MX2012007961A

MX2012007961A - Biomatrices para atraer y retener celulas regenerativas y de reparacion.

Info

Publication number: MX2012007961A
Application number: MX2012007961A
Authority: MX
Inventors: Wanda Seyton; Shane Donovan; Stephen L Smith; Loredana Campo; Jennifer Campbell; Shiri Uriel Wallach
Original assignee: Baxter Healtchare S A
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2012-10-03
Also published as: AU2011203927A1; CN102781464A; CA2786527A1; WO2011085301A1; EP2521565A1; US20110200577A1; JP2013516295A

Abstract

La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un coágulo de fibrina y una citocina, y métodos para suministrar la composición a un sitio de enfermedad o daño in vivo para atraer y retener células madre o mieloides regenerativas o de reparación y su progenie diferenciada.

Description

BIOMATRICES PARA ATRAER Y RETENER CELULAS REGENERATIVAS Y DE REPARACION Campo de la invención La invención generalmente se refiere a una composición farmacéutica que comprende una biomatriz de fibrina o un coágulo de fibrina y una citocina y métodos para administrar la composición a un sitio de enfermedad o lesión in vivo para atraer y retener células madre y mieloides regenerativas y/o reparadoras y su progenie diferenciada.

Antecedentes de la invención Las células madre o células con capacidad regenerativa tienen un enorme potencial para tratar enfermedades humanas regenerando o reparando tejido in vivo. Las células madre adultas se han utilizando durante muchos años para tratar la insuficiencia medular posterior a la irradiación o quimioterapia, así como también varias afecciones hematopoyéticas congénitas. Típicamente, los trasplantes de médula ósea son autógenos (utilizan las propias células madre del paciente) o alógenos (utilizan células madre de un hermano o pariente cercano). En ciertas condiciones fisiológicas o experimentales, las células madre pueden inducirse para convertirse en células con funciones especializadas, tales como células sanguíneas o células de latido rítmico del músculo cardíaco; de ahí su utilidad para el tratamiento de enfermedades cardíacas humanas.

Actualmente se están llevando a cabo estudios clínicos para tratar la cardiopatía isquémica utilizando células madre CD34+ aisladas (CD34 es una glucoproteína de la membrana celular) recogidas de sangre periférica movilizada por el factor estimulante de colonias granulocíticas (G-CSF) (Losordo et al., Circulation 115:3165-72, 2007). Se utiliza tecnología de selección de anticuerpos (Isolex 300i, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) para cosechar las células que expresan CD34+ de la sangre del paciente. A continuación, las células CD34+ se almacenan durante un período de tiempo y se inyectan utilizando un catéter en una zona del músculo cardíaco isquémico. Los experimentos preclínicos en diferentes modelos animales de isquemia han mostrado que estas células tienen utilidad clínica para tratar la enfermedad isquémica, específicamente, la isquemia inducida por cardiopatía coronaria e insuficiencia venosa periférica (Taylor et al., Diabetes Obes. Metab. 10 (Tomo 4): 5-15, 2008; y Li et al., Thromb. Haemost. 95: 301-11, 2006). La terapia celular para tratar enfermedades es técnicamente y comercialmente desafiante. Primero, las células deben recogerse ex vivo en cantidad suficiente para ser clínicamente efectivas para el tratamiento. Típicamente, esto implicaría la extracción de células autólogas antes de volver a reinyectarlas en el paciente receptor. Durante este proceso, las células deben mantenerse en una forma viable durante un período de tiempo, retener su potencial regenerativo y no deben sufrir cambios durante el almacenamiento que provoquen reacciones adversas en los pacientes. Adicionalmente, las células deben administrarse físicamente al sitio de enfermedad o lesión in vivo utilizando un catéter u otro dispositivo de administración.

Adicionalmente, la extracción de células en sitios individuales requiere procedimientos reguladores específicos de sitio que impactan negativamente en la viabilidad comercial de este enfoque.

Las células CD34+ son una población heterogénea, compuesta predominantemente por células mieloides inmaduras y también por algunas células B inmaduras. Existe evidencia acumulada de que las células CD34+ podrían no actuar como células madre en el tratamiento de enfermedades isquémicas. Por ejemplo, ahora está claro que las células CD34+ no reemplazan a células musculares dañadas y tampoco se incorporan directamente en vasos sanguíneos nuevos. En cambio, las células CD34+ actúan de forma paracrina para estimular la angiogénesis o potenciar la vascularización liberando factores proangiogénicos solubles (Hofmann et al., Circulation 111:2198-2202, 2005).

Las células CD34+ purificadas predominantemente exhiben un fenotipo blástico (90%). Aproximadamente, 33% de las células CD34+ coexpresan los marcadores CD45 y Cd11b. Cuando se cultivan ¡n vitro, estas células CD34+ pierden la expresión del marcador CD34+ y aumentan la expresión de CD45 y CD11b como una función del tiempo. Con este cambio en la expresión del marcador en la membrana celular coincide un cambio de un fenotipo blástico más inmaduro a un tipo de célula mieloide más diferenciada, por ejemplo, mielocitos y promielocitos. Utilizando ensayos in vitro que examinan la capacidad de estas células para favorecer la formación del tubo endotelial - un precursor de la generación de vasos sanguíneos, ambas poblaciones mieloides demostraron actividad proangiogénica. Estos experimentos indican que la expresión de la ¡ntegrina CD34+ no es un requisito obligatorio para que las células sean proangiogénicas.

La generación de novo de vasos sanguíneos ha sido examinada cuidadosamente utilizando enfoques genéticos en ratones. Específicamente, los experimentos han mostrado que un componente importante de la neovascularización es la incorporación de células mononucleares derivadas de la médula ósea circulantes que coexpresan los marcadores CD45 y Cd11b. Estos experimentos también han demostrado que la expresión localizada del factor derivado de células estromales 1 (SDF-1, por sus siglas en inglés) en sitios de neovascularización es esencial para retener estas células reparadoras en los alrededores de vasos sanguíneos nuevos y para favorecer la neovascularización. Las células pueden recuperarse del sitio de cultivo de vasos sanguíneos y han mostrado que estimulan la angiogénesis in vitro mediante la secreción de factores solubles que son proangiogénicos (Grunwald et al., Cell 124: 175-89, 2006).

En la técnica existe la necesidad de nuevas composiciones y métodos que estimulen la neovascularización. Aquí describimos una composición que comprende un coágulo de fibrina y SDF-1 y métodos para terapia con células reparadoras que utiliza la composición para incorporar células mieloides reparadoras endógenas y su progenie diferenciada en un sitio in vivo específico. La siguiente divulgación describe los detalles de dicha composición y métodos.

Breve descripción de la invención La invención aborda una o más necesidades en la técnica relacionadas con composiciones farmacéuticas que comprenden un coágulo de fibrina y una citocina o una combinación de citocinas, métodos para preparar la composición y métodos para administrar la composición a un sitio de enfermedad o lesión in vivo, para atraer y retener células mieloides reparadoras y su progenie diferenciada. En un aspecto específico, la citocina es SDF-1. En otros aspectos, la citocina es un factor de células madre (SCF, por sus siglas en inglés). En aspectos adicionales, el coágulo comprende una combinación de SDF-1 y SCF.

En una modalidad, la invención incluye composiciones que comprenden un coágulo de fibrina y una citocina o una combinación de citocinas. En algunos aspectos, la citocina se selecciona del grupo que consiste en factor derivado del estroma 1 (SDF-1) y factor de células madre (SCF). En un aspecto, la citocina es SDF-1. En otros aspectos, la citocina es SCF. En aspectos adicionales, la combinación de citocinas comprende el factor derivado del estroma 1 (SDF-1) y el factor de células madre (SCF). En algunos aspectos, el coágulo de fibrina comprende cualquier pinza hemostática o sellador en base a fibrina. En aspectos específicos, el coágulo de fibrina es Tisseel® o Tisseel® VHSD o Floseal®. En algunos aspectos, el coágulo de fibrina comprende fibrinógeno a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml y trombina a una concentración final de aproximadamente 0,5 lU/ml a aproximadamente 250 lU/ml. En otros aspectos, el coágulo de fibrina comprende fibrinógeno a una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml y trombina a una concentración final de aproximadamente 2 l Uml. En aspectos adicionales, las composiciones de la invención comprenden además amortiguador de fosfato o una solución salina amortiguada con fosfato. En algunos aspectos, la composición comprende SDF-1 a una concentración final de aproximadamente 1 ,0 ng/ml a aproximadamente 50.000 ng/ml. En otros aspectos, la composición comprende SDF-1 a una concentración final de aproximadamente 1 0 ng/ml a aproximadamente 5.000 ng/ml. En algunos aspectos, la composición comprende SCF a una concentración final de aproximadamente 1 ,0 ng/ml a aproximadamente 50.000 ng/ml. En otros aspectos, la composición comprende SCF a una concentración final de aproximadamente 1 0 ng/ml a aproximadamente 5.000 ng/ml.

En otra modalidad, la invención incluye métodos para preparar las composiciones que comprenden un coágulo de fibrina y una citocina o una combinación de citocinas. En ciertos aspectos, dichos métodos comprenden la etapa de mezclar la citocina o combinación de citocinas con trombina y agregar la citocina o combinación de citocinas y trombina al fibrinógeno para formar la composición de coágulo de fibrina. En algunos aspectos, la citocina se selecciona del grupo que consiste en factor derivado del estroma 1 (SDF-1 ) y factor de células madre (SCF). En otra modalidad, la invención incluye métodos para incorporar y retener células reparadoras en un sitio localizado de lesión o enfermedad en un sujeto que lo necesita. Dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones descritas en la presente al sitio de lesión o enfermedad en una cantidad efectiva para incorporar y retener células reparadoras en el sitio de lesión. En algunos aspectos, las células reparadoras son células madre. En otros aspectos, las células reparadoras son células mieloides y su progenie diferenciada. En aspectos específicos, las células reparadoras son positivas para CD34 (CD34+), CD45 (CD45+) o CD 1 1 b (CD1 1 b+). En ciertos aspectos, las células reparadoras son positivas para uno o más de CD34 (CD34+) , CD45 (CD45+) y CD1 1 b (CD 1 1 b+) .

En otra modalidad , la invención incluye métodos para tratar un sitio localizado de lesión o enfermedad en un sujeto que lo necesita. Dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones descritas en la presente al sitio de lesión o enfermedad en una cantidad efectiva para tratar la lesión o enfermedad.

En otra modalidad, la invención incluye métodos para potenciar la vascularización o inducir la angiogénesis en un sitio localizado de lesión o enfermedad en un sujeto que lo necesita. Dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones descritas en la presente al sitio de lesión o enfermedad en una cantidad efectiva para potenciar la vascularización o inducir la angiogénesis.

En otra modalidad, la invención incluye métodos para tratar la isquemia en un sujeto. Dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones descritas en la presente a un sitio de isquemia en el sujeto en una cantidad efectiva para tratar la isquemia.

En otra modalidad, la invención incluye kits para preparar cualquiera de las composiciones descritas en la presente. Dichos kits comprenden un primer vial o primer contenedor de almacenamiento que comprende fibrinógeno; un segundo vial o segundo contenedor de almacenamiento que comprende trombina; y un tercer vial o tercer contenedor de almacenamiento que comprende una citocina o una combinación de citocinas, conteniendo dicho kit opcionalmente un amortiguador de fosfato e instrucciones para el uso de los mismos.

En otras modalidades, la invención incluye usos de las composiciones descritas en la presente en la producción de un medicamento. En algunos aspectos, la invención incluye usos de las composiciones descritas en la presente en la producción de un medicamento para incorporar y retener células reparadoras en un sitio localizado de lesión o enfermedad. En otros aspectos, la invención incluye usos de las composiciones descritas en la presente en la producción de un medicamento para tratar un sitio localizado de lesión o enfermedad. En algunos aspectos, la invención incluye usos de las composiciones descritas en la presente en la producción de un medicamento para potenciar la vascularización o inducir la angiogénesis en un sitio localizado de lesión o enfermedad. En algunos aspectos, la invención incluye usos de las composiciones descritas en la presente en la producción de un medicamento para tratar la isquemia.

Aunque en varias modalidades de la invención se describen específicamente biomatrices en base a fibrina , en la invención se incluyen otras matrices biológicas tales como colágeno, gelatina, hidrogeles sintéticos y similares.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades específicas de la invención, se proporcionan a modo de ejemplo solamente, ya que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Descripción de las figuras La Figura 1 muestra sensogramas de unión de las dos isoformas de SDF1 [SDF-1a (Figura 1 a) y SDF-?ß (Figura 1 b)] con el componente sellador de fibrinógeno de TisseelOVHSD.

La Figura 2 muestra la liberación acumulada de SDF-1a de los coágulos de fibrina Tisseel® VHSD durante un periodo de siete días.

La Figura 3a representa células mieloides CD34+ aisladas recientemente en Matrigel® (BD Biosciences). El ensayo Matrigel® mostró que en un punto de tiempo de 7 días, los tubos de células endoteliales no presentaron retroceso cuando las células CD34+ estaban presentes en comparación con las células endoteliales solas. La Figura 3b muestra que las células mieloides que coexpresan CD45b y CD11b son proangiogénicas in vitro.

La Figura 4a muestra la incorporación de células mieloides CD45+/CD11b+ en coágulos Tisseel®-SDF-1 implantados in vivo. Las células que coexpresan CD45+ y CD11b se incorporaron en mayor cantidad en coágulos Tisseel®-SDF-1 que en coágulos Tisseel® sin SDF-1. La Figura 4b muestra que SDF-1 aumentó la incorporación in vivo de células derivadas de la médula ósea EGFP+ y CD45+/CD11b+ en coágulos Tisseel®-SDF-1 inyectados de forma intramuscular en comparación con los testigos (PBS). La Figura 4c muestra la incorporación de células del antígeno de células madre 1 (Sca-1, por sus siglas en inglés)+ in vivo. Los coágulos Tisseel®-SDF-1 implantados in vivo incorporaron cantidades mayores de células que expresan Sca1, el equivalente murino de CD34.

Descripción detallada de la invención La invención proporciona una biomatriz de fibrina o coágulo de fibrina biodegradable, biocompatible que se utiliza para administrar varias citocinas incluidas, a modo no limitante, SDF-1 y/o SCF. En ciertos aspectos, la invención proporciona varias formulaciones de coágulo de fibrina mediante las cuales se administran citocinas para incorporar células reparadoras en un sitio de enfermedad o lesión y aumentar el tiempo de retención de las células en el sitio. El coágulo de fibrina proporciona una matriz tridimensional para administrar una citocina, incorporar células reparadoras e imitar un ambiente in vivo en tejidos u órganos. La presente invención proporciona dichas formulaciones de coágulos de fibrina y métodos para su utilización.

Antes de explicar las modalidades de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y a la disposición de los componentes establecidos en la siguiente descripción o ilustrados en las figuras y ejemplos. Los títulos de las secciones utilizados en la presente son solamente a efectos organizativos y no deben interpretarse como limitantes del contenido descrito. Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente a modo de referencia en la presente.

La invención abarca otras modalidades y se pone en práctica o lleva a cabo de varias formas. Además, debe entenderse que la fraseología y terminolog ía utilizada en la presente es a efectos de describir y no debe interpretarse como limitante. Se pretende que los términos "incluye", "comprende" o "tiene" y variaciones de los mismos, abarquen los artículos mencionados después de los mismos y equivalentes de los mismos así como también artículos adicionales.

Definiciones A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado tal como lo entiende comúnmente un experto en la técnica a quien corresponde esta invención. Las siguientes referencias proporcionan al experto una definición general de varios de los términos utilizados en esta invención: Singleton, et al. , DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECU LAR BIOLOGY (2a ed. 1994); THE CAMBRI DGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed. , 1 988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5a ED. , R. Rieger, et al. (eds ), Springer Verlag (1991 ); y Hale and Marham, THE HARPER COLLI NS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991 ).

Las siguientes abreviaturas se util iza n en toda la presente.

EGFP Proteína verde fluorescente mejorada FACS Sepa ración de cél ulas activadas por fluorescencia GM-CSF Factor estimulante de colonias de g ranulocitos-macrófagos SDF- 1 Factor derivado del estroma 1 SDF- 1 a Factor derivado del estroma 1 alfa SDF- 1 ß Factor derivado del estroma 1 beta HUVEC Célula endotelial de vena umbilical humana I U Unidades internacionales kDa KiloDaltons µ? o pL Microlitros mi o m L Mililitros ng Nanog ramo Se i nd ica en la presente q ue tal como se uti lizan en esta memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" , "una" y "él/ella" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Los térm inos "fibrina", "matriz de fibrina", "biomatriz de fibrina", "coágulo de fibrina", "soporte en base a fibrina", "soporte de fibrina", "cola de fibri na", "gel de fibrina", "adhesivo de fibrina" y "sellador de fibrina" a menudo se util izan de forma intercam biable en la presente y en la técnica para referirse a una red tridimensional q ue comprende al menos un com ponente de fibrinógeno y un componente de trombina. La invención incluye coágulos de fibrina q ue comprenden cualquier pinza hemostática o sellador en base a fibrina tales como se describen en la presente.

El término "citocina" se refiere a un grupo diverso de proteínas pequeñas segregadas que tienen un papel fundamental en la regeneración de los tejidos y en la mediación y regulación de la inmunidad, inflamación y hematopoyesis. La expresión "combinación de citocinas" se refiere a cualesquiera dos o más citocinas conocidas en la técnica incluidas, a modo no limitante, el factor derivado de células estromales 1 (SDF-1) y el factor de células madre (SCF).

Los términos "SDF-1" o "SDF-1a" o "SDF-?ß" se refieren al polipéptido del factor derivado de células estromales 1, una citocina pequeña que pertenece a la familia quimiocina. En varios aspectos, los términos "SDF-1" y "SDF-1a" se utilizan de forma intercambiable. En otros aspectos, los términos "SDF-1" y "SDF-?ß" se utilizan de forma intercambiable.

El término "SCF" se refiere al polipéptido del factor de células madre, una citocina que pertenece a la familia quimiocina.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de forma intercambiable en la presente para referirse a una polímero de residuos de aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos. Los términos corresponden a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como también de polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. El término "proteína" típicamente se refiere a polipéptidos grandes. El término "péptido" típicamente se refiere a polipéptidos cortos. Los polipéptidos sintéticos pueden prepararse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de polipéptidos automatizado.

Se entiende específicamente que cualquier rango de valores numéricos divulgado en la presente incluye todos los valores desde el valor más bajo al valor más alto, es decir, todas las combinaciones posibles de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerados deben considerarse como indicadas expresamente en esta solicitud. Por ejemplo, si un rango de concentración se indica como aproximadamente 1 % a 50% , se pretende que los valores tales como 2 % a 40% , 1 0% a 30% o 1 % a 3% , etc . , estén en u m e rad os expresa mente en esta memoria descriptiva. Los valores indicados anteriormente son solo ejemplos de lo que se pretende específicamente.

Los rangos, en varios aspectos, se expresan en la presente como "aproximadamente" una valor específico y/o a "aproximadamente" otro valor específico. Cuando los valores se expresan como aproximaciones mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que algo de variación se incluye en el rango.

Tal como se usa en la presente un "fragmento" de un polipéptido se refiere a cualquier porción del polipéptido menor que el polipéptido o producto de expresión proteica de longitud completa. Los fragmentos son típicamente análogos de deleción del polipéptido de longitud completa en donde uno o más residuos de aminoácidos han sido eliminados del extremo am ínico y/o e l extremo carboxílico del polipéptido de longitud completa. Por consiguiente, los "fragmentos" son un subconjunto de análogos de deleción descritos a continuación. La invención incluye fragmentos de polipéptidos que conservan la actividad biológica. Por ejemplo, la invención incluye fragmentos biológicamente activos de las citocinas divulgadas en la presente.

Tal como se utiliza en la presente un "análogo" se refiere a un polipéptido sustancialmente similar en estructura y que tiene la misma o esencialmente la misma actividad biológica, aunque en ciertos casos, hasta un grado de diferenciación , que una molécula de origen natural. Los análogos difieren en la composición de las secuencias de aminoácidos en comparación con el polipéptido de origen natural del cua l deriva e l a ná log o , en base a un a o m ás m utaci o nes q ue i m pl ica n (i) deleción de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más extremos del polipéptido (incluidos fragmentos tales como se describieron anteriormente) y/o una o más regiones internas de la secuencia del polipéptido de origen natural, (ii) inserción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más extremos (típicamente una análogo de "adición") del polipéptido y/o una o más regiones internas (típicamente una análogo de "inserción") de la secuencia del polipéptido de origen natural o (iii) sustitución de uno o más am inoácidos por otros aminoácidos en la secuencia del polipéptido de origen natural. Las sustituciones son conservadoras o no conservadoras en base a la relación físico-química o funcional entre el aminoácido que se va a reemplazar y el aminoácido que va a reemplazarlo. La invención incluye análogos de los polipéptidos de citocina divulgados en la presente.

Un "análogo modificado de forma conservadora" es un polipéptido que comprende sustituciones conservadoras de aminoácidos por aminoácidos químicamente similares. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen en la técnica. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1 ) Alanina (A), Glicina (G); 2 ) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3 ) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4 ) Arginina (R), Lisina (K); 5 ) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); 6 ) Fen ilala n i na (F) , Ti rosi na (Y) , Tri ptófa n o (W) ; 7 ) Serina (S), Treonina (T); y 8 ) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1 984)).

Dichos análogos modificados de forma conservadora son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecíficos y variantes alélicas.

Una "variante alélica" típicamente se refiere a cualquiera de dos o más formas polimórficas de un gen que ocupan el mismo locus genético. Las variaciones alélicas surgen naturalmente a través de la mutación y pueden resultar en un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. En ciertos aspectos, las mutaciones génicas son inactivas (no hay cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipeptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Las "variantes alélicas" también se refieren a cDNAs derivados de transcritos de mRNA de variantes alélicas genéticas, así como las proteínas codificadas por los mismos.

Tal como se usa en la presente una "variante" se refiere a un polipéptido, proteína o análogo de los mismos que se modifica para comprender restos químicos adicionales que no son normalmente parte de la molécula. Dichos restos, en varios aspectos, modulan la solubilidad, absorción y/o semivida biológica de la molécula. Los restos, en varios aspectos adicionales, alternativamente disminuyen la toxicidad de la molécula y eliminan o atenúan cualquier efecto secundario indeseado de la molécula, etc. Los restos capaces de mediar dichos efectos se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). El procedimiento para acoplar dichos restos a una molécula se conocen en la técnica. Por ejemplo, la variante, en algunos aspectos, es una molécula de polipéptido de citocina que tiene una modificación química que confiere una semivida más extensa in vivo al polipéptido de citocina. En una modalidad, los polipéptidos se modifican mediante la adición de un polímero soluble en agua conocido en la técnica. En una modalidad relacionada, los polipéptidos se modifican mediante glucosilación, PEGilación y/o polisialilación. La invención incluye variantes de los polipéptidos de citocina divulgados en la presente.

Tal como se utiliza en la presente "marcador seleccionable" se refiere a un gen que codifica una enzima u otra proteína que confiere a la célula u organismo en el cual se expresa una cambio fenotípico identificable tal como resistencia a una fármaco, antibiótico u otro agente, de forma que la expresión o actividad del marcador se selecciona a favor (por ejemplo, a modo no limitante, un marcador positivo, tal como el gene neo) o en contra (por ejemplo, a modo no limitante, un marcador negativo, tal como el gene de la difteria). Un "marcador seleccionable heterólogo" se refiere a un gene marcador seleccionable que se ha insertado en el genoma de un animal en el cual no se encontraría normalmente.

Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, a modo no limitante, un gen de resistencia a antibióticos tales como neomicina (neo), puromicina (Puro) , toxina diftérica, fosfotransferasa, higromicina fosfotransferasa, xantinaguanina fosforibosil transferasa, la timidina cinasa del virus del herpes simple tipo 1 , adenina fosforibosiltransferasa e hipoxantina fosfonbosiltransferasa. En un aspecto de la invención, un marcador seleccionable es la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP). La EGFP es adecuada como reactivo testigo para estudios de expresión y se utiliza en la presente tal como se describe en los Ejemplos. El experto en la técnica entenderá que cualquier marcador seleccionable conocido en la técnica es útil para los métodos descritos en la presente.

El término "agente" o "compuesto" describe cualquier molécula, por ejemplo proteica o farmacéutica, con la capacidad de afectar un parámetros biológico en la invención.

Un "control", tal como se usa en la presente, puede referirse a un control activo, positivo, negativo o veh ículo. Tal como lo entenderá un experto en la técnica, los testigos se utilizan para establecer la relevancia de los resultados experimentales y proporcionar una comparación para la afección que se está tratando.

Las expresiones "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" ta les como se utilizan en la presente se refieren a uno o más materiales de formulación adecuados para log rar o mejorar la administración de una com posición de la invención .

Las expresiones "ca ntidad efectiva" y "ca ntidad terapéuticamente efectiva" se refieren cada una a la ca ntidad de una composición que comprende un coágulo de fibrina y una citoci na para log rar una cambio observable en un sujeto tal como se esta blece en la presente. Por ejem plo , en ciertos aspectos de la inve n ció n , u na ca ntidad efectiva sería la cantidad necesaria para atraer y retener células madres o células mieloides proang iogénicas y su progenie diferenciada en el coágulo de fibrina ¡n vivo. Una "cantidad efectiva" y una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una composición para em plearse terapéuticamente dependerá, por ejem plo, del contexto y los objetivos terapéuticos.

El término "combinación" se refiere a uno o más polipéptidos o composiciones de la invención . En algunos aspectos, las combinaciones de moléculas de la invención se administran para proporcionar una angiogénesis aumentada o una vascu larización potenciada en un sitio de lesión o enfermedad .

A un "sujeto" se le da su significado convenciona l de un ser vivo que no es vegetal ni protozoario. En la mayoría de los aspectos, el sujeto es un animal . En aspectos específicos , el animal es un mam ífero. En aspectos más específicos, el mam ífero es un humano. En otros aspectos, el mamífero es una mascota o animal de compañía, un animal de granja domesticado o un animal de zoológico. En ciertos aspectos, el mamífero es un gato, perro, caballo o vaca.

Coágulo de fibrina En algunos aspectos, la invención incluye coágulos de fibrina formados mezclando el componente de fibrinógeno con el componente de trombina. La fibrina, también conocida como factor la, es una proteína fibrosa, no globular que participa en la coagulación de la sangre. Más específicamente, la fibrina se produce a partir de la escisión del fibrinógeno, una glucoproteína plasmática soluble sintetizada por el hígado que se encuentra en el plasma sanguíneo. Procesos en la cascada de coagulación activan el zímógeno protrombínico en la serina proteasa trombina, que es responsable por convertir el fibrinógeno en fibrina. A continuación las moléculas de fibrina se combinan para formar hilos de fibrina largos que enredan a las plaquetas, acumulando una masa esponjosa que gradualmente forma un polímero complejo que se contrae para formar el coágulo de sangre. Este proceso de endurecimiento se estabiliza mediante una sustancia conocida como factor estabilizador de fibrina o factor XIII.

Un coágulo de fibrina o matriz de fibrina es una red de proteína que se mantiene unida y sostiene una variedad de tejidos vivos, especialmente en respuesta a lesiones. Este coágulo de fibrina aprovecha la etapa final de la cascada de coagulación en la cual las moléculas de fibrinógeno se escinden mediante la trombina, se convierten en monómeros de fibrina y se ensamblan en fibrillas, formando finalmente fibras en una red tridimensional . Simultáneamente, el factor XI I I (FXI I I) presente en la solución se activa mediante la trombina en presencia de iones de calcio en el factor XII la . Los monómeros de fibrina acumulados y cualquier fibronectina restante posiblemente presente se reticulan para formar un polímero elevado mediante la formación de nuevos enlaces peptídicos. Mediante esta reacción de reticulación , la resistencia del coágulo formado aumenta sustancialmente. Generalmente, este coágulo se adhiere bien a la herida y a las superficies de tejido, lo cual produce el efecto adhesivo y hemostático. (Ver la Patente de los Estados U nidos No . 7.241 .603) . Por consiguiente, los adhesivos de fibrina se usan frecuentemente como adhesivos de dos componentes que comprenden un componente de complejo de fibrinógeno junto con un componente de trombina que contiene adicionalmente iones de calcio.

En la invención, el coágulo de fibrina es una red tridimensional que comprende al menos un componente de fibrinógeno y un componente de trombina, la cual puede actuar como un soporte para la administración de una citocina o una combinación de citocinas con el trascurso del tiempo. En algunos aspectos, la citocina es cualquier citocina que participa en la hematopoyesis y en la proliferación de células madre. En algunos aspectos, la citocina es SDF-1 . En otros aspectos, la citocina es SCF. En aspectos más específicos, el coágulo de fibrina comprende una combinación de citocinas. En aspectos específicos, la invención incluye una combinación de SDF-1 y SCF.

Dicha matriz de fibrina o coágulo de fibrina se proporciona de forma natural en el cuerpo después de una lesión, pero también puede manipularse como un sustituto de tej ido tal como se describe en la presente para acelerar la curación . El coágulo de fibrina consiste en biomateriales de origen natural compuestos por una red de fibrina reticulada y tiene un uso extendido en aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, se utiliza para controlar hemorragias quirúrgicas, acelerar la curación de heridas, cerrar órganos corporales huecos o cubrir agujeros hechos mediante suturas estándares y proporcionar una administración de liberación lenta de medicamentos como antibióticos a tejidos expuestos. Dicho coág u lo de fi bri na es útil pa ra re pa ra r les iones en el cuerpo y es útil en sitios de isquemia. En investigaciones biomédicas, los coágulos de fibrina se han utilizado para rellenar cavidades óseas y reparar neuronas, válvulas card iacas y la superficie del ojo. Los coágulos de fibrina también se han utilizado en el tracto urinario, hígado, pulmón, bazo, riñon y oído. En la presente invención, los coágulos de fibrina se utilizan en cualquier sitio del cuerpo.

Los selladores de fibrina son un tipo de adhesivo de tejido quirúrgico derivado de hemoderivados humanos y animales. Los ingredientes en los selladores de fibrina interactúan durante la aplicación para formar un coágulo estable compuesto por fibrina. Los selladores de fibrina se utilizan para controlar hemorragias quirúrgicas, acelerar la curación de heridas, cerrar órganos corporales huecos o cubrir agujeros hechos mediante suturas estándares y proporcionar una administración de liberación lenta de medicamentos como antibióticos a tejidos expuestos. Desde 2003, todos los selladores de fibrina utilizados en los Estados Unidos se hacen a partir de plasma sanguíneo tomado de donadores seleccionados cuidadosamente y evaluados rigurosamente para eliminar virus de la hepatitis, HIV-1 y parvovirus. Todos los selladores de fibrina en uso desde el 2003 tienen dos ingredientes principales, la proteína fibrinógeno purificada y la enzima trombina purificada derivada de sangre humana o bovina (ganado). Muchos selladores tienen dos ingredientes adicionales, factor XIII de sangre humana y aprotinina, derivada de pulmones de vacas. El factor XIII le da resistencia a los coágulos de sangre formando ligaduras entre las hebras de fibrina. La aprotinina inhibe las enzimas que descomponen los coágulos de sangre. Se describen ejemplos de selladores de fibrina en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.716.645; 5.962.405; y 6.579.537 y están disponibles en forma líquida Mofilizada, congelada o no congelada. Los selladores de fibrina también han sido diseñados desprovistos del ingrediente aprotinina (EVICEL, Ethicon, Inc., Nueva Jersey). La invención incluye el uso de todos los tipos de selladores de fibrina.

Una ventaja específica de un sellador de fibrina es que el adhesivo/gel no permanece en el sitio de aplicación como un cuerpo extraño, sino que se reabsorbe completamente tal como en la curación natural de una herida y se reemplaza por tejido formado nuevamente. Varias células, por ejemplo, macrófagos y, posteriormente fibroblastos migran en el gel, lisan y reabsorben el material de gel y forman tejido nuevo. Los selladores de fibrina se han utilizado para formar coágulos de fibrina o geles de fibrina in situ y estos geles de fibrina se han utilizado para administrar células y factores de crecimiento (Cox et al., Tissue Eng. 10:942-954, 2004; y Wong et al., Thromb. Haemost. 89:573-582, 2003).

En algunos aspectos de la invención, se utilizan selladores de fibrina tales como Tisseel® (Baxter International Inc.) y Tisseel® Vapor Heat Solvent Detergent (Tisseel® VHSD) (Baxter International Inc.), un sellador de fibrina de última generación. Tisseel® VHSD se desarrolló con una etapa de inactivación de virus agregada (tratamiento con disolvente/detergente [S/D, por sus siglas en inglés]) para proporcionar seguridad y conveniencia agregadas al producto actualmente bajo licencia Tisseel®. Tisseel® VHSD se indica para uso como auxiliar para la hemostasis en cirugías que implican circulación extracorporal y tratamiento de lesiones esplénicas. En aspectos específicos de la invención, se prepara un coágulo de fibrina a partir de Tisseel® o Tisseel® VHSD. En otros aspectos, se utilizan selladores de fibrina tales como Floseal® (Baxter International Inc.). Floseal® es una matriz hemostática efectiva que detiene hemorragias en 2 minutos o menos (tiempo medio para la hemostasis).

Tal como se trató anteriormente en la presente, los coágulos de fibrina, en un aspecto, se preparan a partir de soluciones separadas de trombina y fibrinógeno. Las soluciones de trombina y fibrinógeno se cargan en una jeringa de dos cuerpos que permite que se mezclen y combinen. A medida que las soluciones de trombina y fibrinógeno se combinan, se desarrolla un coágulo de la misma forma que se formaría durante la coagulación sanguínea normal a través de una serie de reacciones químicas conocidas como la cascada de coagulación. Al finalizar la cascada, la trombina separa las moléculas de fibrinógeno en moléculas de fibrina que se disponen en cadenas que a continuación se reticulan mediante el Factor XIII para formar una retículo o patrón similar a una red que estabiliza el coágulo.

Los métodos adicionales para producir preparaciones que contienen fibrinógeno que pueden utilizarse como adhesivos de tejido incluyen producción a partir de crioprecipitado, opcionalmente con etapas de lavado y precipitación adicionales con etanol, sulfato de amonio, polietilenglicol, glicina o beta-alanina y producción a partir de plasma dentro del alcance de los métodos de fraccionamiento de plasma conocidos, respectivamente (cf., por ejemplo, "Methods of plasma protein fractionation", 1980, ed.: Curling, Academic Press, pp. 3-15, 33-36 y 57-74, o Blomb ck B. y M., "Purification of human and bovine fibrinogen", Arkiv. Kemi. 10, 1959, p. 415 f.). Los coágulos de fibrina o selladores de fibrina, en algunos aspectos, se hacen utilizando el plasma sanguíneo del propio paciente. Por ejemplo, los sistemas selladores de fibrina CRYOSEAL (Thermogenesis Corp., Rancho Cordova, CA) o VIVOSTAT (Vivolution A/S, Dinamarca) permiten la producción de componentes de sellador de fibrina autólogos a partir del plasma sanguíneo del paciente. Los componentes de los selladores de fibrina están disponibles en forma de líquido, liof ilizado o líquido congelado a baja temperatura.

Tal como se trató anteriormente, en varios aspectos el coágulo de fibrina comprende fibrinógeno y trombina. El tiempo de polimerización del fibrinógeno y la trombina es afectado por la concentración de fibrinógeno y trom bina así como también por la temperatura. La caracterización del coágulo de fibrina mediante microscopía electrónica de barrido revela que a concentraciones más bajas de fibrinógeno se obtienen fibras espesas que componen u na estructura densa y a medida que la concentración de fibrinógeno aumenta se pueden obtener fibras más delgadas y un gel más fuerte. En ciertos aspectos, la estructura del coágulo de fibrina se modifica mediante el amortiguador de dilución utilizado en la preparación del coág ulo de fibrina. La concentración de trom bi na no pa rece afecta r en g ra n med id a a la po l i m erizaci ón co mo el fibrinógeno, pero en concentraciones de fibrinógeno definidas, las fibras del coágulo de fibrina se vuelven más delgadas de forma constante con el aumento de las concentraciones de trombina. En aspectos adicionales, el coágulo de fibrina además comprende colágeno, fibronectina y otras proteínas de matriz. En aspectos adicionales, el coágulo de fibrina es bioabsorbible y biocompatible.

Otras biomatrices biológicas Aunque en varias modalidades de la invención se describen específicamente biomatrices en base a fibrina, en la invención se incluyen otras matrices biológicas tales como colágeno, gelatina, hidrogeles sintéticos y similares. En varios aspectos, al igual que las biomatrices en base a fibrina descritas en la presente, estas otras matrices biológicas comprenden una citocina o una combinación de citocinas. En aspectos específicos, estas biomatrices comprenden SDF-1, SCF o una combinación de SDF-1 y SCF.

Citocinas La invención incluye composiciones y métodos que comprenden una o más citocinas. El término "citocina" es un nombre genérico para un grupo diverso de proteínas pequeñas segregadas que tienen un papel fundamental en la regeneración de los tejidos y en la mediación y regulación de la inmunidad, inflamación y hematopoyesis. Aunque "citocina" es un nombre general utilizado para estas proteínas pequeñas segregadas, otros nombres incluyen linfocina (citocinas hechas por linfocitos), monocina (citocinas hechas por monocitos), quimiocina (citocinas con actividades quimiotácticas) e interleucina (citocinas hechas por un leucocito y que actúan en otros leucocitos) y todos se incluyen para uso en la invención. En aspectos específicos, a modo no limitante, las citocinas incluyen activina, proteína morfogénica ósea (BMP), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF), ligando Flt-3/Flk-2, factor estimulante de colonias de granulocíticas (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento similar a insulina 1 y 2 (IGF-1 y IGF-2), interferón-y (IFN-?), interleucina-1 a -15 (IL-1 a IL-15), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), neurotrofina, factor de crecimiento derivado de plaquetas AB (PDGF-AB), factor de células madre (SCF), factor 1 derivado de células estromales (SDF-1), factor de transformación del crecimiento-ß (TGF-ß), factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Factor derivado del estroma 1 (SDF- 1) En algunos aspectos, la invención incluye moléculas, fragmentos y análogos de los mismos del polipéptido de factor derivado de células estromales 1 (SDF-1 ) y composiciones q ue comprenden estas moléculas. El SDF-1 es una pequeña citocina que pertenece a la familia quimiocina que se designa oficialmente Quimiocina (motivo C-X-C) ligando 1 2 (CXCL1 2). El SDF-1 se produce en dos formas, SDF-1 a/CXCL 1 2a (SDF-1 a) y SDF- 1 ß/CXCL I 2b (SDF-? ß) , mediante empalme alterno del m ismo gen . En varios aspectos, ambas formas, SDF- 1 a y SDF , se utilizan, y el término "SDF-1 " se utiliza de forma intercam biable en la presente para referirse a una o ambas formas.

Las quimiocinas se caracterizan por la presencia de cuatro cisteínas conservadas, las cuales forman dos enlaces disulfuro. Las proteínas CXCL1 2 pertenecen al grupo de quimiocinas CXC , cuyo par inicial de cisteínas está separado por un aminoácido intermedio. La CXCL1 2 tiene un papel importante en la angiogénesis incorporando células genitoras endoteliales (EPCs) de la médula ósea a través de un mecanismo dependiente de CXCR4.

En ciertos aspectos de la invención , se agrega SDF-1 al componente de fibrinógeno antes de mezclarlo con el componente de trombina o después que se ha formado coágulo. El coágulo de fibrina que contiene SDF-1 posteriormente libera SDF-1 del coágulo al ambiente. El SDF-1 liberado, a su vez, atrae a las células hasta el sitio donde se aplicó el coágulo. La concentración local relativamente alta de SDF-1 dentro del coágulo de fibrina ayuda a retener las células alrededor del coágulo. En varios aspectos, esta preparación se aplica en muchos sitios diferentes en pacientes, ya que Tisseel® VHSD ya se utiliza en una gran cantidad de aplicaciones quirúrgicas diferentes donde exhibe una amplia adherencia y compatibilidad con los tejidos.

Factor de células madre (SCF) En algunos aspectos, la invención incluye moléculas, fragmentos o análogos de los mismos del polipéptido del factor de células madre (SCF), también conocido como ligando kit, KL, o factor acero y composiciones que comprenden estas moléculas. El SCF es una citocina que se une al receptor c-Kit (CD117). El SCF puede salir como una proteína soluble y como una proteína de transmembrana, y ambas formas son necesarias para la función hematopoyética normal. En varios aspectos, se utilizan ambas formas de SCF.

El SCF tiene una papel importante en la hematopoyesis (formación de células sanguíneas), espermatogénesis y melanogenesis. En un aspecto específico, el SCF tiene un papel importante en la hematopoyesis durante el desarrollo embrionario. Los sitios donde se lleve a cabo la hematopoyesis, tal como el hígado y la médula ósea fetales, expresan todos SCF. Sin restringirse a ninguna teoría, el SCF puede servir para dirigir a las células madre hematopoyéticas (HSC) a sus nichos de célula madre (el microambiente donde reside una célula madre) y tiene un papel importante en el mantenimiento de las HSC.

En ciertos aspectos de la invención, se agrega SCF al componente de fibrinógeno antes de mezclarlo con el componente de trombina o después que se ha formado coágulo. El coágulo de fibrina que contiene SCF posteriormente libera SCF del gel al ambiente. El SCF liberado, a su vez, atrae a las células hasta el sitio donde se aplicó el gel. La concentración local relativamente alta de SCF dentro del coágulo de fibrina ayuda a retener las células alrededor del coágulo. En varios aspectos, esta preparación se aplica en muchos sitios diferentes en pacientes, ya que Tisseel® VHSD ya se utiliza en una gran cantidad de aplicaciones quirúrgicas diferentes donde exhibe una amplia adherencia y compatibilidad con los tejidos.

Células En algunos aspectos, la invención incluye métodos para utilizar un coágulo de fibrina que comprenden una citocina para incorporar células reparadoras o regenerativas en un sitio de lesión o enfermedad ¡n vivo. En ciertos aspectos de la invención, la célula reparadora es una célula madre. Una célula madres es una célula que tiene el potencial para regenerar el tejido durante el transcurso de su vida. Por ejemplo, la prueba estándar de excelencia para una célula madre de médula ósea (BM, por sus siglas en inglés) o hematopoyética (HSC) es la capacidad para trasplantar una célula y salvar a un individuo sin HSC. En algunos aspectos de la invención, la célula reparadora es una célula mieloide. La línea de células mieloides comienza como células madre mieloides producidas en la BM. Las células mieloides, en varios aspectos, maduran en varios tipos de células sanguíneas, incluidos megacariocitos, eritrocitos, macrófagos, eosinófilos, neutrófilos y basófilos. En aspectos adicionales, la invención incluye una progenie diferenciada de células mieloides.

Angiogénesis inducida por células mieloides En ciertos aspectos, la invención incluye métodos para utilizar una composición que comprende un coágulo de fibrina y una citocina para incorporar células mieloides y su progenie diferenciada in vivo para inducir la angiogénesis o potenciar la vascularización. En el adulto, la angiogénesis es esencial para la reparación de heridas y la inflamación y para funciones altamente especializadas, tales como la regeneración del endometrio. Uno de los descubrimientos importantes en los últimos años ha sido la identificación del papel de los diferentes tipos celulares en la angiogénesis.

Tal como con las células endoteliales (EC) y sus precursores de BM, las poblaciones heterogéneas de células derivadas de la BM del linaje mieloide contribuyen en el proceso angiogénico. Estas poblaciones celulares, que se originan a partir de un precursor derivado de la BM común, circulan en la sangre periférica hasta que se incorporan en los tejidos mediante quimiotrayentes específicos.

En varios aspectos, las células madre se incorporan al coágulo de fibrina que comprende la citocina. En un aspecto específico, se incorporan las células que expresan CD34 (células CD34 + ). Las células CD34+ son una población heterogénea, compuesta predominantemente por células mleloides inmaduras y también por algunas células B inmaduras. Existe evidencia acumulada de que las células CD34+ podrían no actuar como células progenitoras en el tratamiento de enfermedades isquémicas. Las células CD34+ purificadas predominantemente exhiben un fenotipo blástico (90%). Aproximadamente, 33% de las células CD34+ coexpresan los marcadores CD45 y Cd11 b. Por consiguiente, en varios aspectos, se incorporan las células que expresan CD45 (células CD45+) y/o células que expresan CD11b (células CD11b+). Las células CD11b+ son células progenitoras mieloides, que se originan a partir de la médula ósea y participan en la promoción de la angiogénesis y linfangiogénesis. En una aspecto adicional de la invención, las células que expresan uno o más, o una combinación, de CD34, CD45 y CD11b se incorporan al coágulo de fibrina.

Las expresiones "potenciar la vascularización" o "inducir la angiogénesis" se utilizan en la presente para describir medios para formar redes vasculares. La vasculogénesis y la angiogénesis son procesos fundamentales mediante los cuales se forman los vasos sanguíneos. En la técnica, la vasculogénesis se define como la diferenciación de las células precursoras (angioblastos) en células endoteliales y la formación de novo de una red vascular primitiva, mientras que la angiogénesis se define como el crecimiento de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes. La formación de tubos capilares o la formación de tubos endoteliales representa un función de la célula endotelial especializada y es un prerrequisito para el establecimiento de un lumen del vaso continuo. La invención incluye composiciones y métodos para potenciar la vascularización así como también inducir o potenciar la angiogénesis.

La generación de novo de vasos sanguíneos ha sido examinada cuidadosamente utilizando enfoques genéticos en ratones. Específicamente, los experimentos han mostrado que un componente importante de la neovascularización es la incorporación de células mononucleares derivadas de la médula ósea circulantes que coexpresan los marcadores CD45 y Cd11b.

En otros aspectos, se incorporan células que expresan el antígeno 1 de células madre (Sca-1), el equivalente murino de CD34. El Sca-1 es un antígeno de superficie celular expresado en células progenitoras hematopoyéticas inmaduras y, junto con otros marcadores, define células madre hematopoyéticas. La proteína CD34 es miembro de una familia de proteínas sialomucinas transmembrana de un solo paso que exhiben expresión en tejido inicial hematopoyético y vascular.

Composición y Métodos Los aspectos de la invención proporcionan composiciones y métodos para la medicina regenerativa. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden materiales y citocinas de matriz o coágulo de fibrina biocompatible. En ciertos aspectos, la citocina es SDF-1. En otros aspectos, la citocina es SCF.

Los componentes del coágulo de fibrina se agregan a concentraciones apropiadas para proporcionar el tipo de liberación controlada deseada.

El fibrinógeno se agrega a concentraciones variables que incluyen, a modo no limitante, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 11 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 13 mg/ml, aproximadamente 14 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 16 mg/ml, aproximadamente 17 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml, aproximadamente 23 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 26 mg/ml, aproximadamente 27 mg/ml, aproximadamente 28 mg/ml, aproximadamente 29 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 31 mg/ml, aproximadamente 32 mg/ml, aproximadamente 33 mg/ml, aproximadamente 34 mg/ml, aproximadamente 35 mg/ml, aproximadamente 36 mg/ml, aproximadamente 37 mg/ml, aproximadamente 38 mg/ml, aproximadamente 39 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, aproximadamente 41 mg/ml, aproximadamente 42 mg/ml, aproximadamente 43 mg/ml, aproximadamente 44 mg/ml, aproximadamente 45 mg/ml, aproximadamente 46 mg/ml, aproximadamente 47 mg/ml, aproximadamente 48 mg/ml, aproximadamente 49 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml y hasta aproximadamente 200 mg/ml (concentraciones finales en los geles) o en concentraciones intermedias, según sea necesario. En ciertos aspectos, el fibrinógeno se agrega a concentraciones de aproximadamente 10 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml.

Adicionalmente, el fibrinógeno puede combinarse con cualquier concentración apropiada de trombina. La trombina se agrega a concentraciones variables que incluyen, a modo no limitante, aproximadamente 0,1 lU/ml, aproximadamente 0,2 lU/ml, aproximadamente 0,3 lU/ml. aproximadamente 0,4 lU/ml, aproximadamente 0,5 lU/ml, aproximadamente 0,6 lU/ml, aproximadamente 0,7 lU/ml, aproximadamente 0,8 lU/ml, aproximadamente 0,9 lU/ml, aproximadamente 1 lU/ml, aproximadamente 1,1 lU/ml, aproximadamente 1,2 lU/ml, aproximadamente 1,3 lU/ml, aproximadamente 1,4 lU/ml, aproximadamente 1,5 lU/ml, aproximadamente 2 lU/ml, aproximadamente 3 lU/ml, aproximadamente 4 lU/ml, aproximadamente 5 lU/ml, aproximadamente 6 lU/ml, aproximadamente 7 lU/ml, aproximadamente 8 lU/ml, aproximadamente 9 lU/ml, aproximadamente 10 lU/ml, aproximadamente 11 lU/ml, aproximadamente 12 lU/ml, aproximadamente 13 lU/ml, aproximadamente 14 lU/ml, aproximadamente 15 lU/ml, aproximadamente 16 lU/ml, aproximadamente 17 lU/ml, aproximadamente 18 lU/ml, aproximadamente 19 lU/ml, aproximadamente 20 lU/ml, aproximadamente 21 lU/ml, aproximadamente 22 lU/ml, aproximadamente 23 lU/ml, aproximadamente 24 lU/ml, aproximadamente 25 lU/ml, aproximadamente 30 lU/ml, aproximadamente 35 lU/ml, aproximadamente 40 lU/ml, aproximadamente 45 lU/ml, aproximadamente 50 lU/ml, aproximadamente 60 lU/ml, aproximadamente 70 lU/ml, aproximadamente 80 lU/ml, aproximadamente 90 lU/ml, aproximadamente 100 lU/ml, aproximadamente 110 lU/ml, aproximadamente 120 lU/ml, aproximadamente 130 lU/ml, aproximadamente 140 lU/ml, aproximadamente 150 lU/ml, aproximadamente 160 lU/ml, aproximadamente 170 lU/ml, aproximadamente 180 lU/ml, aproximadamente 190 lU/ml, aproximadamente 200 lU/ml, aproximadamente 225 lU/ml, aproximadamente 250 lU/ml, aproximadamente 275 lU/ml, aproximadamente 300 lU/m I o en concentraciones intermedias, según sea necesario. En ciertos aspectos, la trombina se agrega a concentraciones de aproximadamente 2 lU/ml y aproximadamente 4 lU/ml.

En algunos aspectos, las composiciones de la invención comprende formulaciones de coágulo de fibrina (relaciones entre trombina y fibrinógeno) en relaciones que varían de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100,0. En otro aspecto, las relaciones entre trombina y fibrinógeno varían de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10,0. En varios aspectos, la relación es aproximadamente 0,04, o aproximadamente 0,05 o aproximadamente 0,11. La invención incluye, a modo no limitante, las siguientes relaciones entre fibrinógeno y trombina: aproximadamente 0,001, aproximadamente 0,005, aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,02, aproximadamente 0,03, aproximadamente 0,04, aproximadamente 0,05, aproximadamente 0,06, aproximadamente 0,07, aproximadamente 0,08, aproximadamente 0,09, aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,2, aproximadamente 0,3, aproximadamente 0,4, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,6, aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,3, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,1, aproximadamente 8,2, aproximadamente 8,3, aproximadamente 8,4, aproximadamente 8,5, aproximadamente 8,6, aproximadamente 8,7, aproximadamente 8,8, aproximadamente 8,9, aproximadamente 9,0, aproximadamente 9,1, aproximadamente 9,2, aproximadamente 9,3, aproximadamente 9,4, aproximadamente 9,5, aproximadamente 9,6, aproximadamente 9,7, aproximadamente 9,8, aproximadamente 9,9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95 y aproximadamente 100, o en relaciones intermedias, según sea necesario.

En aspectos específicos de la invención, el coágulo de fibrina comprende fibrinógeno a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml y trombina a una concentración final de aproximadamente 0,5 lU/ml a aproximadamente 250 lU/ml. En aspectos más específicos de la invención, las formulaciones de coágulo de fibrina (concentraciones finales de fibrinógeno (mg/ml) y trombina (unidades internacionales (IU) o unidades (U)/ml) son de aproximadamente 10 mg/2U y aproximadamente 20mg/4U.

En varios aspectos de la invención, se pueden mezclar polímeros sintéticos con fibrina para formar un coágulo o matriz híbrido biodegradable. Dichos polímeros sintéticos incluyen, a' modo no limitante, polímeros tales como poli(lactida) (PLA), poli(ácido glucólico) (PGA), poli(lactida-co-glucolida) (PLGA), poli(caprolactona), policarbonatos, poliamidas, polianhídridos, ácidos poliamino, poliorto ésteres, poliacetales, policianoacrilatos y poliuretanos degradables, y polímeros no erosionables tales como poliacrilatos, polímeros de etileno-acetato de vinilo y otros acetatos de celulosa sustituidos por acilo y derivados de los mismos.

En un aspecto, una composición de la invención comprende un coágulo de fibrina y citocinas. En un aspecto específico, una composición de la invención comprende un coágulo de fibrina y SDF-1. En otros aspectos, una composición de la invención comprende un coágulo de fibrina y SCF. En varios aspectos, una composición de la invención comprende un coágulo de fibrina, SDF-1 y SCF.

En otro aspecto, la invención proporciona la administración del coágulo de fibrina in vivo a efectos de incorporar células reparadoras en un sitio de cirugía o lesión o en un sitio en el cuerpo que necesita reparación de tejido. En un aspecto, las composiciones que comprenden un coágulo de fibrina y una citocina se administran con la citocina a una concentración que varía de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 50.000 ng por volumen (1 ml_) de coágulo de fibrina. En otro aspecto, las composiciones que comprenden un coágulo de fibrina y una citocina se administran con la citocina en una concentración que varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 5.000 ng por mi de coágulo de fibrina. En varios aspectos, la citocina se administra en el coágulo de fibrina a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 2 ng/ml, aproximadamente 3 ng/ml, aproximadamente 4 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 6 ng/ml, aproximadamente 7 ng/ml, aproximadamente 8 ng/ml, aproximadamente 9 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 20 ng/ml, aproximadamente 30 ng/ml, aproximadamente 40 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 60 ng/ml, aproximadamente 70 ng/ml, aproximadamente 80 ng/ml, aproximadamente 90 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 120 ng/ml, aproximadamente 140 ng/ml, aproximadamente 160 ng/ml, aproximadamente 180 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml, aproximadamente 300 ng/ml, aproximadamente 400 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 600 ng/ml, aproximadamente 700 ng/ml, aproximadamente 800 ng/ml, aproximadamente 900 ng/ml, aproximadamente 1000 ng/ml, aproximadamente 1100 ng/ml, aproximadamente 1200 ng/ml, aproximadamente 1300 ng/ml, aproximadamente 1400 ng/ml, aproximadamente 1500 ng/ml, aproximadamente 1600 ng/ml, aproximadamente 1700 ng/ml, aproximadamente 1800 ng/ml, aproximadamente 1900 ng/ml, aproximadamente 2000 ng/ml, aproximadamente 2500 ng/ml, aproximadamente 3000 ng/ml, aproximadamente 3500 ng/ml, aproximadamente 4000 ng/ml, aproximadamente 4500 ng/ml, aproximadamente 5000 ng/ml, aproximadamente 5500 ng/ml, aproximadamente 6000 ng/ml, aproximadamente 6500 ng/ml, aproximadamente 7000 ng/ml, aproximadamente 7500 ng/ml, aproximadamente 8000 ng/ml, aproximadamente 8500 ng/ml, aproximadamente 9000 ng/ml, aproximadamente 9500 ng/ml, aproximadamente 10.000 ng/ml, aproximadamente 20.000 ng/ml, aproximadamente 30.000 ng/ml, aproximadamente 40.000 ng/ml y aproximadamente 50.000 ng/ml. En ciertos aspectos, la citocina se administra a concentraciones de hasta aproximadamente 100 pg/ml y aproximadamente 1 mg/ml. Un experto én la técnica apreciará que las concentraciones apropiadas de citocina para el tratamiento, por consiguiente, variarán dependiendo, en parte, del volumen del coágulo de fibrina, el sitio del tejido en cual se administra el coágulo de fibrina, la indicación para la cual se está utilizando el coágulo de fibrina, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y condición (la edad y la salud general) del paciente. Por consiguiente, el profesional de la salud puede titular la dosificación y modificar la concentración administrada para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Administración En aspectos de la invención, la composición se administra a un paciente por varios medios. En algunos aspectos, la composición se administra intramuscularmente, intraperitonealmente, intracranealmente, entre componentes de tejido tales como huesos o cartílagos fracturados o rotos. En otros aspectos, la composición se administra parenteralmente a través de inyección por vía intravenosa, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, i ntra cerebroespinal, intraocular, intraarterial, intraarticular, intraportal, intrarrectal, intranasal o intralesional. Adicionalmente, la composición puede introducirse para tratamiento en un mamífero de otras formas tales como, a modo no limitante, intratumoral, tópica, subconjuntival, intravejida, intravaginal, epidural, intracostal, intradérmica, inhalación, transdérmica, transserosa, ¡ntrabucal, disolución en la boca u otras cavidades corporales, instalación en las vías aérea, insuflación a través de las vías aéreas, inyección en vasos, tumores, órganos o similares, e inyección o deposición en cavidades en el cuerpo de un mamífero. En un aspecto específico, la composición se administra quirúrgicamente.

En otro aspecto, la administración de la composición se dirige a cualquier sitio en el cuerpo. En ciertos aspectos, el sitio de cuerpo objetivo está en los nervios, hígado, riñon, corazón, pulmón, ojo, órganos del tracto gastrointestinal, piel y/o cerebro. En un aspecto, el sitio del cuerpo objetivo es un sitio de isquemia.

La invención incluye varios vehículos para administrar la composición en un sujeto. En un aspecto, se utiliza inyección directa mediante aguja y jeringa. En ciertos aspectos, la inyección directa incluye mezclar el coágulo de fibrina y la citocina en la jeringa inmediatamente antes de la inyección en un sujeto. En otros aspectos, la invención incluye el uso de una cámara de mezcla (entre la jeringa y la aguja) para aumentar la mezcla. En varios aspectos, la invención incluye la administración de la citocina y el coágulo de fibrina a través de un catéter de inyección (para administración en el tejido más profunda), un aerosol para administración superficial o mediante la implantación de un coágulo de fibrina prefabricado (de forma subcutánea o de forma más profunda dentro de los lechos de tejido). En ciertos casos, la implantación puede llevarse a cabo a través de inyección o a través de cirugía.

Cuando se desea, la composición se administra mediante inyección en bolo o continuamente mediante infusión o mediante un dispositivo de implantación. Alternativamente o adicionalmente, la composición se administra localmente a través de la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual el coágulo ha sido absorbido o encapsulado. Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo, en varios aspectos, se implante en cualquier tejido u órgano adecuado y la administración de la composición puede ser a través de difusión, bolo de liberación controlada o administración continua.

En ciertos aspectos, puede ser deseable utilizar o administrar la composición de forma ex vivo. En dichos casos, las células, tejidos u órganos que han sido retiradas del paciente se exponen a la composición después de lo cual las células, tejidos y/u órganos posteriormente se implantan nuevamente en el paciente.

En otros aspectos de la invención, modos adicionales de administrar la composición a un sujeto serán evidentes para los expertos en la técnica, incluidas formulaciones que implican un coágulo de fibrina en formulaciones de administración sostenida o controlada. Las técnicas para formular una variedad de medios de administración sostenida o controlada diferente son conocidas para los expertos en la técnica.

En un aspecto, la administración en un sujeto se hace mediante inyección con una jeringa y una aguja. En cierto aspecto, la administración se hace con una jeringa y una aguja de calibre 25. Sin embargo, también se utilizan varios tamaños de jeringas y agujas para la administración. En varios aspectos, la jeringa puede variar en tamaño entre 0,5 y 100 ce. Sin embargo, el tamaño de la jeringa no está limitado con respecto a la invención. También pueden utilizarse otros tamaños. En aspectos adicionales, el tamaño de la aguja puede variar entre un aguja de calibre 16 y 30. Al igual que con la jeringa, el tamaño de la aguja no es limitante con respecto a la invención.

En ciertos aspectos, se administra una única inyección en bolo mediante infusión intravenosa o mediante inyección directa, utilizando una jeringa. Este modo de administración puede ser deseable para pacientes quirúrgicos, según sea apropiado, tales como pacientes con cirugía cardíaca, por ejemplo, revascularización coronaria y/o valvuloplastia. En estos pacientes, se puede administrar una única infusión de bolo de coágulo de fibrina. (Observe que la cantidad de fármaco administrada se basa en el peso y la condición del paciente y la determina un profesional de la salud con experiencia). En otros aspectos, se administra una única inyección intramuscularmente. Se pueden utilizar períodos de administración más cortos o más largos, según determine que es apropiado un experto en la técnica.

En casos donde sea deseable una administración de la composición de larga duración, se puede llevar a cabo una administración intermitente. En estos métodos, se administra una dosis de carga, posteriormente (i) una segunda dosis de carga y una/s dosis de mantenimiento o (i¡) una/s dosis de mantenimiento, sin una segunda dosis de carga, según determine que es apropiado un experto en la técnica En varios aspectos, para lograr una administración adicional de la composición en un paciente, se administra una/s dosis de mantenimiento del coágulo de fibrina. Las dosis de mantenimiento puede administrarse a niveles que son menores que la/s dosis de carga, por ejemplo, a un nivel que es aproximadamente 1/6 de la dosis de carga. Las cantidades específicas para administrar como dosis de mantenimiento pueden ser determinadas por un profesional de la salud, a efectos de que la composición de que comprende el coágulo de fibrina y la citocina se mantenga al menos en el sitio objetivo durante un período de tiempo. Por supuesto, las dosis de mantenimiento pueden suspenderse en cualquier punto durante este marco de tiempo, según determine que es apropiado un profesional de la salud.

En otros aspectos de la invención, la administración se lleva a cabo con un catéter. La administración por catéter puede llevarse a cabo utilizando productos (por ejemplo, bombas y tuberías de infusión) que están disponibles en la técnica. Un criterio importante a tener en cuenta cuando se selecciona un catéter y/o tubería para utilizar en estos métodos es el impacto del material de estos productos (o revestimiento sobre estos productos) sobre la composición que comprende el coágulo de fibrina y la citocina. Los productos adicionales relacionados con el catéter que pueden utilizarse en los métodos de la invención pueden identificarse determinado si el material de los productos altera la composición que comprende el coágulo de fibrina y la citocina, en condiciones que coinciden con las utilizadas en la administración del fármaco.

Dosificación La invención incluye el uso de varios parámetros de dosificación. En un aspecto, la citocina se dosifica por mi de coágulo de fibrina o por kilogramo de peso corporal de un sujeto que la necesita. En varios aspectos, un sujeto recibe múltiples dosis o múltiples instancias de tratamiento. En ciertos aspectos, es posible volver a dosificar a un sujeto para obtener efectos aumentados o prolongados (semanas, meses o incluso años en el futuro). En la dosificación, el coágulo de fibrina desplaza una cantidad fija de volumen en el músculo y/o áreas cercanas. Por lo tanto, es importante monitorear el volumen de citocina/coágulo que puede inyectarse. En un aspecto, la cantidad máxima de citocina para administrar por coágulo de fibrina se establece por el volumen (tamaño) de los componentes del coágulo de fibrina utilizados así como también por el área de tratamiento y el tamaño del sujeto. En algunos aspectos, los sujetos más grandes toleran volúmenes mayores de coágulo de fibrina, haciendo deseable una dosificación o volumen de citocina aumentado.

Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento, por consiguiente, variarán dependiendo, en parte, del sitio del tejido en cual se administran el coágulo de fibrina y la citocina, la indicación para la cual se está utilizando la composición, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y condición (la edad y la salud general) del paciente. Por consiguiente, el profesional de la salud puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.

En ciertos aspectos, se administran múltiples coágulos. En otros aspectos de la invención, el coágulo de fibrina que comprende citocina se administra en múltiples puntos de tiempo. La frecuencia de la administración del coágulo depende de múltiples parámetros. Típicamente, un profesional de la salud administrará la composición hasta alcanzar la dosificación que logre el efecto deseado. Por lo tanto, la composición puede administrarse como una única dosis o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de citocina) en el tiempo. Los expertos en la técnica puede refinar adicionalmente de forma habitual la dosificación apropiada y dicha refinación está dentro de las tareas habituales que lleva a cabo un profesional de la salud o un experto en la técnica. Las dosificaciones apropiadas pueden establecerse a través del uso de datos de respuesta a la dosis apropiados.

Métodos de tratamientos y usos En aspectos de la invención, el coágulo de fibrina que comprende citocina se utiliza para incorporar células regenerativas o reparadoras en un sitio in vivo para la regeneración de tejido o reparación después de daño o pérdida de tejido como resultado de una enfermedad o lesión, incluidas lesiones por cirugías. En ciertos aspectos, el coágulo de fibrina que comprende citocina se utiliza para potenciar la vasculogénesis o inducir la angiogénesis. La invención incluye la utilización de las composiciones descritas en la presente para cualquier enfermedad o afección que puede beneficiarse con la administración de un coágulo de fibrina que comprende citocina para aumentar la vascularización en un sitio específico in vivo. Por ejemplo, daño de tejido debido a isquemia, debido a pérdida de flujo sanguíneo, laceraciones, extremos de temperatura, traumatismo o enfermedad metabólica o genética, es una de las diversas afecciones o enfermedades que pueden beneficiarse con el tratamiento con citocina en una coágulo de fibrina. Otras enfermedades incluyen enfermedad cardiovascular, diabetes, enfermedades autoinmunes, accidente cerebrovascular, lesión cerebral y/o de la médula espinal, lesión por quemadura, defectos óseas, isquemia renal y degeneración macular. En otro aspecto, las composiciones de la invención se utilizan para tratar un hígado isquémico o una cirrosis hepática. En varios aspectos, la invención incluye usos de una composición que comprende un coágulo de fibrina y una citocina para la fabricación de un medicamento para tratar un sitio de lesión o enfermedad localizado, para potenciar la vascularización hacia un sitio localizado o para tratar la isquemia. En ciertos aspectos, una composición de la invención se utiliza para potenciar la vascularización de un órgano o tejido trasplantado. Los órganos trasplantados incluyen, a modo no limitante, el corazón, ríñones, hígado, pulmones, páncreas, intestino y piel. Los tejidos incluyen, a modo no limitante, huesos, tendones, córnea, válvulas cardíacas, venas y brazos.

Kits En un aspecto adicional, la invención incluye un kit para preparar la composición que comprende un coágulo de fibrina y citocina y administrarla a un sujeto que la necesita. La composición que comprende el coágulo de fibrina y citocina puede proporcionarse de forma ventajosa en forma de kit que incluye las cantidades envasadas de sellador de fibrina y trombina por separado. En otro aspecto, el kit puede comprender además citocina de otra fuente. Alternativamente, el kit puede incluir un agente biológico adicional que puede administrarse en el coágulo de fibrina o conjuntamente con la administración del coágulo de fibrina y una citocina. En una modalidad ejemplar de un kit, cada componente del kit se envasa por separado en envases estériles o en envases que pueden esterilizarse. Los agentes biológicos, que incluyen el componente de fibrinógeno, el componente de trombina o la citocina, pueden proporcionarse en una recipiente tal como una vial de vidrio o plástico y pueden además trasportarse o suspenderse en un medio de almacenamiento líquido adecuado para mantener la citocina u otros compuestos biológicos. El kit puede incluir además opcionalmente una o más jeringas, catéteres u otro/s dispositivo/s de administración para introducir el coágulo de fibrina en el sujeto. Los kits pueden incluir además opcionalmente una o más recipientes adicionales almacenando cada una un agente farmacéutico que puede agregarse al coágulo de fibrina. El kit además incluye, por ejemplo, instrucciones impresas para hacer y utilizar el coágulo de fibrina. Todos los elementos del kit se proporcionan junto en cantidades adecuadas en una caja u otro envase adecuado.

Cada publicación, solicitud de patente, patente y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad en la medida que no sean contradictorias con la presente divulgación.

Se entenderá que las modalidades descritas en la presente son solamente a efectos ilustrativos y que varias modificaciones o cambios en virtud de las mismas serán sugeridas a expertos en la técnica y deben incluirse dentro del espíritu y competencia de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos La invención se describe en más detalle en referencia a los siguiente ejemplos no limitantes, los cuales se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma. Los expertos en la técnica entenderán que las técnicas descritas en estos ejemplos representan técnicas descritas por los inventores para que funcionen bien en la práctica de la invención y como tales constituyen los modos preferidos para poner en practicar la misma. Sin embargo, debe apreciarse que los expertos en la técnica, en virtud de la presente divulgación deben apreciar que pueden hacerse muchos cambios en los métodos específicos que se divulgan y obtener aún un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1: SDF-1 tiene afinidad con TISSEEL® VHSD.

El objetivo de este experimento fue medir la afinidad de SDF-1 con Tisseel®VHSD. La interacción compleja entre el componente de sellador/coágulo de fibrina, Tisseel®VHSD y el SDF-1a humano recombinante (rhSDF-1a) se examinó en tiempo real utilizando resonancia superficial de plasmones (SPR, por sus siglas en inglés). En este ensayo, se revistió un chip sensor de oro con el componente proteico de sellador de fibrina (FC) de Tisseel® a través de enlaces covalentes entre los residuos de lisina de FC y el chip. (El FC de Tisseel® incluye una mezcla de fibronectina de fibrinógeno, albúmina y otras proteínas). El chip sensor se equilibró con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a pH 7,4 haciendo fluir la PBS sobre el chip sensor y se estableció un valor de referencia. La PBS se reemplazó por una inyección de cinco concentraciones de rhSDF-1a (que variaban de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 250 nM) a 0,1 ml/minuto para estudiar las fases de asociación y equilibrio de la unión. Se pasó hSDF-1a recombinante sobre el chip sensor durante siete minutos, antes de detener las inyecciones y reemplazarlas por un flujo de PBS a pH 7,4. Se observaron las fases de disociación de las interacciones durante siete minutos adicionales. La regeneración entre inyecciones no fue necesaria, porque el rhSDF-1a se autodisoció del FC. Después de la unión y liberación de una concentración de rhSDF-1a en el FC, se evaluó otra concentración. Se analizó una serie de datos de sensograma ajustando los datos a los modelos de interacción de unión utilizando Prism 4.0 de Graphpad.

El sensograma resultante (Figura 1a) exhibe los cambios en el índice de refracción con el trascurso del tiempo como resultado de la unión de SDF-1a y FC e indica que SDF-1a tiene una afinidad considerable con el FC de Tisseel®VHSD. Se llevaron a cabo experimentos similares utilizando SPR para examinar la interacción entre SDF-?ß humano recombinante (rhSDF-1p) y FC. Un nuevo chip sensor de oro se revistió con FC, el cual se unió covalentemente con el chip a través de residuos de lisina de FC accesibles. Al igual que en el experimento mencionado anteriormente, se hizo fluir PBS sobre el chip sensor para equilibrarlo y establecer un valor de referencia estable. La PBS se reemplazó por una inyección de cinco concentraciones de rhSDF-?ß (que variaban de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 500 nM) a 0,1 ml/minuto para estudiar las fases de asociación y equilibrio de la unión. Se pasó hSDF-?ß recombinante sobre el chip sensor durante siete minutos, antes de detener las inyecciones y reemplazarlas por un flujo de PBS a pH 7,4. Se observaron las fases de disociación de las interacciones durante siete minutos adicionales. La regeneración entre inyecciones no fue necesaria, porque el rhSDF-?ß se autodisoció del FC. Se analizó una serie de datos de sensograma ajustando los datos a los modelos de interacción de unión utilizando Prism 4.0 de Graphpad.

El sensograma resultante (Figura 1b) exhibe los cambios en el índice de refracción con el trascurso del tiempo como resultado de la unión de SDF-?ß y FC e demuestra que SDF-?ß tiene una afinidad considerable con el FC de TisseelOVHSD.

Ejemplo 2: Preparación de coágulos de fibrina para determinar la cinética de la liberación SDF-1 in vitro.

El objetivo del estudio fue determinar la cinética de la liberación de SDF-1 in vitro. Se prepararon coágulos de fibrina con 125 µ? de FC diluidos con amortiguador de dilución de fibrinógeno (FDB) en 20 mg/ml de fibrinógeno y 4000 ng de SDF-1a. El FDB contiene 3000 KIU/ mi de aprotinina, 25 mM de citrato de sodio, 48 mM de cloruro de sodio, 333 mM de glicina y 15 g/L de seroalbúmina humana. Se agregaron SDF-1a y trombina (125 µ? de 4 U) al FC para formar los coágulos. Las concentraciones finales en los coágulos fueron 10 mg/ml de fibrinógeno, 2000 ng de SDF-1a y 2 U de trombina. Se dejó que los coágulos de fibrina (geles) se polimerizaran a 25°C antes de lavarlos con 250 µ? de seroalbúmina humana al 0,1% en PBS. Los geles se cubrieron con 250 µ? de seroalbúmina humana al 0,1% en PBS y se incubaron a 25°C durante 1 a 7 días. Se retiró el sobrenadante de los tres coágulos de fibrina el día uno. Los sobrenadantes se almacenaron a -20°C y los coágulos de desecharon. Se recogieron los sobrenadantes de tres geles más el día dos. Este proceso se repitió con tres geles nuevos hasta que se recogieron los sobrenadantes de los últimos geles el día siete.

La Figura 2 muestra la liberación acumulada de SDF-1a de los coágulos de fibrina de los geles Tisseel® VHSD durante siete días. Se determinaron las concentraciones de SDF-1a utilizando un ensayo ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). La liberación promedio de SDF-1a varió de 6 ng (Día 1) a una liberación acumulada de 100 ng (Día 7), compensando solo el 5% de la cantidad original de SDF-1a agregada a los coágulos de fibrina (100 ng/2000 ng x 100%). Estos resultados demuestran que los coágulos de fibrina que contienen SDF-1 liberan y retienen SDF-1. In vivo, es probable que esta cinética de liberación sea impactada por la degradación de Tisseel®VHSD que se produce durante un período de 7-8 días.

Ejemplo 3: CD45 y CD11B: diferenciación y formación del tubo endotelial.

El objetivo de este estudio fue estudiar las capacidades angiogénicas y de diferenciación de células mieloides CD34+ en presencia de células endoteliales. Este estudio mostró que las células CD34+ y su progenie más diferenciada son proangiogénicas en este ensayo angiogénico. Por consiguiente, en ciertos casos, Tisseel-SDF-1 aparentemente demuestra una capacidad para incorporar células más maduras (más diferenciadas) y menos maduras (menos diferenciadas). Se aislaron células CD34+ a partir de sangre de cordón umbilical y se evaluaron utilizando centrifugado celular, análisis de citometría de flujo y Matrigel en un ensayo de formación de tubo in vitro. Las células CD34+ aisladas recientemente comprendían aproximadamente 91% de blastos y aproximadamente 85% de CD34+ determinados mediante centrifugado celular y análisis de citometría de flujo, respectivamente. Adicionalmente, las células expresaban aproximadamente 33% de marcadores de triple tinción positiva para CD34/CD11 b/CD45. A continuación se evaluó la capacidad angiogénica de las células utilizando un ensayo de cocultivo de formación de tubo Matrigel con células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC). En el ensayo, se sembraron las HUVEC en Matrigel y se cultivaron durante un período de 7 días sin cambiar los medios. Se examinó la formación del tubo endotelial en presencia y ausencia de células CD34+ en microscopía de fases y se tomaron imágenes a las 24 horas y a los 7 días (Figura 3a). Mientras las HUVEC solas no puede mantener su estructura de tubo, las HUVEC en cocultivo con células CD34 + mantuvieron la estructura de tubo durante al menos una semana (ver el panel inferior derecho de la Figura 3a).

Además del ensayo de angiogénesis (co-cultivo) descrito anteriormente, se cultivaron células CD34+ en un medio de diferenciación Myelocult con factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) durante un período de 17 días. Al finalizar los 17 días, las células CD34+ se diferenciaron más: aproximadamente 5-7% de blastos, aproximadamente 3-12% de CD34+ y aproximadamente 75% de doble positivos para los marcadores de diferenciación CD11b/CD45 mediante centrifugado células y análisis de cítometría de flujo. Cuando se evaluó esta población más diferenciada para determinar la actividad proangiogénica, esta población también fue capaz de mantener la formación del tubo endotelial durante al menos una semana en cultivo de forma similar a las células CD34+ menos diferenciadas. En ambos casos, ambas poblaciones de células mieloides eran proangiogénicas (ver Fig. 3b). Sin ánimo de ceñirse a ninguna teoría, parece que probablemente la capacidad de Tisseel-SDF1 para incorporar una población mieloide más diferenciada utilizando SDF-1 potencia la neovascularización in situ.

Ejemplo 4: Incorporación y retención de células reparadoras in vivo utijizando TISSEEL-SDF-1a y TISSEEL-SCF-1 El objetivo de este estudio fue examinar la incorporación y retención de células reparadoras in vivo utilizando Tisseel con y sin SDF-1a. Se implantaron subcutáneamente coágulos Tisseel, con (Tisseel-SDF-1a) y sin SDF-1a (300ng) (Tisseel), en miembros inferiores murinos. Cada ratón recibió un implante de coágulo Tisseel en ambas patas, de forma que una pata recibió un implante de Tisseel y la otra pata un implante de Tisseel-SDF-1 a. Se recogieron los coágulos Tisseel de los ratones el día uno, día dos, días tres y el día cuarto después de la implantación. Las células CD34+ que migraron en los coágulos se retiraron utilizando un tratamiento de digestión con tripsina-EDTA. Se cuantificó la cantidad de células recogidas de los implantes Tísseel que expresaban Cd45, Cd11b y Sca1 utilizando separación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Los resultados de este experimento (Figura 4a) muestran que las células que coexpresan CD45 y CD11b (CD45/11b+) se incorporaron en los coágulos de Tisseel-SDF-1 en mayor cantidad que en los coágulos sin SDF-1. De forma similar, Tisseel-SDF-1 incorporó una cantidad mayor de células que expresan el equivalente murino de CD34, Sca1 (ver Figura 4c). En los cuatro puntos de tiempo, el análisis estadístico (ANOVA) indica que el aumento en la cantidad células fue estadísticamente considerable para las poblaciones CD45/11b+. Específicamente, el valor P fue 0,002 para la población Sca1+ y 0,003 para las células que coexpresan CD45 y CD11b (CD45/11b+).

También se llevaron a cabo estudios en miembros inferiores de ratones con Tisseel®+SDF-1a administrado a través de inyecciones intramusculares (i.m.) en lugar de implantes. Para estos estudios, se aislaron células con proteína verde fluorescente mejorada (EGFP)+ de la médula ósea (BM) del fémur y la tibia de ratones donantes (ratones transgénicos EGFP+ C57BL/6 (Jackson Labs). Estos ratones transgénicos expresaban EGFP constitutivamente en todas las células con la excepción del pelo y los eritrocitos. Se inyectaron células de BM EGFP+ (5 millones) a través de inyección en la vena de la cola en ratones no EGFP+ receptores. Los ratones receptores se sacrificaron el día 2 y el día 4 y los sitios de inyección i.m. se retiraron, digirieron y evaluaron para determinar la presencia de células EGFP + , CD45+ y CD11b+. Los resultados en la Figura 4b muestran que se detectó un porcentaje mayor de células EGFP+, CD45+ y CD11b+ en los sitios de inyección i.m. que contenían SDF-1a que en los sitios de inyección i.m. sin SDF-1a (testigo Tisseel®; PBS/0,1% BSA) el día 2 y el día 4.

También se llevaron a cabo estudios en miembros inferiores de ratones con Tisseel®+SCF administrado a través de inyecciones intramusculares (i.m.) en lugar de implantes. Para estos estudios, los ratones recibieron inyecciones i.m. en un miembro inferior (50 µ? de Tisseel® que comprendía SCF (300 ng)). Los ratones testigo recibieron inyecciones i.m. en un miembro inferior de Tisseel® (50 µ?) sin SCF. Luego de las inyecciones en el miembro inferior, los ratones recibieron células de médula ósea EGFP (5 millones) tal como se describió anteriormente en la presente en el experimento con SDF-1a. Los ratones receptores se sacrificaron el día 2 y el día 4 y los sitios de inyección i.m. se retiraron, digirieron y evaluaron para determinar la presencia de células EGFP+ y Sca-1 +. Los resultados de este experimento muestran que podría detectarse un porcentaje mayor de células EGFP+Sca-1+ en los animales tratados que en los testigos, los cual indica que el SCF en Tisseel® ayudó a incorporar y retener más células regenerativas y/o reparadoras in vivo.

La invención se ha descrito en términos de modalidades específicas que se descubrió o propuso que comprenden modos específicos para poner en práctica la invención. Varias modificaciones y variaciones de la invención descrita serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades específicas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debe limitarse indebidamente a dichas modalidades específicas. De hecho, se pretende que varias modificaciones a los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en las áreas relevantes estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un coágulo de fibrina y una citocina o una combinación de citocinas.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la citocina se selecciona del grupo que consiste en factor derivado del estroma 1 (SDF-1) y factor de células madre (SCF).

3. La composición de la reivindicación 2, en donde la citocina es SDF-1.

4. La composición de la reivindicación 2, en donde la citocina es SCF.

5. La composición de la reivindicación 1, en donde la combinación de citocinas comprende el factor derivado del estroma 1 (SDF-1) y el factor de células madre (SCF).

6. La composición de la reivindicación 1, en donde el coágulo de fibrina comprende cualquier pinza hemostática o sellador en base a fibrina.

7. La composición de la reivindicación 6, en donde el coágulo de fibrina es Tisseel® o Tisseel® VHSD.

8. La composición de la reivindicación 1, en donde el coágulo de fibrina comprende fibrinógeno a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml y trombina a una concentración final de aproximadamente 0,5 lU/ml a aproximadamente 250 lU/ml.

9. La composición de la reivindicación 8, en donde el coágulo de fibrina comprende fibrinógeno a una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml y trombina a una concentración final de aproximadamente 2 lUml.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9 que además comprende amortiguador de fosfato o una solución salina amortiguada con fosfato.

11. La composición de la reivindicación 2 que comprende SDF-1 a una concentración final de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 50.000 ng/ml.

12. La composición de la reivindicación 11 que comprende SDF- 1 a una concentración final de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 5.000 ng/ml.

13. La composición de la reivindicación 2 que comprende SCF a una concentración final de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 50.000 ng/ml.

14. La composición de la reivindicación 13 que comprende SCF a una concentración final de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 5.000 ng/ml.

15. Un método para preparar una composición que comprende un coágulo de fibrina y una citocina o una combinación de citocinas, comprendiendo el método la etapa de mezclar la citocina o combinación de citocinas con trombina y agregar la citocina y trombina al fibrinógeno para formar la composición de coágulo de fibrina.

16. El método de la reivindicación 15, en donde la citocina se selecciona del grupo que consiste en factor derivado del estroma 1 (SDF-1) y factor de células madre (SCF).

17. Un método para incorporar y retener células reparadoras en un sitio localizado de lesión o enfermedad en un sujeto que las necesita, comprendiendo el método la etapa de administrar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 al sitio de lesión o enfermedad en una cantidad efectiva para incorporar y retener células reparadoras en el sitio de lesión.

18. El método de la reivindicación 17, en donde las células reparadoras son células madre.

19. El método de la reivindicación 18, en donde las células reparadoras son células mieloides y su progenie diferenciada.

20. El método de la reivindicación 17, en donde las células reparadoras son positivas para CD34 (CD34+), CD45 (CD45+) o CD11b (CD11 b+).

21. El método de la reivindicación 17, en donde las células reparadoras son positivas para uno o más de CD34 (CD34+), CD45 (CD45 + ) o CD11b (CD11 b + ).

22. Un método para tratar un sitio localizado de lesión o enfermedad en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método la etapa de administrar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 al sitio de lesión o enfermedad en una cantidad efectiva para tratar la lesión o enfermedad.

23. Un método para potenciar la vascularización o inducir la angiogénesis en un sitio localizado de lesión o enfermedad en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método la etapa de administrar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 al sitio de lesión o enfermedad en una cantidad efectiva para potenciar la vascularización o inducir la angiogénesis.

2 4 . Un método para tratar la isquemia en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administrar una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 a un sitio de isquemia en una cantidad efectiva para tratar la isquemia.

2 5 . Un kit para preparar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, comprendiendo el kit: ( a ) un primer vial o primer recipiente de almacenamiento que comprende fibrinógeno; ( b ) un segundo vial o segundo recipiente de almacenamiento que comprende trom bina; y ( c ) un tercer vial o tercer recipiente de almacenamiento que comprende una citocina o uná combinación de citocinas, conteniendo dicho kit opcionalmente un amortiguador de fosfato e instrucciones para el uso de los mismos.

2 6 . Utilización de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 en la producción de un medicamento.

2 7 . Utilización de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 en la producción de un medicamento para incorporar y tener células reparadoras en un sitio localizado de lesión o enfermedad.

2 8 . Utilización de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 en la producción de un medicamento para tratar un sitio localizado de lesión o enfermedad.

29. Utilización de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 en la producción de un medicamento para potenciar la vascularización o inducir la angiogénesis en un sitio localizado de lesión o enfermedad.

30. Utilización de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en la producción de un medicamento para tratar la isquemia.