MX2014008829A - Metodo para tratar la diabetes usando apolipoproteina a-iv no glicosilada. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para el tratamiento de diabetes mellitus de tipo dos en un sujeto en necesidad de los mismos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo dos, en donde los métodos y las composiciones de la invención se basan en el uso de la apolipoproteína A-lV no glicosilada producida por un sistema de expresión de proteínas, como un sistema de expresión bacteriana; también se describen métodos para restaurar substancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto en necesidad de los mismos a un nivel normal y métodos para bajar los niveles de glucosa en sangre en un sujeto en necesidad del mismo basado en administrar apolipoproteína A-lV no glicosilada producida por un sistema de expresión de la proteína.

Description

MÉTODO PARA TRATAR LA DIABETES USANDO APOLIPOPROTEÍNA A- IV NO GLICOSILADA CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a un método de tratamiento de diabetes usando apolipoproteína no glicosilada A-IV (apoA-IV). Más concretamente, la presente descripción se refiere a un método de tratamiento de diabetes mellitus de tipo dos mediante la administración de una cantidad efectiva de apolipoproteína no glicosilada A-IV, que es producida por un sistema de expresión de proteínas.

SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud de PCT No.

PCT/US2012/021802, presentado el 19 de enero de 2012. Esta solicitud también reclama prioridad para la solicitud de patente de Estados Unidos No. 61/675692, presentada el 25 de julio de 2012. Todo el contenido de las solicitudes de prioridad se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La aparición de la diabetes es extensa, con aproximadamente el 8% de la población en los Estados Unidos sufriendo de diabetes. La diabetes es una enfermedad crónica caracterizada por alto contenido de azúcar en la sangre debido a la incapacidad del cuerpo para efectivamente producir y/o utilizar insulina. La diabetes puede llevar a una variedad de complicaciones físicas, incluyendo pero no limitada a insuficiencia renal, ceguera, daño a los nervios, enfermedad cardíaca, apnea del sueño y la enfermedad celíaca. Por ejemplo, en los Estados Unidos, la diabetes es la principal causa de insuficiencia renal, ceguera, amputación, accidente cerebrovascular y ataque cardíaco. También en los Estados Unidos, la diabetes es la sexta causa de muerte y ha demostrado que reducir la expectativa de vida de los adultos de mediana edad de cerca de cinco a diez años.

La forma más común de la diabetes es la diabetes mellitus tipo 2 (también denominada "T2DM" o "diabetes tipo 2"). La diabetes tipo 2 se caracteriza por hiperglucemia, resistencia a la insulina, disfunción de las células ß y gluconeogénesis hepática mal regulada. Las personas que sufren de diabetes tipo 2 experimentan la pérdida de la secreción de insulina estimulada por glucosa relacionada con la liberación deteriorada de gránulos de insulina almacenada de ß-células en la primera fase de secreción de insulina. En la segunda fase de la secreción de insulina, las personas que sufren de diabetes tipo 2 experimentarán una pérdida gradual de la capacidad de sintetizar activamente la insulina en respuesta a los estímulos de glucosa.

La prevalencia de la diabetes tipo 2 está aumentando y en 2002, la diabetes tipo 2 resultó en más de $ 130 mil millones en gastos médicos. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias para tratar eficazmente la diabetes tipo 2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento sorprendente que la apolipoproteína no glicosilada A-IV (apoA-IV) es no glicosilada en seres humanos. Antes de la presente descripción, era conocido en la técnica que la proteína apoA-IV fue glicosilada. Weinberg y Scanu (J (1983) J of Lipid Res vol. 24:52) informaron que apoA-IV fue una glicoproteína que contiene 6% de hidratos de carbono en peso (1.8% de mañosa, 1.55% galactosa , 1.55% de n-acetil glucosamina, ácido siálico 1.1 %). Como tal, apoA-IV se describe comúnmente como una glicoproteína (véase, por ejemplo, Gomaraschi et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun. 393(1): 126-30). Por el contrario, como se describe en el siguiente ejemplo 13, apoA-IV es una proteína no glicosilada.

Así, en una modalidad, la invención proporciona métodos de tratamiento de la diabetes tipo 2 con proteínas no glicosiladas (también denominadas no glicosiladas) apoA-IV. El método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína no glicosilada de apoA-IV, o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma que tiene al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la proteína apoA-IV.

En una modalidad, apoA-IV no glicosilada se produce mediante un sistema de expresión que carece de la capacidad de glicosilar. Por ejemplo, un sistema de expresión bacteriana como Escherichia coli, puede utilizarse para hacer apoA-IV no glicosilada.

En otra modalidad, los sistemas de expresión que pueden ser utilizados para hacer apoA-IV no glicosilada incluyen, pero son limitadas a, sistemas de expresión de células de mamífero, sistemas de expresión de la levadura y sistemas de expresión de baculovirus. En otra modalidad, un sistema de expresión libre de células puede utilizarse para hacer proteínas apoA-IV no glicosiladas.

En otra modalidad, se describe una composición farmacéutica que comprende proteínas no glicosiladas apoA-IV. La composición farmacéutica comprende proteínas de apoA-IV no glicosiladas con al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la proteína apoA-IV, o un fragmento biológicamente activo de la misma. La composición farmacéutica puede ser formulada para la administración a un sujeto para el tratamiento de la diabetes tipo 2.

En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de apoA-IV no glicosilada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 o 20 a 64 (o una secuencia que es por lo menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a SEQ ID NO: 1 , 3, 4 o 20-64), o un fragmento biológicamente activa de la misma. En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína apolipoproteína A-IV no glicosilada formada por una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4, o 20-64 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que tiene una proteína apolipoproteína A-IV que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 96% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que tiene una proteína apolipoproteína A-IV que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 97% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que tiene una proteína apolipoproteína A-IV que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que tiene una proteína apolipoproteína A-IV que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable o diluyente.

En otra modalidad, la composición farmacéutica es seleccionada del grupo que consiste de una formulación líquida, una formulación acuosa y una formulación liofilizada.

En una modalidad, la invención proporciona un método para tratar la diabetes tipo 2 que comprende administrar una proteína apoA-IV no glicosilada a un sujeto con diabetes tipo 2, o un análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 o 20 a 64 (o una secuencia que es por lo menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a SEQ ID NO: 1 , 3, 4 o 20-64). En una modalidad posterior, se produce la proteína apoA-IV utilizando un sistema de expresión procariota, por ejemplo, sistema de expresión bacteriana tales como E. coli.

En otra modalidad aún, se describe un método para substancialmente restaurar la tolerancia a la glucosa en un sujeto en necesidad de éste a un nivel normal. El método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de apoA-IV no glicosilada o análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, que tiene por lo menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a una proteína apoA-IV, por ejemplo, por la administración sistémica de la apoA-IV no glicosilada o el análogo biológicamente activo o fragmento de éstos. En una modalidad, la invención proporciona un método para restaurar substancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto en necesidad del mismo a un nivel normal, dicho método compuesto por administrar una cantidad efectiva de una proteína apoA-IV no glicosilada (o un análogo biológicamente activo o fragmento del mismo) que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4, o 20 a 64 (o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a SEQ ID NO: 1 , 3, 4 o 20-64).

En todavía otra modalidad, se describe un método para bajar el nivel de glucosa en sangre en un sujeto en necesidad del mismo. El método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma que tiene al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la apoA-IV non-glicosilada al sujeto en necesidad, por ejemplo, por la administración sistémica. En una modalidad, la invención proporciona un método para bajar el nivel de glucosa en sangre en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de apoA-IV no glicosilada (o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma) que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 o 20 a 64 (o una secuencia que es por lo menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a SEQ ID NO: 1 , 3, 4 o 20-64).

Una "cantidad efectiva" es como se describe a continuación y puede incluir de cerca de 0.25 a 2 pg/g de la apoA-IV o el análogo biológicamente activo de la misma. En una modalidad la cantidad efectiva es aproximadamente 0.1 mg/kg a 25 mg/kg. En otra modalidad, la cantidad efectiva es una dosis fija de alrededor de 1 a 1000 mg. En una modalidad posterior, la cantidad efectiva es una dosis fija de alrededor de 1 a 10 mg.

Estas y otras características y ventajas de estas y otras varias modalidades según la presente revelación será más evidentes a la vista de los dibujos, descripción detallada y reivindicaciones proporcionadas aquí.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La siguiente descripción detallada de las modalidades de la presente modalidad puede entenderse mejor cuando se lee conjuntamente con los dibujos siguientes, donde una estructura similar está indicada con números de referencia similares, y en donde: La figura 1 es una vista lateral en perspectiva de un dispositivo que tiene un reservorio de una composición farmacéutica y una jeringa según una modalidad de la presente descripción.

La figura 2 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) en ratones knockout y salvajes macho apoA-IV con respecto al tiempo (min) para una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 3 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) con respecto al tiempo (min) para una prueba de tolerancia de glucosa intraperitoneal en animales de tipo salvaje y knockout apoA-IV a 16 meses de edad.

La figura 4 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) con respecto al tiempo (min) en ratones knockout macho apoA-IV tras la administración intraperitoneal de apoA-IV recombinante (pg/g) o solución salina para una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 5 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) con respecto al tiempo (min) en ratones knockout apoA-IV tras la administración intraperitoneal de apoA-l recombinante o solución salina para una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 6 es un gráfico de la secreción de insulina (ng/mL) con respecto al tiempo (min) en ratones knockout apoA-IV tras la administración intraperitoneal de apoA-l recombinante o solución salina.

La figura 7 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/mL) con respecto al tiempo (min) en ratones de tipo salvaje y knockout apoA-IV en una dieta crónicamente alta en grasas para una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 8 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/mL) con respecto al tiempo (min) en ratones knockout apoA-IV en una dieta crónicamente alta en grasa tras la administración intraperitoneal de apoA-IV de ratón recombinante (1 pg/g) o solución salina para una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 9 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) con respecto al tiempo (h) en ratones diabéticos tras la administración intraperitoneal de apoA-IV de ratón recombinante (1 pg/g) o solución salina para una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 10 muestra los resultados de un análisis de Western blot del nivel de componente de proteína amiloide A sérico en ratones knockout apoA-IV, ratones de tipo salvaje y ratones knockout apoA-l.

La figura 11 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) en ratones de tipo salvaje y knockout apoA-IV hembra y con respecto al tiempo (min) durante una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT).

La figura 12 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) con respecto al tiempo (min) en ratones de tipo salvaje tras la administración intraperitoneal de 1.0 pg/g apoA-IV humana o solución salina durante una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 13 es un gráfico de glucosa en plasma (mg/dL) con respecto al tiempo (min) en ratones hembra tipo salvaje tras la administración intraperitoneal de 1 .0 µg/g de apoA-IV de ratón recombinante o solución salina durante una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

La figura 14 es un gráfico de barras muestra el efecto de 10 pg/g apoA-IV humana en islotes humanos despolarizados por 30mM KCI y 250µ? diazóxido en presencia de 3 mM o 20 mM de glucosa.

La figura 15 es una proteína con la secuencia de aminoácidos de apoA-IV humana de longitud completa tipo salvaje, humana (SEQ ID NO 1).

La figura 16 es una proteína con la secuencia de aminoácidos de apoA-IV ratón de longitud completa tipo salvaje (SEQ ID NO. 2).

La figura 17 es una proteína con la secuencia de aminoácidos de apoA-IV humana de longitud completa, tipo salvaje con la adición de glicina en el N-terminal (SEQ ID NO. 3).

La figura 18 es una proteína con la secuencia de aminoácido de la apoA-IV humana mostrando sustituciones polimórficas T347S, Q360H y/o E165K y la adición opcional de glicina, alanina o valina en el N-terminal (SEQ ID NO. 4).

La figura 19 es un polinucleótido (SEQ ID NO 5) de codificación de apolipoproteína A-IV humana tipo salvaje de longitud completa.

La figura 20 incluye la secuencia de aminoácido y secuencia optimizada de codificación de nucleotido del constructo Omp-Apo A-IV para la expresión periplasmica en E. coli.

La figura 21 incluye la secuencia del aminoácido y secuencia optimizada de codificación de nucleotido del constructo PelB-Apo A-IV para la expresión periplasmica en E. coli.

La figura 22 incluye la secuencia de aminoácido y secuencia optimizada de codificación de nucleotido del constructo ENX-Apo A-IV para la expresión periplasmica en E. coli.

La figura 23 incluye la secuencia de aminoácido y secuencia de codificación de nucleotido aptimizada del constructo Apo A-IV para la expresión citoplásmica en E. coli.

Las figuras 24A y 24B muestran resultados de predicción de N-glicosilación para la apoA-IV tipo salvaje humana (figura 24A) y la variante P393H (figura 24B).

Las figuras 25A y 25B muestran resultados de predicción de O- glicosilación para la apoA-IV tipo salvaje, humana (figura 25A) y la variante de P393H (figura 25B).

Los expertos en la técnica apreciarán que elementos en las figuras están ilustrados por la simplicidad y claridad y no necesariamente dibujadas a escala. Por ejemplo, las dimensiones de algunos de los elementos en las figuras pueden ser exageradas en relación a otros elementos, así como las piezas convencionales desmontadas, para ayudar a mejorar la comprensión de las diversas modalidades de la presente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los siguientes términos se usan en la presente solicitud: Según lo utilizado en este documento, el término "no-glicosilada" o "desglicosilada" significa una proteína sin glicosilación N-enlazado y/o O-enlazado observable, dentro de los límites de detección, por ejemplo, por enfoque isoeléctrico, digestión de PNGasa F y/o análisis de MALDI. En una modalidad, el término "no-glicosilada" o "desglicosilada" significa sin glicosilación N-enlazado observable ni glicosilación O-enlazado observable. En otro modalidad, el término "no-glicosilada" o "desglicosilada" significa sin glicosilación N-enlazado observable. En otra modalidad, el término "no-glicosilada" o "desglicosilada" significa sin glicosilación O-enlazado observable.

Como se utiliza en este documento, el término "sistema de expresión de proteínas" se refiere a un sistema de expresión basada en células o no basado en células que se utiliza para producir una proteína de interés, por ejemplo, apoA-IV. Dado que apoA-IV ha resultado sorprendentemente que carece de glicosilación, los sistemas de expresión que carecen de la maquinaria de glicosilación puede usarse para producir la proteína para su uso en el tratamiento de diabetes tipo II. En una modalidad, los sistemas de expresión basadas en células que glicosilan, tales como las células de mamífero, pueden utilizarse para producir apoA-IV no glicosilada. En una modalidad, el sistema de expresión de proteínas usado para hacer apoA-IV incluye un sistema de expresión bacteriana, un sistema de expresión de células de mamífero, un sistema de expresión celular de baculovirus (insecto) o un sistema de expresión de levadura.

El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), en este documento, se refiere a una célula que se ha transformado, o es capaz de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico y de tal modo expresa un gen de interés, por ejemplo, apoA-IV. Se debe entender que tales términos pretenden referirse no solamente a la célula objeto particular sino a la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones posteriores ya sea debido a sus mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser idéntica, de hecho, con respecto a la célula parental, pero aún así se incluyen dentro del alcance del térjnino "célula hospedera" como se utiliza en la presente invención. Las células hospederas pueden ser células procariotas o eucariotas que son capaces de expresar las secuencias de ácido nucleico exógeno. Ejemplos de las células hospederas incluyen bacterias tales como E. coli, levadura, células vegetales, células de ovario de hámster chino (CHO), células riñon embrionario humano (HEK)-293 y células de insecto.

El término "aislado" como se utiliza en referencia a una proteína, es una proteína, polipéptido o anticuerpo que en virtud de su origen o la fuente de derivación: (1 ) no está asociado con los componentes asociados naturalmente que los acompañan en su estado natal; (2) esté libre de otras proteínas de la misma especie; (3) se exprese por una célula de otra especie; o (4) no ocurre en la naturaleza. De este modo, un polipéptido que está, por ejemplo, sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de manera natural se "aislará" a partir de sus componentes asociados de manera natural. Una proteína también se puede hacer sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados por el aislamiento, utilizando cualquier técnica de purificación de proteínas adecuada. En una modalidad, la proteína de apoA IV utilizada en las composiciones y los métodos de la invención es una proteína aislada obtenida de una célula hospedera recombinante, por ejemplo, una célula bacteriana.

La frase "por ciento idéntica" o "identidad porcentual" se refiere a la similitud (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) entre por lo menos dos secuencias diferentes. Esta identidad porcentual puede ser determinada por los algoritmos de alineación estándar, por ejemplo, la herramienta de búsqueda de alineación básica local (BLAST) descrita por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403-10); the algorithm of Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-53); or the algorithm of Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci. 04:11 a.m.-17). Un conjunto de parámetros puede ser, por ejemplo, la matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización de brecha de 12, una brecha que extiende la penalización de 4 y penalización de brecha de desplazamiento de marco 5. La identidad porcentual entre dos aminoácidos o secuencias de nucleótidos también puede determinarse usando el algoritmo de Meyers y Miller ((1989) CABIOS 4:1 1-17), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando un cuadro de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de 4.

El término "proteína recombinante" se refiere a una molécula de proteína que se expresa de ADN recombinante. Por ejemplo, una proteína recombinante ApoA-IV es una que se expresa en una célula hospedera recombinante. Preferentemente, la proteína ApoA-IV utilizada en los métodos y las composiciones de la invención es una proteína recombinante ApoA-IV.

Como se utiliza en este documento, el término "cantidad efectiva" describe la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. La cantidad efectiva para cualquier solicitud particular puede variar dependiendo de una variedad de factores, incluyendo pero no limitado a la composición particular siendo administrada, el tamaño del sujeto, y/o la severidad de la enfermedad y/o condición a ser tratada. En una modalidad, una "cantidad efectiva" es una dosis de aproximadamente 0.25 a 10 pg/g de apoA-IV no glicosilada o análogo biológicamente activo de la misma. Alternativamente, una "cantidad efectiva de una apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo de la misma es de cerca de 1 a 10 pg/g, cerca de 0.25 a 2 pg/g, aproximadamente 1 pg/g o 0.1 mg/kg a 25 mg/kg. En otra modalidad, la cantidad efectiva es una dosis fija de alrededor de 1 a 1000 mg. En una modalidad posterior, la cantidad efectiva es una dosis fija de alrededor de 1 a 10 mg.

ApoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo se administra una vez diariamente. Alternativamente, apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo de la misma se administra aproximadamente 2 veces por día. En otra alternativa, apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo de la misma se administra más de dos veces al día, por ejemplo, tres veces al día. En otra alternativa, apoA-IV no glicosilada se administra una vez cada segundo, tercero, cuarto, quinto o sexto día, o una vez a la semana.

Como se utiliza en este documento, el término "efecto biológico deseado" describe reducir los efectos de contrarrestar y/o eliminar una enfermedad o condición. Por ejemplo, en el contexto de la diabetes tipo 2, efectos biológicos deseados incluyen, pero no se limitan a bajar la glucosa en la sangre, mejorar la tolerancia a la glucosa, restaurar sustancialmente la tolerancia a la glucosa a un nivel normal, mejorar la secreción de insulina, y/o substancialmente restaurar la secreción de insulina a un nivel normal.

Como se utiliza en este documento, el término "nivel normal" describe un nivel que es sustancialmente igual que el nivel en un sujeto que no está necesitando el tratamiento. Por ejemplo, en el contexto del tratamiento de la diabetes tipo 2, un nivel normal de glucosa en la sangre es de aproximadamente 70 mg/dL a aproximadamente 130 mg/dL antes de las comidas y menos de cerca de 180 mg/dL aproximadamente una o dos horas después de las comidas, o de aproximadamente 70 mg/dL a aproximadamente 100 mg/dL antes de las comidas y menos de cerca de 140 mg/dL aproximadamente una a dos horas después de las comidas. En otro ejemplo en el contexto del tratamiento de la diabetes tipo 2, un nivel normal de tolerancia a la glucosa describe la capacidad del sujeto para metabolizar los carbohidratos tal que el nivel de glucosa en la sangre es de aproximadamente 70 mg/dL a aproximadamente 130 mg/dL antes de las comidas y menos de cerca de 180 mg/dL aproximadamente una a dos horas después de las comidas, o de aproximadamente 70 mg/dL a aproximadamente 100 mg/dL antes de las comidas y menos de cerca de 140 mg/dL aproximadamente una o dos horas después de las comidas. En otro ejemplo aún en el contexto del tratamiento de la diabetes tipo 2, el nivel normal de la secreción de insulina es la cantidad necesaria para mantener un nivel normal de tolerancia a la glucosa, en donde el nivel de la secreción de insulina es mayor de cerca de 1 ng/mL aproximadamente quince horas después de las comidas. En una modalidad adicional, un nivel normal de glucosa en la sangre es de aproximadamente 70 mg/dl a 100 mg/dl para una prueba de azúcar en sangre en ayunas por la mañana.

En el contexto del nivel de glucosa en sangre, el término "restaurar" describe cambiar el nivel de glucosa en sangre de un sujeto a un nivel normal. Asimismo, en el contexto de tolerancia a la glucosa, el término "restaurar" describe cambiar la tolerancia a la glucosa de un sujeto a un nivel normal. Además, en el contexto de la secreción de insulina, "restaurar" describe cambiar la secreción de insulina de un sujeto a un nivel normal.

En el contexto de la apoA-IV no glicosilada, el término "fragmento biológicamente activo" describe un fragmento de apoA-IV no glicosilada, que es capaz de realizar un efecto biológico deseado en un sujeto con diabetes tipo 2. El término "biológicamente activo analógico" describe un análogo de la apoA-IV no glicosilada que es capaz de realizar un efecto biológico deseado en un sujeto con diabetes tipo 2. En un ejemplo, un efecto biológico es restablecer la tolerancia a la glucosa en ratones knockout apoA-IV como se describe en el ejemplo 2. Otro ejemplo de un efecto biológico deseado es causar una reducción estadísticamente significativa de los niveles de glucosa anormal en un modelo animal de diabetes tipo 2, tales como el modelo de ratón descrito en el ejemplo 7.

Como se utiliza en este documento, el término "obeso" describe una condición en donde un sujeto está muy por encima de un peso normal. En un ejemplo concreto, el término obeso describe una condición en la que un sujeto es más de cerca del 20% sobre su peso ideal y/o tiene un índice de masa corporal de cerca de treinta o más de cerca de treintena. En una modalidad, el sujeto a ser tratado es obeso; en otro modalidad, el sujeto a ser tratado no es obeso; y en otra modalidad aún, el sujeto siendo tratado tiene un peso corporal normal.

Las modalidades de la presente descripción se refieren a los métodos para tratar la diabetes tipo 2 en un sujeto en necesidad de los mismos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la diabetes tipo 2. En una modalidad, se describe un método para tratar la diabetes. En una modalidad particular, un método para tratar la diabetes tipo 2 en un sujeto en necesidad del mismo se describe, en donde el método comprende administrar una cantidad efectiva de apolipoproteína A-IV no glicosilada (en lo sucesivo "apoA-IV") o un análogo biológicamente activo o fragmento del mismo al sujeto.

En una modalidad, el método de tratamiento de diabetes tipo 2 es eficaz para bajar el nivel de glucosa en sangre de un sujeto. En una modalidad particular, el método es eficaz para bajar el nivel de glucosa en sangre de un sujeto por cerca de 20 a 50%. En una modalidad posterior, el método es eficaz para bajar el nivel de glucosa en sangre de un sujeto por cerca de 40%. En una modalidad posterior, el método es eficaz para bajar el nivel de glucosa en sangre de un sujeto por cerca de 70 %. En todavía una modalidad más, el método es eficaz para restaurar sustancialmente el nivel de glucosa en sangre a un nivel normal.

En una modalidad, el método de tratamiento de la diabetes tipo 2 resulta en un bajo nivel de glucosa en sangre de un sujeto. En una modalidad particular, el método es eficaz para bajar el nivel de glucosa en sangre de un sujeto en cerca de 1 mg/dl, 2 mg/dl, 3 mg/dl, 4 mg/dl, 5 mg/dl, 6 mg/dl, 7 mg/dl, 8 mg/dl, 9 mg/dl, 10 mg/dl, 11 mg/dl, 12 mg/dl, 13 mg/dl, 14 mg/dl, 15 mg/dl16 mg/dl, 17 mg/dl, 18 mg/dl, 19 mg/dl, 20 mg/dl, 40 mg/dl, 60 mg/dl, 80 mg/dl, 100 mg/dl, 120 mg/dl, 140 mg/dl, 160 mg/dl, 180 mg/dl, 200 mg/dl, 220 mg/dl o 240 mg/dl, desde un nivel básico a lo largo del intervalo de dosificación.

En otra modalidad, el método de tratamiento de la diabetes tipo 2 es eficaz para restaurar sustancialmente la tolerancia a la glucosa de un sujeto a un nivel normal. En una modalidad particular, el método es eficaz para restaurar sustancialmente la tolerancia a la glucosa de un sujeto a un nivel normal dentro de cerca de dos horas después de la administración de una dosis de apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo de la misma. En otra modalidad, el método es eficaz para restaurar sustancialmente la tolerancia a la glucosa de un sujeto a un nivel normal dentro de cerca de tres horas o dentro de cerca de cuatro horas después de la administración de una dosis de una apoA-IV o un análogo biológicamente activo del mismo. En otra modalidad, la tolerancia a la glucosa de un sujeto es restaurada sustancialmente a un nivel normal alrededor de ocho a doce horas.

En otra modalidad, el tratamiento es efectivo para restaurar sustancialmente la secreción de insulina a un nivel normal. En una modalidad particular, el tratamiento es efectiva para restaurar sustancialmente la secreción de insulina a un nivel normal dentro de cerca de dos horas después de la administración de una dosis de apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma. En otra modalidad, la secreción de insulina es restaurada sustancialmente a un nivel normal alrededor de ocho a doce horas. En otra modalidad, el tratamiento es eficaz para bajar el nivel de proteína reactiva-C.

En una modalidad, apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo de la misma es administrada sistémicamente. La administración sistémica de la apoA-IV no-glicosilada o el análogo de la misma es seleccionada del grupo formado por administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal.

En otra modalidad, una composición farmacéutica es descrita. En una modalidad particular, la composición farmacéutica comprende una apoA-IV no glicosilada o análogo biológicamente activo o fragmento de la misma. En otra modalidad, la apoA-IV no glicosilada o análogo de la misma está formulada para la administración a un sujeto para el tratamiento de la diabetes tipo 2. En esta modalidad particular, también se proporciona un método para tratar la diabetes tipo 2 en un sujeto en necesidad del mismo, en donde el método comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica al sujeto.

Una "apolipoproteína A-IV" se refiere a una apoA-IV de mamífero e incluye apoA-IV de longitud completa y fragmentos biológicamente activos de apoA-IV. La proteína humana integral apoA-IV es una proteína de aminoácido 376 (SEQ ID NO: 1), la secuencia de aminoácidos de los cuales se muestra en la figura 15 y el peso molecular de la cual es 43.4 kDa. La secuencia de aminoácidos de la proteína integral de ratón apoA-IV (SEQ ID NO. 2) se muestra en la figura 16. También incluido el término "apolipoproteína A-IV" es el conocido análogo en donde se añade una glicina a N-terminal de la apoA-IV de la secuencia humana de longitud completa (SEQ ID NO. 3, como se muestra en la figura 17) y análogos de la misma con sustituciones conservadoras para la glicina N-terminal (como alanina y valina). Una "apolipoproteína A-IV" también incluye formas polimórficas, incluyendo sustituciones T347S, Q360H o E165K a la secuencia humana representada por SEQ ID NO. 1 o las posiciones correspondientes de SEQ ID NO. 3. Como tal, "la apolipoproteína A-IV" incluye la proteína de SEQ ID NO. 4, se muestra en la figura 18. Además, la "apolipoproteína A-IV" humana incluye las variantes (SEQ ID NOs: 20-64) cada uno con una mutación con sentido erróneo: P393H, Q385K, Q381 K, Q380H, Q377P, T367S, S353A, N352Y, V336M, D335H, G311 R, V307L, R305C, R304Q, E291 G, V274M, V274A, R264Q, A260T, E250K, N235S, Q231 K, R220C, Q214H, E207K, T202M, R200C, D191 N, D184N, P181 L, A172T, R169W, A161 S, R154W, T148M, S147N, A139E, N127K, S95L, R90C, T85A, Q77H, G74S, V13M, o V6M, como se muestra a continuación en el cuadro 1. SEQ ID NOs: 20-65 incluyen la secuencia de señal. En una modalidad, los métodos y composiciones descritas aquí incluyen las formas maduras de las proteínas descritas en SEQ ID NOS: 20-65.

En una modalidad, los métodos y composiciones descritas aquí usan una proteína de ApoA-IV no glicosilada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de 1 , 3, 4, o 20-64 o un fragmento biológicamente activo de la misma. Alternativamente, los métodos y composiciones descritos aquí usan una proteína ApoA-IV no glicosilada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de 1 , 3, 4, o 20-64 o un fragmento biológicamente activo de la misma.

Un análogo biológicamente activo de apoA-IV tiene por lo menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a una apoA-IV. Como se describe en el párrafo anterior, una apoA-IV incluye apoA-IVde mamífero de longitud completa (por ejemplo, humano o mamífero) (humano se describe en SEQ ID NO: 1 ), formas polimórficas de la misma, la proteína de SEQ ID NOS. 3 y 4 y fragmentos biológicamente activos de cualquiera de las anteriores. Las variaciones de aminoácido en los análogos biológicamente activos preferiblemente tienen sustituciones conservadoras en relación con las secuencias de tipo salvaje. Una "sustitución conservadora" es la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene la misma carga electrónica neta y aproximadamente el mismo tamaño y forma. Los residuos de aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticos o alifáticos sustituidos tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbono y heteroátomos en sus cadenas laterales difiere por no más de cerca de cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramificaciones en sus cadenas laterales difiere por no más de uno. Los residuos de aminoácidos con grupos fenilo o fenilo sustituidos en sus cadenas laterales se consideran que tienen alrededor del mismo tamaño y forma. A continuación se enumeran cinco grupos de aminoácidos. La sustitución de un residuo de aminoácidoa con otro residuo de aminoácidoa del mismo grupo resulta en una sustitución conservadora: Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína y aminoácidos no naturales con cadenas Iateriaes alifáticas sustituidas C1-C4 alifática o C1-C4 hidroxilo (de cadena recta o mono ramificada).

Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos no naturales con cadenas Iateriaes alifáticas sustituidas C1-C4 con ácido carboxílico (no ramificado o un punto de ramificación).

Grupo III: lisina, ornitina, arginina y aminoácidos no naturales con cadenas laterales alifáticas sustituidas con amina o guanidina (no ramificado o un punto de ramificación).

Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos no naturales con cadenas laterales alifáticas C1-C4 sustituidas con amida (no ramificado o un punto de ramificación).

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptófano.

Una apoA-IV o un análogo biológicamente activo de la misma es preferentemente no glicosilada. La preparación de apoA-IV humana y de ratón no glicosilada recombinante se describe en el ejemplo 12. La secuencia de polinucleótido de apolipoproteína humana tipo salvaje de longitud completa (SEQ ID NO. 1 ) se muestra como SEQ ID NO. 5 en la figura 19.

ApoA-IV utilizada en los ejemplos 1 a 10 es no glicosilada. La apoA-IV no glicosilada puede ser preparada según métodos estándar conocidos en el campo de la biología molecular. Por ejemplo, se puede preparar apoA-IV no glicosilada mediante técnicas de clonación moleculares tradicionales.

En una modalidad, apoA-IV está preparada según los métodos descritos en Tubb et al. (2009) J of Lipid Res 50:1497, donde los autores expresan apoA-IV recombinante con una etiqueta de afinidad (etiqueta histidina (His)) de un sistema de expresión bacteriana, es decir, E. coli. Tubb et al. describen el uso del virus del grabado del tabaco de proteasa (TEV) como un medio para dividir la etiqueta His de la proteína apoA-IV. Así, la proteína apoA-IV se puede expresar en una célula hospedera recombinante, por ejemplo, Escherichia coli, utilizando una etiqueta His que está dividida por la proteasa TEV. Alternativamente, se puede expresar la proteína apoA-IV en una célula hospedera recombinante, por ejemplo, Escherichia coli, utilizando una etiqueta de glutationa S-transferasa (GST), que es dividida por la proteasa TEV. En una modalidad, la proteasa TEV se utiliza para dividir una etiqueta de afinidad de la proteína apoA-IV.

En una modalidad, un hospedero bacteriano puede utilizarse para producir apoA-IV no glicosilada. Ejemplos de los hospederos bacterianos incluyen, pero no son limitados a, E. coli BL-21 , BL-21 (DE3), BL21-AI™, BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE, BL21 Sta™ (DE3) y BL21 Star™ (DE3) pLysS, (Invitrogen). Corynebacterium también puede usarse como una célula hospedera para expresar apoA-IV. Antes de la transformación en el hospedero bacteriano, se puede incorporar el segmento de ADN de codificación de ApoA-IV o su análogo en cualquiera de los vectores de expresión adecuada para la transformación en el hospedero bacteriano. Los vectores de expresión convenientes incluyen vectores de plásmidos, vectores de cósmido y vectores fago conocidos por aquellos de experiencia en la técnica, por ejemplo, como se describe en Sambrook, et al., Molecular Cloning Manual, 2a edición, 1989. Ejemplos del vector de expresión incluyen vectores pET (Invitrogen), vectores de pDEST (Invitrogen), vectores de pRSET (Invitrogen) y el vector pJexpress (DNA2.0 Inc.). En una modalidad, E. Coli BL-21 (DE3) se transforma con el vector de expresión pET30 que contiene el gen que codifica la ApoA-IV.

Además de procariotas, microbios eucariotas tal como hongos filamentosos o levadura son hospederos adecuados de clonación o expresión de vectores de codificación de apoA-IV-. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común, se usa más comúnmente entre microorganismos eucariotas hospederos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas está comúnmente disponibles y útiles en el presente, como Schizosaccharomyces pombe; hospederos Kluyveromyces como, por ejemplo, K. lactis, K fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos como, por ejemplo, hospederos Aspergillus, Penicillium, Tolypocladium y Neurospora como A. nidulans y A. niger.

Las células hospederas adecuada para la expresión de apoA-IV también pueden derivarse de los organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrado y células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células hospederas de insecto permisivas correspondientes tal como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca) y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles al público, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV y esos virus pueden utilizarse como el virus en el presente documento según la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células de planta de algodón, maíz, patata, soya, petunia, tomate y tabaco también pueden ser utilizadas como anfitriones.

Otra célula hospedera adecuada para la producción de proteína apoA-IV es una célula de vertebrado. Ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero útiles incluyen, pero no se limitan a, línea de riñon de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (por ejemplo, 293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en el cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, por ejemplo, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), incluyendo, pero no limitado a CHO K1 , CHO pro3.sup.-, CHO DG44, CHO DUXB11 , Lec13, B-Ly1 y células CHO DP12, preferiblemente un CHO DUX (DHFR-) o subclón de los mismos (llamado aquí "CHO DUX"); células C127, células de ratón L; células LTK.sup.-; células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); Células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células del carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células del hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células del hígado humano (Hep G2, HB 8065); células de mieloma de ratón; NS0; células de hibridoma tales como células de hibridoma de ratón; células COS; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células hospederas son transformadas con los vectores de expresión o clonación para la producción de la proteína apoA-IV y cultivadas en medios nutritivos convencionales modificados como sea apropiado para inducir a promotores, transformantes de selección o amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas.

Los ratones knockout ApoA-IV usados en los ejemplos se generaron según los procedimientos descritos en J Lipid Res. 1997 Sep; 38(9): 1782-94, las enseñanzas enteras de las cuales se incorporan aquí por referencia.

También se incluyen en los métodos de la invención terapias de combinación para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Ejemplos de agentes terapéuticos adicionales que pueden utilizarse en combinación con apolipoproteína A-IV incluyen, pero no se limitan a, las sulfonilureas, meglitinidas, biguanidas, tiazolidinedionas, inhibidores de la alfa-glicosidasa, inhibidores de la DPP-4, miméticos de incretina e insulina.. Un agente terapéutico adicional pueda ser administrado antes de, concurrentemente con, o con posterior a la administración de apoA-IV al sujeto en necesidad del mismo.

La cantidad efectiva o apoA-IV administrada a un sujeto para el tratamiento de la diabetes tipo 2 puede, por ejemplo, ser una dosis basada en peso (por ejemplo, mg/kg) o, en otro ejemplo, ser una dosis fija (no dependiente del peso). En una modalidad, cerca de 1 a 10 mg/kg, cerca de 0.25 a 2 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, o 0.1 mg/kg a 25 mg/kg de apoA-IV se administra a un sujeto en necesidad de las misma. En otra modalidad, la cantidad efectiva de apoA-IV administrada a un sujeto en necesidad de la misma es una dosis fija de alrededor de 1 a 1000 mg. En una modalidad más, la cantidad efectiva es una dosis fija de apoA-IV administrada a un sujeto en necesidad de la misma, es de alrededor de 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, 20 mg, 21 mg, 22 mg, 23 mg, 24 mg, 25 mg, 26 mg, 27 mg, 28 mg, 29 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, mg 550 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg o 1000 mg.

En una modalidad particular, la composición farmacéutica además puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen una amplia gama de diluyentes conocidos (por ejemplo, solventes), rellenos, agentes de extensión, aglutinantes, agentes de suspensión, desintegradores, agentes tensoactivos, lubricantes, excipientes, agentes de humectación y lo similar comúnmente utilizado en este campo. La composición farmacéutica es preferiblemente acuosa, es decir, es una formulación líquida y preferentemente comprende de agua libre de pirógenos. Estos portadores pueden utilizarse solos o en combinación según la forma de la preparación farmacéutica. La preparación resultante puede incorporar, si fuera necesario, uno o más agentes de solubilización, reguladores de pH, conservantes, colorantes, perfumes, condimentos y similares que son ampliamente utilizados en el campo de la preparación farmacéutica.

La apoA-IV no glicosilada o análogo biológicamente activo de la misma puede formularse en una forma de dosificación seleccionada del grupo que consiste de tabletas, cápsulas, gránulos, pastillas, inyecciones, soluciones, emulsiones, suspensiones y jarabes. La vía de administración y forma para la composición farmacéutica no está limitada y pueden elegirse adecuadamente. Por ejemplo, tabletas, cápsulas, gránulos, pastillas, jarabes, soluciones, emulsiones y suspensiones pueden administrarse por vía oral. Además, las inyecciones (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal) pueden administrarse por vía intravenosa o por separado o en combinación con un reforzador convencional que contiene glucosa, aminoácidos y/o lo similar o puede ser individualmente administrada por vía intramuscular, intracutánea, por vía subcutánea y/o intraperitoneal.

La composición farmacéutica de la invención para el tratamiento de la diabetes tipo 2 puede ser preparada según un método conocido en el campo farmacéutico de este tipo usando un portador farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, formas orales tales como tabletas, cápsulas, gránulos, pastillas y similares están preparados según métodos conocidos utilizando excipientes como la sacarosa, lactosa, glucosa, almidón, manitol y similares; aglutinantes tales como jarabe, goma arábiga, sorbitol, tragacanto, metilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares; desintegradores como almidón, carboximetilcelulosa o la sal de calcio de los mismos, celulosa microcristalina, polietilenglicol y similares; lubricantes tales como talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, sílice y similares; y agentes humectantes como laurato de sodio, glicerol y similares.

Las inyecciones, soluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes y similares pueden estar preparados según un método conocido convenientemente usando solventes para disolver el ingrediente activo, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, glicol de propileno, 1 ,3-butilen glicol, polietilen glicol, aceite de sésamo y similares; agentes tensoactivos como ésteres de ácidos grasos de sorbitán, ésteres de ácidos grasos de polioxietilenosorbitán, ésteres de ácidos grasos polioxietilenosorbitán, polioxietileno de aceite de ricino hidrogenado, lecitina y similares; agentes de suspensión tales como derivados de la celulosa incluyendo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa y similares, gomas naturales incluyendo tragacanto, goma arábiga y similares; y conservantes como ésteres de ácido parahidroxibenzoico, cloruro de benzalconio, sales del ácido sórbico y similares.

La proporción del ingrediente activo contenido en la composición farmacéutica de la invención para tratar la diabetes tipo 2 puede ser adecuadamente seleccionada de una amplia gama.

En una modalidad particular, el sujeto que necesita de tratamiento de la diabetes tipo 2 es un mamífero. El mamífero puede seleccionarse del grupo formado por los seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, múridos, bovinos, equinos, porcinos y lagomorfos. En una modalidad específica, el mamífero es humano. En otra modalidad, apoA-IV no glicosilada o un análogo biológicamente activo de la misma pueda ser administrada a un sujeto para el tratamiento de la diabetes tipo 2 en donde el sujeto es obeso. Alternativamente, apoA-IV no glicosilada se puede administrar a un sujeto para el tratamiento de la diabetes tipo 2 en donde el sujeto no es obeso.

Haciendo referencia a la figura 1 , en otra modalidad, se describe un dispositivo 1. En una modalidad, el dispositivo 1 consta de un reservorio 10 de la composición farmacéutica anteriormente mencionada. En una modalidad posterior, el reservorio 10 consta de un vial 12. El vial 12 puede ser formado de cualquier material que no inhiba la función de la composición farmacéutica. Por ejemplo, el vial 12 puede componerse de vidrio y/o plástico. Además, el vial 12 puede comprender un septo perforable 14 a través del cual puede quitarse la composición farmacéutica. En uso, el septo 14 del vial es atravesado por la aguja 22 de una jeringa 20, la composición farmacéutica es quitada por la jeringa 20 del vial 12 y la composición farmacéutica se administra mediante inyección a un sujeto que lo necesita.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran los métodos de la presente descripción.

EJEMPLO 1 Intolerancia a la glucosa de ratones Knockout ApoA-IV Protocolo experimental Se obtuvieron ratones macho knockout ApoA-IV ("en lo sucesivo "KO"). Ratones tipo silvestre (en lo sucesivo "WT") sirvieron como controles. Los ratones KO ApoA-IV y WT se obtuvieron de una colonia en la Universidad de Cincinnati (Cincinnati, OH). Los ratones ApoA-IV KO y WT se alimentaron con una dieta de comida. Antes de realizar las pruebas de tolerancia a la glucosa, ratones KO ApoA-IV y ratones WT se mantuvieron en ayuno durante cinco horas. En las pruebas de tolerancia a la glucosa, los ratones KO apoA-IV y ratones WT se inyectaron por vía intraperitoneal con una dosis de aproximadamente 2 mg/g de peso corporal de la glucosa y glucosa en plasma se midió a aproximadamente 0, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la inyección de glucosa. Las pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron dos veces, una vez en tres meses de edad y otra vez en 16 meses de edad.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 2, ratones KO apoA-IV fueron intolerantes a la glucosa en comparación con los ratones WT. Específicamente, la figura 2 muestra que los niveles de glucosa del plasma en ratones WT fueron inferiores a los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV durante dos horas después de la inyección intraperitoneal con glucosa. Mientras no sea unida por la teoría, la implicación de estos estudios fue que apoA-IV es necesario para la homeostasis de la glucosa normal (al menos en los machos). Por otra parte, como se muestra en la figura 3, los ratones KO apoA-IV demostraron una intolerancia a la glucosa incrementada cuando se prueba en 16 meses de edad. Específicamente, la figura 3 muestra que los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV probados a dieciséis meses de edad fueron más altos que los niveles de glucosa del plasma en KO apoA-IV probados en tres meses de edad. Aunque no está unido por la teoría, la implicación de estos estudios fue que la tolerancia a la glucosa de ratones KO apoA-IV se agrava con la edad.

Experimento con ratones tipo silvestre hembra y Knockout ApoA- IV Ratones knockout y tipos silvestre Apo-IV hembras fueron sometidos a la misma prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal como fue utilizado para los ratones macho KO ApoA-IV y WT, tal como se describe anteriormente en este ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 1 1. Los ratones hembra -/-apo-A-IV-/-, cuando se desafían por vía intraperitoneal con glucosa, han aumentado los niveles de glucosa del plasma en comparación con los animales WT hembra, pero no hay ninguna diferencia estadística significativa. Por otro lado, los machos tienen una diferencia significativa entre los animales WT y KO.

EJEMPLO 2 Restauración de tolerancia a la glucosa en ratones Knockout ApoA-IV Protocolo experimental Al demostrar que ratones KO apoA-IV son intolerantes a la glucosa, se realizaron una serie de estudios exhaustivos para determinar si la administración de ratones KO apoA-IV a apoA-IV restauraría la tolerancia a la glucosa a un nivel normal. En concreto, se realizaron una serie de estudios para determinar no sólo la cantidad de apoA-IV a administrarse, sino también el tiempo óptimo para administrar apoA-IV antes de realizar pruebas de tolerancia a la glucosa.

Ratones machos KO ApoA-IV fueron inyectados por vía intraperitoneal con dosis de aproximadamente 0.25, 0.5, 1 y 2 pg/g en peso de apoA-IV. Ratones KO ApoA-IV también fueron inyectados intraperitonealmente con solución salina para servir como un control. Después de la inyección con apoA-IV de ratón o solución salina, se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa a los tres meses de edad previamente discutidos. Específicamente, pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas después de la inyección con solución salina o apoA-IV. Los resultados experimentales indicaron que el momento óptimo para restablecer la tolerancia a la glucosa en los ratones KO apoA-IV es administrar apoA-IV aproximadamente dos horas antes de realizar pruebas de tolerancia a la glucosa.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 4, la administración de apoA-IV a ratones KO apoA-IV restaura la tolerancia a la glucosa a un nivel normal. Específicamente, la figura 4 muestra que los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV inyectados apoA-IV fueron inferiores a los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV inyectados con solución salina. Por otra parte, como se muestra en la figura 4, los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV inyectados con apoA-IV fueron los más bajos en los ratones KO apoA-IV inyectados con la dosis más alta de apoA-IV; asimismo, los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV inyectados con apoA-IV fueron los más altos en los ratones KO apoA-IV inyectados con la dosis más baja de apoA-IV. En consecuencia, se descubrió que el grado de mejora de tolerancia a la glucosa es dependiente de la dosis de apoA-IV administrado, con dosis más altas, resultando en la tolerancia a la glucosa mejorada.

EJEMPLO 3 Especificidad de ApoA-IV en la restauración de tolerancia a la glucosa en ratones Knockout ApoA-IV Protocolo experimental Para evaluar la especificidad de apoA-IV, administramos apolipoproteína Al (en lo sucesivo "apoA-l") a los ratones KO apoA-IV. ApoA- I es una proteína hecha de las células epiteliales intestinales pequeñas que también producen apoA-IV. ApoA-l comparte muchas de las funciones de apoA-IV. Ratones KO ApoA-IV se inyectaron por vía intraperitoneal con una dosis de 1 g/g en peso de apoA-l. Ratones KO ApoA-IV también fueron inyectados intraperitonealmente con solución salina para servir como un control. Después de la inyección con apoA-l o solución salina, las pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron a los tres meses de edad como se discutió previamente. Específicamente, pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas después de la inyección con apoA-l o solución salina.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 5, la administración de apoA-l ratones KO apoA-IV falló al restaurar o mejorar la tolerancia a la glucosa.

EJEMPLO 4 Mecanismo de restauración de tolerancia a la glucosa en ratones Knockout ApoA-IV Protocolo experimental Para evaluar el mecanismo por el cual ApoA-IV mejora la tolerancia a la glucosa en los ratones KO apoA-IV, medimos la secreción de insulina inducida por glucosa en ratones KO apoA-IV. Más específicamente, medimos la secreción de insulina inducida por glucosa durante pruebas de tolerancia a la glucosa a los tres meses de edad previamente discutidos. En este estudio, ratones KO apoA-IV se inyectan por vía intraperitoneal con una dosis de aproximadamente 1 g/g por peso de apoA-IV de ratón dos horas antes de la realización de las pruebas de tolerancia a la glucosa. Ratones KO ApoA-IV fueron inyectados con solución salina aproximadamente dos horas antes de realizar pruebas de tolerancia a la glucosa para servir como un control.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 6, la secreción de insulina fase I estuvo ausente en los ratones KO apoA-IV inyectados con solución salina.

Sin embargo, como se muestra en la figura 6, la secreción de insulina fase I fue restaurada en ratones KO apoA-IV cuando apoA-IV se inyecta por vía intraperitoneal dos horas antes de realizar las pruebas de tolerancia a la glucosa.

EJEMPLO 5 Eficacia de ApoA-IV en ratones tipo silvestre y knockout Apo-IV en las dietas altas en grasas Protocolo experimental Ratones KO ApoA-IV y WT crónico fueron alimentados crónicamente con dietas experimentales nutricionalmente, semi-purificadas, altas en grasa (AIN-93 M) adquiridas en Dyets (Bethlehem, PA) durante 10 semanas. Las dietas altas en grasas contienen aproximadamente 20 g de grasa (es decir, aproximadamente 19 g de grasa de mantequilla y 1 g de aceite de soja para proporcionar ácidos grasos esenciales) por cada 100 gramos de dieta. Los ratones KO apoA-IV y WT se alojaron en jaulas con bañera individuales con lecho de mazorca de maíz en un vivero controlado a temperatura - (aproximadamente 22 ± 1 °C) y luz- (aproximadamente 12 h de luz/12 de oscuridad). Se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa a los tres meses de edad previamente se discutió. Antes de realizar las pruebas de tolerancia a la glucosa, ratones KO apoA-IV y ratones WT se mantuvieron en ayuno durante cinco horas. En las pruebas de tolerancia a la glucosa, los ratones KO apoA-IV y ratones WT fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis de aproximadamente 2 mg/g de peso corporal de glucosa.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 7, ratones KO apoA-IV muestran mayor intolerancia a la glucosa en relación con los ratones WT. Específicamente, la figura 7 muestra que los niveles de glucosa del plasma en ratones WT fueron inferiores a los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV durante dos horas después de la inyección intraperitoneal con glucosa.

EJEMPLO 6 Restauración de tolerancia a la glucosa en ratones de tipo silvestre y Knockout ApoA-IV en las dietas altas en grasas Protocolo experimental Una serie de estudios fueron realizados relacionados con la administración de apoA-IV a ratones KO apoA-IV y WT en dietas altas en grasas durante 14 semanas a tres meses de edad (20% en peso de la grasa, 19% de grasa de mantequilla y 1 % de aceite de cártamo). Específicamente, ratones KO apoA-IV y WT se inyectan por vía intraperitoneal con una dosis de aproximadamente 1 pg/g de peso corporal de apoA-IV de ratón. Los ratones KO ApoA-IV y WT también fueron inyectados intraperitonealmente con solución salina para servir como un control. Después de la inyección con apoA-IV o solución salina, se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa. Específicamente, pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron dos horas después de la inyección con solución salina o apoA-IV.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 8, la administración de apoA-IV en ratones KO apoA-IV mejora significativamente la tolerancia a la glucosa. Específicamente, la figura 8 muestra que los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV inyectados apoA-IV fueron inferiores a los niveles de glucosa del plasma en ratones KO apoA-IV inyectados con solución salina. [La frase anterior es redundante, puesto que la siguiente frase describe la misma cosa. Aunque los datos no se incluyen en este documento, se descubrió también que la administración de apoA-IV en ratones WT alimentados crónicamente una dieta alta en grasas también mejora significativamente la glucosa.

EJEMPLO 7 Restauración de tolerancia a la glucosa en ratones con diabetes tipo 2 Protocolo experimental Para confirmar que apoA-IV es efectivo en la promoción de la tolerancia a la glucosa en animales con diabetes tipo 2, ratones heterozigoticos KK Cg-A/J (en adelante "Cg-A/J") se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). Los ratones Cg-A/J desarrollan hiperglucemia, hiperinsulinemia, obesidad y la intolerancia a la glucosa por ocho semanas de edad. La principal causa de la diabetes en estos ratones es resistencia a la insulina producida por las interacciones poligénicas con la mutación Ay, que codifica la proteína relacionada con conejillos de indias y antagonistas del receptor de melanocortina-IV. Los ratones Cg-A/J fueron alimentados con dieta de comida. Adicionalmente, hubo un marcado aumento de glucosa en la sangre de diez a catorce semanas de alimentar la dieta de comida.

En catorce semanas de edad, los ratones Cg-A/J se administran en apoA-IV de ratón (aproximadamente 1 pg/g de peso corporal) o solución salina (para servir como control) vía la inyección intraperitoneal. La glucosa de plasma entonces se determinó en aproximadamente 0, 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 1 1 y 24 horas.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 9, apoA-IV tiene un efecto marcado en reducir el nivel de azúcar en la sangre de los ratones Cg-A/J en relación con el control de solución salina. Mientras que los ratones Cg-A/J se inyectaron con solución salina mantenida en un nivel de glucosa de plasma estable durante todo el período de 24 horas de estudio, los ratones Cg-A/J inyectados con apoA-IV experimentan una disminución de la glucosa en plasma durante más de 10 horas y, durante la mayor parte de este período, el nivel de glucosa en plasma es comparable a los animales C57BL/6J que hemos estado estudiando. De este estudio, podemos concluir que la administración de apoA-IV es efectiva para reducir la glucosa en plasma en ratones Cg-A/J.

EJEMPLO 8 Nivel de componente amiloide P de suero en KO ApoA-IV, KO ApoA-l y ratones WT Protocolo experimental Una serie de estudios se realizaron en relación con la determinación del nivel de componente de proteína A amiloide de suero (en lo sucesivo "SAP") en KO apoA-IV, KO apoA-l y ratones WT en dietas aterogénicas. El KO apoA-IV, KO apoA-l, y ratones WT se obtienen de la Universidad de Cincinnati. SAP es una forma de suero de componente amiloide P (en lo sucesivo "AP"), una primera proteína pentamérica de 25 kDa identificada como el constituyente pentagonal de depósitos patológicos en vivo llamado amiloide. SAP se comporta como proteína C reactiva en seres humanos. Específicamente, el nivel de plasma SAP en ratones KO apoA-IV, KO apoA-l, y WT se determinó en ratones KO apoA-IV, KO apoA-l y WT después de 12 semanas en una dieta aterogénica. Se determinó el nivel de plasma SAP mediante análisis de Western blot.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 10, el nivel de SAP en ratones KO apoA-IV (que corresponde a los números de ratón 1 , 8 y 10) aumentó en relación con el nivel de SAP en ratones KO apoA-l (correspondiente a los números del ratón 28, 29 y 30) y ratones WT (que corresponde a los números del ratón 19. 20 y 25).

Para los fines de describir y definir la presente descripción se observa que los términos "acerca de" y "substancialmente" son utilizados aquí para representar el grado inherente de incertidumbre que puede ser atribuida a cualquier comparación cuantitativa, valor, medida u otro tipo de representación. Los términos "acerca de" y "substancialmente" son utilizados también aquí para representar el grado por el cual una representación cuantitativa puede variar desde una referencia establecida sin ocasionar en un cambio en la función básica de la materia objeto en cuestión.

La descripción anterior y los dibujos son sólo para ser considerados ilustrativos de modalidades ejemplares, que alcanzan las características y ventajas de la presente descripción. Modificación y sustituciones de las características y pasos descritos pueden realizarse sin apartarse de la intención y alcance de la presente descripción. En consecuencia, la descripción no debe ser considerada como que es limitada por la anterior descripción y los dibujos, pero sólo está limitada por el alcance de las reivindicaciones anexadas.

EJEMPLO 9 ApoA-IV humano disminuye los niveles de glucosa en sangre en ratones tipo silvestre sometidos a la prueba de tolerancia de glucosa intraperitoneal Protocolo experimental Se realizan los estudios para determinar si la administración de apoA-IV humano a los ratones de tipo silvestre afectaría los niveles de glucosa en sangre en ratones sometidos a pruebas de tolerancia de glucosa.

Los ratones de tipo silvestre de tres meses de edad se inyectan por vía intraperitoneal con dosis de aproximadamente 1 pg/g en peso de apoA-IV humano. Como un control, otro grupo de ratones de tipo silvestre se inyecta por vía intraperitoneal con solución salina. Después de la inyección con una solución salina o apoA-IV humano, se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa. Específicamente, pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas después de la inyección con solución salina o apoA-IV y tras cinco horas de ayuno. Se colectó la sangre de cola y se medió por glucómetro.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 2, apoA-IV humano fue efectivo en la reducción de glucosa en sangre en ratones de tipo silvestre sometidos a pruebas de tolerancia de glucosa.

EJEMPLO 10 Efecto de ApoA-IV de ratón en ratones hembras tipo silvestre que se someten a pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal Protocolo experimental Se realizaron estudios para determinar si la administración de apoA-IV de ratón a ratones hembra tipo silvestre afectaría los niveles de glucosa en ratones sometidos a pruebas de tolerancia a la glucosa.

Ratones tipo silvestre hembra de tres meses de edad fueron inyectados intraperitonealmente con dosis de aproximadamente 1 pg/g en peso de apoA-IV de ratón. Como un control, otro grupo de ratones hembra tipo silvestre fueron inyectados por vía intraperitoneal con solución salina. Después de la inyección con una solución salina o apoA-IV humano, se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa. Específicamente, pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas después de la inyección con solución salina o apoA-IV y tras cinco horas de ayuno. Se colectó la sangre de cola y se medió por glucómetro.

Resultados experimentales Como se muestra en la figura 13, apoA-IV de ratón fue efectivo en la reducción de glucosa en sangre en ratones hembra tipo silvestre sometidos a pruebas de tolerancia a la glucosa.

EJEMPLO 11 ApoA-IV humano estimula la liberación de insulina en los islotes humanos Islotes humanos de alta pureza fueron proporcionados por la Universidad de Virginia, Axon Cells. Los islotes fueron cultivados en RPMI 1640, que contiene 10% de FBS y 1 1 mM de glucosa a 37°C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de C02 durante 48 horas. Cuatro grupos de islotes 50 IEQ entonces se pre-incubaron a 37°C durante 1 h en KRB regular (129 mM de NaCI, 4.8 mM de KCI, 2.5 mM de CaCI2, 1.2 mM MgS04, 1.2mM KH2P04, 5mM NaHC03, 10mM HEPES y 0.2% BSA)que contiene 3.0 mM de glucosa. Los islotes en los dos primeros grupos luego se incubaron en KRB regular que contiene 3.0 mM de glucosa durante una hora en la presencia o ausencia de 10pg/ml de A-IV humano y además se incubaron con 20 mM de glucosa por hora adicional en la presencia o ausencia de 10 pg/ml de A-IV humano. Los islotes en los dos últimos grupos se incubaron en 30mM KCI KRB (103.8 mM NaCI, 30mM KCI, 2.5mM CaCI2, 1.2 mM MgS04, 1.2mM KH2P04, 5mM NaHC03, 10mM HEPES y 0.2% BSA) más 250µp???/? de diazóxido que contiene 3.0 mM de glucosa durante una hora en la presencia o ausencia de lOpg/ml de A-IV humano y más se incubaron con 20mM de glucosa por hora adicional en la presencia o ausencia de 10pg/ml de A-IV humano. Los medios se colectaron al final de cada hora de incubación. Se midieron los niveles de insulina por el kit ELISA (Millipore).

Como puede observarse en la figura 14, cuando los islotes humanos fueron despolarizados de manera máxima por 30mM de KCI más 250µ? de diazóxido, 10 pg/ml de hA-IV muestra un significativo efecto estimulante sobre la secreción de insulina.

EJEMPLO 12 Preparación de ApoA-IV no qlicosilado ADNc de apoA-IV de ratón y humano fue contenido en un vector de mantenimiento pSP65, y un sitio de la restricción Afl III se diseñó inmediatamente 5' de la secuencia de codificación para la proteína de apoA-IV madura. El gen fue suprimido desde el vector de mantenimiento y ligado en el vector de expresión pET30. El constructo se transfectó en células E. Coli BL-21 (DE3) y se hacen crecer en cultivos Luria-Bertani complementadas con kanamicina (30 pg/ml) a 37°C. Después de la inducción de la síntesis de proteína apoA-IV en las células, las células fueron cosechadas y sonicadas. Proteína ApoA-IV del lisado se purificó por cromatografía de columna de afinidad de unión a His. La proteína resultante apoA-IV se diluyó hasta una concentración final de 1.0 mg/ml en solución salina.

EJEMPLO 13 Ausencia de N- y O-glicosilación en ApoA-IV humano Usando el servidor NetNGIyc 1.0 en www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface?jobid=netNglyc, 4F9C6AD203AFBD5C, apoA-IV humano y 45 variantes sustitutivas se analizaron in silico. Se proporcionan detalles sobre las variantes sin sentido en el cuadro 1. Los análisis de glicosilación enlazados a O- y N- se ejemplifican en las figuras 24A-24B y 25A-25B por apoA-IV nativo y una variante ejemplar, es decir, P393H. Los resultados muestran que apoA-IV humano y las variantes sustitutivas no poseen sitios de glicosilación N-enlazados o N-enlazados. En particular, las variantes descritas en el cuadro 1 (representadas por las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 20-64; SEQ ID NO 65 representa ApoAIV con la secuencia de señal) tienen perfiles de glicosilación idénticos a los presentados en las figuras 24 y 25. Estos resultados son inesperados a la vista de conocimiento común en la técnica, por ejemplo, Weinberg, et al., J Lipid Res. 1983, (24)1 :52-9, que apoA-IV es glicosilado por mañosa, galactosa, N-acetil glucosamina y ácido siálico.

Nota: el estado del filtro es pasar por todas las entradas del cuadro 1.

EJEMPLO 14 Optimización de ApoA-IV para la expresión bacteriana Para facilitar la expresión periplásmica de apoA-IV en E. coli, los constructos fueron preparados mediante varios péptidos de señal. Estos péptidos de señal (es decir, OmpA, PelB y ENX) cada una fueron fundidos al N-terminal de apoA-IV. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de cada secuencia de señal son proporcionadas como sigue: Péptido de señal OmpA M K K T A I A l A V A L A G F T A V A Q A (SEQIDNO:6) ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC (SEQ ID NO: 7) Péptido de señal PelB K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A M A (SEQ ID NO: 8) ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC (SEQ ID NO.9) Péptido de señal ENX F K F K K N F L V G L S A A L M S I S L F S A T A S A (SEQ ID NO: 10) ATG TTT AAG TTT AAA AAG AAT TTC TTA GTT GGA TTA TCG GCA GCT TTA ATG AGT ATT AGC TTG TTT TCG GCA ACC GCC TCT GCA (SEQ ID NO: 11 ) Para mejorar el rendimiento de la proteína en E. coli, se ha optimizado la utilización de codones para apoA-IV. La optimización se realizó utilizando el algoritmo de DNA2.0 (DNA2.0 Inc.) u otros algoritmos basados en datos experimentales y la capacidad de carga del ARNt (amino acetilación). La secuencia de codificación de apoA-IV con codones optimizados entonces fue fusionada en el extremo 5' al 3' de la secuencia de nucleótidos de un péptido de señal. Además, se puede enlazar la secuencia del codón optimizado en su extremo 3' a un codón finalizador doble. Los constructos con los codones optimizados y sitios de clonación son ejemplificadas en las figuras 20-23. Las secuencias de ADN optimizadas se describen en SEQ ID NOs: 13, 15, 17 y 19, con las secuencias resultantes del aminoácido expuestas en SEQ ID NOs: 12, 14, 16 y 18, respectivamente. En particular, las secuencias optimizadas (SEQ ID NOs: 12-19) también pueden ser utilizadas en los métodos y las composiciones de la invención.

Los constructos apoA-IV pueden sintetizarse por DNA2.0, Inc. y sub-clonarse en un vector pJexpress (por ejemplo, pJexpress401) utilizando los sitios de restricción Ndel-Xhol. Estos constructos se pueden transformar en la cepa de E. coli BL21 (Novagen) (F" OmpT r7scfSs rs"ms"J gal dcm) y clones que contienen estos constructos pueden seleccionarse con kanamicina. Un pre-cultivo en 125 mi de medio sYES que contiene kanamicina (por ejemplo, 50 pg/ml) puede ser inoculado a partir de una colonia aislada y se incubó a 37°C con agitación a 270 rpm durante unas 16 horas. Un cultivo fresco en 500 mi de medio YES conteniendo kanamicina puede ser inoculado con 10 mi del pre-cultivo y se incubó a 37°C con agitación a 270 rpm hasta que OD6oo llegue a 0.5 a 1 .0 (óptimo = 0.6). El cultivo resultante será entonces inducido con IPTG (por ejemplo, con una concentración final de 1 mM) y se incubó a 37°C durante 1 hora, 2 horas, 4 horas, o 22 horas.

La proteína ApoA-IV puede ser aislada de fracciones periplásmicas y citoplásmicas del cultivo preparado anteriormente. Más específicamente, el cultivo puede ser granulado. La pella de cultivo resultante puede suspenderse en regulador de pH TES hipertónico (20% de sacarosa) / OD6oo / mi y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la dilución en 4 volúmenes de agua purificada a 4°C. La suspensión diluida puede ser aún incubada además durante 10 minutos en el hielo y centrifugada durante 5 minutos a 13,000 rpm. El sobrenadante resultante es una fracción periplásmica (P) y la pella es la fracción citoplasmática. La expresión de apoA-IV puede ser analizada mediante análisis SDS-PAGE o Western. ApoA-IV en estas fracciones, entonces puede ser purificada por cromatografía convencional y/o afinidad y formulada para la entrega a los seres humanos para el tratamiento de diabetes tipo II.

Incorporación para Referencia Por la presente, el contenido de todas las referencias y las patentes citadas en este documento está incorporado por referencia en su totalidad.

Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar sin utilizar más que la experimentación de rutina, numerosos equivalentes a las modalidades específicas de la invención que se describe en el presente. Se pretende que dichos equivalentes sean abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para tratar la diabetes tipo 2 en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína apolipoproteína A-IV no glicosilada, o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma con al menos el 90% de identidad a la proteína apolipoproteína A-IV, tal que la diabetes mellitus tipo II es tratada en el sujeto, en donde la proteína apolipoproteína A-IV, o el análogo biológicamente activo o fragmento de la misma, se produce mediante un sistema de expresión de la proteína. 2. - Un método para reducir el nivel de glucosa en la sangre en un sujeto en necesidad de éste, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína apolipoproteína A-IV no glicosilada, o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma teniendo al menos un 90% de identidad a la proteína apolipoproteína A-IV, tal que se baja el nivel de glucosa en sangre del sujeto, en donde la proteína apolipoproteína A-IV, o el análogo biológicamente activo o fragmento de la misma, se produce utilizando un sistema de expresión de proteínas. 3. - Un método para restaurar substancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto en necesidad del mismo a un nivel normal, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína apolipoproteína A-IV no-glicosilada, o un análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, que tiene por lo menos 90% de la identidad a la proteína apolipoproteína A-IV, tal que se restablece la tolerancia a la glucosa del sujeto, en donde la proteína apolipoproteína A-IV, o el análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, se produce mediante un sistema de expresión de la proteína. 4 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV no glicosilada tiene al menos un 95% de identidad de la proteína apolipoproteína A-IV. 5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV no glicosilada tiene al menos un 99% de identidad de la proteína apolipoproteína A-IV. 6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque el sujeto es un humano. 7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos de la proteína apolipoproteína A-IV es XiEVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEV NTYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQ KIGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENAD SLQASLRPHADX2LKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAP YAQDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGN LRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQ KLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKX3LSLPELEQQQE QX4QEQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO. 4) en donde, es G, A, V o ausente; X2 es E o K; X3 es T o S; y X4 es Q o H, o un análogo o fragmento biológicamente activo de la misma. 8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV es una proteína apolipoproteína A-IV humana de longitud completa. 9 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque el aminoácido de la proteína apolipoproteína A-IV es EVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNT YAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKI GDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSL QASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQ DTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRG NTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLG PHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQ EQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO. 1), o un análogo o fragmento biológicamente activo de la misma. 10.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos de la proteína apolipoproteína A-IV es GEVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVN TYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQK IGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADS LQASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYA QDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLR GNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKL GPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQ QEQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO. 3), o un análogo o fragmento biológicamente activo de la misma. 1 1 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además por el uso de un sistema de expresión de proteína es un sistema de expresión bacteriana. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el sistema de expresión bacteriana es Escherichia coli. 13. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque el sistema de expresión de proteína se selecciona del grupo que consiste de un sistema de expresión de mamífero, un sistema de expresión de levadura, un sistema de expresión de baculovirus y un sistema de expresión libre de células. 14. - Un método para tratar la diabetes tipo 2 en un sujeto con la diabetes tipo 2 que comprende administrar al sujeto una proteína apoA-IV recombinante glicosilada, en donde la proteína apoA-IV consta de una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4, o 20-64 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad a cualquiera de SEQ ID NO: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la proteína apoA-IV comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4, o 20-64 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96% de identidad a cualquiera de SEQ ID NO: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la proteína apoA-IV comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4, o 20-64 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 97% de identidad a cualquiera de SEQ ID NO: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la proteína apoA-IV comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4, o 20-64 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad a cualquiera de SEQ ID NO: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV se administra sistémicamente. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la administración sistémica de la proteína apolipoproteína A-IV, o análogo biológicamente activo o fragmento de la misma, se selecciona del grupo que consiste de administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal. 20.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV o análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, se administra en una dosis de cerca de 1 a cerca de 10 pg/g. 21. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV o análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, se administra en una dosis de cerca de 0.25 a cerca de 2 pg/g. 22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV, o análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, se administra en una dosis de cerca de 1 pg/g. 23. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV, o análogo biológicamente activo o fragmento del mismo se administra una vez al día. 24. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV, o análogo biológicamente activo o fragmento del mismo se administra cerca de 2 veces por día. 25. - Una composición farmacéutica que comprende proteína apolipoproteína A-IV no glicosilada, o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma, que tiene por lo menos 90% de la identidad a la proteína apolipoproteína A-IV, en donde la proteína apolipoproteína A-IV, o el análogo biológicamente activo o fragmento, es producido mediante un sistema de expresión de proteínas. 26. - Una composición farmacéutica que comprende una proteína apolipoproteína A-IV no glicosilada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4, o 20-64 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 27. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la proteína apolipoproteína A- IV comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 96% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 28 - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la proteína apolipoproteína A-IV comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 97% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 29. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la proteína apolipoproteína A-IV comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 30. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la proteína apolipoproteína A-IV comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs: 1 , 3, 4 ó 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 31. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizada además porque comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. 32 - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , caracterizada además porque la composición farmacéutica es seleccionada del grupo que consiste de una formulación líquida, una formulación acuosa y una formulación liofilizada. 33 - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , caracterizada además porque la secuencia de aminoácidos de la proteína apolipoproteína A-IV es XiEVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEV NTYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQ KIGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENAD SLQASLRPHADX2LKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAP YAQDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGN LRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQ KLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKX3LSLPELEQQQE QX4QEQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO. 4) en donde, X1 es G, A, V o ausente; X2 es E o K; X3 es T o S; y X4 es Q o H, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 34- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , caracterizada además porque la proteína apolipoproteína A-IV es una proteína apolipoproteína A-IV humana de longitud completa. 35.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , caracterizada además porque el aminoácido de la proteína apolipoproteína A-IV es EVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNT YAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKI GDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSL QASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQ DTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRG NTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLG PHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQ EQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO. 1), o un fragmento biológicamente activo de la misma. 36. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , caracterizada además porque la secuencia de aminoácidos de la proteína apolipoproteína A-IV es GEVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVN TYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQK IGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADS LQASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYA QDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLR GNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKL GPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQ QEQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO. 3), o un fragmento biológicamente activo de la misma. 37. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , caracterizada además porque la apolipoproteína A-IV se produce usando un sistema de expresión de proteína que es un sistema de expresión bacteriana. 38. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque el sistema de expresión bacteriana es Escherichia coli. 39. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 31 , caracterizada además porque la apolipoproteína A-IV es producida mediante un sistema de expresión de proteínas que se selecciona del grupo que consiste de un sistema de expresión mamífera, un sistema de expresión de levadura, un sistema de expresión de baculovirus y un sistema de expresión libre de células. 40. - Un método para tratar la diabetes tipo 2 en un sujeto en necesidad del mismo, dicho método que comprende producir la proteína apolipoproteína A-IV, o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma, en un sistema de expresión de la proteína, y administrar la proteína apolipoproteína A-IV, o el análogo biológicamente activo o fragmento de la misma, a un sujeto con diabetes tipo 2, tal que la diabetes tipo 2 se trata, en donde la proteína apolipoproteína A-IV, o un análogo biológicamente activo o fragmento de la misma, es no glicosilada. 41. - El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el sistema de expresión de proteína es un sistema de expresión bacteriana. 42. - El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el sistema de expresión de la proteína es un sistema de expresión de células de mamífero o de levadura. 43. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV consta de una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1 , 3, 4 o 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma. 44.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, caracterizado además porque la proteína apolipoproteína A-IV comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 1 , 3, 4 o 20-64, o un fragmento biológicamente activo de la misma.