las SEQ ID NO: 121 a 140 o 222 a 224. 34. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, caracterizado porque el polipéptido además comprende un resto de extensión de la vida media. 35. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque dicho resto de extensión de la vida media está vinculado en forma covalente a dicho polipéptido y se selecciona del grupo que consiste en un resto de unión a albúmina, tal como un dominio de inmunoglobulinas anti-albúmina, un resto de unión a transferrina, tal como un dominio de inmunoglobulinas anti-transferrina, una molécula de polietilenglicol , una molécula de polietilenglicol recombinante, albúmina de suero humana, un fragmento de albúmina de suero humana, un péptido de unión a albúmina o un dominio Fe. 36. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho resto de extensión de la vida media consiste en un dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina . 37. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el dominio variable simple de inmunoglobulina se selecciona de un dominio VHH, un dominio VHH humanizado, un dominio VH camelizado, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio único y/o "dAb" . 38. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el dominio variable simple de inmunoglobulina anti-albúmina se selecciona de las SEQ ID NOS: 230 a 232. 39. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho polipéptido está unido a una porción Fe, en forma opcional a través de un vinculador o una región de articulación adecuada. 40. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 225 a 227 o 257 a 262. 41. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 253, 254, o 263 a 266. 42. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NO: 249, 277 a 281, y 267 a 276. 43. - Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42. 44. - Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico como el que se reclama en la reivindicación 43. 45. - Una célula huésped, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, en donde dicha célula huésped es capaz de expresar dicho polipéptido. 46. - Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende (i) un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, y (ii) un portador aceptable para uso farmacéutico, y en forma opcional (iii) un diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante. - 47.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es adecuada para inyección intravenosa o subcutánea en un ser humano. 48. - Un método in vi tro de elaboración de un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, caracterizado porque comprende los pasos de - cultivar una célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión de un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, donde dicha célula huésped porta un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico , dicha molécula de ácido nucleico comprende una región que codifica un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, y donde dicha célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota. 49. - El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende además los pasos de - recuperar dicho polipéptido; y - purificar dicho polipéptido. 50. - Un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, para usarse en el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o afección, en un ser humano. 51. - El polipéptido para usarse de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad, trastorno o afección asociada a CX3CR1. 52. - El polipéptido para usarse de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la enfermedad, trastorno o afección se selecciona de trastornos ateroscleróticos cardio y cerebrovasculares , enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatia diabética, glomerulonefritis , glomerulonefritis crescéntica humana, nefropatia de IgA, nefropatia membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schonlein-Henoch y granulomatosis de Wegener, artritis reumatoide, osteoartritis, rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM), enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer. 53. - El polipéptido para usarse de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la enfermedad, trastorno o afección es aterosclerosis . 54. - El uso de un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, para la elaboración de un medicamento útil para el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o afección, en un ser humano. 55. - El uso de un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las realizaciones 1 a 42, para preparar un medicamento útil en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno asociado a CX3CR1. 56. - El uso de conformidad con la reivindicación 55, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona de trastornos ateroscleróticos cardio y cerebrovasculares , enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatia diabética, glomerulonefritis , glomerulonefritis crescéntica humana, Nefropatia de IgA, nefropatia membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schónlein-Henoch y granulomatosis de Wegener, artritis reumatoide, osteoartritis, rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer. 57. - El uso de conformidad con la reivindicación 55, en donde la enfermedad o trastorno es aterosclerosis . 58. - Un kit de diagnóstico, caracterizado porque comprende un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, o el uso del mismo . 59. - Un kit de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 58, para usarse en el diagnóstico de al menos uno de trastornos ateroscleróticos cardio - y cerebrovasculares, enfermedad arterial periférica, reestenosis, nefropatia diabética, glomerulonefritis , glomerulonefritis crescéntica humana, Nefropatia de IgA, nefropatía membranosa, nefritis de lupus, vasculitis que incluye púrpura de Schonlein-Henoch y granulomatosis de egener, artritis reumatoide, osteoartritis, rechazo de aloinjertos, esclerosis sistémica, trastornos neurodegenerativos y enfermedad desmielinizante, esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Alzheimer, enfermedades pulmonares tales como EPOC, asma, dolor neuropático, dolor inflamatorio, o cáncer.
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