MX2013009353A

MX2013009353A - Aparato y proceso para la produccion de un producto de celulas encapsuladas.

Info

Publication number: MX2013009353A
Application number: MX2013009353A
Authority: MX
Inventors: Lisa Beckler Andersen; Christine A Singer; John H Evans Iv
Original assignee: Geosynfuels Llc
Priority date: 2011-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2013-09-26
Also published as: AU2012217733A1; CA2827382A1; US20160032270A1; EA201391184A1; US20120208255A1; WO2012112617A2; EP2675887A2; BRPI1101647A2; BRPI1101646A2; AP2013007111A0; CO6862129A2; US20140335588A1; BRPI1101614A2; CL2013002359A1; PH12013501684A1; ZA201306710B; CR20130456A; PE20141133A1; CN103492563A; WO2012112617A3

Abstract

Se describe un proceso para la producción de un producto celular encapsulado, el proceso comprende los pasos de concentrar las células a partir de un medio de propagación utilizando un sistema de filtración por flujo tangencial. El mezclado de las células concentradas con un medio de encapsulamiento para formar una mezcla de encapsulamiento celular. La polimerización, gelificación o reticulación de la mezcla de encapsulamiento celular para formar un producto celular encapsulado.

Description

APARATO Y PROCESO PARA LA PRODUCCION DE UN PRODUCTO DE CELULAS ENCAPSULADAS Campo de la Invención El presente documento de patente se refiere a un aparato y proceso para el encapsulamiento de células en un medio de encapsulamiento tal como una matriz polimérica.

Antecedentes de la Invención Aunque es sabido que las células pueden ser encapsuladas en una matriz polimérica, se sabe muy poco respecto a intentar producir células encapsuladas a un nivel industrial. La elevación de escala de cualquier proceso a menudo presenta numerosos obstáculos y la elevación de escala de producción de células encapsuladas no es diferente. Mientras que los recipientes de laboratorio y centrífugas pueden ser suficientes para crear una pequeña cantidad de células atrapadas en un laboratorio, las técnicas y . el ,..equipo de laboratorio no pueden ser elevadas de escala para producir de manera efectiva cantidades grandes de células encapsuladas para el uso en biorreactores grandes a escala industrial.

A pesar de las ventajas logradas por el uso de las células encapsuladas, no existen aparatos o ; procesos diseñados para producir un producto de células encapsuladas a gran escala. Por ejemplo, sería benéfico ser capaces de producir productos de células encapsuladas para suministrar Ref. 243178 reactores a la escala de 20,000 L (o 75,000 gal.) o una serie de tales reactores.

Nagashima et al., en Continuous Ethanol Fermentation Using Immobilizad Yeast Cells publicada en 1984 en Biotechnology Bioengineering, Volumen 26, páginas 992-997 describe la producción de levaduras encapsuladas en alginato de calcio, pero únicamente para suministrar a un reactor de investigación relativamente pequeño (1000 L) . En su descripción, la preparación de la levadura encapsulada en esferas de alginato de calcio "fue llevada a cabo mediante lavado con gotas de solución de alginato de sodio que contenían células de levadura vivas desde la boquilla superior dentro de la solución de cloruro de calcio en los reactores. La preparación de las esferas celulares fue completada dentro de varias horas" . El aparato y los métodos descritos en Nagashima et al., podrían no ser adecuados para producir grandes cantidades de esferas.

Similarmente , sistemas comercialmente disponibles para la producción de esferas de cualquier tamaño son limitados. LentiKat's Biotechnologies aconseja un sistema comercial para la producción de esferas, no 'obstante, el sistema de LentiKat's proporciona únicamente un producción a escala pequeña adecuada para experimentos pequeños y no para la producción industrial.

Además, muchos de los procesos utilizados 'para encapsular células en una matriz polimérica a la escala de laboratorio podrían no ser practicables a gran escala, dado su consumo de los productos empleados para encapsular las células. El uso ineficiente del medio de encapsulamiento y otros suministros no es un problema grande cuando se realiza a una escala pequeña. Sin embargo, tal uso ineficiente de los recursos puede ser extremadamente costoso cuando se eleva la escala. Para este fin, los procesos y aparatos que pueden producir eficientemente productos de células encapsuladas , son necesarias. Además, el proceso y los aparatos que pueden ser elevados de escala y producir efectivamente productos de células encapsuladas, son necesarios.

Breve Descripción de la Invención En vista de lo anterior, un objetivo de acuerdo a un aspecto del presente documento de patente es proporcionar aparatos y procesos mejorados para la producción . de un producto de célula encapsulada. Los aparatos y procesos pueden ser utilizados para producir productos d<$; gelulas •encapsuladas a una escala grande o pequeña. Preferentemente, los aparatos y procesos enfrentan o al menos mejoran uno o más de los problemas descritos anteriormente. Para este fin, es proporcionado un proceso para la producción de un producto de células encapsuladas. El proceso comprende los pasos de: concentrar las células a partir de un medio de propagación utilizando un sistema de filtración por flujo tangencial ; mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamiento para formar una mezcla de encapsulamiento de células; y polimerizar la mezcla de encapsulamiento de células para formar un producto de células encapsuladas.

En una modalidad del proceso descrito en la presente, las células son concentradas en el retenido del sistema de filtración de flujo tangencial. En modalidades que concentran las células en el retenido del sistema de filtración de flujo tangencial, una porción del retenido puede ser utilizada como un inoculo para una producción subsiguiente para un producto de células encapsuladas. En modalidades que incluyen el uso del retenido, el retenido puede ser reciclado entre un recipiente de mantenimiento de retenido y el sistema de filtración de flujo tangencial. En ciertas modalidades, el retenido puede ser continuamente reciclado hasta que el retenido alcanza una concentración celular mayor de 180 gramos de masa húmeda de células por litro . 1 En otras modalidades, el paso de mezclado es realizado con un dispositivo que ayuda a preservar la viabilidad de las células. En una modalidad es utilizado un agitador de movimiento alternante. En otra modalidad más, es utilizado un disco de movimiento alternante.

En otra modalidad más, se proporciona un proceso para la producción de un producto de células encapsuladas. El proceso comprende: concentrar las células a partir de un medio de propagación utilizando un sistema de filtración por flujo tangencial, en donde las células son concentradas en un retenido, y el retenido es reciclado a través del sistema de filtración por flujo tangencial hasta que es alcanzada una concentración celular deseada; mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamiento para formar una mezcla de encapsulamiento de células; y polimerizar la mezcla de encapsulamiento de células para formar un producto de células encapsuladas .

En otras modalidades, las células pueden ser utilizadas a partir de medios de propagación como un inoculo para una producción subsiguiente de un producto celular encapsulado. En algunas modalidades, el retenido reciclado entre un recipiente de mantenimiento del retenido y el sistema de filtración por flujo tangencial. En modalidades particulares, el retenido reciclado a través del sistejna de filtración por flujo tangencial hasta que es lograda una concentración celular mayor de 180 gramos de masa húmeda de células por litro.

En las modalidades descritas en la presente, numerosos agentes pueden ser agregados durante el proceso incluyendo: nutrientes, vitaminas y antibióticos por nombrar unos pocos. En algunas modalidades, los agentes tales como los nutrientes pueden ser agregados a través de un filtro estéril.

En otra modalidad más de un sistema para la producción de un producto de células encapsuladas, el sistema comprende: un biorreactor; un medio de concentración celular en comunicación con el biorreactor; y un agitador de movimiento alternante operativamente acomodado para mezclar una suspensión de células a partir del medio de concentración de células con un medio de encapsulamiento . El medio de concentración del sistema puede ser un sistema de filtración por flujo tangencial en algunas modalidades. En otras modalidades del sistema el biorreactor es un biorreactor quimiostático .

En otro aspecto más, es proporcionada una modalidad de un proceso para la producción de un producto de células encapsuladas. El proceso comprende: propagar las células en un recipiente desechable para formar un primer' lote de células; concentrar las células a partir del primer lote de células; mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamiento para formar una mezcla de encapsulamiento de células; polimerizar la mezcla de encapsulamiento de células para formar un producto de células encapsuladas; y propagar las células en un recipiente desechable para formar un segundo lote de células utilizando células a partir del primer lote de células como un inoculo. E . .algunas modalidades, el recipiente desechable puede ser reutilizado para entre 2 y 10 lotes de células. En otras modalidades, el recipiente desechable puede ser reutilizado para entre 2 y 4 lotes de células. En algunas modalidades, el recipiente desechable puede ser una bolsa desechable. En algunas de esas modalidades la bolsa desechable puede ser elaborada de un polímero plástico.

En los sistemas que incorporan un recipiente desechable, el recipiente desechable puede ser adaptado para propagar lotes de células. El sistema puede incluir un medio para mezclar los lotes de células y un medio para mezclar los lotes concentrados de las células con un medio de encapsulamiento. ; En otro aspecto más, se proporciona un sistema para la producción de un producto de células encapsuladas . El sistema comprende: un biorreactor; un sistema de filtración por flujo tangencial en comunicación con el biorreactor™; ' y un recipiente de mantenimiento del retenido en comunicación con el sistema de filtración por flujo tangencial.

En otra modalidad más del sistema, el : sistema incluye además un agitador de movimiento alternante operativamente acomodado para mezclar una suspensión celular a partir del recipiente de mantenimiento del retenido .con un medio de encapsulamiento.

En otra modalidad más del sistema, el bi rfeactor es un biorreactor quimiostático . Un biorreactor quimiostá ico es un tipo de biorreactor que permite que las modalidades del sistema sean continuamente operadas.

En otra modalidad más, se proporciona un proceso para la producción de un producto de células encapsuladas . El producto comprende los pasos de: concentrar las células a partir de un medio . de propagación; mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamiento utilizando un agitador de movimiento alternante para formar una mezcla de encapsulamiento de células; y polimerizar la mezcla de encapsulamiento de células para formar un producto de células encapsuladas.

En una modalidad del proceso, las células son concentradas a más de 180 gramos de masa húmeda de células por litro. En otra modalidad más, el medio de encapsulamiento tiene una viscosidad de aproximadamente 1000 a 35000 centistokes (cSt) , o más preferentemente 2000 a 3000 centistokes (cSt) . En otra modalidad más, la mezcla de encapsulamiento de células tiene una viscosidad de aproximadamente 1000 a 3500 cSt o más preferentemente 1500 a 2500 cSt . i En otro aspecto más, es proporcionado un proceso por lotes para la producción de un producto de células encapsuladas. El proceso comprende los pasos de: propagar las células en un biorreactor para formar un primer ' l'óte de células; concentrar las células a partir del rimeé lote de células; mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamiento para formar una mezcla de encapsulamiento de células; polimerizar la mezcla de encapsulamiento de células para formar una producto de células encapsuladas ,- y propagar las células en un biorreactor para formar un segundo lote de células utilizando las células provenientes del primer lote de células, como un inoculo.

En otra modalidad más, el biorreactor no es esterilizado entre la propagación del primer lote de células y la propagación del segundo lote de células.

En otra modalidad más, el paso de concentración es realizado mediante un sistema de filtración por flujo tangencial y las células son concentradas en un retenido. En las modalidades que incluyen un sistema de filtración por flujo tangencial, una porción del retenido puede ser utilizada como el inoculo. En otras modalidades, el retenido puede ser reciclado entre un recipiente de mantenimiento del retenido y el sistema de filtración por flujo tangénc.ial. En ciertas modalidades, el paso de reciclamiento es . realizado hasta que el retenido alcanza una concentración celular mayor de 180 gramos de masa húmeda de células por litro.

En otra modalidad más, el inoculo . comprende aproximadamente 5 % a 10 % del volumen del primer lote de células . : : En otro aspecto más, se proporciona un proceso para la producción de un producto de células encapsuladas. El proceso comprende los pasos de: mezclar una solución acuosa con un medio de encapsulamiento concentrado para formar un medio de encapsulamiento, en donde el mezclado es realizado sin la adición de calor suficiente para esterilizar el medio de encapsulamiento; mezclar las células con el medio de encapsulamiento sin calentamiento para formar una mezcla de encapsulamiento de células; y polimerizar la mezcla de encapsulamiento de células para producir un producto de células encapsuladas.

En una modalidad, es agregado un agente de esterilización acuosa. El medio de encapsulamiento concentrado es luego esterilizado vía la solución acuosa cuando los dos son mezclados entre sí. En algunas de esas modalidades, el agente de esterilización es clorito de sodio.

En otras modalidades, el proceso puede ser variado por la inclusión de diversos aditivos adicionales. Por ejemplo, algunas modalidades incluyen el paso adicional de agregar antibióticos al medio de encapsulamiento. 'En otras modalidades, son agregados nutrientes al medio de encapsulamiento. En otras modalidades, son agregadas vitaminas al medio de encapsulamiento. - En otra modalidad más, es realizado _ un paso adicional de irradiar el medio de encapsulamiento concentrado. En vez de o en adición a la irradiación del medio de encapsulamiento concentrado, el medio de encapsulamiento puede ser irradiado.

En otra modalidad más, el medio de encapsulamiento concentrado comprende alginato de sodio. En una modalidad donde el medio de encapsulamiento concentrado comprende alginato de sodio, el alginato de sodio es mezclado con la solución acuosa para producir un medio de encapsulamiento con una viscosidad de aproximadamente 1000 a 3500 centistokes o más preferentemente 2000-3000 centistokes. En otra modalidad más, el medio de encapsulamiento tiene una concentración de alginato de sodio de 3.0 % o menos peso por volumen, preferentemente 2.5 % o menos, y aun más preferentemente aproximadamente 2.0 % peso por volumen. En otra modalidad más, la mezcla de encapsulamiento de células tiene una viscosidad de aproximadamente 1000 a 3500 centistokes o más preferentemente 1500 a 2500 centistokes.

En otro aspecto más, es proporcionada una i esfera de alginato para el encapsulamiento de una célula. La esfera comprende: alginato polimerizado en una concentraei¡on.-de 3 % o menos peso por volumen; y una célula encapsulada .· En otras modalidades, la concentración de alginato es preferentemente de 2.5 % o menos peso por volumen, y más preferentemente aproximadamente 2.0 % peso por volumen. En algunas modalidades, la concentración de alginato está en un intervalo de aproximadamente 1.0 % a 3.0 % peso por volumen.

En otras modalidades, la concentración de alginato está en un intervalo de aproximadamente 1.0 % a 2.5 % peso por volumen. En otras modalidades adicionales, la concentración de alginato está en un intervalo de aproximadamente 1 % a 2 % peso por volumen.

En diversas modalidades diferentes, la célula encapsulada pueden ser diferentes tipos de células. En algunas modalidades, la célula encapsulada es una célula seleccionada del grupo que consiste de una levadura, una bacteria, y una célula animal. En algunas modalidades, la célula encapsulada es una célula en una concentración sustancialmente alta de células. En algunas modalidades, la célula encapsulada es una levadura o preferentemente una levadura seleccionada del grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Candida, Kluyveromyces, Pachysolen, Pichia, y Saccharomyces. En otras modalidades adicionales de una esfera de alginato, la célula encapsulada es una bacteria y preferentemente una bacteria en un género seleccionado de Escherichia coli, y Zymomonas mobilis. ', ' En diferentes modalidades, pueden ser utilizadas diferentes concentraciones de células. En algunas modalidades la célula de levadura puede ser una de una pluralidad de células de levadura, en donde las células de: levadura comprenden 25 % o más de la masa de la esfera de alginato. En otras modalidades, la célula de levadura es una de una pluralidad de células de levadura en una concentración de 5 gramos de célula por 100 mililitro de alginato.

En algunas modalidades, la esfera de alginato comprende además un antibiótico y preferentemente un antibiótico seleccionado del grupo que consiste de penicilina y virginiamicina .

En otras modalidades adicionales, la esfera de alginato comprende además vitaminas y preferentemente la vitamina es biotina. En algunas modalidades, la esfera de alginato puede comprender nutrientes. Los nutrientes pueden ser licor de infusión de maíz. Los nutrientes pueden tener diversas concentraciones. En algunas modalidades utilizando el licor de infusión de maíz, el licor de infusión de maíz es 1 % a 5 % del volumen de la esfera de alginato.

En otro aspecto más, es proporcionada una esfera de alginato para el encapsulamiento de una célula. La esfera de alginato comprende: alginato polimerizado; y: células encapsuladas que comprenden al menos 25 % de la másalde la esfera de alginato. En algunas de estas modalidades, la concentración de alginato es 2.5 % o menos peso por volumen. En otras modalidades, la concentración de alginato es de aproximadamente 2.0 % peso por volumen. En:, algunas modalidades, la concentración de alginato está '. en un intervalo de aproximadamente 1.0 % a 3.0 % peso por' volumen. En otras modalidades, la concentración de alginato está en un intervalo de aproximadamente 1.0 % a 2.5 % peso por volumen. En otras modalidades adicionales, la concentración de alginato está en un intervalo de aproximadamente 1.0 % a 2.0 % peso por volumen.

Los aparatos y métodos para producir las células atrapadas descritas en la presente proporcionan soluciones elevables de escala que pueden ser utilizadas para la producción en masa. Aspectos, objetivos, características deseables y ventajas adicionales de los dispositivos y métodos descritos en la presente, serán entendidos mejor a partir de la descripción detallada y de las figuras que siguen, en las cuales las diversas modalidades son ilustradas a manera de ejemplo. Se debe entender expresamente, no obstante, que las figuras son para fines de ilustración únicamente y no están destinadas como una definición de los límites de las modalidades reclamadas.

Breve Descripción de las Figuras ¦ La Figura 1 ilustra un proceso general, para la producción de un producto de células encapsuladas. j :¡| La Figura 2 ilustra un proceso para la producción del medio de encapsulamiento a partir de un polímero de encapsulamiento seco.

La Figura 3A ilustra una modalidad de un proceso para la producción para la suspensión de células concentradas.

La Figura 3B ilustra una modalidad de un sistema para la producción de una suspensión celular concentrada como se muestra en la Figura 3A.

La Figura 4 es una vista en corte parcial de un biorreactor ejemplar para propagar células.

Descripción Detallada de la Invención Consistente con su significado biológico ordinario, el término "célula" es utilizado en la presente para referirse a la unidad más pequeña de vida que es una cosa viviente. "Célula" incluye células Procarióticas y Eucarióticas . A manera de ejemplo, "célula" incluye pero no está limitada a bacterias, levaduras, células de hongos, de algas, de insectos o de mamíferos, por nombrar unas pocas.

Las células que pueden ser encapsuladas incluyen células simples, incluyendo todas las células derivadas de cualquier miembro de los reinos vegetal, animal,, fúngico, protista, eubacterias o arqueobacterias . Las célulás simples pueden ser células derivadas de o retiradas de una planta viviente, animal, u hongo, de otro modo conocidas como células primarias. Las células primarias pueden ser derivadas, por ejemplo, de tejidos de mamífero, tejidos de insecto, tejidos de nemátodos, tejidos de Arabid psis, tejidos de plantas de tomate, o tejidos de plantas de tabaco. Las células primarias pueden también ser aisladas dé hongos o de protistas .

Las células simples para el encapsulamiento pueden también ser derivadas de líneas establecidas de cultivo celular. Por ejemplo, las células pueden ser derivadas de las líneas celulares cultivadas tales como la línea celular de mamífero HeLa, líneas de células vegetales, líneas de células de algas, líneas de células de insecto tales como las células Sf9, y líneas celulares de nemátodos, insectos, anfibios, reptiles y otros animales y plantas.

Las células pueden también ser fabricadas. Por ejemplo, las células pueden ser derivadas de fusiones de dos células diferentes, tales como células hibridomas .

Además de las células simples, los grupos funcionales de células o tejidos celulares pueden ser inmovilizados mediante encapsulamiento. Los tejidos celulares podrían incluir cualesquiera tejidos derivados de plantas, protistas, hongos o animales. Por ejemplo, grupos de- células tales como un acino (un tejido) proveniente de un- páncreas humano o espacio conectado por tejido conectivo o grupos de otro modo funcionalmente conectados de células neuronales y gliales pueden ser encapsulados . ; El término "microbio" es utilizado en la presente para referirse a su significado ordinario de un organismo que es unicelular. Como ejemplos no limitantes, "microbio" incluye levaduras, bacterias, hongos, arqueas, protistas, plancton y planarias por nombrar unos pocos. El término "microbio" es completamente abarcado por el término "célula" .

El término "encapsular" o "encapsulamiento" es utilizado en la presente para referirse al encerramiento de las células en un medio de encapsulamiento. El "encapsulamiento de las células es realizado en un medio de encapsulamiento que es lo suficientemente poroso para permitir que los nutrientes y otros productos necesitados por la célula fluyan dentro, y los subproductos producidos por la célula fluyan hacia afuera, al tiempo que previenen que la célula escape. "Encapsulamiento" como se utiliza en la presente, incluye los procesos conocidos en general como la inmovilización de las células, aunque se pueden movilizar células en formas diferentes del encapsulamiento, por ejemplo mediante adsorción a un sustrato. Más en general, el "encapsulamiento" incluye cualquier tipo de proceso que forma un alojamiento o cápsula alrededor de las células, incluyendo técnicas de inmovilización celular.

Los medios de encapsulamiento para el encapsulamiento de células pueden incluir materiales naturales y sintéticos. A manera de ejemplo no limitante, los medios de encapsulamiento incluyen numerosos polímeros naturales y sintéticos. Los materiales naturales. , incluyen alginato, un producto natural proveniente de las algas cafés (algamarina) , carragenano, gomas de xantano, quitosano, agarosa, agar, colágeno, celulosa y sus ' 'derivados , hialuronato, pectina, fibrina, proteína, ácidos nucleicos y gelatina. Los materiales sintéticos utilizados para el encapsulamiento incluyen resina epóxica, resinas reticulables por luz, poli (alcohol vinílico) , poliacrilamida, poliéster, poliestireno, poli (ácido acrílico) , poli (óxido de etileno) , polifosfazeno y poliuretano.

En algunas aplicaciones, dos o más materiales pueden ser utilizados como el medio de encapsulamiento, por ejemplo, alginato y alcohol polivinílico o copolímeros de poli (óxido de etileno) y poli (óxido de propileno) o de poli (ácido láctico) que podrían ser utilizados como una matriz de encapsulamiento.

Las células encapsuladas en una matriz polimérica pueden ser utilizadas para muchos procesos industriales diferentes, incluyendo por ejemplo fermentación, y tratamiento con agua de desecho. El encapsulamiento en matriz de las células incluye numerosos beneficios sobre los usos de las células "libres". Las células "libres" son células que no son encapsuladas o inmovilizadas de ninguna manera". Una de las ventajas más grandes de los sistemas d células encapsuladas sobre los sistemas de células "libres" es las altas densidades celulares que puede alcanzar un sistema de células encapsuladas. Las altas densidades celulares son deseables en numerosos procesos fermentativos diferentes como la producción de productos químicos basados en material biológico, tales como el ácido 2 -hidroxipropiónico, ácido glucárico, ácido levulínico, xilitol, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, etanol y similares. La alta densidad celular lograda por los sistemas de células encapsuladas en matriz es benéfica para alcanzar altas productividades volumétricas, todavía los sistemas de células libres no están disponibles para alcanzar tales altas densidades celulares.

Otra ventaja más del encapsulamiento en matriz de las células es que el encapsulamiento facilita la operación continua en vez de por lotes de los procesos bioquímicos, tales como los procesos de fermentación, sin lavado de los biocatalizadores celulares. Los procesos de fermentación continua experimentan menos tiempo perdido en comparación a los procesos en lotes. Menos tiempo perdido da una ventaja económica a los sistemas continuos. Además del menor tiempo perdido, la prevención del lavado celular en un sistema continuo representa grandes ahorros en costo, ya: ¾ e la propagación de las células para un proceso industrial es costosa.

En ciertas aplicaciones, el uso de los sistemas celulares encapsulados proporciona ventajas además de la alta densidad celular y la prevención del lavado. En aplicaciones donde el medio que hace contacto con las células contiene compuestos que son dañinos para las células, el encapsulamiento de las células en una matriz : confiere resistencia incrementada a los compuestos dañinos. Por ejemplo, la fermentación del hidrolizado de biomasa vegetal para producir biocombustibles es a menudo complicada por la presencia de varios compuestos diferentes que. son dañinos para el proceso de fermentación. El encapsulamiento de las células microbianas en una matriz polimérica, alginato de calcio, por ejemplo, confiere resistencia incrementada a los compuestos, y de este modo mejora el proceso fermentativo.

El presente documento de patente enseña procesos y aparatos nuevos y mejorados para la producción de un producto de células encapsuladas. Previamente, los procesos para producir los productos de células encapsuladas fueron diseñados para un uso final específico, o fueron realizados a una escala relativamente pequeña, o ambos. El presente documento de patente enseña los novedosos procesos que incrementan la capacidad de producción de los productos de células encapsuladas.

La Figura 1 ilustra un proceso general: para la producción de un producto de células encapsuladas 106. En la modalidad del proceso 100 mostrada en la Figuré- 1, las células 101 son combinadas con un medio de encapsulamiento 102 en el paso de mezclado 103, para producir una mezcla de encapsulamiento celular 104. Las células 101 son preferentemente proporcionadas en una suspensión que', ha sido preparada para el encapsulamiento. Una solución del medio de encapsulamiento 102 es mezclada junto con las células suspendidas 101 para producir la mezcla de encapsulamiento celular 104. Una vez que la mezcla de encapsulamiento de células es producida, ésta es polimerizada, gelificada o reticulada en el paso 105 para producir un producto de células encapsuladas 106.

Las células 101 pueden ser células bacterianas, de levaduras, de hongos, de algas, de insectos o de mamíferos, o cualquier otro tipo celular como se explicó anteriormente. Las células 101 pueden también comprender una combinación de tales células. Las células 101 pueden también ser parte de un grupo funcional de células o tejidos, o ser un producto de la fusión celular tal como una célula hibridoma . Las células 101 pueden también ser una mezcla de células que se desarrollan simbióticamente, por ejemplo una mezcla de células de algas o una mezcla de células de levaduras o de hongos. El tipo, combinación y densidad de las células 101 son dependientes del uso deseado del producto de células encapsuladas 106 final . ¦ Las células 101 pueden ser proporcionadas al proceso 100 en un número de diferentes formas dependiendo del producto de células encapsuladas 106 deseado que va a ser creado. Si un producto de células encapsuladas 10Í6 con una alta densidad celular es deseado, preferentemente las ..células 101 son proporcionadas en una suspensión de células concentradas. Cuando las células 101 están en una suspensión de células concentradas, el paso de mezclado 103 puede ser realizado para mantener la alta densidad celular en el producto de células encapsuladas 106 resultante. Una. alta concentración de células en un producto de células encapsuladas 106 es ventajosa para muchos procesos bioquímicos, incluyendo, por ejemplo, aplicaciones en fermentación. Por ejemplo, una alta concentración de células de levaduras o de bacterias puede ser requerida para producir una alta velocidad de fermentación en un reactor.

En otras modalidades, las células 101 pueden estar en una suspensión rela ivamente diluida. Las células 101 pueden ser proporcionadas en una suspensión diluida de modo que el paso de mezclado 103 y el paso de polimerización 105 son capaces de encapsular una célula simple en un producto de células encapsuladas 106. Otras combinaciones de suspensiones celulares 101 y el paso de mezclado 103 pueden ser combinadas para proporcionar diferentes variaciones del productb de células encapsuladas 106.

En otras modalidades, las células 101 pueden. ser un grupo funcional de células o un tejido, tal como ! un., acino humano simple proveniente de un páncreas humano. Las células 101 podrían también incluir grupos conectados por unión de espacio vacío o de otro modo funcionalmente conectados de células neuronales y gliales. El tejido puede ser proporcionado en una suspensión diluida de modo que el paso de mezclado 103 y el paso de polimerización 105 son capaces de realizar el encapsulamiento de una sección simple de un tejido, tal como un acino simple en un producto de células encapsuladas 106.

El medio de encapsulamiento 102 puede ser un número de diferentes materiales. Por ejemplo, las células pueden ser encapsuladas utilizando alginato de calcio, un producto natural de las algas cafés (alga marina) . Otros materiales naturales y sintéticos pueden ser utilizados incluyendo compuestos poliméricos tales como alginato de sodio, carragenano, gomas de xantano, agarosa, agar, celulosa y sus derivados, colágeno, hialuronato/ pectina, gelatina, resina epoxi, resinas resticulables por luz, poli (alcohol vinílico) , poliacrilamida, poliéster, poliestireno, poli (acetato de vinilo) y poliuretano por numerar unos pocos. En algunas modalidades, más de un medio de encapsulamiento 102 puede ser combinado. Por ejemplo, el alginato y el poJL'i (alcohol vinílico) pueden ser combinados como el medio de encapsulamiento 102. ¿ Una vez que una solución acuosa del " medio de encapsulamiento 102 y una suspensión celular concentrada 101 son preparadas, éstas son mezcladas 103 en un recipiente. El paso de mezclado 103 puede ser logrado utilizando cualquier método que produzca la 104 deseada. Es importante lograr el paso de mezclado 103 con daño mínimo a la célula 101 y el medio de encapsulamiento 102. Para este fin, el paso de mezclado 103 debería reducir al mínimo las fuerzas de corte sobre las células 101 y el medio de encapsulamiento 102. Además, el medio de encapsulamiento 102 puede ser altamente viscoso, complicando adicionalmente el mezclado. En modalidades ejemplares, el paso de mezclado 103 es realizado utilizando un agitador de movimiento alternante, o un disco de movimiento alternante para mezclar las células 101 con el medio de encapsulamiento 102. Los mezcladores de impulsor estándares impartirán tensión de corte sobre las células 101 y no son apropiados para el mezclado en soluciones altamente viscosas.

El paso de mezclado 103 también mezcla preferentemente la célula 101 y el medio de encapsulamiento 102 para surtir las células 101 a todo lo largo del ' medio de encapsulamiento y lograr una viscosidad preferida. En algunas Si:\ modalidades, puede ser deseable mezclar hasta que se alcanza una dispersión sustancialmente uniforme. No obstante, en otras modalidades, las células 101 y el medio. de encapsulamiento 102 pueden no ser mezclados hasta la homogeneidad.

Una vez que las células 101 y el medio de encapsulamiento han sido mezclados hasta una ¦ cantidad deseada, preferentemente hasta la homogeneidad, la mezcla de encapsulamiento celular 104 puede ser polimerizada, gelificada o reticulada en el paso 105 para generar un producto de células encapsuladas 106. Antes del paso de polimerización 105, la mezcla de encapsulamiento celular 104 puede ser formada en cualquier número de productos estructuralmente diferentes. Por ejemplo, la mezcla de encapsulamiento celular 104 puede ser diseñada en partículas esféricas o hilos, aplicada a una estructura de soporte tal como una malla abierta, estructura en panal, o estropajo, aplicado a las paredes del reactor, o conformado en otra forma tridimensional antes de la gelificación, la reticulación o la polimerización 105 para producir el producto final 106.

La naturaleza del agente de polimerizaición, gelificación o reticulación es específica para los polímeros empleados como el agente de encapsulamiento. En el .caso del alginato de sodio, la reticulación de los polímeros de alginato es lograda por el contacto con diferentes j cationes divalentes o trivalentes.

Existen muchas técnicas para mejorar la eficiencia de un producto de células encapsuladas 106. Una manera de mejorar la eficiencia es mediante la provisión de una alta proporción de área superficial a volumen. La polimerización de la mezcla de encapsulamiento celular 104 incrementa su área superficial expuesta y puede, por lo tanto, incrementar la eficiencia del producto de células encapsuladas 106. Por ejemplo, para ayudar en un proceso bioquímico, tal como un proceso de fermentación, las células de levadura en una solución de alginato de sodio pueden ser polimerizadas en la forma de partículas esféricas pequeñas, las cuales proporcionan una alta proporción de área superficial a volumen. Alternativamente, las células de levadura en una solución de alginato de sodio pueden ser polimerizadas en la forma de filamentos o hilos delgados.

La mezcla de encapsulamiento celular 104 puede ser formada en esferas utilizando un procedimiento de formación de gotas. Las esferas resultantes pueden ser de un tamaño diferente y poseen diferentes tamaños de poro. Existen muchos dispositivos para producir las esferas. Uno puede producir esferas a partir de una corriente continua mediante el uso de atracción electrostática para producir gotitas, utilizando vibración para producir gotitas, utilizando aire para producir gotitas, y utilizando un atomizador :de: disco giratorio, por nombrar unos pocos. Por ejemplo, si la matriz es alginato de sodio, las esferas son fácilmente polimerizadas al poner en contacto las esferas; con una solución de cloruro de calcio.

En otras modalidades, la mezcla de encapsulamiento celular 104 puede ser formada en filamentos o hilos . delgados . En este caso, los filamentos o hilos pueden ser ligeramente más grandes que el diámetro de las células atrapadas. Los filamentos o hilos pueden ser depositados' aleatoriamente para formar una estructura porosa que puede ser utilizada en un biorreactor. Existen muchos medios mediante los cuales para producir filamentos o hilos delgados, tales como mediante extrusión a través de una aguja de calibre angosto, seguido por el contacto con un agente de polimerización o mediante electro-hilado. En el caso de la extrusión, una suspensión de células en una solución de matriz de alginato pueden ser extruidas bajo una presión a través de uno o, preferentemente un arreglo de orificios huecos de calibre estrecho hacia una solución de cloruro de calcio para producir una masa grande de filamentos o hilos.

En otra modalidad más, la mezcla de encapsulamiento celular 104 puede ser aplicada como un recubrimiento a una estructura de soporte natural o sintética, de alta área superficial. En una implementación de esta modalidad, la estructura de soporte únicamente necesita ser capaz de soportar la mezcla de encapsulamiento celular 104 y así misma. Por ejemplo, la estructura de soporte puede comprender una esponja de cerámica, una estructura en forma de panal, un material de empaque de reactor u otra estructura de ; soporte que incrementa el área superficial por masa de la mezcla de encapsulamiento celular 104 cuando se aplica. .En- otra modalidad más, la mezcla de encapsulamiento celular iÓ4:- puede también, o en una alternativa, ser aplicada a partes de la superficie del reactor, tales como las paredes o las superficies de los dispositivos de mezclado.

Un aspecto importante del producto de células encapsuladas 106 es que la matriz polimerizada resultante es insoluble al medio acuoso o en el medio en el cual el producto va a ser utilizado. En algunos casos, los agentes químicos contenidos en el medio pueden debilitar o perturbar los polímeros o los agentes de reticulación en el producto de células encapsuladas 106. Por ejemplo, varios aniones, tales como citrato, fosfato y sulfato pueden quelar los iones calcio del alginato de calcio, eliminando de este modo la reticulación y haciendo soluble al alginato. Debido a esto, los aniones citrato, fosfato y sulfato deben estar en baja concentración o deben ser eliminados del medio que es puesto en contacto con un producto celular encapsulado con alginato de calcio . · .

Otro aspecto importante del producto de ; células encapsuladas 106 es que la matriz polimerizada resultante contiene poros que retienen las células encapsuladas, pero son permeables a las diferentes moléculas que son requeridas por la célula para el mantenimiento o la fermentación. Por ejemplo, en el caso del encapsulamiento de levaduras en esferas de alginato de calcio para la fermentación de azucares a etanol, el tamaño de poro del producto de células encapsuladas 106 debe ser lo suficientemente pequeño para retener las células de levaduras al tiempo que permitan el movimiento sin restricciones de los azucares dentro de la esfera y el etanol hacia afuera.

Las células 101 pueden ser encapsuladas en un medio de encapsulamiento 102 utilizando un número de métodos. Todos los métodos del encapsulamiento celular involucran un paso de mezclado 103, donde las células 101 son mezcladas con el medio de encapsulamiento 102 en una forma líquida, seguido por un paso de gelificación, reticulación o polimerización 105, el cual completa el encapsulamiento de las células en la matriz de encapsulamiento.

El alginato es ideal para el uso como un medio de encapsulamiento 102. Las sales de alginato son solubles en medios acuosos por arriba de pH 4, pero son convertidas a ácido algínico cuando el pH es disminuido por debajo de aproximadamente pH 4. Un gel de alginato insoluble en .agua es formado en presencia de los iones formadores dé: "gé¾L-, por ejemplo calcio, bario, estroncio, zinc, cobre (II) , aluminio y mezclas de los mismos, a concentraciones apropiadas. Los geles de alginato son hidrogeles, es decir polímeros de alginato reticulados que contienen grandes cantidades de agua sin dilución. Estas propiedades hacen a los geles de, alginato ideales como un medio de encapsulamiento 102.

Muchas matrices poliméricas se originan ; como sólidos secos y son en general suspendidas como una solución acuosa antes el uso. Algunos polímeros pueden requerir suspensión en un solvente orgánico antes del uso. Debido a que el grado de polimerización, gelificación o reticulación es una función de la longitud del polímero y de la concentración en solución, algunos polímeros son empleados de manera más rutinaria como una matriz de encapsulamiento que otros. Otras consideraciones para una elección del polímero incluyen: la facilidad relativa de gelificación, polimerización o reticulación de la matriz para producir un producto final; y la toxicidad celular relativa de los polímeros mismos y del o de los agentes de reticulación o polimerización. Más consideraciones incluyen la termoestabilidad de la matriz en la aplicación específica. Todavía más consideraciones incluyen la facilidad de uso y el costo y la disponibilidad comercial. - Por muchas de las razones anteriormente establecidas, los alginatos son comúnmente utilizados para el encapsulamiento celular. Los alginatos son biopolímeros marinos hidrofílicos con la habilidad para formar geles térmicamente estables que pueden desarrollarse y establecerse a temperaturas bajas y moderadas. Los alginatos " stín una familia de polímeros no ramificados de residuos de ácido ß-D-manurónico y ácido (X-L-gulurónico enlazados po enlaces glucosídicos 1-4. El ácido algínico es sustancialmente insoluble en agua, pero forma sales solubles en agua con metales alcalinos, tales como sodio, potasio y litio. Las preparaciones de alginato de sodio son comercialmente disponibles.

En la preparación del alginato de sodio para el uso como un medio de encapsulamiento, deben ser considerados un número de factores. Por ejemplo, la longitud de la cadena, la viscosidad y la concentración pueden todos afectar la efectividad del producto final encapsulado. Además, los diferentes productos de alginato de sodio tienen diferentes proporciones de ácido manurónico y ácido gulurónico que aparecen de manear natural en diferentes alginatos . Los alginatos con proporciones específicas de ácido manurónico y ácido gulurónico pueden ser deseables para aplicaciones específicas . , . ..

Como un ejemplo no limitante del proceso 100 en el uso para fermentar los azucares a etanol, una suspensión densa de células de levadura de Saccharomyces cerevisiae puede ser utilizada como las células 101 y una solución de alginato de sodio, un polímero natural proveniente ..de las algas cafés, puede ser utilizado para el ^medio de encapsulamiento 102. En otras modalidades, otras células de levaduras pueden ser utilizadas tales como las levadoras de los géneros Candida., Kluyveromyces, Pachysolen;' Pichia, Saccharomyces y otras. Cuando las levaduras son mezcladas con el medio de encapsulamiento 102, la concentración de las células de levadura es preferentemente de aproximadamente 10 a 200 gramos de masa húmeda de células por litro o aproximadamente 25 % de masa húmeda de células por litro después de la concentración.

Preferentemente, el alginato de sodio es mezclado a una concentración de 1 a 6 gramos por litro en el medio de encapsulamiento 102. En una modalidad, la concentración del alginato de sodio puede ser menor de 3 % p/v en agua. La suspensión de levaduras y la solución de alginato son preferentemente mezcladas entre sí hasta la homogeneidad en el paso del proceso 103 para formar una mezcla de encapsulamiento celular 104. Preferentemente, cuando el medio de mezclado 103 es el alginato de sodio, la viscosidad del medio de encapsulamiento 102 es de aproximadamente 1500 a 3500 cSt y más preferentemente 2000 a 3000 cS . La viscosidad de la mezcla de encapsulamiento celular 10¾ es preferentemente de 1000 a 3500 cSt y más preferentemente de 1500 a 2500 cSt . Una vez que la mezcla de encapsulamiento celular 104 es creada, ésta puede ser polimerizada 105. En una modalidad, la polimerización es lograda mediante él : aso de la mezcla de encapsulamiento celular 104 a través - de un dispositivo de 96 espigas huecas para producir gotitas que son goteadas hacia una solución de cloruro de calcio'.

En otra modalidad más, las células mezcladas con el medio de encapsulamiento son células bacterianas, incluyendo las bacterias Escherichia coli, Zymomonas mobilis u otras. Cuando las bacterias son mezcladas con la solución de la matriz, la concentración de las células bacterianas es preferentemente de aproximadamente 80 a 625 gramos de masa húmeda de células por litro.

La Figura 2 ilustra un proceso para la producción del medio de encapsulamiento 102 a partir de un producto de encapsulamiento concentrado 201. El producto de encapsulamiento concentrado 201 puede comenzar en el eßtado sólido o líquido y puede detener el intervalo completo de viscosidades dentro del mismo. En una modalidad, el producto de encapsulamiento concentrado 201 es un polvo seco. Otras modalidades del proceso pueden comenzar con un polímero u otro medio que ésta en forma líquida. El almacenamiento del producto de encapsulamiento concentrado 201 en una forma de polvo seco, o tan concentrado y deshidratado .como sea posible, es ventajoso debido a que las sustancias tienen típicamente una vida en anaquel incrementada en la forma seca. Además, la forma concentrada seca reduce el volumen de almacenamiento y permite la transportación más fácil y más barata. No obstante en otras modalidades, el proceso mostrado en la Figura 2 puede comenzar con un producto de encapsulamiento concentrado 201 en cualquier estado viscoso de sólido a líquido.

En la modalidad mostrada en la Figura 2, un producto de encapsulamiento concentrado 201 es proporcionado y solubilizado con una solución acuosa 208 en el paso de mezclado 202. El paso de mezclado crea un medio de encapsulamiento solubilizado que puede funcionar como un medio de encapsulamiento 102. No obstante, en otras modalidades, la solución solubilizada puede ser además procesada mediante otros pasos opcionales como se explica más adelante. Una vez que el medio de encapsulamiento 102 es creado, éste puede ser mezclado con las células 101 como se ' muestra en la Figura 1.

En una modalidad preferida, el producto de encapsulamiento concentrado 201 es un polímero. Más preferentemente, el producto de encapsulamiento concentrado 201 puede ser alginato de sodio. El alginato de sodio está disponible en diversas formas a partir de un número de fuentes incluyendo: WEGO Chemical and Mineral Co . , !23¡9 Great Neck Road Great Neck, NY 11021 (www.wegochem.com); Sigma-Aldrich, 2050 Spruce St . St . Louis, MO 63103 (www.sigmaaldrich.com); y MP Biomedicals, 295245 Fountain Pkwy, Solón, OH 44139 (www.mpbio.com) .

La modalidad mostrada en la Figura 2 ilustra la visión de una solución acuosa 2008 para solubilizar el producto de encapsulamiento concentrado 201 en el paso de mezclado 202. En una modalidad del proceso 200, el producto de encapsulamiento concentrado 201 es introducido en un estado seco dentro de un recipiente de mezclado que contiene un líquido, mediante el uso de un eductor de mezclado. En la modalidad preferida, la solución acuosa es agua. No obstante, en otras modalidades la solución acuosa puede ser una combinación de agua y otros aditivos que pueden mejorar el desempeño del medio de encapsulamiento 102 final.

El paso de mezclado 202 es realizado para producir un medio de encapsulamiento 102 con la concentración deseada. En una modalidad ejemplar del proceso 200, el polvo de alginato de sodio es utilizado como el medio de encapsulamiento concentrado 201. El polvo de alginato de sodio puede ser agregado a la solución acuosa 208 hasta una concentración de aproximadamente 1 % p/v hasta 6 % p/v. Preferentemente, el alginato de sodio utilizado es un producto granulado de aproximadamente 320 mPa a 1400 mPa, donde la viscosidad de la solución acuosa de alginato de sodio utilizada para el encapsulamiento es de 1500 a 3500 centistokes (cSt) . Un alginato de sodio granulado es preferido debido a que un producto granulado es solubilizado más fácilmente en agua entre aproximadamente 15 a 30°C.

El producto de encapsulamiento concentrado 201 puede contener contaminantes microbianos tales ¦· como bacterias. Para reducir el nivel de contaminación del producto de. encapsulamiento concentrado 201, un número de diferentes procedimientos de esterilización diferentes 205, 210 y 213 son opcionalmente posibles por diferentes modalidades del proceso 200. Además, otras modalidades pueden tener antibióticos agregados 207 y 211 antes de o después del mezclado 202.

En una modalidad del proceso 200, la irradiación gamma opcional 210 puede ser utilizada para esterilizar el medio de encapsulamiento concentrado 201. La irradiación gamma puede ser utilizada de 8 a 20 kilogray (kGy) para irradiar el medio de encapsulamiento concentrado.

En otras modalidades, la solución acuosa 208, la cual es estéril, puede ser utilizada como un vehículo para esterilizar el medio de encapsulamiento concentrado 201 durante el paso de mezclado 202. La solución acuosa 208 puede tener un agente de esterilización químico 203 o antibiótico 212 agregado antes del mezclado 202 con el medio de encapsulamiento concentrado 201 para reducir el nivel de contaminación microbiana en la mezcla resultante. E tal modalidad, un agente de esterilización 203 es mezclado 205 con la solución acuosa 208 antes del paso de mezclado 202. En ciertas modalidades, los antibióticos 212 pueden estar también agregados a la solución acuosa 208 antes del' paso de mezclado 202 La solución acuosa 208 distribuye el agente de esterilización 203 y/o el antibiótico 212 dentro del medio de encapsulamiento concentrado 201 durante el paso de mezclado 202. Al mezclar primeramente el agente de esterilización 203 y/o los antibióticos 212 con la solución acuosa 208, el agente de esterilización 203 y/o los antibióticos 212 pueden ser distribuidos de manera uniformemente más efectiva al medio de encapsulamiento concentrado 201.

En otras modalidades del proceso 200, el medio de encapsulamiento puede ser esterilizado después del mezclado 202 mediante el uso de irradiación ultravioleta 213 para reducir la contaminación microbiana de la mezcla final 102.

Aunque el uso inmediato del medio de encapsulamiento es siempre preferible, pueden ser deseables pasos de esterilización opcionales 205, 210 y 213 para incrementar la vida de anaquel del medio de encapsulamiento solubilizado para el almacenamiento. Además, ciertas modalidades pueden agregar antibióticos ya sea antes o después del paso de mezclado 202. Debido a que los productos de encapsulamiento concentrados son a menudo no estériles y su vida de anaquel después de la solubilización es acortada por el crecimiento de microorganismos no deseables, ; puéde ser deseable tratar el medio de encapsulamiento concentrado con algunos de los pasos opcionales descritos. Además,' debido a que el crecimiento de los organismos no deseados en la solución puede disminuir la viscosidad del ¡medio de encapsulamiento 102, diversos pasos de esterilización pueden ayudar a prevenir cambios no deseados en la viscosidad.

Aunque los pasos de esterilización opcionales 205, 210 y 213 fueron descritos separadamente anteriormente, en diversas modalidades los pasos de esterilización pueden ser utilizados en cualquier combinación. Además, el paso de esterilización 205, 210 y 213 puede ser utilizado en cualquier combinación con la adición opcional de antibióticos .

El presente documento de patente enseña la novedosa idea de utilizar los métodos de esterilización no térmicos 205 y los métodos de mezclado 202. Con el fin de poner algunos productos de encapsulamiento concentrados 201 en solución, la mezcla puede ser calentada y agitada sobre una placa de agitación o, más comúnmente, calentada en un autoclave de laboratorio a 121°C a 15 a 45 minutos. No obstante, el calentamiento de los polímeros de alginato puede provocar cierta cantidad de hidrólisis del alginato y con esto cambiar las propiedades de la solución de alginato, incluyendo su viscosidad.

Los métodos térmicos son también a menudo utilizados para esterilizar la solución. Si el paso de mezclado 202 y los pasos de esterilización 205, 206 y 213 son realizados utilizando un método no térmico, es necesaria sustancialmente menor concentración del producto de encapsulamiento concentrado 201 en el medio de encapsulamiento final. Por ejemplo, si el paso de esterilización 205 es realizado utilizando un método térmico tal como el calentamiento en autoclave, una concentración de alginato dé sodio de alrededor de 3.5 % (p/v) de alginato de sodio al agua es requerida para elevar al máximo el rendimiento del etanol del producto resultante de células encapsuladas . No obstante, si el paso de mezclado 202 y los pasos de esterilización 205, 210 y 213 utilizan un método no térmico tal como la esterilización química, es necesario menos de 3 % de alginato de sodio y preferentemente menos de 2.5 % y más preferentemente aproximadamente 2 % de alginato de sodio (p/v) con respecto al agua para elevar al máximo el rendimiento del etanol del producto encapsulado resultante. A pesar de la menor concentración del alginato de sodio en el producto final de células encapsuladas, el desempeño del producto de células encapsuladas no es disminuido. , .

Al reducir la concentración del medio de encapsulamiento concentrado 201 que es requeriid ' para producir el medio encapsulado 102, sin afectar el rendimiento del producto celular encapsulado 106, la. realización de los pasos de esterilización 205, 210 y 213 utilizando :un' método no térmico proporciona un ahorro sustancial en costos sobre los métodos térmicos. En particular, cuando el proceso 'de la Figura 2 es elevado de escala a una escala industrial, la reducción en la concentración del producto de encapsulamiento 201, necesaria para crear el medio de encapsulamiento 102, puede proporcionar ahorros de costos significativos.

Diversos productos de esterilización químicos pueden ser utilizados como el agente de esterilización 203. Por ejemplo, en ciertas modalidades el agente de esterilización 203 puede ser seleccionado del grupo que consiste de Lactrol (por PhibroChem) , Lactoside (por Lallemand Ethanol Technologies) ; FermaSure (por DuPont) ; FermGuard (por Ferm Solutions) ; FermGuard Xtreme (por Ferm Solutions); clorito de sodio; y Cloramfenicol . Además, más de un agente de esterilización 203 puede ser combinado conjuntamente .

En una modalidad que utiliza clorito de sodio como un agente de esterilización 203, la concentración del clorito de sodio puede ser de aproximadamente 1 a 2000 partes por millón (ppm) . La solución del clorito de sodio puede ser el producto comercial FermaSure. , En otra modalidad más diseñada para conservar la esterilidad del anillo de encapsulamiento 102°:; los antibióticos penicilina y virginiamicina pueden ser agregados después de la esterilización. Preferentemente, el producto comercial Lactoside puede ser agregado a una concentración de aproximadamente 1 a 5 ppm. En otras modalidades otros antibióticos pueden ser utilizados incluyendo los antibióticos industrialícente producidos tales como' FermGuard Xtreme en concentraciones de 1 a 5 ppm.

Como se explicó anteriormente, en vez de agregar un agente de esterilización 203 o además de agregar un agente de esterilización 203, ciertas modalidades del proceso 200 pueden esterilizar el medio de encapsulamiento concentrado 201 utilizando irradiación ultravioleta 213. Preferentemente, la mezcla del medio encapsulado 102 es irradiada con luz ultravioleta de 10 a 50 mWs/cm2 o 10 a 50 mJ por cm2 para lograr la esterilización.

Además de la esterilización óptima 205 y el mezclado opcionalmente en antibióticos, el medio de encapsulamiento 102 puede ser además procesado en uñ paso de mezclado de nutrientes/vitaminas 207. Las vitaminas y los nutrientes 204 pueden ser agregados dentro del medio de encapsulamiento 102 en la preparación para el mezclado con la célula 101 como se muestra en la Figura 1. Mediante la creación de un medio de encapsulamiento 102 que contiene ya vitaminas y nutrientes esenciales para el crecimiento de las células, las células 101 pueden llegar a encapsularse en un ambiente que aumenta el crecimiento, la producción y la eficiencia de las células 101.

En una modalidad, las vitaminas y nutrientes 204 pueden ser polvo de infusión de maíz o licor de infusión de maíz. El polvo de infusión de maíz puede ser utilizado a una concentración de 1 a 5 % peso/volumen. El licor de infusión de maíz puede ser utilizado a una concentración de 1 a 5 por ciento en volumen/volumen .

En otras modalidades, vitaminas individuales o una mezcla de vitaminas pueden también ser agregadas. En una modalidad, la vitamina biotina puede también ser agregada en el paso de mezclado a una concentración de 2 ng/L hasta 2 microgramos/L. En otra modalidad más, las vitaminas biotina y tiamina pueden ser agregadas en el paso de mezclado a una concentración de 4 ng por litro hasta 400 microgramos por litro.

La Figura 2 muestra la esterilización 205, el mezclado del antibiótico 211, y el mezclado de nutriente/vitaminas 207 como pasos adicionales opcionales. Sin embargo, en otras modalidades, la esterilización 205, el mezclado de antibióticos 207 y el mezclado de nutriente/vitaminas 207 pueden ser realizados en un paso de mezclado simple 202 y/o en el mismo recipiente de .mezclado. Por ejemplo, el producto de encapsulamiento concentrado; puede ser disuelto en el medio de crecimiento, dentro de una mezcla de vitaminas que incluyen biotina y/o tiamina, o dentro del medio de crecimiento suplementado con vitaminas, o dentro de una solución natural que contiene biotina y/o tiamina. El paso de mezclado 202 puede ser realizado en "el ' mismo recipiente o en recipientes separados. ['¦ El proceso 200 para la elaboración de un medio de encapsulamiento 102 y el proceso 100 para mezclar el medio de encapsulamiento 102 con las células 101 para elaborar un producto de células encapsuladas 104 requieren ambos el paso de mezclado 202 y 103, respectivamente. En una modalidad preferida, el paso de mezclado 202 y 103 pueden suceder en el mismo recipiente. Preferentemente, el mezclado 103 del medio de encapsulamiento 102 y las células 101 ocurre en el mismo recipiente desechable en el cual es solubilizado y esterilizado el polímero de encapsulamiento.

El siguiente ejemplo será referido como el Ejemplo 1 y demuestra la aplicación de una modalidad del proceso de la Figura 2 para producir un medio de encapsulamiento 102 a partir de alginato de sodio. En el Ejemplo 1, el proceso mostrado en la Figura 2 fue utilizado para producir cinco (5) diferentes lotes de un medio de encapsulamiento. Cada uno de los cinco (5) diferentes lotes comenzó con un producto diferente de alginato de sodio como el medio de encapsulamiento concentrado 201. Cada uno de los !cirico (5) productos de alginato de sodio tuvieron una : : longitud polimérica diferente. La viscosidad del alginato dé sodio es proporcional a la longitud del polímero y en consecuencia, el Ejemplo 1 es proporcionado para ilustrar el efecto- de la variación de la viscosidad del medio de encapsulamiento concentrado 201 (tal como el alginato de sodio) ' sobre la eficiencia de producción de etanol del producto' celular encapsulado polimerizado 106. Como se muestra por el Ejemplo 1, al variar la viscosidad del producto de encapsulamiento concentrado, se puede afectar la eficiencia de producción de etanol de un microbio encapsulado en un biorreactor productor de etanol .

En el Ejemplo 1, todos los lotes variantes fueron mezclados con Zymomonas mobilis 8b como se muestra en la Figura 1, polimerizadas en esferas, y utilizado para fermentar el hidrolizado de bagazo de caña de azúcar. Cada uno de los cinco (5) lotes utilizó un producto diferente de alginato de sodio con una viscosidad diferente como el medio de encapsulamiento concentrado 201. Los productos de alginato de sodio con viscosidades variantes fueron luego solubilizados al mezclarlos con agua en el paso de mezclado 202 mediante la adición de 3.5 % (peso (p) /volumen (v) ) de alginato de sodio con respecto al agua. En todos los casos, la carga de biomasa de las Zymomonas fue de 3; % y la inoculación fue de 0.2 gramos de esferas por mi de la solución de hidrolizado. La solución de hidrolizado fue suplementada por 1.2 g/L de fosfato de diamonio y 0.5 % p/v de extracto de levadura. Las incubaciones fueron a- 3Q°C por 71 horas a 50 rpm sobre un agitador rotatorio.

La Tabla 1 muestra las concentraciones de etanol después de la incubación de Zymomonas mobilis 8b encapsuladas en 5 diferentes productos de alginato en hidrolizado de bagazo de caña de azúcar. Los datos son mostrados como el promedio de las determinaciones por triplicado. Las viscosidades para los diferentes productos de alginato de sodio (1 % en ácido acético 1 % a 20°C) están en el intervalo de 100 a 200 mPa, incluso hasta tanto como 1236 mP . Los datos muestran que los dos alginatos que dieron como resultado las más altas concentraciones de alcohol fueron los productos de alginato de sodio a 324 mPa y 620 mPa producidos por Wego Chemical and Mineral Co. En consecuencia, una modalidad preferida para el uso del hidrolizado de bagazo de caña de azúcar en fermentación, incluye el alginato con una viscosidad media a baja de aproximadamente 324 mPa a 620 mP .

La variación de la viscosidad del producto de encapsulamiento concentrado puede ser ventajosa por un número de razones. Por ejemplo, si las esferas van a ser utilizadas en un reactor en estado sólido, una esfera más dura · puede ser deseable para mantener mejor su forma bajo el peso de la biomasa y otras esferas. En consecuencia, diferentes viscosidades pueden ser deseadas dependiendo del propósito para el cual está siendo producido el medio de encapsulamiento. Los factores que afectarán la viscosidad deseada del medio de encapsulamiento incluyen, pero no están limitados al tipo de hidrolizado que es fermentado, siendo la célula que es encapsulada y el tipo de reactor en el que eventualmente terminará el medio de encapsulamiento.

Un segundo ejemplo, el Ejemplo 2 de una modalidad de proceso de la Figura 2 para producir un medio de encapsulamiento 102 a partir de alginato de sodio, será ahora discutido. El ejemplo 2 es proporcionado para ilustrar el efecto de la variación de la concentración del alginato de sodio (u otro medio de encapsulamiento) sobre la eficiencia del etanol del producto de células encapsuladas polimerizadas . Como se muestra por el Ejemplo 2, la variación de la concentración del alginato de sodio en el medio de encapsulamiento afecta la eficiencia de producción He Tetaño1 de un microbio encapsulado en un biorreactor productor de etanol.

En el Ejemplo 2, el proceso mostrado en la Figura 2 fue utilizado para producir cinco (5) diferentes lotes» de un medio de encapsulamiento comenzando con el mismo producto de alginato de sodio pero variando la concentración del alginato de sodio en el medio de encapsulamiento final. Los diversos lotes fueron luego mezclados con Zymomonas molibis 8b como se muestra en la Figura 1, polimerizados dentro de esferas, y utilizados para fermentar el hidrolizado de bagazo de caña de azúcar .

La concentración final del alginato de sodio, u otro producto de encapsulamiento, dependerá del volumen del agente de solubilización agregado y también del volumen de la suspensión concentrada de células, y otros aditivos tales como los productos químicos de esterilización y vitaminas y nutrientes que están presentes en el producto de células encapsuladas 106 final.

En el Ejemplo 2, cada uno de los cinco lotes utilizó el mismo alginato de sodio como el medio de encapsulamiento concentrado 201. El alginato de sodio puede ser luego solubilizado al mezclarlo con diversas cantidades de agua desde 0.05 % hasta 10 % (peso (p/volumen (v) ) de alginato de sodio respecto al agua. En todos los casos, la carga de la biomasa de las Zymomonas fue de 3 % y la inoculación fue de 0.2 gramos de esferas por mililitro de solución de hidrolizado. Las incubaciones fueron a 30°C por 48 horas, a 80 rpm en un agitador rotatorio. Los datos se muestran como el promedio de las determinaciones por triplicado .

La Tabla 2 muestra las concentraciones de etanol después de la incubación de Zymomonas mobilis 8b, encapsuladas en 5 diferentes concentraciones de alginato de sodio Wego a 324 mPa, en hidrolizado de bagazo de caña de azúcar. Los datos son mostrados como el promedio de las determinaciones por triplicado. Los datos muestran que el porcentaje de alginato que dio como resultado en la más alta concentración final de etanol después de la fermentación fue de aproximadamente 2 % (p/v) de alginato de sodio al agua o aproximadamente 2 gramos de alginato de sodio por 100 mL de solución acuosa. En consecuencia, una modalidad preferida para el uso en la fermentación del hidrolizado de bagazo de caña de azúcar, incluye el mezclado del alginato de sodio a una concentración de aproximadamente 1 % a 2 % (p/v) de alginato de sodio respecto al agua, y más preferentemente aproximadamente 1.75 % a 2 % (p/v) de alginato de sodio respecto al agua y todavía más preferentemente 2 % (p/v) de alginato de sodio respecto al agua.

Además de realizar el proceso mostrado en la Figura 2 para crear un medio de encapsulamiento 102 que tiene la viscosidad inicial deseada, es también importante mantener la viscosidad del medio de encapsulamiento 102 si éste no es inmediatamente utilizado. Como se mencionó anteriormente, la viscosidad del medio de encapsulamiento 102 puede ser reducida por el crecimiento de organismos no deseados. En consecuencia, puede ser ventajoso realizar algunos de los pasos de esterilización opcionales ya sea individualmente o en combinación si el medio de encapsulamiento será almacenado por cierta longitud de tiempo antes del uso.

Un tercer ejemplo, el Ejemplo 3, de una modalidad del proceso de la Figura 2 será ahora discutido. El Ejemplo 3 muestra los efectos benéficos de incluir el paso de esterilización opcional 205 en el proceso de la Figura 2 si el medio de encapsulamiento 102 va a ser almacenado antes del uso . , En el Ejemplo 3, seis (6) lotes separados de soluciones al 2 % p/v de alginato de sodio (Wego 324 mPa) fueron preparadas como los medios de encapsulamiento 102. Uno de los lotes no fue esterilizado del todo y cada uno de los otros cinco (5) lotes fue esterilizado 205 con un agente de esterilización diferente 203. Los agentes de esterilización 203 fueron seleccionados del grupo que incluye: táctoside ; FermaSure; FermGuard; FermGuard Xtreme; y cloramfenicol . Cada uno de los 6 lotes se dejó luego incubar por 120 horas a temperatura ambiente. Las viscosidades subsiguientes después de la incubación fueron determinadas utilizando un viscosímetro del tipo Zahan Cup. Los datos muestran que el uso de un antibiótico comercial que es en general reconocido como seguro (GRAS) ayuda en el mantenimiento de la viscosidad alta de la solución de alginato.

Las células son en general preparadas ' en algún método antes del encapsulamiento en una matriz de encapsulamiento . Una preparación es preparar una cierta densidad de células para el encapsulamiento. Dependiendo del producto celular encapsulado en matriz 106, las células encapsuladas en una matriz pueden estar ya sea en una alta densidad o en una baja densidad. Por ejemplo, en los procesos de fermentación para producir ácidos orgánicos, antibióticos o etanol, es deseable que las células estén en una alta densidad en el estado "libre" en el reactor de fermentación, sería por lo tanto también ventajoso que las células estuvieran en una alta densidad en la matriz de encapsulamiento .

Con el fin de lograr la alta densidad celular en un reactor de fermentación, por ejemplo, las células deben ser primeramente concentradas a una alta densidad antes del mezclado con una matriz de encapsulamiento. Un método de laboratorio común para lograr la alta densidad celular como un medio de preparar un concentrado celular para el encapsulamiento dentro de una matriz de encapsulamiento, es centrifugar un cultivo celular para incrementar la concentración de las células. La suspensión celular concentrada es luego mezclada con el medio de encapsulamiento. Aunque las centrifugas continuas y las centrifugas de lotes grandes son disponibles en la industria, ambos sistemas de centrifugación son no adecuados para la producción de cantidades muy grandes de células concentradas en periodos cortos de tiempo. : Las figuras 3A-3BA ilustran una modalidad' de un proceso 300 para producir una suspensión de células concentradas 305. En una modalidad, el proceso 300 puede ser utilizado para crear una suspensión de células concentradas 305 para el uso como las células 101 en el proceso 100 de la Figura 1. Como se muestra en las figuras 3A-3B, una célula o células de siembra 302 son combinadas con un caldo nutritivo 301 y las células 302 se dejan propagar a todo lo largo del caldo nutritivo 301. Las células son luego concentradas 304 en una suspensión de células concentradas 305.

La Figura 3B ilustra una modalidad de un sistema para la producción de una suspensión de células concentradas como se muestra en la Figura 3A. La propagación celular es preferentemente realizada en un biorreactor 311. El proceso 300 puede ser un proceso por lotes o un proceso continuo y el tipo de biorreactor 311 puede ser seleccionado en consecuencia. En un proceso por lotes, el biorreactor 311 es preferentemente un tipo de biorreactor diseñado para el procesamiento por lotes, tal como un reactor de * lecho empaquetado o un reactor de tanque agitado. En una modalidad preferida del proceso 300 utilizando un modo de operación por lotes, la propagación 303 de un lote subsecuente de células inicia mientras que el lote previo está siendo concentrado 304.

Otras modalidades del proceso 300 pueden : utilizar un proceso continuo en vez de un proceso por lotes. En una modalidad preferida de un proceso continuo 300, el biorreactor 311 es un biorreactor quimiostático, no obstante, pueden ser utilizados otros tipos de reactores continuos. En modalidades del proceso 300 que son continuas, es continuamente agregado un medio . de crecimiento fresco, mientras que el medio que contiene las células es continuamente retirado. De este modo, bajo condiciones de procesamiento continuo, es un suministro continuo de suspensión celular es producido para el encapsulamiento final.

Numerosos tipos de biorreactores son comercializados por diversas compañías que incluyen: Xcellerex, Inc., 170 Locke Drive Marlborough, MA 01752-72.17; Sartoius AG, eender Landstrasse 94-108, D-37075 Goettingen, Alemania; Thermo-Scientific (HyClone) 925 West 1800 South Logan, UT 84321; y illipore, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821. . i.

Con el fin de crear una suspensión grande de ¦ células para el uso a escala industrial o a otra escala grande, el biorreactor 311 utilizado para propagar las células puede también ser de un tamaño grande. Por ejemplo, las células pueden ser propagadas en al menos 10 litros (L) , o más preferentemente al menos 200 L, o aun más preferentemente al menos 2000 L del biorreactor 311. ... .....

La concentración de las células en el biorreactor 311 después de la propagación celular 303 variará dependiendo de muchos factores tales como el tipo de célula, el caldo nutritivo, y el tipo de biorreactor. Las concentraciones celulares típicamente después de la propagación celular 303 están en el intervalo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25 gramos de masa húmeda por litro de medio de crecimiento. Existen numerosas aplicaciones, tales como la fermentación de la biomasa, que son más efectivas si la densidad celular de las células puede ser adicionalmente incrementada .

En las modalidades mostradas en las Figuras 3A y 3B, las células son además concentradas en el paso de concentración celular 304 en un dispositivo de concentración de células 302. Es importante que el paso de concentración celular 304 no afecte significativamente la viabilidad de las células 302. ; ¦ En una modalidad preferida, el paso de concentración celular 304 es realizado mediante la concentración de las células sobre una membrana y cosechándolas. En tal modalidad preferida, el dispositivo de concentración celular 312 es preferentemente un sistema de filtración por flujo tangencial.

En un sistema de filtración por flujo tangencial, también conocido como un sistema de filtración ; de flujo cruzado, la alimentación es pasada a través de una membrana de filtro (tangencialmente) a presión positiva con relación al lado del permeado. Una proporción del material que es más pequeña que el tamaño de poro de la membrana pasa a través de la membrana como el permeado o filtrado; cualquier cosa más es retenida sobre el lado de alimentación de la membrana como el retenido.

Un sistema de filtración por flujo tangencial separa las células del medio de crecimiento y recolecta las células sobre la membrana o el filtro. Las células pueden ser luego cosechadas de la membrana y recolectadas. El sistema de filtración por flujo tangencial puede producir una suspensión celular, mientras que mantiene altas viabilidades celulares.

En otra modalidad más del proceso 300, una suspensión de células concentradas 305 es lograda al integrar operacionalmente el proceso de propagación celular 303 con el proceso de concentración celular 304. En un proceso integrado 300, la cosecha de las células concentradas en el retenido de filtración del flujo tangencial es utilizada para producir el producto celular encapsulado y puede ser utilizado como el inoculo para los lotes de propagación en serie.

En un sistema preferido 310 el diseño para : correr como un sistema integrado 300, el dispositivo de concentración celular 312 puede ser operacionalmente y funcxonalmente conectado al biorreactor 311, de modo que las células pueden ser fácilmente transferidas entre el biorreactor 311 y el dispositivo de concentración 312. No obstante, la propagación integrada 303 y la concentración 304 pueden ser utilizadas para el procesamiento por lotes o en forma continua, conectando el biorreactor 311 con el dispositivo de concentración de células 312 que es especialmente deseable cuando el proceso 300 está diseñado como un proceso continuo. En otras modalidades no integradas, el biorreactor 311 y el dispositivo de concentración 312 pueden no estar conectados y las células 302 son externamente transferidas entre los dos dispositivos.

En otra modalidad más, el dispositivo de concentración celular 312 que incluye además un recipiente de mantenimiento de la concentración celular. El recipiente de mantenimiento de la concentración celular permite que el dispositivo de concentración celular 312 ; . recicle repetidamente las células concentradas nuevamente ' a través del proceso de concentración y con esto incremente adicionalmente la concentración de las células . ¦ Como una modalidad ejemplar, un sistema de filtración por flujo tangencial es conectado a un recipiente de mantenimiento del retenido. Las células son repetidamente recicladas nuevamente a través del sistema de filtración por flujo tangencial desde el recipiente de mantenimiento del retenido para incrementar repetidamente la concentración celular. En tal modalidad, las células pueden estar a una concentración de aproximadamente 80 a 625 gramos de células en masa húmeda por litro.

En otras modalidades, otros dispositivos de concentración de células 312 pueden ser utilizados, tales como una centrífuga. Otro medio mediante el cual se produce una suspensión de células concentradas es el que confía en el comportamiento de floculación natural de algunas células. En el caso de las células en floculación, por ejemplo, los flóculos sedimentados que se asientan hacia el fondo de un biorreactor contienen una alta concentración de células. Estos flóculos pueden ser cosechados y mezclados con un medio de encapsulamiento o pueden tener una matriz de encapsulamiento agregada a los mismos. Un inconveniente para este método de concentración celular es que únicamente un bajo número de especies celulares floculan, o floculan bajo condiciones donde son producidos productos valiosos.

En otras modalidades, las células libres,' se dejan sedimentar en un recipiente reactor para incrementar la densidad celular. Las células sedimentadas pueden ser luego cosechadas a una alta densidad para el mezclado subsecuente con un medio de encapsulamiento. Un inconveniente " paira este método es una pérdida de la viabilidad celular después de la sedimentación. Otro inconveniente más es que ciertas células son móviles y no se sedimentan fácilmente.

En ciertas modalidades del proceso 300, las ¡células pueden ser propagadas mediante el crecimiento de las células por lotes en un biorreactor bajo condiciones específicas para la generación de la biomasa celular. La propagación repetida de las células en un recipiente biorreactor simple puede ser lograda sin el beneficio de la esterilización del recipiente biorreactor entre los lotes de propagación en este proceso.

En las modalidades del proceso 300 que son diseñadas para ser un proceso por lotes, una porción de las células provenientes del paso de concentración celular 304 pueden ser re'utilizadas en el paso opcional 306 como un inoculo para el siguiente lote de propagación celular. En una modalidad preferida donde es utilizado un inoculo, 2 % a 20 % y más preferentemente 5 % a 10 % de las células provenientes de la concentración celular son recicladas nuevamente del dispositivo de concentración celular 312 hacia el biorreactor 311 para actuar como un inoculo para el siguiente lote de la propagación celular 303. Mediante el uso de una porción del lote previo de las células como un inoculo para un lote subsecuente de células, el biorreactor puede · procesar numerosos lotes de células sin ninguna esterilización adicional. En modalidades donde es utilizado un inócuio, el medio de crecimiento fresco puede ser agregado al inócuio celular, mediante la introducción a través de un filtro estéril dentro del biorreactor de propagación.

En modalidades del proceso 300 que están .diseñadas para ser corridas como un proceso continuo, una porción de las células provenientes de un proceso previo pueden ser también utilizadas como un inoculo para obtener el proceso continuo iniciado.

Un dispositivo de filtración por flujo tangencial es la modalidad preferida del dispositivo de concentración celular 312. La concentración de las células es utilizando un dispositivo de filtración por flujo tangencial es particularmente muy adecuada para la producción de volúmenes grandes de esferas de alginato de calcio que tienen una o más células fermentativas encapsuladas en éstas. La Tabla 4 muestra los ejemplos de la filtración por flujo tangencial para concentrar las células fermentativas propagadas, tales como Pachysolen y Zymomonas mobilis 8b de NREL.

Tabla 4. Concentración de las células microbianas mediante filtración por flujo tangencial.

Como se muestra en la Tabla 4, las células pueden ser concentradas entre 10 y 21 veces su concentración de propagación normal mediante el uso de un dispositivo de filtración por flujo tangencial. En otras modalidades, las células pueden ser concentradas aun más de 21 veces sus concentraciones de propagación normal. Además, el uso de un sistema de filtración por flujo tangencial tiene muy poco efecto sobre la viabilidad general de las células. Una alta concentración de las células en la suspensión celular es deseable para crear un producto celular encapsulado con una alta concentración de células. Los productos celulares encapsulados con altas concentraciones celulares tienen mejor desempeño a concentraciones celulares más bajas en muchas situaciones que incluyen un reactor de fermentación.

Después de la concentración celular 304, las células concentradas 305 son recuperadas y pueden ser utilizadas en un proceso 100 como se muestra en la, Figura 1 para producir un producto celular encapsulado 106'. Como se muestra en la Figura 1, las células concentradas son perfectamente mezcladas 103 con un medio de encapsulamiento 102 tal como alginato de sodio. La concentración celular deseada dentro del medio de encapsulamiento es dependiente del organismo y del sustrato. Por ejemplo, una carga objetivo adecuada para Pachysolen tannophilus en alginato de sodio para fermentar el hidrolizado, es al menos de-¦· 5<- g de células/100 mL de medio de alginato de sodio.

El mezclado 103 del medio de encapsulamiento 102 con la suspensión celular concentrada 305 puede ocurrir en el mismo dispositivo o recipiente que es utilizado para la suspensión del alginato o el mezclado puede ocurrir en un dispositivo separado. Por ejemplo, el alginato de sodio puede ser preparado en una bolsa de mezclado y luego las células 101 pueden ser asépticamente agregadas a la misma bolsa para formar la mezcla de encapsulamiento celular 104.

Con referencia nuevamente a la Figura 1, el paso de mezclado 103 puede mezclar más de un tipo de célula en el mismo medio de encapsulamiento 102, de modo que el producto celular encapsulado contiene una pluralidad de tipos de células con propiedades complementarias. Por ejemplo, las células que son particularmente buenas en la fermentación de azucares de cinco átomos de carbono pueden ser combinadas en el mismo producto celular encapsulado con las células que son particularmente buenas en la fermentación de azucares dé seis átomos de carbono.

Cuando se combinan las células con propiedades complementarias, las células pueden ser combinadas dentro del mismo vehículo de encapsulamiento, o las células pueden ser encapsuladas separadamente y las células separadamente encapsuladas combinadas en el mismo reactor de fermentación.

Por ejemplo, si las esferas de alginato de calcio son utilizadas como el vehículo de encapsulamiento, diferentes células complementarias pueden ser combinadas dentro de la misma esfera. Como un ejemplo, para fermentar efectivamente hidrolizado de manera blanda, que contiene los azucares mañosa, galactosa, glucosa y xilosa, a etanol, se puede combinar Zymomonas obilis, NREL cepa 8b, que fermenta la glucosa y xilosa a etanol, con Saccharomyces cerevisiae, que fermenta la mañosa y la galactosa, en un producto de esferas simples. De esta manera, las propiedades fermentativas ventajosas de las especies microbianas diferentes son combinadas en un producto simple de esferas.

En la modalidad preferida del proceso 300, un recipiente desechable es reutilizado para los lotes de propagación celular individuales. Una modalidad de un recipiente es un biorreactor desechable de polímero de plástico en bolsa en una estructura de plástico o de metal. El recipiente desechable puede ser preferentemente utilizado para entre 1 y 10 lotes de propagación: celular individuales, y más preferentemente puede ser utilizado para 3 a 4 lotes de propagación celular. En ciertas modalidades, cuando un recipiente desechable es reutilizado para los múltiples lotes de propagación celular, el recipiente no es esterilizado entre los lotes. En otra modalidad más, 5 % a 10 % de la bioraasa celular proveniente del lote de propagación previo puede ser utilizado como un inoculo para los lotes subsecuentes. El sistema de filtración por flujo tangencial es utilizado como el dispositivo de filtración, una porción del retenido concentrado puede ser utilizada como el inoculo y transferida al biorreactor de propagación desde el recipiente de mantenimiento del retenido.

La Figura 4 ilustra un ejemplo de un biorreactor que utiliza una bolsa reutilizable y desechable. La Figura 4 es una modalidad de un biorreactor 400 que incluye una estructura 401 y una bolsa desechable y/o reutilizable 402. El biorreactor 400 es una modalidad de un biorreactor 311 que puede ser utilizado en el sistema 300 de las figuras 3A-3B.

Utilizando un biorreactor 400. que incluye una bolsa desechable 402, se proporcionan diversas ventajas sobre otros diseños de biorreactores . Las bolsas desechables 402 evitan los procedimientos de limpieza ;en el sitio (CIP, por sus siglas en inglés) costosos :: y los procedimientos de validación de sanitización que deben ser utilizados cuando se utilizan tanques de fermentación de acero inoxidable. Además, una bolsa desechable puede. ayudar a controlar los problemas de contaminación debido a que ésta puede ser desechada y reemplazada con una bolsa nueva estéril a cualquier tiempo. Mientras que la bolsa desechable 402 puede ser remplazada con cada lote, como se explica anteriormente, la bolsa desechable puede también ser utilizada para un número de lotes antes de ser desechada. En una modalidad preferida de un proceso 300 que incluye un biorreactor 311 que incluye una bolsa desechable 402, la bolsa desechable 402 es utilizada para 3 a 4 lotes antes de ser desechada. La reutilización de la bolsa desechable reduce el costo recurrente del remplazo de la bolsa desechable 402.

El biorreactor 400 que incluye la bolsa reutilizable 402, puede ser utilizado para el procesamiento por lotes y el procesamiento continuo (quimiostático) .

Los procesos y aparatos descritos en la presente están diseñados para ser particulares incluso cuando son elevados de escala para crear un producto celular encapsulado a una escala industrial. Por ejemplo, los procesos y aparatos descritos en la presente pueden ser elevados de escala para servir a reactores industriales o a una serie de reactores industriales. Los reactores industriales pueden estar a una escala de 20,000 :L .(75,00 galones) o incluso mayores.

Aunque las modalidades han sido descritas con referencia a las Figuras y los ejemplos específicos, será fácilmente apreciado por aquellos expertos en la técnica que muchas modificaciones y adaptaciones de los pfpc sos y aparatos descritos en la presente son posibles sin apartarse del espíritu y alcance de las modalidades como se reclaman más adelante en la presente. De este modo, se entiende claramente que esta descripción es realizada únicamente a manera de ejemplo y no como una limitación sobre el alcance de las modalidades como se describen más adelante .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para la producción de un producto de células encapsuladas , caracterizado porque comprende los pasos de : a. concentrar las células a partir de un medio de propagación utilizando un sistema de filtración por flujo tangencial, en donde las células son concentradas en un retenido, y el retenido es reciclado a través del sistema de filtración por flujo tangencial hasta que es alcanzada una concentración celular deseada; b. mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamxento para formar una mezcla de encapsulamiento de células ; y c. polimerizar la mezcla de encapsulamiento de células para formar un producto celular encapsulado."

2. El proceso de conformidad ¦ con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende el paso de utilizar las células provenientes del medio de propagación como un inoculo para una producción subsiguiente de un producto celular encapsulado.

3. El proceso de conformidad · con la reivindicación 1, caracterizado porque el retenido reciclado entre un recipiente de mantenimiento del retenido y el sistema de filtración por flujo tangencial.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el retenido reciclado a través del sistema de filtración por flujo tangencial hasta que es alcanzada una concentración celular mayor de 180 gramos de masa húmeda de células por litro.

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de mezclado es realizado con un agitador de movimiento alternante.

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de mezclado es realizado con un disco de movimiento alternante.

7. Un sistema para la producción de un producto celular encapsulado, caracterizado porque comprende: un biorreactor; un sistema de filtración por flujo tangencial en comunicación con el biorreactor; y i un recipiente de mantenimiento del retenido en comunicación con el sistema de filtración por flujo tangencial .

8. El sistema de conformidad · con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende un agitador de movimiento alternante operativamente : acomodado para mezclar una suspensión celular a partir del recipiente de mantenimiento del retenido con un medio de encapsulamiento .

9. El sistema de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el biorreactor es un biorreactor quimiostático .

10. Un proceso para la producción de un producto celular encapsulado, caracterizado porque comprende los pasos de: a. concentrar las células a partir de un medio de propagación; b. mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamiento utilizando un agitador de movimiento alternante para formar una mezcla de encapsulamiento; y c. polimerizar la mezcla de encapsulamiento para formar un producto celular encapsulado.

11. El proceso de conformidad .con. la reivindicación 10, caracterizado porque las células son concentradas a más de 180 gramos de masa húmeda dé células por litro.

12. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el medio de encapsulamiento tiene una viscosidad de aproximadamente 1000 a 3500 centistokes.

13. El proceso de conformidad ' con la reivindicación 10, caracterizado porque la mezcla de encapsulamiento celular tiene una viscosidad de aproximadamente 1000 a 3500 centistokes.

14. Un proceso para la producción de un producto celular encapsulado, caracterizado porque comprende los pasos de: a. propagar las células en un biorreactor para formar un primer lote de células; b. concentrar las células a partir del primer lote de células; c. mezclar las células concentradas con un medio de encapsulamiento para formar una mezcla de encapsulamiento celular; d. polimerizar la mezcla de encapsulamiento celular para formar un producto celular encapsulado; y e. propagar las células en un biorreactor para formar un segundo lote de células utilizando las células provenientes del primer lote de células como un inócülo. ;

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el biorreactor- no es esterilizado entre la propagación del primer lote de células y la propagación del segundo lote de células. i

16. El proceso de conformidad ".coñ la reivindicación 14, caracterizado porque el paso' de concentración es realizado mediante un sistema de filtración por flujo tangencial y las células son concentradas en un retenido .

17. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque una porción del retenido es utilizado como el inoculo.

18. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque incluye además el paso de reciclar el retenido entre un recipiente de mantenimiento del retenido y el sistema de filtración por flujo tangencial.

19. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el paso de reciclamiento es realizado hasta que el retenido alcanza una concentración celular mayor de 180 gramos de masa húmeda de células por litro.

20. El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el inoculo comprende aproximadamente 5 % a 10 % del volumen del primeír lote de células. - .

21. Un proceso para la producción de un producto celular encapsulado, caracterizado porque comprende' los pasos de: : a. mezclar una solución acuosa con un medio de encapsulamiento concentrado para formar un ¡medio de encapsulamiento, en donde el mezclado es realizado sin la adición de calor suficiente para esterilizar el medio de encapsulamiento; b. mezclar las células con el medio de encapsulamiento sin calentamiento para formar una mezcla de encapsulamiento celular; y c. polimerizar la mezcla de encapsulamiento celular para producir un producto celular encapsulado; y en donde el medio de encapsulamiento celular es esterilizado por al menos una de las siguientes técnicas: agregar un agente de esterilización a la solución acuosa antes del paso de mezclado de una solución acuosa; agregar un agente de esterilización al medio de encapsulamiento durante el paso de mezclado de una solución acuosa; esterilizar la solución acuosa y el producto de encapsulamiento concentrado antes del paso de mezclado de una solución acuosa; e irradiar el medio de encapsulamiento.

22. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agente de esterilización es agregado a la solución acuosa.

23. El proceso de conformidad Í:' COÍI¡>- la reivindicación 22, caracterizado porque el agente de esterilización es clorito de sodio.

24. El proceso de conformidad co la reivindicación 21, caracterizado porque comprende 'además el paso de agregar antibióticos al medio de encapsulamiento.

25. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende además el paso de agregar nutrientes al medio de encapsulamiento.

26. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque además comprende el paso de agregar vitaminas al medio de encapsulamiento.

27. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende además el paso de irradiar el medio de encapsulamiento concentrado.

28. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque además comprende el paso de irradiar el medio de encapsulamiento.

29. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de mezclar las células es realizado con un agitador de movimiento alternante.

30. El proceso de conformidad "con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de mezclar las células es realizado con un disco de movimiento alternante.

31. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el imedio de encapsulamiento concentrado comprende alginato de sodio.

32. El proceso de conformidad · con la reivindicación 31, caracterizado porque el alginato de sodio es mezclado con la solución acuosa para producir un medio de encapsulamiento con una viscosidad de aproximadamente 1000 a 3500 centistokes.

33. El proceso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la mezcla del encapsulamiento celular tiene una viscosidad de aproximadamente 1000 a 3500 centistokes.

34. El proceso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el medio de encapsulamiento tiene una concentración de alginato de sodio de 3.0 % o menos peso por volumen.

35. El proceso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el medio de encapsulamiento tiene una concentración de alginato de sodio de 2.5 % o menos peso por volumen.

36. El proceso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el medio de encapsulamiento tiene una concentración de alginato d| sodio de aproximadamente 2.0 % peso por volumen.

37. Una esfera de alginato para el encapsulamiento de una célula, caracterizada porque comprende: a. alginato polimerizado en una concentración de 3 % o menos peso por volumen; y b. una célula encapsulada. :

38. La esfera de alginato de conformidad ; con la reivindicación 37, caracterizada porque la concentración de alginato es de 2.5 % o menos peso por volumen.

39. La esfera de alginato de conformidad con reivindicación 37, caracterizada porque la concentración alginato es de 2.0 % peso por volumen.