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MX2014002950A - Composiciones que comprenden enzimas con activiad de endo-1,4-beta-xilanasa y enzimas con actividad de endo-1,3(4)-beta glucanasa. - Google Patents

Composiciones que comprenden enzimas con activiad de endo-1,4-beta-xilanasa y enzimas con actividad de endo-1,3(4)-beta glucanasa.

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Publication number
MX2014002950A
MX2014002950A MX2014002950A MX2014002950A MX2014002950A MX 2014002950 A MX2014002950 A MX 2014002950A MX 2014002950 A MX2014002950 A MX 2014002950A MX 2014002950 A MX2014002950 A MX 2014002950A MX 2014002950 A MX2014002950 A MX 2014002950A
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MX
Mexico
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sec
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enzyme
activity
preparation
Prior art date
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MX2014002950A
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Inventor
Jens Frisbaek Sørensen
Lone Brønd Miller
Original Assignee
Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dupont Nutrition Biosci Aps filed Critical Dupont Nutrition Biosci Aps
Publication of MX2014002950A publication Critical patent/MX2014002950A/es
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Abstract

La presente invención se refiere a enzimas novedosas que tienen actividad de endo-1,4-beta-xilanasa y enzimas que tienen actividad de endo-1,3(4)- beta-glucanasa con propiedades mejoradas, y a composiciones que comprenden estas enzimas adecuadas para usar en la producción de un alimento, pienso, o bebida de malta, tal como en un proceso de destilación.

Description

COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN ENZIMAS CON ACTIVIDAD DE ENDO-1, 4-BETA-XILANASA Y ENZIMAS CON ACTIVIDAD DE ENDO-1, 3 (4) -BETA GLUCANASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a enzimas con propiedades mejoradas y a composiciones que comprenden estas enzimas adecuadas para usar en la producción de un alimento, bebida (por ejemplo, cerveza), pienso, o combustible biológico, tal como en un proceso de destilación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El uso de enzimas en la producción de cerveza se conoce bien. En la patente núm. WO 97/42302 se describe la aplicación de enzimas en la etapa de mezclado para mejorar la filtrabilidad de la mezcla y aumentar el rendimiento del extracto .
Las patentes núms . WO2005118769 y O2005059084 se refieren a una etapa de mezclado y filtrado en un proceso para la producción de cerveza, y a composiciones enzimáticas para usar en ese proceso.
La patente núm. WO1999057325 se refiere a cepas de Penicillium funiculosum, a nuevas mezclas de enzimas obtenidas de estas y secuencias nucleicas de estas.
Sin embargo, existe una necesidad de enzimas mejoradas, así como de una combinación de enzimas útiles para la Ref . :246275 producción de productos alimenticios y bebidas, tal como en las etapas de mezclado, cocción y filtrado en la producción de una bebida alcohólica, tal como cerveza o whisky.
SUMARIO DE LA INVENCION Un objeto de las modalidades de la invención es proporcionar enzimas adecuadas para la producción de productos alimenticios y bebidas, tal como en la producción de una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de cereales o malta, como cerveza o whisky. La enzimas que se proporcionan pueden tener propiedades mejoradas respecto al uso en la destilación. Estas amplias variedades de propiedades mejoradas comprenden, por ejemplo, óptimos de temperatura mejorados, relación mejorada en la actividad de sustratos de arabinoxilano solubles (WE-AX) a insolubles (WU-AX) , presión acumulada total reducida durante las etapas de separación de los residuos y/o filtrado de un proceso de destilación, así como una filtrabilidad aumentada del material tratado con enzimas.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION El (Los) presente (s) inventor (es) ha (n) encontrado que una o más enzimas, así como ciertas combinaciones de enzimas, tienen propiedades mejoradas con relación a enzimas y combinaciones de enzimas conocidas, particularmente, con relación al uso en un proceso de destilación, en donde el material que contiene almidón se trata con esa enzima o esas enzimas para producir una mezcla de destilación.
De esa manera, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una enzima que exhibe actividad de endo-1, 4^-xilanasa; la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera de las que se seleccionan de la sec. con núm. de ident. :1, la sec. con núm. de ident. :2, la sec. con núm. de ident. :3, la sec. con núm. de ident. :4, la sec. con núm. de ident. :5, la sec. con núm. de ident. :6, la sec. con núm. de ident. :17, y la sec. con núm. de ident. :18, o cualquier fragmento funcional de estas.
Como se usa en la presente descripción, el término "fragmento funcional" se refiere a una versión truncada de una enzima con, prácticamente, igual o por lo menos un grado significativo de actividad enzimática que la enzima de referencia no truncada.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una enzima que exhibe actividad de endo-1 , 3 (4 ) - ß-glucanasa,· la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera de las que se seleccionan de la sec. con núm. de ident . : 7 , la sec. con núm. de ident.: 8, la sec. con núm. de ident. :9, la sec. con núm. de ident. :10, y la sec. con núm. de ident. :11, la sec. con núm. de ident. :12, la sec. con núm. de ident. :13, la sec. con núm. de ident .: 14 , la sec. con núm. de ident.: 15, la sec. con núm. de ident. :16, o cualquier fragmento funcional de estas.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende una construcción de ADN, que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula que se ha transformado con una construcción de ADN, que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una preparación que comprende una enzima, o una construcción de ADN, o un vector, o una célula de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende una enzima que exhibe actividad de endo-1, 4- -xilanasa de conformidad con la invención, en combinación con una o más ß-glucanasas .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa de conformidad con la invención, en combinación con una o más xilanasas.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima de conformidad con la invención, o una preparación de conformidad con la invención, o una composición de conformidad con la invención, en la producción de un alimento, pienso, o bebida de malta, tal como cerveza o whisky .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima de conformidad con la invención, o una preparación de conformidad con la invención, o una composición de conformidad con la invención, en la producción de masa o productos horneados .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima de conformidad con la invención, o una preparación de conformidad con la invención, o una composición de conformidad con la invención, en la preparación de pulpa o papel .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima de conformidad con la invención, o una preparación de conformidad con la invención, o una composición de conformidad con la invención, para la preparación de componentes de cereales. En algunas modalidades, el cereal es centeno, trigo o cebada.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima de conformidad con la invención, o una preparación de conformidad con la invención, o una composición de conformidad con la invención, en la producción de cerveza o modificación de subproductos de un proceso de destilación .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima de conformidad con la invención, o una preparación de conformidad con la invención, o una composición de conformidad con la invención, en la producción de vino o jugo.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima de conformidad con la invención, o una preparación de conformidad con la invención, o una composición de conformidad con la invención, en la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para alterar la filtrabilidad de un material que comprende almidón; el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima, o una preparación, o una composición de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para reducir la presión acumulada durante la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación; el método comprende la etapa de tratar una mezcla de destilación con una enzima, o una preparación, o una composición de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la producción de un alimento, pienso, o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de cereales o malta, como cerveza o whisky; el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima, o una preparación, o una composición de conformidad con la invención .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la producción de una mezcla de destilación; el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima, o una preparación, o una composición de conformidad con la invención .
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol; el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima, o una preparación, o una composición de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un producto obtenido mediante un método de conformidad con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende el producto obtenido mediante un método de conformidad con la invención, como cuando el producto está en un intervalo de 0.1 %-99.9 %.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Perfil de mezclado usado en la destilación a escala de laboratorio y a escala piloto. El mezclado se inició con un período de mezclado de 10 minutos. Transcurrido ese período, se añadió la enzima.
Figura 2. Resultados de la aplicación durante la destilación a escala piloto a partir de la verificación de la detección de glucanasas y xilanasas. La B. sub glucanasa S combinada con las A. tub xilanasas se evaluaron en comparación con un testigo y con UltraFlo max. Los datos que se recogieron fueron el flujo promedio (1/h) , la presión acumulada total durante la separación de los residuos (mm WC, en donde 1 mm WC = 9.80665 Pa) , y la presión máxima registrada durante la separación de los residuos (mm WC) .
Figura 3. Funciones de la xilanasa en la destilación Figura 4. Flujo - separación de los residuos aplicando varios candidatos xilanasa Figura 5. Filtrado de la cerveza - promedio de filtraciones repetidas Figura 6: Filtrado de la cerveza - promedio de filtraciones repetidas Figura 7. Diagrama de mezclado del Ejemplo 3.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Tradicionalmente , se conoce a la cerveza como una bebida alcohólica que deriva de la malta, tal como una malta que deriva del grano de cebada y, opcionalmente, un adjunto, tal como un material vegetal que contiene almidón (por ejemplo, granos de cereales) y, opcionalmente, saborizado, por ejemplo, con lúpulo.
En el contexto de la presente invención, se entiende que el término "cerveza" comprende cualquier mosto fermentado, producido por la fermentación/destilación de un material vegetal que contiene almidón; por lo tanto, particularmente, además, la cerveza producida exclusivamente de adjunto, o cualquier combinación de malta y adjunto.
En el contexto de la presente invención, se entiende que el término "fermentación" se refiere a la producción de una sustancia, tal como etanol, mediante el crecimiento de microorganismos en un cultivo. Normalmente, se usan microorganismos, tal como la levadura, para la fermentación.
Tal como se usa en la presente descripción, se entiende que el término "malta" se refiere a cualquier grano de cereal malteado, tal como cebada malteada. Un "adjunto" puede definirse como cualquier material vegetal que contiene almidón, que no sea malta o malta de cebada.
El "material vegetal que contiene almidón" puede ser, por ejemplo, uno o más cereales, tales como cebada, trigo, maíz, centeno, sorgo, mijo, o arroz, y cualquier combinación de estos. El material vegetal que contiene almidón puede estar procesado, por ejemplo, molido, malteado, parcialmente malteado o no malteado. El cereal no malteado se denomina, además, "grano crudo". Los ejemplos de material vegetal que contiene almidón que no son cereales comprenden, por ejemplo, tubérculos, tales como las papas y la yuca.
Tal como se usa en la presente descripción, se entiende que el término "bebida (s)" incluye las bebidas fermentadas espumosas como la cerveza malteada completa, cerveza fermentada de acuerdo con la "Reinheitsgebot", cerveza inglesa ale, cerveza seca, bebida de cereal {near beer) , cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza baja en calorías, cerveza porter, cerveza negra, cerveza stout, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol, y lo similar. El término "bebida (s)" incluye, además, la cerveza no espumosa y las bebidas de malta alternativas, tales como las bebidas de malta saborizadas, por ejemplo, con sabor a cítricos, tales como las bebidas de malta con sabor a limón, naranja, lima, o bayas, las bebidas de malta con sabor a licor, por ejemplo, el licor de malta con sabor a vodka, ron, o tequila, o las bebidas de malta con sabor a café, tal como el licor de malta con sabor a cafeína, y lo similar.
La cerveza puede elaborarse a partir de una variedad de materiales vegetales que contienen almidón mediante, prácticamente, el mismo proceso, en donde el almidón consiste en, principalmente, homopolímeros de glucosa en los que los residuos de glucosa están unidos por enlaces alfa-1,4 o alfa-1,6, en donde predomina el primero.
Al proceso de elaboración de bebidas fermentadas, tal como la cerveza, normalmente, se le denomina destilación. Las materias primas tradicionales que se usan para la elaboración de esas bebidas son agua, lúpulo y malta. Además de la malta, o en lugar de esta, como una fuente de almidón pueden usarse adjuntos, como la polenta común, polenta refinada, levadura de cerveza molida, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarada, trigo, almidón de trigo, cereal tostado, copos de cereales, centeno, avena, papa, tapioca, y jarabes, tal como el jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertido, jarabe de cebada y/o trigo, y lo similar. Eventualmente , el almidón se convertirá enzimáticamente en azúcares fermentables .
Con respecto a las cervezas que, predominantemente, se elaboran de malta (por ejemplo, hasta 15-20 % de adjunto) , por una cantidad de razones, la malta que, fundamentalmente, se produce de variedades selectas de cebada, tiene el mayor efecto en el carácter y calidad total de la cerveza. En primer lugar, la malta es el principal aromatizante de la cerveza. Segundo, la malta proporciona la mayor parte del azúcar fermentable. Tercero, la malta proporciona las proteínas que contribuirán al cuerpo y el carácter de la espuma de la cerveza. Cuarto, la malta proporciona la actividad enzimática necesaria durante el mezclado.
Además, el lúpulo contribuye significativamente a la calidad de la cerveza, incluso al sabor. Particularmente, el lúpulo (o los constituyentes del lúpulo) agrega a la cerveza sustancias de sabor amargo convenientes. Además, el lúpulo actúa como precipitante de las proteínas, determina los agentes conservantes y contribuye a la formación y estabilización de la espuma. No todas las cervezas se elaboran con lúpulo. Además, pueden usarse otros agentes estabilizadores, tales como las proteasas (por ejemplo, papaína) .
Sin la intención que se interprete como limitante para la presente invención, se puede describir un proceso de destilación convencional de la siguiente manera: El proceso de elaboración de la cerveza es conocido en la industria pero, brevemente, incluye cinco etapas: (a) Mezclado y/o cocción del adjunto, (b) separación y extracción del mosto, (c) ebullición y precipitación del mosto, (d) enfriamiento, fermentación y almacenamiento, y (e) maduración, elaboración y envasado. Típicamente, en la primera etapa, la malta molida o machacada se mezcla con agua y durante un período de tiempo se mantiene a temperaturas controladas, para permitir que las enzimas presentes en la malta conviertan el almidón presente en la malta en azúcares fermentables .
En la segunda etapa, la malta remojada se transfiere a un "tanque de filtrado" o filtro para la mezcla en donde se separa el líquido del residuo de los granos. Este líquido dulce se llama "mosto", y el residuo de los granos sobrantes se llama "cereal ya procesado". Típicamente, la mezcla se somete a una extracción, que incluye agregar agua a la mezcla para recuperar el extracto soluble residual del cereal ya procesado.
En la tercera etapa, se hierve el mosto enérgicamente. Esto esteriliza el mosto y contribuye a desarrollar el color, sabor y olor. Se agrega el lúpulo en algún momento durante la ebullición .
En la cuarta etapa, el mosto se enfría y transfiere a un termentador, que contiene la levadura o al cual se agrega la levadura. La levadura convierte los azúcares en alcohol y gas carbónico por fermentación; al final de la fermentación, el termentador se enfría, o se puede enfriar el termentador para detener la fermentación. La levadura flocula y se retira.
En la última etapa, la cerveza se enfría y almacena por un período de tiempo, durante el cual la cerveza se clarifica y desarrolla su sabor, y cualquier material que pueda afectar la apariencia, el sabor y el tiempo de caducidad de la cerveza se sedimenta. Antes del embalaje, se realiza la carbonación de la cerveza y, opcionalmente , se filtra y pasteuriza .
Después de la fermentación, se obtiene una bebida que, normalmente, contiene de aproximadamente 2 % a aproximadamente 10 % de alcohol en peso. Los carbohidratos no fermentables no se convierten durante la fermentación, y forman la mayoría de los sólidos disueltos en la cerveza final .
Este residuo permanece debido a la incapacidad de las amilasas de la malta de hidrolizar los enlaces alfa-1,6 del almidón. Los carbohidratos no fermentables aportan aproximadamente 50 calorías por 12 onzas de cerveza.
Recientemente, ha habido una popularización generalizada de bebidas fermentadas denominadas cervezas ligeras, cervezas de calorías reducidas o cervezas baja en calorías, particularmente en el mercado de los Estados Unidos. Tal como se define en los Estados Unidos, estas cervezas tienen aproximadamente un 30 % menos de calorías que una cerveza "normal" del fabricante.
Puede encontrarse información adicional sobre los procesos de destilación convencionales, así como las definiciones de los términos usados en el campo de la tecnología cervecera que se aplican a la presente invención, en "Technology Brewing and Malting" por Wolfgang Kunze del Research and Teaching Institute of Brewing, Berlín (VLB), 2.° edición 1999 revisada, ISBN 3-921690-39-0, 3.° edición (2004): ISBN 3-921690-49-8, 4.° edición actualizada, 2010 (ISBN 978-3-921690-64-2) .
Las xilanasas se clasifican con el código EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.136 y EC 3.2.1.156.; su actividad puede determinarse, por ejemplo, como se describe en los ejemplos. Las xilanasasadecuadaspara usar en combinación con una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa de conformidad con la invención incluye cualquier xilanasa clasificada con los códigos EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.136 y EC 3.2.1.156, tal como cualquiera de las descritas en las patentes núms. O 2010072226, WO 2010072225, WO 2010072224, O 2005059084, WO2007056321, WO2008023060A, 09421785, WO2006114095, O2006066582 , US 2008233175, y W010059424.
La endo-l,4-beta-xilanasa se clasifica como EC 3.2.1.8.
La enzima causa la endohidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos.
Los términos "xilanasa de la familia 11", "familia 11 de glicósido hidrolasa (GH)" o simplemente "xilanasa de GH 11", como se usa en la presente descripción, se refieren a una endo-1, 4 -beta-xilanasa clasificada como EC 3.2.1.8, que causa la endohidrólisis de los enlaces 1 , 4 -beta-D-xilosídicos en xilanos, y que está clasificada como una xilanasa de la familia 11 de acuerdo con B. Henrissat, una clasificación de glicósido hidrolasas basada en las similitudes de la secuencia de aminoácidos. Biochem. J. 280 (1991), págs. 309-316.
Los términos "xilanasa de la familia 10", "familia 10 de glicósido hidrolasa (GH)", o simplemente "xilanasa de GH 10", comprenden las enzimas con una cantidad de actividades conocidas, tal como la xilanasa (EC : 3.2.1.8) ; endo-1, 3-beta- xilanasa (EC : 3.2.1.32 ) ; celobiohidrolasa (EC: 3.2.1.91) . Anteriormente, a estas enzimas se las conocía como la familia F de celulasa.
En algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1, 4^-xilanasa es una xilanasa de la familia 11. En algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1 , 4 - ß-xilanasa es una xilanasa de la familia 10.
En un aspecto, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de endo- 1 , -beta-xilanasa, como se determinó en el ensayo descrito en los ejemplos.
Se puede llevar a cabo un ensayo para medir la actividad de la xilanasa a pH 3.5 o pH 5 y 50 °C, mediante el uso de xilano como sustrato, o puede realizarse a valores de pH y temperatura diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas. La actividad enzimática se calcula a partir del aumento en la absorbancia causado por la xilosa a 540 nra por unidad de tiempo.
En algunas modalidades, la composición enzimática de conformidad con la invención comprende una actividad de la xilanasa de por lo menos aproximadamente 5000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 6000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 7000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 8000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 8500 U/g, como se determinó en el ensayo descrito en los ejemplos.
La composición enzimática de conformidad con la invención puede tener actividad celulolítica . La denominación sistemática de la celulosa es 4 - (1 , 3 ; 1 , 4 ) - ß-D-glucano 4-glucanohidrolasa, y las enzimas celulolíticas o celulasas se clasifican con el código EC 3.2.1.4. La celulasa endohidroliza los enlaces (1?4) -ß-D-glucosídicos en, por ejemplo, la celulosa, liquenina y ß-D-glucanos de cereales, y también hidroliza los enlaces 1,4 en ß-D-glucanos que contienen, además, enlaces 1,3. La celulasa tiene, además, otras denominaciones, tales como endo-1, 4^-D-glucanasa, ß-1, 4-glucanasa, ß-1 , 4-endoglucano hidrolasa, celulasa A, celulosin AP, endoglucanasa D, celulosa alcalina, celulasa A 3, celudextrinasa, celulasa 9.5, avicelasa, pancelasa SS y 1,4- (1,3,-1,4) - ß-D-glucano 4 -glucanohidrolasa .
En un aspecto de la invención, la actividad de la celulasa de la composición enzimática de conformidad con la invención se determina mediante el "Método de la actividad de la celulasa", como se describe bajo el título "Ensayos" a continuación .
En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a enzimas que tienen actividad de endo-1 , 3 (4) - -glucanasa, como se determina en el ensayo descrito en los ej emplos .
La "ß-glucanasa" o "beta-glucanasa", como se usa en la presente descripción, se refiere a una endo- 1 , 3 (4 ) -beta- glucanasa de EC 3.2.1.6. Se cataliza la endohidrólisis de los enlaces (l->3) o (l->4) en beta-D-glucanos , cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor se incluye en el enlace a hidrolizar, se sustituye a sí mismo en C-3. Las beta-glucanasas adecuadas para usar en combinación con una enzima que exhibe actividad de endo-1, - -xilanasa de conformidad con la invención, incluye cualquier beta-glucanasa que se describe en las patentes núms. WO2004087889, WO2005059084, W09414953, WO2007056321, W09531533, WO08023060, WO2005100582 , WO9828410, WO9742301, WO2006066582, WO05118769, WO2005003319, y WO10059424.
Se lleva a cabo el ensayo estándar a pH 5.0, y puede realizarse a valores de pH diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas.
Una unidad de actividad de endo-1, 3 (4) -ß -glucanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µp??? de equivalentes de glucosa por minuto, en las condiciones del ensayo (pH 5.0 (o como se especifique) y 50 °C) .
En algunas modalidades, la composición enzimática de conformidad con la invención comprende una actividad de ß-glucanasa de por lo menos aproximadamente 10000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 12000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 14000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 15000 U/g, tal como por lo menos aproximadamente 18000 U/g, como se determinó en el ensayo descrito en los ejemplos.
En aspectos adicionales, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de laminarinasa, o comprende una o más enzimas adicionales que tienen actividad de laminarinasa. La actividad de la laminarinasa se determina como se describe en el ensayo de la laminarinasa descrito en la sección Ensayos.
La laminarinasa puede ser una endo-1, 3 (4) -beta-glucanasa clasificada con el código E.C. 3.2.1.6 o glucano endo-1, 3-beta-D-glucosidasa clasificada con el código E.C. 3.2.1.39. La endo- 1 , 3 (4 ) -beta-glucanasa con las denominaciones alternativas laminarinasa, endo-1, 3 -beta-glucanasa, endo-1, 4-beta-glucanasa está clasificada con el código E.C. 3.2.1.6. Los sustratos incluyen laminarina, liquenina y D-glucanos de cereales, y la enzima cataliza la endohidrólisis de los enlaces (l->3) o (l->4) en beta-D-glucanos , cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor se incluye en el enlace a hidrolizar, se sustituye a sí mismo en C-3. La glucano endo-1 , 3 -beta-D-glucosidasa con las denominaciones alternativas (l->3) -beta-glucano endohidrolasa, endo-1 , 3 -beta-glucanasa y laminarinasa está clasificada con el código E.C. 3.2.1.39, e hidroliza los enlaces (l->3) -beta-D-glucosídicos en (l->3)-beta-D-glucanos en sustratos como por ejemplo, laminarina, paramilon y paquimano.
En algunos aspectos, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de arabinanasa, o comprende una enzima adicional que tiene actividad de arabinanasa. La arabinanasa está clasificada como EC 3.2.1.99. La denominación sistemática es 5 - -L-arabinano 5-OÍ-L-arabinanohidrolasa, pero tiene otras varias denominaciones, tales como arabinano endo- 1 , 5 -a-L-arabinosidasa, y endo-1,5-a-L-arabinanasa, endo-a-1, 5-arabanasa, endo-arabanasa, 1,5-a-L-arabinano y 1, 5-a-L-arábinanohidrolasa. La arabinasa endohidroliza los enlaces (1?5) - -arabinofuranosídicos en (1?5) -arabinanos. La arabinanasa actúa, además, en el arabinano.
En un aspecto de la invención, la actividad de la arabinasa de la composición enzimática de conformidad con la invención se determina con el ensayo de la arabinasa, como se describe bajo el título "Ensayos" a continuación. El ensayo se puede llevar a cabo a pH 3.5 y 50 °C, mediante el uso de arabinano de remolacha azucarera como sustrato, y puede realizarse a valores de pH y temperatura diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas. La actividad enzimática se calcula a partir del aumento en la absorbancia a 540 nm por unidad de tiempo.
Una unidad de actividad de arabinasa se define como la cantidad de enzima (normalizada para el volumen de ensayo total) que produce un aumento en ???5 0 nm.min"1 en las condiciones del ensayo (pH 3.5 y 50 °C) .
En algunos aspectos, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de beta-D- glucósido glucohidrolasa, o comprende una enzima adicional que tiene actividad de beta-D-glucósido glucohidrolasa. La beta-D-glucósido glucohidrolasa se refiere a enzimas de E.C 3.2.1.21.
En algunos aspectos, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de ß-xilosidasa, o comprende una enzima adicional que tiene actividad de ß-xilosidasa. La "ß-xilosidasa" o "xilano 1 , 4 -beta-xilosidasa" se refiere a enzimas de E.C 3.2.1.37. La ß-xilosidasa cataliza la hidrólisis de los ( 1- > ) -beta-D-xilanos , para retirar los residuos de D-xilosa sucesivos de las terminales no reductoras .
En algunos aspectos de la invención, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de celobiohidrolasa, o comprende una enzima adicional que tiene actividad de celobiohidrolasa. La "celobiohidrolasa" o "celulosa 1 , 4 -beta-celobiosidasa" se refiere a enzimas de EC 3.2.1.91. La celulosa 1 , 4 -beta-celobiosidasa cataliza la hidrólisis de los enlaces 1 , 4 -beta-D-glucosídicos en celulosa y celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas.
La actividad de la celobiohidrolasa de la composición enzimática de conformidad con la invención se determina con el ensayo de la celobiohidrolasa, como se describe bajo el título "Ensayos" a continuación. Se lleva a cabo el ensayo estándar a pH 5.0, y puede realizarse a valores de pH diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas.
Una unidad de actividad de celobiohidrolasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 umol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenilo ß-D-celobiopiranosida por minuto, en las condiciones del ensayo (pH 5.0 (o como se especifique) y 50 °C) .
En algunos aspectos, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de a-N-arabinofuranosidasa , o comprende una enzima adicional que tiene actividad de arabinofuranosidasa . La "a-N-arabinofuranosidasa" o "alfa-N-arabinofuranosidasa" se refiere a enzimas de EC 3.2.1.55. La a-?-arabinofuranosidasa cataliza la hidrólisis de los residuos de alfa-L-arabinofuranosida de la terminal no reductora en alfa-L- arabinosidas .
En un aspecto de la invención, la actividad de la arabinofuranosidasa de la composición enzimática de conformidad con la invención se determina con el ensayo de la arabinofuranosidasa, como se describe bajo el título "Ensayos" a continuación. El ensayo estándar puede llevarse a cabo a pH 5.0 y 50 °C, y puede realizarse a valores de pH y temperatura diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas.
Una unidad de actividad de a-?-arabinofuranosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 umol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenilo a-L-arabinofuranosida por minuto, en las condiciones del ensayo (pH 5.0 y 50 °C (o como se especifique) ) .
En algunos aspectos, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de glucano 1,4-beta-glucosidasa, o comprende una enzima adicional que tiene actividad de glucano 1 , 4 -beta-glucosidasa . La "glucano 1,4-beta-glucosidasa" o "glucano 1 , 4 -beta-glucosidasa" se refiere a enzimas de E.C3.2.1.74. La glucano 1 , 4 -beta-glucosidasa cataliza la hidrólisis de los enlaces (l->4) en (l->4)-beta-D-glucanos, para retirar las unidades de glucosa sucesivas.
En algunos aspectos, la composición enzimática de conformidad con la invención tiene actividad de exo-beta-1 , 4-glucanasa específica del xiloglucano, o comprende una enzima adicional que tiene actividad de exo-beta-1 , 4 -glucanasa específica del xiloglucano. La "exo-beta-1 , 4 -glucanasa específica del xiloglucano" se refiere a enzimas de E . C3.2.1.155. La exo-beta- 1 , 4-glucanasa específica del xiloglucano cataliza la hidrólisis de los enlaces (l->4)-beta-D-glucosídicos en xiloglucano.
Las enzimas y las composiciones enzimáticas de conformidad con los aspectos del procedimiento, pueden usarse en un proceso que comprende reducir la viscosidad de una solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón.
Las enzimas y las composiciones enzimáticas pueden usarse, además, en un proceso que comprende el filtrado de una solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón. En algunas modalidades, la solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón es una mezcla para la elaboración de cerveza, y en otras modalidades, la solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón es una composición alimenticia .
Alternativamente, la composición enzimática de conformidad con la presente invención puede usarse en la producción de jugo de frutas, vino, procesamiento de granos, alcohol combustible, combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol, y alcohol potable.
En algunas modalidades, el combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol, se produce a partir de productos base agrícolas, tal como la caña de azúcar, papa, maíz, trigo, sorgo, etc., o a partir de material celulósico, tal como el forraje de maíz, pasto varilla u otro material vegetal. En ambos casos se extraen azúcares fermentables de la materia prima y se fermentan con microorganismos en alcohol, el que se destila y puede usarse como combustible de transporte. La composición enzimática de conformidad con la presente invención puede usarse en esta producción de combustible biológico. Puede añadirse el complejo de enzimas para mejorar la extracción de polisacáridos de la materia prima, para ayudar a degradar los polisacáridos a azúcares fermentables y/o para mejorar los parámetros de procesamiento, tal como la separación de líquidos de sólidos, características de flujo y bombeo.
El proceso de la invención puede aplicarse en el mezclado de cualquier molienda. De conformidad con la invención, la molienda puede comprender cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar que deriva de cualquier planta y parte de planta, que incluye tubérculos, raíces, tallos, hojas y semillas.
En algunas modalidades, la molienda comprende granos, tales como los granos de cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, milo, mijo y sorgo y, con mayor preferencia, por lo menos 10 % o, con mayor preferencia, por lo menos 15 %, todavía con mayor preferencia, por lo menos 25 % o, con la máxima preferencia, por lo menos 35 %, tal como por lo menos 50 %, por lo menos 75 %, por lo menos 90 %, o aún 100 % (p/p) de la molienda del mosto deriva de los granos.
En algunas modalidades, la molienda comprende granos malteados, tal como la malta de cebada. Preferentemente, por lo menos 10 % o, con mayor preferencia, por lo menos 15 %, todavía con mayor preferencia, por lo menos 25 % o, con la máxima preferencia, por lo menos 35 %, tal como por lo menos 50 %, por lo menos 75 %, por lo menos 90 %, o aún 100 % (p/p) de la molienda del mosto deriva de los granos malteados.
El término "mezcla" se comprende como una suspensión de almidón acuosa, por ejemplo, que comprende malta de cebada machacada , cebada machacada , y/u otro adj unto o una combinación de estos , mezclados luego con agua para separarlos en mosto + cereales ya procesados .
El término "separación de la mezcla" se comprende como la separación del mosto de los cereales ya procesados, como mediante la separación de los residuos o filtrado de la mezcla .
El término "filtrado de la cerveza" se comprende como un proceso de separación en el que se retiran las células de levadura y otros materiales que ocasionan turbiedad aún presentes en la cerveza, como mediante microf iltración o procesos de membrana .
La preparación enz imát ica , tal como en forma de un ingrediente alimenticio preparado de conformidad con la presente invención, puede estar en forma de una solución o como un sólido - dependiendo del uso, y/o el modo de aplicación, y/o el modo de administración. La forma sólida puede estar como un polvo enzimático seco o como una enzima granulada.
En un aspecto, la invención proporciona una preparación de la composición de enzimas que comprende la enzima o composición enzimática de conformidad con la invención, un portador enzimático y, opcionalmente , un estabilizador y/o un conservante .
En aún un aspecto adic ional de la invención , el portador enzimático se selecciona del grupo que consiste en gl icerol o agua .
En un aspecto adicional , la preparación comprende un estabi l i zador . En un aspecto , el estabilizador se selecciona del grupo que consiste en sales inorgánicas, polioles, azúcares y combinaciones de estos. En un aspecto, el estabilizador es una sal inorgánica, tal como cloruro de potasio. En otro aspecto, el poliol es glicerol, propilenglicol , o sorbitol . En aún otro aspecto, el azúcar es un carbohidrato de molécula pequeña, particularmente, cualquiera de los varios de sabor dulce, tal como la glucosa, fructosa y sacarosa.
En aún un aspecto adicional, la preparación comprende un conservante. En un aspecto, el conservante es metilparabeno, propilparabeno, benzoato, sorbato u otro conservante aprobado para alimentos, o una mezcla de estos.
Modalidades específicas de la invención En algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1, 4^-xilanasa, opcionalmente , en combinación con una o más ß-glucanasas de conformidad con la presente invención, mantiene una viscosidad significativamente reducida en las aplicaciones durante la destilación, lo que facilita una mezcla mejorada y separación de la cerveza.
Las características de xilanasa deseadas para las aplicaciones durante la destilación pueden incluir uno o más de los siguientes aspectos: a) Especificidad del sustrato de la enzima o la relación WE-AX/WU-AX tiene un impacto en la viscosidad. En algunas modalidades, esta relación es menor que aproximadamente 7.0, tal como menor que aproximadamente 6.5, tal como menor que aproximadamente 6.0, tal como menor que aproximadamente 5.5, tal como menor que aproximadamente 5.0, tal como menor que aproximadamente 4.5. b) Selectividad del sustrato de la enzima o qué tan cerca de los puntos de ramificación se cree que los cortes de la(s) enzim (s) tiene (n) un impacto en la funcionalidad. c) Termoestabilidad de la enzima o la solubilización continua de AX durante el mezclado -termoestabilidad, es una característica clave. Por consiguiente, en algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1, 4^-xilanasa de conformidad con la presente invención es termoestable dentro de un intervalo de temperatura de 65-78 °C. d) pH óptimo de la enzima. Por consiguiente, en algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1, 4 -ß-xilanasa tiene un pH óptimo en el intervalo de pH 5.4 - 5.6. e) Inhibición de la enzima (por ejemplo, factor clave conocido para xilanasas) La viscosidad significativamente reducida en las aplicaciones durante la destilación puede determinarse como una viscosidad reducida en la aplicación durante la destilación, en comparación con un control con una enzima conocida o una combinación de actividades enzimáticas, tal como Ultraflo® Max, usado en iguales condiciones y cantidades .
En algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1, 4- -xilanasa de conformidad con la presente invención, opcionalmente , en combinación con una o más ß-glucanasas de conformidad con la presente invención, proporciona una mezcla y separación de la cerveza mejoradas en las aplicaciones durante la destilación.
En algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1, 4^-xilanasa de conformidad con la presente invención, opcionalmente, en combinación con una o más ß-glucanasas de conformidad con la presente invención, proporciona una posibilidad baja de formación de mal sabor, tal como el mal sabor relacionado con la descomposición del arabinoxilano .
En algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo-1 , 4- ß-xilanasa de conformidad con la presente invención, opcionalmente, en combinación con una o más ß-glucanasas de conformidad con la presente invención, proporciona un riesgo menor de colapso del lecho filtrante, tal como en la separación de los residuos.
En algunas modalidades, la enzima que exhibe actividad de endo- 1 , 4 - ß-xilanasa de conformidad con la presente invención, opcionalmente, en combinación con una o más ß-glucanasas de conformidad con la presente invención, proporciona una reducción de la posibilidad de mal sabor y/o una reducción de la formación de mal sabor. Un aspecto de la invención se refiere a una enzima que exhibe actividad de endo-1, - ß-xilanasa ; la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera de las que se seleccionan de la sec. con núm. de ident.:l, sec. con núm. de ident . : 2 ( sec. con núm. de ident.:3, sec. con núm. de ident . : 4 , sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident . : 6 , sec. con núm. de ident. :17, y sec. con núm. de ident. :18, o cualquier fragmento funcional de estas.
Otro aspecto se refiere a una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa; la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera de las que se seleccionan de la sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 8, sec. con núm. de ident. :9, sec. con núm. de ident. :10, y sec. con núm. de ident. :11, sec. con núm. de ident. :12, sec. con núm. de ident. :13, sec. con núm. de ident. :14, sec. con núm. de ident. :15, sec. con núm. de ident. :16, o cualquier fragmento funcional de estas.
En algunas modalidades de la invención, la enzima que exhibe actividad de endo-1, 4- ß-xilanasa tiene una relación en actividad de sustrato de arabinoxilano soluble (WE-AX) a sustrato de arabinoxilano insoluble ( U-AX) menor que aproximadamente 7.0, tal como menor que aproximadamente 6.5, tal como menor que aproximadamente 6.0, tal como menor que aproximadamente 5.5, tal como menor que aproximadamente 5.0, tal como menor que aproximadamente 4.5.
En algunas modalidades, la enzima de conformidad con la invención tiene un óptimo de temperatura en el intervalo de 40-70 °C, tal como en el intervalo de 45-65 °C, tal como en el intervalo de 50-65 °C, tal como en el intervalo de 55-65 °C.
En algunas modalidades, la enzima de conformidad con la invención tiene por lo menos 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con cualquier secuencia de aminoácidos que se selecciona de las sec. con núms . de ident . : 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas.
En algunas modalidades, la enzima de conformidad con la invención tiene una cantidad total de aminoácidos menor que 350, tal como menor que 340, tal como menor que 330, tal como menor que 320, tal como menor que 310, tal como menor que 300 aminoácidos, tal como en el intervalo de 200 a 350, tal como en el intervalo de 220 a 345 aminoácidos.
En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de la enzima de conformidad con la invención tiene por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos, en comparación con cualquier secuencia de aminoácidos que se selecciona de las sec . con núms . de ident . : 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas.
En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de la enzima de conformidad con la invención tiene un máximo de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos, en comparación con cualquier secuencia de aminoácidos que se selecciona de las sec. con núms. de ident.: 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas.
En algunas modalidades, la enzima de conformidad con la invención comprende la secuencia de aminoácidos identificada mediante cualquiera de las sec. con núms. de ident. : 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas.
En algunas modalidades, la enzima de conformidad con la invención consiste en la secuencia de aminoácidos identificada mediante cualquiera de las sec. con núms. de ident.: 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas.
Un aspecto importante adicional de la invención se refiere a una composición que comprende una enzima que exhibe actividad de endo- 1 , 4 - ß -xilanasa de conformidad con la invención, en combinación con una o más ß-glucanasas . En algunas modalidades, esta o más ß-glucanasas son de conformidad con la invención.
Un aspecto importante adicional de la invención es una composición que comprende una enzima que exhibe actividad de endo-1 , 3 (4) - ß-glucanasa de conformidad con la invención, en combinación con una o más xilanasas. En algunas modalidades, esta o más xilanasas son una enzima que exhibe actividad de endo-1 , 4 - ß-xilanasa de conformidad con la invención. En algunas modalidades, esta o más xilanasas son una enzima de conformidad con la sec . con núm. de ident.:17 y/o la sec. con núm. de ident.:18, o cualquier fragmento funcional de estas.
En algunas modalidades, la combinación de una enzima que exhibe actividad de endo-1, 4-p-xilanasa con una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) - ß-glucanasa es de conformidad con la siguiente tabla: Se debe comprender que cualquiera de las combinaciones anteriores de una 1.° enzima, que es una enzima que exhibe actividad de endo-1, 4- ß-xilanasa, puede combinarse con una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) - ß-glucanasa, con una relación entre las dos enzimas de 1:10, 2:10, 3:10, 4:10, 5:10, 6:10, 7:10, 8:10, 9:10, 10:10, 10:9, 10:8, 10:7, 10:6, 10:5, 10:4, 10:3, 10:2, o 10:1, tal como dentro del intervalo de 1:10-10:1, tal como 2:10-10:2, tal como 3:10-10:3, tal como 4:10-10:4, tal como 5:10-10:5, tal como 6:10-10:6, tal como 7:10-10:7, tal como 8:10-10:8, o dentro de 9:10-10:9.
En algunas modalidades, la composición de conformidad con la invención comprende una combinación de por lo menos dos enzimas; esas dos enzimas, o dos enzimas con una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad de secuencia con la respectiva identidad de secuencia, o cualquier fragmento funcional de estas, se seleccionan de la lista que consiste en la sec . con núm . de ident . : 1 y la sec . con núm . de ident . :7; la sec . con núm. de ident . : 2 y la sec . con núm. de ident . :7; la sec . con núm. de ident . :3 y la sec . con núm. de ident . :7; la sec . con núm . de ident . :4 y la sec . con núm. de ident . :7; la sec . con núm. de ident . : 5 y la sec . con núm. de ident . :7; la sec . con núm . de ident . : 6 y la sec . con núm . de ident . :7; la sec . con núm . de ident . : 11 y la sec . con núm de ident . :7; la sec . con núm . de ident . : 18 y la sec . con núm de ident • :7; la sec . con núm . de ident . : 1 y la sec . con núm . de ident . :8; la sec . con núm . de ident . : 2 y la sec . con núm . de ident . :8; la sec . con núm . de ident . : 3 y la sec . con núm. de ident . :8; la sec . con núm . de ident . :4 y la sec . con núm. de ident . :8; sec . con núm. de ident. : 5 y la sec. con núm. de ident. :8 sec . con núm. de ident.: 6 y la sec. con núm. de ident .: 8 sec. con núm. de ident. :17 y la sec. con núm. de ident : 8 sec. con núm. de ident. :18 y la sec. con núm. de ident : 8 sec. con núm. de ident. : 1 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident. :6 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident. :17 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident.: 18 y la sec. con núm. de ident : 9 sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident:10 sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident:10 sec. con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident:10 sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident:10 sec. con núm. de ident. : 5 y la sec. con núm. de ident: 10 sec. con núm. de ident. :6 y la sec. con núm. de ident:10 sec. con núm. de ident. :17 y la sec. con núm. de ident:10 sec. con núm. de ident. :18 y la sec. con núm. de ident:10 sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident:ll sec. con núm. de ident. : 2 y la sec. con núm. de ident : 11 sec. con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident:ll sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident : 11 sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident : 11 sec . con núm. de ident. : 6 y la sec . con núm. de ident: 11; sec . con núm. de ident.: 17 y la sec. con núm. de ident: 11 sec. con núm. de ident. :18 y la sec. con núm. de ident:ll sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident : 12 sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident : 12 sec. con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident:12 sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident:12 sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident:12 sec. con núm. de ident. :6 y la sec. con núm. de ident:12 sec. con núm. de ident. : 17 y la sec. con núm. de ident: 12 sec. con núm. de ident. :18 y la sec. con núm. de ident: 12 sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident : 13 sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident : 13 sec. con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident:13 sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident:13 sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident : 13 sec. con núm. de ident. :6 y la sec. con núm. de ident : 13 sec. con núm. de ident. :17 y la sec. con núm. de ident : 13 sec. con núm. de ident. :18 y la sec. con núm. de ident:13 sec. con núm. de ident. : 1 y la sec. con núm. de ident : 14 sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident : 14 sec. con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident : 14 sec. con núm. de ident.: 4 y la sec. con núm. de ident -.14 sec. con núm. de ident.: 5 y la sec. con núm. de ident : 14 sec. con núm. de ident. : 6 y la sec. con núm. de ident: 14 la sec . con núm. de ident . : 17 y la sec .. con núm . de ident :14; la sec . con núm. de ident . : 18 y la sec . . con núm . de ident :14; la sec . con núm . de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident : 15; la sec . con núm . de ident . : 2 y la sec . con núm. de ident : 15; la sec . con núm. de ident . : 3 y la sec . con núm. de ident : 15; la sec . con núm . de ident . :4 y la sec . con núm. de ident : 15; la sec . con núm . de ident . : 5 y la sec . con núm. de ident : 15; la sec . con núm . de ident . :6 y la sec . con núm. de ident : 15; la sec . con núm. de ident . :17 ; / la sec . . con núm . de ident :15; la sec . con núm. de ident . :18 y la sec , . con núm . de ident :15; la sec . con núm. de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident : 16; la sec . con núm . de ident . :2 y la sec . con núm . de ident : 16; la sec . con núm . de ident . :3 y la sec. con núm. de ident :16; la sec. con núm. de ident.:4 y la sec. con núm. de ident: 16; la sec. con núm. de ident.: 5 y la sec. con núm. de ident :16; la sec. con núm. de ident.: 6 y la sec. con núm. de ident:16; la sec. con núm. de ident. :17 y la sec. con nm. de ident:16; y la sec. con núm. de ident. :18 y la sec. con núm. de ident: 16.
En algunas modalidades, la actividad de endo- 1 , 3 (4 ) - ß-glucanasa y la actividad de endo-1, 4-p-xilanasa derivan de por lo menos dos enzimas diferentes, tal como por lo menos dos enzimas diferentes de dos especies diferentes.
En algunas modalidades, la presión acumulada total se reduce a un valor menor que 470 mm WC, tal como menor que 450 mm WC, tal como menor que 430 mm WC, tal como menor que 410 mm WC, tal como menor que 390 mm WC, tal como menor que 370 mm WC, tal como menor que 350 mm WC, tal como menor que 330 mm WC, tal como menor que 310 mm WC, tal como menor que 300 mm WC, tal como menor que 290 mm WC, cuando la composición de conformidad con la presente invención se usa antes de la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación.
En algunas modalidades, la presión acumulada total se reduce en por lo menos 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 o 95 %, en comparación con el uso de un control negativo sin la composición; cuando se usa antes de la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación.
En algunas modalidades, la filtrabilidad del mosto según lo determinado por el volumen de mosto recogido después de 5 minutos de filtración con relación al control sin enzimas, se incrementa por encima de 1.5, tal como por encima de 1.6, tal como por encima de 1.7, tal como por encima de 1.8, tal como por encima de 1.9, tal como por encima de 2.0, tal como por encima de 2.1, tal como por encima de 2.2, tal como por encima de 2.3, tal como por encima de 2.4, tal como por encima de 2.5, cuando la composición de conformidad con la invención se usa en una aplicación durante la destilación antes de la separación del mosto.
En algunas modalidades, la filtrabilidad del mosto según lo determinado por el volumen de mosto recogido después de 5 minutos de filtración, se incrementa por lo menos 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 , 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, o 300 %, en comparación con el uso de un control negativo sin la composición.
En algunas modalidades, la composición de conformidad con la invención comprende una o más enzimas adicionales. En algunas modalidades, la enzima adicional o las enzimas adicionales se seleccionan de la lista que consiste en una xilanasa clasificada con los códigos EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.136, o EC 3.2.1.156, una celulasa, una laminarinasa, una endo-1 , 5-a-L-arabinanasa, una beta-D-glucósido glucohidrolasa, una ß-xilosidasa, una celobiohidrolasa, una glucano 1 , 4 -beta-glucosidasa , una exo-beta- 1 , 4 -glucanasa específica del xiloglucano y una a-?-arabinofuranosidasa .
Las secuencias y enzimas identificadas por una secuencia como se menciona en la presente descripción, y usadas de conformidad con la presente invención solas o combinadas con otras enzimas o compuestos, pueden estar con o sin el péptido señal .
Ensayos Método para la actividad de la celulasa en DNS (método para CMC en DNS) Denominación sistemática: 1 , 4 - (1 , 3 ; 1 , 4 ) - ß-D-glucano 4-glucanohidrolasa Número IUB : EC 3.2.1.4 Principio El ensayo de la celulasa se basa en la endo-hidrólisis enzimática de los enlaces 1 , 4 - ß-D-glucosídicos en carboximetilcelulosa (CMC), un ß-1, 4-glucano. Los productos de la reacción (ß-1,4 glucano oligosacáridos) se determinaron colorimétricamente , midiendo el aumento resultante en los grupos reductores con un reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico . La actividad enzimática se calculó a partir de la relación entre la concentración de los grupos reductores, como equivalentes de glucosa, y la absorbancia a 540 nm.
El ensayo se llevó a cabo a pH 5.0, pero puede realizarse a valores de pH diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas. Definición de la unidad Una unidad de actividad de la celulasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µ???? de equivalentes de glucosa por minuto, en las condiciones del ensayo (pH 5.0 (o como se especifique) y 50 °C) .
Materiales Carboximetilcelulosa . Proveedor: Megazyme Ltd. Producto núm. : CM-Cellulose 4M D-Glucosa 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH) . Producto núm.: 10117. P.M.: 180.16 Acetato de sodio anhidro 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Producto núm. : 10236. P.M. : 82.03 Ácido acético ["glacial") 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Producto núm.: 10001. P.M.: 60.05 Ácido 3, 5-dinitrosalicílico GPR (ácido 3, 5-dinitro-2-hidroxibenzoico) . Proveedor: Merck Ltd (BDH) . Producto núm. : 28235 Gránulos de hidróxido de sodio 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Producto núm.: 10252. P.M.: 40.00 (+) -Tartrato de sodio y potasio 'AnalaR' . Proveedor: Merck Ltd (BDH). Producto núm.: 10219. P.M. : 282.22 Solución al 1.5 % (solución p/v) de carboximetilcelulosa (CMC) en 0.1M de regulador de acetato de sodio, pH 5.0 (solución de sustrato) .
Solución de ácido 3 , 5 -dinitrosalicílico (DNS) . 20 g/1 de DNS en regulador que contiene 32 g/1 de gránulos de hidróxido de sodio, y 600 g/1 de (+) -tartrato de sodio y potasio.
Solución estándar de glucosa (0.50 mg/ml) Procedimiento La composición enzimática se diluyó en muestras y se realizó una curva estándar de glucosa, como se muestra en la Figura 2, con concentraciones de glucosa de 0, 0.125, 0.25, 0.375, y 0.5 mg/ml .
Se mezclaron 0.25 mi de la solución enzimática con 1.75 mi de la solución de sustrato (1.5 % p/v) a 50 °C, y la reacción se detuvo después de 10 minutos mediante la adición de una solución de DNS. Esto fue seguido por calentamiento a 95 °C durante 5 minutos.
La densidad óptica se midió a 540 nm (OD540 nm) de las diferentes muestras.
Cálculo La actividad enzimática se determina a partir de la curva estándar, como se muestra en la Figura 2.
La actividad se calcula de la siguiente manera: T e 1 1 1 Actividad (u.ml-1 o u.g"1) = x A x x103x— x-xD m 180.16 V t en donde : T = AOD5 0 nm PRUEBA = OD540 nm PRUEBA - OD540 nm EN BLANCO m = gradiente de la curva estándar (aproximadamente 1.0) c = intercepción de ejes y de la curva estándar (siempre negativo y aproximadamente -0.02) 180.16 = peso molecular de la glucosa 103 = para convertir a µp???ß? A = volumen del ensayo en mi V= volumen de la enzima en mi t = tiempo del ensayo en minutos D = factor de dilución enziraática real (por ejemplo, para 1.000 g diluido a 1 litro D = 1000) Laminarinasa (método para laminarina con DNS) Principio La reacción, catalizada por la laminarinasa, incluye la endohidrólisis de enlaces 1,3- glucosídicos en 1, 3-p-D-glucanos. Los sustratos incluyen laminarina, paramilon y paquimano. Los productos de la reacción (ß-l, 3-glucano oligosacáridos) se determinaron colorimétricamente por medio de medir el aumento resultante en los grupos reductores con un reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico. La actividad enzimática se calcula a partir de la relación entre la concentración de los grupos reductores, como equivalentes de glucosa, y la absorbancia a 540 nm.
El ensayo se llevó a cabo a pH 5.0 y 50 °C, pero puede realizarse a valores de pH y temperatura diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas. Definición de la unidad Una unidad de actividad de laminarinasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µ???? de equivalentes de glucosa por minuto, en las condiciones del ensayo (pH 5.0 y 50 °C (o como se especifique) .
Materiales Ver los materiales que se indicaron anteriormente para el ensayo sobre la actividad de la celulasa.
Laminarina (de Laminaria digitata) . Proveedor: Sigma-Aldrich Co . Ltd. Producto núm. : L 9634 Solución al 1.00 % (solución p/v) de laminarina (solución de sustrato de 0.1M de regulador de acetato de sodio, pH 5.0) 1.75 mi de una solución de laminarina se mezcla con 0.25 mi de una solución enzimática diluida a 50 °C durante 10 minutos, y se detiene la reacción mediante la adición de 2 mi de una solución de DNS .
Se realizó una curva estándar de glucosa con 0, 0.125, 0.25, 0.5 y 0.75 mg/ml de una solución de glucosa.
La densidad óptica se midió a 540 nm (OD540 nm) · Cálculo La actividad se calcula de la siguiente manera: y- ^ ^ 1 1 Actividad (u.ml-1 o u.g_L) = xAx x103x— x-xD m 180.16 V t en donde : T = AOD540 nm PRUEBA = OD540 nm PRUEBA - OD540 nm EN BLANCO m = gradiente de la curva estándar (aproximadamente 1.0) c = intercepción de ejes y de la curva estándar (siempre negativo y aproximadamente -0.03) 180.16 = peso molecular de la glucosa 103 = para convertir a umoles A = volumen del ensayo en mi V = volumen de la enzima en mi t = tiempo del ensayo en minutos D = factor de dilución enzimática (por ejemplo, para 1 g diluido a 1 litro D = 1000) Ensayo de la arabinasa.
Principio El ensayo de la actividad de la arabinasa se basa en la determinación colorimétrica por medio de medir el aumento resultante en los grupos reductores con un reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico. La actividad enzimática se calculó a partir de la relación entre la concentración de los grupos reductores, como equivalentes de arabinosa, y la absorbancia a 540 nm.
El ensayo se llevó a cabo a pH 3.5, pero puede realizarse a valores de pH diferentes, para la caracterización adicional y especificación de las enzimas. Definición de la unidad Una unidad de actividad de arabinasa (arabinanasa (endo-1 , 5-alfa-L-arabinanasa) ) se define como la cantidad de enzima que produce 1 umol de equivalentes de arabinosa por minuto, en las condiciones del ensayo (pH 3.5 (o como se especifique) y 50 °C) .
Materiales Arabinano de remolacha azucarera Megazyme Arabinosa Sigma A3131 P.M.: 150.1 Acetato de sodio anhidro 'AnalaR1. Proveedor: Merck Ltd (BDH) . Producto núm. : 10236. P.M. : 82.03 Ácido acético ("glacial") 'AnalaR' . Proveedor: Merck Ltd (BDH) . Producto núm. : 10001. P.M. : 60.05 Ácido 3 , 5-dinitrosalicílico GPR (ácido 3 , 5-dinitro-2 -hidroxibenzoico) . Proveedor: Merck Ltd (BDH) . Producto núm. : 28235 Gránulos de hidróxido de sodio 'AnalaR' . Proveedor: Merck Ltd (BDH) . Producto núm. : 10252. P.M. : 40.00 (+) -Tartrato de sodio y potasio 'AnalaR' . Proveedor: Merck Ltd (BDH) . Producto núm. : 10219. P.M.: 282.22 Solución al 1.5 % (solución p/v) de arabinano en 0.1 M de regulador de acetato de sodio, pH 3.5 (solución de sustrato) .
Solución de ácido 3 , 5-dinitrosalicílico (DNS) . 20 g/1 de DNS en regulador que contiene 32 g/1 de gránulos de hidróxido de sodio, y 600 g/1 de (+) -tartrato de sodio y potasio.
Solución estándar de arabinasa (0.50 mg/ml) Procedimiento La composición enzimática se diluyó en muestras y se realizó una curva estándar de glucosa, con concentraciones de arabinasa de 0, 0.125, 0.25, 0.375, y 0.5 mg/ml.
Se mezclaron 0.25 mi de la solución enzimática con 1.75 mi de la solución de sustrato (1.5 % p/v) a 50 °C, y la reacción se detuvo después de 10 minutos mediante la adición de una solución de DNS. Esto fue seguido por calentamiento a 95 °C durante 5 minutos.
La densidad óptica se midió a 540 nm (OD540nm) de las diferentes muestras.
Cálculo La actividad enzimática se determina a partir de la curva estándar.
La actividad se calcula de la siguiente manera: T—c 1 1 1 Actividad (u.ml"1 o u.g"1) = xAx x103x— x-xD m 150.13 V t en donde : T = AOD54onm PRUEBA = OD540nm PRUEBA - OD54onm EN BLANCO m = gradiente de la curva estándar (aproximadamente 1.0) c = intercepción de ejes y de la curva estándar (siempre negativo y aproximadamente -0.02) 150.13 = peso molecular de la arabinasa 103 = para convertir a umoles A = volumen del ensayo en mi V = volumen de la enzima en mi t = tiempo del ensayo en minutos D = factor de dilución enzimática real (por ejemplo, para 1.000 g diluido a 1 litro D = 1000) Ensayo de la arabinofuranosidasa .
La reacción, catalizada por la a-?-arabinofuranosidasa, incluye la endohidrólisis del enlace terminal, en el residuo de a-L-arabinofuranosida no reductor, de las -L- arabinosidas . La enzima actúa en las a-L-arabinofuranosidas, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos .
El ensayo de la a-?-arabinofuranosidasa se basa en la hidrólisis enzimática de p-nitrofenilo -L-arabinofuranosida . El ensayo es un método "de dos puntos", en lugar de un método "de monitoreo continuo". El cálculo de la actividad enzimática se basa en las mediciones que se toman solamente al inicio y al final del período de incubación. Un producto de la reacción, p-nitrofenol , se determina colorimétricamente (después del ajuste de pH) . La actividad enzimática se calcula a partir de la relación entre la concentración del p-nitrofenol y la absorbancia a 400 nm.
Preparación de la solución enzimática diluida: Se preparan todas las soluciones enzimáticas, a partir de preparaciones enzimáticas líquidas o en polvo, con agua destilada en vaso de laboratorio. Se minimizan los errores de dilución en el ensayo al evitar las fases de dilución extensas que incluyan pesos y volúmenes pequeños. Para realizar diluciones enzimáticas es más eficaz, aún para una muestra líquida, pesar la muestra enzimática inicial. Si esto se lleva a cabo, en el caso de las muestras líquidas es necesario, por consiguiente, medir la gravedad específica del líquido a 20 °C Dado que el ensayo es un método "de dos puntos", en lugar de un método "de monitoreo continuo", es importante asegurarse la linealidad dentro del período de incubación con sistemas enzimáticos y condiciones diferentes. En las condiciones de ensayo estándar de concentración de sustrato, pH, temperatura y tiempo de ensayo, se ha demostrado que el ensayo es lineal en el intervalo de AOD540 nm PRUEBA (P) = 0.20 - 1.50. Sin embargo, para una buena práctica, el ensayo se lleva a cabo dentro de un intervalo definido de AOD540 nm PRUEBA (P) = 0.400 - 0.800.
Procedimiento Cada ensayo de muestra enzimática incluye tres análisis: análisis de prueba (PRUEBA) por duplicado y un análisis en blanco (EN BLANCO) . El procedimiento indicado describe el análisis de una muestra enzimática única.
PRUEBA EN BLANCO 0.2 M de regulador de acetato de 1.00 mi 1. 00 mi sodio, pH 5.0 Agua destilada en vaso de 1.00 mi 1. 00 mi laboratorio 1.00 mi 1. 00 mi Solución p-nitrofenil-ß-?- celobiopiranosida Se agregaron 0.25 mi de una solución enzimática diluida a las soluciones a 50 °C, la reacción se detuvo después de 10 minutos mediante la adición de 4 mi de solución de glicina 0.4 M, pH 10.8 (reactivo de parada) .
Se midió la absorbancia a 400 nm a 25 °C, en comparación con un testigo de agua. • se determinó el análisis de prueba OD40o nm PRUEBA para las PRUEBAS por duplicado medidas; • se determinó el análisis en blanco OD40o nm E BLANCO.
Cálculo AOD4oo „m PRUEBA (P) = OD400 nm PRUEBA - OD400 nm EN BLANCO T V 1 Unidades (umol.min-1) = x x10flx- 18300 1000 f Actividad (u.ml"1 o u.g"1) = Unidades x en donde: T = OD400 nm PRUEBA - OD400 nm EN BLANCO 18300 = coeficiente de extinción molar para p-nitrofenol (1 cm de paso óptico) V = 7.25 (volumen líquido total en la prueba en mi) t = 10 (minutos) 1 u = 1 pmol.min-l E = 0.25 (volumen de la muestra enzimática diluida en mi) D = factor de dilución enzimática, por ejemplo, para 1 mi diluido a 1 litro D = 1000) Ensayo de la celobiohidrolasa .
Principio La reacción, catalizada por la celobiohidrolasa, incluye la hidrólisis de los enlaces 1, 4^-D-glucosídicos en celulosa y celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas.
El ensayo de la celobiohidrolasa se basa en la hidrólisis enzimática de la p-nitrofenilo ß-D-celobiopiranosida . El producto de la reacción, p-nitrofenol , se determina colorimétricamente (después del ajuste de pH) . La actividad enzimática se calcula a partir de la relación entre la concentración del p-nitrofenol y la absorbancia a 400 nm.
El ensayo se lleva a cabo dentro del intervalo lineal definido de ???540 nm PRUEBA (T) = 0.400 - 0.800.
Procedimiento Cada ensayo de muestra enzimática incluye tres análisis: análisis de prueba (PRUEBA) por duplicado y un análisis en blanco (EN BLANCO) . El procedimiento indicado describe el análisis de una muestra enzimática única.
PRUEBA EN BLANCO 0.2 M de regulador de acetato 1.00 mi 1. 00 mi de sodio, pH 5.0 Agua destilada en vaso de 1.00 mi 1. 00 mi laboratorio 1.00 mi 1. 00 mi Solución p-nitrof???-ß-?-celobiopiranosida Se agregaron 0.25 mi de una solución enzimática diluida a la solución de prueba a 50 °C, después de 30 minutos se agregaron 4 mi de solución de glicina 0.4 M, pH 10.8 (reactivo de parada) a cada tubo.
Se midió la absorbancia a 20 °C a 400 nm en una cubeta de vidrio de 1 cm, en comparación con un testigo de agua. • se determinó el análisis de prueba OD400 nm PRUEBA para las PRUEBAS por duplicado medidas; • se determinó el análisis en blanco OD400 nm en BLANCO.
Cálculo AODjnn PRUEBA (P) OD,00 nm PRUEBA - OD,0. _ EN BLANCO Unidades (pmol.mirr1) x x10e x- 18300 1000 Actividad (u.ml"1 o u.g"1) Unidades x— x D en donde : T = OD400 nm PRUEBA - OD400 nm EN BLANCO 18300 = coeficiente de extinción molar para p-nitrofenol (1 cm de paso óptico) V = 7.25 (volumen líquido total en la prueba en mi) 1000 = para convertir a litros 106 = para convertir a µ?????? t = 30 (minutos) 1 u = 1 umol.min"1 E = 0.25 (volumen de la muestra enzimática diluida en mi) D = factor de dilución enzimática, por ejemplo, para 1 mi diluido a 1 litro D = 1000) Modalidades numeradas de conformidad con la invención: 1. Una enzima que exhibe actividad de endo-l,4-p-xilanasa; la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera de las que se seleccionan de la sec . con núm. de ident.:l, la sec. con núm. de ident.:2, la sec. con núm. de ident . -.3 , la sec . con núm. de ident.:4, la sec . con núm. de ident.:5, la sec . con núm. de ident.:6, la sec. con núm. de ident.:17, y la sec. con núm. de ident.:18, o cualquier fragmento funcional de estas. 2. La enzima de conformidad con la modalidad 1; la enzima tiene una relación en actividad de sustrato de arabinoxilano soluble (WE-AX) a sustrato de arabinoxilano insoluble (WU-AX) menor que aproximadamente 7.0, tal como menor que aproximadamente 6.5, tal como menor que aproximadamente 6.0, tal como menor que aproximadamente 5.5, tal como menor que aproximadamente 5.0, tal como menor que aproximadamente 4.5. 3. Una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa; la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera de las que se seleccionan de la sec. con núm. de ident. :7, la sec. con núm. de ident. :8, la sec. con núm. de ident. :9, la sec. con núm. de ident. :10, y la sec. con núm. de ident. :11, la sec. con núm. de ident. :12, la sec. con núm. de ident. :13, la sec. con núm. de ident. : 14 , la sec. con núm. de ident. :15, la sec. con núm. de ident. :16, o cualquier fragmento funcional de estas. 4. La enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-3; la enzima tiene un óptimo de temperatura en el intervalo de 40-70 °C, tal como en el intervalo de 45- 65 °C, tal como en el intervalo de 50-65 °C, tal como en el intervalo de 55-65 °C. 5. La enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-4, en donde la enzima tiene por lo menos 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con cualquier secuencia de aminoácidos que se selecciona de las sec . con núms . de ident.: 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas. 6. La enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-5; la enzima tiene un número total de aminoácidos menor que 350, tal como menor que 340, tal como menor que 330, tal como menor que 320, tal como menor que 310, tal como menor que 300 aminoácidos, tal como en el intervalo de 200 a 350, tal como en el intervalo de 220 a 345 aminoácidos. 7. La enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-6, en donde la secuencia de aminoácidos de la enzima tiene por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos, en comparación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se seleccionan de las sec. con núms. de ident.: 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas. 8. La enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-7, en donde la secuencia de aminoácidos de la enzima tiene un máximo de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos, en comparación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se seleccionan de las sec. con núms . de ident.: 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas. 9. La enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-8; la enzima comprende la secuencia de aminoácidos identificada mediante cualquiera de las sec. con núms. de ident.: 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas . 10. La enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1 o 3 ; la enzima consiste en la secuencia de aminoácidos identificada mediante cualquiera de las sec. con núms. de ident.: 1-18, o cualquier fragmento funcional de estas . 11. Una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima, de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-10. 12. Un vector de expresión recombinante que comprende una construcción de ADN, de conformidad con la modalidad 11. 13. Una célula que se ha transformado con una construcción de ADN de conformidad con la modalidad 11, o el vector de conformidad con la modalidad 12. 14. Una preparación que comprende una enzima de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-10, o una construcción de ADN de conformidad con la modalidad 11, o un vector de conformidad con la modalidad 12, o una célula de conformidad con la modalidad 13. 15. Una composición que comprende una enzima que exhibe actividad de endo- 1 , - ß-xilanasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 1, 2, 4-10, en combinación con una o más ß-glucanasas . 16. La composición de conformidad con la modalidad 15, en donde una o más de las ß-glucanasas son una enzima que exhibe actividad de endo- 1 , 3 (4 ) - ß-glucanasa, de conformidad con cualquiera de las modalidades 3-10. 17. Una composición que comprende una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa de conformidad con cualquiera de las modalidades 3-10, en combinación con una o más xilanasas. 18. La composición de conformidad con la modalidad 17, en donde una o más de las xilanasas son una enzima que exhibe actividad de endo-1, 4^-xilanasa, de conformidad con cualquiera de las modalidades 1, 2, 4-10. 19. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-18, en donde la actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa y la actividad de endo-1, 4^-xilanasa derivan de por lo menos dos enzimas diferentes, tal como por lo menos dos enzimas diferentes de dos especies diferentes. 20. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-19; la composición comprende una combinación de por lo menos dos enzimas; esas dos enzimas, o dos enzimas con una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad de secuencia con la respectiva identidad de secuencia, o cualquier fragmento funcional de estas, se seleccionan de la lista que consiste en: la sec . con núm . de ident . : 1 y la sec . con núm . de ident . : ; la sec . con núm . de ident . : 2 y la sec . con núm. de ident . :7; la sec . con núm. de ident . :3 y la sec . con núm. de ident . :7; la sec . con núm . de ident . :4 y la sec . con núm . de ident . :7; la sec . con núm. de ident . : 5 y la sec. con núm. de ident . : 7 ; la sec. con núm. de ident . :6 y la sec. con núm. de ident . :7; la sec. con núm. de ident . : 17 y la sec con núm de ident - :7; la sec. con núm. de ident. : 18 y la sec con núm de ident • :7; la sec. con núm. de ident . :1 y la sec. con núm. de ident . :8; la sec. con núm. de ident . :2 y la sec. con núm. de ident . :8; la sec . con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident . :8; la sec. con núm. de ident . :4 y la sec. con núm. de ident . :8; la sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident . :8; la sec. con núm. de ident . :6 y la sec. con núm. de ident . :8; la sec. con núm. de ident . : 17 y la sec con núm de ident :8; la sec. con núm. de ident . : 18 y la sec con núm de ident :8; la sec . con núm. de ident . :1 y la sec. con núm. de ident : 9; la sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident : 9; la sec. con núm. de ident . :3 y la sec. con núm. de ident : 9; la sec. con núm. de ident . :4 y la sec. con núm. de ident : 9; la sec. con núm. de ident . :5 y la sec. con núm. de ident :9; la sec. con núm. de ident . :6 y la sec. con núm. de ident : 9; la sec. con num. de ident. : 17 y la sec con núm de ident :9; la sec. con núm. de ident. : 18 y la sec con núm de ident :9; la sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident : 10; la sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident : 10; la sec. con núm. de ident . :3 y la sec. con núm. de ident : 10; la sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident: 10; la sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident : 10; la sec. con núm. de ident. :6 y la sec. con núm. de ident : 10; la sec. con núm. de ident. :17 y la sec con núm de ident :10; la sec. con núm. de ident . :18 y la sec con núm de ident :10; la sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident : 11; la sec . con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident: 11; la sec. con núm. de ident. :3 y la sec. con núm. de ident: 11; la sec. con núm. de ident . :4 y la sec. con núm. de ident: 11; la sec. con núm. de ident . :5 y la sec. con núm. de ident: 11; la sec. con núm. de ident. :6 y la sec. con núm. de ident : 11; la sec. con núm. de ident. : 17 y la sec con núm de ident :ii; la sec. con núm. de ident. : 18 y la sec con núm de ident :ii; la sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident: 12; la sec. con núm. de ident . :2 y la sec. con núm. de ident: 12; la sec. con núm. de ident . :3 y la sec. con núm. de ident : 12; la sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident : 12; la sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident: 12; la sec. con núm. de ident. :6 y la sec. con núm. de ident :12; la sec. con núm. de ident. : 17 y la sec, . con núm. , de ident : 12; la sec. con num. de ident . : 18 y la L sec, . con núm. de ident: 12; la sec. con núm. de ident . :1 y la sec. con núm. de ident :13; la sec. con núm. de ident . :2 y la sec. con núm. de ident : 13; la sec. con núm. de ident . :3 y la sec. con núm. de ident : 13; la sec. con núm. de ident . :4 y la sec. con núm. de ident : 13; la sec. con núm. de ident . :5 y la sec. con núm. de ident : 13; la sec. con núm. de ident . :6 y la sec. con núm. de ident : 13; la sec. con núm. de ident. : 17 y la sec. . con núm. de : ident: 13; la sec. con núm. de ident . : 18 y la L sec. . con núm. de : ident: 13; la sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident :1 ; la sec. con núm. de ident . :2 y la sec. con núm. de ident : 14; la sec . con núm. de ident . :3 y la sec. con núm. de ident: 14 ; la sec. con núm. de ident. :4 y la sec. con núm. de ident: 14 ; la sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident :14; la sec. con núm. de ident . :6 y la sec. con núm. de ident :1 ; la sec. con núm. de ident . : 17 y la . sec. . con núm. de : ident : 14; la sec. con núm. de ident . : 18 y la . sec. . con núm. de ¡ ident : 14; la sec. con núm. de ident . :1 y la sec. con núm. de ident: 15; la sec. con núm. de ident. :2 y la sec. con núm. de ident :15; la sec. con núm. de ident . :3 y la sec. con núm. de ident : 15; la sec. con núm. de ident . :4 y la sec. con núm. de ident : 15; la sec. con núm. de ident . :5 y la sec. con núm. de ident: 15; la sec. con núm. de ident . :6 y la sec. con núm. de ident :15; la sec. con núm. de iden . : 17 y la sec . con núm.. de ident : 15 ; la sec. con núm. de ident . : 18 y la sec. con núm, . de ident : 15; la sec. con núm. de ident. :1 y la sec. con núm. de ident : 16 ; la sec. con núm. de ident. :2 y la sec . con núm. de ident : 16 ; la sec. con núm. de ident . :3 y la sec. con núm. de ident :16; la sec. con núm. de ident . :4 y la sec . con núm. de ident : 16 ; la sec. con núm. de ident. :5 y la sec. con núm. de ident : 16 ; la sec. con núm. de ident . :6 y la sec . con núm. de ident : 16 ; la sec. con núm. de ident . :17 y la sec. con núm. de ident : 16 ; y la sec. con núm. de ident. :18 y la sec. con núm. de ident . : 16. 21. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-20, en donde cuando se usa antes de la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación, la presión acumulada total se reduce a un valor menor que 470 mm WC, tal como menor que 450 mm WC, tal como menor que 430 mm WC, tal como menor que 410 mm C, tal como menor que 390 mm C, tal como menor que 370 mm WC, tal como menor que 350 mm WC, tal como menor que 330 mm WC, tal como menor que 310 mm WC, tal como menor que 300 mm WC, tal como menor que 290 mm WC. 22. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-21, en donde cuando se usa antes de la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación, la presión acumulada total se reduce en por lo menos 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 o 95 %, en comparación con el uso de un control negativo sin la composición. 23. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-22, en donde cuando se usa en una aplicación durante la destilación antes de la separación del mosto, la filtrabilidad del mosto según lo determinado por el volumen de mosto recogido después de 5 minutos de filtración con relación al control sin enzimas, se incrementa por encima de 1.5, tal como por encima de 1.6, tal como por encima de 1.7, tal como por encima de 1.8, tal como por encima de 1.9, tal como por encima de 2.0, tal como por encima de 2.1, tal como por encima de 2.2, tal como por encima de 2.3, tal como por encima de 2.4, tal como por encima de 2.5. 24. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-23, cuando se usa en una aplicación durante la destilación antes de la separación del mosto, la filtrabilidad del mosto según lo determinado por el volumen de mosto recogido después de 5 minutos de filtración se incrementa por lo menos 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, o 300 % en comparación con el uso de un control negativo sin la composición. 25. La composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-24; la composición comprende una o más enzimas adicionales. 26. La composición de conformidad con la modalidad 25, en donde la enzima adicional o las enzimas adicionales se seleccionan de la lista que consiste en una xilanasa clasificada con los códigos EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.136, o EC 3.2.1.156, una celulasa, una laminarinasa , una endo- 1 , 5 -a-L-arabinanasa, una beta-D-glucósido glucohidrolasa, una ß-xilosidasa, una celobiohidrolasa, una glucano 1,4-beta-glucosidasa, una exo-beta-1, 4-glucanasa específica del xiloglucano y una a-?-arabinofuranosidasa . 27. El uso de una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26, en la producción de un alimento, pienso, o bebida de malta. 28. El uso de una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26, en la producción de masa o productos horneados. 29. El uso de una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26, en la preparación de pulpa o papel. 30. El uso de una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26, para la preparación de componentes de cereales. 31. El uso de conformidad con la modalidad 29, en el que el cereal es centeno, trigo o cebada. 32. El uso de una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26, en la producción de cerveza o modificación de subproductos de un proceso de destilación. 33. El uso de una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26, en la producción de vino o jugo. 34. El uso de una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26, en la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol . 35. Un método para alterar la filtrabilidad de un material que comprende almidón; el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26. 36. Un método para reducir la presión acumulada durante la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación; el método comprende la etapa de tratar una mezcla de destilación con una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26. 37. Un método para la producción de un alimento, pienso, o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de cereales o malta, como cerveza o whisky el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26. 38. Un método para la producción de una mezcla de destilación; el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26. 39. Un método para la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol el método comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las modalidades 1-10, o una preparación de conformidad con la modalidad 14, o una composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 15-26. 40. Producto obtenido mediante el método de conformidad con cualquiera de las modalidades 38-39. 41. Una composición que comprende el producto de conformidad con la modalidad 40, como cuando el producto está en un intervalo de 0.1 %-99.9 %.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Métodos y resultados con respecto a la presentación de xilanasas/glucanasas en la aplicación durante la destilación.
Los métodos a continuación se han usado para detectar xilanasas y glucanasas en la aplicación durante la destilación: Métodos Método de la xilanasa en arabinoxilanos extraíbles en agua (WE-AX) : Las muestras para obtener aproximadamente OD540 = 0.25 -0.30 en este ensayo y los estándares de xilosa (0, 0.125, 0.250, 0.375 y 0.500 mg/ml de agua destilada) se prepararon en agua destilada. En el tiempo t=0 minutos, se colocaron 1.75 mi de arabinoxilano de trigo soluble (0.5 % de arabinoxilano de trigo (PWAXYH, Megazyme, Bray, Irlanda)) en 0.1 M de acetato de sodio/ácido acético, pH 5) en un tubo de ensayo a 50 °C. En el tiempo t=5 minutos, se agregaron 250 µ? de solución enzimática al sustrato a 50 °C, seguido por mezclado. Se usa agua destilada como testigo. En el tiempo t=15 minutos, se agregaron 2 mi de solución de DNS (1 % de ácido 3 , 5-dinitrosalicílico (DNS), 1.6 % de hidróxido de sodio, 30 % de tartrato sódico potásico en agua destilada) a la solución de sustrato de la enzima, y 2.0 mi de solución estándar. Las muestras, testigos y estándares con DNS agregado se colocan en un baño de agua en ebullición (95 °C) durante 5 minutos. Más adelante, se enfrían las muestras, testigos y estándares, colocándolos en un baño de agua a 25 °C durante 20 minutos. La densidad óptica de todas las muestras se lee a OD540 mediante el uso de un espectrofotómetro . Teniendo en cuenta la dilución de las muestras, la cantidad de muestra que se pone a trabajar y los estándares, se puede calcular la actividad de las xilanasas de la muestra.
Una unidad de actividad de WE-AX de endo-1 , 4 -beta-xilanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 umol de equivalentes de xilosa por minuto, en las condiciones que se mencionan anteriormente (Método de la xilanasa en arabinoxilanos extraíbles en agua (WE-AX, por sus siglas en inglés) ) Método de la xilanasa en arabinoxilanos no extraíbles en agua (WU-AX) : Las muestras se preparan en agua destilada. En el tiempo t=0 minutos, se colocaron 1.75 mi de trigo insoluble (0.5 % de arabinoxilano de trigo (PWAXYI, Megazyme, Bray, Irlanda)) en 0.1 M de acetato de sodio/ácido acético, pH 5) en un tubo de ensayo a 50 °C. En el tiempo t=5 minutos, 250 µ? de solución enzimática se agregaron al sustrato a 50 °C, seguido por mezclado. Se usa agua destilada como testigo. En el tiempo t=15 minutos, las muestras y testigos se colocan en un baño de agua en ebullición (95 °C) durante 5 minutos. Después, se centrifugan las muestras y testigos para precipitar el sustrato insoluble residual. La cantidad de arabinoxilano que se incorpora a la solución se determina con el método descrito por Rouau, X. y Surget, A. (1994), Carbohydrate Polymers, 24, 123-132.
El WU-AX con actividad de endo-1,4-beta-xianasa se define como la cantidad de pentosas solubilizadas ^g de pentosas) en las condiciones descritas anteriormente, con una definición de unidad de ug de pentosa/gramo de muestra de xilanasa.
Ensayo de actividad de la xilanasa Se preparan muestras para obtener aproximadamente OD540 = 0.25 - 0.30 en este ensayo y estándares de xilosa (0, 0.125, 0.250, 0.375 y 0.500 mg/ml de agua destilada) en agua destilada. En el tiempo t=0 minutos, se colocaron 1.75 mi de arabinoxilano de trigo soluble (0.5 % de arabinoxilano de trigo (PWAXYH, Megazyme, Bray, Irlanda)) en 0.1 de acetato de sodio/ácido acético, pH 5) en un tubo de ensayo a 50 °C. En el tiempo t=5 minutos, se agregaron 250 µ? de solución enzimática al sustrato a 50 °C, seguido por mezclado. Se usa agua destilada como testigo. En el tiempo t=15 minutos, se agregaron 2 mi de solución de DNS (1 % de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), 1.6 % de hidróxido de sodio, 30 % de tartrato sódico potásico en agua destilada) a la solución de sustrato de la enzima, y 2.0 mi de solución estándar. Las muestras, testigos y estándares con DNS agregado se colocan en un baño de agua en ebullición (95 °C) durante 5 minutos. Más adelante, se enfrían las muestras, testigos y estándares, colocándolos en un baño de agua a 25 °C durante 20 minutos. La densidad óptica de todas las muestras se lee a OD540 mediante el uso de un espectrofotómetro . Teniendo en cuenta la dilución de las muestras, la cantidad de muestra que se pone a trabajar y los estándares, se puede calcular la actividad de las xilanasas de la muestra.
Una unidad de actividad de WE-AX de endo-1 , 4 -beta-xilanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µp\?1 de equivalentes de xilosa por minuto, en las condiciones que se mencionan anteriormente Ensayo de actividad de la glucanasa Las muestras para obtener OD540 dentro de la curva estándar en este ensayo y los estándares de glucosa (0; 0.125; 0.250; 0.500; y 0.750 mg/ml de agua destilada) se preparan en agua destilada. En el tiempo t=0 minutos, se colocaron 1.75 mi de beta-glucano de cebada (1.5 % de beta-glucano de cebada (P-BGBM, Megazyme, Bray, Irlanda)) en 1 M de acetato de sodio/ácido acético, pH 5) en un tubo de ensayo a 50 °C. En el tiempo t=5 minutos, se agregaron 250 µ? de solución enzimática al sustrato a 50 °C, seguido por mezclado. Se usa agua destilada como testigo. En el tiempo t=15 minutes, se agregaron 2 mi de solución de DNS (1 % de ácido 3 , 5-dinitrosalicílico (DNS), 1,6 % de hidróxido de sodio, 30 % de tartrato sódico potásico en agua destilada) a la solución de sustrato de la enzima, y 2.0 mi de solución estándar. Las muestras, testigos y estándares con DNS agregado se colocan en un baño de agua en ebullición (95 °C) durante 5 minutos. Más adelante, se enfrían las muestras, testigos y estándares, se colocan en un baño de agua a 25 °C durante 20 minutos. La densidad óptica de todas las muestras se lee a OD540 mediante el uso de un espectrofotómetro . Teniendo en cuenta la dilución de las muestras, la cantidad de muestra que se pone a trabajar y los estándares, se puede calcular la actividad de la glucanasa de la muestra.
Una unidad de actividad de endo-1 , 3 (4 ) - ß-glucanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µt??? de equivalentes de glucosa por minuto, en las condiciones del ensayo (pH 5.0 (o como se especifique) y 50 °C) .
Método de aplicación durante la destilación a escala de laboratorio : Se condujeron estudios para la aplicación durante la destilación a escala de laboratorio con malta Pilsner : cebada en una relación 75:25, en una relación agua :molienda de 3:1 (150 ml:50 g de molienda). Inicialmente , se precalentó agua a 53 °C antes de premacerar y ajustar el pH (5.4, 2 M de H2S04) . Después de recuperar la temperatura inicial (un periodo de 10 minutos) se inicia el perfil de mezclado (véase la Figura 1), y se agregan las enzimas. Después de mezclar, se lleva a cabo la separación del mosto con un embudo de plástico convencional y papel filtro (papel filtro núm. 1, 24 cm de diámetro, hatman, Inglaterra) . Se evaluó el desempeño de filtrado, así como también algunos otros parámetros de mosto, tal como, por ejemplo, viscosidad, ß-glucano y pentosana.
Se midió el filtrado del mosto durante 30 minutos. Transcurrido ese período, finalizó el filtrado. El mosto reunido se enfrió antes de realizar cualquier otro análisis. Filtrado Los datos de filtrado se presentan como volumen de mosto recogido después de 5 , 10, 15 y 30 minutos con relación a un testigo (destilación sin enzimas exógenas agregadas) .
Destilación a escala piloto Se condujeron pruebas en una instalación para destilación a escala piloto (2 HL de capacidad) . La separación del mosto se realizó mediante la separación de los residuos y el filtrado de la cerveza mediante filtración kiselguhr horizontal.
Para elucidar la optimización del filtrado mediante la combinación de glucanasa y xilanasa en condiciones de destilación "difíciles", se condujeron pruebas de destilación a escala piloto mediante el uso de una molienda mezclada que comprende el 75 % de malta y 25 % de cebada. Inicialmente , la relación agua ¡molienda se fijó en 2.8:1 (inicio de la mezcla), que aumentó a 3.1:1 al inicio de la separación de los residuos. En comparación, las relaciones agua ¡molienda de aproximadamente 3.2-3.8 son típicas en la separación de los residuos en las destilerías a gran escala. Por lo tanto, se cree que los ajustes de pruebas piloto actuales de una relación 3.1:1 agua ¡molienda están en el extremo difícil de la escala.
La malta y la cebada se molieron en seco con un molino de dos rodillos. Tanto la cebada como la malta se molieron dos veces, con una distancia entre los rodillos de -0.7 mm.
El mezclado se realizó aspirando a una temperatura de mezclado inicial de 53 °C. Después del mezclado se realizaron pequeños ajustes, tales como: ajuste del volumen de la mezcla para la relación agua : molienda de 2.8:1, y ajuste de pH a -5.56 (ácido láctico) . Después de los ajustes de precisión de la mezcla, se agregó la enzima y se siguió el perfil de mezclado que se indicó en la Figura 1. Se programó un reposo de la sacarificación a 70 °C de 15 minutos, sin embargo, el período de reposo se extendió por 5 minutos, hasta que la prueba de yodo mostró que no había almidón presente. (Ludwig Narziss y Wemer Back, Technische Universitaet Muenchen (Fakultaet fuer Brauwesen, Weihenstephan) , Abriss der Bierbrauerei . WILEY-VCH Verlags GmbH, einheim, Alemania, 2005) .
El mezclado se inició luego de un reposo de 5 minutos a 78 °C. La mezcla se transfirió al tanque de filtrado, el que se precargó con agua de antemano a una altura justo por debajo del "falso fondo". Se dejó reposar la mezcla durante 5 minutos para la decantación del residuo sólido. A continuación siguió una recirculación (140 1/h) de 15 minutos, para asegurar la decantación del residuo sólido y la clarificación del mosto. Típicamente, en la destilación a escala completa, el filtrado se inicia cuando se obtiene una determinada turbiedad del mosto. Sin embargo, en las pruebas actuales la recirculación se mantuvo constante a 15 minutos, lo que permite la comparación de las pruebas. Durante la separación de los residuos se recogieron los siguientes datos, que incluyen el tiempo (minutos) , volumen de mosto recogido (L) , diferencia de la presión de filtrado a través del residuo sólido (mm C, mm de columna de agua (por su sigla en inglés)), capacidad de la bomba (%) , turbidez del mosto (EBC) y temperatura de la mezcla (°C) .
Se cree que la presión acumulada total a través del residuo sólido durante el filtrado es un factor que contribuye a ajustar el estándar del desempeño de la separación de los residuos del mosto. Al alcanzar diferencias de presión muy altas, por ejemplo, 250 mmWC durante la recolección del primer mosto y, por ejemplo, 450 mmWC para la restante separación de los residuos, se induce un trasiego del residuo sólido (conocido, además, como corte profundo). El trasiego es un proceso en donde el residuo sólido colapsa, o se forma un canal de filtración al cortar gradualmente el residuo sólido con cuchillos de diseño especial. Después del trasiego del residuo sólido, se introduce una recirculación del mosto de 6 minutos (tasa de flujo: 120 1/h) para cebar el residuo sólido para lograr una filtración continua. El trasiego del residuo sólido da lugar a un desempeño de filtración que en caso contrario estaría comprometido, y que de otra manera podría dar como resultado, además, un mosto de mala calidad. Si no se ha introducido un trasiego inducido por presión para el comienzo de la tercera aspersión, se llevan a cabo trasiegos automáticos al comienzo de la tercera y la cuarta aspersión, para asegurar que no ocurra un bloqueo de filtración total justo antes de finalizar la separación del mosto.
La separación de los residuos se realizó con los ajustes que se ilustran en la Tabla 1.
Tabla 1. Ajustes de separación de los residuos. Volúmenes recogidos (L) , flujo de filtración (L/h) y volúmenes de aspersión (L) .
Después de finalizada la separación de los residuos, el mosto dulce regresó al tanque de la mezcla, se calentó hasta la ebullición, y se añadió lúpulo. La precipitación del mosto continuó durante 80 minutos, y al final de la precipitación del mosto el pH se ajustó a 5.10 ± 0.05. Se clarificó el lúpulo del mosto amargo por efecto remolino, y el mosto a continuación se enfrió a ~8 °C. Para la fermentación, se seleccionó una levadura seca de fermentación baja (Saccharomyces cerevisiae) 34/70 de Fermentis. La levadura se rehidrató durante 30 minutos, y se añadió a 100 g/HL. La fermentación principal se mantuvo durante 5-6 días a 10 °C, seguida por la maduración a 15 °C, hasta que se atenuó, y diacetilo por debajo de 80 ppb. La cerveza se almacenó por otras 2-3 semanas a 1 °C y 70 kPa (0.7 bar) antes del filtrado.
La cerveza se filtró horizontalmente mediante el uso de placas de PP-vela de 1.2 µ?t? y kieselguhr. Pueden incluirse hasta 8 placas en la unidad de filtrado, lo que da lugar a un área de filtración total de -0.5 m2. En los estudios actuales se incluyeron 3 placas, y la filtración se realizó a una tasa de flujo de 130 1/h, lo que da lugar a una velocidad de filtración de 6.9 HL/ (h·m2 ) . En fábricas de cerveza a gran escala, la velocidad de la filtración se ajusta, usualmente, entre 5-7 HL/(h-m2). Por consiguiente, es obvio que los ajustes actuales están en el extremo superior - una elección deliberada desafiando las condiciones de filtrado de la cerveza, para verificar los beneficios potenciales de la elección de usar una enzima en el proceso de destilación. Durante el filtrado de la cerveza, se monitorearon las tasas de flujo (L/h) , así como los valores de la presión (P-in y P-out) , para verificar el desempeño del filtrado de la cerveza. Además, se realizaron varios análisis a la cerveza, tales como la gravedad original (OG, por sus siglas en inglés) , extracto aparente (AE, por sus siglas en inglés) , alcohol por volumen (ABV, por sus siglas en inglés) , grado de fermentación aparente (ADF, por sus siglas en inglés) , grado de fermentación real (RDF, por sus siglas en inglés) , pH, color y sabor amargo, para una evaluación de la calidad de la cerveza.
Resultados : Xilanasas : Se analizaron las xilanasas por su actividad en el sustrato soluble y el sustrato insoluble, su pH y las características de temperatura.
Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Xilanasas analizadas, su actividad en el sustrato de arabinoxilano soluble (WE-AX) e insoluble (WU-AX) , y sus características bioquímicas con respecto a la temperatura y el pH.
Se midieron las actividades enzimáticas del WE-AX y WU-AX (U) , como se describe en las secciones "método de la xilanasa en arabinoxilanos extraíbles en agua (WE-AX)" y "método de la xilanasa en arabinoxilanos no extraíbles en agua (WU-AX) " .
Teniendo en cuenta los resultados del cribado bioquímico, se seleccionaron las xilanasas que tienen una relación de actividad adecuada en arabinoxilano soluble frente a insoluble, para pruebas adicionales en ensayos de aplicación. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Xilanasas analizadas y rendimiento del extracto relativo obtenido mediante el uso de xilanasas en comparación con un testigo (sin xilanasas) . Finalmente, se ilustra la especificidad del sustrato de las xilanasas como una relación de su actividad en arabinoxilano soluble frente a insoluble (WU-AX/WE-AX) .
Se determinó el desempeño de filtrado como se describió previamente ("filtrado") , y se presenta como volumen de filtrado en los diferentes puntos temporales con respecto al control negativo (en blanco) .
Se midieron las actividades enzimáticas del WE-AX y WU-AX (U) , como se describe en las secciones 'faétodo de la xilanasa en arabinoxilanos extraíbles en agua (WE-AX) " y "método de la xilanasa en arabinoxilanos no extraíbles en agua (WU-AX)".
Glucanasas.
Se analizaron las glucanasas por su actividad y las características de temperatura, y los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Glucanasas analizadas, su actividad y sus características bioquímicas con respecto a la temperatura La(s) actividad/unidades de la glucanasa se determinó/determinaron como se describe en el ensayo de actividad de la glucanasa descrito anteriormente.
Teniendo en cuenta los resultados del cribado bioquímico, se seleccionaron las glucanasas que tienen características adecuadas, para pruebas adicionales en ensayos de aplicación. Los resultados se muestran en la Tabla Tabla 5. Nombre y origen de las glucanasas analizadas y el rendimiento del extracto relativo obtenido mediante el uso de glucanasas en comparación con un testigo (sin enzima) .
Se determinó el desempeño de filtrado como se describió previamente ("filtrado") , y se presenta como volumen de filtrado en los diferentes puntos temporales con respecto al control negativo (en blanco) .
Teniendo en cuenta los análisis individuales de las xilanasas y glucanasas, se llevaron a cabo experimentos combinatorios, y los resultados se ilustran en la Tabla 6.
Tabla 6 Resultados de la aplicación durante la destilación de experimentos combinatorios de xilanasas y glucanasas en comparación con un testigo y en comparación con UltraFlo® Max. Los resultados de 250 unidades de xilanasa fúngica FXU-S/g; 700 unidades de celulasa EGU/g (Novozymes, Dinamarca) se ilustran como rendimiento del extracto relativo obtenido.
(El origen de UltraFlo® Max puede incluir otros microorganismos aparte de A. aculeatus, tal como se describe en la patente núm. WO05059084) Se determinó el desempeño de filtrado como se describió previamente ("filtrado") , y se presenta como volumen de filtrado en los diferentes puntos temporales con respecto al control negativo (en blanco) .
Las combinaciones adecuadas, además, se sometieron a prueba en una instalación a escala piloto de 2 HL para su verificación, y los resultados se muestran en la Tabla 7 y la Figura 3.
Tabla 7. Resultados de la aplicación durante la destilación a escala piloto a partir de la verificación de la detección de glucanasas y xilanasas. La B. sub glucanasa S combinada con las A. tub xilanasas se evaluaron en comparación con un testigo y con UltraFlo® Max. Los datos que se recogieron fueron el flujo promedio (1/h) , la presión acumulada total durante la separación de los residuos (mm C) , y la presión máxima registrada durante la separación de los residuos (mm WC) .
Ejemplo 2 En este ejemplo se intentó mostrar que las xilanasas para las aplicaciones durante la destilación pueden tener una selectividad muy alta para el arabinoxilano soluble de alto peso molecular (HMWS-AX) y el arabinoxilano extraíble en agua (WE-AX) . Se cree que en la presente descripción solamente necesitan solubilizarse cantidades limitadas de arabinoxilano. Por consiguiente, la posibilidad de mal sabor relacionado se reduce sustancialmente .
Una viscosidad significativamente reducida facilita la mezcla y la separación de la cerveza. Las características de xilanasa deseadas para las aplicaciones durante la destilación pueden incluir uno o más de los siguientes aspectos de la Tabla 8: Tabla 8 Criterios de análisis para la selección de la xilanasa Especificidad del sustrato de la enzima La relación WE-AX/WU-AX tiene un impacto en la viscosidad Selectividad del sustrato de la enzimaQué tan cerca de los puntos de ramificación el corte de la enzima tiene un impacto en la uncionalidad Termoestabilidad de la enzima La solubilización continua de AX durante el mezclado -termoestabilidad, es una característica clave pH óptimo de la enzima (pH 5.4 - 5.6) Inhibición de la enzima (por ejemplo, factor clave conocido para xilanasas) El arabinoxilano insoluble en agua (WU-AX) en cereales como se muestra en la Figura 3, está unido a la estabilidad del residuo sólido en la destilería.
La concentración de ácido ferúlico (FA) en cereales depende en gran medida del tejido. La concentración más alta se encuentra en el material del pericarpio, mientras que la concentración en el endosperma es mucho más baja. Se reportan diferentes concentraciones. Una concentración de 2700 ug/g de fibra insoluble, y 185 ug/g de fibra soluble (Bunzel y col. 2001, Journal of Se. of food and agriculture, vol. 81, pág. 653-60) .
Para poner estos datos en perspectiva , signif ica que el ácido ferúl ico solo se encuentra para cada molécula de xilosa en arabinoxilano número 200 en f ibra insoluble (WU-AX) , y para cada xilosa número 2500 en fibra soluble (WE-AX) .
Se conoce que las xilanasas pueden llevar a la formación de mal sabor en la cerveza, tal como ácido ferúlico libre y 4-VG.
Métodos Teniendo en cuenta los criterios mencionados en las Tablas 8+9, se encontraron más de 15 xilanasas de DuPont Industrial Biosciences como candidatos potenciales . Se analizaron las xilanasas en aplicaciones de mezcla de laboratorio, aplicando hasta 30 % de cebada en combinación con la malta . Entre otras cosas, se moni torearon la velocidad de separación , el nivel de pentosano/arabinoxi lano y las viscosidades del mosto . Los principales candidatos se sometieron a prueba en varios estudios en plantas de fábrica de cerveza piloto, para probar nuestra hipótesis y unir las características de la xilanasa a la funcionalidad en la destilación. La dosis óptima de la xilanasa candidato seleccionada se somet ió a prueba en combinac ión con una ß -glucanasa .
Resultados y discusión .
Cervezas de plantas pi loto en donde la dosis de enzima es la única variable. Aplicar una xilanasa selectiva de WU-AX (XI) da como resultado el colapso del lecho filtrante. Las xilanasas selectivas candidato de WE-AX (referencia, X2 , X3) dan como resultado una presión acumulada baja. La referencia es una mezcla de xilanasa + beta-glucanasa .
Tabla 11. Análisis del mosto - estudio de plantas piloto Tabla 12. Análisis de aldehidos de Strecker de la cerveza añej ada Mezclas optimizadas de una xilanasa selectiva de WE-AX aplicada a un medio (X) y una dosis alta (Xh) en combinación con ß-glucanasa (B) en 20 % de cebada/80 % de malta. Los resultados indican una buena mezcla y desempeño de separación de la cerveza, con un riesgo bajo de mal sabor y colapso del lecho filtrante.
Conclusión El estudio ha demostrado la importancia de aplicar xilanasas para la destilación, que son altamente selectivas para el WE-AX durante el mezclado. Se lograron los siguientes beneficios: • Buena separación de la mezcla y desempeño de filtrado de la cerveza • Riesgo mínimo de colapso del lecho filtrante en la separación de los residuos · Posibilidad reducida de formación de mal sabor relacionado con la descomposición del arabinoxilano • Tolerancia hacia la sobredosis de xilanasa Las xilanasas pueden, frecuentemente, aplicarse con un gran efecto beneficioso en combinación con beta-glucanasas para el control de separación.
Ej emplo 3.
Evaluación de combinaciones de X3/BglS (que se conoce, además, como AtuXyn3/BsuGluS) en pruebas de destilación piloto de 2 HL Material y métodos.
Experimentos. Enzimas.
AtuXyn3 (X3)/ BsuGluS (Bgls) (a): Combinación de BglS (glucanasa de Bacillus) y X3 (xilanasa de Aspergillus; BgLS : 0.50 mg de proteína/kg de molienda y X3 : 1.50 mg de proteína/kg de molienda) .
AtuXyn3 (X3)/ BsuGluS (Bgls) (b) : Como AtuXyn3 (X3)/ BsuGluS (Bgls) (a) , pero con 20 % de aumento X3 dosis para probar la robustez.
Referencia. Producto enzimático de los estudios comparativos (Ultraflo® Max) dosificado a 0.20 kg/T de molienda .
Materia prima: Material adjunto: cebada 22 % p/p.
Malta: Malta Pilsner Chiraz 42.6 % p/p, malta Pilsner Quench DMG 35.4 % en peso (p/p) .
Todos los materiales que se usaron para el ajuste del ácido de los niveles de pH, calcio, zinc y sabor amargo son aptos para el consumo humano, y considerados como materiales para destilación estándar.
La receta para la destilación apuntaba a un estilo de cerveza como una cerveza rubia lager internacional.
Molienda : Molino piloto de dos rodillos Künzel. El material molido pasó por los rodillos 2 veces emulando un molino de 4 rodillos.
Molienda de la malta: el molino estaba funcionando a 1.5 mm la primera vez que la malta pasó por los rodillos, y a 0.7 mm la segunda vez.
Molienda de la cebada: el molino estaba funcionando a 1.5 mm la primera vez que la cebada pasó por los rodillos, y a 0.4 mm la segunda vez.
Destilería de 2 HL : Todas las cervezas se basaron en el mezclado de infusión de HGB (elaboración de cerveza de alta densidad, por su sigla en inglés) y separación de los residuos estándar de 190 1 de mosto, aspirando a 16 °Plato. Durante la separación de los residuos que se realizó a un flujo fijo, se registró la presión diferencial (que se usó como parámetro para evaluar el desempeño de la separación de los residuos) . Todos los materiales de destilación se molieron con antelación (24 horas) , y se mantuvieron en cubetas cerradas antes del contacto con el agua. Todo el material se vertió en la caldera de macerado dentro de los primeros 3 minutos posteriores al inicio del mezclado. Se realizó el ajuste de pH y calcio antes de la adición de la enzima. El pH (20 °C) se volvió a revisar en el receso a 52 °C. La normalidad del yodo se confirmó luego de 10 minutos a 72 °C. La separación de los residuos se llevó a cabo a 78 °C Se evaluó el desempeño de la separación de los residuos en un flujo fijo a 90 1/H durante la recolección del primer mosto. El flujo se incrementó a 110 1/hora y 130 1/hora durante la aspersión y la recolección leve del mosto. El análisis químico se realizó en el mosto frío.
Ebullición del mosto: La ebullición se llevó a cabo mediante el uso de una caldera externa con 4-5 % de evaporación. Se agregaron los extractos de lúpulo desde el comienzo de la ebullición del mosto, aspirando a 20 BU en la cerveza final.
Fermentación de 50 1: Todas las fermentaciones se llevaron a cabo en tanques cilindrocónicos de 50 1. La fermentación se llevó a cabo de conformidad con los procedimientos de funcionamiento estándares. La adición de levadura al mosto se llevó a cabo con 15 x 106 células de levadura vivas/ml. El recuento de levadura y viabilidad se calculó con el uso de un contador Núcleo.
Elaboración de la cerveza: El filtro prensa de placas y marcos operó a presión constante. La evaluación del flujo se hizo en peso.
Se recogieron los datos de placas de 1 y 3 filtros.
Destilación: Todas las cervezas se destilaron a 5.0 % de ABV (alcohol por volumen) , considerado como una norma para cerveza rubia internacional .
Embotellado : Se ajustó el C02 a 5.0 g/1. Se embotellaron todas las muestras de cerveza en botellas estándar de 33 el, en una máquina de llenado automática McLennon con una sola evacuación.
Análisis de la cerveza: Se analizaron las cervezas frescas con una GC-MS Se determinó el perfil de añej amiento químico con una GC-MS.
Resultados y observaciones: Mezclado.
El mezclado se llevó a cabo en las siguientes condiciones : A 52 °C durante 10 minutos, emulando un mezclado de 15 -20 minutos con un molino en funcionamiento.
A 65 °C durante 40 minutos.
A 72 °C durante 30 minutos.
A 78 °C durante 10 minutos.
Todos los etapas en progresión se llevaron a cabo a 1 °C. En la Figura 7 se indica una representación gráfica.
Todas las pruebas se realizaron con este régimen de mezclado, aspirando a una destilación a 16 °Plato. No hubo comentarios para esta etapa del proceso.
Resultados y observaciones: Separación de los residuos.
La separación de los residuos se llevó a cabo en la fábrica de cerveza de 2 hl con una carga de 150 kg/m2. Esto es lo típico para un funcionamiento de destilería estándar.
El control del proceso de separación de los residuos se hizo a un flujo fijo, a un promedio de 100 litros/hora. La tasa de flujo es 90 litros/hora, aumentando a 130 litros/hora durante la recolección leve del mosto. Se registró la presión diferencial y la medición en línea de la opacidad para las cuatro cervezas. La separación de los residuos total y la recolección del mosto se llevó a cabo durante aproximadamente 2 horas .
Se sugiere que las pruebas de X3/BglS (b) y X3/BglS (a) son las pruebas que tuvieron el mejor desempeño de la separación de los residuos, seguido por la prueba de X3/BglS (a) y la prueba de UF max con el peor desempeño.
Tabla 13 Datos que se recogieron durante la separación de los residuos de la mezcla de las cuatro pruebas.
La "presión diferencial" y la "presión acumulada del primer mosto" en la tabla se midieron como cm C (cm de columna de agua), y no como (cm) y (cm/h), respectivamente. Resultados y observaciones: Análisis del mosto después de la ebullición .
El análisis del mosto frío muestra resultados similares. El análisis de beta-glucano indica una ligera diferencia entre las muestras.
Tabla 14. Análisis químico del mosto frío.
Tabla 15. Datos analíticos sobre el mosto frío. (12 °C es 12 ° Plato) ; (% de Plato puede usarse de manera intercambiable con °Plato) Resultados y observaciones: Fermentación.
El análisis de la cerveza verde o joven se indica en la Tabla 16.
Tabla 16 Análisis de la cerveza verde o joven.
El análisis de la cerveza verde o joven muestra un alto grado de similitud entre las pruebas. Tedas las pruebas tienen un RDF bajo relativo, pero esto se ve, normalmente, con la inclusión de 22 % de cebada calculado sobre la base de peso por peso (p/p) .
Resultados y observaciones. Filtrado de la cerveza.
Las muestras de cerveza se filtraron mediante el uso de un filtro prensa de placas y marcos con una presión fija. Se filtraron dos barriles de aproximadamente 15 kg, y los datos de filtrado de cada barril se presentan en la Tabla 17. El primer barril se filtró mediante el uso de 1 placa filtrante, y el segundo barril se filtró con 3 placas filtrantes. La presión diferencial siempre fue 50 kPa (0.5 bar) . Las placas filtrantes son KD7 (20 cmx20 cm) de Begerow.
La imagen en general de las curvas de filtraciones, ya sea con 1 placa filtrante o con 3 placas filtrantes, es igual. Creemos que el registro de 1 placa filtrante puede ser demasiado sensible para mostrar la diferencia de proporción real.
Tabla 17 Datos de filtrado del barril de las cuatro pruebas Resultados y observaciones. Análisis de cerveza final.
Las cervezas de la prueba se analizaron de conformidad con los procedimientos de f ncionamiento estándares (EBC, por su sigla en inglés), y se presentaron en la Tabla 18.
Tabla 18 Análisis final de cerveza.
Resultados y observaciones; Aldehidos de Strecker y "marcadores de añej amiento" en la cerveza final.
Los análisis se realizaron tanto en la cerveza fresca como en la cerveza añejada. Se analizaron los aldehidos de Strecker y "marcadores de calor y añej amiento" (2- e-Pr (2-metilpropanal) , 2-Me-Bu (2-metilbutanal) , 3-Me-Bu (3-metilbutanal) , furfural, metional, PheAcal (fenilacetaldehido) y T2N (trans-2-nonenal) ) mediante GC-MS, tanto en la cerveza fresca como en la cerveza añejada. Los datos del análisis de la cerveza fresca se presentan en la Tabla 19.
Tabla 19. Análisis de aldehidos de Strecker de la cerveza fresca. Se usan marcadores para calor y añej amiento (furfural y trans-2-nonenal) como control de muestra.
Las cervezas de la prueba se incubaron a 37 °C durante 2 semanas, antes del análisis de aldehidos de Strecker. Los datos de las muestras de cerveza añejada se presentan en la Tabla 20.
Tabla 20 Análisis de aldehidos de Strecker de la cerveza añejada. Se usan marcadores para calor y añej amiento (furfural y trans-2-nonenal) como control de muestra.
Los datos que se presentan en la Tabla 20 muestran un aumento previsto en el nivel de aldehidos de Strecker. El aumento en furfural y trans-2-nonenal llega a un nivel esperado .
Conclusión .
Teniendo en cuenta los experimentos a escala piloto, podemos concluir que la relación de BglS y X3 que se sometió a prueba en este experimento tiene un desempeño tan bueno o mejor que la referencia UltraFlo Max en la destilación a escala piloto.
Los resultados son sorprendentes, teniendo en cuenta la materia prima compleja que se usó, una inclusión de 22 % de cebada en combinación con 300 mg/1 de malta que contiene ß-glucano. El desempeño no solo se ve en los resultados de la separación de la mezcla sino, además, en el filtrado de la cerveza. Debido a la baja solubilización del material de la pared celular cuando se usa BRE 2 (datos de pentosana) , puede registrarse un grado más bajo del material de la pared celular, que puede ocasionar problemas de calidad con respecto al sabor desagradable y estabilidad.
Finalmente, puede concluirse que un aumento del 20 % en la dosis del componente de la xilanasa en la X3/Bgls (b) parece no tener ningún impacto en cualquiera de los parámetros evaluados, lo que indica que la X3/Bgls (a) es una combinación de enzima robusta.
Secuencias .
AtuXyn3 , Aspergillus tubigensis (sec. con núm. de ident . : 1) , 302 aa QASVSIDTKFKAHGKKYLGNIGDQYTLTK SKTPAI IKADFGALTPENSMKWDATEPSRGQ FSFSGSDYLV FAQSNNKLIRGHTLV HSQLPS VQAITDK TLIEVMKNHITTVMQHYKG KIYAWDVYNEIFNEDGSLRDSVFYQVIGEDYVRIAFETARAADPNAKLYI DYNLDSASYP KLTGMVSHVKKWIEAGIPIDGIGSQTHLSAGGGAGISGALNALAGAGTKEIAVTELDIAGA SSTDYVEWEACLDQPKCIGITVWGVADPDSWRSSSTPLLFDSNYNPKPAYTAIANAL TerXynl, Geosmithia emersonii (Taleromyces emersonii) (sec. con núm. de ident.:2) AGLNTAAKAIGLKYFGTATDNPELSDTAYETQLNNTQDFGQLTPA SMKWDATEPEQNVFT FSAGDQIA LAKANGQMLRCHNLVWYNQLPS VTSGS TNETLLAAMK HITNWTHYKGQ CYAWDW EALNDDGTYRSNVFYQYIGEAYIPIAFATAAAADPNAKLYYNDYNIEYPGAKA TAAQNLVKLVQSYGARIDGVGLQSHFIVGETPSTSSQQQNMAAFTALGVEVAITELDIRMQ LPETEALLTQQATDYQSTVQACA TKGCVGITV D TDKYSWVPSTFSGYGDACPWDANYQ KKPAYEGILTGLGQTVTSTTYIISPTTSVGTGTTTSSGGSGGTTGVAQHWEQCGGLGWTGP TVCASGYTCTVINEYYSQCL AtuXyn , Aspergillus tubigensis (sec. con núm. de ident.:3) EPIEPRQASVSIDTKFKAHGKKYLGNIGDQYTLTKNSKTPAIIKADFGALTPENSMKWDAT EPSRGQFSFSGSDYLVNFAQSNNKLIRGHTLVNHSQLPSWVQSITDKNTLIEVMKNHITTV MQHYKGKIYAWDWNEIFNEDGSLRDSVFYKVIGEDYVRIAFETARAADPNAKLYINDYNL DSASYPKLTGMVSHVKKWIAAGIPIDGIGSQTHLSAGGGAGISGALNALAGAGTKEIAVTE LDIAGASSTDYVEWEACLNQPKCIGITVWGVADPDSWRSSSTPLLFDSNYNPKPAYTAIA NAL AacXyn2 , Aspergillus aculeatus (sec. con núm. de ident . : 4 ) MVGLLSITAALAATVLPNIVSAVGLDQAAVAKGLQYFGTATDNPELTDIPYVTQLNNTADF GQITPGNSMKWDATEPSQGTFTFTKGDVIADLAEGNGQYLRCHTLVWYNQLPSWVTSGTNT NATLTAALKNHITNWSHYKGKCLHWDWNEALNDDGTYRTNIFYTTIGEAYIPIAFAAAA AADPDAKLFYNDYNLEYGGAKAASARAIVQLVKNAGAKIDGVGLQAHFSVGTVPSTSSLVS VLQSFTALGVEVAYTEADVRILLPTTATTLAQQSSDFQALVQSCVQTTGCVGFTIWDWTDK YSWVPSTFSGYGAALPWDENLVKKPAYNGLLAGMGVTVTTTTTTTTATATGKTTTTTTGAT STGTTAAHWGQCGGLNWSGPTACATGYTCTYVNDYYSQCL TreXyn3 , Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.:5) MKA VILCLLAPLVAALPTETIHLDPELAALRA LTERTADLWDRQASQSIDQLIKRKGKL YFGTATDRGLLQREK AAIIQADLGQVTPENSMKWQSLENNQGQLNWGDADYLVNFAQQNG KSIRGHTLIWHSQLPAWVNNINNADTLRQVIRTHVSTWGRYKGKIRA DW EIFNEDGT LRSSVFSRLLGEEFVSIAFRAARDADPSARLYINDYNLDRA YGKVNGLKTYVSKWISQGV PIDGIGSQSHLSGGGGSGTLGALQQLATVPVTELAITELDIQGAPTTDYTQWQACLSVSK CVGITV GISDKDSWRASTNPLLFDANFNPKPAYNSIVGILQ TreXyn5 , Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.:6) QCIQPGTGYNNGYFYSYWNDGHGGVTYCNGPGGQFSVNWSNSGNFVGGKGWQPGTKNRVIN FSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPS GATKLGEVTSDGSVYDIYRTQR VNQPSIIGTATFYQYNSVRRNHRSSGSVNTANHFNANAQQGLTLGTMDYQIVAVEGYFSSG SASITVSD BsuGluS, Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident.:7), 214 aa QTGGSFFDPFNGYNSGFWQKADGYSNGNMF CTWRANNVS TSLGEMRLALTSPAYNKFDC GENRSVQTYGYGLYEVRMKPAK TGIVSSFFTYTGPTDGTP DEIDIEFLGKDTTKVQFNY YTNGAGNHEKIVDLGFDAANAYHTYAFDWQPNSIKWYVDGQLKHTATNQIPTTPGKIMMNL WNGTGVDEWLGSYNGV PLYAHYDWVRYTKK TerGlul, Geosmithia emersonii (Taleromyces emersonii) (sec. con núm. de ident.:8) APVKEKGIKKRASPFQWFGSNESGAEFGNNNIPGVEGTDYTFPNTSAIQILIDQGMNIFRV PFLMERMVPNQMTGPVDSAYFQGYSQVINYITSHGASAVIDPHNFGRYYNNIISSPSDFQT FWHTIASNFADNDNVIFDTNNEYHDMDESLWQLNQAAIDGIRAAGATSQYIFVEGNSWTG A TWTQWDA ANLTDPQNKIVYEMHQYLDSDGSGTSDQCVNSTIGQDRVESATAWLKQNG KKAILGEYAGGANSVCETAVTGMLDYLAN TDVWTGAI AAGP WGDYIFSMEPPSGIAY EQVLPLLQPYL BsuGlul03FULL, Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident . : 9) DDYSWEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMKWLRDDWGITVF RAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDWHILSDNDPNIYKEEAKDFFDEM SELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVTWDNQIKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTNSQDVH HAADNQLADPNVMYAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDE AQVWIDFMDERNLSWANNSLTHKDESSAALMPGANPTGGWTEAELSPSGTFVREKIRESAS IPPSDPTPPSDPGEPDPGEPDPTPPSDPGEYPAWDSNQIYTNEIVYHNGQLNQAKNWTQNQ EPGDPYGPWEPLKSDPDSGEPDPTPPSDPGEYPAWDSNQIYTNEIVYHNGQLWQAKWWTQN QEPGDPYGPWEPLN TreGlu2 , Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident. :10) QQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNPYYAQCIPGATTI TSTRPPSGPTTTTRATST SSSTPPTSSGVRFAGVNIAGFDFGCTTDGTCVTSKVYPPLKNFTGSNNYPDGIGQMQHFVN DDGMTIFRLPVGWQYLVNNNLGGNLDSTSISKYDQLVQGCLSLGAYCIVDIHNYARWNGGI IGQGGPTNAQFTSLWSQLASKYASQSRVWFGIMNEPHDVNINTWAATVQEWTAIRNAGAT SQFISLPGNDWQSAGAFISDGSAAALSQVTNPDGSTTNLIFDVHKYLDSDNSGTHAECTTN NIDGAFSPLATWLRQNNRQAILTETGGGNVQSCIQDMCQQIQYLNQNSDVYLGYVGWGAGS FDSTYVLTETPTGSGNSWTDTSLVSSCLARK TreGlu3, Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident. :11) QTSCDQ ATFTGNGYTVSNNLWGASAGSGFGCVTAVSLSGGASWHADWQWSGGQNNVKSYQ NSQIAIPQKRTV SISSMPTTASWSYSGSNIRAVAYDLFTAA PNHVTYSGDYELMIWLG KYGDIGPIGSSQGTV VGGQSWTLYYGYNGAMQVYSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNK GYAAGQYVLSYQFGTEPFTGSGTL VAS TASI TreGlu4 , Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.:12) HGHINDIVINGVWYQAYDPTTFPYESNPPIWGWTAADLDNGFVSPDAYQNPDIICHKNAT NAKGHASVKAGDTILFQWVPVPWPHPGPIVDYLANCNGDCETVDKTTLEFFKIDGVGLLSG GDPGTNASDVLISNNNTWWKIPDNLAPGNYVLRHEIIALHSAGQANGAQNYPQCFNIAVS GSGSLQPSGVLGTDLYHATDPGVLINIYTSPLNYIIPGPTWSGLPTSVAQGSSAATATAS ATVPGGGSGPTSRTTTTARTTQASSRPSSTPPATTSAPAGGPTQTLYGQCGGSGYSGPTRC APPATCSTNPYYAQCLN TreGlu6 , Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.:13) AFSWKNVKLGGGGGFVPGIIFHPKTKGVAYARTDIGGLYRLNADDSWTAVTDGIADNAGWH NNGIDAVALDPQDDQKVYAAVGMYTNSWDPSNGAIIRSSDRGATWSFTNLPFKVGGNMPGR GAGERLAVDPANSNIIYFGARSGNGLWKSTDGGVTFSKVSSFTATGTYIPDPSDSNGYNSD KQGLMWVTFDSTSSTTGGATSRIFVGTADNITASVYVSTNAGSTWSAVPGQPGKYFPHKAK LQPAEKALYLTYSWWPDAQLFRSTDSGTTWSPIWAWASYPTETYYYSISTPKAPWIKNNFI DVTSESPSDGLIKRLGWMIESLEIDPTDSNHNLYGTGMTIFGGHDLTNWDTRHNVSIQSLA DGIEEFSVQDLASAPGGSELLAAVGDDNGFTFASRNDLGTSPQTVWATPTWATSTSVDYAG NSVKSWRVGNTAGTQQVAISSDGGATWSIDYAADTSMNGGTVAYSADGDTILWSTASSGV QRSQFQGSFASVSSLPAGAVIASDKKTNSVFYAGSGSTFYVSKDTGSSFTRGPKLGSAGTI RDIAAHPTTAGTLYVSTDVGIFRSTDSGTTFGQVSTALTNTYQIALGVGSGSNWNLYAFGT GPSGARLYASGDSGASWTDIQGSQGFGSIDSTKVAGSGSTAGQVYVGTNGRGVFYAQGTVG GGTGGTSSSTKQSSSSTSSASSSTTLRSSWSTTRASTVTSSRTSSAAGPTGSGVAGHYAQ CGGIGWTGPTQCVAPYVCQKQNDYYYQCV TreGlu7 , Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.:14) HGQVQNFTINGQYNQGFILDYYYQKQNTGHFPNVAGWYAEDLDLGFISPDQYTTPDIVCHK NAAPGAISATAAAGSNIVFQWGPGVWPHPYGPIVTYWECSGSCTTVNKNNLRWVKIQEAG INYNTQVWAQQDLINQGNKWTVKIPSSLRPGNYVFRHELLAAHGASSANGMQNYPQCVNIA VTGSGTKALPAGTPATQLYKPTDPGILFNPYTTITSYTIPGPALWQG TreGlu8, Trichoderma reesei (sec. con núm. de ident.:15) GKIKYLGVAIPGIDFGCDIDGSCPTDTSSVPLLSYKGGDGAGQMKHFAEDDGLNVFRISAT WQFVLNNTVDGKLDELNWGSYNKWNACLETGAYCMIDMHNFARYNGGIIGQGGVSDDIFV DLWVQIAKYYEDNDKIIFGLMNEPHDLDIEINAQTCQKWTAIRKAGATSQMILLPGTNFA SVETYVSTGSAEALGKITNPDGSTDLLYFDVHKYLDINNSGSHAECTTDNVDAFNDFADNL RQNKRQAIISETGASMEPSCMTAFCAQNKAISENSDVYIGFVGWGAGSFDTSYILTLTPLG KPGNYTDNKLMNECILDQFTLDEKYRPTPTSISTAAEETATATATSDGDAPSTTKPIFREE TASPTPNAVTKPSPDTSDSSDDDKDSAASMSAQGLTGTVLFTVAALGYMLVAF BsuGluC CBD, Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident . : 16) MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASAAGTKTPVAKNGQLSIKGTQLVNRDGKAVQLKG ISSHGLQWYGEYVNKDSLKWLRDDWGITVFRAAMYTADGGYIDNPSVKNKVKEAVEAAKEL GIYVIIDNHILNDGNPNQNKEKAKEFFKEMSSLYGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDIKPY AEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTW3QDVNDAADDQLKDANVMYALHFYAGTHGQFLRDKAN YALSKGAPIFVTEWGTSDASGNGGVFLDQSRENLKYLDSKTISNVNWNLSDKQESSSALKP GASKTGGWRLSDLSASGTFVRENILGTKDSTKDIPETPSKDKPTQENGISVQYRAGDGSMN SNQIRPQLQIKNNGNTTVDLKDVTARYWYKAKNKGQNFDCDYAQIGCGNVTHKFVTLHKPK QGADTYLELGFKNGTLAPGASTGNIQLRLHNDDNSNYAQSGDYSFFKSNTFKTTKKITLYD QGKLIWGTEPN BsuXyn3, variante de xilanasa Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident. :17) ASTDYWQNWTFGGGIVNAVNGSGGNYSV WSNTGNFWGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPN GNGYLTLYGWTRSPLIEYYWDSWGTYRPTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDD TTFTQY SVRQSKRPTGSNATITFSNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQVMATEGYQSSGSSNVT VW BsuXyn , variante de xilanasa Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident . :18) ASTDYWQNWTDGYGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFWGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPN GNGYLTLYG TRSPLIEYYWDSWGTYRPTGTYKGTVYSDGGWYDIYTATRDNAPSIDGDF TTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHV A RSHGMDLGSNWAYQVMATEGYLSSGSSNVT VW Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Una enzima que exhibe actividad de e???-1,4-ß-xilanasa; caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera que se selecciona de la sec . con núm. de ident.:l, o cualquier fragmento funcional de esta.
2. La enzima de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene por lo menos 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con cualquier secuencia de aminoácidos que se selecciona de la sec. con núm. de ident. : 1, o cualquier fragmento funcional de esta.
3. Una construcción de ADN caracterizada porque comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, tal como un vector de expresión recombinante.
4. Una célula caracterizada porque se ha transformado con una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3.
5. Una preparación caracterizada porque comprende una enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, o una célula de conformidad con la reivindicación 4.
6. Una composición caracterizada porque comprende una enzima que exhibe actividad de endo-1, 4- -xilanasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, en combinación con una o más ß-glucanasas, tal como una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) - ß-glucanasa; la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con cualquiera de las que se seleccionan de la sec . con núm. de ident.:7, la sec . con núm. de ident.:8, la sec. con núm. de ident.:9, la sec. con núm. de ident.:10, y la sec. con núm. de ident.:ll, la sec. con núm. de ident.:12, la sec. con núm. de ident.:13, la sec. con núm. de ident. :14, la sec. con núm. de ident.:15, la sec. con núm. de ident.:16, o cualquier fragmento funcional de estas.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 6; caracterizada porque comprende una combinación de por lo menos dos enzimas; esas dos enzimas, o dos enzimas con una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad de secuencia con la respectiva identidad de secuencia, o cualquier fragmento funcional de estas, se seleccionan de la lista que consiste en la sec. con núm. de ident.:l y la sec. con núm. de ident.: 7; la sec. con núm. de ident . : 1 y la sec. con núm. de ident . : 8 ; la sec. con núm. de ident .: 1 y la sec. con núm. de ident:9; la sec . con núm. de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident :10; la sec . con núm . de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident :11; la sec . con núm . de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident :12; la sec . con núm . de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident :13; la sec . con núm. de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident : 14; la sec . con núm. de ident . : 1 y la sec . con núm. de ident : 15; y la sec . con núm . de ident . : i y la sec. con núm . de ident . : 16.
8 . El uso de una enzima de conformidad con las reivindicaciones 1-2, o una preparación de conformidad con la reivindicación 5, o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en la producción de un alimento, pienso, o bebida de malta, en la producción de masa o productos horneados, en la preparación de pasta o papel, para la preparación de componentes de cereales, tal como en los que el cereal es centeno, trigo o cebada, en la producción de cerveza o modificación de subproductos de un proceso de destilación, en la producción de vino o zumo, o en la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol .
9. Un método para alterar la filtrabilidad de un material que comprende almidón; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las reivindicaciones 1-2, o una preparación de conformidad con la reivindicación 5, o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7.
10. Un método para reducir la presión acumulada durante la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación; caracterizado porque comprende la etapa de tratar una mezcla de destilación con una enzima de conformidad con las reivindicaciones 1-2, o una preparación de conformidad con la reivindicación 5, o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7.
11. Un método para la producción de un alimento, pienso, o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de cereales o malta, como cerveza o whisky; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las reivindicaciones 1-2, o una preparación de conformidad con la reivindicación 5, o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7.
12. Un método para la producción de una mezcla de destilación; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las modalidades 1-2, o una preparación de conformidad con la reivindicación 5, o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7.
13. Un método para la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con las modalidades 1-2, o una preparación de conformidad con la reivindicación 5, o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7.
14. Un producto caracterizado porque se obtiene mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-13.
15. Una composición caracterizada porque comprende el producto de conformidad con la reivindicación 14, en donde el producto está en un intervalo de 0.1 %-99.9 %.
16. Una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa; caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la sec. con núm. de ident.:7, o cualquier fragmento funcional de esta .
17. Una construcción de ADN caracterizada porque comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima de conformidad con la reivindicación 16, tal como un vector de expresión recombinante .
18. Una célula caracterizada porque se ha transformado con una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 17.
19. Una preparación caracterizada porque comprende una enzima de conformidad con la reivindicación 16, o una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 17, o una célula de conformidad con la reivindicación 18.
20. Una composición caracterizada porque comprende una enzima que exhibe actividad de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa de conformidad con la reivindicación 16, en combinación con una o más xilanasas.
21. El uso de una enzima de conformidad con la reivindicación 16, o una preparación de conformidad con la reivindicación 19, o una composición de conformidad con la reivindicación 20, en la producción de un alimento, pienso, o bebida de malta, en la producción de masa o productos horneados, en la preparación de pasta o papel, para la preparación de componentes de cereales, tal como en los que el cereal es centeno, trigo o cebada, en la producción de cerveza o modificación de subproductos de un proceso de destilación, en la producción de vino o zumo, o en la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol .
22. Un método para alterar la filtrabilidad de un material que comprende almidón; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con la reivindicación 16, o una preparación de conformidad con la reivindicación 19, o una composición de conformidad con la reivindicación 20.
23. Un método para reducir la presión acumulada durante la separación de los residuos en una aplicación durante la destilación; caracterizado porque comprende la etapa de tratar una mezcla de destilación con una enzima de conformidad con la reivindicación 16, o una preparación de conformidad con la reivindicación 19, o una composición de conformidad con la reivindicación 20.
24. Un método para la producción de un alimento, pienso, o bebida, tal como una bebida alcohólica o sin alcohol, tal como una bebida a base de cereales o malta, como cerveza o whisky; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con la reivindicación 16, o una preparación de conformidad con la reivindicación 19, o una composición de conformidad con la reivindicación 20.
25. Un método para la producción de una mezcla de destilación; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con la reivindicación 16, o una preparación de conformidad con la reivindicación 19, o una composición de conformidad con la reivindicación 20.
26. Un método para la producción de un combustible biológico de primera o segunda generación, tal como bioetanol; caracterizado porque comprende la etapa de tratar el material que comprende almidón con una enzima de conformidad con la reivindicación 16, o una preparación de conformidad con la reivindicación 19, o una composición de conformidad con la reivindicación 20.
27. Un producto caracterizado porque se obtiene mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-26.
28. Una composición caracterizado porque comprende el producto de conformidad con la reivindicación 27, donde el producto está en un intervalo de 0.1 %-99.9 %.
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