MX2013000320A

MX2013000320A - Composiciones y metodos para suministro al sistema nervioso central de heparan n-sulfatasa.

Info

Publication number: MX2013000320A
Application number: MX2013000320A
Authority: MX
Inventors: Zahra Shahrokh; Pericles Calias; Farah Natoli; Gaozhong Zhu; Jennifer Terew; Yuan Jiang; Jamie Tsung; Brian Vernaglia; Jing Pan; Richard Pfeifer
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-25
Publication date: 2013-06-05
Also published as: JP2013530988A; TW201204385A; WO2011163647A2; WO2011163647A3; US20120014936A1; AU2011270667B2; EP2588131A2; AU2011270667A1; NZ605874A; EP2588131A4; JP6073783B2; KR20140005842A; US9320711B2; RU2012154576A; CN103260637B; EP2588131B1; BR112012033197A2; TWI546078B; CN103260637A; AU2017202216A1

Abstract

La presente invención proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para suministro al CNS de enzimas lisosomales para tratamiento efectivo de enfermedad de almacenamiento lisosomal; en algunas modalidades, la presente invención incluye una formulación estable para administración intratecal directa al CNS que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS), sal, y un tensoactivo de polisorbato para el tratamiento del Síndrome de Sanfilippo Tipo A.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA SUMINISTRO AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE HEPARAN N-SULFATASA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad a las Solicitudes de Patente Provisionales Estadounidenses números de serie 61/358,857 presentada en Junio 25 de 2010; 61/360,786, presentada en Julio 1 de 2010; 61/387,862, presentada en Septiembre 29 de 2010; 61/435,710, presentada en Enero 24 de 201 1 ; 61/442,1 15, presentada en Febrero 1 1 de 201 1 ; 61/476,210, presentada en Abril 15 de 201 1 ; y 61/495,268 presentada en Junio 9 de 201 1 ; la totalidad de cada una de la cual se incorpora en la presente por referencia. Esta solicitud se refiere a las solicitudes Estadounidenses tituladas "CNS Delivery of Therapeutic Agents", presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of lduronate-2-Sulfatase," presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of ß-Galactocerebrosidase," presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of Arylsulfatase A", presentada en la misma fecha; "Treatment of Sanfilippo Syndrome Type B," presentada en la misma fecha; la totalidad de cada una de las cuales está de este modo incorporada por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia de reemplazo de enzima (ERT) involucra la administración sistémica de proteínas naturales o recombinantemente derivadas y/o enzimas a un sujeto. Las terapias aprobadas son típicamente administradas a sujetos intravenosamente y son en general efectivas en el tratamiento de los síntomas somáticos de la deficiencia de enzima subyacente. Como un resultado de la distribución limitada de la proteína intravenosamente administrada y/o enzima en las células y tejidos del sistema nervioso central (CNS), el tratamiento de enfermedades que tienen una etiología del CNS ha sido especialmente estimulante debido a que las proteínas y/o enzimas intravenosamente administradas no cruzan adecuadamente la barrera hematoencefálíca (BBB).

La barrera hematoencefálíca (BBB) es un sistema estructural comprendido de células endoteliales que funciona para proteger el sistema nervioso central (CNS) de sustancias deletéreas en la corriente sanguínea, tales como bacterias, macromoléculas (por ejemplo, proteínas) y otras moléculas hidrofílicas, limitando la difusión de tales sustancias a través de la BBB y en el fluido cerebroespinal subyacente (CSF) y CNS.

Existen varias formas para eludir la BBB para mejorar el suministro cerebral de un agente terapéutico que incluye inyección intracraneal directa, permeabilización temporal de la BBB, y modificación del agente activo para alterar la distribución del tejido. La inyección directa de un agente terapéutico en el tejido cerebral deriva la complejidad de la vasculatura, pero sufre principalmente del riesgo de complicaciones (infección, daño al tejido, sensibilidad inmune) incurrida por inyecciones intra-craneales y pobre difusión del agente activo a partir del sitio de administración. A la fecha, la administración directa de proteínas en la sustancia cerebral no ha logrado efecto terapéutico significante debido a las barreras de difusión y al volumen limitado de terapéutico que puede ser administrado. La difusión asistida por convección se ha estudiado vía catéteres colocados en el parénquima cerebral usando infusiones a largo plazo, lentas (Bobo, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 91 , 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), pero no terapias aprobadas usando actualmente este procedimiento para terapia a largo plazo. Además, la colocación de catéteres intracerebrales es muy invasiva y menos deseable como una alternativa clínica.

La inyección intratecal (IT), o la administración de proteínas al fluido cerebroespinal (CSF) también se ha intentado pero aún no ha sido proporcionado éxito terapéutico. Un desafío principal en este tratamiento ha sido la tendencia del agente activo para unir el revestimiento ependimal del ventrículo muy herméticamente el cual previene la subsecuente difusión. Actualmente, no existen productos aprobados para el tratamiento de enfermedades genéticas cerebrales por administración directamente al CSF.

En efecto, muchos creen que la barrera a la difusión en la superficie cerebral, así como también la carencia de métodos de suministro efectivos y convenientes, fueron también demasiado un obstáculo para lograr efecto terapéutico adecuado en el cerebro para cualquier enfermedad.

Muchos trastornos de almacenamiento lisosomal afectan el sistema nervioso y de este modo demuestran desafíos únicos en el tratamiento de estas enfermedades con terapias tradicionales. Existe a menudo una gran acumulación de glicosaminoglicanos (GAGs) en neuronas y meninges de individuos afectados, conduciendo a varias formas de síntomas del CNS. A la fecha, ningunos síntomas del CNS resultantes de un trastorno lisosomal han sido exitosamente tratados por cualesquiera medios disponibles.

De este modo, permanece una mayor necesidad para suministrar efectivamente agentes terapéuticos al cerebro. Más particularmente, existe una mayor necesidad para suministro más efectivo de agentes activos al sistema nervioso central para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosomal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un procedimiento efectivo y menos invasivo para suministro directo de agentes terapéuticos al sistema nervioso central (CNS). La presente invención está en parte, basada en el descubrimiento inesperado que una enzima de reemplazo (por ejemplo, heparan N-sulfatasa (HNS)) para una enfermedad de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, Síndrome de Sanfilippo A) puede ser directamente introducida en el fluido cerebroespinal (CSF) de un sujeto en necesidad de tratamiento a una alta concentración (por ejemplo, mayor de aproximadamente 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml o más) de manera que la enzima de difunde efectivamente y extensivamente a través de varias superficies y penetra varias regiones a través del cerebro, que incluyen regiones profundas del cerebro. Más sorprendentemente, los presentes inventores han demostrado que tal suministro de concentración de proteína alta se puede hacer usando formulaciones simples a base de amortiguador o salina y sin inducir efectos adversos sustanciales, tales como respuesta inmune severa, en el sujeto. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento altamente eficiente, clínicamente deseable y amigable al paciente para suministro directo al CNS para el tratamiento de varias enfermedades y trastornos que tienen componentes del CNS, en particular, enfermedades de almacenamiento lisosomal. La presente invención representa un avance significante en el campo de terapia de reemplazo de enzima y de objetivo del CSN.

Como se describe en detalle abajo, los presentes inventores han desarrollado exitosamente formulaciones estables para administración intratecal (IT) efectiva de una proteína de heparan N-sulfatasa (HNS). Se contempla, sin embargo, que varias formulaciones estables descritas en la presente son en general adecuadas para suministro al CNS de agentes terapéuticos, que incluyen varias otras enzimas lisosomales. Sin embargo, las formulaciones estables de conformidad con la presente invención pueden ser usadas para suministro al CNS vía varias técnicas y rutas que incluyen, pero no se limitan a, administraciones intraparenquimal, intracerebral, intraventricular cerebral (ICV), intratecal (por ejemplo, IT-Lumbar, IT-cisterna magna) y cualesquiera otras técnicas y rutas para inyección directamente o indirectamente al CNS y/o CSF.

También se contempla que varias formulaciones estables descritas en la presente son en general adecuadas para suministro al CNS de otros agentes terapéuticos, tales como proteínas terapéuticas que incluyen varias enzimas de reemplazo para enfermedades de almacenamiento lisosomal. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo puede ser una enzima sintética, recombinante, activada por gen o natural.

En un aspecto, la presente invención incluye formulaciones estables para administración intratecal que comprenden una proteína heparan N-sulfatasa (HNS), sal, un agente amortiguador y un tensoactivo de polisorbato. En algunas modalidades, la proteína HNS está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 1 -300 mg/ml (por ejemplo, 1-250 mg/ml, 1-200 mg/ml, 1 -150 mg/ml, 1 -100 mg/ml, 1-50 mg/ml). En algunas modalidades, la proteína HNS está presente en o hasta una concentración seleccionada de 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, ó 300 mg/ml.

En varias modalidades, la presente invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la proteina HNS comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, la proteína HNS comprende una secuencia de aminoácido al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 98% idéntica a la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, la formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente incluye una sal. En algunas modalidades, la sal es NaCI. En algunas modalidades, el NaCI está presente como una concentración que varía desde aproximadamente 0-300 mM (por ejemplo, 0-250 mM, 0-200 mM, 0-150 mM, 0-100 mM, 0-75 mM, 0-50 mM, ó 0-30 mM). En algunas modalidades, el NaCI está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 135-155 mM. En algunas modalidades, el NaCI está presente en una concentración de aproximadamente 145 mM.

En varias modalidades, la presente invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde el tensoactivo de polisorbato se selecciona del grupo que consiste de polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el tensoactivo de polisorbato es polisorbato 20. En algunas modalidades, el polisorbato 20 está presente a una concentración que varía aproximadamente 0-0.02%. En algunas modalidades, el polisorbato 20 está presente en una concentración de aproximadamente 0.005%. En algunas modalidades, el polisorbato 20 está presente a una concentración de aproximadamente 0.02%.

En varias modalidades, la presente invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación además comprende un agente amortiguador. En algunas modalidades, el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste de fosfato, acetato, histidina, succinato, Tris, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el agente amortiguador es fosfato. En algunas modalidades, el fosfato está presente en una concentración no mayor de 50 mM (por ejemplo, no mayor de 45 m , 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, ó 5 mM). En algunas modalidades, el fosfato está presente eñ una concentración no mayor de 20 mM. En ciertas modalidades, el fosfato está presente a una concentración de aproximadamente 5 mM. En varios aspectos la invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 3-8 (por ejemplo, aproximadamente 4-7.5, 5-8, 5-7.5, 5-6.5, 5-7.0, 5.5-8.0, 5.5-7.7, 5.5-6.5, 6-7.5, 6-7.0, ó 6.5-7.5). En algunas modalidades, la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.5-7.5 (por ejemplo, 6.5, 6.7, 6.9, 7.0, 7.2, 7.3 ó 7.5). En algunas modalidades, la formulación tiene un pH de aproximadamente 7.0.

En algunas modalidades, la formulación además comprende un agente estabilizante. En ciertas modalidades, el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol, PEG 4000, histidina, arginina, lisina, fosfolípidos y combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, el agente estabilizante es sacarosa. En algunas modalidades, la sacarosa está presente a una concentración que varia desde aproximadamente 0-10%. En algunas modalidades, la sacarosa está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0.5-2.0%. En ciertas modalidades, el agente estabilizante es glucosa. En algunas modalidades, la glucosa está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0.5-1.0%.

En vahas modalidades, la presente invención incluye formulaciones estables de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación es una formulación líquida. En varias modalidades, la presente invención incluye formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación es formulada como polvo seco liofilizado.

En algunas modalidades, la presente invención incluye una formulación estable para administración intratecal que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS) a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 100-200 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.02%, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM, y a un pH de aproximadamente 7.0. En algunas modalidades, la proteina de HNS está a una concentración de aproximadamente 15 mg/ml. En algunas modalidades, la proteína de HNS está a una concentración de aproximadamente 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, ó 300 mg/ml. En algunas modalidades, el NaCI está a una concentración de aproximadamente 145 mM. En algunas modalidades, la formulación además comprende sacarosa a una concentración de aproximadamente 0-10% (por ejemplo, aproximadamente 0-5%, 1 -7%, 1 -2.5%. 1-1.5%, ó 0.5-1.5%).

En algunas modalidades, la presente invención incluye una formulación estable para administración intratecal que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS) a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 145 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.02%, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM, sacarosa a una concentración de aproximadamente 0.5-2%, y a un pH de aproximadamente 7.0.

En algunas modalidades, la presente invención incluye una formulación estable para administración intratecal que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS) a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 145 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.02%, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM, glucosa a una concentración de aproximadamente 0.5-1.0%, y a un pH de aproximadamente 7.0.

En varios aspectos, la presente invención incluye un contenedor que comprende una forma de dosificación única de una formulación estable en varias modalidades descritas en la presente. En algunas modalidades, el contenedor se selecciona de una ampolleta, un vial, una botella, un cartucho, un reservorio, una lyo-ject o jeringa pre-llenada. En algunas modalidades, el contenedor es una jeringa pre-llenada. En algunas modalidades, la jeringa pre-llenada se selecciona de jeringas de vidrio de borosilicato con revestimiento de silicona al horno, jeringas de vidrio de borosilicato con silicona rociada, o jeringas de resina plástica sin silicona. En algunas modalidades, la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 50 ml_ (por ejemplo, menos de aproximadamente 45 mi, 40 mi, 35 mi, 30 mi, 25 mi, 20 mi, 15 mi, 10 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2.5 mi, 2.0 mi, 1.5 mi, 1.0 mi, ó 0.5 mi). En algunas modalidades, la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 3.0 ml_.

En varios aspectos, la presente invención incluye métodos para tratar Síndrome de Sanfilippo A que incluye la etapa de administrar intratecalmente a un sujeto en necesidad de tratamiento una formulación de conformidad con cualquiera de las modalidades descritas en la presente.

En algunas modalidades, la presente invención incluye un método para tratar Síndrome de Sanfilippo A que incluye una etapa de administrar intratecalmente a un sujeto en necesidad de tratamiento una formulación que comprende una proteína HNS a una concentración que varía desde aproximadamente 1-300 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 145 mM de polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.02%, y un pH de aproximadamente 7.

En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en ningunos efectos adversos sustanciales (por ejemplo, respuesta inmune severa) en el sujeto. En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en ninguna respuesta inmune mediada por células-T adaptivas sustanciales en el sujeto.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en suministro de la proteína de HNS a varios tejidos objetivo en el cerebro, la médula espinal, y/u órganos periféricos. En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en suministro de la proteína de HNS a tejidos cerebrales objetivos. En ciertas modalidades, uno o más tejidos cerebrales objetivo se seleccionan del grupo que consiste de tejidos de la materia gris, materia blanca, áreas periventriculares, pia-aracnoide, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región caudada/putamen, cerebro medio, regiones profundas de las protuberancias o médula, y combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, la proteína de HNS se suministra a neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meningeales. En algunas modalidades, la proteína de HNS es además suministrada a las neuronas en la médula espinal.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación además resulta en suministro sistémico de la proteína HNS en tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, los tejidos periféricos objetivos son seleccionados de hígado, riñon, bazo y/o corazón.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en localización lisosomal en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en reducción de almacenamiento de GAG en los tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, el almacenamiento de GAG se reduce por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1-vez, .5-veces, ó 2-veces comparada con un control (por ejemplo, el almacenaje de GAG de pre-tratamiento en el sujeto). En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en vacuolización reducida en neuronas (por ejemplo, por al menos 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1-vez, 1.5-veces, ó 2-veces comparada con un control). En algunas modalidades, las neuronas comprenden células Purkinje.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en actividad enzimática HNS incrementada en los tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la actividad enzimática HNS se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control (por ejemplo, la actividad enzimática endógena de pre-tratamiento en el sujeto). En algunas modalidades, la actividad enzimática HNS incrementada es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg ó 600 nmol/hr/mg.

En algunas modalidades, la actividad enzimática HNS se incrementa en la región lumbar. En algunas modalidades, la actividad enzimática HNS incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, ó 10,000 nmol/hr/mg.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en intensidad reducida, severidad, o frecuencia, o comienzo retardado de al menos un síntoma o característica del Síndrome de Sanfilippo A. En algunas modalidades, al menos un síntoma o característica del Síndrome de Sanfilippo A es pérdida auditiva, desarrollo retardado del habla, deficiencias en habilidades motoras, hiperactividad, retraso mental, agresividad y/o alteraciones del sueño.

En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada mes. En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada dos meses. En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en conjunto con administración intravenosa. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada semana. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada mes. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada dos meses. En ciertas modalidades, la administración intravenosa es más frecuente que la administración mensualmente, tal como dos veces semanalmente, semanalmente, cada tercer semana, o dos veces mensualmente.

En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan en el mismo día. En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales no se realizan dentro de una cierta cantidad de tiempo de entre sí, tal como no dentro de al menos 2 días, dentro de al menos 3 dias, dentro de al menos 4 días, dentro de al menos 5 días, dentro de al menos 6 días, dentro de al menos 7 días, o dentro de al menos una semana. En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan en un esquema alterno, tal como administraciones alternadas semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente. En algunas modalidades, una administración ¡ntratecal reemplaza una administración intravenosa en un esquema de administración, tal como en un esquema de administración intravenosa semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente, cada tercera o cuarta o quinta administración en tal esquema puede ser reemplazada con una administración ¡ntratecal en lugar de una administración intravenosa.

En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan secuencialmente, tal como realizar administraciones intravenosas primero (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más) seguido por administraciones intratecales (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por más de dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más). En algunas modalidades, administraciones intratecales son realizadas primero (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses dosificando por dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más) seguido por administraciones intravenosas (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por más de dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más).

En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en ausencia de administración intravenosa.

En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en ausencia de terapia inmunosupresora concurrente BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras son para propósitos de ilustración solamente, no para limitación.

Las figura 1A-1 D representan cromatogramas ejemplares de perfiles de elución de SEC-HPLC para HNS. (Figura 1A) Perfil de 2mg/ml de rhHNS 20mM de Citrato, pH 7.0; (Figura 1 B) Cromatograma escalado de 2 mg/ml de rhHNS 20mM de Citrato, pH 7.0, valores de referencia (ilc); (Figura 1 C) Cromatograma escalado de 2mg/ml de rhHNS 20mM de Citrato, pH 7.0 después de 7 días a 50°C; (Figura 1 D) Traslape del barrido de longitud de onda del pico a 16 min y pico de dímero a 26 min de 2mg/ml de Citrato, pH 7.0 después de 7 días a 50°C.

Las figuras 2A-2C representan geles de SDS-PAGE reducidos ejemplares a partir de estudios de pH para rhHNS en varios amortiguadores y a varios pH (Figuras 2A-2C).

Las figuras 3A-3C representan geles de SDS-PAGE no reducidos ejemplares a partir de estudios de pH para rhHNS en varios amortiguadores y a varios pH (Figuras 3A-3C).

La Figura 4 representa estabilidad térmica dependiente de pH ejemplar en citrato como se determina por DSC. La temperatura de fusión más alta de rhHNS en citrato fue 90°C a pH 6.0. La temperatura de fusión de rhHNS a cada pH examinado excede 70°C.

La Figura 5 representa estabilidad térmica dependiente de pH ejemplar en fosfato como se determina por DSC. Formulaciones de rhHNS que contienen fosfato muestran estabilidad térmica mayor a pH 6-7. La temperatura de fusión de rhHNS a cada pH examinado excede 70°C.

Las figuras 6A-6B representan geles de SDS-PAGE teñidos con plata ejemplares de formulaciones de rhHNS a partir de estudios de efectos iónicos después de 7 días a 50°C. Los geles se corrieron usando muestras las cuales se sometieron a ebullición por 10 minutos (Figuras 6A-6B).

Las figuras 7A-7B representan un estudio de solubilidad de rhHNS ejemplar. (Figura 7A) Efecto de pH en solubilidad de rhHNS; (Figura 7B) Efecto de concentración de sal en la solubilidad de rhHNS. El incremento en pH y cloruro de sodio parece incrementar la solubilidad en rhHNS.

Las figuras 8A-8B representan un estudio ejemplar del efecto de la sal en el estado nativo de rhHNS usando AUC. (Figura 8A) Efecto de 145 mM de sal; (Figura 8B) Efecto de 300 mM de sal.

Las figuras 9A-9B representan un estudio ejemplar en el efecto del nivel de sacarosa y unidad de liofilización en la apariencia de la torta de formulaciones de rhHNS liofilizadass. (Figura 9A) unidad VirTis lyo; panel superior, 1 % de sacarosa; panel inferior 1.5% de sacarosa; (Figura 9B) 1.5% de sacarosa; panel superior, unidad VirTis lyo; panel inferior unidad LyoStar lyo.

La Figura 10 representa imágenes de partículas ejemplares por Formación de imagen por Micro-Flow (MFI) para muestras de rhHNS liofilizadas.

La Figura 11 representa imágenes ejemplares de un estudio del efecto de polisorbato 20 en partículas detectadas por MFI para muestras de rhHNS pre-liofilizadas que contienen 1 .5% de sacarosa después de 0.22 µ?t? de filtración.

La Figura 12A representa un resultado ejemplar que ilustra concentraciones CSF de la rhHNS como una función de tiempo a 1.5, 4.5 y 8.3 mg de dosis después de 6 meses de dosificación. La figura 12B detalla un resultado ejemplar que ilustra concentraciones de anticuerpo anti-HNS en el CSF después de 6 meses de administración TI de dosis a 1.5, 4.5 y 8.3 mg en monos. Los datos son mostrados para machos y hembras combinados. La figura 12C detalla en resultado ejemplar que ilustra concentraciones de anticuerpo anti-HNS en el CSF después de 6 meses de administración de dosis 1.5, 4.5 y 8.3 mg en monos después de 6 meses de dosificación. Los datos se muestran para machos y hembras combinados. Las dos concentraciones más elevadas (32,205 ng/ml y 15,467 ng/ml) después de la dosis IT de 6 a 8.3 mg de rhHNS se excluyeron del lote porque las muestras de CSF no se tomaron con la predosis 6.

Las figuras 13A-13F representan imágenes representativas ejemplares de secciones del tejido a partir de las meninges y parénquima del cerebro teñido con hetatoxilina y eosina. La Figura 13A describe un resultado ejemplar que ilustra una vista de baja energía de los infiltrados neutrofilicos locales al catéter IT en un mono DC. La figura 13B representa un resultado ejemplar que ilustra una vista de energía alta de infiltrados eosinofilicos en las meninges de un mono de dosis alta (83 mg/dosis); la severidad total de infiltrados es similar al grupo de dosis media (4.5 mg/dosis) (no mostrado). La figura 13C describe un resultado ejemplar que ilustra un vista de energía baja de un mono de dosis baja (1.5 mg/kg) que muestra eosinófilos en un espacio perivascular (parénquima del cerebro). La figura 13D representa un resultado ejemplar que ilustra un mono de baja dosis (1.5 mg/dosis) que muestra eosinófilos en el espacio perivascular y contiguo al parénquima. La figura 13E representa un resultado ejemplar que ilustra eosinófilos en el parénquima de la médula espinal (indicado por flechas) de un animal del grupo de baja dosis; las neuronas en el área son normales. La figura 13F describe un resultado ejemplar que ilustra eosinófilos y un área de microgliosis (las flechas indican eosinófilos; el cuadro indica un área de microgliosis) en un mono de baja dosis (1.5 mg/dosis). Existen varias neuronas grandes en el área, todas las cuales son normales. Barras de escala: 200 pm.

Las figuras 14A-14D representan un resultado ejemplar que ilustra actividad enzimática de rhHNS en médula espinal y cerebro del mono. Las figuras 14A y 14B representan un resultado ejemplar que ilustra la actividad en las médulas espinales de monos (figura 14A) macho y (figura 14B) hembra. Corte -3 = lumbar, cortes 3, 6 = torácico, y corte 9 = cervical; 0 = punta de catéter. Las figuras 14C y 14D representan un resultado ejemplar que ilustra la actividad de rhHNS en los cerebros de monos (figura 14C) macho y (figura 14D) hembra. Los cortes son numerados rostrales a caudales (3 a 15). Todas las muestras de tejido se recolectan a aproximadamente 24 horas del la última dosis o 4 semanas después de la última dosis de la recuperación de los animales. DC, control de dispositivo. Los datos representan media ± SEM para n = 4 monos por grupo de tratamiento.

Las figuras 15A-15B representan un resultado ejemplar que ilustra actividad enzimática en cerebro e hígado del mono. La Figura 15A representa un resultado ejemplar que ¡lustra la distribución de la actividad rhHNS en el cerebro del mono del grupo de dosis alta (8.3 mg/dosis) Se muestra el cambio de veces en la actividad para áreas de superficie, profundas y muy profundas (periventricular) del cerebro comparado con niveles endógenos (grupo DC). Todas las muestras del tejido se recolectaron aproximadamente 24 horas después de la última dosis o 4 semanas después de la última dosis para la recuperación de los animales. Los datos representan media ± SEM para n = 6 monos (ambos sexos), cortes del cerebro 6 y 9. Los datos para dos monos no son incluidos; en necropsia de catéteres no se encontraron estar distinguible. La figura 15B muestra actividad rhHNS en hígado del mono. Todas las muestras del tejido se recolectaron aproximadamente 24 horas después de la última dosis o 4 semanas después de la última dosis para la recuperación de los animales. DC, control de dispositivo. Rec, recuperación. Los datos representan media ± SEM para n = 4 monos por grupo de tratamiento excepto para el grupo de hembra de baja dosis (4.5 mg/dosis) (n = 3).

Las figuras 16A-16D representa un resultado ejemplar que ilustra la localización de rhHNS en el cerebelo de monos cinomólogos juveniles: cohorte interino de 3 meses. La Figura 16A representa un resultado ejemplar que ilustra el cerebelo de un animal de control con vehículo (0 mg/dosis) negativo para inmunoteñido de rhHNS; amplificación 20X. La Figura 16B representa un resultado ejemplar que ilustra el cerebelo de un animal de baja dosis (1.5 mg/dosis) que muestra teñido positivo mínimo limitado a la capa molecular; amplificación 20X. La Figura 16C representa un resultado ejemplar que ilustra el cerebelo de un animal de dosis media (4.5 mg/dosis) que muestra teñido mínimo en la capa granular externa; amplificación 20X. La Figura 16D representa un resultado ejemplar que ilustra teñido moderado en el cerebelo de un animal de dosis alta (8.3 mg/dosis) que incluye capa granular externa, molecular, y células Purkinje; amplificación 20X.

La Figura 17 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en la región de cabeza trazado con tiempo en los primeros 20 minutos después de La dosificación IT de 12 I-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 18 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en el cerebro trazado con tiempo después de la dosificación IT de 24I-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 19 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en la región del cerebro trazado con tiempo después de la dosificación IT de 24I-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 20 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en la región de cabeza trazado con tiempo después de La dosificación IT de 24I-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 21 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en la espina próxima trazado con tiempo después de la dosificación IT de 124I-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 22 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en la espina media trazado con tiempo después de la dosificación IT de 12 I-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 23 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en la espina distal trazado con tiempo después de la dosificación IT de 124l-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 24 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en el hígado trazado con tiempo después de la dosificación IT de 24l-HNS a 1 y 10 mg/kg.

La Figura 25 representa un estudio ejemplar de la concentración de rhHNS en el cerebro trazado con tiempo después de la dosificación IT de 124I-HNS a 1 y 10 mg/kg, individual (superior) y media ±SD (inferior).

La Figura 26 representa un estudio ejemplar de la concentración hepática de rhHNS trazado con tiempo después de la dosificación IT de 2 l-HNS a 1 y 10 mg/kg, individual (superior) y media ±SD (inferior).

La Figura 27 representa un estudio ejemplar de la concentración renal de rhHNS trazado con tiempo después de la dosificación IT de 12 I-HNS a 1 y 10 mg/kg, individual (superior) y media ±SD (inferior).

La Figura 28 representa un estudio ejemplar de la concentración del corazón de rhHNS trazado con tiempo después de la dosificación IT de 12 I-HNS a 1 y 10 mg/kg, individual (superior) y media ±SD (inferior).

La Figura 29 representa un estudio ejemplar de la concentración de piel de rhHNS trazado con tiempo después de la dosificación IT de 12 l-HNS a 1 y 10 mg/kg, individual (superior) y media ±SD (inferior).

La Figura 30 representa un estudio ejemplar de la concentración de cerebro de rhHNS trazado con tiempo después de la dosificación IT de 12 l-HNS a 1 y 10 mg/kg (superior), y una comparación de los parámetros PK no compartamentales del cerebro (inferior).

La Figura 31 representa un estudio ejemplar de la concentración de hígado de rhHNS trazado con tiempo después de la dosificación IT de 124l-HNS a 1 y 10 mg/kg (superior), y una comparación de los parámetros PK no compartamentales en el hígado (inferior).

La Figura 32 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD).

La Figura 33 representa un sistema de acceso implantable intratecal de bajo perfil de puerto de catéter.

La Figura 34 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD).

La Figura 35 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD), el cual permite la administración en el hogar para terapia de reemplazo enzimático (ERT) de CNS.

La Figura 36 ilustra un diagrama ejemplar de un dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IDDD) con un mecanismo de seguridad.

La Figura 37A representa ubicaciones ejemplares dentro del cuerpo del paciente en donde un IDDD se puede reemplazar; La Figura 37B representa varios componentes de un dispositivo de suministro del fármaco intratecal (IDDD); y la Figura 37C describe una ubicación de inserción ejemplar dentro de un cuerpo del paciente para inyección IT-lumbar.

Definiciones Para que se comprenda más fácilmente la presente invención, a continuación se definen primero ciertos términos. Definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la especificación.

Aproximadamente o alrededor de: Como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" o "alrededor de", según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un rango de valores que caen dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%), 15%, 14%), 13%), 12%, 1 1 %, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%), o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o que sea evidente a partir del contexto (excepto donde tal número excedería 100% de un posible valor).

Mejora: Como se utiliza aquí, el término "mejora" denota la prevención, reducción o paliación de un estado, o la mejora del estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere la recuperación completa o la prevención completa de una condición del padecimiento. En algunas modalidades, la mejora incluye incrementar los niveles de la proteína pertinente o su actividad que es deficiente en los tejidos de padecimiento pertinentes.

Biológicamente activo: Como se utiliza aquí, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera como biológicamente activo. En modalidades particulares, donde una proteína o un polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o el polipéptido típicamente se refiere como una porción "biológicamente activa".

Agente espesante. Como se utiliza aquí, el término "agente espesante1' se refiere a un compuesto que agrega masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada (por ejemplo, facilita la producción de una torta liofilizada esencialmente uniforme que mantiene una estructura de poro abierto). Los agentes espesantes ejemplares incluyen manitol, glicina, cloruro de sodio, almidón de hidroxietilo, lactosa, sacarosa, trehalosa, polietilenglicol y dextrano.

Receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (Cl-MPR): Como se utiliza aquí, el término "receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR)" se refiere a un receptor celular que enlaza las etiquetas de manosa-6-fosfato (M6P) en los precursores de las hidrolasas ácidas en el aparato Golgi que se destinan para el transporte al lisosoma. Además de los manosa-6-fosfatos, el CI-MPR también enlaza otras proteínas incluyendo IGF-II. El CI-MPR también es conocido como "receptor M6P/IGF-II", "receptor CI-MPR/IGF-II", "receptor IGF-II" o "receptor IGF2". Estos términos y abreviaturas de los mismos se utilizan aquí de forma intercambiable.

Terapia inmunosupresora concurrente: Como se utiliza aquí, el término "terapia inmunosupresora concurrente" incluye cualquier terapia inmunosupresora utilizada como p re-trata miento, pre-condicionamiento o en paralelo a un método de tratamiento.

Diluyente: Como se utiliza aquí, el término "diluyente" se refiere a una sustancia diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, segura y no tóxica para la administración a un humano), útil para la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución amortiguada en pH (por ejemplo, solución salida amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

Forma de dosificación: Como se utiliza aquí, los términos "forma de dosificación" y "forma de dosificación unitaria" se refieren a una unidad físicamente discreta de una proteína terapéutica para que el paciente sea tratado. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado. Se comprenderá, sin embargo, que la dosis total de la composición se decidirá por el médico tratante dentro del alcance del juicio médico razonable.

Terapia de reemplazo de enzima (ERT). Como se utiliza aquí, el término "terapia de reemplazo de enzima (ERT)" se refiere a cualquier estrategia terapéutica que corrija una deficiencia enzimática proporcionando la enzima faltante. En algunas modalidades, la enzima faltante se proporciona mediante administración intratecal. En algunas modalidades, la enzima faltante se proporciona mediante infusión en el torrente sanguíneo. Una vez administrada, la enzima es tomada por las células y transportada al lisosoma, donde la enzima actúa para eliminar el material que se ha acumulado en los lisosomas debido a la deficiencia enzimática. Típicamente, para que la terapia de reemplazo de enzima lisosómica sea efectiva, la enzima terapéutica se suministra a los lisosomas en las células apropiadas en los tejidos objetivo donde se manifiesta el defecto de almacenamiento.

Mejorar, incrementar, o reducir. Como se utiliza aquí, los términos "mejorar", "incrementar" o "reducir", o los equivalentes gramaticales, indican los valores que son relativos a una medición de línea de base, tal como una medición en el mismo individuo antes de la iniciación del tratamiento aquí descrito, o una medida en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento aquí descrito. Un "individuo de control" es un individuo afligido con la misma forma de padecimiento por almacenamiento lisosómico que el individuo que se trata, quien es de aproximadamente la misma edad que el individuo que se trata (para asegurar que las fases del padecimiento en el individuo tratado y el individuo(s) de control sean comparables).

Individuo, sujeto, paciente: Como se utiliza aquí, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se refieren a un humano o un sujeto mamífero no humano. El individuo (también referido como "paciente" o "sujeto") que se trata es un individuo (feto, bebé, niño, adolescente, o adulto) que sufre de un padecimiento.

Administración intratecal: Como se utiliza aquí, el término "administración intratecal" o "inyección intratecal" se refiere a una inyección en el canal espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Se pueden utilizar diversas técnicas incluyendo, sin limitación, la inyección cerebroventricular lateral a través de un trepanado o punción cisternal o lumbar o similar. En algunas modalidades, la "administración intratecal" o el "suministro intratecal" de acuerdo con la presente invención se refiere al suministro o administración IT por medio de la región o área lumbar, es decir, el suministro o administración IT lumbar. Como se utiliza aquí, el término "región lumbar" o "área lumbar" se refiere al área entre las tercera y cuarta vértebras lumbares (parte trasera inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral.

Enlazador. Como se utiliza aquí, el término "enlazador" se refiere a, en una proteina de fusión, una secuencia de aminoácidos aparte de aquella que aparece en una posición particular en la proteina natural y que generalmente se diseña para ser flexible o para interponer una estructura, tal como una a-hélice, entre dos radicales de proteína. Un enlazador también se refiere como un espaciador.

Lioprotector. Como se utiliza aquí, el término "lioprotector" se refiere a una molécula que previene o reduce la inestabilidad química y/o física de una proteína u otra sustancia tras la liofilización y el subsiguiente almacenamiento. Los lioprotectores ejemplares incluyen azúcares tales como sacarosa o trehalosa; un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio: un poliol tal como alcoholes de azúcar superior o trihidricos, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xílitol, sorbitol, y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; Pluronics; y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, un lioprotector es un azúcar no reductor, tal como trehalosa o sacarosa.

Enzima lisosómica: Como se utiliza aquí, el término "enzima lisosómica" se refiere a cualquier enzima que sea capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas mamíferos o que pueda rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico. Las enzimas lisosómicas adecuadas para la invención incluyen tanto las enzimas lisosómicas modificadas como las enzimas lisosómicas de tipo salvaje y se pueden producir utilizando métodos recombinantes y sintéticos o se pueden purificar a partir de fuentes naturales. Las enzimas lisosómicas ejemplares se listan en la Tabla 1.

Deficiencia de enzima lisosómica: Como se utiliza aqui, "deficiencia de enzima lisosómica" se refiere a un grupo de desórdenes genéticos que resultan de la deficiencia en al menos una de las enzimas que se requieren para desdoblar las macromoléculas (por ejemplo, sustratos de enzima) a péptidos, aminoácidos, monosacáridos, ácidos nucleicos y ácidos grasos en los lisosomas. Como consecuencia, los individuos que sufren de las deficiencias de enzima lisosómica tienen materiales acumulados en diversos tejidos (por ejemplo, CNS, hígado, bazo, intestino, paredes de los vasos sanguíneos y otros órganos).

Padecimiento por almacenamiento lisosómico: Como se utiliza aquí, el término "padecimiento por almacenamiento lisosómico" se refiere a cualquier padecimiento que resulta de la deficiencia de una o más enzimas lisosómicas necesarias para metabolizar las macromoléculas naturales. Estos padecimientos típicamente dan como resultado la acumulación de moléculas no degradadas en los lisosomas, dando como resultado números incrementados de gránulos de almacenamiento (también llamados vejigas de almacenamiento). Estos padecimientos y diversos ejemplos se describen en más detalle debajo.

Polipéptido: Como se utiliza aquí, un "polipéptido", generalmente hablando, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace de péptido. En algunas modalidades, un polipéptido puede incluir al menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales se une a los otros por medio de al menos un enlace de péptido. Aquellos de habilidad ordinaria en el arte apreciarán que, opcionalmente, los polipéptidos algunas veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que no obstante son capaces de integrarse a una cadena de polipéptidos.

Enzima de reemplazo: Como se utiliza aquí, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos en parte la enzima deficiente o faltante en un padecimiento a ser tratado. En algunas modalidades, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos en parte la enzima lisosómica deficiente o faltante en un padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo es capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas mamíferos o puede rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico. Las enzimas de reemplazo adecuadas para la invención incluyen tanto las enzimas lisosómicas modificadas como las enzimas lisosómicas de tipo salvaje y se pueden producir utilizando métodos recombinantes y sintéticos o se pueden purificar a partir de fuentes naturales. Una enzima de reemplazo puede ser una enzima recombinante, sintética, activada por genes o natural.

Soluble: Como se utiliza aquí, el término "soluble" se refiere a la habilidad de un agente terapéutico para formar una solución homogénea. En algunas modalidades, la solubilidad del agente terapéutico en la solución dentro de la cual se administra y mediante la cual se transporta al sitio de acción objetivo (por ejemplo, las células y los tejidos del cerebro) es suficiente para permitir el suministro de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente terapéutico al sitio de acción que se tiene como objetivo. Varios factores pueden impactar la solubilidad de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, los factores relevantes que pueden impactar la solubilidad de la proteina incluyen la fuerza iónica, la secuencia de aminoácidos y la presencia de otros agentes co-solubilizantes o sales (por ejemplo, sales de calcio). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan tal que las sales de calcio se excluyen de tales composiciones. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos de conformidad con la presente invención son solubles en su composición farmacéutica correspondiente. Se apreciará que, mientras que las soluciones isotónicas son generalmente preferidas para los fármacos parenteralmente administrados, el uso de soluciones isotónicas puede limitar la solubilidad adecuada para algunos agentes terapéuticos y, en particular algunas proteínas y/o enzimas. Las soluciones ligeramente hipertónicas (por ejemplo, cloruro de sodio hasta 175m en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) y las soluciones que contienen azúcar (por ejemplo, sacarosa hasta 2% en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) han demostrado ser adecuadamente toleradas en los monos. Por ejemplo, la composición de la formulación de bolo CNS más comúnmente aprobada es la solución salina (NaCI 150mM en agua).

Estabilidad: Como se utiliza aquí, el término "estable" se refiere a la habilidad del agente terapéutico (por ejemplo, una enzima recombinante) para mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayor parte de su actividad biológica pretendida y/o su integridad fisioquimica) sobre periodos de tiempo extendidos. La estabilidad de un agente terapéutico, y la capacidad de la composición farmacéutica para mantener la estabilidad de tal agente terapéutico, se pueden evaluar durante periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, durante al menos 1 , 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En general, las composiciones farmacéuticas aquí descritas se han formulado tal que sean capaces de estabilizar, o alternativamente desacelerar o prevenir la degradación, de uno o más agentes terapéuticos formulados con las mismas (por ejemplo, las proteínas recombinantes). En el contexto de una formulación, una formulación estable es una en la cual el agente terapéutico ahí esencialmente retiene su integridad física y/o química y su actividad biológica tras el almacenamiento y durante los procesos (tales como el congelamiento/deshielo, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de la proteína, se puede medir por la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), la pérdida de actividad enzimática, la generación de fragmentos de péptido y el cambio de los perfiles de carga.

Sujeto: Como se utiliza aquí, el término "sujeto" significa cualquier mamífero, incluyendo humanos. En ciertas modalidades de la presente invención el sujeto es un adulto, un adolescente o un bebé. También se contempla por la presente invención la administración de las composiciones farmacéuticas y/o el desempeño de los métodos de tratamiento in-útero.

Homología sustancial: La frase "homología sustancial" se utiliza aquí para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, dos secuencias generalmente se consideran como "sustancialmente homologas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos que heredan características funcionales y/o estructurales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien conocido por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, ciertos aminoácidos típicamente se clasifican como aminoácidos "hidrofóbicos" o "hidrofílicos", y/o como que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo se puede considerar una sustitución "homologa".

Como es bien conocido en este arte, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST de hendidura, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Bioi, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al.., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs", Nucleic Acids Res, 25:3389-3402,1997; Baxevanis, et aL, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias homologas, los programas anteriormente mencionados típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas modalidades, se considera que dos secuencias son sustancialmente homologas si al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos sobre un tramo pertinente de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo pertinente es al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70,75, 80, 85, 90, 95, 100,125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Identidad sustancial: La frase "identidad sustancial" se utiliza aquí para referirse a una comparación entre las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como es bien conocido en este arte, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST de hendidura, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, er a/. , Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al. , Bioinformatics: A Practica! Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas anteriormente mencionados típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas modalidades, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos sobre un tramo pertinente de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo pertinente es al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 0 más residuos.

CSF sintético. Como se utiliza aqui, el término "CSF sintético" se refiere a una solución que tiene pH, composición de electrólitos, contenido de glucosa y osmolaridad consistente con el fluido cerebroespinal. El CSF sintético también se refiere como CSF artificial. En algunas modalidades, el CSF sintético es una solución B de Elliott.

Adecuado para suministro al CNS: Como se utiliza aqui, la frase "adecuado para suministro al CNS" o "adecuado para suministro intratecal" que se refiere a las composiciones farmacéuticas de la presente invención generalmente se refiere a la estabilidad, tolerabilidad, y propiedades de solubilidad de tales composiciones, así como la habilidad de tales composiciones para suministrar una cantidad efectiva del agente terapéutico contenido ahi al sitio de suministro que se tiene como objetivo (por ejemplo, el CSF o el cerebro).

Tejidos objetivo: Como se utiliza aquí, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que sea afectado por el padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado o cualquier tejido en que la enzima lisosómica deficiente sea normalmente expresada. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales hay una cantidad detectable o anormalmente alta de sustrato de la enzima, por ejemplo almacenada en los lisosomas celulares del tejido, en pacientes que sufren de o susceptibles al padecimiento por almacenamiento lisosómico. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que despliegan una característica, síntoma o patología asociada al padecimiento. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales la enzima lisosómica deficiente es normalmente expresada en un nivel elevado. Como se utiliza aquí, un tejido objetivo puede ser un tejido objetivo del cerebro, un tejido objetivo de la médula espinal y/o un tejido objetivo periférico. Los tejidos objetivo ejemplares se describen en detalle debajo.

Radical terapéutico: Como se utiliza aquí, el término "radical terapéutico" se refiere a una porción de una molécula que suministra el efecto terapéutico de la molécula. En algunas modalidades, un radical terapéutico es un polipéptido que tiene actividad terapéutica.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) que confiere un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado, en una proporción de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por cualquier prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto). Particularmente, la "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica o composición efectiva para tratar, mejorar, o prevenir una condición o padecimiento deseado, o para exhibir un efecto preventivo o terapéutico detectable, tal como mejorar los síntomas asociados con el padecimiento, prevenir o retardar el inicio o progreso del padecimiento, y/o también disminuir la severidad o frecuencia de los síntomas del padecimiento. Una cantidad terapéuticamente efectiva comúnmente se administra en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente efectiva (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad terapéuticamente efectiva específica (y/o la dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el desorden que se trata y la severidad del desorden; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, y/o la tasa de excreción o metabolismo de la proteína de fusión específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las artes médicas.

Tolerable: Como se utiliza aquí, los términos "tolerable" y "tolerabilidad" se refieren a la habilidad de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para no producir como respuesta una reacción adversa en el sujeto a quién se administra tal composición, o alternativamente para no producir como respuesta una reacción adversa seria en el sujeto a quién se administra tal composición. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son bien toleradas por el sujeto a quién se administran tales composiciones.

Tratamiento: Como se utiliza aquí, el término "tratamiento" (también "tratar") se refiere a cualquier administración de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima lisosómica) que parcialmente o completamente alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa el inicio de, reduce la severidad de y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de un padecimiento, desorden, y/o condición particular (por ejemplo, el síndrome de Hunter, el síndrome de Sanfilippo tipo A, Síndrome de Sanfilippo tipo B). Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no exhibe signos del padecimiento, desorden y/o condición pertinente y/o de un sujeto que exhibe sólo signos anticipados del padecimiento, desorden, y/o condición. Alternativamente o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos del padecimiento, desorden y/o condición pertinente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos mejorados para el suministro directo efectivo de un agente terapéutico al sistema nervioso central (CNS). Como se discute anteriormente, la presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que una enzima de reemplazo (por ejemplo, una proteína HNS) para un padecimiento por almacenamiento lisosómico (por ejemplo Síndrome de Sanfilippo A) se puede introducir directamente en el fluido cerebroespinal (CSF) de un sujeto en necesidad de tratamiento en una alta concentración sin inducir efectos adversos sustanciales en el sujeto. Más sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que la enzima de reemplazo se puede suministrar en una solución salina simple o formulación basada en amortiguador, sin utilizar CSF sintético. Aun más inesperadamente, el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención no da como resultado efectos adversos sustanciales, tales como respuesta inmune severa, en el sujeto. Por consiguiente, en algunas modalidades, el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en ausencia de la terapia inmunosupresores concurrente (por ejemplo, sin inducción de tolerancia inmune por el pre-tratamiento o el pre-condicionamiento).

En algunas modalidades, el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención permite la difusión eficiente a través de diversos tejidos del cerebro dando como resultado un suministro efectivo de la enzima de reemplazo en diversos tejidos del cerebro objetivo en regiones del cerebro superficiales, poco profundas y/o profundas. En algunas modalidades, el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención dio como resultado una cantidad suficiente de enzimas de reemplazo entrando a la circulación periférica. Como consecuencia, en algunos casos, el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención dio como resultado el suministro de la enzima de reemplazo en tejidos periféricos, tales como el hígado, el corazón, el bazo y el riñon. Este descubrimiento es inesperado y puede ser particularmente útil para el tratamiento de padecimientos por almacenamiento lisosómico que tienen componentes tanto CNS como periféricos, que típicamente requeriría tanto la administración intravenosa como la administración intratecal regular. Se contempla que el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención puede permitir la dosificación y/o frecuencia reducida de inyección iv sin comprometer los efectos terapéuticos en los síntomas periféricos que se tratan.

La presente invención proporciona diversas características inesperadas y benéficas que permiten el suministro eficiente y conveniente de las enzimas de reemplazo a diversos tejidos objetivo del cerebro, dando como resultado el tratamiento efectivo de padecimientos por almacenamiento lisosómico que tienen indicaciones CNS.

Diversos aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicar a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se diga lo contrario.

Enzimas de Reemplazo Proteína Heparan-N-Sulfatasa (HNS) En algunas modalidades, los métodos inventivos y composiciones proporcionadas por la presente invención son usados para suministrar una proteina Heparan-N-Sulfatasa (HNS) al CNS para el tratamiento de Sanfilippo A. Una proteína HNS adecuada puede ser cualquier molécula o una porción de una molécula que puede sustituirse por una actividad de proteína Heparan-N-Sulfatasa (HNS) que se origina naturalmente o rescatar uno o más fenotipos o síntomas asociados con deficiencia de HNS. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la invención es un polipéptido que tiene un N-término y un C-término y una secuencia de aminoácido sustancialmente similar o idéntica a la proteina HNS humana madura.

Típicamente, se produce HNS humana como una molécula precursora que es procesada a una forma madura. Este proceso ocurre en general removiendo el péptido señal de 20 aminoácidos. Típicamente, la forma precursora también es referida como una proteina precursora de longitud completa o HNS de longitud completa, la cual contiene 502 aminoácidos. Los 20 aminoácidos N-terminales son desdoblados, resultando en una forma madura que es de 482 aminoácidos de longitud. De este modo, se contempla que los 20 aminoácidos N-terminales son en general no requeridos para la actividad de proteína HNS. Las secuencias de aminoácido de la forma madura (SEQ ID NO:1 ) y precursora de longitud completa (SEQ ID NO:2) de una proteína HNS humana que se origina naturalmente o de tipo nativo típica, se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Heparan-N-Sulfatasa Humana Forma madura RPRNALLLLA DDGGFESGAY NNSAIATPHL DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG LPQHQNGMYG LHQDVHHFNS FD VRSLPLL LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTE ENGSVLQVGR NITRIKLLVR FLQTQDDRP FFLYVAFHDP HRCGHSQPQY GTFCE FGNG ESGMGRI PDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP AARADLAAQY TTVGRMDQGV GLVLQELRDA GVLNDTLVIF TSDNGIPFPS GRTNLYWPGT AEPLLVSSPE HPKRWGQVSE AYVSLLDLTP TILDWFSIPY PSYAI FGSKT I HLTGRSLLP ALEAEPL AT VFGSQSHHEV TMSYPMRSVQ HRHFRLVHNL NF MPFPIDQ DFYVSPTFQD LLNRTTAGQP TGWYKDLRHY YYRARWELYD RSRDPHETQN LATDPRFAQL LEMLRDQLAK WQWETHDPWV CAPDGVLEEK LSPQCQPLHN EL (SEQ ID NO: 1) Precursor de MSCPVPACCA LLLVLGLCRA RPRNALLLLA DDGGFESGAY Longitud-Completa NNSAIATPHL DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG LPQHQNGMYG LHQDVHHFNS FDKVRSLPLL LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTE ENGSVLQVGR NITRIKLLVR KFLQTQDDRP FFLYVAFHDP HRCGHSQPQY GTFCEKFGNG ESGMGRI PDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP AARADLAAQY TTVGRMDQGV GLVLQELRDA GVLNDTLVIF TSDNGIPFPS GRTNLYWPGT AEPLLVSSPE HPKRWGQVSE AYVSLLDLTP TILDWFSIPY PSYAI FGSKT IHLTGRSLLP ALEAEPLWAT VFGSQSHHEV TMSYPMRSVQ HRHFRLVHNL NFKMPFPIDQ DFYVSPTFQD LLNRTTAGQP TGWYKDLRHY YYRARWELYD RSRDPHETQN LATDPRFAQL LEMLRDQLAK WQWETHDPWV CAPDGVLEEK LSPQCQPLHN EL (SEQ ID NO:2) De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es la proteina HNS humana madura (SEQ ID NO:1). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada puede ser un homólogo o un análogo de la proteína HNS humana madura. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteina HNS humana madura puede ser una proteína HNS humana madura modificada que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido comparada con una proteína HNS que se origina naturalmente o de tipo nativa (por ejemplo, SEQ ID N0:1), mientras retiene la actividad de la proteína HNS sustancial. De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a la proteina HNS humana madura (SEQ ID NO:1 ). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la proteina HNS humana madura (SEQ ID NO:1 ). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de proteina HNS humana madura.

Alternativamente, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es una proteina HNS de longitud completa. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada puede ser un homólogo o un análogo de la proteina HNS humana de longitud completa. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteina HNS humana de longitud completa puede ser una proteína HNS humana de . longitud completa modificada que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido comparada con una proteina HNS de longitud completa que se origina naturalmente o de tipo nativa (por ejemplo, SEQ ID NO:2), mientras retiene la actividad sustancial de la proteína HNS. De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a la proteína HNS humana de longitud completa (SEQ ID NO:2). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de proteína HNS humana de longitud completa. Como se usa en la presente, una proteina HNS de longitud completa típicamente contiene una secuencia de péptido señal.

Otras Enfermedades por almacenamiento Lisosómico y Enzimas de reemplazo Se contempla que los métodos inventivos y composiciones de acuerdo con la presente se pueden utilizar para tratar otras enfermedades por almacenamiento lisosómico, en particular aquellos padecimientos por almacenamiento lisosómico que tienen síntomas y/o etiología CNS, incluyendo, pero no limitado a, aspartilglucosaminuria, padecimiento por almacenamiento de éster de colesterol, padecimiento de Wolman, cistinosis, padecimiento de Danon, padecimiento de Fabry, lipogranulomatosis de Farber, padecimiento de Farber, fucosidosis, galactosialidosis tipos 1/11, padecimiento de Gaucher tipos l/ll/lll, leucodistrofia de células globoides, padecimiento de Krabbe, padecimiento por almacenamiento de glicógeno II, padecimiento de Pompe, gangliosidosis GM1 tipos l/ll/lll, gangliosidosis GM2 tipo I, padecimiento de Tay Sachs, gangliosidosis GM2 tipo II, padecimiento de Sandhoff, gangliosidosis GM2, a-manosidosis tipos l/ll, beta-manosídosis, leucodistrofia metacromática, mucolipidosis tipo I, sialidosis tipos l/ll, mucolipidosis tipos ll/lll, padecimiento de célula I, mucolipidosis tipo IIIC polidistrofia pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis tipo I, mucopolisacaridosis tipo II, mucopolisacaridosis tipo MIA, síndrome de Sanfilippo (por ejemplo, tipos A, B, C, D), mucopolisacaridosis tipo IIIB, mucopolisacaridosis tipo IIIC, mucopolisacaridosis tipo IIID, mucopolisacaridosis tipo IVA, síndrome de Morquio, mucopolisacaridosis tipo IVB, mucopolisacaridosis tipo VI, mucopolisacaridosis tipo VII, síndrome de Sly, mucopolisacaridosis tipo IX, deficiencia múltiple de sulfatasa, lipofuscinosis ceroide neuronal, padecimiento de Batten CLN1 , padecimiento de Batten CLN2, padecimiento de Niemann-Pick tipos A/B, padecimiento de Niemann-Pick tipo C1 , padecimiento de Niemann-Pick tipo C2, picnodisostosis, padecimiento de Schindler tipos l/ll, padecimiento de Gaucher y padecimiento por almacenamiento de ácido siálico.

Una revisión detallada de la etiología genética, las manifestaciones clínicas, y la biología molecular de los padecimientos por almacenamiento lisosómico se detalla en Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol. II, McGraw Hill, (1995). De esta manera, las enzimas deficientes en los padecimientos anteriormente mencionados son conocidas por aquellos de habilidad en el arte, algunas de éstas se ejemplifican en la Tabla siguiente: TABLA 2 Los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para suministrar varias otras enzimas de reemplazo. Como se utiliza aquí, las enzimas de reemplazo adecuadas para la presente invención pueden incluir cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos parcialmente la actividad de la enzima lisosómica deficiente o faltante en un padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo es capaz de reducir la sustancia acumulada en los lisosomas o puede rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico.

En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada puede ser cualquier enzima lisosómica conocida por estar asociada con el padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada es una enzima seleccionada a partir de las enzimas listadas en la Tabla 2 anterior.

En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la invención puede tener una secuencia de tipo salvaje o existente de manera natural. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la invención puede tener una secuencia modificada que tiene identidad u homología sustancial a la secuencia existente de manera natural o de tipo salvaje (por ejemplo, que tiene al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia a la secuencia de tipo salvaje o existente de manera natural).

Una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención se puede producir por cualquier medio disponible. Por ejemplo, las enzimas de reemplazo se pueden producir de manera recombinante utilizando un sistema de célula hospedera diseñado para expresar un ácido nucleico que codifica la enzima de reemplazo. Alternativamente o adicionalmente, las enzimas de reemplazo se pueden producir activando genes endógenos. Alternativamente o adicionalmente, las enzimas de reemplazo pueden ser parcialmente o completamente preparadas mediante síntesis química. Alternativamente o adicionalmente, las enzimas de reemplazo también se pueden purificar a partir de fuentes naturales.

Donde las enzimas se producen de manera recombinante, se puede utilizar cualquier sistema de expresión. Por dar algunos ejemplos, los sistemas de expresión conocidos incluyen, por ejemplo, huevo, baculovirus, planta, levadura, o células mamíferas.

En algunas modalidades, las enzimas adecuadas para la presente invención se producen en células mamíferas. Ejemplos no limitantes de células mamíferas que se pueden utilizar de conformidad con la presente invención incluyen línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1 , ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, Países Bajos); linea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); línea de riñon embrionario humano (293 or 293 cells subcloned for growth in suspensión culture, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59, 1977); linea celular de fibrosarcoma humano (por ejemplo, HT 080); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células ováricas de hámster chino +/- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc, Nati. Acad. Sci. EEUU, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 , 1980); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñon canino ( DCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2).

En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención se utilizan para suministrar enzimas de reemplazo producidas a partir de células humanas. En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención se utilizan para suministrar enzimas de reemplazo producidas a partir de células CHO.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo suministradas utilizando un método de la invención contienen un radical que enlaza a un receptor en la superficie de las células del cerebro para facilitar la absorción celular y/o la focalización lisosómica. Por ejemplo, tal receptor puede ser el receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (Cl- PR) que enlaza los residuos manosa-6-fosfato (M6P). Además, el CI-MPR también enlaza otras proteínas incluyendo IGF-II. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención contiene residuos M6P en la superficie de la proteína. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención puede contener oligosacáridos bis-fosforilados que tienen mayor afinidad de enlace para el Cl-MPR. En algunas modalidades, una enzima adecuada contiene hasta aproximadamente un promedio de aproximadamente al menos 20% de oligosacáridos bis-fosforilados por la enzima. En otras modalidades, una enzima adecuada puede contener aproximadamente 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% de oligosacáridos bis-fosforilados por la enzima. Mientras que tales oligosacáridos bis-fosforilados pueden estar presentes de manera natural en la enzima, se debe notar que las enzimas se pueden modificar para poseer tales oligosacáridos. Por ejemplo, las enzimas de reemplazo adecuadas se pueden modificar por ciertas enzimas que son capaces de catalizar la transferencia de N-acetilglucosamina-L-fosfato a partir de UDP-GIcNAc a la posición 6' de mañosas a-1 ,2-enlazadas en enzimas lisosómicas. Los métodos y composiciones para producir y utilizar tales enzimas se describen por, por ejemplo, Canfield et al. en la Patente Norteamericana No. 6,537,785, y en la Patente Norteamericana No. 6,534,300, cada una incorporada aquí por referencia.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo para el uso en lá presente invención se pueden conjugar o fusionar a un radical dirigido lisosómico que es capaz de enlazar a un receptor en la superficie de las células del cerebro. Un radical dirigido lisosómico adecuado puede ser IGF-I, IGF-II, RAP, p97, y variantes, homólogos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, incluyendo aquellos péptidos que tienen una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idéntica a una secuencia de péptidos IGF-I, IGF-II, RAP, p97 humanos maduros de tipo salvaje).

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo adecuadas para la presente invención no han sido modificadas para mejorar el suministro o el transporte de tales agentes a través del BBB y hacia el CNS.

En algunas modalidades, una proteína terapéutica incluye una porción de objetivo (por ejemplo, una secuencia de objetivo de lisosoma) y/o un péptido de penetración de membrana. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo y/o un péptido dé penetración de membrana es una parte intrínseca de la porción terapéutica (por ejemplo, vía un enlace químico, vía una proteína de fusión). En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción de manosa-6-fosfato. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción IGF-I. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción IGF-II.

Formulaciones En algunas modalidades, las enzimas deseadas se suministran en formulaciones estables para suministro intratecal. Ciertas modalidades de la invención se basan en, al menos en parte, en que el descubrimiento de varias formulaciones descritas en la presente facilitan el suministro y distribución efectivos de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, una enzima HNS) para tejidos objetivo, células y/o organelos del CNS. Entre otras cosas, las formulaciones descritas en la presente con capaces de solubilizar altas concentraciones de agentes terapéuticos (por ejemplo, una enzima HNS) y son adecuadas para el suministro de estos agentes terapéuticos al CNS de los sujetos para el tratamiento de enfermedades que tienen un componente y/o etiología de CNS (por ejemplo, Síndrome de Sanfilippo A). Las composiciones descritas en la presente son además caracterizadas por mejorar la estabilidad y mejorar la tolerabilidad cuando se administra al CNS de un sujeto (por ejemplo, intratecal) en necesidad del mismo.

Antes de la presente invención, la solución Elliot B y salina istónica no amortiguada tradicional, la cual es CSF artificial, fueron típicamente usadas para suministro intratecal. Una comparación que bosqueja las composiciones del CSF con relación a la solución B de Elliott se incluye en la Tabla 3 debajo. Como se muestra en la Tabla 3, la concentración de la solución B de Elliott se asemeja mucho a aquella del CSF. La solución B de Elliott, sin embargo, contiene una concentración de amortiguador muy baja y consecuentemente no puede proporcionar la capacidad de amortiguamiento adecuada necesaria para estabilizar los agentes terapéuticos (por ejemplo, las proteínas), especialmente sobre periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, durante las condiciones de almacenamiento). Además, la solución B de Elliott contiene ciertas sales que pueden ser incompatibles con las formulaciones pretendidas para suministrar algunos agentes terapéuticos, y en particular enzimas o proteínas. Por ejemplo, las sales de calcio presentes en la solución B de Elliott son capaces de mediar la precipitación de proteínas y reducir por consiguiente la estabilidad de la formulación TABLA 3 Así, en algunas modalidades, formulaciones adecuadas para suministro a CNS de acuerdo a la presente invención no son CSF sintético o artificial.

En algunas modalidades, las formulaciones para suministro al CNS han sido formuladas de manera que son capaces de estabilizar, o alternativamente mostrar o prevenir la degradación de un agente terapéutico formulado con las mismas (por ejemplo, una enzima HNS). Como se usa en la presente, el término "estable" se refiere a la habilidad del agente terapéutico (por ejemplo, una enzima HNS) para mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayor parte de su actividad biológica pretendida y/o su integridad fisioquímica) sobre periodos de tiempo extendidos. La estabilidad de un agente terapéutico, y la capacidad de la composición farmacéutica para mantener la estabilidad de tal agente terapéutico, se pueden evaluar durante periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, preferiblemente durante al menos 1 , 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En el contexto de una formulación, una formulación estable es una en la cual el agente terapéutico ahí esencialmente retiene su integridad física y/o química y su actividad biológica tras el almacenamiento y durante los procesos (tales como el congelamiento/deshielo, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de la proteína, se puede medir por la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), la pérdida de actividad enzimática, la generación de fragmentos de péptido y el cambio de los perfiles de carga.

La estabilidad del agente terapéutico es de particular importancia. La estabilidad del agente terapéutico se puede evaluar adicionalmente con relación a la actividad biológica o integridad fisioquímica del agente terapéutico durante periodos de tiempo extendidos. Por ejemplo, la estabilidad en un punto de tiempo dado se puede comparar contra la estabilidad en un punto de tiempo anterior (por ejemplo, en el día 0 de formulación) o contra el agente terapéutico no formulado y los resultados de esta comparación se pueden expresar como un porcentaje. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención mantienen al menos 100%, al menos 99%, al menos 98%, al menos 97% al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55% o al menos 50% de la actividad biológica o integridad fisioquímica del agente terapéutico sobre un periodo de tiempo extendido (por ejemplo, según se mide sobre al menos aproximadamente 6-12 meses, a temperatura ambiente o bajo condiciones de almacenamiento aceleradas).

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, enzimas deseadas) son preferiblemente solubles en las formulaciones de la presente invención. El término "soluble" que se refiere a los agentes terapéuticos de la presente invención se refiere a la habilidad de tales agentes terapéuticos para formar una solución homogénea. Preferiblemente, la solubilidad del agente terapéutico en la solución dentro de la cual se administra y mediante la cuál se transporta al sitio de acción objetivo (por ejemplo, las células y los tejidos del cerebro) es suficiente para permitir el suministro de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente terapéutico al sitio de acción que se tiene como objetivo. Varios factores pueden impactar la solubilidad de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, los factores relevantes que pueden impactar la solubilidad de la proteína incluyen la fuerza iónica, la secuencia de aminoácidos y la presencia de otros agentes co-solubilizantes o sales (por ejemplo, sales de calcio). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan tal que las sales de calcio se excluyen de tales composiciones.

Formulaciones adecuadas, en ya sea forma acuosa, pre-liofilizada, liofilizada o reconstituida, pueden contener un agente terapéutico de interés a varias concentraciones. En algunas modalidades, las formulaciones pueden contener un agente terapéutico o proteína de interés a una concentración en el rango de aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 100 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 80 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 60 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 50 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 40 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 30 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 25 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 20 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 60 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 50 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 40 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 30 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 25 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 20 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 15 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 10 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml hasta 10 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml hasta 20 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml hasta 40 mg/ml, aproximadamente 5 rng/ml hasta 100 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml hasta 50 mg/ml, o aproximadamente 5 mg/ml hasta 25 mg/ml). En algunas modalidades, las formulaciones de conformidad con la invención pueden contener un agente terapéutico a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, ó 100 mg/ml Las formulaciones de la presente invención son caracterizadas por su tolerabilidad ya sea como soluciones acuosas o como soluciones liofilizadas reconstituidas. Como se usa en la presente, los términos "tolerable" y "tolerabilidad" se refieren a la capacidad de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para no provocar una reacción adversa en el sujeto a quién tales composiciones son administradas, o alternativamente no provoca una reacción adversa seria en el sujeto a quién tal composición se administra. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son bien toleradas por el sujeto a quién se administra tales composiciones.

Muchos agentes terapéuticos, y en particular las proteínas y enzimas de la presente invención, requieren pH controlado y excipientes específicos para mantener su solubilidad y su estabilidad en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. La Tabla 4 de abajo identifica ciertos aspectos típicos ejemplares de las formulaciones de proteina que se consideran importantes para mantener la solubilidad y la estabilidad de los agentes terapéuticos de proteína de la presente invención.

TABLA 4 Parámetro Rango Típico/Tipo Fundamento pH 5 a 7.5 Para estabilidad Algunas veces también para solubilidad Tipo de acetato, succinato, citrato, Para mantener pH óptimo Amortiguador histidina, fosfato o Tris También puede afectar la estabilidad Concentración 5-50 mM Para mantener pH del Amortiguador También puede estabilizar o agregar fuerza iónica Tonificador NaCI, azúcares, manitol Para suministrar soluciones ¡so- osmóticas o isotónicas Surfactante Polisorbato 20, polisorbato 80 Para estabilizar contra interfaces y corte Otro Aminoácidos (por ejemplo, arginina) Para estabilidad o solubilidad en decenas a cientos de mM mejorada Amortiguadores El pH de la formulación es un factor adicional el cual es capaz de alterar la solubilidad de un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima o proteina) en una formulación acuosa o para una formulación de pre-liofilización. De conformidad con las formulaciones de la presente invención preferiblemente comprenden uno o más amortiguadores. En algunas modalidades, las formulaciones acuosas comprenden una cantidad de amortiguador suficiente para mantener el pH óptimo de la composición entre aproximadamente 4.0-8.0 (por ejemplo, aproximadamente 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.2, 6.4, 6.5, 6.6, 6.8, 7.0, 7.5, ó 8.0). En algunas modalidades, el pH de la formulación es entre aproximadamente 5.0-7.5, entre aproximadamente 5.5-7.0, entre aproximadamente 6.0-7.0, entre aproximadamente 5.5-6.0, entre aproximadamente 5.5-6.5, entre aproximadamente 5.0-6.0, entre aproximadamente 5.0-6.5 y entre aproximadamente 6.0-7.5. Amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo acetato, citrato, histidina, fosfato, succinato, tris(hidroximetil)aminometano ("Tris ") y otros ácidos orgánicos. La concentración de amortiguador e intervalo de pH de las composiciones farmacéuticas de la presente invención son factores en el control o ajuste de la tolerabilidad de la formulación. En algunas modalidades, un agente amortiguador está presente a una concentración que varia entre aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 150 mM, o entre aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades, un agente amortiguador adecuado está presente a una concentración de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM ó 150 mM.

Tonicidad En algunas modalidades, en ya sea forma acuosa, pre-liofilizada, liofilizada o reconsitutida, contienen un agente de isotonicidad para mantener las formulaciones isotónicas. Típicamente, por "isotónica" se tiene por entendido que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica como la sangre humana. Las formulaciones isotónica generalmente tendrán una presión osmótica desde aproximadamente 240 mOsm/kg hasta aproximadamente 350 mOsm/kg. La isotonicidad se puede medir utilizando, por ejemplo, una presión de vapor u osmómetros de tipo punto de congelación. Los agentes de isotonicidad ejemplares incluyen, pero no se limitan a, glicina, sorbitol, manitol, cloruro de sodio y arginina. En algunas modalidades, los agentes isotónicos adecuados pueden estar presentes en las formulaciones acuosas y/o pre-liofilizadas a una concentración desde aproximadamente 0.01 - 5% (por ejemplo, 0.05, 0.1 , 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1 .5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 o 5.0%) en peso. En algunas modalidades, las formulaciones para liofilización contienen un agente de ¡sotonicidad para mantener las formulaciones de pre-liofilización o las formulaciones isotónicas reconstituidas.

Aunque en general las soluciones isotónicas son preferidas para fármacos parenteralmente administrados, el uso de soluciones isotónicas puede cambiar la solubilidad para algunos agentes terapéuticos y en particular algunas proteínas y/o enzimas. Las soluciones ligeramente hipertónicas (por ejemplo, hasta 175 mM de cloruro de sodio en 5 mM de fosfato de sodio a pH 7.0) y soluciones que contienen azúcar (por ejemplo, hasta 2% de sacarosa en 5 mM de fosfato de sodio a pH 7.0) han sido demostradas por ser bien toleradas. La composición de formulación de bolo del CNS aprobada más común es salina (aproximadamente 150mM NaCI en agua).

Agentes Estabilizantes En algunas modalidades, las formulaciones pueden contener un agente de estabilización, o lioprotector, para proteger la proteina. Típicamente, un agente de estabilización adecuado es un azúcar, un azúlcar no reductor y/o un aminoácido. Azúcares ejemplares incluyen, pero no se limitan a dextrano, lactosa, manitol, mañosa, soritol, rafinosa, sacarosa y trehalosa. Aminoácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, arginina, glicina y metionina. Agentes estabilizantes adicionales pueden incluir cloruro de sodio, hidroxietilalmidón y polívinilpirrolidona. La cantidad de agente estabilizante en la formulación liofilizada es en general tal que la formulación será isotónica. Sin embargo, las formulaciones reconstituidas hipertónicas pueden también ser adecuadas. Además, la cantidad de agente de estabilización no debe ser muy baja tal que ocurra una cantidad inaceptable de degradación/agregación del agente terapéutico. Las concentraciones ejemplares del agente de estabilización en la formulación pueden variar dentro del rango desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 400 mM (por ejemplo, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 300 mM, y desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 100 mM), o alternativamente, desde 0.1 % hasta 15% (por ejemplo, desde 1% hasta 10%, desde 5% hasta 15%, desde 5% hasta 10%) en peso. En algunas modalidades, la proporción de la cantidad de masa del agente de estabilización y el agente terapéutico es aproximadamente 1 :1. En otras modalidades, la proporción de la cantidad de masa del agente de estabilización y el agente terapéutico puede ser aproximadamente 0.1 : 1 , 0.2:1 , 0.25: 1 , 0.4: 1 , 0.5: 1 , 1 :1 , 2:1 , 2.6:1 , 3:1 , 4:1 , 5:1 , 10: 1 , ó 20: 1. En algunas modalidades, el agente de estabilización adecuado para la liofilización es también un lioprotector.

En algunas modalidades, las formulaciones líquidas adecuadas para la presente invención contienen materiales amorfos. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas adecuadas para la presente invención contienen una cantidad sustancial de materiales amorfos (por ejemplo, formulaciones a base de sacarosa). En algunas modalidades, las formulaciones liquidas adecuadas para la presente invención contienen materiales parcialmente cristalinos/parcialmente amorfos.

Agentes espesantes En algunas modalidades, las formulaciones adecuadas para liofilización pueden además incluir uno o más agentes espesantes. Un "agente espesante" es un compuesto que agrega masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada. Por ejemplo, un agente espesante puede mejorar la apariencia de la torta liofilizada (por ejemplo, una torta liofilizada esencialmente uniforme). Los agentes espesantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, lactosa, manitol, glicina, sacarosa, trehalosa, almidón de hidroxietilo. Las concentraciones ejemplares de los agentes espesantes son desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% (por ejemplo, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, y 10.0%).

Tensoactivos En algunas modalidades, es deseable agregar un surfactante a las formulaciones. Los surfactantes ejemplares incluyen surfactantes no iónicos tales como los Polisorbatos (por ejemplo, Polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); tritón; docecilsulfato de sodio (SDS); laurel sulfato de sodio; octil glucósido de sodio, lauril-, miristil-, linoleil-, o estearil-sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina, linoleil-, miristil-, o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio, o metil ofeil-taurato de disodio; y la serie MOIMAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilen glicol, polipropil glicol, y copolímeros de etilen y propilen glicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc). Típicamente, la cantidad de surfactante agregado es tal que reduce la agregación de la proteína y minimiza la formación de particulados o efervescencias. Por ejemplo, un surfactante puede estar presente en una formulación en una concentración desde aproximadamente 0.001 - 0.5% (por ejemplo, aproximadamente 0.005 -0.05%, o 0.005 - 0.01 %). Particularmente, un surfactante puede estar presente en una formulación en una concentración de aproximadamente 0.005%, 0.01 %, 0.02%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, o 0.5%, etcétera. Alternativamente, o además, el tensoactivo puede ser agregado a la formulación liofilizada, formulación pre-liofilizada y/o la formulación reconstituida.

Otros portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) pueden ser incluidos en la formulación (y/o la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida) siempre que no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a, agentes amortiguadores adicionales; preservativos; co-solventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones que forman sales tales como sodio.

Formulaciones, en ya sea forma acuosa, pre-liofilizada, liofilizada o reconstituida de confomridad con la presente invención, se pueden evaluar con base en el análisis de la calidad del producto, el tiempo de reconstitución (si está liofilizado), la calidad de la reconstitución (si está liofilizado), el alto peso molecular, la humedad, y la temperatura de transición al vidrio. Típicamente, la calidad de la proteína y el análisis del producto incluyen un análisis de la tasa de degradación del producto utilizando métodos que incluyen, pero no se limitan a, HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC), HPLC de intercambio de cationes (CEX-HPLC), difracción de rayos X (XRD), calorimetría de exploración diferencial modulada (mDSC), HPLC en fase inversa (RP-HPLC), dispersión de la luz multi-ángulo (MALS), fluorescencia, absorción ultravioleta, nefelometría, electroforesis capilar (CE), SDS-PAGE, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la evaluación del producto de conformidad con la presente invención puede incluir una etapa de evaluar la apariencia (ya sea apariencia de líquido o de torta).

Generalmente, las formulaciones (liofilizadas o acuosas) se pueden almacenar durante periodos de tiempo extendidos a temperatura ambiente. La temperatura de almacenamiento típicamente puede variar dentro del rango desde 0°C hasta 45°C (por ejemplo, 4°C, 20°C, 25°C, 45°C, etc.). Las formulaciones se pueden almacenar durante un periodo de meses hasta un periodo de años. El tiempo de almacenamiento generalmente será 24 meses, 12 meses, 6 meses, 4.5 meses, 3 meses, 2 meses o 1 mes. Las formulaciones se pueden almacenar directamente en el recipiente utilizado para la administración, eliminando etapas de transferencia.

Las formulaciones se pueden almacenar directamente en el recipiente de liofilización (si están liofilizadas), el cual también puede funcionar como el recipiente de reconstitución, eliminando etapas de transferencia. Alternativamente, las formulaciones del producto liofilizadas se pueden medir en incrementos más pequeños para el almacenamiento. El almacenamiento generalmente debería evitar circunstancias que conduzcan a la degradación de las proteínas, incluyendo pero no limitado a la exposición a la luz del sol, radiación UV, otras formas de radiación electromagnética, calor o frío excesivo, rápido choque térmico, y choque mecánico.

Liofilización Los métodos inventivos de conformidad con la presente invención pueden ser utilizados para liofilizar algunos materiales, en particular, agentes terapéuticos. Típicamente, una formulación de pre-liofilización además contiene una elección apropiada de excipientes u otros componentes tales como estabilizadores, agentes amortiguadores, agentes espesantes, y tensoactivos para prevenir al compuesto de interés de la degradación (por ejemplo, agregación de proteína, desamidación y/u oxidación) durante el secado por congelación y almacenamiento. La formulación para liofilización puede incluir uno o más ingredientes adicionales que incluyen lioprotectores o agentes estabilizantes, amortiguadores, agentes espesantes, agentes de isotonicidad y tensoactivos.

Después que la sustancia de interés y algunos componentes adicionales son mezclados en conjunto, la formulación es liofilizada. La liofilización en general incluye tres etapas principales: congelación, secado primario y secado secundario. La congelación es necesario para convertir agua en hielo o algunos componentes de formulación amorfos a la forma cristalina. El secado primario es la etapa del proceso cuando el hielo se remueve del producto congelado por sublimación directa a baja presión y temperatura. El secado secundario es la etapa del proceso cuando el agua unida es removida de la matriz del producto utilizando la difusión de agua residual a la superficie de evaporación. La temperatura del producto durante el secado secundario es normalmente superior que durante el secado primario. Véase Tang X. et al. (2004) "Design of congelación-drying processes for pharmaceuticals: Practical advice," Pharm. Res., 21 : 191 -200; Nail S.L. et al. (2002) "Fundamentáis of congelación-drying," in Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Nail S.L. editor New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, pp 281-353; Wang et al. (2000) "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals," Int. J. Pharm., 203: 1-60; Williams N.A. et al. (1984) "The lyophilization of pharmaceuticals; A literature review." J. Parenteral Sci. Technol., 38:48-59. En general, cualquier proceso de liofilización puede ser usado en conjunto con la presente invención.

En algunas modalidades, una etapa de hibridización puede ser introducida durante la congelación inicial del producto. La etapa de hibridización puede reducir el ciclo de tiempo total. Sin desear ser ligado por cualquier teoría, se contempla que la etapa de la etapa de hibridización puede ayudar a promover la cristalización del excipiente yformación de cristales de hielo más grandes debido a la re-cristalización de cristales pequeños formados durante el superenfriamiento, el cual, a su vez, mejora la reconstitución. Típicamente, una etapa de hibridación incluye un intervalo u oscilación en la temperatura durante la congelación. Por ejemplo, la temperatura de congelación puede ser -40 °C, y la etapa de hibridización incrementará la temperatura a, por ejemplo, -10 °C y mantendrá esta temperatura por un segundo periodo de tiempo. El tiempo de la etapa de hibridización puede variar desde 0.5 horas hasta 8 horas (por ejemplo, 0.5, 1.0 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 6, y 8 horas). La temperatura de hibridización puede estar entre la temperatura de congelación y 0 °C.

La liofilización puede ser realizada en un contenedor, tal como un tubo, una bolsa, una botella, una charola, un vial (por ejemplo, un vial de vidrio), jeringa o cualesquiera otros contenedores adecuados. Los contenedores pueden ser desechables. La liofilización también puede ser realizada a una gran escala o escala menor. En algunos casos, puede ser deseable liofilizar la formulación de proteína en el contenedor en el cual la reconstitución de la proteína se lleva a cabo para evitar una etapa de transferencia. El contenedor en este caso puede, por ejemplo, ser un vial de 3, 4, 5, 10, 20, 50 ó 100 ce.

Muchos secadores por congelación diferentes están disponibles para este propósito tales como un secador a escala piloto Hull (SP Industries, USA), secadores por congelación de laboratorio Génesis (SP Industries), o algunos secadores por congelación capaces de controlar los parámetros de procesos de liofilización dados. El secado por congelación se realiza congelando la formulación y subsecuentemente sublimando el hielo del contenido congelado a una temperatura adecuada para secado primario. La congelación inicial lleva la formulación a una temperatura por debajo de aproximadamente -20 °C (por ejemplo, -50 °C, -45 °C, -40 °C, -35 °C, -30 °C, -25 °C, etc.) en típicamente no más de aproximadamente 4 horas (por ejemplo, no más de aproximadamente 3 horas, no más de aproximadamente 2.5 horas, no más de aproximadamente 2 horas). Bajo esta condición, la temperatura del producto está típicamente por debajo del punto eutéctico o la temperatura de colapso de la formulación. Típicamente, la temperatura de anaquel para el secado primario variará desde aproximadamente -30 hasta 25 °C (siempre que el producto permanezca por debajo del punto de fusión durante el secado primario) a una presión adecuada, que varía típicamente desde aproximadamente 20 hasta 250 mTorr. La formulación, tamaño y tipo del sujetador de contenedor de la muestra (por ejemplo, vial de vidrio) y el volumen del líquido principalmente dictará el tiempo requerido para secado, el cual puede variar desde algunas horas hasta varios días. Se lleva a cabo una etapa de secado secundario a aproximadamente 0-60°C, dependiendo principalmente del tipo y tamaño del contenedor y el tipo de proteina terapéutica empleada. Nuevamente, el volumen del líquido principalmente dictará el tiempo requerido para secado, el cual puede variar desde algunas horas hasta varios días.

Como una proposición general, la liofilización resultará en una formulación liofilizada en la cual el contenido de humedad en la misma es menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 1 %, y menos de aproximadamente 0.5%.

Reconstitución Mientras las composiciones farmacéuticas de la presente invención están en general en una forma acuosa después de la administración a un sujeto, en algunas modalidades las composiciones farmacéuticas de la presente invención son liofilizadas. Tales composiciones deben ser reconstituidas agregando uno o más diluyentes a estas previo a la administración a un sujeto. En la etapa deseada, típicamente en un tiempo apropiado previo a la administración al paciente, la formulación liofilizada puede ser reconstituida con un diluyente de manera que la concentración de proteína en la formulación reconstituida es deseable.

Varios diluyentes pueden ser usados de conformidad con la presente invención. En algunas modalidades, un diluyente adecuado para reconstitución es agua. El agua usada como el diluyente puede ser tratada en una variedad de formas que incluyen osmosis reversa, destilación, desionización, filtraciones (por ejemplo, carbono activado, microfiltración, nanofiltración) y combinaciones de estos métodos de tratamiento. En general, el agua debe ser adecuada para inyección que incluye, pero no se limita a, agua estéril o agua bacteriostática para inyección.

Diluyentes ejemplares adicionales incluyen una solución amortiguada de pH (por ejemplo, salina amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Elliot, solución de Ringer, o solución de dextrosa. Los diluyentes adecuados pueden contener opcionalmente un preservativo. Los preservativos ejemplares incluyen alcohole aromáticos tales como alcohol bencílico o fenílico. La cantidad de preservativo empleado se determina valorando diferentes concentraciones de preservativos para compatibilidad con la proteina y pruebas de eficacia del preservativo. Por ejemplo, si el preservativo es un alcohol aromático (tal como alcohol bencílico), puede estar presente en una cantidad desde aproximadamente 0.1 -2.0%, desde aproximadamente 0.5-1.5%, o aproximadamente 1.0-1.2%.

Diluyentes adecuados para la invención pueden incluir una variedad de aditivos, que incluyen, pero no se limitan a, agentes amortiguadores de pH (por ejemplo, Tris, histidina), sales (por ejemplo, cloruro de sodio) y otros aditivos (por ejemplo, sacarosa) que incluyen aquellos descritos anteriormente (por ejemplo, agentes estabilizantes, agentes de isotonicidad).

De conformidad con la presente invención, una sustancia liofilizada (por ejemplo, proteína) puede ser reconstituida a una concentración de al menos 25 mg/ml (por ejemplo, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/) y en cualquiera de los intervalos entre estos. En algunas modalidades, una sustancia liofilizada (por ejemplo, proteína) puede ser reconstituida a una concentración que varía desde aproximadamente 1 mg/ml hasta 100 mg/ml (por ejemplo, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta 50 mg/ml, desde 1 mg/ml hasta 100 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 30 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml, desde aproximadamente 25 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, desde aproximadamente 25 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 25 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml, desde aproximadamente 50 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 50 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml). En algunas modalidades, la concentración de proteína en la formulación reconstituida puede ser superior que la concentración en la formulación de pre-liofilización. Las concentraciones altas de proteína en la formulación reconstituida son consideradas por ser particularmente útiles donde se pretende el suministro subcutáneo o intramuscular de la formulación reconstituida. En - algunas modalidades, la concentración de proteína en la formulación reconstituida puede ser aproximadamente 2-50 veces (por ejemplo, aproximadamente 2-20, aproximadamente 2-10 veces, o aproximadamente 2-5 veces) de la formulación pre-liofilizada. En algunas modalidades, la concentración de proteína en la formulación reconstituida puede ser al menos aproximadamente 2 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 3, 4, 5, 10, 20, 40 veces) de la formulación pre-liofilizada.

La reconstitución de conformidad con la presente invención puede ser realizada en cualquier contenedor. Contenedores ejemplares adecuados para la invención incluyen, pero no se limitan a, tales como tubos, viales, jeringas (por ejemplo, cámara única o cámara dual), bolsas, botellas, y charolas. Contenedores adecuados pueden ser elaorados de cualquiera de los materiales tales como vidrio, plásticos, metal. Los contenedores pueden ser deschables o reutilizables. La reconstitución también puede ser realizada a una gran escala o escala pequeña.

En algunos casos, puede ser deseable liofilizar la formulación de proteina en el contenedor en el cual la reconstitución de la proteína se lleva a cabo para evitar una etapa de transferencia. El contenedor en este caso puede ser, por ejemplo, un vial de 3, 4, 5, 10, 20, 50 ó 100 ce. En algunas modalidades, un contenedor adecuado para liofilización y reconstitución es una jeringa de cámara dual (por ejemplo, jeringas Lyo-Ject,® (Vetter)). Por ejemplo, una jeringa de cámara dual puede contener tanto la sustancia liofilizada como el diluyente, cada uno en una cámara separada, separado por un tapón (véase Ejemplo 5). Para reconstitución, se puede unir un émbolo al tapón en el lado diluyente y presionar para mover el diluyente en la cámara de producto de manera que el diluyente puede contactar la sustancia liofilizada y la reconstitución puede tomar lugar como se describe en la presente (véase Ejemplo 5).

Las composiciones farmacéuticas, formulaciones y métodos relacionados de la invención son útiles para suministrar una variedad de agentes terapéuticos al CNS de un sujeto (por ejemplo, intratecalmente, intraventricularmente o intracisternalmente) y para el tratamiento de enfermedades asociadas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para suministrar proteínas y enzimas (por ejemplo, terapia de reemplazo de enzima) a sujetos que sufren de trastornos de almacenamiento lisosomal. Las enferemdades de almacenamiento lisosomal representan un grupo de trastornos metabólicos hereditarios relativamente raros que resultan de defectos en la función lisosomal. Las enfermedades lisosomales son caracterizadas por la acumulación de macromoléculas no digeridas dentro de las lisosomas, lo cual resulta en un incremento en el tamaño y número de tales lisosomas y finalmente en la disfunción celular y anormalidades clínicas.

Suministro al CNS Se contempla que varias formulaciones estables descritas en la presente son en general adecuadas para suministro al CNS de agentes terapéuticos. Formulaciones estables de conformidad con la presente invención pueden ser usadas para suministro al CNS vía varias técnicas y rutas que incluyen, pero no se limitan a, administraciones intraparenquimal, intracerebral, intravetricular cerebral (ICV), intratecal (por ejemplo, IT-Lumbar, IT-cisterna magna) y cualesquiera otras técnicas y rutas para inyección directamente o indirectamente al CNS y/o CSF.

Suministro Intratecal En algunas modalidades, una enzima de reemplazo se suministra al CNS en una formulación descritas en la presente. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo se suministra al CNS administrando en el fluido cerebroespinal (CSF) de un sujeto en necesidad de tratamiento. En algunas modalidades, se usa administración intratecal para suministrar una enzima de reemplazo deseada (por ejemplo, una proteína HNS) en el CSF. Como se usa en la presente, la administración intratecal (también referida como inyección intratecal) se refiere a una inyección en el canal espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Pueden ser usadas varias técnicas que incluyen, sin limitación, inyección cerebroventricular lateral a través de un trepanado o punción cisternal o lumbar o similar. Los métodos ejemplares se describen en Lazorthes et al., Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 y Omaya et al., Cáncer Drug Delivery, 1 : 169-179, el contenido de las cuales se incorpora aquí por referencia.

De conformidad con la presente invención, una enzima puede ser inyectada en cualquier región que rodea el canal espinal. En algunas modalidades, una enzima se inyecta en el área lumbar o la cisterna magna o de manera intraventricular en un espacio del ventrículo cerebral. Como se utiliza aqui, el término "región lumbar" o "área lumbar" se refiere al área entre las tercera y cuarta vértebras lumbares (parte trasera inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral. Típicamente, la inyección ¡ntratecal por medio de la región lumbar o el área lumbar también se refiere como "suministro IT lumbar" o "administración IT lumbar". El término "cisterna magna" se refiere al espacio alrededor y debajo el cerebelo vía la abertura entre el cráneo y la parte superior de la columna vertebral. Típicamente, la inyección intratecal vía la cisterna magna también se refiere como "suministro por cisterna magna". El término "ventrículo cerebral" se refiere a las cavidades en el cerebro que son continuas con el canal central de la médula espinal. Típicamente, las inyecciones vía las cavidades del ventrículo cerebral se refieren como suministro cerebral intraventricular (ICV).

En algunas modalidades, "administración intratecal" o "suministro intratecal" de conformidad con la presente invención se refiere a administración o suministro IT lumbar, por ejemplo, suministrado entre la tercera y cuarta vértebra lumbar (espalda baja) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la espina. Se contempla que el suministro o administración IT lumbar se distingue sobre el suministro por cisterna magna en que el suministro o administración IT lumbar de acuerdo con esta invención proporciona un suministro mejor y más efectiva al canal espinal distante, mientras que el suministro por cisterna magna, entre otras cosas, típicamente no efectúa el suministro adecuadamente al canal espinal distante.

Dispositivo para el suministro intratecal Diversos dispositivos se pueden utilizar para el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención. En algunas modalidades, un dispositivo para la administración intratecal contiene un puerto de acceso de fluido (por ejemplo, un puerto inyectable); un cuerpo hueco (por ejemplo, un catéter) que tiene un primer orificio de flujo en comunicación fluida con el puerto de acceso de fluido y un segundo orificio de flujo configurado para la inserción en la médula espinal; y un mecanismo de aseguramiento para asegurar la inserción del cuerpo hueco en la médula espinal. Como un ejemplo no limitante mostrado en la Figura 36, un mecanismo de aseguramiento adecuado contiene uno o más pernos o nudos montados en la superficie del cuerpo hueco y un anillo suturado ajustable sobre los uno o más pernos o nudos para prevenir que el cuerpo hueco (por ejemplo, el catéter) se deslice fuera de la médula espinal. En diversas modalidades, el puerto de acceso de fluido comprende un depósito. En algunas modalidades, el puerto de acceso de fluido comprende una bomba mecánica (por ejemplo, una bomba de infusión). En algunas modalidades, se conecta un catéter implantado a ya sea un depósito (por ejemplo, para el suministro del bolo), o una bomba de infusión. El puerto de acceso de fluido se puede implantar o puede ser externo.

En algunas modalidades, la administración intratecal se puede realizar mediante ya sea punción lumbar (es decir, bolo lento) o por medio de un sistema de suministro de catéter con puerto (es decir, infusión o bolo). En algunas modalidades, el catéter se inserta entre las láminas de las vértebras lumbares y la punta se rosca hasta el espacio tecal al nivel deseado (generalmente L3-L4) (Figuras 37A-37C).

Con relación a la administración intravenosa, un volumen de dosis única adecuado para la administración intratecal es típicamente pequeño. Típicamente, el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención mantiene el balance de la composición del CSF así como la presión intracraneal del sujeto. En algunas modalidades, el suministro intratecal se realiza sin la remoción correspondiente de CSF a partir de un sujeto. En algunas modalidades, un volumen de dosis única adecuado puede ser por ejemplo, menor que aproximadamente 0 mi, 8 mi, 6 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2 mi, 1.5 mi, 1 mi, o 0.5 mi. En algunas modalidades, un volumen de dosis única adecuado puede ser aproximadamente 0.5-5 mi, 0.5-4 mi, 0.5-3 mi, 0.5-2 mi, 0.5-1 mi, 1-3 mi, 1-5 mi, 1.5-3 mi, 1-4 mi, o 0.5-1.5 mi. En algunas modalidades, el suministro intratecal de acuerdo con la presente invención involucra una etapa de remover primero una cantidad deseada de CSF. En algunas modalidades, primero se remueven menos de aproximadamente 10 mi (por ejemplo, menos de aproximadamente 9 mi, 8 mi, 7 mi, 6 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2 mi, 1 mi) de CSF antes de la administración IT. En esos casos, un volumen de dosis única adecuado puede ser por ejemplo, mayor que aproximadamente 3 mi, 4 mi, 5 mi, 6 mi, 7 mi, 8 mi, 9 mi, 10 mi, 15 mi, o 20 mi.

Diversos otros dispositivos se pueden utilizar para efectuar la administración intratecal de una composición terapéutica. Por ejemplo, las formulaciones que contienen enzimas deseadas se pueden administrar utilizando un depósito de Ommaya que es de uso común para administrar de manera intratecal fármacos para la carcinomatosis meníngea (Lancet 2: 983-84, 1963). Más específicamente, en este método, un tubo ventricular se inserta a través de un agujero formado en el cuerno anterior y se conecta a un depósito de Ommaya instalado bajo el cuero cabelludo, y el depósito se pincha subcutáneamente para suministrar de manera intratecal la enzima particular que se reemplaza, que se inyecta en el depósito. Otros dispositivos para la administración intratecal de formulaciones o composiciones terapéuticas a un individuo se describen en la Patente Norteamericana No. 6,217,552, incorporada aquí por referencia. Alternativamente, el fármaco se puede administrar por vía intratecal, por ejemplo, mediante una inyección sencilla, o una infusión continua. Se debe entender el tratamiento de la dosis puede estar en la forma de una sola administración de la dosis o múltiples dosis.

Para la inyección, las formulaciones de la invención se pueden formular en soluciones líquidas. Además, la enzima se puede formular en forma sólida y se puede re-disolver o suspender inmediatamente antes del uso. También se incluyen las formas liofilizadas. La inyección puede ser, por ejemplo, en la forma de una inyección en bolo o infusión continua (por ejemplo, utilizando bombas de infusión) de la enzima.

En una modalidad de la invención, la enzima se administra mediante inyección cerebroventricular lateral en el cerebro de un sujeto. La inyección se puede hacer, por ejemplo, a través de un trepanado hecho en el cráneo del sujeto. En otra modalidad, la enzima y/u otra formulación farmacéutica se administra a través de una derivación quirúrgicamente insertada en el ventrículo cerebral de un sujeto. Por ejemplo, la inyección se puede hacer en los ventrículos laterales, que son mayores. En algunas modalidades, la inyección también se puede hacer en los tercer y cuarto ventrículos menores.

En todavía otra modalidad, las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención se administran mediante inyección en la cisterna magna, o el área lumbar de un sujeto.

En otra modalidad del método de la invención, la formulación farmacéuticamente aceptable proporciona un suministro sostenida, por ejemplo, una "lenta liberación" de la enzima u otra composición farmacéutica utilizada en la presente invención, a un sujeto durante al menos una, dos, tres, cuatro semanas o periodos de tiempo más largos después de que la formulación farmacéuticamente aceptable se administra al sujeto.

Como se utiliza aquí, el término "suministro sostenido" se refiere al suministro continuo de una formulación farmacéutica de la invención in vivo durante un periodo de tiempo después de la administración, preferiblemente al menos varios días, una semana o varias semanas. El suministro sostenida de la composición se puede demostrar mediante, por ejemplo, el efecto terapéutico continuado de la enzima con el paso del tiempo (por ejemplo, el suministro sostenida de la enzima se puede demostrar por la cantidad reducida continuada de granulos de almacenamiento en el sujeto). Alternativamente, el suministro sostenida de la enzima se puede demostrar detectando la presencia de la enzima in vivo con el paso del tiempo.

Suministro a los Tejidos Objetivo Como se discute anteriormente, una de las características sorprendentes e importantes de la presente invención es que los agentes terapéuticos, en particular, las enzimas de reemplazo administradas utilizando los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención son capaces de difundirse efectivamente y extensivamente a través de la superficie del cerebro y penetrar varias capas o regiones del cerebro, incluyendo regiones profundas del cerebro. Además, los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención suministran efectivamente los agentes terapéuticos (por ejemplo, una enzima de HNS) a diversos tejidos, neuronas o células de la médula espinal, incluyendo la región lumbar, que es difícil de tener como objetivo por los métodos de suministro al CNS existentes tales como la inyección ICV. Además, los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención suministran una cantidad suficiente de agentes terapéuticos (por ejemplo, una enzima de HNS) al torrente sanguíneo y a diversos órganos periféricos y tejidos.

De esta manera, en algunas modalidades, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de HNS) se suministro al sistema nervioso central de un sujeto. En algunas modalidades, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de HNS) se suministro a uno o más de los tejidos objetivo del cerebro, médula espinal, y/u órganos periféricos. Como se utiliza aquí, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que sea afectado por el padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado o cualquier tejido en que la enzima lisosómica deficiente sea normalmente expresada. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales hay una cantidad detectable o anormalmente alta de sustrato de la enzima, por ejemplo almacenada en los lisosomas celulares del tejido, en pacientes que sufren de o susceptibles al padecimiento por almacenamiento lisosómico. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que despliegan una característica, síntoma o patología asociada al padecimiento. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales la enzima lisosómica deficiente es normalmente expresada en un nivel elevado. Como se utiliza aquí, un tejido objetivo puede ser un tejido objetivo del cerebro, un tejido objetivo de la médula espinal y/o un tejido objetivo periférico. Los tejidos objetivo ejemplares se describen en detalle debajo.

Tejidos Objetivo del Cerebro En general, el cerebro se puede dividir en diferentes regiones, capas y tejidos. Por ejemplo, el tejido meníngeo es un sistema de membranas que envuelve el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro. Las meninges contienen tres capas, incluyendo la duramadre, aracnoides y piamadre. En general, la función primaria de las meninges y del fluido cerebroespinal es proteger el sistema nervioso central. En algunas modalidades, una proteina terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a una o más capas de las meninges.

El cerebro tiene tres subdivisiones primarias, incluyendo el cerebro, el cerebelo, y el tallo cerebral. Los hemisferios cerebrales, que están situados por encima de la mayoría de las otras estructuras del cerebro y que están cubiertos con una capa cortical. Debajo del cerebro yace el tallo cerebral, el cual se parece a un tallo en el cual está adjunto el cerebro. En la parte trasera del encéfalo, debajo del cerebro y detrás del tallo cerebral, está el cerebelo.

El diencéfalo, que se localiza cerca de la línea media del cerebro y por encima del mesencéfalo, contiene el tálamo, el metatálamo, el hipotálamo, el epitálamo, el pretálamo, y el pretectum. El mesencéfalo, también llamado cerebro medio, contiene el tectum, tegumentum, mesocoelta ventricular, y pedúnculos cerebrales, el núcleo rojo, y el núcleo del nervio craneal III. El mesencéfalo se asocia con la vista, el oído, el control motor, el sueño/despertar, el estado de alerta, y la regulación de la temperatura.

Las regiones de tejidos del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, se pueden caracterizar con base en la profundidad de los tejidos. Por ejemplo, los tejidos del CNS (por ejemplo, el cerebro) se pueden caracterizar como tejidos superficiales o poco profundos, tejidos de profundidad media, y/o tejidos profundos.

De acuerdo con la presente invención, una proteina terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) se puede suministrar a cualquier tejido(s) objetivo del cerebro apropiado asociado con un padecimiento particular a ser tratado en un sujeto. En algunas modalidades, una proteina terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro superficial o poco profundo. En algunas modalidades, una proteina terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro de profundidad media. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a una combinación de tejido objetivo del cerebro superficial o poco profundo, tejido objetivo del cerebro de profundidad media, y/o tejido objetivo del cerebro profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a un tejido del cerebro profundo al menos 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm o más abajo (o interno a) la superficie externa del cerebro.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos superficiales o poco profundos del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se localizan dentro de 4 mm de la superficie del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se seleccionan a partir de tejidos de la piamadre, tejidos de la cinta cortical cerebral, hipocampo, espacio de Virchow-Robin, vasos sanguíneos dentro del espacio VR, el hipocampo, porciones del hipotálamo en la superficie inferior del cerebro, los tractos y nervios ópticos, las proyecciones y el bulbo olfatorio, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos profundos del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se localizan 4 mm (por ejemplo, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, o 10 mm) debajo de (ó interno a) la superficie del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos profundos que se tienen como objetivo del cerebro incluyen la cinta cortical cerebral. En algunas modalidades, los tejidos profundos que se tienen como objetivo del cerebro incluyen uno o más del diencéfalo (por ejemplo, el hipotálamo, tálamo, pretálamo, subtálamo, etcétera), metencéfalo, núcleo Ientiforme, ganglios básales, núcleo caudado, putamen, amígdala, globo pálido, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos del cerebelo. En ciertas modalidades, los uno o más tejidos que se tienen como objetivo del cerebelo se seleccionan a partir del grupo que consiste de tejidos de la capa molecular, tejidos de la capa de células de Purkinje, tejidos de la capa celular Granular, pedúnculos cerebelosos, y combinación de los mismos. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos profundos del cerebelo incluyendo, pero no limitado a, tejidos de la capa de células de Purkinje, tejidos de la capa celular Granular, tejido de la sustancia blanca cerebelosa profunda (por ejemplo, profunda con relación a la capa celular Granular), y tejido del núcleo cerebeloso profundo.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos del tallo cerebral. En algunas modalidades, los uno o más tejidos que se tienen como objetivo del tallo cerebral incluyen tejido de la sustancia blanca del tallo cerebral y/o tejido del núcleo del tallo cerebral.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a diversos tejidos del cerebro incluyendo, pero no limitado a, la materia gris, sustancia blanca, áreas periventriculares, pia-aracnoides, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región del núcleo caudado/putamen, cerebro medio, regiones profundas del puente de Varolio o la médula, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a diversas células en el cerebro incluyendo, pero no limitado a, las neuronas, células gliales, células penvasculares y/o células meníngeas. En algunas modalidades, una proteína terapéutica se suministra a los oligodendrocitos de la sustancia blanca profunda.

Médula Espinal En general, las regiones o tejidos de la médula espinal se pueden caracterizar con base en la profundidad de los tejidos. Por ejemplo, los tejidos de la médula espinal se pueden caracterizar como tejidos superficiales o poco profundos, tejidos de profundidad media, y/o tejidos profundos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos superficiales o poco profundos de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido superficial o poco profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal se localiza dentro de 4 mm desde la superficie de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido superficial o poco profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal contiene piamadre y/o los tractos de la sustancia blanca.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos profundos de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal se localiza interno a 4 mm desde la superficie de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal contiene materia gris de la médula espinal y/o células ependimarias.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a las neuronas de la médula espinal.

Tejidos Periféricos Objetivo Como se utiliza aquí, los órganos o tejidos periféricos se refieren a cualquier órgano o tejido que no sea parte del sistema nervioso central (CNS). Los tejidos periféricos objetivo pueden incluir, pero no se limitan a, el sistema sanguíneo, hígado, riñon, corazón, endotelio, médula ósea y células derivadas de la médula ósea, bazo, pulmón, nodo linfático, hueso, cartílago, ovario y testículo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) de conformidad con la presente invención se suministro a uno o más de los tejidos periféricos objetivo.

Biodistribución y biodisponibilidad En diversas modalidades, una vez que se suministro al tejido objetivo, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de HNS) se localiza intracelularmente. Por ejemplo, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima) se puede localizar en los exones, axones, lisosomas, mitocondria o vacuolas de una célula objetivo (por ejemplo, las neuronas tales como las células de Purkinje). Por ejemplo, en algunas modalidades, las enzimas administradas por vía intratecal demuestran una dinámica de translocación tal que la enzima se mueve dentro del espacio perivascular (por ejemplo, mediante mecanismos convectivos asistidos por pulsaciones). Además, los mecanismos de transporte axónico activos referentes a la asociación de la proteína o enzima administrada con los neurofilamentos, también pueden contribuir a o de otra manera pueden facilitar la distribución de las enzimas o proteínas administradas por vía intratecal en los tejidos más profundos del sistema nervioso central.

En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de HNS) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr actividades o niveles terapéuticamente o clínicamente efectivos en diversos tejidos objetivo aquí descritos. Como se utiliza aquí, una actividad o nivel terapéuticamente o clínicamente efectivo es una actividad o nivel suficiente para conferir un efecto terapéutico en un tejido objetivo. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por cualquier prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto). Por ejemplo, una actividad o nivel terapéuticamente o clínicamente efectivo puede ser una actividad o nivel enzimático que es suficiente para mejorar los síntomas asociados con el padecimiento en el tejido objetivo (por ejemplo, almacenamiento GAG).

En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático que es al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de la actividad o nivel normal de la enzima lisosómica correspondiente en el tejido objetivo. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático que se incrementa por al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces según se compara a un control (por ejemplo, las actividades o niveles endógenos sin el tratamiento). En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático incrementado al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg o 600 nmol/hr/mg en un tejido objetivo.

En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles para tener como objetivo la región lumbar. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático incrementado en la región lumbar de al menos aproximadamente 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, o 10,000 nmol/hr/mg.

En general, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de reemplazo) suministrados de acuerdo con la presente invención tienen una vida media suficientemente larga en el CSF y los tejidos objetivo del cerebro, la médula espinal, y los órganos periféricos. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede tener una vida media de al menos aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, hasta 3 días, hasta 7 días, hasta 14 días, hasta 21 días o hasta un mes. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede retener una actividad o nivel detectable en el CSF o el torrente sanguíneo después de 12 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 66 horas, 72 horas, 78 horas, 84 horas, 90 horas, 96 horas, 102 horas, o una semana después de la administración. La actividad o el nivel detectable se puede determinar utilizando diversos métodos conocidos en el arte.

En ciertas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención logra una concentración de al menos 30 pg/ml en los tejidos del CNS y las células del sujeto después de la administración (por ejemplo, una semana, 3 días, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, o menos, después de la administración intratecal de la composición farmacéutica al sujeto). En ciertas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención logra una concentración de al menos 20 pg/ml, al menos 15 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 7.5 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 2.5 pg/ml, al menos 1.0 pg/ml o al menos 0.5 pg/ml en los tejidos o células que se tienen como objetivo del sujeto (por ejemplo, los tejidos del cerebro o las neuronas) después de la administración a tal sujeto (por ejemplo, una semana, 3 días, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, o menos después de la administración intratecal de tales composiciones farmacéuticas al sujeto).

Tratamiento de Síndrome de Sanfílippo A y otras Enfermedades de Almacenamiento üsosomal Las enfermedades por almacenamiento lisosómico representan un grupo de trastornos metabólicos heredados, relativamente raros, que resulta de defectos en la función lisosómica. Las enfermedades lisosómicas se caracterizan por la acumulación de macromoléculas no digeridas, incluyendo aquellos substratos enzimáticos, dentro de lisosomas (véase Tabla 1), las cuales resultan en el aumento de tamaño y del numero de tales lisosomas y por ultimo en disfunción celular y anormalidades clínicas.

Los métodos de la invención descritos aquí pueden facilitar ventajosamente la administración de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, una o más enzimas de remplazo) a los organelos específicos. Por ejemplo, puesto que los trastornos por almacenamiento lisosómico, tales como Síndrome de Sanfilippo Tipo A, se caracterizan por una acumulación de glicosaminoglicanos (GAG) en los lisosomas de las células afectadas, los lisosomas representan un organelo objetivo deseado para el tratamiento de los trastornos por almacenamiento lisosómico.

Los métodos y las composiciones inventivas, de la presente invención son particularmente útiles para tratar aquellas enfermedades que tienen una etiología o componente en el CNS. Las enfermedades por almacenamiento lisosómico que tienen una etiología o componente en el CNS incluyen, por ejemplo y sin limitación: el síndrome de Sanfilippo Tipo A, el síndrome de Sanfilippo tipo B, el síndrome de Hunter, leucodistrofia metacromática y leucodistrofia de células globoídes. Antes de la presente invención, las terapias tradicionales estaban limitadas porque estas se administraban a los sujetos de forma intravenosa, y por lo general solo eran efectivas para tratar los síntomas osmáticos de la deficiencia enzimática subyacente. Las composiciones y los métodos de la presente invención pueden ser administradas directamente en el CNS de los sujetos que sufren de una enfermedad que tenga tal etiología en el CNS logrando por ello una concentración terapéutica dentro de las células y los tejidos afectados del CNS (por ejemplo, el cerebro), superándose por lo tanto las limitaciones asociadas con la administración sistémica tradicional de tales agentes terapéuticos.

En algunas modalidades, los métodos y las composiciones inventivas de la invención son útiles para tratar tanto las secuelas o los síntomas neurológicos y somáticos de los trastornos por almacenamiento lisosómico. Por ejemplo, algunas modalidades de la invención se refieren a composiciones y métodos para la administración de uno o más agentes al CNS de los sujetos (por ejemplo, de forma intratecal, intravenosa o intracisternal) para el tratamiento del CNS o las secuelas y las manifestaciones de las enfermedades por almacenamiento lisosómico, al tiempo que también se tratan las manifestaciones sistémicas o somáticas de esas enfermedades lisosómicas. Por ejemplo, algunas composiciones de la presente invención pueden ser administradas a los sujetos de forma intratecal, suministrando por ello uno o más agentes terapéuticos al CNS de los sujetos y tratan las secuelas neurológicas, junto con la administración intravenosa de uno o más agentes terapéuticos para administrar tales agentes terapéuticos tanto a las células y los tejidos de la circulación sistémica (por ejemplo, las células y los tejidos del corazón, los pulmones, el hígado, los ríñones o los nodos linfáticos) para tratar por ello las secuelas somáticas. Por ejemplo, los sujetos que tienen o que padecen de otra manera una enfermedad por almacenamiento lisosómico (por ejemplo, Síndrome de Sanfilippo Tipo A) pueden ser administrados con una composición terapéutica que comprenda uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, HNS) de forma intratecal, al menos una vez por semana, cada dos semanas, mensualmente, cada dos meses o más, para tratar las secuencias neurológicas, al tiempo que se administra un agente terapéutico diferente a los sujetos, de forma intravenosa, sobre una base más frecuente (por ejemplo, una vez al día, cada tercer día, tres veces a la semana o semanalmente) para tratar las manifestaciones sistémicas o somáticas de la enfermedad.

El síndrome de Sanfilippo, o mucopolisacaridosis III (MPS III), es un trastorno genético raro caracterizado por la deficiencia de enzimas involucradas en la degradación de glicosaminoglicanos (GAG). En la ausencia de la enzima, las moléculas GAG parcialmente degradadas no se pueden se parar del cuerpo y acumularse en lisosomas de varios tejidos, resultando en el progreso de la disfunción somática expandida (Neufeld y Muenzer, 2001 ).

Se han identificado cuatro distintas formas de MPS III, designadas MPS IIIA, B, C y D. Cada una representa una deficiencia en una de las cuatro enzimas involucradas en la degradación del heparan sulfato de GAG. Todas las formas incluyen grados variados de los mismos síntomas clínicos, que incluyen características faciales gruesas, hepatoesplenomegalia, opacidad corneal y deformidades esqueléticas. Más notable, sin embargo, es la severa y progresiva pérdida de la habilidad cognitiva, la cual es está unida n solamente a la acumulación de heparan sulfato en neuronas, pero también la subsecuente elevación de la gangliósidos GM2, GM3 y GD2 causados por acumulación de GAG primaria (Walkley 1998).

La mucopolisacaridosis tipo IIIA (MPS MIA; síndrome de Sanfilippo tipo A) es la forma más severa de síndrome de Sanfilippo y afecta aproximadamente a 1 de 100,000 personas a nivel mundial. El síndrome de Sanfilippo tipo A (San A) se caracteriza por una deficiencia de la enzima heparan N-sulfatasa (HNS), una exosulfatasa involucrada en el catabolismo lisosómico del glicosaminoglicano (GAG) heparan sulfato (Neufeld EF, et al., The metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001 ) pp. 3421 -3452). En ausencia de esta enzima, el GAG heparan sulfato se acumula en los lisosomas de las neuronas y las células gliales, con menos acumulación fuera del cerebro.

Una característica clínica definitoria de este trastorno es la degeneración del sistema nervioso central (CNS), la cual resulta en la pérdida de, o la incapacidad para lograr, los niveles de desarrollo principales. La declinación cognoscitiva progresiva culmina en demencia y mortalidad prematura. La enfermedad típicamente se manifiesta la misma en niños pequeños, y la duración de vida de un individuo afectado en general no excede más allá de la adolescencia a los veinte años.

Composiciones y métodos de la presente invención se pueden usar para efectivamente tratar individuos que sufren de o son susceptibles al Síndrome de Sanfilippo Tipo A. Los términos, "tratar" o "tratamiento", como se usa en la presente, se refieren a mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, prevención o retraso del inicio o progreso de uno o más síntomas de la enfermedad, y/o disminución de la severidad o frecuencia de uno o más síntomas de la enfermedad.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere al alivio, mejora, inhibición retardo del inicio, reducción de la severidad yo la incidencia, completa, parcialmente o completamente, del deterioro neurologico en los pacientes con SanA. Como se usa aquí, el término "deterioro neurologico" incluye varios síntomas asociados con el deterioro del sistema nervioso central (por ejemplo, el cerebro y la médula espinal). Los síntomas del deterioro neurologico pueden incluir, por ejemplo, retardo del desarrollo, deterioro cognoscitivo progresivo, pérdida de la audición, desarrollo deteriorado del habla, déficit en las habilidades motoras, hiperactividad, agresividad yo perturbaciones del sueño, entre otros.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la reducción del almacenamiento lisosómico (por ejemplo, GAG) en varios tejidos. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a al almacenamiento lisosómico reducido en los tejidos objetivo del cerebro, las neuronas de la médula espinal yo los tejidos periféricos objetivo. En ciertas modalidades, el almacenamiento lisosómico se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%. 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles. En algunas modalidades, el almacenamiento lisosómico se reduce en al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces ó 10 veces, en comparación con los controles. En algunas modalidades, el almacenamiento lisosómico se mide mediante la presencia de gránulos de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, morfología de rayas de cebra).

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la vacuolización reducida en las neuronas (por ejemplo, las neuronas que contienen células de Purkinje). En ciertas modalidades, la vacuolización en las neuronas se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles. En algunas modalidades, la vacuolización se reduce en al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces ó 10 veces, en comparación con los controles.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere una actividad incrementada de enzima HNS en varios tejidos. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere una actividad incrementada de enzima HNS en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la actividad de la enzima HNS se incrementa por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 1000% o más comparada con un control. En algunas modalidades, la actividad de la enzima HNS se incrementa por al menos 1 -vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control. En algunas modalidades, la actividad enzimática HNS incrementada es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg o más. En algunas modalidades, la actividad enzimática HNS se incrementa en la región lumbar. En algunas modalidades, actividad enzimática HNS incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 10,000 nmol/hr/mg, o más.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la progresión reducida de la pérdida de la actividad cognoscitiva. En ciertas modalidades, la progresión de la pérdida de la habilidad cognoscitiva se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la reducción en el retardo del desarrollo. En ciertas modalidades, el retardo del desarrollo se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la supervivencia aumentada (por ejemplo, tiempo de supervivencia). Por ejemplo, el tratamiento puede resultar en una esperanza de vida aumentada de los pacientes. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en una esperanza de vida aumentada de los pacientes en más de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, aproximadamente 105%, aproximadamente 1 10%, aproximadamente 1 15%, aproximadamente 120%, aproximadamente 125%, aproximadamente 130%, aproximadamente 135%, aproximadamente 140%, aproximadamente 145%, aproximadamente 150%, aproximadamente 155%, aproximadamente 160%, aproximadamente 165%, aproximadamente 170%, aproximadamente 175%, aproximadamente 180%, aproximadamente 185%, aproximadamente 190%, aproximadamente 195%, aproximadamente 200%, o más, en comparación con la esperanza de vida promedio de uno o más individuos de control con enfermedades similares, sin tratamiento. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en una esperanza de vida aumentada de los pacientes en más de aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 1 1 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años, aproximadamente 10 años, o más, en comparación con la esperanza de vida promedio de uno o más individuos de control con enfermedades similares, sin tratamiento. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en la supervivencia a largo plazo de los pacientes. Como se usa aquí, el término "supervivencia a largo plazo" se refiere a un tiempo se supervivencia o esperanza de vida mayor a aproximadamente 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años, o más.

Los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir" como se usan aquí, indican valores que son relativos a los controles. En algunas modalidades, un control adecuad son las mediciones de los niveles de referencia, como por ejemplo las mediciones en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito aquí, o una medición en un individuo de control (o en varios individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito aquí. Un "individuo de control" es un individuo afligido con Síndrome de Sanfilippo Tipo A, quién tiene aproximadamente la misma edad y/o el género que el individuo que está siendo tratado (para garantizar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y el o los individuos de control, sean comparables).

El individuo (conocido también como "paciente" o "sujeto") que está siendo tratado es un individuo (un humano fetal, infante, niño, adolescente, o adulto) que tiene Síndrome de Sanfilippo Tipo A o que tiene el potencial de desarrollar Síndrome de Sanfilippo Tipo A. El individuo puede tener expresión y/o actividad HNS endógena residual, o no tiene actividad mensurable. Por ejemplo, los individuos que tienen Síndrome de Sanfilippo Tipo A pueden tener niveles de expresión de HNS que son menores a aproximadamente 30-50%, menores a aproximadamente 25-30%, menores a aproximadamente 20-25%, menores a aproximadamente 15-20%, menores a aproximadamente 10-15%, menores a aproximadamente 5-10%, menores a aproximadamente 0.1-5% de los niveles de expresión normales de HNS.

En algunas modalidades, el individuo es un individuo quien ha sido diagnosticado recientemente con la enfermedad. Típicamente, el tratamiento temprano (comienza el tratamiento tan pronto como sea posible después del diagnóstico) es importante para minimizar los efectos de la enfermedad y maximizar los beneficios del tratamiento.

Tolerancia Inmunolóqica Por lo general, la administración intratecal de un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de remplazo) de acuerdo con la presente invención, no resulta en efectos adversos seros en el sujeto. Como se usa aquí, los efectos adversos severos inducen, pero no se limitan a, respuesta inmunológica sustancial, toxicidad, o muerte. Como se usa aquí, "respuesta inmunológica sustancial" se refiere a respuestas inmunológicas severas o serias, tales como respuestas inmunológicas de células T adaptativas.

Por lo tanto, en muchas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran terapia inmunosupresora concurrente (es decir, cualquier terapia inmunosupresora usada como pre-tratamiento/pre-condicionamiento o en paralelo con el método). En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran una inducción de la tolerancia inmunológica en los sujetos que están siendo tratados. En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran un pre-tratamiento o pre acondicionamiento de los sujetos usando agentes inmunosupresores de células T.

En algunas modalidades, la administración intratecal de agentes terapéuticos puede desarrollar una respuesta inmunológica contra estos agentes. Por lo tanto, en algunas modalidades, puede ser útil hacer que los sujetos que reciben la enzima de reemplazo, se vuelvan tolerantes a la terapia de remplazo de enzimas. La tolerancia inmunológica puede ser inducida usando varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un régimen inicial de 30-60 días de un agente inmunosupresor de células T, tal como ciclosporina A (CsA) y un agente anti proliferativo, tal como azatioprina (Aza), combinada con infusiones intratecales semanales de dosis bajas de una enzima de remplazo.

Cualquier agente inmunosupresor conocido por los especialistas experimentados puede ser empleado junto con una terapia de combinación de la invención. Tales agentes inmunosupresores incluyen pero no se limitan a ciclosporina, FK506, rapamicina, CTI_A4-lg, y agentes anti-TNF tales como etanercept (véase, por ejemplo, Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kulberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51 , 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret et al., 1999, Ann. N. Y. Acad. Sci 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283). El anticuerpo del receptor anti-IL2 (subunidad alfa), daclizumab (por ejemplo, Zenapax.TM ), el cual ha demostrado resultar efectivo en los pacientes de trasplante, también puede ser usado como un agente inmunosupresor (véase, por ejemplo, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R. D. 1 , 55-60; Berard et al., 1999, Pharmacotherapy 19, 1 127-1 137; Eckhoff et al., 2000, Transplantation 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151 -159). Los agentes inmunosupresores adicionales incluyen, pero no se limitan a anti-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantations 68, 1588-1596; Przepiorka et al, 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 238-152), y el ligando anti-CD40 (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235).

Administración Los métodos inventivos de la presente invención contemplan administraciones individuales así como múltiples de una cantidad efectiva terapéuticamente de los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de remplazo) descritos aquí. Los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de remplazo) pueden ser administrados a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, la severidad y la extensión de la condición del sujeto (por ejemplo, una enfermedad por almacenamiento lisosómico). En algunas modalidades, una cantidad efectiva terapéuticamente de los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de remplazo) de la presente invención, puede ser administrada periódicamente de forma intratecal, a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada tres meses, bímensualmente (una vez cada dos meses), mensualmente (una vez al mes), bisemanalmente (una vez cada dos semanas), semanalmente).

En algunas modalidades, la administración intratecal puede ser usada en conjunción con otras rutas de administración (por ejemplo, de forma intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, transdérmicos, o a través de las mucosas (por ejemplo, oralmente o nasalmente)). En algunas modalidades, esas otras rutas de administración (por ejemplo, la administración intravenosa) puede ser llevada a cabo no más frecuentemente que la administración bisemanalmente, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses.

Como se usa aquí, el término "cantidad efectiva terapéuticamente" se determina en gran medida con base en la cantidad total del agente terapéutico contenido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En general, una cantidad efectiva terapéuticamente es suficiente para lograr un beneficio significativo a los sujetos (por ejemplo, tratar, modular, curar, evitar y/o aliviar la enfermedad o la condición subyacente). Por ejemplo, una cantidad efectiva terapéuticamente puede ser una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico suficiente, tal como una cantidad suficiente para modular los receptores de la enzima lisosómica o sus actividad para tratar por ello tal enfermedad por almacenamiento lisosómico o los síntomas de la misma (por ejemplo, una reducción o eliminación de la presencia o la incidencia de "los cuerpos cebra" o la vacuolización celular enseguida de la administración de las composiciones de la presente invención a los sujetos). En general, la cantidad un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima lisosómica recombinante) administrada a los sujetos en necesidad de la misma, dependerá de las características de los sujetos. Tales características incluyen la condición, la severidad de la enfermedad, la salud general, la edad, el sexo y el peso corporal de los sujetos. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica serán capaces de determinar fácilmente las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos tanto objetivos y subjetivos para identificar los rangos de dosificación óptimos.

Una cantidad efectiva terapéuticamente se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender varias dosis unitarias. Para cualquier proteina terapéutica particular, una cantidad efectiva terapéuticamente (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad efectiva terapéuticamente (y/o la dosis unitaria), para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el trastorno que está siendo tratado y la severidad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, y/o la tasa de expresión o de metabolismo de la proteína de fusión especifica empleada; la duración del tratamiento; y los factores similares que son bien conocidos en las técnica médicas.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente varía desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 500 mg/kg en peso del cerebro, por ejemplo, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 400 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 300 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 200 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 100 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 90 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 80 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 70 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 60 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 50 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 40 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 30 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 25 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 20 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 15 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 10 mg/kg en peso del cerebro.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente es mayor a aproximadamente 0.1 mg/kg, mayor a aproximadamente 0.5 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 1.0 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 3 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 5 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 10 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 15 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 20 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 30 mg/kg en peso del cerebro, mayos a aproximadamente 40 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 50 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 60 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 70 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 80 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 90 mg/kg en peso del cerebro, mayor a 100 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 150 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 200 mg/kg en peso del cerebro, mayor a 250 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 300 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 350 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 400 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 450 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 500 mg/kg en peso del cerebro.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente también puede ser definida por los mg/kg en peso del cerebro. Como apreciaran las personas experimentadas en la técnica, el peso del cerebro y el peso corporal pueden estar correlacionados. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights", Ann Neurol 1978; 4:345-56. Por lo tanto, en algunas modalidades, las dosis pueden ser convertidas como se muestra en la Tabla 5.

TABLA 5 Correlación entre el Peso del Cerebro, el peso corporal y las edades de hombres Edad (años) Peso del Cerebro Peso Corporal (kg) 3(31-43 meses) 1.27 15.55 4-5 1.30 19.46 En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente también puede ser definida por mg/15 ce de CSF. Como apreciarán las personas experimentadas en la técnica, las dosis efectivas terapéuticamente con base en los pesos del cerebro y los pesos corporales, pueden ser convertidas a mg/15 ce de CSF. Por ejemplo, el volumen de CSF en humanos adultos es aproximadamente 150 ml_ (Johanson CE, et al., "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease", Cerebrospinal Fluid Res. 2008 Mayo 14; 5: 10). Por lo tanto, las inyecciones de dosis unitarias de 0.1 mg a 50 mg de proteína a adultos, serían dosis de aproximadamente 0.01 mg/15 ce de CFS (0.1 mg) a 5.0 mg/15 ce de CSF (50 mg) dosis en adultos.

Se debe entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ser ajustados en el transcurso del tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el juicio profesional de las personas que administran o que supervisan la administración de la terapia de remplazo de enzimas y aquellos rangos de dosificación establecidos aquí, son solo ejemplificantes y no tienen la intención de limitar el ámbito o la práctica de la invención reivindicada.

Kits La presente invención proporciona además kits y otros artículos de fabricación, los cuales contienen la formulación de la presente invención y proporcionan instrucciones para su reconstitución (si están liofilizadas) y/o uso. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir un recipiente, un IDDD, un catéter y cualquier otro artículo, dispositivo o kit útiles en la administración intratecal y la cirugía asociada. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas (por ejemplo, jeringas pre llenadas), ampolletas, cartuchos, depósitos o lyo-jects. El recipiente puede ser formado de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. En algunas modalidades, los recipientes son jeringas pre-llenadas. Las jeringas pre-llenadas incluyen, pero no se limitan a, jeringas de vidrio de borosilicato con revestimiento de silicona horneada, jeringas de vidrio de borosilicato con silicona rociada, o jeringas de resina plástica sin silicona.

Típicamente los recipientes contienen formulaciones y una etiqueta sobre, o asociada con el recipiente que puede indicar las instrucciones para la reconstitución y/o el uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación se reconstituye a las concentraciones de la proteína como se describen anteriormente. La etiqueta puede indicar además que la formulación es útil o deseada para, por ejemplo, la administración IT. En algunas modalidades, los recipientes pueden contener una dosis única de una formulación estable que contiene un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de remplazo). En varias modalidades, una dosis única de la formulación estable está presente en un volumen menor a aproximadamente 15 mi, 10 mi, 5.0 mi, 4.0 mi, 3.5 mi, 2.5 mi. 2.0 mi, 1.5 mi, 1 .0 mi, 0 0.5 mi. Alternativamente, los recipientes que contiene la formulación pueden ser frascos de usos múltiples, los cuales hacen posible la administración repetida (por ejemplo, de 2-6 administraciones) de la formulación. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además un segundo recipiente que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI, solución salina, solución salina amortiguada). Después del mezclado del diluyente y la formulación, la concentración final de proteina en la formulación reconstituida será por lo general de al menos 1 mg/ml (por ejemplo, al menos 5 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml). Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen, otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, IDDDs, catéteres, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso.

La invención se entenderá de forma más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Los cuales no deben, sin embargo, ser considerados como limitantes del ámbito de la invención, todas las citas de la literatura se incorporan como referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Formulación de HNS Los experimentos en el presente ejemplo son diseñados como parte del estudio de pre-formulación para examinar la estabilidad de Heparan-N-Sulfatasa (HNS) en varias condiciones de formulación que incluye pH, resistencia iónica y tipo de amortiguador planeado para suministro intratecal.

HNS es generalmente encontrado por ser un dimero en un estado nativo (Bielicki er a/., Journal de Biochemistry, 1998, 329, 145-150). El peso molecular del dimero HNS es 1 15 kDa. HNS típicamente se eluye como un dimero durante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Cuando se corre en geles SDS-PAGE, HNS parece como un dimero a menos que la muestra se caliente a 100°C antes de ser carga en el gel, en este caso aparece como un monómero (62 kDa). Las secuencias de longitudes completas y maduras de HNS se muestran debajo en la Tabla 6 y Tabla 7, respectivamente. La secuencia HNS maduras que contienen 5 residuos de cisteina (subrayada), la cual puede permitir dos uniones de disulfuro interno y uno de cisteina libre.

TABLA 6 Secuencia de HNS de Longitud Completa MSCPVPACCA LLLVLGLCRA RPRNALLLLA DDGGFESGAY NNSAIATPHL DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG LPQHQNGMYG LHQDVHHFNS FDKVRSLPLL LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTE ENGSVLQVGR NITRIKLLVR KFLQTQDDRP FFLYVAFHDP HRCGHSQPQY GTFCEKFGNG ESGMGRIPDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP AARADLAAQY TTVGRMDQGV GLVLQELRDA GVLNDTLVIF TSDNGIPFPS GRTNLYWPGT AEPLLVSSPE HPKRWGQVSE AYVSLLDLTP TILDWFSIPY PSYAIFGSKT IHLTGRSLLP ALEAEPLWAT VFGSQSHHEV TMSYPMRSVQ HRHFRLVHNL NFKMPFPIDQ DFYVSPTFQD LLNRTTAGQP TGWYKDLRHY YYRARWELYD RSRDPHETQN LATDPRFAQL LEMLRDQLAK WQWETHDPWV CAPDGVLEEK LSPQCQPLHN EL (SEQ ID NO:2) TABLA 7 Secuencia de HNS Madura (rhHNS) RPRNALLLLA DDGGFESGAY NNSAIATPHL DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG LPQHQNGMYG LHQDVHHFNS FDKVRSLPLL LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTE ENGSVLQVGR NITRIKLLVR KFLQTQDDRP FFLYVAFHDP HRCGHSQPQY GTFCEKFGNG ESGMGRIPDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP AARADLAAQY TTVGRMDQGV GLVLQELRDA GVLNDTLVIF TSDNGIPFPS GRTNLYWPGT AEPLLVSSPE HPKRWGQVSE AYVSLLDLTP TILDWFSIPY PSYAIFGSKT IHLTGRSLLP ALEAEPLWAT VFGSQSHHEV TMSYPMRSVQ HRHFRLVHNL NFKMPFPIDQ DFYVSPTFQD LLNRTTAGQP TGWYKDLRHY YYRARWELYD RSRDPHETQN LATDPRFAQL LEMLRDQLAK WQWETHDPWV CAPDGVLEEK LSPQCQPLHN EL (SEQ ID N0: 1 ) En este ejemplo, son examinados los siguientes parámetros de formulación: (1 ) pH de formulaciones de citrato de pH 3-8 y en formulaciones de fosfato de pH 5-8; (2) Amortiguadores: amortiguador de citrato de sodio (pH 3.0-8.0) y amortiguador de fosfato de sodio (pH 5.0-8.0), todas las concentraciones a 20 mM; y (3) resistencia iónica: NaCI (0-300 mM).

Todos los estudios de pre-formulación descritos en este ejemplo se conducen a bajas concentraciones de proteína de 1-2 mg/ml.

Para analizar los productos de formulación y productos de degradación generados bajo varios énfasis, se usaron ensayos SEC-HPLC, SDS-PAGE, Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC), turbidez (OD 320) y actividad enzimática.

Generalmente, los resultados SDS-PAGE muestran fragmentación de la formulación a pH bajo (pH 3), mientras las formulaciones a pH mayores mostraron poca fragmentación. La evaluación de la temperatura de fusión por DSC mostró formulaciones de rhHNS que contienen citrato y fosfato que tienen estabilidad térmica más elevada a un pH que varía de 6-7. Los resultados de actividad enzimática muestran que las formulaciones rhHNS que contienen citrato en todos los valores de pH evaluados se vuelven inactivas después del almacenamiento a 50°C por 7 días. Las formulaciones rhHNS que contienen fosfato a pH 6-7 retienen actividad significante después del almacenamiento a 50°C por 7 días. Sin embargo, un pico de peso molecular elevado ("pico de 16 minutos", como se observa por SEC) es máximo a pH 7-8, a pesar que este pico no es consistentemente observado en preparaciones separadas de la misma formulación.

Los efectos de intensidad iónica, 0-300 mM de NaCI, en estabilidad de la formulación de rhHNS también se evaluaron. Los geles de SDS-PAGE de muestras almacenadas a condiciones de estabilidad acelerada de 50°C por 7 días no mostraron mayor fragmentación que la del control de lote interno. Las formulaciones de rhHNS que contienen citrato mostraron una pérdida completa en actividad después de 7 días a 50°C con respecto de la intensidad iónica. Las formulaciones de rhHNS que contienen fosfato retienen actividad significante en 50-300 mM de NaCI. Sin embargo, el pico a 16 minutos (por SEC) es máximo en el rango de 50 - 150 mM de NaCI.

Métodos Efecto de pH en la Estabilidad de rhHNS rhHNS (9.2 mg/ml en 10 mM de fosfato de sodio, 138 mM de cloruro de sodio, pH 7.0), se intercambió de amortiguador usando diálisis (Piece Slide-A-Lyzer, PN# 66383, lote # HK107537) en 20 mM de citrato de sodio con un intervalo de pH de 3.0 a 8.0, y 20 mM de fosfato de sodio con un intervalo de pH de 6.0 a 8.0. La concentración de proteína final en cada amortiguador intercambiado se dirigió a 2.0 mg/mL. Estas soluciones se sometieron a alícuotas a 0.5 mL cada una en viales de vidrio de 2.0 mi (West Pharmeuticals, Cat#: 6800-0314, lote#: 30809A2001 ), y después incubaron en cámaras de 50°C, 25°C y 2-8°C. Después de 7, 14 y 28 días, las muestras se retiraron para análisis de agregación (SEC-HPLC), fragmentación (SDS-PAGE), turbidez (OD320) y actividad enzimática.

El estudio de pH subsecuente en amortiguador de fosfato se repitió siguiendo los mismos procedimientos como anteriormente, sin embargo, se usó la rhHNS lote # SS10. El intervalo de pH para el estudio de fosfato inicial fue muy estrecho, de manera que el estudio se repitió para incorporar un intervalo de pH más amplio.

OD320 La turbidez de las muestras de rhHNS se determinó realizando mediciones de OD320. Las muestras se midieron en los Dispositivos Moleculares SpectraMax Plus 384 a 2 mg/ml en una cubeta de 0.2 cm de longitud. El volumen total usado fue 30 µ? para cada una de las pruebas.

SEC-HPLC Para análisis de SEC-HPLC de rhHNS, se usó una columna Superdex 200 (10/300 GL, PN: 17-5175-01 , GE Healthcare). La fase móvil fue salina amortiguada con fosfato (25 mM de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 6) que corre a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. El volumen de inyección fue 30 µ? de 1 mg/ml (diluido de 2 mg/ml en amortiguador respectivo). El tiempo de corrida de cada inyección fue 50 minutos y una longitud de onda de detección de 214 nm.

SDS-PAGE Este método evalúa la fragmentación y agregación de rhHNS bajo condiciones de desnaturalización y reducidas. Las muestras de rhHNS se mezclaron con amortiguador de SDS (concentración final = 0.5 mg/ml), y se agregó DTT (muestras reducidas solamente). Las muestras se calentaron a 100°C por 5 minutos. Las muestras en ebullición por más de 5 minutos resultaron en fragmentación de rhHNS. Cada línea se cargó con 10 g de muestras de rhHNS en geles de acrilamida de 8-16% de gradiente (Cat#: EC6045BOX). El gel se corrió a 150V y después incubó durante la noche (con sacudimiento) con el teñido de Código de Gel Azul Coomassi. Los geles se destiñeron con agua por 1 hora previo al barrido.

Ensayo de Actividad El ensayo de actividad para rhHNS es una reacción de dos etapas. En la primera reacción, la heparan-N-sulfatasa desulfata el sustrato. Ocurre hidrólisis adicional en la segunda reacción con la adición de enzima alfa-glucosidasa que libera 4-MU, la cual puede entonces ser medida. Se diluyó rhHNS 1 :210 para una concentración de ensayo final de 10 pg/ml. Para el Estudio de pH de Amortiguador de Fosfato, el ensayo se modificó y la rhHNS se diluyó 1 :24 para una concentración de ensayo final de ~100 g/mL.

DSC Se realizaron mediciones de calorimetría de barrido diferencial (DSC) en el instrumento Microcalorímetro (MicroCal VP-DSC). Las muestras de rhHNS probadas fueron 0.5 mg/ml. La temperatura se equilibró a 10°C, y después elevó a 100°C a 1o por minuto.

Efecto de Intensidad Iónica en estabilidad de HNS La rhHNS se intercambió de amortiguador usando diálisis (Pierce Slide-A-Lyzer lote # HK107537) en 20 mM de amortiguador de citrato de pH 6.0 con cloruro de sodio en el intervalo de 0-300 mM, y 20 mM de amortiguador de fosfato de pH 7.0 con cloruro de sodio en el intervalo de 0-300 mM. La concentración de proteína final en cada amortiguador intercambiado se dirigió a 2.0 mg/mL. Esta soluciones se sometieron a alícuotas a 0.5 mL cada uno en viales de vidrio de 2.0ml (West Pharmaceuticals, Cat# 6800-0314, lote# 30809A2001), y después incubaron en cámaras a 50°C, 25°C y 2-8°C. Después de 7, 14 y 28 días, las muestras se retiraron para análisis de agregación (SEC-HPLC), fragmentación (SDS-PAGE), turbidez (OD 320), y actividad enzimática.

Resultados Efecto de pH en la estabilidad de HSN OD320 v Apariencia Los resultados de los valores OD 320 para medir la turbidez se muestran abajo en la Tabla 8. No hubo cambios significantes en la turbidez bajo condiciones de estabilidad acerada de las formulaciones de rhHNS que contienen fosfato a pH 7 o citrato a pH 3-6. Sin embargo, las muestras a pH 8.0 en tanto formulaciones de fosfato como citrato, y el citrato a pH 7.0, mostraron turbidez incrementada después de 7 días a 50°C. Se realizó verificación de apariencia bajo una caja de luz (M.W. Technologies, INC, Modelo #: MIH-DX) y todas las formulaciones parecen permanecer claras, incoloras y libres de particulados visibles.

TABLA 8 OD320 Sumario de Estudio de pH SEC-HPLC Cromatogramas representativos de perfiles de elución SEC de rhHNS se muestran en las Figuras 1A-1 C. La muestra de valores de referencia principalmente contiene tres picos con tiempos de retención de ~22 min, ~26 min, y ~32 min, respectivamente. Ocasionalmente, también tiene un pico a ~34 min. El pico principal a ~26 min, se confirmó como un dimero por SEC-LS. Las naturalezas de otros picos son desconocidas.

Los datos de SEC a partir del primer estudio de pH se resumen abajo en la Tabla 9. En total, todas las formulaciones esencialmente tienen poco cambio bajo las condiciones estresadas (50°C) asi como también aceleradas (25°C) y condiciones de almacenaje en tiempo real (2-8°C). Sin embargo, después de 7 días a 50°C, las formulaciones de rhHNS que contienen citrato o fosfato a pH 6-8 generan un pico en alto peso molecular con un tiempo de retención de 16 min. En la formulación de rhHNS que contiene fosfato a pH 7.0, los picos a 16 min principales cuentan para -2% del área total. Sin embargo, la misma formulación preparada en el estudio de intensidad iónica solamente contiene aproximadamente 0.1 %.

TABLA 9 Sumario de datos de SEC-HPLC Data a partir del estudio de pH Para verificar este fenómeno, el estudio de pH en amortiguador de fosfato se repitió durante un amplio intervalo de pHs y los datos de SEC se resumen abajo en la Tabla 100. En este estudio, el pico de 16 min no estuvo presente en el amortiguador a pH 5 después de 7 días a 50°C, pero sin embargo existía en las formulaciones de pH 6-8, el cual incrementa con incremento de pH. Además de polisorbato 20 (0.05%) no afecta significantemente el tamaño del pico a 16 minutos. De manera interesante, a través de la formulación el pH 5 no contiene este pico en las muestras de estabilidad, durante la preparación de dialización de solución salina en pH 5, precipitó una cantidad significante de rhHNS.

TABLA 10 Sumario de Datos de SEC-HPLC a partir del estudio repetido de pH de Amortiguador de Fosfato Los resultados de caracterización preliminar confirman que el pico a 16 minutos tiene un espectro indicativo de proteina la cual, cuando es escalada, se súper impone también dentro del espectro de pico de dímero de rhHNS (Figura 1 D). Cuando se examina por SEC-LS, el pico a 16 minutos exhibe un peso molecular aparente de > 1 MDa. La caracterización adicional puede ser necesaria para entender la naturaleza de este pico.

Actividad Enzimática El sumario de datos de actividad del primer estudio de pH se muestra abajo en la Tabla 5. Bajo condiciones de estabilidad acelerada de 50°C por 7 días, la rhHNS pierde la mayoría de la actividad enzimática en todas las formulaciones que contienen citrato, pH 3-8, mientras las formulaciones de rhHNS que contienen fosfato, pH 7-8, retienen la actividad. A 25°C y 5°C, todas las formulaciones de rhHNS en amortiguadores tanto de citrato como fosfato retienen la mayoría de la actividad. Las formulaciones de rhHNS que contienen citrato pH 3.0, parecen tener valores de actividad total inferiores. Los datos de actividad del estudio de pH repetido en fosfato se resumen en las Tablas 1 y 12. Todas las formulaciones de rhHNS en pH 5-7 retienen 84-100% de la actividad enzimática después de 7 días a 50°C, excepto que la formulación de rhHNS a pH 8.0 pierde 65% de actividad.

TABLA 11 Sumario de Actividad a partir del Primer Estudio de pH TABLA 12 Sumario de Actividad a partir del Estudio Repetido de pH Geles de SDS-PAGE de Formulaciones de HNS a partir del Estudio de pH Geles de SDS-PAGE ejemplares se muestran en las Figuras 2A-2C y Figuras 3A-3C. Geles reducidos a partir del estudio de pH se muestran en las Figuras 2A-2C, y muestran bandas de fragmentación en la formulación que contiene citrato a pH 3. Todas las otras formulaciones de pH 4-8 fueron similares y solamente muestran una banda principal (monómero) de ~60 kDa, excepto algunos de los agregados de alto MW muestran en el pH 8.0 amortiguador de citrato después de 7 días a 40 °C. Las Figuras 3A-3C muestran los geles no reducidos a partir del estudio de pH. Nuevamente, la fragmentación podría ser vista con la formulación de rhHNS que contiene citrato a pH 3.

Con base en estos resultados, es aparente que el dímero nativo de rhHNS es principalmente unido no covalentemente puesto que la presencia o ausencia del agente reductor no afecta la posición de la banda principal. Una banda débil de dímero de 12 kDa, sin embargo, estuvo presente principalmente en las muestras no reducidas sugiriendo que esta banda es un dímero no nativo covalentemente unido. La banda del dímero no nativo fue pronunciada en las muestras de ILC y 25 °C que en las muestras de 40 °C.

Datos de DSC a partir del estudio de pH La Figura 4 muestra la estabilidad térmica dependiente del pH de citrato como se determina por DSC. La temperatura de fusión más alta de rhHNS en citrato fue 90 °C a pH 6.0. Las formulaciones de rhHNS que contienen fosfato mostraron mayor estabilidad térmica a pH 6-7. La temperatura de fusión de rhHNS a cada pH examinado excede 70 °C.

Efecto de Intensidad Iónica en la Estabilidad de rhHNS Turbidez y apariencia Los sumarios de valores OD320 se muestran abajo en la Tabla 13. No hubo ningún cambio observado en la turbidez de las muestras durante el tiempo, y ningún cambio dependiente de la temperatura en los valores. La apariencia de las muestras permanece sin cambio en cada punto de tiempo. Todas las muestras aparecen claras, incoloras, y no partículas visibles TABLA 13 OD320 de Efecto Iónico SEC-HPLC La Tabla 14 muestra el sumario de datos a partir del estudio de efecto iónico. Después de 7 días a 50°C, todas las formulaciones tienen pocos cambios excepto el pico a 16 min. En el amortiguador de citrato, el porcentaje de área del pico a 16 minutos fue entre 0.1 y 0.3 % sin tendencia de incremento o decremento particular con el nivel de NaCl. En el amortiguador de fosfato, sin embargo, hubo un incremento en el porcentaje de pico de 16 minutos a ~ 0.5 % para intensidades iónicas de 50 a 150 mM. Intensidades iónicas superiores e inferiores, el pico de 16 minutos volvió a bajar a ~ 0.1 %.

TABLA 14 Sumario de Datos de SEC-HPLC de Efecto de Intensidad Iónica Actividad Enzimática La Tabla 15 muestra el sumario de datos de actividad de efecto iónico en estabilidad de rhHNS bajo condiciones aceleradas de 7 dias a 50°C. Las formulaciones de rhHNS que contienen citrato retienen solamente 8-30% de actividad, con respecto de la intensidad iónica bajo condiciones aceleradas. Las formulaciones de rhHNS que contienen fosfato con 0-300 mM de NaCI todas muestran actividad total superior retenida bajo condiciones aceleradas, 45-70%.

TABLA 15 umario de Actividad de Estudio de Efecto de Intensidad Iónica SDS-PAGE Las Figuras 6A-6B muestran los geles de SDS-PAGE teñidos con plata de formulaciones de rhHNS a partir de los estudios de efectos iónicos después de 7 días a 50°C. Estos geles se corrieron usando las muestras las cuales se sometieron a ebullición por 10 minutos, de manera que la fragmentación vista en los geles podría ser debido a 10 min de ebullición, puesto que en los estudios subsecuentes, la fragmentación no se observó cuando la rhHNS se sometió a ebullición por 5 minutos.

Las formulaciones de citrato con 0-300 mM de NaCl y formulaciones de fosfato con 0-300 mM de NaCl todas mostraron una banda de monómero primario a 60 kDa. Los controles de lote interno (almacenados a -80°C) de formulaciones de rhHNS parecen mostrar bandas de fragmentos más pronunciados que las muestras mantenidas a 50°C por 7 días. En total, la intensidad iónica no afecta en patrón de bandas en los geles de SDS.

Conclusiones Los resultados de los estudios demuestran que los ensayos que indican estabilidad primaria para las formulaciones seleccionadas son actividad enzimática y HPLC-SEC. Los datos de DSC muestran que la rhHNS tiene la estabilidad térmica más grande con un valor de Tm de ~90°C a pH 6-7. La rhHNS en los amortiguadores de citrato mostró una pérdida significante de actividad bajo condiciones aceleradas a todos los pHs e intensidades iónicas, sugiriendo que el citrato es un amortiguador de formulación inaceptable. Los resultados para fosfato fueron considerablemente mejores, reteniendo la actividad máxima bajo condiciones aceleradas a pH 6-7. Además, las formulaciones de fosfato que contienen 100-150 mM de NaCI mostraron la retención más grande de actividad bajo condiciones aceleradas. El pico de alto peso molecular (16 minutos) en SEC-HPLC, sin embargo, es mínimo a pH 6-8 y a intensidades iónicas de 50-150 mM, bajo condiciones aceleradas.

Experimentos de formulaciones adicionales están en curso para entender mejor las causas del pico a los 16 minutos. Además, los estudios están en curso para comparar la estabilidad de las formulaciones de fosfato con formulaciones de salina sin amortiguador, y la estabilidad de concentraciones de proteína baja contra alta.

EJEMPLO 2 Formulación líquida para RHHNS Los experimentos en este ejemplo se diseñaron para optimizar la estabilidad de las formulaciones de rhHNS propuestas para suministro ¡ntratecal. Como se describe en la presente, el suministro de fármaco intratecal requiere una pequeña cantidad de volumen líquido inyectado, y consecuentemente, es necesaria una solución de proteína altamente concentrada. Sin embargo, la rhHNS típicamente tiene un perfil de carga heterogénea con un intervalo de punto isoeléctrico de 5.1 a 6.5, el cual impacta su solubilidad. Los estudios en el presente ejemplo proporcionan información en el efecto de pH y concentración de cloruro de sodio en la solubilidad del producto de rhHNS.

Como se puede ver en las Figuras 7A-7B, el incremento de pH o concentración de sal (por ejemplo, cloruro de sodio) resultó en solubilidad de rhHNS incrementada. El estado nativo de rhHNS se analizó por ultracentrifugación analítica (AUC) de rhHNS formulada con concentración de sal variante (145 mM ó 300 mM). Como se puede ver en las Figuras 8A-8B, la rhHNS contiene moléculas homogéneas y mantiene la misma estructura de concentración de sal de 145 mM a 300 mM a pH 7. Tomados juntos, estos resultados indican que el incremento en concentración de NaCI conduce a solubilidad incrementada de rhHNS.

Se identificaron dos formulaciones líquidas para el estudio adicional, que incluyen una formulación líquida alta en sal (15 mg/mL de rhHNS, 175 mM de NaCI, 5 mM de fosfato, 0.005% de polisorbato 20, pH 7.0); y una formulación que contiene sacarosa (15 mg/mL de rhHNS, 2% de sacarosa, 145 mM de NaCI, 5 mM de fosfato, 0.005% de polisorbato 20, pH 7.0.

EJEMPLO 3 Formulación liofilizada para RHHNS Los experimentos en este ejemplo se diseñaron para optimizar las formulaciones de liofilización y condiciones para rhHNS. En particular, estos estudios proporcionan información en el efecto de formulación en la estabilidad del producto, que incluyen apariencia de la torta liofilizada, actividad enzimática de rhHNS e integridad química del producto liofilizado.

Se formuló rhHNS en varias formulaciones liofilizadas a base de fosfato. Se examinaron los siguientes parámetros de formulación: (1 ) Agente estabilizante: Glucosa (0.5-1 %) o Sacarosa (1-1 .5%); y (2) Tensoactivo: Polisorbato 20 (0.02-0.005%). Los siguientes parámetros se usaron en todas las formulaciones probadas: (3) 15 mg/mL de rhHNS; (4) 145 mM d NaCI; (5) 5 mM de fosfato; (6) pH 7.0.

Formulaciones ejemplares se liofilizaron de conformidad con las condiciones en la Tabla 6: TABLA 16 Ciclo de Liofilización Ejemplar Se observó que las formulaciones que contienen glucosa tienen tiempos de reconstitución largos (>30 minutos), aunque la estabilidad química se mantiene (datos no mostrados).

Las formulaciones liofilizadas de rhHNS que contienen 1 % de sacarosa tienen dados de 15 meses a 2-8°C y datos de 3 meses a 25°C/40°C (como se muestra abajo en la Tabla 17), mostrando < 1% de cambio en SEC, RP y SDS-PAGE.

TABLA 17 Estabilidad de formulación liofilizada al 1% de sacarosa Formulaciones liofilizadas de rhHNS que contienen 1.5% de sacarosa tienen datos de 14 meses a 2-8°C y datos de 3 meses a 25°C (como se muestra abajo en la Tabla 18), mostrando= 0.2% de cambio en SEC, P, y SDS-PAGE.

TABLA 18 Estabilidad de formulación liofilizada a 1.5% de sacarosa Las tortas liofilizadas se observaron para determinar la apariencia e integridad de la torta (por ejemplo, retro-fusión). Como se puede ver en la Figura 9A, las tortas liofilizadas formuladas con 1.5% de sacarosa tienen más encongimiento de la torta que aquellas formuladas con 1.0% de sacarosa. Las tortas liofilizadas formuladas con 1.5% de sacarosa también fueron más sensibles a diferentes unidades de liofilización, tales como las unidades VirTis contra la unidad LyoStar (Figura 9B).

Una serie de experimentos separados confirma que el incremento de sacarosa causa encogimiento incrementado de la torta, como se indica en la Tabla 19 abajo.

TABLA 19 Comparación de Estabilidad de rhHNS y Apariencia de la Torta a Varias Sacarosas Tomados juntos, estos datos demuestran que un incremento en la concentración de sacarosa en formulaciones liofilizadas de rhHNS se correlacionan con un incremento en la estabilidad así como también un incremento en el encogimiento de la torta liofilizada.

Se observaron formulaciones liofilizadas reconstituidas para determinar la presencia de partículas por Formación de Imagen Micro-Flow (MFI). Las imágenes de partículas ejemplares se representan en la Figura 10. Como se puede ver en la Figura 10, se observaron partículas grandes después de la reconstitución de formulaciones liofilizadas que contienen ya sea 1 % y 1.5% de sacarosa después del almacenaje.

Se observaron formulaciones preliofilizadas para determinar la presencia de partículas después de filtración a 0.22 um. Como se puede ver en la Figura 1 1 , la presencia de polisorbato 20 (P20) previene floculantes similares a la proteína que se generaron sin P20 después de la filtración con 0.22 µp? De este modo, el P20 es efectivo para prevenir la formación de partículas y/o proteger la proteína de rhHNS durante la filtración. Estudios adicionales muestran que la presencia de P20 fue efectiva para reducir la presencia de partículas inducidas por congelación-descongelación así como también partículas inducidas por liofilización en formulaciones de rhHNS (datos no mostrados).

Condiciones de Liofilización Se estudiaron condiciones del ciclo de liofilización para determinar el efecto en formulaciones liofilizadas con rhHNS. Por ejemplo, se variaron las temperaturas de secado primario de -38°C a -20X, y la estabilidad de formulaciones liofilizadas de rhHNS se determinó por actividad de la enzima, SEC, RP y apariencia de la torta. Resultados ejemplares de estos análisis se muestran en la Tabla 20 abajo.

TABLA 20 Efecto de Secado Primario en Formulaciones liofilizadas al 1.5% de Sacarosa Como se puede ver, no se observó diferencia significante en el perfil de estabilidad dentro de un rango de temperatura de secado primaria de -38C a -20C. La apariencia de la torta liofilizada mostró encogimiento incrementado de la torta a una temperatura de secado primario de -20°C. Resultados similares también se observaron en formulaciones liofilizadas que contienen 1.25% y 1 .0% de sacarosa (datos no mostrados).

EJEMPLO 4 Administración intratecal crónica de heparan n-sulfatasa Este ejemplo demuestra que la administración intratecal se puede usar para suministrar efectivamente una enzima lisosomal, tal como heparan N-sulfasa humana recombinante (rhHNS), en tejidos del cerebro para el tratamiento de los síntomas neurológicos de mucopolisacaridosis MIA (MPS MIA; síndrome de Sanfilippo), la característica clínica que define este trastorno. Los experimentos descritos en este ejemplo demuestran que la administración IT crónica de rhHNS es bien tolerada con actividad enzimática relacionada a la dosis detectada en el cerebro, médula espinal e hígado.

En resumen, una formulación intratecal (IT) de heparan N-sulfatasa (rhHNS) humana recombinante se ha desarrollado para el tratamiento de los síntomas neurológicos de mucopolisacaridosis MIA (MPS III A; síndrome de Sanfilippo), la característica clínica que define este trastorno. Ya que la edad promedio de pacientes con MPS MIA es 4.5 años, los estudios toxicológicos esenciales para rhHNS se condujeron en monos cinomólogos juveniles para evaluar los efectos en el cerebro en desarrollo. Los monos son implantados con un dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IT)-lumbar y dosificados cada semana por infusión rápida (1.5, 4.5 ó 8.3 mg/dosis de rhHNS por 6 meses; 12 dosis), con el dispositivo y controles de vehículo que recibieron salina amortiguada de fosfatasa o vehículo, respectivamente. Ocho animales por grupo (4/sexo) se sometieron a necropsia a 3 y 6 meses (grupo control de dispositivo sometido a necropsia a los 3 meses) y 8 animales del grupo de vehículo y los 3 grupos de dosis rhHNS se sometieron a necropsia a 1 mes después de la dosis IT final. No se observaron signos clínicos relacionados a rhHNS o lesiones del sistema nervioso central grueso. Comparado a los controles, existen infiltrados celulares de severidad media ligera a mínima en las meninges/perineurio que rodean al cerebro/médula espinal correlacionado con incremento temporal en leucocitos del fluido cerebroespinal (CSF), predominantemente eosinófilos, los cuales ampliamente resuelven la dosis post-final de 1 mes. Estos cambios no están asociados con cualquiera de los cambios morfológicos secundarios en el cerebro o médula espinal. Parecen ser una dosis relacionada que tiende hacia niveles rhHNS de CSF medios mayores y en niveles de actividad rhHNS del tejido en el cerebro, médula espinal e hígado. El nivel de efecto secundario no observado es 8.3 mg/dosis proporcionado cada semana, la mayor dosis administrada, indicando que rhHNS puede ser seguramente administrado intratecalmente a varias concentraciones incluyendo concentraciones mayores que 8.3 mg/dosis.

Síndrome de Enfermedad de Sanfilippo A Mucopolisacaridosis tipo IIIA (MPS IIIA; Enfermedad de Sanfilippo A), un trastorno de almacenamiento lisosomal rato que afecta a aproximadamente 1 en 100,000 personas en el mundo, los resultados de la ausencia o deficiencia de la función de heparan N-sulfatasa (HNS) (Neufeld EF, et al. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001 ) pp. 3421 -3452), una exosulfatasa involucrada en el catabolismo lisosomal de heparan sulfato de glicosaminoglicano (GAG). En la ausencia de esta enzima, heparan sulfato de GAG acumulado en lisosomas de neuronas y células glial, con menor acumulación fuera del cerebro. La definición de característica clínica de este trastorno es la degeneración del sistema nervioso central (CNS), lo cual resulta en pérdida de, o falla para lograr, un mejor desarrollo de hechos memorables. El deterioro cognitivo progresivo termina en demencia y mortalidad prematura.

Suministro IT de rhHNS Ya que la edad promedio de pacientes con MPS IIIA es 4.5 años, estudios toxicológicos esenciales para rhHNS se conducen en monos cinomólogos juveniles (selección de especie en base a similitud genética y anatómica a humanos) para evaluar los efectos en el cerebro en desarrollo. La edad equivalente de monos a humanos como se cita en la literatura baria de 7.6 meses a 12.1 meses para niños de 30 ó 40 meses de edad (Hood RD, Developmental and Reproductive Toxicology: A practical approach (2006) p. 276). Como parte de este esfuerzo, se condujo un estudio toxicológico de 6 meses en monos cinomólogos juveniles para evaluar la administración IT lumbar de rhHNS. Los datos obtenidos a partir de un estudio previo de toxicidad en monos cinomólogos juveniles de 1 mes que guía la selección del nivel de dosis y diseño del estudio en monos cinomólogos juveniles con dosis repetidas de 6 mese. Basados en datos conocidos a la fecha, este primer estudio que involucra la administración IT crónica de ERT en primates no humanos juveniles.

Se usaron monos cinomólogos (Macaca fascicularis) juveniles 56 machos y 56 hembras d aproximadamente 6 a 9 meses de edad y pesando 0.82 a 1.8 kg en este estudio. Los monos son alimentados con 15 galletas de Dieta para Primate Certificada 5048 MPI (Richmond, IN) diariamente. Se proporcionó agua ad libitum por medio de un sistema de agua automático filtrado y se retienen durante el periodo de recolección de orina. Los monos son alojados por grupos (dos por jaula) por 2 a 4 semanas en jaulas de acero inoxidable hasta llegar con la excepción de los monos de 3 meses, todos los monos son alojados en jaulas de acero inoxidable individuales en cuartos con temperatura y humedad controladas con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

Antes del inicio del estudio, todos los monos son implantados quirúrgicamente con puertos SC y catéteres IT. Se les administró succinato de prednisolona de sodio (IV, 30 mg/kg) y fluxin meglumina (intramuscular [IM], 2 mg/kg) antes de la cirugía. Los monos son pretratados con sulfato de atropina SC (0.04 mg/kg), sedados con HCI de cetamina IM; 8 mg/kg); entubados, y mantenidos a aproximadamente 1 l/min de oxigeno e isoflurano al 2.0%. Se realizó una incisión sobre el proceso dorsal de la espina lumbar (U, L5 ó Le) y se realizó una hemilaminectomia para la inserción de un catéter de poliuretano ahusado (25 cm en longitud, 0.9 mm de diámetro externo x 0.5 mm de diámetro interno, con seis perforaciones laterales de 0.33 mm de diámetro) en L3, L4 o L5. El catéter se insertó a través de una incisión dural pequeña y se hizo avanzar aproximadamente 10 cm anterógrada al área de la articulación toracolumbar. Se unió un puerto SC de titano al catéter IT y se implantó en el tejido SC. Se confirmó la colocación apropiada del catéter por mielograma usando lsovue-300 (0.8 mi; Braceo Diagnostics, Inc., Princeton, NJ). Después de la recuperación de la cirugía, los monos recibieron tartrato de butorfanol (IM, 0.05 mg/kg) y ceftiofur sodio (IM, 5.0 mg/kg dos veces al día por 2 días).

En este ejemplo se proporcionó rhHNS en un vehículo de formulación IT que incluye fosfato de sodio 5 mM, cloruro de sodio 145 mM y polisorbato 20 al 0.005% (pH 7.0). Se administraron dosis E0W de rhHNS como una infusión rápida durante aproximadamente once minutos: 0.6 mi (4 minutos) seguido con un enjuague con 0.5 mi de salina amortiguada de fosfato (PBS) (7 minutos). Los monos en el grupo de control con vehículo recibieron solo la formulación IT; los monos DC recibieron PBS (pH 7.2) IT.

Morbidez y Mortalidad No existen muertes relacionadas con rhHNS o sacrificios tempranos. No se notaron signos clínicos relacionados a rhHNS en la dosificación o durante las observaciones diarias. Extravío, prurito, temblores y ataxia observadas durante y después de ser resuelto dentro de unos pocos minutos a aproximadamente 4 horas de administración y se consideraron que responde en relación al volumen en lugar de una reacción a rhHNS o al vehículo. Se observaron signos clínicos durante e inmediatamente después que la dosificación se observó en una incidencia comparable en grupos de control (grupo dosificado con el vehículo y/o DC); no hay evidencia de una respuesta a la dosis. En general, la incidencia de signos clínicos en dosificaciones disminuidas con cada dosis subsecuente. No hay cambios relacionados a rhHNS en peso corporal, consumo de alimento y descubrimientos físicos y neurológicos, o alteraciones en ECG o exámenes de oftalmología.

Patología clínica No hay cambios considerados que se relacionan a rhHNS en parámetros hematológicos, química de suero, coagulación o análisis de orina en cualquier intervalo.

Conteo y química de célula CSF Existe incremento relacionado a la dosis en conteos de leucocito CSF para todos los grupos, que incluyen los grupos DC y 0 mg/dosis, 24 horas post-dosis. Existe un incremento general en conteos de leucocitos con cada dosis administrada. La recolección de CSF a partir de aproximadamente la mitad de los monos previo a la dosificación muestra que estos efectos han sido abatidos en las 2 semanas desde la dosis previa. Después de la dosis 5, además a un incremento en leucocitos, se observaron mayor proteína total CSF media y albúmina por grupo para los machos dosificados con rhHNS en los grupos de 4.5 y 8.3 mg/dosis (hasta 4- a 5 veces) comparado con la predosis media (P < 0.05 contra el DC y el grupo de 0 mg/dosis); es evidente menos de una tendencia en los grupos dosificados con rhHNS de hembras.

Concentraciones de rhHNS y análisis de anticuerpo Típicamente, los niveles de rhHNS medios en suero son < limite de detección (LOD) para todos los grupos de prueba para todos los puntos de tiempo. La concentración de rhHNS en CSF de monos en el grupo de control dosificado con DC y vehículo está generalmente por debajo del límite de cuantificación (LOQ). A pesar que no se realizan análisis estadísticos, parece ser una tendencia relacionada con la dosis hacia niveles de rhHNS medios mayores en CSF en los grupos 1.5, 4.5 y 8.3 mg/dosis. Los niveles de rhHNS medios de CSF en predosis son significativamente menores que los niveles de CSF postdosis. Las concentraciones medias de rhHNS para el cohorte de 6 meses (ambos sexos) en el término del estudio (necropsia principal y de recuperación) son resumidos en la Tabla 21. En un nivel de dosis proporcionado, las concentraciones medias de rhHNS en el CSF parecen ser mantenidas en el mismo intervalo (Figura 12A) a pesar de los niveles de anticuerpo anti-HNS en el suero y CSF, lo cual continúa para elevarse a través del estudio.

TABLA 21 Concentraciones de rhHNS de CSF al término del estudio (necropsias principal y de recuperación) CSF, fluido cerebroespinal; HNS heparan N-sulfatasa humana; n = número de muestras por debajo de LOQ; IT, intratecal; SD, desviación estándar. a = muestras recolectadas aprox. 24 horas postdosis NA = muestras no disponibles para análisis o muestras por debajo del LOQ.

En el cohorte de recuperación de 6 meses, ninguno de los monos en el grupo de control del dispositivo (PBS solamente) o aquellos dosificados con el vehículo que desarrolla anticuerpos anti-HNS en suero o CSF en cualquier punto de tiempo probado. Todos los monos en los grupos de 1.5, 4.5 y 8.3 mg/dosis probaron ser negativos (<LOD) para anticuerpos anti-HNS en suero y se recolectaron muestras de CSF para pre-estudio (para CSF) y en predosis 2. Para el final del estudio, todos los monos probaron ser positivos para anticuerpo anti-HNS en suero.

Todos los monos en los grupos de 1.5 mg/dosis y 8.3 mg/dosis y seis de ocho monos en el grupo de 4.5 mg/dosis probaron ser positivos para anticuerpos anti-HNS en el CSF e uno o más puntos de tiempo. Ya que dos monos en el grupo de 4.5 mg no tienen muestra recolectada en cualquier punto de tiempo incluyendo necropsia, estos resultados puede parecer que indican que todos los monos dosificados con rhHNS produce una respuesta del anticuerpo.

En todos los tres niveles de dosis, se detectaron concentraciones de anticuerpo anti-HNS en suero después de la dosis 2, y los niveles se incrementaron marcadamente después de la dosis 4. A pesar que no se realizaron análisis estadísticos, parecen ser una tendencia relacionada a la dosis hacia altas concentraciones del anticuerpo en suero; para el final del estudio, los niveles son comparables a través de los 3 grupos de dosis rhHNS (Figura 12B). Los niveles de anticuerpo anti-HNS en el suero son siempre mayores que en el CSF sobre el tiempo transcurrido de este estudio (concentraciones de anticuerpo en suero/CSF de 9 a 236 veces); las mayores proporciones de concentraciones suero a CSF (98 y 236 veces) se observan a un nivel de dosis de 8.3 mg en el curso más temprano de dosificación (6 y 10 semanas).

Las concentraciones del anticuerpo anti-HNS en el suero se incrementa 9, 16 y 16 veces a niveles de 1.5 mg, 4.5 mg y 8.3 mg/dosis, respectivamente, en el tiempo más temprano de dosificación (de la semana 6 a la semana 14). Durante el mismo periodo de tiempo, las concentraciones del anticuerpo CSF se incrementan 30, 40 y 52 veces a niveles de 1.5 mg, 4.5 mg y 8.3 mg/dosis, respectivamente (Figura 2B), niveles sustanciales restantes después de la fase de recuperación libre de dosis de 1 mes (Tabla 22) TABLA 22 Concentración de anticuerpo anti-HNS en CSF al término del estudio Necrops ia Principal3 Necrops ia de Recuperación Grupo n Media ± SD (ng/mL) n Media ± SD (ng/mL) Vehículo 8 - 8 - 1 .5 mg IT 8 351 ,456 ± 244, 1 71 8 299,512 ± 226,654 4.5 mg IT 7 147, 187 ± 213,095 7 193,045 ± 1 57,896 8.3 mg IT 8 185,227 ± 3 15,858 8 238,727 ± 185,785 CSF, fluido cerebroespinal, HNS heparan N-sulfatasa humana; IT, intratecal; n, número de muestras por debajo del limite de cuantificación; SD, desviación estándar. a Muestras recolectadas aproximadamente 1 semana antes de la dosificación.

Los anticuerpos anti-HNS aparecieron más tarde en el CSF que en el suero (Figura 12C). No se observaron diferencias aparentes relacionadas a la dosis de concentraciones del anticuerpo en el suero o CSF (análisis estadístico no se realizó debido a tamaño de muestras pequeña); no hay diferencias observables entre macos y hembras en respuestas del anticuerpo.

En la presencia del anticuerpo anti-HNS en el CSF, las concentraciones medias de rhHNS en el CSF parecen ser mantenidas, lo que sugiere que la presencia de anticuerpos anti-HNS en el suero y CSF no altera el nivel de concentración del rhHNS dosificado con IT. El análisis del cohorte recuperación de 6 meses de la administración de dosis repetida de 6 meses de rhHNS indica que las concentraciones del anticuerpo anti-HNS para los monos sacrificados de cohorte de 6 meses e interino 3 meses son comparables (Figura 12C).

Grosor y Descubrimientos histopatolóqicos En todos los niveles de dosis (aunque no todos los intervalos de sacrificio, específico del género, ni en una manera relacionada con la dosis), infiltrados eosinofílicos (Figuras 3A-13F) está presentes en el parénquima del cerebro (predominantemente materia gris), médula espinal (materia blanca y gris), raíz/ganglio del nervio de la espina dorsal y el ganglio trigémino (solamente machos con la mitad de dosis) (Figuras 13A-13E). Los infiltrados parecen ser secundarios a los infiltrados meníngea/perineurio y/o por la presencia de (penetración por) rhHNS dentro del parénquima del tejido. A pesar que hay numerosos cambios de tipo inflamatorio, los monos parecen tolerar la administración de rhHNS y ninguno de los infiltrados son considerados por estar relacionados a o que causan cambios morfológicos secundarios en el parénquima del sistema nervioso. Específicamente, no hay evidencia de necrosis/degeneración neuronal y no hay respuesta glial relacionada con la administración de rhHNS.

La microgliosis en la materia gris del cerebro y médula espinal, en asociación con infiltrados celulares, predominantemente eosinofílico, es relativamente común en un estudio de toxicidad en monos juveniles de 1 mes previamente realizado; estos cambios son relativamente poco comunes por el sacrificio interino de 3 meses en el estudio de 6 meses, pero la evidencia residual de esta respuesta puede aún observarse en el cohorte de 6 meses (Figura 13F). Las reacciones de microglial tienden a ser un evento relativamente temprano en la reacción a algunos artículos de prueba (típicamente en base a la proteína) centralmente administrados (o centralmente reactivo). Los infiltrados eosinofílicos están correlacionados con un número incrementado de eosinófilos en el CSF de monos dosificados con rgHNS, a pesar que las células no están presentes en números suficientes para provocar una reacción secundaria.

En todos los niveles de dosis, se observaron infiltrados eosinifilicos en las raíces/ganglio del nervio de la espina dorsal para la mayoría de los grupos dosificados con rhHNS, sin tener en cuenta el género. Los infiltrados en los variados tejidos del sistema nervioso parecen ser secundarios a los infiltrados meningeal/perineurio y/o a la presencia de (penetración por) rhHNS dentro del parénquima del tejido. En los monos de sacrifico por recuperación, los efectos relacionados a rhHNS están generalmente ausentes o reducidos a niveles de control. Algunos cambios, tal como microgliosis en la médula espinal, están completamente resueltos después del periodo de recuperación. Ninguno de los cambios relacionados a rhHNS parecen estas asociados con cualquiera de los cambios microscópicos estructurales secundarios en el cerebro o médula espinal. No se ha notado necrosis neural en el cerebro, médula espinal o ganglio.

La degeneración de la fibra del nervio y gliosis en la médula espinal parecen ser secundarios a la colocación y/o presencia del catéter IT. Estos cambios fueron relativamente similares entre los grupos dosificados con rhHNS y de control. En las raíces del nervio espinal, la hiperplasia de células de Schwann (la célula mielinante del sistema nervioso periférico) y degeneración de fibra nerviosa estuvieron presentes en tanto monos de control como dosificados con rhHNS. Estos cambios fueron debido al daño a una o más raíces del nervio espinal al tiempo de la colocación del catéter.

Actividad enzimática de HNS En los cohortes de recuperación de 6 meses, la actividad enzimática de rhHNS en la médula espinal y cerebro del grupo dosificado con el vehículo (0.0-0.154 mol/hr/mg de proteina) son similar a los niveles mostrados en los tejidos del cohorte interino de 3 meses (0.0-0.154 nmol/hr/mg de proteína). Los niveles de actividad enzimática en la espina son elevados (aproximadamente una orden de magnitudes elevadas en la espina lumbar) que los niveles medidos en el cerebro o hígado, los grupos de 4.5 mg y 8.3 mg/dosis que tienen niveles similares. La actividad enzimática de rhHNS es cortes de la médula espinal varía de 3.9-18.6, 13.1-67.1 y 3.6-69.2 nmol/hr/mg de proteína en machos (Figura 14A) y 1.8-16.2, 4.5-61.2 y 21.2-66.0 nmol/hr/mg de proteína en hembras (Figura 14B) para los grupos de 1.5, 4.5 y 8.3 mg/dosis, respectivamente. En el tejido espinal después de un periodo de recuperación de 1 mes, los niveles de actividad enzimática regresaron a los niveles consistentes con los valores del control con vehículo.

La actividad enzimática de RHHNS en cortes del cerebro varía de 0.03-16.0, 0.30-55.7 y 0.15-21.2 mol/hr/mg de proteína en machos (Figura 14C), y 0.04-5.1 , 0 0-14.4 y 0.9-33.2 nmol/hr/mg de proteína en hembras (Figura 14D) para los grupos de 1.5, 4.5 y 8.3 mg/dosis, respectivamente. En el tejido del cerebro después de la recuperación, los niveles de actividad enzimática regresan a niveles consistentes con los valores de control.

El cambio de veces en la actividad para diferentes áreas del cerebro comparadas con niveles endógenos (grupo DC) se muestra en la Figura 15A. A pesar que tiende hacia una distribución incrementada se nota en las muestras de superficie, rhHNS administrado por lumbar-IT se puede mostrar por penetrar a áreas periventriculares del cerebro.

En los cohortes cohorte/recuperación de 6 meses, los niveles de actividad media son 0.50, 2.41 y 6.65 nmol/hr/mg de proteina en machos y 1.04, 4.15 y 7.62 nmol/hr/mg de proteina en hembras para los grupos de 1.5, 4.5 y 8.3 mg/dosis, respectivamente (Figura 15B). Los niveles en los monos de control con vehículo son 0.089 nmol/hr/mg de proteína para machos y 0.083 nmol/hr/mg de proteína para hembras. Después del periodo de recuperación, los niveles de actividad de rhHNS en el hígado son comparables con los niveles de control de la linea base para todos los grupos dosificados.

Inmunohistoquímica El suministro de rhHNS al CNS por medio de inyección IT de bolo en cohortes de recuperación de 6 meses e interino de 3 meses resulta en el suministro del artículo de prueba a los tejidos pia-araquinoideos de la médula espinal y cerebro. En los monos que han recibido rhHNS por IT, el material inmunorreactivo está consistentemente presente en macrófagos meníngea y perivasculares (cerebro/médula espinal) y variablemente presentes en la población de célula glial y neuronal adyacente. La carencia de teñido en los monos de control dosificados con vehículo (Figura 16A) demuestra la especificidad del anticuerpo a rhHNS humano. Generalmente, la inmunorreactividad está relacionada con la dosis (es decir, usando una escala de clasificación semi-cuantitativa, se notó incremento del teñido inmunohistoquímico en una manera generalmente dependiente de la dosis). Se suministró HNS al CNS por medio de IT del bolo resultando en inmunoteñido positivo en la corteza cerebral y cerebelo (Figura 16B-16D); sin embargo, la inmunorreactividad no es consistentemente evidente en la región caudada/putamen, mesoencéfala o regiones más profundas del puente de Varolio o médula. La inmunorreactividad es evidente en los hígados (en células sinusoidales de lignina incluyendo células Kupffer, pero no en hepatocitos) de todos los monos administrados con rhHNS. La inmunorreactividad no es evidente en una hembra sacrificada tempranamente (grupo de 4.5 mg/dosis) debido a un catéter con fuga que no puede ser reparado.

En el grupo de 1.5 mg/dosis, es evidente la recuperación esencialmente evidente con la excepción del hígado y las meninges del cerebro y médula espinal en donde es evidente alguna inmunorreactividad residual. A altas dosis (4.5 y 8.3 mg/dosis), la intensidad e incidencia de inmunorreactividad son tan bajas como al final de la dosificación. En todos los niveles de dosis, los niveles de rhHNS en la médula espinal, cerebro e hígado aproximados a aquellos que aparecen en los controles dosificados con vehículo después del periodo de recuperación de 1 mes.

Discusión En este estudio, el suministro de EOW de rhHNS administrado por IT durante 6 meses es generalmente bien tolerado. No se observan cambios remarcables en peso corporal, estado clínico, examen oftalmológico/neurológico/fisico, ECGs, pesos de órganos o apariencia del órgano grueso. Los descubrimientos son limitados por cambios temporales en patologías clínicas de CSF acompañados con infiltrados meníngeos ligeros o medios e inflamación epidural, con inversión casi completa en todos los grupos de dosis elevadas después del periodo de recuperación. Se observó la distribución amplia de rhHNS a través del cerebro y médula espinal.

La administración por IT de EOW de rhHNS provocó una respuesta inflamatoria caracterizada por infiltración de leucocito residual y efusión de albúmina notada a las 24 horas post dosis y en la necropsia. Sin que se desee estar unido por cualquier teoría particular, esto presumiblemente refleja una apertura temporal, localizada e incompleta de BBB relacionado a los cambios en las uniones estrechas cerca de la punta del catéter, resultando en entrada de leucocitos y proteínas de plasma en el CSF (Simard J , et al. Lancet Neurol. (2007) 6, 258-268; Stamatovic SM, et al. Curr. Neuropharmacol. (2008)6, 179-192). Esto puede resultar en dos componentes: uno relacionado a los procedimientos o volumen de administración de la dosis y otro relacionado a administración por IT de una proteína.

Los cambios temporales en permeabilidad de BBB (diferencias no significantes entre grupos de dosis y controles a 24 horas postdosis en la necropsia principal), no están acompañados por cualquiera de los signos clínicos.

Parece haber una tendencia relacionada con la dosis ara niveles medios rhHNS de CSF elevados; en un nivel de dosis proporcionado, las concentraciones medias de rhHNS en el CSF parecen ser mantenidas en el mismo intervalo a pesar del incremento de niveles de anticuerpo anti-HNS en el suero y CSF.

Se observó infiltración celular meníngeo de severidad media ligera a mínima en los cerebros y médulas espinales de monos juveniles dosificados con rhHNS. Este cambio microscópico también es notado en controles dosificados con vehículo, indicando que algo de la respuesta está relacionado a la colocación del catéter IT, asi como también a una respuesta inflamatoria no específica a proteína extraña. La introducción de un biológico/proteína en el espacio IT, especialmente uno que penetra el CNS, casi siempre provocan algún grado de respuesta inflamatoria (Hovland DN, et al. Toxicol. Pathol. (2007) 35, 1013-1029; Butt MT, Toxicol. Pathol. (201 1 ) 39, 213-219), la cual si está presente en números que dañan el tejido adyacente, puede estar presente un efecto secundario. En el estudio actual, sin embargo, estas células (predominantemente eosinófilos) parece que representan un marcador de reacción/penetración del tejido y no se encontró en cantidades suficientes para calificar como un efecto secundario. Ninguno de los cambios relacionados a rhHNS parece estar asociados con cualquiera de los cambios microscópicos estructurales secundarios en el cerebro o médula espinal. No se notó necrosis neuronal en el cerebro, médula espinal o ganglios.

Hubo cambios en los tractos dorsales de la médula espinal asociados con el dispositivo de suministro de fármaco en algunos monos que incluyen degeneración de fibra nerviosa, fibrosis del tracto del catéter, y compresión de la médula espinal; ninguno de estos cambios fueron considerados por estar relacionados con la rhHNS en que ocurrieron en proximidad al catéter IT. El dispositivo de suministro de fármaco lumbar IT no fue específicamente diseñado para implantación IT en monos juveniles, los cuales tienen un espacio IT más pequeño que los humanos. Un análisis en restrospectiva de datos de evaluación microscópica de animales de control (dispositivo y/o dosificados con salina) en estudios de IT concluye que se observa algún grado mínimo de infiltración meningeal e inflamación asociada con el tracto del catéter, fibrosis, y gliosis, y degeneración de la fibra del nervio de la médula espinal (Butt MT, Toxicol. Pathol. (201 1 ) 39, 213-219).

La evaluación de anticuerpos anti-artículo de prueba es un aspecto importante de los estudios de toxicidad debido al potencial impacto de anticuerpos neutralizantes o de enlace en la separación o biodistribución del artículo de prueba (Ponce RP, et al. Regul. Toxicol. Pharmacol. (2009) 54, 164-182). En este estudio, ya que los niveles cuantitativamente similares y relacionados con la dosis de la actividad enzimática de rhHNS se notan en el cerebro y médula espinal de los cohortes de 6 meses e interino de 3 meses, y concentraciones medias de rhHNS en el CSF parecen ser mantenidas en el mismo intervalo a pesar del incremento de niveles de anticuerpo anti-HNS en el suero y CSF, se concluye que no se observó actividad neutralizante.

Parece haber una tendencia relacionada a la dosis hacia altos niveles de actividad enzimática de rhHNS en la médula espinal, cerebro e hígado, que es mayor cerca del sitio de inyección en la región lumbar de la médula espinal y uniforme en el cerebro, sin diferencias significantes rostral a caudal y entre los hemisferios derecho e izquierdo. No se notó evidencia para acumulación de rhHNS en el tejido del cerebro y médula espinal del cohorte de 6 meses comparado con el cohorte interino de 3 meses. A pesar que no se notó de la tendencia hacia la distribución incrementada en las muestras de superficie, rhHNS administrado por lumbar-IT para penetrar áreas periventriculares, profundas del cerebro. La actividad enzimática de rhHNS en el hígado sugiere que el rhHNS redistribuido sistemáticamente después del suministro por IT; no se observaron efectos secundarios relacionados con rhHNS en el hígado después de la evaluación de parámetros patológicos clínicos y anatómicos en los estudios de toxicidad esencial.

En general, los resultados de inmunohistoquimica corroboran la actividad enzimática del tejido en que se observó inmunorreactividad relacionada con la dosis en la médula espinal y meninges pia-araquinoideas del cerebro en los tejidos nerviosos (neuronas, células glial) en la cercanía intermedia de las meninges. Existe buena penetración de la materia gris del cerebro y cerebelo después de inyección IT de bolo o infusión IT rápida. A pesar que no es evidente la inmunorreactividad en estructuras más profundas tal como los ganglios básales o regiones centrales del tálamo/hipotálamo, mesoencefálica o puente de Varolio/médula, los resultados de actividad enzimática indican que el rhHNS administrado o lumbar-IT penetra áreas periventriculares, profundas del cerebro. Así, la inmunohistoquimica puede ser una técnica menos sensible para detectar la biodistribución de un artículo de prueba. La inmunorreactividad es evidente en células Kupffer y las células endoteliales (células capaces de fagocitosis) del hígado, pero no las células parenquimales (hepatocitos).

Son comparables los análisis del cohorte de recuperación de 6 meses del estudio de toxicidad IT de dosis repetida de 6 meses en monos juveniles indican que los cambios relacionados a rhHNS en monos sacrificados de 6 meses e interino de 3 meses, incluidos en parámetros en vida, patología clínica y anatómica, concentraciones de rhHNS y anticuerpos anti-HNS en CSF y suero, y distribución/localización subcelular de rhHNS en la médula espinal, cerebro e hígado. En los monos sacrificados de recuperación, los efectos por rhHNS están ya sea ausentes o significativamente reducidos. Así, el nivel de efecto secundario no observado para el estudio en monos juveniles de 6 meses fue 8.3 mg/dosís, la dosis más alta administrada.

Se monitorearon cambios en celularidad de CSF y las concentraciones de proteína parecen estar correlacionadas de forma exacta a los cambios morfológicos notados en una evaluación hístopatológica y pueden ser útiles en pacientes tratados por IT con rhHNS; estos cambios son considerados ser una reacción esperada a una proteína administrada por IT y son ampliamente resueltas después del periodo de recuperación. Estos datos a partir de modelos anímales proporcionan confianza para perseguir la terapia IT como una estrategia del tratamiento para las manifestaciones neurológicas de enfermedades de almacenamiento lisosomal. Este estudio toxicológico en primates no humanos juveniles demostró la factibilidad y tolerabilidad de la administración de rhHNS por medio de un dispositivo de suministro del fármaco IT-lumbar a pacientes pediátricos. La patología del CNS no adversa y la carencia de signos clínicos adversos han soportado la reciente aprobación del informe de producto médico de investigación e indica que el rhHNS administrado por IT puede con seguridad y efectividad tratar los síntomas del CNS del síndrome de Sanfilippo A.

Se proporcionan debajo materiales y métodos ejemplares usando en varios experimentos descritos en este ejemplo.

Diseño del Estudio y dosificación de rhHNS Los monos se seleccionaron al azar en cinco grupos de tratamiento; grupo 1 sin tratamiento (control de dispositivo implantado [DC], puerto y catéter) y no se dosificó con el vehículo o articulo de prueba. Grupo 2 hasta 5 recibieron 0.6 mi de 0, 2.5, 7.5 ó 13.8 mg/ml de rhHNS por IT (es decir, una dosis total de 0, 1.5, 4.5 ó 8.3 mg) EOW. Cuatro monos/sexo/grupo son sometidos a necropsia a los 3 meses (necropsia interina; 24 horas después de la 6ta dosis), cuatro monos/sexo/grupo (excepto el grupo DC, los cuales son sometidos a necropsia a los 3 meses) se sometieron a necropsia a los 6 meses de dosificación (necropsia principal; 24 horas después de la 12ava dosis), y los restantes cuatro monos/sexo/grupo se sometieron a necropsia al final de un periodo de recuperación de 1 mes. En la necropsia, los tejidos seleccionados se recolectaron, procesaron y examinaron microscópicamente.

Se proporcionó rhHNS en un vehículo con formulación IT que consiste de fosfato de sodio 5 mM, cloruro de sodio 145 mM y polisorbato 20 al 0.005% (pH 7.0). Se administraron dosis de rhHNS cada semana como una infusión rápida durante aproximadamente once minutos; 0.6 mi (4 minutos) seguido con un lavado de 0.5 mi de salina amortiguada de fosfato (PBS)(7 minutos). Los monos en el grupo de control con el vehículo recibieron solo la formulación de IT; los monos DC recibieron PBS (pH 7.2) por IT.

Evaluación Clínica Se registraron signos clínicos y las observaciones de morbidez y mortalidad al menos dos veces al día iniciando a la primera dosis. Se midieron los pesos corporales antes de la cirugía, en el día de la cirugía, semanalmente durante el estudio y en la necropsia. Se monitoreo diariamente el consumo de alimento iniciando antes de la cirugía. Se realizaron exámenes físico (frecuencia cardiaca, respiración, temperatura corporal, auscultación, forma de andar, disposición, palpación abdominal, nodos linfáticos y apariencia general) y neurológico (nivel de conciencia, seguimiento), antes que el estudio iniciara, cada mes durante el estudio, y antes de la necropsia. También se valoraron las funciones motoras, reflejos cerebrales (pupilar, parpadeo y reflejo de la córnea), y reflejos espinales (pie sensorial, reflejo rotular, reflejos de cutáneos, propioceptivos y de la cola). Se completaron exámenes electrocardiográficos (ECG; conducido por I, II y III) y oftalmológicos antes de la primera dosis de rhHNS y en la semana antes de la necropsia interina (3 meses) y la principal (6 meses). Los exámenes oftalmológicos son realizados por oftalmoscopio indirecto, los monos son sedados con HCI de cetamina (IM, 8 mg/kg), y los ojos se dilataron con tropicamida al 1 %.

Patología clínica Se recolectaron muestras de sangre de los monos en ayunas para hematología y química de suero antes de iniciar el estudio, después de la dosis IT 1 , 3, 5, 7, 9 y 1 1 , a la mitad de la recuperación y en necropsia. Se recolectaron muestras de orina por medio de una bandeja de recolección de predosis, una vez al mes durante el periodo de dosificación y recuperación, y antes de la necropsia. Se recolectaron muestras de CSF por medio del catéter lumbar para conteo de célula total y análisis químico al tiempo de la cirugía, y 24 horas después de las dosis IT 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , a la mitad de la recuperación y en la necropsia; de vez en cuando, no se recolectaron muestras debido a la obstrucción parcial del catéter. Debido a que se notaron conteos de leucocito CSF mayores que el esperado, las muestras CSF de dosis 5 de 3 meses se recolectaron de la mitad de los monos en cada grupo antes de la dosificación y de resto de los monos 24 horas después de la dosificación. La recolección de la muestra de predosis ocurrió al menos 1 vez al día antes de la dosificación para no alterar significativamente el volumen de CSF justo antes de la dosificación. Para los monos de 6 meses y en recuperación, se recolectó CSF para conteo de célula total y química de la mitad de los monos en cada grupo antes de la dosificación y de los monos restantes 24 horas después de la dosificación. Si un mono tiene un catéter ajeno al muestreo debido a una obstrucción, se realiza una punción espinal (cisterna magna) en la necropsia.

Análisis de rhHNS Se recolectaron muestras de sangre para análisis rhHNS de una vena periférica antes y 24 horas después de la dosis IT 2, 4, 6, 8, 10, 12; a la mitad de la recuperación y en la necropsia. Se recolectaron muestras CSF por medio del catéter lumbar antes y 24 horas después de la dosis IT 2, 4, 6, 8, 10, 12; a la mitad de la recuperación y en la necropsia. Se determinaron concentraciones de rhHNS por ensayo inmunosorbente unido a la enzima. El anticuerpo de captura es un IgG anti-HNS de conejo policlonal y el anticuerpo de detección es un conjugado de peroxidasa de rábano picante del mismo IgG anti-HNS de conejo. El LOD es 0.22 ng/ml; así, el LOQ se calculó ser 0.66 ng/ml. Se seleccionaron muestras de suero y CSF por duplicado a diluciones de 1 :100 y 1 :5; las muestras que exceden el extremo más alto de la curva de calibración son diluidas adicionalmente y probadas nuevamente.

Análisis de anticuerpo anti-HNS Se recolectó sangre para análisis de anticuerpo de una vena periférica aproximadamente 1 semana antes de la dosis IT 2, 4, 6, 8, 10, 12; a la mitad de la recuperación y en la necropsia. Se recolectaron muestras de CSF para análisis de anticuerpo en la cirugía, y por medio de catéter lumbar aproximadamente 1 semana antes de la dosis IT 2, 4, 6, 8, 10, 12; a la mitad de la recuperación; y en la necropsia. Se usó una tecnología Meso Scale Discovery (MSD®) para prueba del puente electroquimioluminiscente para detección de anticuerpos anti-HNS. El ensayo es un método de selección, pero sensible general para anticuerpos anti-HNS de cualquier especie y todos los isotipos de inmunoglobulina. El LOD fue 5 ng/ml, y las muestras se seleccionaron por duplicado a una dilución de 1 :20, resultando en una sensibilidad de ensayo positiva de 100 ng/ml. Las muestras que exceden el extremo más alto de la curva de calibración se diluyeron adicionalmente y se probaron nuevamente.

Necropsia y preparación de tejidos Los monos se sometieron a necropsia completa ya sea 24 horas después de la dosis IT final (necropsia principal) o al final del periodo de recuperación de 1 mes (necropsia de recuperación). Todos los monos se sedaron con HCI de cetamida (I , 8 mg/kg), se mantuvieron en una mezcla isoflurano/oxígeno, y recibieron un bolo IV de heparin sodio (200 lU/kg). Los monos se perfundieron por medio del ventrículo cardiaco izquierdo con nitrito de sodio al 0.001% a temperatura ambiente en salina a una proporción de 200 ml/min por 12 minutos (-2400 mi). Después de la recolección, las muestras del tejido entonces se fijaron en formalina amortiguada neutral al 10% para examen histopatológico/análisis inmunohistoquímico o se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -60°C o menor para análisis de actividad rhHNS.

El cerebro se cortó en una matriz del cerebro (MBM-2000C, ASI Instruments, Inc., Warren, MI) a un espesor de corte coronal de 3 mm. Los cortes se numeraron, con el corte más rostral designado como corte 1. Los cortes 1 , 4, 7, 10, 13 y 16 son procesados para histopatología y los cortes 2, 5, 8, 1 1 , 14 y 17 (si están disponibles) se procesaron para inmnohistoquimica. Los cortes 3, 6, 9, 12 y 15 se congelaron para análisis de actividad rhHNS. Las médulas espinales (cervical, torácica, y porciones lumbares) se cortaron en secciones de 1 cm. El primer corte y cada tercer corte después de este se procesaron para evaluación histopatológica y el segundo corte y cada tercer corte después de este se procesaron para análisis de inmunohistoquímica. El tercer corte y cada tercer corte después de este se congelaron para análisis rhHNS. La distribución de los cortes se ajustó de forma que el corte que contiene la punta del catéter intratecal (corte 0) se fijó en formalina y se analizó para histopatología. Las muestras en duplicado de ~5 g del hígado se tomaron de dos lóbulos separados y se congelaron para análisis rhHNS y una muestra adicional de ~5 g se fijó para análisis de inmunohistoquímica.

Histopatología Se recolectaron los cerebros, médula espinal, raíces/ganglios del nervio de la espina dorsal, nervio ciático, de la tibia y sural, una lista de tejido completa (típica para estudios de seguridad de fármaco preclínico de esta duración en estas especies), y cualquier lesión gruesa en la necropsia de todos los monos. Las secciones de los tejidos se incrustaron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (adicional a cualquier procedimiento de teñido/incrustado especial anotados debajo) para evaluación microscópica comprehensiva.

Las secciones del cerebro de los bloques de parafina preparada del dispositivo y grupos de control con el vehículo, y los monos con dosis altas se tiñeron con Fluoro-Jade B (un teñido que incrementa la sensibilidad para evaluar la degeneración neuronal) y plata de Bieischowsky (un procedimiento que permite la visualización directa de axonas, dendritas y filamentos neuronales). Los cortes teñidos con Fluoro-Jade B se examinaron bajo luz fluorescente usando un cubo con filtró de isotiocianato de fluoresceina.

Se seccionaron serialmente las médulas espinales, con secciones transversales y oblicuas tomadas de las regiones cervical, torácica y lumbar (un corte examinado en cada nivel) que incluyen secciones en la punta del catéter; una sección transversal adicional se tomó de la región cola de caballo. Se procesaron las raíces y ganglios de la espina dorsal (cervical media y lumbar media) y se examinaron. Los nervios periféricos (ciático, de la tibia y sural) se seccionaron longitudinalmente, se incrustaron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Las secciones cruzadas se postfijaron en osmio, se incrustaron en resina de Spurr, se seccionaron (2 pm) y tiñeron con toluidina azul. Las secciones de la médula espinal, asi como también las raíces y ganglios del nervio de la espina dorsal, de los grupos del dispositivo y de control con vehículo y del grupo de dosis alta se tiñeron con plata de Bieischowsky. Las secciones de la médula espinal de estos grupos también se tiñeron con proteína acídica fibrilar anti-glial, un tinte inmunohístoquímico que permite la visualización directa de astrocitos y sus procesos.

Preparación de extractos del tejido para análisis cuantitativo Los cortes del cerebro congelados 3, 6, 9, 12 y 15 se diseccionaron separando los hemisferios izquierdo y derecho. El tejido de la superficie se tomaron para medir 4 mm de la superficie y el tejido restante de cada hemisferio se consideró tejido profundo. Si está presente (por ejemplo, los cortes 6 y 9), una muestra periventricular adicional se cortó de los cortes coronales. Ya que solamente la mitad del cerebro (lado derecho) es procesado (el lado izquierdo permanece congelado), el seccionamiento resultó en dos a tres muestras por corte: superficie derecha, profundidad derecha, y si está presente, periventricular derecho (es decir, Ventrículo profundo; Vprofudo). Los tejidos del tronco cerebral y cerebelo, cuando están presentes, son aislados antes de la separación de los hemisferios y son procesados independientemente. Las secciones de la médula espinal son preparadas similarmente, pesadas y homogenizadas.

Las muestras del tejido son homogenizadas en amortiguador de lisis (1 ml/0.25 g de tejido) formuladas con Tris 10 mM ácido etilendiamintetracético 5 mM, Igepal al 0.1 % complementado con monotabletas del inhibidor de proteasa Alpha Complete (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) usando tubos de Matrix A de Lisado TeenA o tubos de propileno cónicos. Las muestras se procesaron por 40 segundos en un homogenizador automatizado Fastprep-24 (MP Biomedical, Solón, OH) u homogenizador energizado PowerGen Modelo 125 (Ommi International, Kennesaw, GA). Una vez homogenizadas, las muestras se sometieron a cinco ciclos de congelamiento-descongelamiento usando un baño de etanol/hielo seco y un baño con agua a 37°C y entonces se centrifugó a 4°C para eliminar las pelotillas de tejido; se almacenaron los sobrenadantes a -80°C hasta el ensayo. Se determinó la actividad de rhHNS usando un sustrato específico (4-metilumbelifery-a-D-N-sulfoglucosamida) con un ensayo fluorométrico de 2 etapas.

Procesamiento y teñido del tejido para inmunohistoquimica Seis cortes del cerebro coronal fijados en formalina (números de cortes 2, 5, 8, 1 1 , 14 y 17) de 3 mm de espesor de cada mono se numeraron de 1 a 6 rostral a caudal. Generalmente, los cortes 1 a 4 contienen núcleos basales/tálamo/mesoencéfalo y cerebro, y los cortes de dos caudales contienen tejido de tronco de cerebelo y cerebro (médula oblongada). Las secciones del cerebro, médula espinal e hígado (de los mismos bloques de parafina como aquellos usados por H&E y los variados teñidos especiales) son inmunohistoquímicamente teñidos por rhHNS. Un anticuerpo monoclonal de ratón específico (clon 2C7; Maine Biotech, Portland, ME) se usó para detectar absorción intracelular de rhHNS administrado-IT, este reactivo no demostró actividad cruzada con mono rhHNS cinomólogo endógeno. Se realizaron controles negativos usando un IgG de ratón irrelevante. Los cortes desparafinados son incubados con anticuerpo anti-HNS de ratón primario durante la noche de 2 a 8°C. Se agregó una inmunoglobulina G biotinilada anti-ratón de cabra secundario y se incubó por 30 minutos s 37°C. Se agregó complejo avidina/peroxidasa de rábano picante biotinilada y se incubó por 30 minutos. Los cortes se incubaron en solución de diaminobenzidina con sustrato de peroxidasa hasta que se desarrolló la intensidad del teñido deseada. Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina.

Análisis Estadístico Se analizaron pesos corporales, cambios de peso corporal, consumo de alimento, frecuencia respiratoria, temperatura corporal, frecuencia cardiaca, conteo de células CSF, química de CSF, datos de patología clínica, datos de orina y pesos de órganos relativos y absolutos por un análisis de una vía de varianza y una comparación de los grupos del dispositivo y control con vehículo a cada uno de los grupos dosificados con rhHNS por la prueba de Dunnett. Además, el análisis estadístico compara los dos grupos de control entre sí. En análisis es de dos colas para niveles significantes de 5% y 1 %. Todos los datos son presentados como media ± desviación estándar.

EJEMPLO 5 Blodistribución de heparan N-sulfatasa y estudios de farmacocinética Los experimentos en este ejemplo se diseñaron para determinar distribución de tejido de rhHNS en ratas después de una dosis única intravenosa o intratecal (1 6 10 mg/kg) de rhHNS. Por ejemplo, entre otras cosas, los propósitos de estos experimentos fueron para caracterizar las propiedades de biodistribución (BD) de rhHNS en ratas usando tomografía de emisión de positrón (PET); para comparar patrones de distribución de rhHNS cuando se proporciona en diferentes rutas (IV o IT) y a diferentes dosis (1 ó 10 mg/kg); y para determinar propiedades farmacocinéticas de rhHNS en cada uno de los órganos de interés en estos regímenes de dosificación.

Se estudiaron los perfiles de farmacocinética (PK) y biodistribución (BD) de 12 l-sulfamidasa (rhHNS) por imagen PET de tejido en ratas después de la administración única intravenosa (IV) o intratecal (IT) de 1 ó 10 mg/kg de 124I-HNS. Los datos de tiempo de radioactividad en la región de interés se obtuvieron de imágenes dinámicas en los primeros 20 min y de imágenes estáticas a 0.05 (solamente para administración IT), 1 , 2, 4, 8, 24, 48, 96 y 192 horas post-dosificación IV o IT.

Se usaron cuatro ratas en cada uno de los cuatro grupos (1 mg/kg IV, 1 mg/kg IT, 10 mg/kg IV y 10 mg/kg IT) en este estudio. Los datos de tiempo de radioactividad se midieron en la cabeza, cerebro (que incluye fluido cerebroespinal, CSF), espina y regiones del hígado después de la administración IT; y en la sangre, cerebro (que incluye CSF), hígado, riñon, corazón (que incluye pulmones) y piel después de la administración IV. Los datos se corrigieran por la vida media de desintegración de 124-yodo (100.2 horas), expresado como porcentajes de dosis inyectadas (%ID) de una región de interés o %ID por gramo (%ID/g) de los tejidos formados en imagen, y después normalizaron para el peso corporal de 200 gramos. Las cantidades totales (ug) o concentraciones (ug/g) de la proteína dosificada en la región de interés se calcularon a partir de los datos de %ID o %ID/g correspondientes.

En los primeros 20 min después de la dosificación IT, la cantidad total de rhHNS en la región craneal se redujo a una velocidad constante de 0.002/min - 0.011/min (??) a 1 y 10 mg/kg. Los volúmenes de distribución e índices de separación no se usaron para comparaciones de farmacocinética entre las dos dosis y las dos rutas de administración de este reporte (véase la sección de Resultados para más información). Las velocidades constantes de eliminación del cerebro fueron esencialmente las mismas a las dos dosis de prueba (??: 0.016/hr contra 0.0 4/hr para 1 y 10 mg/kg, respectivamente) con una vida media similar de aproximadamente dos días como se determina por imagen estática hasta 192 horas después de la dosificación IT. Los valores de Cmax y AUC (0-pasado ó 0-infinito) fueron proporcionales a las dosis administradas. Se indicó un comportamiento de PK lineal en el rango de dosis de 1 a 10 mg/kg dado en estos regímenes de dosificación únicos IT. Se observaron gradientes de concentración a partir de las secciones próximas a distales de la espina en ambos niveles de dosis.

Después de la dosificación IT, la proteína rhHNS fue medióle en el hígado hasta 96 horas a 1 mg/kg y hasta 192 horas a 10 mg/kg de rhHNS. Las concentraciones en el hígado alcanzaron el pico 2 horas a 1 mg/kg, y 7 horas a 10 mg/kg. La eliminación fue 0.030 ± 0.01 1/hr (media ??) a 1 mg/kg, la cual no fue significantemente diferente de aquella a 10 mg/kg (?? 0.0 7 ± 0/hr) (p=0.10), con una t1/2 correspondiente (28 contra 42 horas a las dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente).

Después de la dosificación IV, las vidas medias de eliminación en el hígado, riñon, corazón y piel fueron 47 ± 10 y 38 ± 13 horas para el hígado, 54 + 25 y 29 ± 16 horas para el ríñón, 36 ± 15 y 42 ± 19 horas para el corazón, y 40 ± 21 y 31 ± 13 horas para la piel a 1 y 10 mg/kg, respectivamente, mientras las vidas medias en el cerebro fueron 71 ± 23 y 60 ± 53 horas. Los valores medios de Cmax para el hígado, piel, riñon, corazón y cerebro fueron 9.6, 0.30, 0.25, 0.22, y 0.08 ug/g a 1 mg/kg y 132, 7.9, 3.9, 3.7 y 1.8 ug/g a 10 mg/kg. Después que los valores Cmax de animales individuales fueron normalizados por dosis, los valores Cmax/dosis a 10 mg/kg fueron significantemente superiores que aquellos a 1 mg/kg en todos estos órganos (la mayoría de valores p <0.05, p=0.06 para el hígado). Los valores de AUCmínimos para el hígado, piel, riñon, corazón y cerebro fueron 525, 16, 14, 9 y 7 hr.ug/g a 1 mg/kg; y 6747, 276, 183, 201 y 86 hr.ug/g a 10 mg/kg. Después de la normalización, los valores de dosis/AUCminimos a 10 mg/kg fueron significantemente superiores que aquellos a 1 mg/kg en la piel (p<0.01), marginalmente diferente en el corazón (p=0.06), y no significantemente diferente en el hígado, cerebro y riñon (todos los valores p >0.34).

Cuando la misma dosis de rhHNS se inyectó, la administración intratecal resultó en una exposición del cerebro mayor de tres-log que aquella con administración intravenosa. La vida media de eliminación en el cerebro fue 2 días por IT y 3 días por administración IV. Sin embargo, las exposiciones hepáticas después de la dosificación IT fueron similares a aquellas después de la dosificación IV a la misma dosis de rhHNS. La exposición (Cmax y AUCmínimos) para el hígado por IT/IV a 1 mg/kg y 10 mg/kg estuvieron en un rango de 0.4 - 1.2.

Diseño Experimental El sistema nervioso central (CNS) es vulnerable en la mayoría de las enfermedades de almacenamiento lisosomal y es seriamente dañado en algunos tipos de estas enfermedades, tales como el síndrome de Sanfilippo tipo A o B (mucopolisacaridosis III), Leucodistrofia Metacromática (MLD) y Síndrome de Hunter. Como se describe en la presente, se contempla que, debido a la pobre penetración a través de la barrera hemato-encefálica cuando se administra periféricamente, la administración directa de las proteínas enzimáticas en el CNS puede incrementar sus concentraciones en los tejidos nerviosos centrales y además mejora sus efectos terapéuticos. La administración intratecal (IT, o cisterna magna) se investigó y comparó con la administración IV a diferentes niveles de dosis en este estudio.

El PET es una tecnología no invasiva, repetible y cuantitativa para proporcionar cambio dinámico de la concentración de fármaco con el tiempo en el órgano de interés. Los datos de tiempo de concentración dinámica de órganos objetivo (sitios activos, en lugar de la circulación sanguínea) son valiosos y están directamente relacionados con la actividad biológica del fármaco dosificado. Además, la información en tejidos expuestos del estudio PET en animales puede ser usado para guiar la selección de la primera dosis en humanos.

Materiales y Métodos Artículos de Prueba Se formuló heparin N-Sulfatasa (rhHNS) a una concentración de 20 mg/mL de rhHNS en 5mM de amortiguadores de fosfato de sodio con 145 mM de cloruro de sodio a pH 7.0. El material se purificó por RP-HPLC y contiene 98.7% de Heparin N-Sulfatasa con 99.9% de dimero. El rhHNS se etiquetó con 12 yodo.

Fuente de Muestra Las imágenes de radioactividad fueron de ratas después de la dosificación IV e IT con 12 l-H-N-sulfatasa a 1 y 10 mg/kg.

Animales Se adquirieron dieciséis ratas macho Sprague-Dawley de Charles River Laboratories (190 ± 60 g, n = 16), y se separaron en cuatro grupos (n = 4). La inyección única IV o IT a dos diferentes dosis (1 mg/kg y 10 mg/kg) se dio a cada grupo de estas ratas (4 grupos en total). El volumen inyectado y dosis fueron individualizados con base en el peso corporal de cada animal. En dos grupos tratados IV, se induje sedación por inyección IV de pentoarbital sódico a una dosis de 35 mg/kg. Las dosis intravenosas se inyectaron en un bolo a través de la vena de la cola. En dos grupos tratados con IT, los animales fueron anestesiados por administración intra-peritoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 50 mg/kg. Las dosis intratecales se administraron durante 1 min al nivel cisterna magna a través de la membrana atlanto-occipital. La radioactividad administrada actual se midió por PET, y sirvió como la dosis inyectada.

Métodos de Ensayo v/o Experimentales Se obtuvieron imágenes dinámicas (cada 2 min) en los primeros 20 minutos en las regiones del corazón (que incluye los pulmones), hígado y ríñones post-inyección IV; y en la región de cabeza post-administración IT de ambas dosis. Se adquirieron imágenes estáticas en las regiones que incluyen el cerebro (que incluye fluido cerebroespinal, CSF), hígado, riñon, corazón (que incluye los pulmones), músculo, piel y huesos en el grupo tratado-IV; y en la región de cabeza, cerebro (que incluye CSF) e hígado de animales tratados-IT a 0.05 (solamente disponible para grupos IT), 1 , 2, 4, 8, 24, 48, 96 y 192 horas post-dosificación. Las imágenes se reconstruyeron y las tres secciones del cuerpo se fusionaron en una imagen.

Análisis de Datos Los datos de PET se expresaron en nanocuria (nCi) por mL (por fluido) o por gramo (por tejido). Se obtuvo la actividad relativa para las regiones del cerebro, hígado, ríñones, músculo esqueleto, estómago, corazón (con pulmones) y piel en imágenes estáticas. La actividad absoluta en las regiones completas de la cabeza o cerebro se obtuvieron para los animales que recibieron las inyecciones IT. La radioactividad por milímetro de columna espinal se determinó en los animales inyectados IT en las tres secciones seleccionadas: la espina próxima (cuello), media (contra el borde superior del hígado), y distal (1 cm del extremo distal del compartimiento que contiene proteína).

Todos los datos se corrigieron por la vida media de desintegración de 124l (100.2 horas) y normalizaron por eficacia de registro con base en la calibración con una fuente de 124l con actividad externamente medida. Los datos fueron entonces expresados como porcentajes de dosis inyectadas (%ID) de una región completa (la cabeza y cerebro) o %ID por gramo (%ID/g) de un tejido, y después normalizaron para un peso corporal de 200 gramos [datos de normalización: (%ID o %ID/g)/peso corporal del animal x 200]. La normalización se adoptó para reducir la variabilidad de los datos, ya que solamente se usaron cuatro animales en cada grupo.

En este ejemplo, las concentraciones o cantidades de proteína rhHNS se calcularon usando la dosis de proteína inyectada a cada animal: concentración de proteína (ug/g) = (%ID/g) x (mg/kg de dosis inyectada x1000 x 0.2); cantidad total de la proteína dosificada (ug) en una región de interés = %ID x (mg/kg de dosis inyectada x 1000 x 0.2), aquí la dosis inyectada fue 1 mg/kg ó 10 mg/kg y 0.2 es el factor de normalización para peso corporal. La desviación estándar y media del grupo de cada parámetro de PK se calcularon con base en los datos no compartímentales individuales en cada uno de los cuatro grupos. Se realizó una prueba-f de Student para comparar los valores de ??, t1/2, Cmax y AUC entre las dos dosis de prueba y las dos rutas de administración. La significancia estadística se definió como un valor-p menor que 0.05 (p<0.05).

Resultados Las cantidades (ug) o concentraciones (ug/g) de rhHNS en las siguientes tablas, figuras y análisis de PK se calcularon multiplicando la dosis de proteína inyectada (1 mg/kg ó 10 mg/kg) con los valores correspondientes de %ID o %ID/g.

Tratamiento intratecal con 2 I-HNS a dosis de 1 y 10 mq/kq La cantidad de la proteína dosificada (ug) en la región de cabeza de imágenes dinámicas se trazó como una función de tiempo en la Figura 17. La concentración (ug/g) en las regiones del cerebro de imágenes estáticas se trazó como una función de tiempo en la Figura 18. La cantidad total de proteína inyectada (ug) en las regiones del cerebro y cabeza de imágenes estáticas se trazaron con el tiempo en la Figura 19 y Figura 20, respectivamente. Las curvas de tiempo de concentración (ug/mm) en la espina próxima, media y distal fueron mostradas en la Figura 21 a Figura 23. La Figura 24 muestra los cambios de concentración de rhHNS (ug/g) en el hígado con el tiempo después de la administración IT de 124I-HNS a 1 y 10 mg/kg.

Los datos de cantidad total-tiempo (ug) o tiempo de concentración (ug/g) se analizaron por modelos no compartimentales (WinNonlin 5.2, Pharsight, Mountain View, CA). Los parámetros de PK, tales como la velocidad constante de eliminación (??), concentración pico (Cmax), vida media terminal (t1/2), área bajo la curva (AUCmínimos y AUCO-inO y otros se estimaron a partir de los datos de cada animal individual.

Se estimaron los volúmenes de distribución y velocidades de separación (véase Apéndice 3), sin embargo, no fueron usados para comparaciones de PK entre las dos dosis y las dos rutas de administración en este reporte por dos razones (1 ) este estudio se enfoca en la biodistribución de rhHNS en tejidos sólidos, en lugar de PK en sangre; y (2) la radioactividad en la región del cerebro fue la suma de aquellos del tejido cerebral (sólido) y CSF (líquido), lo cual no podría ser separado de otro en el estudio. El ?? se evaluó y uso para comparación, debido a que indica un porcentaje de dosis inyectada eliminada por unidad de tiempo.

Las desviaciones estándares y medias del grupo (SD) se calcularon y compararon entre dos dosis de prueba. Estos parámetros de PK son tabulados en la Tabla 23 abajo.

TABLA 23 Sumario de parámetros de PK no compartimentales (media del grupo + SD) en varios órganos después de la dosificación IT e IV 1 y 10 mg/kq de 24I-HNS.

En los primeros 20 min después de la dosificación, la cantidad total (ug) de rhHNS en la región de cabeza se redujo a una velocidad constante de 0.002 - 0.01 1 por min (??, 0.005±0.004/min) a 1 mg/kg y 0.003 -0.010 por min (0.007±0.003/min) a 10 mg/kg. Estas velocidades constantes de eliminación no fueron significantemente diferentes a estos dos niveles de dosis (p=0.57, Figura 17).

La curva de tiempo de concentración (ug/g de 0.05 a 192 horas) para el cerebro indica un perfil bifásico (Figura 18). La fase temprana dura por aproximadamente dos horas. La fase terminal sigue cinéticas de primer orden. Las velocidades constantes de eliminación del cerebro fueron muy similares a las dos dosis probadas (0.0016 ± 0.003 y 0.014 ± 0.001 por hora) con una vida media similar de aproximadamente dos días (45 ± 7 y 49 ± 4 horas a 1 y 10 mg/kg, respectivamente). Los valores de concentraciones pico (257 ± 90 y 2628 ± 265 ug/g) y AUCmínimos (8393 ± 2457 y 83962 ± 10083 hr.ug/g a 1 y 10 mg/kg, respectivamente) incrementan aproximadamente diez veces cuando la dosis se incrementa de 1 a 10 mg/kg. Estas observaciones indican un comportamiento de PK lineal en el rango de dosis de 1 a 10 mg/kg dado en estos regímenes de dosificación única IT. La concentración pico aparece en el cerebro 3 min (Tmax) después de la dosificación IT.

La curva de tiempo-cantidad total (ug de 0.05 a 192 horas) en las regiones del cerebro y cabeza siguen el mismo patrón bi-fásico como se observa con las curvas de tiempo de concentración (ug/g) en el cerebro (Figura 19 y Figura 20). Los valores de Cmax en la región del cerebro fueron significantemente inferiores que aquellas en la región de cabeza (69 ± 8 contra 200 ± 0 a 1 mg/kg, p<0.01 ; y 836 ± 117 contra 1844 ± 314 ug, p<0.01a 10 mg/kg, respectivamente). Las velocidades de eliminación constantes fueron 0.017 ± 0.002/hr y 0.014 ± 0.001/hr para el cerebro, y 0.016 ± 0.002 y 0.010 ± 0.001/hr para la región de cabeza a 1 y 10 mg/kg, respectivamente. Los valores de tiempo medio residual fueron 42 ± 5 contra 51 ± 5 horas para el cerebro (p=0.048), y 45 ± 7 contra 70 ± 9 horas para la cabeza (p<0.01 ) a 1 y 10 mg/kg, respectivamente. Estas observaciones sugieren que la proteína dosificada fue eliminada de ambas regiones más rápidamente a dosis inferiores que a dosis superiores. Las medias de las vidas medias estuvieron en un rango de 42 a 70 horas en estas regiones después de la dosificación IT 1 mg/kg y 10 mg/kg de rhHNS.

Se observó un gradiente de concentración de las secciones próxima, a la media y a la distal de la espina en ambos niveles de dosis (datos no mostrados). Después de la dosificación IT, la concentración pico (ug/mm de columna espina) se vio aproximadamente 30 min (0 a 1 hora) en la próxima, 1 a 4 horas en la media (excepto para una rata siendo 24 horas) y 1 a 8 horas en la sección distal. Las vidas medias en estas secciones fueron variables (media t1/2: 32 ± 13 y 45 ± 18 horas para la próxima, 39 ± 16 y aproximadamente 50 horas para la media, y 30 ± 12 y aproximadamente 123 horas para las secciones distales de la espina a 1 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente). Los valores medios de concentraciones pico fueron bastante proporcionales a las dosis en cada una de estas tres secciones a 1 y 10 mg/kg de 124I-HNS (0.5 contra 6.0, 0.2 contra 0.9 y 0.1 contra 0.5 ug/mm en las secciones próxima, media y distal de la espina, respectivamente). Los valores medios de AUCmínimos siguen el mismo patrón proporcional como se observa en la concentración pico (9.5 contra 83, 6.8 contra 35, y 2 contra 38 hr.ug/mm en las secciones próxima, media y distal, respectivamente).

Aún a pesar de que el rhHNS no fue detectable en la mayoría de los órganos periféricos, fue medible en el hígado de tan pronto como 1 hora (el primer punto de tiempo de imagen después de la dosificación) a 96 horas (tres de cuatro animales) a 1 mg/kg y a 192 horas (las cuatro ratas) a 10 mg/kg después de la dosificación IT (Figura 24). Las concentraciones en el hígado alcanzaron el pico 2 horas después de la dosificación IT de 1 mg/kg, y 7 horas después de la dosificación IT de 10 mg/kg, la cual se siguió por una fase de eliminación con cinéticas de primer orden. La constante de velocidad de eliminación fue más rápida a 1 mg/kg (?? 0.030 ± 0.01 1/hr) a aquella a 10 mg/kg (?? 0.017 ± 0/hr) (p=0.10), con una t1/2 más corta correspondiente (28 ± 16 contra 42 ± 1 horas a las dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente, p=0.76) El valor de AUCmínimo a 1 mg/kg se reduce aproximadamente 40-veces en comparación con aquel a 10 mg/kg (204 ± 50 contra 7987 ± 3276 ug/g, respectivamente).

Tratamiento intravenoso con 124I-HNS a dosis de 1 y 10 mq/kq La concentración en l cerebro, hígado, riñon, corazón (que incluye tejido pulmonar) y piel fueron trazados como una función de tiempo después de la dosificación IV 1 y 10 mg/kg de rhHNS como se muestra en la Figura 25 hasta la Figura 29, respectivamente. Puesto que el primer punto de tiempo de imagen estática para estos órganos fue una hora después de la dosificación, la fase inicial de estas curvas de tiempo de concentración no puede ser observada en este estudio. Las curvas de tiempo de concentración para el hígado, riñon, corazón y piel mostraron una fase plana de 1 a 8 horas después de la dosificación IV. Esta fase plana dura por 24 horas en el cerebro post-dosificación, sugiriendo que el cerebro toma la proteína dosificada IV más lenta que aquella por los órganos periféricos. Los datos restantes indican una fase de eliminación terminal con aproximadamente cinéticas de primer orden.

Las vidas medias de eliminación en el hígado, riñon, corazón y piel fueron 47 ± 10 y 38 ± 13 horas para el hígado, 54 ± 25 y 29 ± 16 horas para el riñon, 36 ± 15 y 42 ± 19 horas para el corazón y 40 ± 21 y 31 ± 13 horas para la piel a 1 y 10 mg/kg, respectivamente; mientras las vidas medias en el cerebro fueron 71 ± 23 y 60 ± 53 horas (3 Ratas en el grupo de 10 mg/kg se excluyeron por datos insuficientes para determinar t1/2) a 1 y 10 mg/kg, respectivamente. No se observaron diferencias estadísticas entre las vidas medias a 1 y 10 mg/kg en estos órganos, con una excepción del valor p < 0.03 para el riñon.

Los valores medios de Cmax para el hígado, piel, riñon, corazón y cerebro fueron 9.6, 0.3, 0.25, 0.22, y 0.08 ug/g a 1 mg/kg y 132, 7.9, 3.9, 3.7 y 1.8 ug/g a 10 mg/kg. Las relaciones de Cmax a 10 mg/kg a los valores correspondientes a 1 mg/kg fueron 14, 26, 16, 7 y 23 para estos órganos. Después que los valores Cmax de animales individuales fueron normalizados por dosis, los valores Cmax/dosis a 10 mg/kg fueron significantemente superiores que aquéllos a 1 mg/kg en todos estos órganos (la mayoría de valores p <0.05, p=0.06 para el hígado). Los valores de AUCmínimos para el hígado, piel, riñon, corazón y cerebro fueron 525, 16, 14, 9.3 y 7 hr.ug/g a 1 mg/kg; y 6747, 276, 183, 201 y 86 hr.ug/g a 10 mg/kg. Las relaciones de AUCmínimos a 10 mg/kg a los valores correspondientes de AUCmínimos a 1 mg/kg fueron 13, 17, 13, 22 y 12 para estos órganos, respectivamente. Después de la normalización, los valores AUCmínimos/dosis a 10 mg/kg fueron significantemente superiores que aquellos a 1 mg/kg en la piel (p<0.01 ), marginalmente diferente en el corazón (p=0.06), y no significantemente diferente en el hígado, cerebro y riñon (todos los valores p >0.34).

Estas observaciones sugieren (1 ) que las vidas medias en la mayoría de los órganos fueron aproximadamente 2 días, con la excepción del cerebro (aproximadamente 3 días); (2) la exposición por gramo en el hígado fue más larga que aquella de la piel, corazón y riñon, las cuales son más largas que aquellas del cerebro; (3) con un incremento de diez veces en la dosis (10/1 mg/kg), los valores de Cmax a 10 mg/kg de todos los órganos probados se incrementan más de 10 veces que aquellos a 1 mg/kg.

La concentración pico en el cerebro se alcanzó 1 -24 horas (Tmax) después de la dosificación IV.

Comparación de tratamientos IV contra IT Las curvas de tiempo de concentración en el cerebro e hígado después de la administración IV e IT a 1 y 10 mg/kg son comparadas en la Figura 30 y Figura 31 , respectivamente. Las relaciones de Cmax en el cerebro por IT/IV a 1 y 10 mg/kg fueron 3212 y 1501 , respectivamente. Estas relaciones de AUC0-192hr fueron 1 136 y 978. Estas observaciones indican que, cuando la misma dosis de rhHNS se inyectó, la administración intratecal resultó en una exposición mayor aproximadamente de tres-log de cerebro que aquella con la administración intravenosa. La vida media de eliminación en el cerebro fue 2 días (45 y 49 horas a 1 y 10 mg/kg) por IT y 3 días (71 y 60 horas a 1 y 10 mg/kg) por administración IV en ambos niveles de dosis.

Sin embargo, las exposiciones hepáticas después de la dosificación IT fueron similares a aquellas después de la dosificación IV a la misma dosis de rhHNS. Las relaciones de Cmax en el hígado por IT/IV a 1 mg/kg y 10 mg/kg fueron 0.5 y 0.8, y las relaciones de AUCmínimos fueron 0.4 y 1.2, respectivamente.

Conclusiones Los perfiles de farmacocinética y biodistribución de 1241-sulfamídasa (rhHNS) fueron estudiados por imágenes PET de tejido en ratas después de la administración intravenosa o intratecal de 1 ó 10 mg/kg de 124l-sulfamidasa. Se obtuvieron datos de tiempo de concentración tanto dinámicamente (los primeros 20 min) como estáticamente en las regiones de interés a 0.05, 1 , 2, 4, 8, 24, 48, 96 y 192 horas post-dosificación. Por imagen dinámica después de la dosificación IT, la cantidad total de rhHNS en la región craneal se redujo a una velocidad constante similar de 0.005/min - 0.007/min (media ??) en los primeros 20 min. Por imagen estática, las velocidades de eliminación del cerebro fueron esencialmente las mismas a dos dosis probadas (??: 0.016/hr contra 0.014/hr para 1 y 10 mg/kg, respectivamente) con una vida media similar aproximadamente dos días.

Los valores de Cmax y AUCmínimos fueron proporcionales a las dosis administradas, y se indicó un comportamiento de PK lineal en el rango de dosis de 1 a 10 mg/kg dados en estos regímenes de dosificación única IT.

Se observaron gradientes de concentración de la espina próxima a distal en ambos niveles de dosis.

Después de la dosificación IT, la concentración pico se vio aproximadamente 20 min en las secciones próxima, 1 a 4 horas en la media y 1 a 8 horas en la distal. El comportamiento PK lineal también se indica en las diferentes secciones de la espina.

Después de la dosificación IT, la proteína rhHNS fue medible en el hígado a partir de tiempo muy temprano hasta 96 horas a 1 mg/kg y 192 horas a 10 mg/kg. La velocidad de eliminación fue más rápida a 1 mg/kg (?? 0.030/hr) que aquella a 10 mg/kg (?? 0.017/hr), con una t1/2 más corta correspondiente a la dosis inferior (28 ± 16 contra 42 ± 1 horas a las dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente).

Después de la dosificación IV, las vidas medias de eliminación en el hígado, riñon, corazón y piel fueron 47 ± 10 y 38 ± 13 horas para el hígado, 54 ± 25 y 29 ± 16 horas para el riñon, 36 ± 15 y 42 + 19 horas para el corazón y 40 ± 21 y 31 ± 13 horas para la piel a 1 y 10 mg/kg, respectivamente; mientras las vidas medias en el cerebro fueron 71 ± 23 y 60 ± 53 horas. Los valores medios de Cmax para el hígado, piel, riñon, corazón y cerebro fueron 9.6, 0.30, 0.25, 0.22, y 0.08 ug/g a 1 mg/kg y 132, 7.9, 3.9, 3.7 y 1.8 ug/g a 10 mg/kg. Después que los valores Cmax de animales individuales fueron normalizados por dosis, los valores Cmax/dosis a 10 mg/kg fueron significantemente superiores que aquellos a 1 mg/kg en todos estos órganos (la mayoría de los valores p <0.05, p=0.06 para el hígado). Los valores de AUCmínimos para el hígado, piel, riñon, corazón y cerebro fueron 525, 16, 14, 9.3 y 7 hr.ug/g a 1 mg/kg; y 6747, 276, 183, 201 y 86 hr.ug/g a 10 mg/kg. Después de la normalización, los valores de dosis/AUCmínimos a 10 mg/kg fueron significantemente superiores que aquellos a 1 mg/kg en la piel (p<0.01 ), marginalmente diferente en el corazón (p=0.06), y no significantemente diferente en el hígado, cerebro y riñon (todos los valores p >0.34).

EJEMPLO 6 Tratamiento de Pacientes con Sanfilippo A (San A) con RHHNS La administración al CNS directa a través de, por ejemplo, suministro IT puede ser usada para tratas efectivamente pacientes con San A. Este ejemplo ilustra un estudio de escalación de dosis de centro múltiple diseñado para evaluar la seguridad de hasta 3 niveles de dosis cada tercer semana (EOW) por un total de 40 semanas de rhHNS administrada vía un dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IDDD) a pacientes con San A. Varios dispositivos de suministro de fármaco intratecal ejemplares adecuados para tratamiento humano son representados en la Figuras 32-35.

En un ejemplo particular, hasta 16 pacientes serán enrolados: Cohorte 1 : 4 pacientes (Dosis más baja - 10 mg) Cohorte 2: 4 pacientes (Dosis intermedia - 30 mg) Cohorte 3: 4 pacientes (Dosis más alta - 100 mg) 4 pacientes serán aleatorizados a ningún tratamiento. Pacientes con Síndrome de Sanfilippo Tipo A en general demuestran deterioro cognitivo y de neurodesarrollo que incluye lesiones leves del desarrollo temprano y retardado (por ejemplo, caminar, hablar, entrenamiento par air al baño), deficiencia intelectual, hiperactividad, pérdida auditiva, desarrollo deteriorado del habla, deficiencias en habilidades motoras, hiperactividad, agresividad y/o alteraciones del sueño, entre otros. Todas las indicaciones pueden ser parte del criterio para los ensayos. Los pacientes son seleccionados para el estudio con base en la inclusión del siguiente criterio: (1 ) 3 - 18 años de edad; (2) cociente intelectual de menos de 77 ó un decline de 15 a 30 puntos de IQ en los últimos 3 años; (3) sin trastorno convulsivo escasamente controlado o no encerrado en el CSF y (4) sin co-morbilidades que presentan riesgos quirúrgicos y/o anestésicos.

Se determinan las dosis de seguridad de ascenso de rhHNS administradas por inyección IT por 6 meses en niños con Síndrome de Sanfilippo Tipo A infantiles tardíos. La integración y escalación será muy lenta para proporcionar valoración completa de la seguridad del paciente.

Los objetivos del estudio serán evaluar la seguridad y tolerabilidad de dosis ascendentes de rhHNS, así como también la seguridad, tolerabilidad y potencia a largo plazo del IDDD. Adicionalmente, la concentración de rhHNS después de dosis IT únicas y repetidas en tanto CSF como sangre, así como también los efectos de rhHNS en biomarcadores de CF y GAG urinario. La evaluación adicional incluirá efectos de rhHNS en parámetros clínicos tales como valoraciones psicológicas y neurocognitivas, volúmenes de estructura cerebral y función neural. Adicionalmente, los efectos de tratamiento sobre la vida diaria y las relaciones entre biomarcadores y síntomas pueden ser evaluados.

Típicamente, el tratamiento de pacientes con Síndrome de Sanfilippo Tipo A por suministro IT de rhHNS resulta en reducción de acumulación de GAG en varios tejidos (por ejemplo, el sistema nervioso, ríñones, vesícula biliar y otros órganos).

Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente han sido descritos con especificidad de conformidad con ciertas modalidades, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos de la invención y no están propuestos para limitar los mismos.

Los artículos "un" y "uno" como se usan en la presente en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que sé indique claramente lo contrario, deben ser entendidos por incluir los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo son consideradas satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o de otro modo sea evidente del contexto. La invención incluye modalidades en las cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, empleado en, o de otro modo relevante a un producto o proceso dado. La invención también incluye modalidades en las cuales más de uno, o los miembros del grupo completo están presentes en, empleados en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado. Además, se entiende que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las cuales una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones listadas se introducen en otra reivindicación dependiente en la misma reivindicación base (o, como sea relevante, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique de otro modo o amenos que podría ser evidente para uno de habilidad ordinaria en la técnica que una contradicción o consistencia podría originarse. Donde los elementos están presentes como listas (por ejemplo, en un grupo Markush o formato similar) se entiende que cada subgrupo de los elementos también se describe, y cualesquiera de los elementos pueden ser removidos del grupo. Se entiende que, en general, donde la invención, o aspectos de la invención, es/son referidos como que comprenden elementos particulares, características, etc., ciertas modalidades de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente de, tales elementos, características, etc. Para propósitos de simplicidad estas modalidades no han sido en cualquier caso específicamente expuestas en así muchas palabras en la presente. Se debe entender también que cualquier modalidad o aspecto de la invención puede ser explícitamente excluido de las reivindicaciones, con respecto de si la exclusión específica se menciona en la especificación. Las publicaciones, sitios de red y otros materiales de referencia aquí referenciados para describir el antecedente de la invención y proporcionar detalle adicional con respecto a su práctica están de este modo incorporados por referencia.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 . Una formulación estable útil para administración intratecal, que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS), sal, un agente amortiguador y un tensoactivo de polisorbato.

2. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína de HNS está presente a una concentración de hasta aproximadamente 100 mg/ml.

3. La formulación estable de conformidad con la reivindicación , caracterizada además porque la proteína de HNS está presente a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/ml.

4. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la proteína de HNS está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 10-20 mg/ml.

5. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la proteína de HNS está presente a una concentración que varía de aproximadamente 15 mg/ml.

6. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la proteína de HNS comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1.

7. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la sal es NaCI.

8. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el NaCI está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0-300 mM.

9. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el NaCI está presente a una concentración de aproximadamente 100-200 mM.

10. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el NaCI está presente a una concentración de aproximadamente 145 mM.

1 1. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el tensoactivo de polisorbato se selecciona del grupo que consiste de polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80 y combinaciones de los mismos.

12. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque el tensoactivo de polisorbato es polisorbato 20.

13. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el polisorbato 20 está presente a una concentración que varía aproximadamente 0-0.05%.

14. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el polisorbato 20 está presente a una concentración de aproximadamente 0.02%.

15. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el polisorbato 20 está presente a una concentración de aproximadamente 0.005%.

16. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el agente amortiguador es fosfato.

17. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el fosfato está presente a una concentración no mayor de 50 mM.

18. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el fosfato está presente a una concentración no mayor de 20 mM.

19. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el fosfato está presente a una concentración de aproximadamente 5 mM.

20. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 5.0-8.0.

21. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.5-7.5.

22. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 7.0.

23. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación además comprende un agente estabilizante.

24. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol, PEG 4000, histidina, arginina, lisina, fosfolípidos y combinaciones de los mismos.

25. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el agente estabilizante es sacarosa.

26. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque la sacarosa está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0-10%.

27. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la sacarosa está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0.5-2.0%.

28. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque el agente estabilizante es glucosa.

29. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque la glucosa está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0.5-1.0%.

30. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación es una formulación líquida.

31. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizada además porque la formulación es formulada como polvo seco liofilizado.

32. Una formulación estable útil para administración intratecal, que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS) a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 100-200 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.02%, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM, y a un pH de aproximadamente 7.0.

33. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque la proteína de HNS está a una concentración de aproximadamente 15 mg/ml.

34. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 32 ó 33, caracterizada además porque el NaCI está a una concentración de aproximadamente 145 mM.

35. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 - 34, caracterizada además porque la formulación además comprende sacarosa a una concentración de aproximadamente 0-10%.

36. Una formulación estable útil para administración intratecal, que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS) a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 145 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.02%, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM, sacarosa a una concentración de aproximadamente 0.5-2%, y a un pH de aproximadamente 7.0.

37. Una formulación estable útil para administración intratecal, que comprende una proteína heparan N-sulfatasa (HNS) a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 145 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.02%, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM, glucosa a una concentración de aproximadamente 0.5-1.0%, y a un pH de aproximadamente 7.0.

38. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, caracterizada además porque la formulación es formulada como polvo seco liofilizado.

39. Un contenedor que comprende una forma de dosificación única de una formulación estable de cualquiera de las reivindicaciones 1-38.

40. El contenedor de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el contenedor se selecciona de una ampolleta, una jeringa pre-llenada, un vial, un cartucho, un lyo-ject, un reservorio.

41 . El contenedor de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el contenedor es un vial pre-llenado.

42. El contenedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41 , caracterizado además porque la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 50 ml_.

43. El contenedor de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 5.0 ml_.

44. El uso de una formulación como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-38, en la preparación de un medicamento para tratar el Síndrome de Sanfilippo A en un sujeto que necesite el mismo, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable ¡ntratecalmente.

45. El uso que se reclama en la reivindicación 44, en donde el medicamento está adaptado para no mostrar ningún efecto adverso sustancial en el sujeto.

46. El uso que se reclama en la reivindicación 45, en donde el medicamento está adaptado para no mostrar ninguna respuesta inmune sustancial mediada por células-T adaptivas en el sujeto.

47. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-46, en donde el medicamento está adaptado para suministrar la proteína de HNS a uno o más tejidos cerebrales objetivos.

48. El uso que se reclama en la reivindicación 47, en donde uno o más tejidos cerebrales objetivo se seleccionan del grupo que consiste de tejidos de la materia gris, materia blanca, áreas periventriculares, pia-aracnoide, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región caudada/putamen, cerebro medio, regiones profundas de las protuberancias o médula, y combinaciones de los mismos.

49. El uso que se reclama en la reivindicación 47 ó 48, en donde la proteína de HNS en el medicamento está adaptada para ser suministrada a neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meningeales.

50. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-49, en donde la proteína de HNS en el medicamento está adaptada para ser suministrada a las neuronas en la médula espinal.

51. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-50, en donde el medicamento está adaptado para el suministro sistémico de la proteína de HNS en tejidos objetivos periféricos.

52. El uso que se reclama en la reivindicación 51 , en donde los tejidos periféricos objetivos se seleccionan de hígado, riñon, y/o corazón.

53. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-52, en donde el medicamento está adaptado para la localización lisosomal en tejidos objetivos cerebrales, neuronas de la médula espinal y/o tejidos objetivos periféricos.

54. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-53, en donde el medicamento está adaptado para reducir el almacenamiento lisosomal en tejidos objetivos cerebrales, neuronas de la médula espinal y/o tejidos objetivos periféricos.

55. El uso que se reclama en la reivindicación 54, en donde el almacenamiento lisosomal se reduce por al menos 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1-veces, 1.5-veces, ó 2-veces comparados con un control.

56. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-55, en donde el medicamento está adaptado para la vacuolización reducida en neuronas.

57. El uso que se reclama en la reivindicación 56, en donde las neuronas comprenden células Purkinje.

58. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-53, en donde el medicamento está adaptado para incrementar la actividad enzimática de la HNS en los tejidos' objetivos cerebrales, neuronas de la médula espinal y/o tejidos objetivos periféricos.

59. El uso que se reclama en la reivindicación 58, en donde la actividad enzimática de HNS en el medicamento se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparado con un control.

60. El uso que se reclama en la reivindicación 58 ó 59, en donde la actividad enzimática incrementada de la HNS en el medicamento es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg ó 600 nmol/hr/mg.

61. El uso que se reclama en la reivindicación 58, en donde la actividad enzimática de HNS en el medicamento se incrementa en la región lumbar.

62. El uso que se reclama en la reivindicación 61 , en donde la actividad enzimática incrementada de la HNS en la región lumbar es al menos aproximadamente 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, ó 10,000 nmol/hr/mg.

63. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-62, en donde el medicamento está adaptado para reducir la intensidad, severidad, o frecuencia, o comienzo retardado de al menos un síntoma o característica del Síndrome de Sanfilippo A.

64. El uso que se reclama en la reivindicación 63, en donde al menos un síntoma o característica de la enfermedad de Sanfilippo A es pérdida auditiva, desarrollo retardado del habla, deficiencias en habilidades motoras, hiperactividad, retraso mental, agresividad y/o alteraciones del sueño.

65. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-62, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable una vez cada dos semanas.

66. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-62, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable una vez cada mes.

67. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-62, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable una vez cada dos meses.

68. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-67, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en conjunto con administración intravenosa.

69. El uso que se reclama en la reivindicación 68, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable no más frecuentemente que una vez cada mes.

70. El uso que se reclama en la reivindicación 68, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable no más frecuentemente que una vez cada dos meses.

71. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-67, en donde cuando el medicamento está adaptado para ser administrable intratecalmente se usa en la ausencia de administración intravenosa.

72. El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 44-71 , en donde cuando el medicamento está adaptado para ser administrable intratecalmente intratecalmente se usa en la ausencia de terapia inmunosupresora concurrente.