MX2011005133A - Vacuna contra eimeria para pavos. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe una vacuna que proporciona protección a los pavos contra la coccidiosis, y los métodos para fabricar y usar la vacuna por sí sola, o en combinación con otros agentes protectores. Además, la presente invención describe los conjuntos de cebadores de PCR que son útiles en la identificación de las especies de Eimeria en una muestra biológica.

Description

VACUNA CONTRA El ME RIA PARA PAVOS Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada Esta solicitud reivindica la prioridad de acuerdo con 35 U.S.C. § 119(e) de la Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/114,208 presentada el 13 de noviembre de 2008.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a una vacuna para pavos que proporciona protección contra la coccidiosis. También se proporcionan los métodos para hacer y usar la vacuna sola o en combinación con otros agentes protectores. Además, la presente invención proporciona los conjuntos de cebadores de PCR que son útiles en la identificación de las especies patógenas de Eimeria de pavo.

Antecedentes de la Invención La coccidiosis es una enfermedad entérica de animales que afecta a las aves de corral y ganado domésticos en todo el mundo. Los negocios que se basan en la producción animal frecuentemente se enfrentan a costos significativos debido la coccidiosis, que incluyen pérdidas financieras debido al ganado enfermo, así como costos por tratamientos profilácticos previstos para reducir y/o prevenir la enfermedad. Tales costos son especialmente relevantes para las industrias animales comerciales e intensivas, tal como la industria de las aves de corral, donde el alojamiento intensivo de las aves favorece la propagación de la coccidiosis.

Los miembros de la subclase esporozoo intracelular estricta, Coccidia, son la causa etiológica de la coccidiosis. Un género de Coccidia, Eimeria, tiene un impacto significativo sobre la producción animal. Al igual que para los géneros estrechamente relacionados Isospora, Cyclospora (Cystoisospora) , y Cryptosporidium , Eimeria requiere solamente a un solo anfitrión para completar su ciclo vital. Bajo condiciones naturales, este ciclo vital comienza con la ingestión de oocistos esporulados del ambiente.

Eimeria son parásitos unicelulares con un ciclo vital monóxeno complejo, que exhibe un alto grado de especificidad de anfitrión-especie y tejido. Las especies Eimeria incluyen aquellas que se encuentran en pollos: E. tenella, E. acervulina, E. máxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, E. mivati, E. hagani y E. brunetti, y aquellas encontradas en pavos: E. meleagrimitis 1 (conocida hasta ahora simplemente como E. meleagrimitis) , E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis , E. innocua, y E. subrotunda .

En el campo de la coccidiosis aviar, la cantidad de investigación con respecto a la coccidia de pavo es superada por la cantidad presente en pollos. De hecho, en todo el mundo aunque hay solamente dos vacunas contra la coccidia de pavo comercialmente disponibles (Coccivac-T®, usada primero en los años 60 e Immucox , usada primero en los años 80), existen aproximadamente una docena de vacunas contra coccidia de pollo. Por lo tanto, aún existe un necesidad particularmente fuerte por las vacunas adicionales y mejoradas que puedan proporcionar protección para los pavos contra la coccidiosis aviar.

La numerosas especies de Eimeria pueden infectar a un solo anfitrión vía la ruta oral, ruta nasal y/o por el ingreso de las partículas infecciosas en el conducto lacrimal. Una vez que son injeridos, los parásitos penetran las células de la mucosa intestinal y experimentan las etapas asexual y sexual del ciclo vital. El daño intestinal resultante puede conducir finalmente al crecimiento deteriorado (atrofiamiento), uso disminuido de la alimentación, pérdida de pigmentación, y mortalidad creciente. Además, el daño al revestimiento intestinal puede predisponer a los pavos a otros agentes infecciosos.

Las etapas del ciclo vital de Eimeria son esencialmente iguales para todas las especies de Eimeria, aunque cada especie tiene un sitio preferido en el intestino para el desarrollo, y el tiempo requerido para completar el ciclo vital varía de especie a especie. La infección comienza con la ingestión por un anfitrión de los oocistos esporulados de Eimeria. Los oocistos injeridos entonces liberan esporocistos en el intestino del anfitrión. Los esporocistos liberan los esporozoítos que entran a las células epiteliales intestinales y después las transforman en trofozoítos. Los trofozoítos, a su vez, experimentan un proceso conocido como merogonia para formar los esquizontes de primera generación. Debido a los esquizontes relativamente grandes, por ejemplo en el caso de E. necatrix o E. tenella, o a la abundancia de los esquizontes, tal como E. mivati, o gamontes grandes como en el caso de E. máxima, éstas son las etapas que causan el efecto patógeno principal de la infección, es decir, el daño de tejido al anfitrión.

Los esquizontes de primera generación maduros producen numerosos merozoítos que son liberados e invaden nuevas células epiteliales, después crecen y forman la siguiente generación de esquizontes. Estas fases asexuales continúan durante un número variable de generaciones antes del principio de la fase sexual. La fase sexual comienza cuando los esquizontes se desarrollan en gamontes; micro-gamontes y macro-gamontes. Los micro-gamontes se desarrollan ¡ posteriormente en micro-gametos que fertilizan los macro-gamontes para producir una progenie de oocistos no <: esporulados. Los oocistos no esporulados entonces se liberan en el lumen intestinal y se excretan con las heces del anfitrión. La conclusión del ciclo vital endógeno, precedida por la aparición de oocistos no esporulados en las heces del anfitrión, se conoce como evidencia.

La esporulacion de los oocistos ocurre fuera del anfitrión, cuando las condiciones ambientales son favorables. La ingestión inevitable por un anfitrión de los oocistos esporulados comienza el siguiente ciclo de la infección. El tiempo de la ingestión del anfitrión de los oocistos esporulados a la aparición de los oocistos no esporulados en las heces es llamado período pre-evidencia. El período pre-evidencia se diferencia entre varias especies de Eimeria.

Las aves de corral que se exponen en varias ocasiones a las infecciones de Eimeria pueden adquirir inmunidad a la coccidiosis. De hecho, dependiendo de la inmunogenicidad de cada especie de Eimeria, la infección diaria de los pavos con una pequeña cantidad de oocistos esporulados puede dar lugar a que las aves adquieran una inmunidad completa después de tan poco como dos infecciones repetidas. Por lo tanto, los protocolos actuales que ' utilizan las vacunas vivas contra Eimeria se basan en el principio de la inmunidad adquirida, es decir, infecciones repetidas con una pequeña cantidad de oocistos contagiosos.

La vacunación es realizada generalmente en el criadero el día de la salida del huevo del ave administrando la vacuna viva contra Eimeria vía una aplicación por aerosol (directamente sobre las aves). La ingestión de los oocistos esporulados al acicalarse normalmente las plumas entonces da lugar a una inoculación oral de la vacuna. Alternativamente o en combinación, las vacunas pueden ser aplicadas más adelante en la alimentación y/o agua potable. Los oocistos infecciosos terminan su ciclo vital dentro de la zona intestinal del ave, según lo descrito anteriormente, culminando con la liberación de una nueva generación de oocistos no esporulados en 5-11 días, dependiendo de la especie de Eimeria. Los oocistos no esporulados excretados con las heces entonces llegan a ser infecciosos, es decir, se esporulan fuera del anfitrión, e infectan nuevamente a las aves a través de la ingestión del anfitrión. Después de dos o tres de tales ciclos, las aves se inmunizan contra la especie de coccidios a la cual fueron expuestos previamente. Esta inmunidad es caracterizada por la protección contra la enfermedad o agentes infecciosos según lo determinado por: (i) una disminución y/o ausencia de parásitos observados microscópicamente en el intestino, (ii) una reducción de la propagación de oocistos, (iii) una reducción de las lesiones intestinales, (iv) una reducción de la enfermedad clínica, (v) una reducción o prevención de la pérdida de peso, y/o (vi) una • í ¦ < reducción en la debilitación de la eficacia de utilización de alimentación. La inmunidad adquirida disminuye durante el transcurso del tiempo en la ausencia de la exposición subsecuente a los oocistos infecciosos.

Eimeria de tipo silvestre se aisla de brotes de enfermedad clínica en bandadas de aves de corral y se puede propagar generalmente para el uso como cepas patogénicas de desafio. Las vacunas no atenuadas comunes se componen de oocistos infecciosos de cepas de ligera a moderadamente patogénicas de diferentes especies de Eimeria que han sido mantenidas por el paso de laboratorio. Éstas Eimeria no atenuadas son capaces de causar coccidiosis cuando son injeridas en números muy elevados. Los fabricantes y usuarios de las vacunas tienen que tener cuidado de asegurar que la vacunación proporcione solamente los oocistos infecciosos suficientes para producir la inmunidad, pero no la enfermedad en el anfitrión sin tratar. Después de la dosis inicial, el proceso de vacunación se basa solamente en la reinfección a través de la ingestión del anfitrión de los oocistos esporulados de la parvada.

La patogenicidad, patología, y síntomas clínicos para la coccidiosis en los pavos pueden ser característicos para cada especie de Eimeria. La Eimeria aislada generalmente de granjas comerciales de pavos es E. adenoeides, E. meleagrimitis 1, E. dispersa, y E. gallopavonis; los cuatro coccidios que hasta ahora, fueron considerados como las únicas especies patogénicas de Eimeria de pavo. E. adenoeides y E. gallopavonis atacan principalmente el intestino ciego y el recto, y en la mayoría de los casos la porción inferior del íleo. En contraste, E. dispersa y E. meleagrimitis 1 atacan el pequeño delgado con los parásitos que residen principalmente en el intestino delgado superior y central. Los cambios patofisiológicos tal como pérdida de agua creciente vía las heces, producción creciente de moco y/o daño vascular debido a la pérdida de sangre, dan lugar a funcionamiento deteriorado tal como índice de crecimiento reducido, utilización de alimentación deteriorada e incluso mortalidad.

Los brotes recientes de coccidiosis en parvadas de pavos comerciales demuestran que los métodos de control existentes no pueden por sí mismos impedir las infecciones de Eimeria. De hecho, debido a la carencia del buen control de los farmacéuticos y/o vacunas para contrarrestar tales infecciones de Eimeria, aún existe la necesidad percibida hace largo tiempo de vacunas nuevas y/o mejoradas que puedan proteger mejor a los pavos contra esta enfermedad entérica costosa.

La mención de cualquier referencia en la presente no se debe interpretar como una admisión de qué tal referencia está disponible como una "técnica anterior" a la presente solicitud.

Breve Descripción de la Invención Por consiguiente, la presente invención proporciona nuevas composiciones inmunogenéticas que comprenden una o más especies de Eimeria que puedan ayudar a proteger a los pavos contra la coccidiosis. En un aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna que comprende E. meleagrimitis 2 (también referida como E. edgari) y E. meleagrimitis 1. En una modalidad particular de este tipo, la vacuna además comprende una o más especies de Eimeria adicionales seleccionadas del grupo que consiste de E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua, y E. subrotunda. En una modalidad particular la especie de Eimeria adicional es E. adenoeides . En otra modalidad la especie de Eimeria adicional es E. gallopavonis. En aún otra modalidad la especie de Eimeria adicional es E. dispersa. En aún otra modalidad la especie de Eimeria adicional es E. innocua. En aún otra modalidad la especie de Eimeria adicional es E. subrotunda . También se proporcionan las vacunas que comprenden cualquiera y todas las combinaciones de tales especies de Eimeria. Además, se proporcionan las vacunas que comprenden dos o más cepas de dos o más de tales especies individuales. En una modalidad de este tipo, la vacuna comprende pares de cepas de múltiples especies de Eimeria en las cuales múltiples pares de cepas de especies simples de Eimeria poseen períodos pre-evidencia asincrónicos. En una modalidad particular de este tipo, todos los pares de cepas de especies simples de Eimeria en la vacuna poseen períodos pre-evidencia asincrónicos.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan los métodos para inmunizar un pavo contra la coccidiosis. En tal modalidad el método para inmunizar un pavo contra la coccidiosis comprende la administración al pavo de una vacuna contra E. meleagrimitis 2 que comprende una cantidad ¡nmunológicamente efectiva de E. meleagrimitis 2. En otra modalidad, el método además comprende la administración al pavo de una o más vacunas adicionales contra una especie de Eimeria distinta a E. meleagrimitis 2. En una modalidad particular de este tipo, cada vacuna adicional comprende una cantidad ¡nmunológicamente efectiva de una o más especies de Eimeria seleccionadas del grupo que consiste de E. meleagrimitis 1, E. adenoeides , E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, y E. subrotunda. La administración de la vacuna contra E. meleagrimitis 2 y la administración de una o más vacunas adicionales contra una especie de Eimeria distinta de E. meleagrimitis 2 pueden ser realizadas en cualquier orden, incluyendo simultáneamente en una administración polivalente combinada.

Así, la presente invención proporciona los métodos que comprenden la administración a un pavo de una cantidad inmunológicamente efectiva de una o más especies de Eimeria de pavo en una vacuna de la presente invención. En una modalidad particular, tal vacuna es administrada por la aplicación por aerosol al pavo. En otra modalidad, la vacuna se administra en el agua potable del pavo. En aún otra modalidad, la vacuna se administra en la alimentación del pavo. En aún otra modalidad la vacuna se administra en la alimentación del pavo y el agua potable. En aún otra modalidad la vacuna es administrada mediante aplicación por aerosol al pavo, en la alimentación del pavo, y/o en el agua pot.able Además, cualquiera de las vacunas de la presente invención que comprenden cepas de Eimeria pueden también incluir uno o más especie y/o cepas de Isospora, Cyclospora (Cystoisospora), y/o Cryptosporidium . En una modalidad particular de este tipo, las cepas de la especie de Isospora, Cyclospora (Cystoisospora) , y/o Cryptosporidium puede también poseer un período pre-evidencia asincrónico.

La presente invención además proporciona los métodos para identificar un aislado de Eimeria tal como E. meleagrimitis 2. Tal modalidad comprende comparar la secuencia de nucleotido de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria con la secuencia de nucleotido de la región ITS-1 dentro de la SEC ID NO: 44. El aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria entonces exhibe más de 87% de homología con la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 dentro de la SEC ID NO: 44. En una modalidad particular de este método, el aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria exhibe más de 95% de homología con la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 dentro de la SEC ID NO: 44. En otra modalidad de este método, el aislado de Eimeria se identifica como E. t meleagrimitis 2 cuando la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria exhibe 100% de identidad con la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 dentro de la SEC ID NO: 44.

En las modalidades particulares la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 de la SEC ID NO: 44 contiene entre 394 y 409 nucleótidos. En otras modalidades, la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 de la SEC ID NO. 44 contiene entre 400 y 409 nucleótidos. En aún otras modalidades, la secuencia de nucleotido completa de la región ITS-1 de la SEC ID NO: 44 contiene entre 395 y 400 nucleótidos. En aún otras modalidades, la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 de SEC ID NO: 44 contiene entre 394 y 398 nucleótidos. En aún otras modalidades, la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 de la SEC ID NO: 44 contiene entre 405 y 409 nucleótidos. En aún otras modalidades, la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 de la SEC ID NO: 44 contiene 409 nucleótidos.

En las modalidades relacionadas los métodos comprenden comparar la secuencia de ácido nucleico de la región ITS-1 del genoma de un aislado de Eimeria con aquellas identificadas específicamente en la presente. En tal modalidad, el método comprende comparar la secuencia de ácido nucleico de la región ITS-1 del genoma de un aislado de Eimeria con la secuencia de ácido nucleico de la región ITS-1 dentro de una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, y/o SEC ID NO: 43. El aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de ácido nucleico completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria entonces exhibe más de 87% de homología con la secuencia de ácido nucleico completa de la región ITS-1 dentro de la secuencia o secuencias de nucleótido que se están comparando. En otra modalidad, el aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de ácido nucleico completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria entonces exhibe más de 95% de homología con la secuencia de ácido nucleico completa de la región ITS-1 que está dentro de la secuencia o secuencias de nucleótido que se están comparando. En aún otra modalidad de este método, el aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria exhibe 100% de identidad con la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 dentro de la secuencia de nucleótido que se está comparando. Las alineaciones de secuencia de nucleótido se pueden realizar con la metodología de Clustal W según lo descrito más adelante.

La presente invención también proporciona los ácidos nucleicos que comprenden respectivamente, la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 13, o SEC ID NO: 14, o SEC ID NO: 15, o SEC ID NO: 16, o SEC ID NO: 17, o SEC ID NO: 18, o SEC ID NO: 19, o SEC ID NO: 20, o SEC ID NO: 21, o SEC ID NO: 22, o SEC ID NO: 23, o SEC ID NO: 24, o SEC ID NO: 25, o SEC ID NO: 26, o SEC \D NO: 27, o SEC ID NO: 28, o SEC ID NO: 29, o SEC ID NO: 30, o SEC ID NO: 31, o SEC ID NO: 32, o SEC ID NO: 33, o SEC ID NO: 34, o SEC ID NO: 35, o SEC ID NO: 36, o SEC ID NO: 37, o SEC ID NO: 38, o SEC ID NO: 39, o SEC ID NO: 40, o SEC ID NO: 41, o SEC ID NO: 42, o SEC ID NO: 43, o SEC ID NO: 44. En una modalidad particular tal ácido nucleico i comprende no más de 800 pares de bases. En otra modalidad tal ácido nucleico comprende no más de 600 pares de bases. En aún j . ¡ otra modalidad tal ácido nucleico no comprende más de 500 pares de bases. En una modalidad relacionada, el ácido nucleico puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótido heteróloga.

La presente invención además proporciona los ácidos nucleicos que comprenden respectivamente, la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 51, o SEC ID NO: 52, o SEC ID NO: 53, o SEC ID NO: 54, o SEC ID NO: 55, o SEC ID NO: 56, o SEC ID NO: 57, o SEC ID NO: 58, o SEC ID NO: 59, o SEC ID NO: 60, o SEC ID NO: 61, o SEC ID NO: 62, o SEC ID NO: 63, o SEC ID NO: 64, o SEC ID NO: 65, o SEC ID NO: 66, o SEC ID NO: 67, o SEC ID NO: 68, o SEC ID NO: 69, o SEC ID NO: 70, o SEC ID NO: 71, o SEC ID NO: 72, o SEC ID NO: 73, o SEC ID NO: 74, o SEC ID NO: 75, o SEC ID NO: 76, o SEC ID NO: 77, o SEC ID NO: 78, o SEC ID NO: 79, o SEC ID NO: 80, o SEC ID NO: 81. En una modalidad particular tal ácido nucleico comprende no más de 800 pares de bases. En otra modalidad tal ácido nucleico comprende no más de 600 pares de bases. En aún otra modalidad tal ácido nucleico comprende no más de 500 pares de bases. En una modalidad relacionada, el ácido nucleico puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótido heteróloga.

La presente invención también proporciona un ácido nucleico que comprend la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 3. Eri otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 4. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 5. En otra más modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 6. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 7. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 8. En' aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 9. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 10. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 11. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 12. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 45. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 46. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 47. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 48. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 49. En aún otra modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 50.

Tales ácidos nucleicos se pueden utilizar entre otras cosas, como sondas de hibridación, o alternativamente, como cebadores en amplificaciones de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por su abreviatura en inglés) para producir los productos de PCR que corresponden a las porciones y/o todas las regiones ITS-1 de los genomas respectivos de las especies de Eimeria de pavo, E. adenoeides, E. meleagrimitis 1, E. dispersa, E. gallopavonis y E. meleagridis 2, también conocida en la presente como E. edgari. En una modalidad particular, uno o más de los ácidos nucleicos ya mencionados comprenden 50 nucleotidos o menos. En aún otra modalidad, uno o más de los ácidos nucleicos ya mencionados comprenden 30 nucleotidos o menos. En aún otra modalidad, uno o más de los ácidos nucleicos ya mencionados comprenden solamente el número de nucleotidos incluidos explícitamente en la secuencia identificada por el número de identificación de secuencia.

Cualquiera de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden también incluir una secuencia de nucleótido heteróloga. Además, la presente invención además proporciona los ácidos nucleicos que consisten de las secuencias de nucleótido que son complementarias a cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la presente.

La presente invención además proporciona los pares de cebadores de PCR para amplificar una región ITS-1 del genoma de una especie de Eimeria de pavo. En tal modalidad el par de cebadores de PCR comprende un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 3 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 4. En otra modalidad el par de cebadores de PCR comprende un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 5 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 6. En aún otra modalidad el par de cebadores de PCR comprende un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 7 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 8. En aún otra modalidad los pares de cebadores de PCR comprenden un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 9 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 10. En aún otra modalidad el par de cebadores de PCR comprende un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 11 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 12. En aún otra modalidad los pares de cebadores de PCR comprenden un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 45 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 46. En aún otra modalidad el par de cebadores de PCR comprenden un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 47 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 48. En aún otra modalidad los pares de cebadores de PCR comprenden un primer cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 49 y un segundo cebador que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 50.

La presente invención proporciona además los kits de amplificación de PCR que comprenden uno, dos o más pares de cebadores de PCR de la presente invención. Tales kits pueden incluir cualquier combinación/permutación. Así los kits alternativos de la presente invención pueden comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más de tales pares de cebadores de PCR.

Por ejemplo, en tal kit, las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de un par comprenden la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12. En otro kit, las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de un par comprenden la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, y las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de otro par comprenden la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12. En aún otro kit, las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de un par comprenden la SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, y las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de otro par comprenden la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.

En aún otro kit, las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de un par comprenden la SEC ID NO: 5 í ? <¦ - 1 y SEC ID NO: 6, las secuencias de nucleotido respectivas del primer y segundo cebador de otro par comprende la SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10, y las secuencia de nucleotido respectivas del primer y segundo cebad.or de aún otro par comprenden la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.

En una modalidad particular, el kit comprende los pares de cebadores de PCR que tienen respectivamente pares de cebadores que comprenden la secuencia de nucleotido de la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10, y SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12. Alternativamente, en ciertos kits, la SEC ID NO: 45 y SEC ID NO: 46 se pueden reemplazar por la SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8; y/o la SEC ID NO: 47 y SEC ID NO: 48 se pueden reemplazar por la SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6; y/o la SEC ID NO: 49 y SEC ID NO: 50 se pueden reemplazar por la SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10.

En aún otra modalidad, un kit de la presente invención comprende los pares de cebadores de PCR que tienen respectivamente pares de cebadores que comprende la secuencia de nucleotido de la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 45 y SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47 y SEC ID NO: 48, y SEC ID NO: 49 y SEC ID NO: 50.

La presente invención además proporciona los métodos para utilizar uno o más pares de cebadores de PCR para identificar una o más especies patogénicas de Eimeria de pavo en una muestra biológica. Tal método se puede utilizar para identificar la E. meleagrimitis 2 en una muestra biológica. Una modalidad particular de este método comprende los ácidos nucleicos de acceso contenidos por una muestra biológica y amplificados por PCR en presencia de un par específico de cebadores de PCR para E. meleagrimitis 2 bajo condiciones que produzcan un producto de PCR cuando los ácidos nucleicos de E. meleagrimitis 2 son contenidos por la muestra biológica. La producción del producto de PCR se supervisa, y cuando se detecta el producto de PCR, E. meleagrimitis 2 se identifica como presente en la muestra biológica. En una modalidad particular de este tipo, las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de los pares de cebadores de PCR utilizados comprenden la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12, respectivamente. En aún otra modalidad, los productos de PCR producidos se secuencian y cuando se encuentra que tienen una homología mayor de 87% con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 31, 32, 33, 34, 43, y/o 44, la E. meleagrimitis 2 se identifica como presente en la muestra.

En aún otra modalidad, los productos de PCR producidos se secuencian y cuando se encuentra que tienen una homología mayor de 95% con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 31, 32, 33, 34, 43, y/o 44, la E. meleagrimitis 2 se identifica cómo presente en la muestra. En aún otra modalidad, los productos de PCR producidos se secuencian y cuando se encuentra que tienen 100% de identidad con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 31, 32, 33, 34, 43, y/o 44, la E. meleagrimitis 2 se identifica como presente en la muestra.

En otra modalidad, un método para identificar la Eimeria patogénica de pavo presente en una muestra biológica comprende acceder a los ácidos nucleicos contenidos en la muestra biológica y amplificar estos ácidos nucleicos por PCR en presencia de un conjunto completo de cebadores para las ahora cinco especies de Eimeria patogénica de pavo bajo condiciones que producirán los productos de PCR correspondientes cuando los ácidos nucleicos correspondientes de Eimeria patogénica de pavo contenidos por la muestra biológica. Se supervisan los productos de PCR, y I ! cuando cualquiera de los productos de PCR se detectan durante la supervisión, se identifica Eimeria patogénica de pavo como presente en la muestra biológica.

En una modalidad relacionada, un método para identificar la especie de Eimeria patogénica de pavo presente en una muestra biológica' comprende acceder a los ácidos nucleicos contenidos en una muestra ' biológica y amplificar tales ácidos nucleicos por PCR en presencia de un conjunto completo de cebadores para la especie de Eimeria patogénica de pavo bajo condiciones que producirán los productos de PCR correspondientes cuando los ácidos nucleicos correspondientes de la Eimeria patogénica de pavo son contenidos por la muestra biológica. Se detectan los productos de PCR y son determinadas las especies de Eimeria patogénica de pavo asociadas a cada producto de PCR detectado. La determinación puede así identificar cada especie de Eimeria patogénica de pavo presente en la muestra biológica.

En las modalidades particulares, son determinadas las secuencias de nucleótido de los productos de PCR obtenidos. Cuando tal secuencia de nucleótido tiene más de 87% de homología con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 31, 32, 33, 34, 43, y/o 44, la E. meleagrimitis 2 se identifica como presente en la muestra. Similarmente, cuando la secuencia de nucleótido de un producto de PCR obtenido tiene más de 90% de homología con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 29, y/o 30, la E. meleagrimitis 1 se identifica como presente en la muestra. Cuando la secuencia de nucleótido de un producto de PCR obtenido tiene más de 90% de homología con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 18, 19, 20, y/o 21, E. adenoeides se identifica como presente en la muestra. Cuando la secuencia de nucleótido de un producto de PCR obtenido tiene más de 90% de homología con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 36, 39, 40, y/o 41, la E. gallopavonis se identifica como presente en la muestra. Finalmente, cuando la secuencia de nucleótido de un producto de PCR obtenido tiene más de 90% de homología con la secuencia de nucleótido correspondiente contenida dentro de las SEC ID NO: 22, 23, y/o 42, la E. dispersa se identifica como presente en la muestra. En las modalidades relacionadas, la homología porcentual requerida se puede establecer como mayor de 95%, e incluso hasta 100% de identidad para la especie seleccionada cuando se desee.

En una modalidad particular el par de cebadores de PCR específico para E. meleagrimitis 2 comprende las secuencias de nucleótido de la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12, respectivamente; el par de cebadores de PCR específico para E. meleagrimitis 1 comprende las secuencias de nucleótido de la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, respectivamente; el par de cebadores de PCR específico para E. adenoeides comprende las secuencias de nucleótido de la SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6 respectivamente; el par de cebadores de PCR específico para E.

I ! gallopavonis comprende las secuencias de nucleótido de la SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, respectivamente; y el par de cebadores de PCR específico para E. dispersa comprende las secuencias de nucleótido de la SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10, respectivamente.

En otra modalidad relacionada, un método para identificar la especie de Eimeria patogénica de pavo presente en una muestra biológica comprende el aislamiento de uno o más aislados de Eimeria de pavo de la muestra biológica y determinar una o más propiedades de la Eimeria patogénica de pavo aislada. Estas características incluyen, pero no se limitan a la patología, patogenicidad , inmunidad cruzada, y/o morfometrías de los aislados de Eimeria de pavo. En una modalidad particular de este tipo, el método además incluye el uso de uno o más análisis genéticos (por ejemplo, PCR) en combinación con la determinación de una o más propiedades de la Eimeria patogénica de pavo. Cuando se realiza más de un método para identificar la especie de Eimeria patogénica de pavo presente en una muestra biológica, tales métodos se pueden implementar en cualquier orden, incluyendo simultáneamente, si es factible. Éstos y otros aspectos de la presente invención serán apreciados mejor por la referencia a la descripción detallada, figuras, y ejemplos.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra las lesiones evidentes comunes I · observadas con E. meleagrimitis 1 o E. meleagrimitis 2 en el duodeno.

La figura 2 muestra las lesiones evidentes comunes observadas con E. meleagrimitis 1 o E. meleagrimitis 2 en el yeyuno. Las heces de los animales infectados son acuosas, con moco y sangre. Los parásitos invaden las células epiteliales desde el duodeno al recto y se encuentran ocasionalmente en el intestino ciego.

La figura 3A muestra la ubicación de los cebadores de PCR ITS-1. La figura 3B muestra la ubicación de los cebadores específicos para las especies internas.

La figura 4 muestra un árbol filogenético construido de acuerdo con la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención En un aspecto, la presente invención proporciona una especie patogénica recientemente identificada de Eimeria, que se ha nombrado E. meleagrimitis 2 (o alternativamente, E. edgari). Según lo proporcionado adicionalmente en la presente, la E. meleagrimitis 2 se ha caracterizado suficientemente para permitir su identificación inequívoca. En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona las nuevas vacunas que protegen contra esta especie patogénica recientemente identificada de Eimeria. En aún otro aspecto, la presente invención proporciona los kits que se pueden utilizar para identificar y distinguir fácilmente las ahora cinco especies patogénicas conocidas de Eimeria de pavo.

La E. meleagrimitis 2 fue aislado de brotes de coccidiosis clínica en operaciones de pavo comerciales de varios estados en los Estados Unidos de Norteamérica y de los pavos silvestres que vivían en la región de Delmarva. La E. meleagrimitis 2 (Eme2) afecta a la misma región del intestino que E. meleagrimitis 1, no obstante Eme2 se puede distinguir por la morfología de los oocistos, inmunidad conferida (estudios de protección cruzada), y secuencia de ADN.

Hasta ahora, no ha habido vacunas que proporcionen la protección contra la E. meleagrimitis 2 y E. meleagrimitis 1. Por lo tanto, en un aspecto esencial, la presente invención proporciona las vacunas que protegen contra la E. meleagrimitis 2 y E. meleagrimitis 1. En tal modalidad, la vacuna comprende el E. meleagrimitis 2 y E. meleagrimitis 1. En un aspecto relacionado, se proporcionan los métodos para administrar las vacunas de la presente invención.

Además, la presente invención proporciona el análisis de secuencia de la región de separación transcrita interna uno (ITS-1) ubicada entre los genes de ARN ribosomáticos 18S y 5.8S en el genoma de Eimeria, para cada uno de las especies patogénicas de Eimeria: E. meleagrimitis 1, E. adenoeides , E. gallopavonis, E. dispersa, y E. meleagrimitis 2. Por lo tanto, en aún otro aspecto esencial, la presente invención proporciona los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de nucleótido que únicamente identifican estas cinco especies patogénicas de Eimeria. ^ ¦ ¦ : ? i La presente invención además proporciona los kits de diagnóstico y los métodos relacionados que utilizan los conjuntos de cebadores de reacción en cadena de polimerasa (PCR) capaces de identificar cada una de estas cinco especies patogénicas de Eimeria. En una modalidad particular, tales cebadores y/o conjuntos de cebadores y/o secuencias de nucleótido únicas proporcionados en la presente, se pueden utilizar para distinguir la E meleagrimits, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispers , y/o E. meleagrimitis 2 entre sí.

El uso de los términos singulares para la conveniencia en la descripción no se piensa de ninguna manera como una limitante. Así, por ejemplo, la referencia a una composición que comprende "una cantidad" incluye la referencia a una o más de tales cantidades. Además, la referencia a un "oocisto" incluye la referencia a una pluralidad de tales oocistos, a menos que se indique lo contrario.

Todas las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente, a menos que se indique lo contrario, se escriben de 5' a 3'.

Según lo utilizado en la presente los siguientes términos tienen que las definiciones establecidas más adelante: El término "pavo", según lo utilizado en la presente, y a menos que se indique lo contrario, incluye todos los miembros del género meleagris, incluyendo las especies gallopavo y ocellata. Casi todos los pavos domésticos pertenecen a la especie gallopavo.

El término "muestra biológica" según lo utilizado en la presente es cualquier muestra obtenida de un animal, por ejemplo, pavo, o alrededores del animal (por ejemplo, heces, y/o área geográfica donde residen los animales y/o límites) que contienen y/o se sospecha que contienen Eimeria, y/o ácidos nucleicos y/o derivados de Eimeria. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen, pero no se limitan: muestras fecales, muestras de excrementó, y muestras gastrointestinales.

Según lo utilizado en la presente el término "acceder a los nucleicos" contenidos por una muestra biológica, se entiende como asegurar que los ácidos nucleicos de la muestra biológica están disponibles para servir como cebadores durante la PCR. En el caso más simple, el acceso a los ácidos nucleicos exige colocar una muestra biológica en el recipiente de reacción PCR. Sin embargo, este término puede también incluir una o más manipulaciones de una muestra biológica, por ejemplo, fractura/lisis de células, etapas de purificación, etc., que ayudan en la fabricación de los ácidos nucleicos contenidos por la muestra biológica disponibles para servir como cebadores durante la PCR.

El término "Eimeria" , según lo utilizado en la presente, a menos que se indique lo contrario, significa una o más especies del género Eimeria que infectan aves domesticadas. Las especies ¦ i ? de Eimeria incluyen los que se encuentren en pollos, e incluyen, por ejemplo, E. tenella, E. acervulina, E. máxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, E. mivati, E. hagani y E. brunetti, y también las que se encuentren en pavos, incluyendo E. meleagrimitis 1, E. adenoeides, E. gallopavonis , E. dispersa, E. meleagridis , E. innocua, y E. subrotunda. Según lo utilizado en la presente, una "Eimeria de pavo" se refiere a la Eimeria que infecta a los pavos. El término "Eimeria" también incluye todas las cepas de las especies anteriores de 'Eimeria, incluyendo, pero sin limitarse a, cepas precoces, y cepas atenuadas, que también incluyen las cepas que se han irradiado, o tratado de otra manera, para que ! no puedan completar el desarrollo. El término Eimeria además incluye cualquier cepa ,o especie descubierta recientemente de Eimeria que infecta las aves domesticadas según lo definido anteriormente, por ejemplo E. meleagrimitis 2, según lo descrito en la presente.

Según lo utilizado en la presente el término "E. MAD" significa una mezcla de E. meleagrimitis 1, E. adenoeides, y E. dispersa.

Según lo utilizado en la presente, una cepa "atenuada" de una especie de un género de Coccidia (tal como una "Eimeria atenuada") es una cepa que se ha seleccionado por su patogenicidad reducida en el anfitrión. Tal atenuación se puede alcanzar por un número de medios incluyendo paso serial (tal como paso de embrión serial), mutagénesis química, o por métodos de irradiación.

Según lo utilizado en la presente, una cepa "precoz" de una especie de un género de Coccidia (tal como una "Eimeria precoz") es una cepa que tiene un período pre-evidencia acortado con i relación a la. cepa no atenuada de la misma especie. Una cepa precoz puede también ser una cepa atenuada.

Según lo utilizado1 en la presente, una cepa "silvestre" de una especie de un género de Coccidia (tal como una "Eimeria silvestre") es un aislado de campo que no ha sido alterado por el paso de atenuación o ningún otro tratamiento incluyendo la selección por: aislamiento de un solo oocisto, tolerancia ¡nmunológica, u otro proceso segregativo.

Según lo utilizado en la presente, una cepa "no atenuada" de una especie de un género de Coccidia (tal como "Eimeria no atenuada") es una cepa que no tiene un período pre-evidencia acortado ni una patogenicidad reducida en el anfitrión con relación a la cepa silvestre de la misma especie, pero se ha mantenido en el laboratorio durante un periodo prolongado.

Según lo utilizado en la presente, una "cepa" de una especie de un género Coccidia ((por ejemplo, una especie de Eimeria) es una subpoblación de las especies del género Coccidia que se puede distinguir de la población general de las especies por una o más de las siguientes características: morfometrías, patogenicidad, inmunogenicidad, período pre-evidencia, y/o una población resultante de la expansión de un solo oocisto.

Según lo declarado anteriormente, el tiempo de ingestión del anfitrión de los oocistos esporulados hasta la aparición de los oocistos no esporulados en las heces, es llamado período pre-evidencia. El término "período pre-evidencia asincrónico" se refiere a los períodos pre-evidencia de dos o más especies de un género de Coccidia y/o dos o más cepas de una especie de un género de Coccidia que diferencian por 10% o más. En una modalidad particular, dos o más especies de un género de Coccidia y/o dos o más cepas de una sola especie de un género de Coccidia tienen períodos pre-evidencia asincrónicos que se diferencian por 20% o más. En aún otra modalidad, dos o más especies de un género de Coccidia y/o dos o más cepas de una sola especie de un género de Coccidia tienen períodos pre-evidencia asincrónicos que se diferencian por 25% o más.

En referencia a los períodos pre-evidencia asincrónicos para las cepas precoces y/o atenuadas con las cepas no atenuadas que se diferencian por un porcentaje (%) de tiempo, el porcentaje se basa en el periodo pre-evidencia de la cepa no atenuada. Así, cuando una cepa no atenuada de un género de Coccidia tiene un período pre-evidencia de 120 horas y una cepa precoz de la misma especie del género de Coccidia tiene un período pre-evidencia de 108 horas, las dos cepas tienen períodos pre-evidencia asincrónicos que se diferencian por 10%.

Según lo utilizado en la presente, un "material homólogo" es una composición y/o una alícuota de: los organismos que tienen I¦ ! · · · ci propiedades biológicas uniformes, y/o se derivan de los : i organismos de la misma especie, y/o muestran un grado de semejanza de las propiedades que indican un origen común.

Según lo utilizado en la presente, un "material heterólogo" es una composición y/o alícuota de: los organismos que tienen diversas propiedades biológicas, y/o se derivan de los organismos de diferentes especies, y/o muestran un grado de desemejanza de las propiedades que indican diferentes orígenes.

Los términos "oocistos", "merozoítos" y "esporozoítos", .. . . ¡ según lo utilizado en l presente, y a menos que se indique lo contrario, significan oocistos, merozoítos, y esporozoítos de Eimeria de pavo que pueden ser eliminados, atenuados, o no atenuados.

El término "esporocisto" se refiere a la cápsula que incluye los esporozoítos. en el oocisto.

El tér,m,ino "enquistado" significa la etapa del oocisto del parásito protozoario.

Según lo utilizado en la presente, los términos "inmunizar" y "vacunar" son sinónimos y se utilizan alternativamente. El término "dosis de inmunización efectiva", según lo utilizado en la - 1 presente, a menos que se indique lo contrario, significa el número de esporozoos en cualquier etapa en su ciclo vital incluyendo mezclas de uno o más, o incluso todas las etapas de sus ciclos vitales, por ejemplo, esporozoítos, oocistos y/o merozoítos, o, cuando se mezclan, por ejemplo, el número de esporozoítos, oocistos y merozoítos, suficientes para producir una reacción inmunológica en animales vacunados de tal manera, por ejemplo, producen un aumento de títulos de anticuerpo correspondientes y/o una activación de la inmunidad mediada por células. Preferiblemente, la reacción inmunológica que se produce proporciona la inmunidad protectora que limita o reduce los síntomas clínicos de la enfermedad, pérdida de peso, morbosidad, utilización de alimentación disminuida, y/o mortalidad en los animales vacunados (por ejemplo, aves) cuando se desafían con una dosis virulenta de esporozoos (por ejemplo, Eimeria o Cryptosporidia) .

El término "inmunidad sólida" se utiliza alternativamente en la presente con el término "inmunidad completa" y el término I "hiper-inmunidad", y denota un grado de inmunidad concedido en un grupo de animales vacunados (por ejemplo, una parvada de aves vacunados) que proporciona la protección contra un desafio homólogo tal que los animales vacunados son estadísticamente similares a los controles no desafiados (y/o estadísticamente no similares a los controles desafiados no vacunados) en salud y desempeño según lo medido mediante por ejemplo, conversión de alimentación, aumento de peso, y/o lesiones (evidentes o microscópicas) de la coccidiosis.

Los términos "adyuvante" y "estimulante inmunológico" se utilizan alternativamente en la presente, y se definen como una o I más sustancias que causan el estímulo del sistema inmunológico. Los adyuvantes son los agentes que aumentan de manera no específica una inmunorespuesta a un antígeno particular, reduciendo así la cantidad de antígeno necesaria en cualquier vacuna dada, y/o la frecuencia de la inyección necesaria para generar una inmunorespuesta adecuada al antígeno de interés. En este contexto, un adyuvante se utiliza para aumentar una inmunorespuesta a uno o más antígenos/aislantes de vacuna. Un adyuvante se puede administrar al animal objeto antes, en combinación con, o después de la administración de la vacuna.

Según lo utilizado en la presente una "secuencia de nucleótido heteróloga" es una secuencia de nucleótido que es agregada a. una .secuencia de nucleotido de la presente invención por métodos recpmbinantes para formar un ácido nucleico que no se forma naturalmente. Tales ácidos nucleicos pueden codificar los ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, quiméricos). En una modalidad particular la secuencia de nucleotido heterologa puede funcionar como medio para la detección de una secuencia de nucleotido de la presente invención. En otra modalidad tal secuencia de nucleotido heterologa puede funcionar para facilitar el uso del ácido nucleico en una reacción PCR.

Según lo utilizado en la presente el término "aproximadamente" se utiliza alternativamente con el término "más o menos" y significa que un valor está dentro de cincuenta por ciento del valor indicado es decir, una composición que contiene "aproximadamente" 100 oocistos contiene de 50 a 150 oocistos.

El término "estadísticamente similar" según lo utilizado en la presente denota que una comparación estadística de los dos grupos o poblaciones de animales daría lugar a la aceptación de la hipótesis nula (o hipótesis de ninguna diferencia) en un nivel de significación de < 0.1.

El término "estadísticamente diferente" según lo utilizado en la presente denota que una comparación estadística de los dos grupos o poblaciones de animales daría lugar al rechazo de la hipótesis nula (o hipótesis de ninguna diferencia) en un nivel de significación de < 0.1. i Í i ; Según lo utilizado en la presente, cuando una serie de secuencias de nucleótido es proporcionada por una lista de SEC ID NO, por ejemplo, SEC ID NO: 31, 32, 33, 34, y/o 43 (o SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, y/o SEC ID NO: 43), "y/o" se piensa para modificar la relación entre todas las SEC ID NO enumeradas en la serie. Por lo tanto, una comparación/identificación basada en tal serie de secuencias de nucleótido se puede hacer con referencia a las secuencias de nucleótido individuales enumeradas solas, o en cualquier combinación enumerada de secuencias de nucleótido individuales, incluyendo todas las secuencias de nucleótido enumeradas en la serie.

Las alineaciones de secuencia de nucleótido se realizan usando la metodología de Clustal W basada en J.D. Thompson y colaboradores, [Nucleic Acid Research 22:4673-4680 (1994)], en el programa de alineación Megalign™ del software de análisis de i- ¿ ( datos DNASTAR (Windows 32 Megalign 5.06. 1993-2203 DNASTAR Inc.) usando los ajustes por defecto en todo momento. Caracterización de E. meleagrimitis 2 La E. meleagrimitis 2 invade las mismas regiones de los intestinos que E. meleagrimitis 1 y E. dispersa, pero los oocistos de E. meleagrimitis 2 son relativamente más pequeños que los de estas dos especies. Los oocistos esporulados examinados fueron encontrados como sub-esféricos que midieron 17.824 x 16.444 micrones (16.915-19.549 x 14.585-18.314 micrones) con un índice de forma de 1.0839.

El parasitismo con E. meleagrimitis 2 es acompañado por hiperemia severa y producción excesiva de moco en la mitad superior del intestino delgado, con hemorragia de mucosa moderada a severa que se extiende desde el duodeno al íleo mientras que progresa la infección (ver, las figuras 1 y 2).

La especie de Eimeria recientemente identificada E. meleagrimitis 2, se puede identificar inequívocamente por su secuencia de nucleótido única en la región de separación transcrita interna uno (región ITS-1, ver, la figura 3B), ubicada entre los genes de ARN ribosómicos 18S y 5.8S en el genoma de Eimeria. Por consiguiente, la presente invención proporciona las secuencias de .nucleótido individuales de la región ITS-1 de cuatro aislados de E. meleagrimitis 2, SEC ID NO: 31, 32, 33, y 39. Estas secuencias compartes más de 96% (y hasta 100%) de homología entre sí. La presente invención además proporciona una secuencia de consenso para la región ITS-1 de E. meleagrimitis 2 con una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 44.

Además, los conjuntos de cebadores de PCR, basados en la secuencia de región ITS-1 de cada especie, se han diseñado para el usó en análisis de identidad basados en PCR. Un conjunto completo de tales cebadores está contenido dentro del grupo de pares de secuencias de nucleótido de las SEC ID NO: 3 y 4, para E. meleagrimitis 1; SEC ID NO: 5 y 6, para E. adenoeides; SEC ID NO: 7 y 8, para E. gallopavonis; SEC ID NO: 9 y 10, para E. dispersa; SEC ID NO: 11 y 12, para el E. meleagrimitis 2.

Sujetos animales El animal que se tratará es preferiblemente un miembro del género Meleagris, es decir, un pavo. En una modalidad particular, el pavo es del género gallopavo, es decir, un pavo doméstico. En otra modalidad, el pavo es del género ocellata. Generalmente, la administración de la vacuna será realizada en polluelos de pavo, frecuentemente, el día que sale del cascarón el polluelo de pavo. Antígenos 1 · i ' Los oocistos silvestres son obtenibles de las heces o tejido de animales infectados; alimentación o agua contaminada; suelo; excremento o lecho de gallinas; o una variedad de otras fuentes. Se conocen los métodos para el aislamiento de esporocistos y oocistos. Los procedimientos exactos usados para separar los oocistos variarán con el material del cual los oocistos se obtienen y serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Los merozoitos se pueden desarrollar en un cultivo por los métodos descritos en el docume'nto US 7,250,286 B2, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

Un método disponible para aislar los organismos de las muestras ambientales naturales es como sigue: La etapa inicial es la separación de los esporocistos y/o oocistos del material extraño. El suelo o excreciones es procesado generalmente formando una mezcla con la solución salina saturada y separando los esporocistos y/o oocistos de la mezcla. Por ejemplo, el material que se procesará se mezcla con un mínimo de 2 volúmenes (peso/volumen) de NaCI acuoso saturado para formar una mezcla. En caso de ser necesario, la mezcla se puede procesar en un mezclador o Iicuadora hasta que se alcance una consistencia homogénea. La mezcla se centrifuga aproximadamente 800 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante es recolectado vertiendo a través de una capa doble de una gasa tejida de 24 x 24. Otros métodos para purificar los oocistos de las muestras que son usados comúnmente incluyen la flotación de sucrosa de Sheather y la flotación de zinc-sulfato, [por ejemplo, ver LR Ash y TC Orihel, Parasites: A Guide to Laboratory Procedures and Identification. ASCP Press © 1991, incorporado por la referencia en la presente].

El sobrenadante filtrado se diluye con dos volúmenes de agua potable y es centrifugado a aproximadamente 1600 x g durante 10 minutos a 4°C. Los oocistos granulados se lavan con agua y son granulados por centrifugación tres veces más según lo descrito. Los oocistos entonces se lavan tres veces en 2.5% de dicromato de potasio usando el mismo procedimiento usado para los lavados con agua. Después del lavado final, los oocistos se pueden almacenar en 2.5% de dicromato de potasio a 4°C o transferir a un envase para la esporulación.

Alternativamente, la filtración secuencial se puede utilizar para aislar los oocistos basados en el tamaño. Si se utiliza la filtración, los oocistos se lavan con agua y 2.5% de dicromato de potasio según lo descrito previamente.

Las líneas no atenuadas que se originaron como aislados de campo silvestres ha sido mantenidas en ajustes de laboratorio por el paso serial durante muchos años y se caracterizan bien como bajas a moderadas en patogenicidad, con fecundidad media a alta, períodos pre-evidencía definidos y patrones conocidos de propagación del anfitrión.

Además de las líneas de Eimeria precoces existentes, las líneas precoces también se pueden obtener de cepas madre virulentas silvestres o cepas no atenuado después del paso serial en pavos. En un tal caso, los oocistos se recolectan de las heces solamente durante las primeras horas después de la evidencia. De este modo, el periodo de tiempo pre-evidencia puede ser reducido progresivamente. Este tipo de paso es llamado un paso de selección. Alternativamente, para aumentar la cantidad de oocistos disponibles para la cosecha, puede ser ventajoso recolectar los oocistos una sola vez entre el inicio de la evidencia y el periodo de tiempo pre-evidencia aproximado de la cepa madre. Este tipo de paso se llama paso neutral. Finalmente, en el proceso conocido como paso relajado, virtualmente todos los oocistos se recolectan/ incluyendo aquellos producidos después del periodo de tiempo pre-evidencia de la cepa madre.

Vacunas Las vacunas de la presente invención pueden ser preparadas por muchos procedimientos, uno de ellos se proporciona solamente como ejemplo.

Composición del producto Seis especies de Eimeria de pavo fueron aislada y después propagadas por el paso a través de pavos.

Proporciones (Oocisto viable o unidad por 1000 dosis).

Cultivos Método de identificación: Los coccidios son identificados por examen microscópico y las mediciones de la longitud y anchura. El área de la infección (cambios patológicos) es también un criterio en la distinción de la especie de Eimeria. Debido a que cada especie es antigénicamente distinta, los estudios inmunológicos cruzados en aves susceptibles y sin inmunizar se pueden también utilizar como medio para la identificación de cultivos.

La cristalería y utensilios usados en laboratorios de producción son lavados exhaustivamente después del uso y permanecen en el sitio específico para cada especie. Si tales artículos que se utilizaran para una diferente especie de Eimeria desarrollada en el mismo anfitrión, se someten a autoclave a 121°C durante 30 minutos y/o a tratamiento térmico a más de 100°F (37°C) durante 72 horas o más de 150°F (65°C) durante 48 horas.

Virulencia y pureza de cultivos: La pureza de los cultivos de siembra se pueden obtener por aislamiento unicelular. Un oocisto viable, medido con un micrómetro ocular, se proporciona oralmente a aves de 3-10 días de edad libres de coccidiano. Debido a que el período pre-evidente se conoce para cada especie, el ave se sacrifica al momento de la producción de oocistos y los intestinos y/o bolsas cecales se lavan con agua estéril, 2.5% de dicromato de potasio se agrega y se dejan al aire durante 24-72 horas para permitir que los oocistos contenidos en la suspensión se esporulen, y de tal modo, sean infecciosos. Éstos se pasan a través de otro ave libre de coccidios y se repite el proceso hasta que suficientes cantidades de oocistos se hayan obtenido las cuales serán utilizados como semilla para la producción.

Composición de medios: Todos los oocistos, obtenidos en cultivos puros según lo descrito anteriormente, se reproducen en los polluelos que acaban de salir de cascaron, se ponen en cuarentena y son mantenidos libres de infección por coccidios. Los aves varían en edad de 3-28 días de edad para la producción de semilla y de 3-8 semanas para la producción de vacuna. Los aves son examinados semanalmente para determinar la ausencia de infección por el método de flotación de azúcar y justo antes del momento de inoculación.

Cultivos de semilla/Oocistos: Las cultivos de semilla se almacenan a temperatura de refrigeración. Los oocistos para la inoculación se suspenden en agua de grifo fría.

Inoculaciones: Los aves individuales son inoculadas con 1.0 mi de la suspensión insertando una pipeta o jeringa calibrada que contiene la suspensión de oocistos en la cosecha. El número de oocistos por 1.0 mi varía con cada especie: Propagación y cosecha de oocistos: • Cada especie se propaga en el intestino de pavos vivos. Después de un período pre-evidencia apropiado, ver anteriormente, los oocistos no esporulados se depositan en los excrementos. Los excrementos se pueden recolectar diariamente a partir del día.14 después de la inoculación. Los oocistos se examinan microscópicamente y se deben ajustar al tamaño y forma de los oocistos usados en la inoculación. Ningún otro tipo debe estar presente, lo cual indicará de otra manera que una especie contaminante fue sido introducida inadvertidamente. Las aves seleccionadas aleatoriamente pueden ser sacrificadas y observarse las lesiones características en las secciones apropiadas del intestino. No se hace ninguna cosecha si existe alguna evidencia de lesiones causadas por una enfermedad extraña u otra especie de coccidios.

Las aves usadas para la producción de cada especie de coccidios se crían en baterías y se mantienen en cuarentena hasta que se necesiten para la producción. Se transfieren a un sitio des.ignado para la producción de una especie, y cada ave se infecta oralmente con un,a suspensión de un cultivo de semilla puro de oocistos. Las aves son vigiladas por los técnicos entrenados durante el período pre-evidencia.

El período pre-evidencia varía con cada especie.

· Los excrementos de aves infectados se recolectan en las bandejas que contienen papel que se cambia diariamente. Los excrementos se transfieren a un recipiente limpio y se mezclan con agua de grifo producir una consistencia espesa. Una dilución de 1:10 se hace de esta suspensión en agua de grifo y los oocistos se cuentan en un hemocitómetro. Si la cuenta aparece suficientemente alta, los oocistos se lavan fuera de los excrementos.

Si los excrementos son ricos en conteos de oocistos, una dilución de 1:5 (aproximada) se hace de la suspensión espesa en 2.5% de dicromato de potasio y la suspensión se agita vigorosamente. Las partículas extrañas más pesadas descienden rápidamente y los oocistos permanecen suspendidos en el sobrenadante. Este sobrenadante se pasa a través de un tamiz de malla 100 para eliminar cualquier partícula flotante grande. Este procedimiento es repetido lavando el sedimento varias veces para eliminar la mayoría de oocistos. La mezcla sobrenadante se transfiere a los frascos y airean por burbujeo de aire pasante. La aireación se continúa durante 24-72 horas hasta que se haya obtenido la esporulación máxima.

Después de la aireación, los oocistos se mantienen a temperatura ambiente hasta que hayan descendido. El sedimento se lava con 2.5% de dicromato hasta que ningún oocisto se pueda observar en el sedimento. La sedimentación y lavado del sobrenadante se repite hasta que los oocistos sean contenidos en un volumen que sería aproximadamente una mitad de sedimento y i una mitad de dicromato limpio. La suspensión se enfría a aproximadamente 4°C después se agrega dera-propiolactona fría en una concentración final de 0.1-0.2% y se coloca en el refrigerador. Alternativamente, los excrementos se diluyen con agua de grifo y se pasan a través de un tamiz de malla 100. Este procedimiento se repite varias veces hasta eliminar la mayoría de los oocistos. El sobrenadante es concentrado permitiendo que se asiente hasta que los oocistos se asienten o por centrifugación de flujo continuo a 2000 rpm. El sedimento entonces se mezcla con una solución saturada de azúcar y se centrifuga con el efluente retenido.

El efluente se diluye con agua de grifo fría y se somete a centrifugación nuevamente con el sedimento que contiene los oocistos que soh retenidos. Los oocistos se suspenden nuevamente con 2.5% de dicromato de potasio y se airean : í durante 24-72 horas. La oefa-propiolactona se agrega a concentraciones finales de 0.1-0.2% y se coloca en un ¾ ? refrigerador. ! : t Cada suspensión de especie se cultiva para esterilidad. 1 mi de cada suspensión se inocula encendido a cada uno de los siguientes: solución para cerebro-corazón, desoxicolato, SS y agar de dextrosa de Sabouraud. Ningún patógeno puede estar presente.

Las alícuotas de !cada especie con un número óptimo de oocistos se inoculan oralmente en grupos de tres aves de 2-8 r semanas de edad. Estas aves se sacrifican durante el período de infección para comprobar que las lesiones producidas fueron causadas por la especie prevista. Cada porción debe contener solamente la especie prevista.

Todo el material desechado se maneja de acuerdo con V.S. Memo 800.56. Los materiales sólidos se colocan en bolsos de polietileno y se entierran o se incineran. Los líquidos se tratan con blanqueador doméstico (50 mi por 1000 mi de fluidos para dar aproximadamente 600 ppm de cloro) y se mantienen a temperatura ambiente durante por lo menos 15 minutos antes del desecho a través del drenaje sanitario.

Las jaulas o celdas de aves son lavadas a presión y descontaminadas con el calor seco (150°F (65°C) durante 48 horas o 100°F (37°C) durante 72 horas). i . 2 i ! Dosificación • Ejemplo de montaje de dosificación: (Dosificación promedio 80,000 mi) Número mínimo de oocistos esporulados en la solución 2.5% de dicromato de potasio Especies 1000 DOSIS 5000 DOSIS E. adenoeides 4 X 109 8 X 109 E. dispersa 8 X 109 1.6 X 1010 E. gallopavonis :4 X 109 8 X 109 E. meleagrimitis 1 4 X 109 8 X 109 E. meleagrimitis 2 4 X 109 8 X 109 Volumen de dosificación promedio: 80,000 mi Volumen de dosificación máxima: 160,000 mi Volumen de llenado: (El volumen de llenado se comprueba periódicamente durante el llenado.) 4.2±0.2 mi en un frasco estéril de 10 mi para 1 ,000 dosis 10.5±0.5 mi en un frasco estéril de 20 mi para 5,000 dosis La vacuna a granel es agitada durante el llenado y se dispersa en los envases finales por medio de una máquina de pipeteo. Las jeringas y tubería de llenado se esterilizan en autoclave antes del uso. Los envases finales son esterilizado en horno en cacerolas recubiertas y se dejan enfriar antes del llenado. Los tapones de goma, esterilizados en autoclave, se colocan en los frascos y un sello de aluminio es aplicado. Los frascos llenados se almacenan en un refrigerador a 3-7°C.

Adyuvantes Bajo ciertas circunstancias las composiciones de vacuna de la presente invención también pueden incluir un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes de la presente invención se pueden obtener de cualquiera de un número de fuentes que incluyen fuentes naturales, fuentes recombinantes, y/o se sintetizan químicamente, etc. Convenientemente los adyuvantes para la vacunación de animales incluyen, pero no se limitan a, Adyuvante 65 (que contiene aceite de cacahuete, monooleato de manida y monoestearato de aluminio); adyuvante de Freund completo o incompleto; geles minerales, compuestos de aluminio tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, y alumbre; tensioactivos, tal como hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, ?,?-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroximetil)propandiamina, metoxihexadecilglicerol, y polioles plurónicos; polianiones, tal como piran, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico; péptidos, tal como dipéptido de muramilo, dimetilglicina y tuftsina; y emulsiones de aceite. La información referente a los adyuvantes es descrita, por ejemplo, en la serie de P. Tijssen [Practice and Theory of Enzyme Immunoassays , 3ra Edición, Elsevier, New York, (1987), cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad].

Otros adyuvantes potenciales incluyen, pero no se limitan a aceites metabolizables y no metabolizables, polímeros de bloque, ISCOM (complejos estimulantes inmunológicos), vitaminas y minerales (incluyendo pero sin limitarse a: vitamina E, vitamina A, selenio, y vitamina B12), Quil A (saponinas), polímeros de ácido acrílico reticulados con éteres de polialquenilo o divinilglicol, según lo vendido bajo la marca registrada CARBOPOL® (por ejemplo, CARBOPOL® 941), y gotas de aceite de tamaño micrométrico dispersas uniformemente en la emulsión de agua (por ejemplo, según lo vendido bajo la marca registrada Emulsigen®).

Los ejemplos adicionales de adyuvantes, que ocasionalmente se han referido específicamente como estimulantes inmunológicos, incluyen los componentes de pared celular bacterianos y fúngicos (por ejemplo, lipopolisacáridos, lipoproteínas, glicoproteínas, muramilpéptidos, beta-1 ,3/1 ,6-glucanos), varios carbohidratos complejos derivados de plantas (por ejemplo, glicanos, acemanano), varias proteínas y péptidos derivados de animales (por ejemplo, hormonas, citocinas, factores co-estimulantes), y nuevos ácidos nucleicos derivados de virus y otras fuentes (por ejemplo, ARN bicatenario, CpG). Además, cualquier número de combinaciones de las sustancias mencionadas anteriormente pueden proporcionar un efecto adyuvante, y por lo tanto, pueden formar un adyuvante de la presente invención.

Una vacuna de la presente invención es administrada fácilmente por cualquier ruta estándar incluyendo la vacunación por aerosol, intravenosa, intramuscular, subcutánea, oral (incluyendo en la alimentación y/o agua potable), intranasal, intradérmica, e intraperitoneal. El experto apreciará que la composición de vacuna sea formulada preferiblemente de manera apropiada para cada tipo de animal receptor y ruta de administración .

EJEMPLO 1 UNA NUEVA ESPECIE PATOGENICA DE EIMERIA i Sinopsis Según lo demostrado en la presente, la E. meleagrimitis 2 (E. edgari) es una nueva especie patogénica de coccidios para pavos. Las aves inmunizadas con una combinación de E. adenoeides, E. meleagrimitis 1, E. dispersa y E. gallopavonis (Coccivac-T) o E. adenoeides y E. meleagrimitis (Immucox) o E.meleagrimitis 1 como entidades simples no fueron protegidas contra E. meleagrimitis 2. La E. meleagrimitis 2 fue aislado de operaciones de pavo comerciales de varios estados en los Estados Unidos de Norteamérica y de pavos silvestres de la región de Delmarva. Los polluelos hiper-inmunizados durante varias semanas con E. meleagrimitis 1, E. adenoeides y E. dispersa (E. MAD) y desafiados con los organismos sospechosos (E. meleagrimitis 2) exhibieron síntomas clínicos de parasitismo severo (depresión, no alimentación y letargo) 6.5 días después del desafío. Los polluelos desarrollaron la inmunidad después de varias exposiciones de grado inferior y la inmunidad fue solamente a E. meleagrimitis 2.

El E. meleagrimitis 2 invade las mismas regiones de los intestinos que E. meleagrimitis 1 y E. dispersa, pero los oocistos de E. meleagrimitis 2 son más pequeños que los de estas dos otras especies. Las aves inmunizadas con E. MAD no fueron protegidas contra E. meleagrimitis 2 y las aves inmunizadas con E. meleagrimitis 2 no fueron protegidas contra E. meleagrimitis 1, E. adenoeides o E. dispersa. La E. meleagrimitis 2 parece ser relativamente frecuente en los Estados Unidos de Norteamérica, estando presente en muchas de las áreas de crecimiento de pavos de los Estados Unidos de Norteamérica. De hecho, el predominio de E. meleagrimitis 2 se estima que es de más del 40%, con estos organismos identificados en muestras fecales de California, lowa, North Dakota, South Dakota, Minnesota, Pennsylvania, Virginia, Wisconsin, Delaware, y Maryland.

Materiales y métodos Fuente de coccidios: Las muestras fecales, muestras de desechos y/o muestras gastrointestinales fueron evaluadas debido a los brotes de coccidiosis en parvadas de pavos comerciales. Los organismos recuperados fueron caracterizados originalmente como similares a E. meleagrimitis 1 basados en la morfología, la región del tracto gastrointestinal con parásitos y su patología. Las muestras fueron obtenidas de granjas de pavos comerciales de los siguientes estados: California, lowa, North Dakota y South Dakota, Pennsylvania, Minnesota, y Virginia. Las muestras fecales también fueron obtenidas de pavos silvestres de Delaware y Maryland.

Patogenicidad y patología: El parasitismo con £. meleagrimitis 2 es acompañado por la producción severa de moco en la mitad superior de los intestinos delgados y hemorragia moderada a severa que ocurre desde el duodeno al íleo mientras progresa la infección. Las lesiones evidentes son hiperemia, exceso de moco en el duodeno y yeyuno, seguido por hemorragia en la mucosa en los intestinos delgados. Las heces de los animales infectados son acuosas, mucoides, y con sangre. Los parásitos invaden las pélulas epiteliales desde el duodeno al recto y se encuentran ocasionalmente en el intestino ciego.

Pruebas conducidas: Prueba de sensibilidad anti-coccidios (AST): Los coccidios fueron expandidos en polluelos de pavo no tratados y las pruebas fueron conducidas para determinar la eficacia de anti-coccidios específicos contra varios de los aislados. Los aislados de las granjas comerciales mostraron tolerancia o resistencia a CLINACOX® y AMPROL®. En los casos de lowa, California, Minnesota, hubo informes de las fallas de CLINACOX® durante el período de uso. Como es ahora conocido, los organismos predominantes fueron similares a E. meleagrimitis 1 que en la presente se han descrito y se han identificado como E. meleagrimitis 2. Los aislados pavos silvestres de Delaware y Maryland fueron probados contra anti-coccidios específicos tal como CLINACOX® y AMPROL®. Los resultados fueron similares, los fármacos demostraron una eficacia deficiente contra los aislados de pavo silvestre, tabla 1. La E. meleagrimitis 1 de Coccivac®-T demostró una tolerancia moderada a CLINACOX®, pero menos pronunciada que la respuesta de E. meleagrimitis 2.

Hiper-inmunización: Los polluelos de pavo que crecieron en jaulas fueron administrados con múltiples inoculaciones durante varias semanas con Coccivac™-T, una combinación de E. adenoeides, E. dispersa y E. meleagrimitis 1 (Coccivac®-T) o E. ¦: í meleagrimitis 1, o una combinación de E. meleagrimitis 2 (Immucox™), E. adenoides y E. meleagrimitis 2.

Métodos de inoculación: Los polluelos fueron inoculados inicialmente dentro de los primeros siete días de edad, entonces varias veces durante varias semanas después. La inoculación inicial fue hecha vía sonda y las inoculaciones subsecuentes fueron vía la alimentación. Cada dosis subsecuente fue dos veces la dosis anterior.

Desafío/lnoculació de oocistos: A aproximadamente 28 días de edad, las aves sanas fueron seleccionadas y designadas de manera aleatoria en jaulas de desafío. Cada ave desafiada fue administrada con 1 mi de un material homólogo o heterólogo.

Lesión evidente y conteo microscópico: 6 días después del desafío, todas las aves fueron sacrificadas y los intestinos fueron examinados para determinar el conteo de lesiones usando un sistema 0 a 4. El frotis de preparación húmeda fue preparado de seis áreas de cada intestino, 1) duodeno, 2) yeyuno, 3) divertículo del conducto onfalomesentérico, 4) íleo, 5) bolsa cecal (CP) y, 6) recto para la determinación de la carga de parásitos usando un sistema 0 a 4+ (0 = ningún parasitismo y 4 = parasitismo severo).

Resultados y discusión Inmunización con E. MAD: Las aves inmunizadas con E. MAD y desafiados con uno de varios materiales heterologos mostraron que las aves ??· fueron protegidas contra los organismos desconocidos referidos en la presente como E. meleagrimitis 2. El nivel de parasitismo osciló de moderadamente severo a severo (ver, la tabla 1).

Tabla 1 Niveles de parasitismo en los polluelos hiper-inmunizados E. MADS desafiados con los aislados de campo de meleagrimitis 2A ALos aislados de campo se caracterizaron por PCR como que contienen E. meleagrimitis 2, así como otra Eimeria en algunos i casos.

YSD = divertículo del saco vitelino; CP = bolsa cecal; E. me2 = E. meleagrimitis 2 Inmunización con E. meleagrimitis 1: Las aves inmunizadas con E. meleagrimitis 1 y desafiadas con uno de los aislados de campo mostraron que las aves no fueron protegidas contra el organismo que se describe y define en la presente como E. meleagrimitis 2. El nivel de parasitismo osciló de moderadamente severo a severo (ver, la tabla 2). Sin embargo, los polluelos desafiados con el material homólogo no mostraron ninguna lesión evidente o carga de parásitos, (ver, la tabla 2).

Tabla 2 Niveles de parasitismo en polluelos hiper-inmunizados con E. meleagrimitis 1 desafiados con los aislados de campo de E. meleagrimitis 2A ALos aislados de campo se caracterizaron por PCR como que contienen E. meleagrimitis 2, así como otra Eimeria en algunos casos.

E. me2 = E. meleagrimitis 2; YSD = divertículo del saco vitelino; CP = bolsa cecal; Inmunización con IMMUCOX®: Las aves inmunizados con IMMUCOX® y desafiadas con uno de varios materiales heterólogos incluyendo Coccivac®-T o materiales homólogos mostraron que las aves no fueron protegidas contra Coccivac®-T, pero proporcionaron resultados variados contra organismos desconocidos, definidos en la presente como E. meleagrimitis 2. El nivel de parasitismo osciló de ninguno a células parasíticas raras para E. meleagrimitis 2 a parasitismo severo para los organismos Coccivac®-T (ver, la tabla 3).

Tabla 3 Niveles de parasitismo en polluelos hiper-inmunizados IMMUCOX® desafiados con los aislados de campo de meleagrimitis 2A o E. MAD ALos aislados de campo se caracterizaron por PCR como que contienen E. meleagrimitis 2, así como otra Eimeria en algunos casos.

E. me2 = E. meleagrimitis 2; YSD = divertículo del saco vitelino; CP = bolsa cecal; R = Raro Inmunización con E. meleagrimitis 2: Las aves inmunizadas con E. meleagrimitis 2 y desafiados con uno de varios de los aislados de campo de E. meleagrimitis 2 mostraron que las aves fueron protegidas. El nivel de parasitismo osciló de ninguno a parasitismo ligero, pero las aves desafiadas con E. meleagrimitis 1 no mostraron ninguna protección según lo medido por la carga de parásitos en intestino delgado superior (ver, la tabla 4).

Tabla 4 Niveles de parasitismo en polluelos hiper-inmunizados con E. meleagrimitis 2 desafiados con los aislados de campo de E. meleagrimitis 2A ALos aislados d,e campo se caracterizaron por PCR como que contienen E. meleagrimitis 2, así como otra Eimeria en algunos casos.

E. me2 = E. meleagrimitis 2; YSD = divertículo del saco vitelino; CP = bolsa cecal; Patogenicidad y patología: El parasitismo con estas especies es acompañado por la producción severa de moco en la mitad superior de los intestinos delgados, con hemorragia moderada a severa que ocurre desde el duodeno al íleo mientras progresa la infección. Las lesiones evidentes son hiperemia, exceso de moco en el duodeno y yeyuno, seguido por hemorragia en la mucosa en los intestinos delgados, (ver, la tabla 5 y 6, figuras 1 y 2).

Tabla 5 Severidad de lesiones evidentes y regiones de los intestinos afectadas por E. meleagrimitis 2 en polluelos hiper-inmunizados contra E. meleagrimitis 1 o E. meleagrimitis 2 E. me1 = E. meleagrimitis 1; E. me2= E. meleagrimitis 2; NA = no aplicable Tabla 6 Severidad de lesiones evidentes y producción de oocistos por ave (OPB, por su abreviatura en inglés) en millones para los polluelos hiper-inmunizados contra E. meleagrimitis 1 o E. meleagrimitis 2 y desafiados con E. meleagrimitis 2 E. me1 = £. meleagrimitis 1 ; E. me2= E. meleagrimitis 2; NA = no aplicable Sinopsis De acuerdo con los datos de los estudios de inmunización e inmunización cruzada con los coccidios de diferentes fuentes, las especies heterólogas y homologa mostraron que los polluelos inmunizados con E. meleagrimitis 1, E. adenoeides y E. dispersa (E. MAD) y desafiados con E. meleagrimitis 2 no fueron protegidos contra ese desafío. Los polluelos inmunizados contra E. meleagrimitis 2 y desafiados con £. meleagrimitis 2 mostraron un alto nivel de protección, pero no cuando fueron desafiados con E. meleagrimitis 1 DESCRIPCION DE OOCYST Eimeria meleagrimitis 2 (£. edgari sp.n.) según lo descrito en la presente: Los oocistos esporulados son sub-esféricos, los cuales miden 17.82 x 16.44 micrones (16.92-19.55 x 14.59-18.31 micrones) con un índice de forma de 1.084.

E. Mealeagrimitis 1: Los oocistos esporulados son sub-esféricos, los cuales miden 21.47 x 19.19 micrones (18.90-25.93 x 16.36-21.78 micrones) con un índice de forma de 1.119.

Eimeria meleagrimitis 1 con referencia a las enfermedades de aves de corral: Los oocistos esporulados son sub-esféricos, los cuales miden 19.2 x 16.3 micrones con un índice de forma de 1.178.

EJEMPLO 2 ESTUDIO DE PROTECCION CRUZADA EN PAVOS Materiales y métodos: Cuarenta polluelos de pavos comerciales de 4 días de edad fueron hiper-inmunizados durante un período de 28 días con una solución pura de E. meleagrimitis 1 (E. me-080121). Cuarenta polluelos de cuatro días de edad (compañeros de salida del cascarón) fueron mantenidos libres de coccidios por alimentación con AMPROL® a 125 ppm durante el período de crecimiento. El AMPROL® fue retirado 96 horas antes del desafío. Las aves de los grupos hiper-inmunizado y de control fueron designadas aleatoriamente a cinco grupos y desafiados con uno de cinco tratamientos, según lo mostrado en la tabla 1. Hubo siete aves por grupo. Los pavos fueron juzgados listos para el desafío cuando no se propagó ningún oocísto en las heces 5 a 6 días después de la exposición. El desafío fue realizado por sonda oral y los pollos fueron sacrificados y se contaron las lesiones evidentes de la coccidiosís en una escala de 0 a 4 (ninguna lesión a lesiones severas) el día 6 después del desafío. Los cuenteas acumulativos de lesiones evidentes del duodeno, intestino medio, íleo e intestino ciego fueron tabuladas (evidentes). El intestino fue examinado para determinar la parasitemia microscópica (Micros) a 100X y se realizó el conteo a una escala de 0 a 4. La propagación de oocistos fue determinada por la recolección de heces recolectadas de cada ave durante un período de 48 horas del día 4 al día 6. Los oocistos fueron contados y tabuladas por gramo, por ave (OPB). Ver la tabla 1 para los resultados. El aumento fue calculado como la diferencia en peso corporal del día de desafío y del día 6.

Tabla 1 Estudio de protección cruzada en los pavos inmunizados contra EME1 y desafiados con varios aislados según lo medido por el aumento de peso y carga de parásitos Vacuna Desafío Aumento (g) Evidente Micro OPB x 106 Control E.me2- 213 1.25 7.75 15.0 Sundale E.me1-080121 = E. meleagrimitis 1 madre; E.mel -071690 = E. meleagrimitis 1 madre; E.me2-WPC = aislado de campo de E. meleagrimitis 2 = E. edgari; E.me2-Sundale = aislado de campo de E. meleagrimitis 2 = E. edgari; E.me2-UK = m E. meleagrimitis 2 madre Resultados y conclusiones Las aves inmunizadas con E.me1-080121 fueron sólidamente inmunes cuando no fueron desafiadas con E. me1-080121, sin lesiones evidentes, ninguna propagación de oocistos y ningún parásito observado in situ. Los pollos inmunizados con E.me2-080121 mostraron una inmunidad sólida cuando no fueron desafiados con E.me1-071690, sin lesiones evidentes, ningún oocisto propagado y ningún parásito observado in situ; pero hubo parásitos de E. adenoeides observados en el tejido cecal. Los pollos inmunizados con E.me1-080121 y desafiados con E.me2-UK, E.me2-WPC o E.me2-Sundale no fueron protegidos contra el desafío con E.mel según lo mostrado por la depresión de crecimiento, lesiones evidentes, parasitemia microscópica y propagación de oocistos. Todos los aislados de E.me2 mostraron patogenicidad en los polluelos sin trata con coccidios. Las patologías evidentes fueron similares entre los aislados de E.me2. E.mel y E.me2 no fueron similares.

EJEMPLO 3 ANALISIS DE SECUENCIA DE LAS ESPECIES DE EIMERIA DE PAVO Cuatro cepas de referencia de Eimeria de pavo clasificadas previamente por el examen de su patología en aves fueron obtenidas de la University of Georgia. El análisis de la secuencia de ADN fue realizado en los fragmentos amplificados por PCR clonados de la región ITS-1 (separación transcrita interna uno del grupo de ADN ribosómico 18S-5.8S-28S) de cada cepa, y las relaciones filogénicas fueron establecidas. Considerando que, los análisis análogos habían sido realizados para identificar diferentes aislados de Eimeria de pollo, hasta ahora, ninguno de tales análisis había sido realizado en pavos.

Los presentes resultados identifican las cuatro especies previamente clasificadas de pavo, más inesperadamente identifican una especie adicional de Eimeria de pavo que había sido agrupada previamente con E. meleagrimitis 1 (ver, el ejemplo 1 anterior). La especie adicional, descrita, caracterizada, y descrita en la presente, se ha nombrado E. meleagrimitis 2. Además de clasificar los varios aislados de pavo de los Estados Unidos de Norteamérica, los conjuntos de cebadores de PCR capaces de identificar cada una de las cinco especies también se describen en la presente. Estos conjuntos de cebadores de PCR han demostrado, entre otras cosas, ser útiles como herramientas de diagnóstico.

Una vacuna que ya se ha utilizado para ayudar en la prevención de la coccidiosis de pavo, Coccivac-T®, contiene oocistos vivos de cuatro especies de Eimeria de pavo: E. adenoeides , E. meleagrimitis (identificado en la presente como E. meleagrimitis 1), E. gallopavonis y E. dispersa. Previamente, la secuencia de nucleótido de la región ITS-1, ubicada entre los genes de ARN ribosomicos 18S y 5.8S en el genoma de Eimeria, se ha utilizado para establecer las relaciones filogénicas entre diferentes especies de Eimeria que infectan a los pollos. Genbank contiene numerosos depósitos de esta región para que varios aislados de pollo soporten su uso en los aislados de especiación, pero no hay depósitos comparables para las especies de pavo en esta región específica.

Según lo descrito en la presente, la cepa de referencia de cada especie de Eimeria de pavo conocida fue obtenida de una fuente muy respetada y la secuencia de ITS-1 entonces fue determinada para cada uno de los aislados obtenidos. Una comparación fue realizada entre las secuencias de las cepas de referencia y las contenidas en Coccivac-T®. Además, fue realizado un análisis del árbol filogenético. Los análisis de secuencia también fueron utilizados para determinar si los conjuntos de cebadores basados en las cuatro especies de pavo previamente clasificadas podrían identificar inequívocamente todos los aislados.

Materiales y métodos Kits v peles comerciales: ver la tabla 1 Tabla 1 Kits y geles NO. DE REACTIVO FABRICANTE PROCEDIMIENTO CATALOGO/PARTE Kit QlAamp Extracción de Qiagen 51304 DNA Mini ADN de Eimeria Kit HotStar Amplificación T aq Qiagen 203444 por PCR M áster Visualización de E-Gels Invitrogen G5018-02 fragmento de PCR Kit de purificación de extracción Qiagen 28704 producto de PCR de gel de agarosa QIAquick Kit de Clonación de clonación Invitrogen K4400-40 fragmento de TOPO TA PCR Extracción de ADN de la Kit QIAprep bacteria que Spin . Qiagen 27104 contiene el Miniprep fragmento de PCR clonado Productos biológicos: Las muestras de Eimeria de referencia (ver la tabla 2) fueron obtenidas de la University of Georgia, en Athens (UGA). Todos los aislados de Eimeria UGA habían sido caracterizados previamente por la patología. Algunas de las muestras fueron de los aislamientos de campo, y por lo tanto, potencialmente contuvieron múltiples especies. El ADN también fue aislado de la especie en la vacuna de Eimeria de pavo Coccivac-T®, que contiene los aislados de E. adenoeides, E. meleagrimits, E. dispersa y E. gallopavonis. Además, fue obtenida la información de ADN y secuencia de tres muestras europeas de Eimeria de pavo. Estas muestras habían sido caracterizadas por la patología, y fueron etiquetadas con E. adenoeides-UE , E. dispersa-UE y E. meleagrimitis 1-EU.

Protocolo: El ADN fue aislado de las muestras de Eimeria de pavo de referencia de UGA (ver la tabla 2).

La región ITS-1 de cada cepa de referencia fue amplificada por PCR usando el conjunto de cebadores WW1 /WW3r para la amplificación de ITS-1 y después fue purificada [ver, la tabla 5 para la secuencia de cebador, y la figura 3A para su ubicación en el genoma; Woods y colaboradores Electrophoresis 21: 3558-3563 (2000)].

Cada fragmento de PCR fue clonado en un vector de plásmido, pCR2.1-TOPO, y el fragmento es secuenciado.

Los datos de secuencia fueron analizados por un programa comercialmente disponible, [software de análisis ADNSTAR, Seqman, Editseq, Mapdraw, Megalign] y fue determinada la relación filogénica de las cepas de referencia con las cepas internas (ver, la tabla 4).

Las discrepancias fueron evaluadas entre las determinaciones de especie obtenidas por la patología y por el análisis de secuencia usando la amplificación por PCR que utiliza los conjuntos de cebadores de especie de ITS-1 internos (ver, la tabla 5 para las secuencias de cebadores, la figura 3B para la ubicación en el genoma, y la tabla 7).

Procedimientos experimentales Purificación de sucrosa de oocistos - RDP 7416.0-01 (escala manual/pequeña) Exquistación de esporocistos - RDP 7423.0-01 Suspender 1 x 10e5 a 1 a x 10e6 de oocistos en 1 mi de PBS, usando un tubo de micrófuga de tapón de presión de 1.5 mi y agregar un gránulo de cristal limpio (estéril) de un gramo [SIGMA 710-1, 180 µ?? (tamiz de 16-25 U.S.)] al tubo. Cerrar el tapón.

Someter a vórtice en el ajuste más alto durante 1 minuto, entonces se transfiere la suspensión de esporocistos por pipeteo a un tubo de micrófuga de 2 mi, y se enjuagan los gránulos con es. a 2 mi de PBS.

Centrifugar lá suspensión de esporocistos (12,000 rpm durante 15 segundos en una micrófuga), retirar el sobrenadante, y suspender de nuevo los esporocistos liberados en 200 µ? de PBS.

La extracción de ADN de esporocistos liberados se realiza según lo descrito en mini kit de ADN Qiagen QlAamp (protocolo de giro de sangre y fluido corporal): Pipetear 20 µ? de proteinasa K en el fondo de un tubo de micrófuga de 1.5 mi.

Agregar 200 µ? de muestra al tubo, agregar en 200 µ? de amortiguador de AL a la muestra, mezclar por vórtice de pulso durante 15 segundos.

Incubar a 56°C durante 10 minutos.

• Centrifugar brevemente para eliminar las gotas dentro de la tapa, agregar 200 µ? de etanol y mezclar nuevamente durante 15 segundos. Centrifugar brevemente para eliminar las gotas dentro de la tapa.

Transferir la mezcla a la columna de giro QlAamp, tapar y centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto, transferir la columna a un tubo limpio de 2 mi, descartar el flujo directo.

Agregar 500 µ? de amortiguador AW1 , tapar y centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto, transferir la columna a un tubo limpio de 2 mi, descartar el flujo directo.

Agregar 500 µ? de amortiguador AW2, tapar y centrifugar a 14,000 rpm durante 3 minutos, transferir la columna a un tubo limpio de 1.5 mi, descartar el flujo directo.

Agregar 200 µ? de amortiguador AE, tapar, incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, y centrifugar a 8,000 rpm durante 1 minuto para recolectar el ADN eluído.

• Amplificación por PCR de ITS-1 Ajustar las reacciones de PCR que contienen 10 µ? de cebador de ADN, 1 µ? de cada cebador delantero y trasero de ITS-1 de Woods (WW1 y WW3r), 1x de mezcla HotStar Taq Master, y agua libre de ARNasa a un volumen final de 50 µ?. Las condiciones de ciclo fueron como sigue: 1 ciclo de 95°C durante 15 minutos; 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos; entonces 1 ciclo de 72°C durante 7 minutos, seguido por un ciclo de 4°C mantenido. Un cebador de ADN de control positivo y un control negativo de agua (ningún cebador) fueron incluidos para cada conjunto de cebadores.

Electroforesis de los productos de PCR - RDP 7605.0- 03 • Ajustar la amplificación, 10 µ? de cada reacción fue cargado sobre 2% de agarosa E-Gel, y la corriente fue aplicada durante 15-30 minutos. La descripción completa del uso de E-Gels se describe en Invitrogen E-Gel Technical Guide. Estos geles contienen bromuro de etidio que une a cualquier fragmento de ADN, y permite que sea visualizado y fotografiado cuando se expone a luz UV. Una escala de 1-kb de ADN fue implementada en cada gel para la comparación del tamaño de fragmento de PCR.

Para purificar los fragmentos de PCR, un gel de 2% de agarosa fue preparado en una solución de 1X de amortiguador de TAE y 0.5 pg/ml de bromuro de etidio, siguiendo las pautas descritas en RDP 7605.0-03. El resto de la mezcla de reacción PCR, ~40 µ?, fue mezclado con 10x de tinte de carga Bluejuice a una concentración final de 1x, después fue cargado en los pozos del gel, y la corriente fue aplicada y fue sometido a electroforesis hasta que fue obtenida una buena separación de todos los fragmentos (85 durante 60 minutos, seguido por 75V durante 50 minutos). Nuevamente, una escala de 1-kb de ADN también fue cargada como una referencia de tamaño. El gel fue expuesto a luz UV para visualizar los fragmentos de ADN.

Purificación en gel de los productos de PCR Una vez que cada fragmento de PCR había sido separado por electroforesis en 2% de agarosa, un escalpelo fue utilizado para cortar un bloque de gel de agarosa que contuvo el fragmento de PCR, y el bloque de gel fue transferido a un tubo de microcentrífuga pesado.

El volumen del bloque de gel fue determinado en peso (1 miligramo igual a 1 µ? de gel fundido).

· El ADN fue extraído usar un kit de extracción de gel Qiagen, siguiendo las instrucciones de los fabricantes, y eluyendo el ADN a un volumen final de 200µ?.

Clonación de los productos de PCR en un vector de clonación pCR2.1-TOPO, y transformación del plásmido en E. coli.

Para clonar cada fragmento de PCR purificado, se siguen las instrucciones de los fabricantes suministradas con el kit de. clonación TOPO TA, que incluyen la transformación de las mejores 10 células competentes de E. coli.

• Colocar las células transformadas en placas de agar imMedia Amp, distribuidas con 40 µ? de una solución de 40 mg/ml de X-Gal e incubar a 37°C durante la noche.

Crecimiento, extracción de ADN y análisis de restricción de los clones Después de 20-24 horas de crecimiento bacteriano en las placas de transformación, son visibles las colonias bacterianas de color blanco y azul.

Dos colonias "blancas" de cada transformación se eligieron para el crecimiento y análisis. Cada colonia fue seleccionada con un mondadientes estéril y fue inoculada en 3 mi de caldo de Luria que contuvo 100 pg/ml de antibiótico de carbenicilina. Cada tubo de cultivo entonces fue aireado a 200 rpm a una temperatura de 37°C durante aproximadamente 16-20 horas.

El ADN fue extraído de 1.5 mi de cada cultivo durante la noche usando un kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep. Las instrucciones- del fabricante fueron seguidas, y el ADN fue enjuagado a un volumen final de 50 µ?.

La digestión de restricción de cada preparación de ADN fue realizada con la enzima EcoRI, y el material digerido fue cargado sobre un gel de 1.5% de agarosa en 1X de amortiguador de TAE y 0.5 pg/ml de bromuro de etidio. Cada reacción de digestión contuvo 5 µ? de ADN miniprep, 100 gg/ml de BSA, 1x de amortiguador de enzima EcoRI, 10 U de enzima y agua en un volumen final de 20 µ?. Las mezclas de reacción fueron incubadas durante más de 2 horas a 37°C, después el tinte de carga fue agregado a una concentración final de 1%. Después, la mezcla fue cargada sobre el gel y fue sometida a electroforesis a 95V durante 41 minutos. La luz UV fue utilizada para visualizar los productos de digestión. El ADN digerido de los clones bacterianos que contuvo el fragmento de PCR deseado liberó el fragmento del resto del plásmido y se pudo identificar por la comparación a un estándar de tamaño de ADN.

Análisis de secuencia de los productos de PCR clonados El ADN purificado de cada clon que contuvo el fragmento de PCR deseado fue enviado a SeqWright DNA Technologies para las reacciones Big Dye Sequence usando la secuencia de cebadores que hibridizan el vector de plásmido, y se leen en el fragmento de PCR reproducido.

La prueba de identidad de PCR usando conjuntos de cebadores basados en ITS- 1 Ajustar las reacciones PCR que contienen 10 µ? de ADN de molde, 1 µ? de cada cebador delantero y trasero específica a las especies, 1x HotStar Taq Master Mix, y agua libre I de ARNasa a un volumen final de 50 µ?. Las condiciones de ciclo fueron como sigue: 1 ciclo de 95°C durante 15 minutos; 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, la temperatura de hibridación variable (55-65°C) durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos; entonces 1 ciclo de 72°C durante 7 minutos, seguido por una retención a 4°C. Las reacciones que contienen los conjuntos de cebadores de E. adenoeides o E. meleagrimitis 2 utilizaron una temperatura de hibridación de 60°C. Las reacciones que contuvieron los conjuntos de cebadores de E. dispersa o £. gallopavonis utilizaron una temperatura de hibridación de 65°C, y r las reacciones que contuvieron el conjunto de cebadores de E. meleagrimitis 1 utilizaron una temperatura de hibridación de 55°C. Un molde de ADN de control positivo y un control negativo de agua (ningún molde) fueron incluidos para cada conjunto de cebadores, y los resultados son visualizados según lo descrito anteriormente.

Análisis de datos Criterios de validez y aceptabilidad de prueba: Los productos de PCR de la región ITS-1 fueron amplificados para todos los aislados. El número y secuencia de las regiones ITS-1 para cada aislado puro fueron agrupados en familias. Los aislados que contuvieron las múltiples especies fueron identificados basados en el análisis de PCR con los conjuntos de cebadores específicos para las especies.

Resultados El ADN fue extraído con éxito de todos los aislados de Eimeria de pavo de UGA. La amplificación por PCR de las regiones ITS-1 fue realizada en cada aislado de UGA, junto con los otros aislados de US (excepto E. dispersa), y los fragmentos resultantes fueron clonados en un plásmido comercial para facilitar la secuenciacion. La región ITS-1 del aislado interno de E. dispersa fue amplificada, pero no clonada o secuenciada, debido a que fue identificable usando los cebadores basados en la secuencia de E. dispersa-EU . Un solo clon para cada fragmento de ITS-1 clonado fue enviado a una compañía de secuenciacion comercial [SeqWright DNA Technology Services of Houston, Texas] para realizar la secuenciacion de extsension de cebador BigDye. Las cadenas sentido y anti-sentido fueron secuenciadas para cada fragmento, y la información sin procesar entonces fue analizada usando el software ADNSTAR. El análisis demostró las secuencias no ambiguas para todos los clones.

Tabla 2 Productos de PCR de ITS-1 de los aislados de pavo de UGA Productos de PCR de ITS-1 Aislado No. (544) Identificación (cebadores WW1/WW3r) -0648 E. dispersa 409bp -064C E. dispersa 409bp -065A E. meleagrimitis 1 405 bp -0658 E. gallopavonis 534 bp + 392 bp -065C E. gallopavonis 534 bp + 392 bp -066A E. adenoides 500 bp + 417 bp -066C E. adenoides 534 bp + 417 bp E. adenoides -0660 417 bp desconocida -066E E. adenoides 417 bp -067A E. meleagrimitis 1 502 bp -0678 £.. meleagrimitis 1 503 bp -067C E. meleagrimitis 1 405 bp -O670 E. meleagrimitis 1 405 bp E. meleagrimitis -Ó67E 405 bp 1/E. adenoides E. meleagrimitis 1 -067F 405 bp (puede no ser pura) -067G E. meleagrimitis 1 407 bp -068A E. meleagrimitis 1 501 bp i Tabla 3 Aislados de COCCIVAC-T Tabla 4 Aislantes de EU Tipo Productos de PCR de ITS-1 (cebadores WW1/WW3r) E. gallopavonis 535 bp + 392 bp E. meleagrimitis 2 >500 bp E. dispersa 410 bp Tabla 5 Cebadores de PCR Tamaño de Secuencias de par de cebadores producto Objetivo (5' -> 3') de PCR (bp) variable por especices, AAGTTGCGTAAATAGAGCCC -440-770 SEC ID NO: 1 Región ITS-1a bp pueden CAAGACATCCATTGCTGAAA producir SEC ID NO: 2 múltiples bandas CTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTG E.

SEC ID NO: 3 meleagrimitis 205 bp AGCCACCTGCGCAACACATTCT 1b SEC ID NO: 4 GCTTGTAGGTTTGCATTGGTTC SEC ID NO: 5 E. adenoeides 172 bp CTCGTTGTGAGAAAAGAAAAAAGAT SEC ID NO: 6 TCCGTTTGTTGATTGTTGTGG E. SEC ID NO: 7 282 bp gallopavonis TCCCCTATCAGCACCAACAAA SEC ID NO: 8 Tamaño de Secuencias de par de cebadores producto Objetivo (5' 3') de PCR (bp) CAGGAGCTGGTATTCATTCATTTCT SEC ID NO: 9 E. dispersa 179 bp AGGGCGCAACTTTCATTCTTT SEC ID NO: 10 E.

CTGGAAAGGTGCCTGTTTGT meleagrimitis SEC ID NO: 11 2 (basada en 225 bp AGCACAGTGAAGCAGCTGAA meleagrimitis SEC ID NO: 12 EU)C a Fuente de secuencia: Woods y colaboradores, Electrophoresis 21:3558-3563 (2000) b Fuente de secuencia: SPAH US para E. meleagrimitis 1, E. adenoeides, E. gallopavonis, y E. dispersa 0 Fuentes de secuencia: SPAH UK Una vez que la secuencia de cada fragmento de ITS-1 fue determinada, la alineación y análisis filogénico fueron realizados en estas secuencias, así como en las secuencias de los aislados europeos. Los resultados del análisis filogénico se muestran en la figura 4. El análisis de alineación de secuencia agrupó los veinticinco aislados en cinco "especies". Los moldes de E. adenoeides amplifican un solo producto de PCR de 419 pares de bases (bp) usando el conjunto de cebadores de ITS-1 de Woods. Los moldes de E. dispersa producen un solo producto de ITS-1 de 409 bp. Todos los moldes de E. gallopavonis producen dos productos, de 534 bp y 392 bp de tamaño. El ADN de los aislados caracterizado originalmente como E. meleagrimitis amplifica un solo producto con las cebadores de Woods, pero asombrosamente, los aislados son segregados en dos familias distintas. Los fragmentos de ITS-1 producidos de estas dos familias son de diferentes tamaños y solamente comparten 10.6% de homología. Una familia amplificó un producto de 405 bp, mientras que la segunda, designada como E. meleagrimitis 2, amplificó un producto de 500 bp. Las secuencias de los fragmentos de ITS-1 dentro de cada grupo comparten entre 96% a 100% de homología, pero entre los grupos comparten solamente 10.6% a 49.7% de homología.

Tabla 6 Fragmentos de Nombre Lote No.

ITS-1 -0648, -064C E. dispersa 409 bp Edi (Coccivac-T) Edi (UK) -066A, -066C E. adenoeides 417 bp -0660, -066E CAD (Coccivac-T) Fragmentos de Nombre Lote No.

ITS-1 -658, -65C E. gallopavonis 534 bp + 392 bp Egai (Coccivac-T) Ead (UK) -67C, -670 -67E, -67F E. meleagrimitis 1 405 bp -67G, -65A -64A, Eme (Coccivac-T) -067A, -678 E. meleagrimitis 2 500 bp -68A Eme (UK) Con algunas excepciones importantes, las agrupaciones basadas en secuencia de las cepas de referencia de UGA son iguales a las agrupaciones basadas en patología. Según lo entendido desde el comienzo, no todos los aislados estudiados fueron puros, y examinando la secuencia de un solo fragmento clonado por aislado, permaneció la posibilidad de que alguna cepa contuviera múltiples especies, y que un clon de un contaminante de Eimeria pudiera ser seleccionado dentro de una cepa caracterizada. Para determinar si éste pudo ser el caso donde un conflicto existió entre la información de secuencia y la caracterización basada en patología, un análisis de PCR fue realizado usando los cebadores específicos para las especies.

Finalmente, los cebadores de PCR que habían sido diseñados basados en la secuencia de E. meleagrimitis de EU fueron segregados, según lo descrito en la presente como E. meleagrimitis 2, así también estos cebadores fueron sintetizados y utilizados en un análisis de PCR (ver, la tabla 5).

El análisis de PCR con los cebadores específicos para las especies dio los siguientes resultados: El aislado de E. adenoeides de UGA 544-066A fue positivo con los cebadores E. adenoeides y E. meleagrimitis 2. El aislado de E. adenoeides de UGA 544-066C fue positivo con los cebadores de E. adenoeides y E. gallopavonis. El aislado de E. dispersa de UGA 544-064A fue positivo con los cebadores de E. dispersa y E. meleagrimitis 1. Tabla 7 Análisis de PCR usando los cebadores específicos para las especie para resolver los conflictos Resultados de PCR Cepa Determinación (positivos) Eimeria adenoeides Contaminada con Aislado de E. & Eimeria Eimeria adenoeides de UGA meleagrimitis 1-2 meleagrimitis 2 Eimeria adenoeides Aislado de E. Contaminada con & Eimeria adenoeides de UGA Eimeria gallopavonis gallopavonis Eimeria Contaminada con Aislado de E. meleagrimitis 1 & Eimeria dispersa de UGA Eimeria dispersa meleagrimitis 1 Conclusiones Los aislados de Eimeria de pavo fueron estudiados para aumentar la comprensión de las relaciones filogénicas entre la especie existente, y validar una prueba de identidad de especie basada en PCR para los aislados de pavo. Las muestras de referencia de todas las cepas conocidas de Eimeria de pavo de US fueron obtenidas de una colección en la University of Georgia, en Athens (UGA), y su ADN fue extraído. Este ADN entonces fue sometido a la amplificación por PCR usando el conjunto de cebadores de región de ITS-1 de Woods, y los fragmentos resultantes fueron clonados y secuenciados. El análisis filogenético de las secuencias entonces fue realizado, y los resultados fueron comparados con los aislados internos de Eimeria de pavo, más tres aislados europeos. De estos análisis, una quinta especie distinta fue identificada. Cuatro especies de pavo habían sido reconocidas previamente, basado en la patología de la lesión, pero el presente análisis de secuencia indica que una de las cuatro, E. meleagrimitis se debe subdividir adicionalmente en dos especies separadas, E. meleagrimitis 1 y E. meleagrimitis 2.

Apéndice Los cebadores de PCR adicionales también fueron creados basado en la secuencia de ITS-1 de los aislados de Eimeria de pavo de EU, y una secuencia de ITS-1 "desconocida" amplificada originalmente de Coccivac-T®. La identidad de estas cepas fue verificada en el experimento descrito anteriormente, cebadores adicionales probaron ser útiles para identifica cepas descritas más adelante.

Tabla 8 Cebadores de PCR adicionales EJEMPLO 3 SECUENCIA DE CONSENSO PARA LA REGION ITS-1 DEL GENE RIBOSOMICO 18 S DE E. MELE AGRIMITIS 2 EL ADN de ocho aislados de campo de Eimeria de pavo fue aislado y sus regiones ITS-1, ubicadas entre los genes ribosómicos 18S y 5.8S, fueron amplificadas por PCR y clonadas en un vector de E. coli. Hasta cinco clones de cada aislado (a-e), fueron seleccionados y secuenciados. Las secuencias de la región ITS-1 de cada clon entonces fueron comparadas con las secuencias de referencia de E. meleagrimitis 2 del aislado de EJ-E.me2 y de cuatro aislados de UGA-£.me2. Cada secuencia se extiende de la primera base después del gene de ARN ribosómico 18S al gene de ARN ribosómico 5.8S. Un árbol filogenético fue desarrollado. Las secuencias fueron analizadas para determinar la semejanza y una secuencia de consenso fue generada (SEC ID NO: 44, ver más adelante). La secuencia incluye las "N" donde hay sustituciones, inserciones o supresiones. El intervalo de tamaño para las secuencias de ITS-1 entre los ocho aislados es 394-398 bases. La secuencia de consenso, SEC ID NO: 44, comparte 87.2-88.5% de homología con los clones de Eme2 ITS1 secuenciados, con respecto a la homología de secuencia de las ocho secuencias entre sí que muestran 93.8-100% de homología.

DETERMINACIONES DE SECUENCIA Las SEC ID NO: 13-44 se refieren a las secuencias de nucleótido de las regiones ITS-1 respectivas y se denotan en mayúsculas. Las SEC ID NO: 51-81 se refiere a la secuencia de nucleótido completa presentada.

Las secuencias mostradas A CONTINUACION no incluyen todas las secuencias de 18S y 5.8S que componen el fragmento de PCR generado por los conjuntos de cebadores de Woods WW1/WW3r.

El texto en NEGRITAS es la región 18S (se subraya el cebador WW1) El texto en CURSIVA es la región 5.8S (se subraya el cebador WW3R) Aislados de E. gallooavonis de UGA 544-065B: Fragmento grande 5' 3" (534 bp) SEC ID NO: 51; [SEC ID NO: 13 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcqtaaatagagccctctaaaggatgcaaaaqtcqtaacacqqtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTAAAGCATGAAAGCAGGG AAAGATACTTTTTGATCTTATCCGTTTGTTGATTGTTGTGGGACAG TCAGCTTGCATGAGGGTTGGGTCACGAGTGTCTGCTGCTGTTCAG GCTTATCCGGGTGGGACAAAGATTAACAACAACCTGTAAATCTGT TTTTTTCTCACAACGAGTTTTCTTTTTTTTGCCGAAAAAGTCTTTTT GCTGCTTCACTGTGTAGTGCGGTGTGGGTGTGGCGGCAGGTGTT GTGATCTCCATAACTCCCCTCCCATGCATCATCATGACCAGTGTT GGGTACTGGTTTGTTGGTGCTGATAGGGGAACGTTATGTAGAGG A CCCATAGCCGTTACACAACGTTTCCGGCCTCAGTGTATTGCAGGG ACTTTATTCTGTATATACTAACAGAATGTATATATGAAGCCAAAaaa actttcagcaataaatatcttg 544-0658: Fragmento pequeño 5' ? 3' (392 bp) SEC ID NO: [SEC ID NO: 14 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aaqttqcgtaaatagagccctctaaaqgatgcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTATAAAGCATGAAAGCAGG AAGAGACATATTTCTTTTATTTGATCTCCTCCTATATCCTTCTTGAG AGATCTGCGTTTACGCGGCTTGATCAAGTTTGGTGGTGGTTGGTC AATAGAAGAGGTGTCTTTTTGACTGGTCTTTTCAGGCTTATTATGG GATAATATTCAACCGCAACCTGTAAATCTCTTTTTCCTCTCTCACA ACAACGAGTTTTCTGTAGATTGCAATTGATGCAAGTGTATTCTGTA CGCTAC AG AATATAAAGGTACAAAAAG AAAAAAaaaacfffcaqcaafqq atatcffp 544-065C: Fragmento grande 5' ? 3' (534 bp: 518 bp secuenciado) SEC ID NO: 53 [SEC ID NO: 15 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTAAAGCATGAAAGCAGGG AAAGATACTTTTTGATCTTATCCGTTTGTTGATTGTTGTGGGACAG TCAGCTTGCATGCGGGTTGGGTCACGAGTGTCTGCTGCTGTTCAG GCTTATCCGGGTGGGACAAAGATTAACAACAACCTGTAAATCTGT TTTTTTCTCACAACGAGTTTTCTTTTTTTTGCCGAAAAAGTCTTTTT GCTGCTTCACTGTGTAGTGCGGTGTGGGTGTGGCGGCAGGTGTT GTGATCTCCATAACTCCCCTCCCATGCATCATCATGACCAGTGTT GGGTACTGGTTTGTTGGTGCTGATAGGGGAACGTTATGTAGAGGA CCCATAGCCGTTACACAACGTTTCCGGCCTCAGTGTATTGCAGGG ACTTTATTCTGTATATACTAACAGAATGTATATATGAAGCCAAAaaa actttc 544-065C: Fragmento pequeño 5' ? 3' (392 bp) SEC ID NO: 54 [SEC ID NO: 16 es la región ITS- 1 , exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTATAAAGCATGAAAGCAGG AAGAGACATATTTCTTTTATTTGATCTCCTCCTATATCCTTCTTGAG AGATCTGCGTTTACGCGGCTTGATCAAGTTTGGTGGTGGTTGGTC AATAGAAGAGGTGTCTTTTTGACTGGTCTTTTCAGGCTTATTATGG GATAATATTCAACCGCAACCTGTAAATCTCTTTTTCCTCTCTCACA ACAACGAGTTTTCTGTAGATTGCAATTGATGCAAGTGTATTCTGTA CGCTACAGAATATAAAGGTGCAAAAAGAAAAAAaaaacfffcaqcaafaa atatctta 544-066C: Fragmento grande 5' -? 3' (532 bp) SEC ID NO: 55 [SEC ID NO: 17 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aatgcqtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttccgt aggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTAAAGCATGAAAGCAGGGAA AGATACTTTTTGATCTTATCCGTTTGTTGATTGTTGTGGGAC AGTC AGCTTGCATGCGGGTTGGGTCACGAATGTCTGCTGCTGTTCAGGC TTATCCGGGTGGGACAAAGATTAACAACAACCTGTAAATCTGTTTT TTTCTCACAACGAGTTTTCTTTTTTTTGCCGAAAAAGTCTTTTTGCT GCTTCACTGTGTAGTGCGGTGTGGGTGTGGCGGCAGGTGTTGTG ATCTCCATAACTCCCCTCCCATGCATCATCATGACCAGTGTTGGG TACTGGTTTGTTGGTGCTGATAGGGGAACGTTATGTAGAGGACCC ATAGCCGTTACACAACGTTTCCGGCCTCAGTGTATTGCAGGGACT TTATTCTGTATATACTAACAGAATGTATATATGAAGCCAAAaaaacfff caacaataaatcitctta Aislados de E. adenoeides de UGA 544-066A: Fragmento pequeño 5' ? 3' (417 bp) SEC ID NO. 56 [SEC ID NO: 18 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGAAGCATGAAGGCAGAG AAAGGATGCTTTTGATCAGATATATCTGCTTTGCTTGTAGGTTTGC ATTGGTTCTTGGTAACAAGTCGCCAAGCAGATTTGCATGCATGC A GTTTTGTGATCATTATTTATAGCGTCACTTTCTTTGACTGCTGTTTA TGCTTTTGTTATGGATTGGACACACATTACAAAATCTGTAAATCTTT TTTCTTTTCTCACAACGAGTTTTCTCTTTGAAATTTCTGG AAAG AAA GAATATAGATTGCTGGCTGTGTATGTACCAGCAGAATGTGTAGAA JGAAAAAGTTGAaaaactttcapcaataaatatcffQ 544-066C: Fragmento pequeño 5' -? 3' (417 bp) SEC ID NO: 57 [SEC ID NO: 19 es la región ITS- 1 , exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggat caaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGAAGCATGAAGGCAGAG AAAGGATGCTTTTGATCAGATATATCTGCTTTGCTTGTAGGTTTGC ATTGGTTCTTGGTAACAAGTCGCCAAGCAGATTTGCATGCATGCA GTTTTGTGATCATTATTTATAGCGTCACTTTCTTTGGCTGCTGTTTA TGCTTTTGTTATGGATTGGACACACATTACAAAATCTGTAAATCTTT TTTCTTTTCTCACAACGAGTTTTCTCTTTGAAATTTCTGG AAAG AAA GAATATAGATTGCTGGCTGTGTATGTACCAGCAGAATGTGTAGAA JGAAAAAGTTGAaaaactttcaqcaatQQatptcttQ 544-066D: 5' ? 3' (417 bp) SEC ID NO: 58 [SEC ID NO: 20 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcqtaaatagagccctctaaaggatqcaaaagtcqtaacacqqtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGAAGCATGAATGCAGAGA AAGGATGCTTTTGATCAGATATATCTGCTTTGCTTGTAGGTTTGCA TTGGTTCTTGGTAACAAGTCGCCAAGCAGATTTGCATGCATGC AG TTTAGTGATCATTATTTATAGCGTCTCTTTCTTTGACTGCTGTTTAT GCTTTTGTTATGGATTGGACACACATTACAAAATCTGTAAATCTTTT TTCTTTTCTCACAACGAGTTTTCTCTTTGAAATTTCTGGAAAGAAA GAATATAGATTGCTGGCTGTGTATGTACCAGCAGAATGTGTAGAA IGAAAAAGTTGAaaaactttcaqcaataaatqtcttq 544-066E: 5' ? 3' (416 bp) SEC ID NO: 59 [SEC ID NO: 21 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaqgatqcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGAAGCATGAATGCAGAGA AAGGATGCTTTTGATCAGATATATCTGCTTTGCTTGTAGGTTTGCA TTGGTTCTTGGTAACAAGTCGCCAAGCAGATTTGCATGCATGCAG TTTTGTGATCATTATTTATAGCGTCTCTTTCTTTGACTGCTGTTTAT GCTTTTGTTATGGGTTGGACACACATTACAAAATCTGTAAATCTTT TTTCTTTTCTCACAACGAGTTTTCTCTTTGAAATTTCTGGAAAGAAA GAATATAGATTGCTGGCTGTGTATGTACCAGCAGAATGTGTAGAA JGAAAAAGTTGAaaaactttcaqcaatqqatgtctt Aislados de E. dispersa de UGA 544-0648: 5'-73' (409 bp) SEC ID NO: 60 [SEC ID NO: 22 es la región ITS- 1 , exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacg tttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTCTGTCCAACAGGAGCTG GTATTCATTGATTTCTGTGTGAAATGGCATAGATGGGTGTTGCAAG CTTCCTGTCTTGGGCGGCTGAGTATTGAACCTTTTTATCCCTCCCA C AACCTTTG AATCGGTTTGTTGAGTTTTCTTTCCACG ACG AGTTTT CTTAATATTTAAAAGAATGAAAGTTGCGCCCTTGCTGGCCACTCAT TGAGAGCCGCATTTGTAACTGCTCTCGTGAGCAGTGGAAGCGGG GCTTTTTCAGTGAGTGGCTGCATGCGCGCATGCGTAATATTTATC AG CTCTT a aaactttcagca atoo atatcttg 544-064C: 5' ? 3' (409 bp) SEC ID NO: 61 [SEC ID NO: 23 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaataqaqccctctaaaggatqcaaaagtcgtaacacqqtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTCTGTCCAACAGGAGCTG GTATTCATTCATTTCTGTGTGAAATGGCACAGATGGGTGTTGCAAG CTTCCTGTCTTGGGCGGCTGAGTATTGAACCTTTTTATCCCTCCCA C AACCTTTG AATCGGTTTGTTGAGTTTTCTTTCCACG ACG AGTTTT CTTAAAATTTAAAAGAATGAAAGTTGCGCCCTTGCTGGTCACTCAT TGAGAGCCGCATTTGTAACTGCTCTCGAGAGCAGAGGAAGCGGG GCTTTTTAGGTGAGTGGCTGCATGCGCGCATGCGTAATATTTATC AGCTCTTaaaactttcagcaatggatgtcttg Aislados de E. meleagrimitis de UGA 544-067C: 5' ? 3' (405 bp) SEC ID NO: 62 [SEC ID NO: 24 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttqcqtaaataqaqccctctaaaqqatgcaaaagtcqtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAA AAGGAGCCTCTCTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAG TGGAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTC TTGTTGGCCGACTGGAATCCTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCCA ACCTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTT GAGAATAAAAGAGAATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTTGCTCGTTG AGAGTGGCTGGGCTGCATGCGCGCATGCGAAGAGAGAAAAAAGG ACCC aaaactttcagcaataaatgtctta 544-067D: 5' ? 3' (405 bp) SEC ID NO: 63 [SEC ID NO: 25 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttqcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAA AAGGAGCCTCTCTCTCCTCTGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAG TGGAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTC TTGTTGGCCGACTGGAATCCTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCCA ACCTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTT GAGAATAAAAGAGAATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTCGCTCGTTG AGAGTGGCTGGOCTGCATGCGCGCATGCGAAGAGAGAAAAAAGG ACCCaaaactttca'acaatQaatatcttp 544-067?: 5' ? 3' (404 bp) SEC ID NO: 64 [SEC ID NO: 26 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttccgta ggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAAAAG GAGCCTCTCTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAGTG GAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTCTT GTTGGCTGACTGGAATCCTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCC AAC CTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTTGA GAATAAAAGAGAATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTCGCTCGTTGAG AGTGGCTGGGCTGCATGCGCGCATGCGAAGCGAGAAAAAAGGAC CC a aaactttcaacaataa ata tctt 544-067F: 5'? 3' (405 bp) SEC ID NO: 65 [SEC ID NO: 27 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttqcgtaaatagaqccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacgqtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAA AAGGAGCCTCTCTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAG TGGAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTC TTGTTGGCCGACTGGAATCCTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCCA ACCTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTT GAGAATAAAAGAGAATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTCGCTCGTTG AGAGTGGCTGGGCTGCATACGCGCATGCGAAGCGAGAAAAAAGG ACCC aaaactttcaaca atoa ata tctta 544-067G: 5"? 3' (407 bp) SEC ID NO: 66 [SEC ID NO: 28 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtc taacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAA AAGGAGCCTCTCTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAG TGGAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTC TTGTTGGCCGACTGGAÁTCCTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCC A ACCTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTT GAGAATAAAAGAGATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTCGCTCGTTGA GAGTGGCTGGGCTGCATGCTGCGCGCATGCGAAGAGAGAAAAAA GG ACCC aaaactttcaqcaataciatqtctta 544-064A: 5'? 3' (405 bp) SEC ID NO: 67 [SEC ID NO: 29 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcqtaaatagaqccctctaaaggatgcaaaagtcqtaacacggtt.ee gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAA AAGGAGCCTCTCTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAG TGGAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTC TTGTTGGCCGACTGGAATCCTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCCA ACCTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTT GAGAATAAAAGAGAATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTCGCTCGTTG AGAGTGGCTGGGCTGCATGCGCGCATGCGAAGAG AGAAAAAAGG ACCCa aaactttcaacaataaatatctta 544-065A: 5'? 3' (405 bp) SEC ID NO: 68 [SEC ID NO: 30 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaataga ccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAA AAGGAGCCTCTCTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAG TGGAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTC TTGTTGGCCGACTGGAATCGTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCCA ACCTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTT GAGAAT.AAAAGAGAATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTCGCTCGTTG AGAGTGGCTGGGCTGCATGCGCGCATGCGAAGAG AGAAAAAAGG ACCC a a aactttcagca ata a at tctta Aislados de E. meleagrimitis 2 de UGA 544-066A: Fragmento grande 5' ? 3' (500 bp) SEC ID NO: 69 [SEC ID NO: 31 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGATGCATGCAGCAAGCT GGAAAGGTGCCTGTTTGTATGTGGGAAGTGCATTTATTATGCACA CCTGCATTCATGCGAGGTTACTGTCAATCCGGCGACTGCATGTAT GGCTTCTTGGACCGCAATAACAACCTGTAAATCTCTTTTCTTCTCC ACAACGGTTTTTCTTTTGTTTACGGTACTTTATTTGTGTACCAC AAC TATAAGTTGTTGGGGTTTTCAGCTGCTTCACTGTGCTACTGGATG A TAGGCTAGCTGCATTTGTTTTGCCGGTCGGGGTTGTTGTTCGGCA ¡ ; ? GGCACAGCATGGCAGCAGGGCTGTCGGCAGTGGCAGGTGTTTGC AGTTGTGTACCATTTAATTCTGCTAAAGAGCAGAATGATTTGTTTA CAAAAAAAaaaactttcaacaataoatatctta 544-067A: 5'? 3' {502 bp) SEC ID NO: 70 [SEC ID NO: 32 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaa tc taacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGATGCATGCAGCAAGCT GGAAAGGTGCCTGTTTGTATGTGGGAAGTGCATTTCTTATGCACA i - CCTG'CATGCATGTGAGGTTACTGTCAAGCCGGCGACTGCATGTAT GGCTTCTTGGACCGCAATAACAACAACCTGTAAATCTCTTTTCCTC TCCACAACGGTTTTTCTTTTGTTTACGGTACTTTATTTGTGTACCAC AACTATAAGTTCTTGGGGTTTTCAGCTGCTTCAGTGTGCTACTGGA TGATAGGCTAGCTGCATTTGTTTTGCCAGTCGGGGTTGCTGTTTG GCAGGCACAGCATGGCAGCAGGGGTGTTGGCAGTTGCAGTGTTT GCAGTTGTATACCATTTAATTCTGCTGAAGAGCAGAATGTTTTGTT T ACAAAAAA A a a aactttcapca ata a atg tcttq 544-0678: 5' ? 3" (503 bp) SEC ID NO: 71 [SEC ID NO: 33 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaataqagccctctaaagqatqcaaaaqtcqtaacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGATGCATGCAGCAAGCT GGAAAGGTGCCTGTTTGTATGTGGGAAGTGCATTTCTTATGC ACA CCTGCATGCATGTGAGGTTACTGTCAAGCCGGCGACTGCATGTAT GGCTTCTTGGACCGCAATAACAACAACCTGTAAATCTCTTTTCCTC TCCACAACGGTTTTTCTTTTGTTTACGGTACTTTATTTGTGTACCAC AACTATAAGTTCTTGGGGTTTTCAGCTGCTTCACTGTGCTACTGGA TGATAGGCTAGCTGCATTTGTTTTGCCAGTCGGGGTTGCTGTTTG GCAGGCACAGCATGGCAGCAGGGGTGTTGGCAGTTGCAGTGTTT GCAGTTGTATACCATTTAATTCTGCTGAAGAGCAGAATGTTTTGTT TAC AAAAAAAAaaaactttcagcaatQQatqtctta 544-068A: 5' ? 3' (501 bp) SEC ID NO: 72 [SEC ID NO: 34 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaataga ccctctaaaqqatgcaaaaqtcqtaacacqgtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGATGCATGCAGCAAGCT GGAAAGGTGCCTGTTTGTATGTGGGAAGTGCATTTCTTATGCACA CCTGCATGCATGTGGGGTTACTGTCAATCCGGCGACTGCATGTAT GGCTTCTTGGACCGCAATAACAACAACCTGTAAATCTCTTTTCTTC TCCACAACGGTTTTTCCTTTGTTTACGGTGCTTTATTTGTGTACCA CAACTATAAGTTGTTGGGGTTTTCAGCTGCTTCACTGTGCTACTGG ATGACCGGCTAGCTGCATTTATTTTGCCAGTCGGGGTTGCTGTTC GGCAGGCACAGCATGGCAGCAGGGCTGTCGGCAGTGGCAGGTGT TTGCAGTTGTATACCATTTAATTCTGCTGAAGAGCAGAATGTTTTG TTTAC AAAAAaaaactttcaQcaatggatQtctta Aislados de US-SPAH E. adenoe/des-SPAH-US (CAD) 5' ? 3' (417 bp) SEC ID NO: 75 [SEC ID NO: 37 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttqcgtaaatagaqccctctaaaggatgcaaaagtc taacacggtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGAAGCATGAAAGCAGAG AAAGGATGCTTTTGATCAGATATATCTGCTTTGCTTGTAGGTTTGC ATTGGTTCTTGGTAACAAGTCGCCAAGCAGATTTGCATGCATGCA GTTTTGTG ATC ATTATTTATAGCGTCTCTTTCTTTG ACTGCTGTTTA TGCTTTTGTTATGGATTGGACACACATTACAAAATCTGTAAATCTTT TTTCTTTTCTC ACAACGAGTTTTCTCTTTG AAATTTCTGG AAAG AAA GAATATAGATTGCTGGCTGTGTATGTACCAGCAGAATGTGTAGAA TGAAAAAGTTGÁAaaactttcagcaataaatgtcttg E. meleagrimitis í-SPAH-US (Eme) 5' ? 3' (403 bp) SEC ID *· · NO: 76 [SEC ID NO: 38 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtc taacac gtttcc gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACATTTTCGGTCGCGCGAACAA AAGGAGCCTCTCTCTCCTCCGTTCACTCCTTTCTGCTGCAATTCAG TGGAATGTGGGGTGTGCAGATGGTCGTGTGTGACGGCTTTTTGTC TTGTTGGCCGACTGGAATCCTTTTTGAACCTTTTTAATTCCTCCC A ACCTTTGAATCGGTTAAGAGTTTTCTTCCCACGACGAGTTTTCTTT GAGAATAAAAGAGAATGTGTTGCGCAGGTGGCTGCTCGCTCGTTG AGAGTGGCTGGGCTGCATGCGCGCATGCGAAGAGAGAAAAAAGG ACCC AaaactttcapcaatPQatptct E. gallopavonis-SPAH-US (Ega) Fragmento grande 5' ? 3' (538 bp) SEC ID NO: 77 [SEC ID NO: 39 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] taagttgcggtaaatagagccctctaaaggatgcaaaagtcgtaacacggttt ccgtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTAAAGCATGAAAGCAGG GAAAGATACTTTTTGATCTTATCCGTTTGTTGATTGTTGTGGG ACA GTCAGCTTGCATGCGGGTTGGGTCACGAGTGTCTGCTGCTGTTCA GGCTTATCCGGGTGGGACAAAGATTAACAACAACCTGTAAATCTG TTTTTTTCTCACAACG AGTTTTCTTTTTTTTGCCG AAAAAGTCTTTT TGCTGCTTCACTGTGTAGTGCGGTGTGGGTGTGGCGGCAGGTGT TGTGATCTCCATAACTCCCCTCCCATGCATCATCATGACCAGTGTT GGGTACTGGTTTGTTGGTGCTGATAGGGGAACGTTATGTAGAGGA CCCATAGCCGTTACACAACGTTTCCGGCCTCAGTGTATTGCAGGG ACTTTATTCTGTATATACTAACAGAATGTATATATGAAGCCAAAAaa actttcaqcaataaaatgtcttQa E. gallopavonis-SPAH- S (Ega): Fragmento pequeño 5' ? 3' (392 bp) SEC ID NO: 78 [SEC ID NO: 40 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] aagttgcgtaaatagagccctctaaag atgcaaaagtcgtaacac tttcc í : gtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTATAAAGCATGAAAGCAGG AAGAGACATATTTCTTTTATTTGATCTCCTCCTATATCCTTCTTGAG AGATCTGCGTTTACGCGGCTTGATCAAGTTTGGTGGTGGTTGGTC AATAGAAGAGGTGTCTTTTTGACTGGTCTTTTCAGGCTTATTATGG GATAATATTCAACCACAACCTGTAAATCTCTTTTTCCTCTCTCACAA CAACGAGTTTTCTGTAGATTGCAATTGATGCAAGTGTATTCTGTAC GCTACAGAATATAAAGGTACAAAAAGAAAAAAAaaaacmcaqcaa fgg atatctt Aislados de referencia de EU E .meleagrimitis 25' ? 3' (475 bp) SEC ID NO: 73 [SEC ID NO: 35 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] gcatgcagtcgtacacggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattcAC ACGTGATGCATGCAGCAAGCTGGAAAGGTGCCTGTTTGTATGTGG GAAGTGCATTTCTTATGCACACCTGCATTCATGCGAGGTTACTGTC AATCCGGCGACTGCATGTATGGCTTCTTGGACCGCAATAACAACA ACCTGTAAATCTCTTTTCCTCTCCACAACGGTTTTTCTTTTGTTTAC GGTACTTTATTTGTGTACCACAACTATAAGTTGTTGGGGTTTTCAG CTGCTTCACTGTGCTACTGGATGATAGGCTAGCTGCATTTGTTTTG CCGGTCGGGGTTGTTGTTCGGCAGGCACAGCATGGCAGCAGGGC TGTCGGCAGTGGCAGGTGTTTGCAGTTGTATACCATTTAATTCTG CTAAAAAGCAAAATGTTTTGTTTACAAAAAAAAAATTTTTCAACGGT GGTTTTGAGGAA E. gallopavonis- agmento grande 5' ? 3' (506 bp) SEC ID NO: 74 [SEC ID NO: 36 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] gtcgtcaagtcgtacacggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattcAC ACGTAAAGCATGAAAGCAGGGAAAGATACTTTTTGATCTTATCCGT TTGTTGATTGTTGTGGGACAGTCAGCTTGCATGCGGGTTGGGTCA CGAGTGTCTGCTGCTGTTCAGGCTTATCCGGGTGGGACAAAGATT AACAACAACCTGTAAATCTGTTTTTTTCTCACAACGAGTTTTCTTTT TTTTGCCGAAAAAGTCTTTTTGCTGCTTCACTGTGTAGTGCGGTGT GGGTGTGGCGGCAGGTGTTGTGATCTCCATAACTCCCCTCCCATG CATCATCATGACCAGTGTTGGGTACTGGTTTGTTGGTGCTGATAG GGGAACGTTATGTAGAGGACCCATAGCCGTTACACAACGTTTCCG GCCTCAGTGTATTGCAGGGACTTTATTCTGTATATACTAACAG AAT GTATATATGAAGCCAAAAaaactttcaacaataaatatcttaa E. gallopavonis- agmento pequeño 5' ? 3' (355 bp) SEC ID NO: 79 [SEC ID NO: 41 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] gtaatcagtcgtacacggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattcACA CGTATAAAGCATGAAAGCAGGAAGAGACATATTTCTTTTATTTGAT CTCCTCCTATATCCTTCTTGAGAGATCTGCGTTTACGCGGCTTGAT CAAGTTTGGTGGTGGTTGGTCAATAGAAGAGGTGTCTTTTTG ACT GGTCTTTTCAGGCTTATTATGGGATAATATTCAACCGCAACCTGTA AATCTCTTTTTCCTCTCTCACAACAACGAGTTTTCTGTAGATTGCA ATTGATGCAAGTGTATTCTGTACGCTACAGAATATAAAGGTACAAA A AGAAAA A Aaaaactttcagcaaaaaa E. dispersa 5' ? 3' (373 bp) SEC ID NO: 80 [SEC ID NO: 42 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] I tagatcagtcgtacacggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattcACA CATTCTGTCCAACAGGAGCTGGTATTCATTCATTTCTGTGTG AAAT GGCACAGATGGGTGTTGCAAGCTTCCTGTCTTGGGCGGCTGGGT ATTGAACCTTTTTATCCCTCCCACAACCTTTGAATCGGTTTGTTGA GTTTTCTTTCCACGACGAGTTTTCTTAAAATTTAAAAGAATG AAAGT TGCGCCCTTGCTGGTCACTCATTGAGAGCCGCATTTGTAACTGCT CTCGAGAGCAGTGGAAGCGGGGCTTTTTAAGTGAGTGGCTGCAT GCGCG CATGCGTAATATTTATCAGCTCTTAaaacf ffcaqcafqqaaa Aislados de UK-SPAH E. meleagrimitis 2-SPAH-UK 5' ? 3' (268 bp) SEC ID NO: 81 [SEC ID NO: 43 es la región ITS-1, exhibida en mayúsculas] cggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattcACACGTGATGCATGCA GCAAGCTGGAAAGGTGCCTGTTTGTATGTGGGAAGTGCATTTCTT ATGCACACCTGCATGCATGTGAGGTTACTGTCAATCCGGCGACTG CATGTATGGCTTCTTGGACCGCAATAACAACAACCTGTAAATCTCT TTTCCTCTCCACAACGGTTTTTCTTTTGTTTACGGTACTTTATTTGT GTACCACAACTATAAGTTGTTGGGGTTTTCAGCT Secuencia de consenso de E. meleagrimitis-2 Secuencia de consenso para E. meleaqrimitis 2 5' ? 3' (409 bp) SEC ID NO: 44 ACACGTGÁNGCATGCAN NNAGCTGGAAAN NTNGCCTGTTTG TATGTGGGAAGTGCATTTNTTATGCACACCTGCATNCATGNG NGG TTACTGTCAANCCGGCGANCTGCATGTATGGCTTCTTGGACCGC A ATAACAN NNACCTGTAAATCNCTTTTN NTCTCCACAACGGTTTTTC NTTTGTTTACGGTNCTTTATTTGTGTACCACAACTATAAGTTNTTG GGGTTTTCNGCTGCTTCACTGTGCTACTGGNTGAN N NN N NGGCTA GCTGCATTTNTTTTGCCNGTCGGGGTTGNTGTTNGGCAGGCNCAG CATGGCAGCAGGG NTGTNGGCAGTNGCAGN NGTTTGCAGTTG N N TACNATTTANTTCTGCTNAANAGCANNATGNTTTGTTTACAAAAAA AANNNN (5.8S final) Donde "N" puede ser cualquier nucleótido o no nucleótido Se debe entender que esta invención no está limitada a las configuraciones, etapas de proceso, y materiales particulares descritos en la presente aunque tales configuraciones, etapas de proceso, y materiales pueden variar parcialmente. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente es usada con el propósito de describir las modalidades particulares solamente y está pensada como una limitación, debido a que el alcance de la presente invención será limitado solamente por las reivindicaciones anexadas y equivalentes de las mismas.

Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna que comprende E. meleagrimitis 2 y E. meleagrimitis 1.

2. La vacuna de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una o más especies adicionales de Eimeria seleccionadas del grupo que consiste de E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua, y E. subrotunda .

3. La vacuna de la reivindicación 2, en donde la especie adicional de Eimeria es E. adenoeides.

4. La vacuna de la reivindicación 3, que adicionalmente comprende E. meleagridis.

5. La vacuna de la reivindicación 3, que adicionalmente comprende E. dispersa.

6. La vacuna de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un parásito del género coccidia seleccionado del grupo que consiste de Isospora, Cystoisospora , y Cryptosporidium .

7. La vacuna de la reivindicación 1, en donde E. meleagrimitis 2 es una cepa no atenuada.

8. La vacuna de la reivindicación 7, en donde E. meleagrimitis 1 es una cepa no atenuada.

9. La vacuna de la reivindicación 8, que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de cada una de E. meleagrimitis 2 y E. meleagrimitis 1.

10. La vacuna de la reivindicación 1, en donde £. meleagrimitis 2 es una cepa atenuada.

11. La vacuna de la reivindicación 10, en donde E. meleagrimitis 1 es una cepa atenuada.

12. La vacuna de la reivindicación 11, en donde la cantidad de oocistos es de aproximadamente 100 a aproximadamente 10,000 oocistos de cada una de E. meleagrimitis 2 y E. meleagrimitis 1.

13. La vacuna de la reivindicación 1, que comprende los merozoítos.

14. Una composición de vacuna que comprende una primera cepa de E. meleagrimitis 2 y una segunda cepa de E. meleagrimitis 2; en donde la primera cepa y la segunda cepa tienen un período pre-evidencia asincrónico.

15. La vacuna de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una o más especies adicionales de Eimeria seleccionadas del grupo que consiste de E. meleagrimitis 1, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis , E. innocua, y E. subrotunda .

16. Un método para inmunizar un pavo contra la coccidiosis que comprende administrar al animal una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna de la reivindicación 1.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la vacuna se administra en el agua potable del pavo.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la vacuna se administra en el alimento del pavo.

19. Un método para inmunizar un pavo contra la coccidiosis que comprende administrar al pavo una vacuna contra E. meleagrimitis 2 que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de E. meleagrimitis 2.

20. El método de la reivindicación 19, que adicionalmente comprende administrar al pavo una o más vacunas adicionales contra una especie de Eimeria distinta de E. meleagrimitis 2, en donde cada vacuna adicional comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de una o más especies de Eimeria seleccionadas del grupo que consiste de E. adenoeides , E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, y E. t subrotunda; en donde la administración de la vacuna contra E. meleagrimitis 2 y la administración de una o más vacunas adicionales contra una especie de Eimeria distinta de E. meleagrimitis 2 se pueden realizar en cualquier orden, incluyendo simultáneamente en una administración combinada.

21. Un método para identificar un aislado de Eimeria como E. meleagrimitis 2 que comprende comparar la secuencia de nucleótido de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria con la secuencia de nucleótido de la región ITS-1 dentro de la SEC ID NO: 44; en donde el aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria exhibe más de 87% de homología con la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 dentro de la SEC ID NO: 44.

22. Un método para identificar un aislado de Eimeria como E. meleagrimitis 2 que comprende comparar la secuencia de ácido nucleico de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria con la secuencia de ácido nucleico de la región ITS-1 dentro de una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, y SEC ID NO: 34; en donde el aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de ácido nucleico completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria exhibe más de 95% de homología con la secuencia de ácido nucleico completa de la región ITS-1 dentro de la secuencia de nucleótido.

23. Un método para identificar un aislado de Eimeria como i E. meleagrimitis 2 que comprende comparar la secuencia de ácido nucleico de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria con la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 de la SEC ID NO: 44; en donde el aislado de Eimeria se identifica como E. meleagrimitis 2 cuando la secuencia de nucleótido completa de la región ITS-1 del genoma del aislado de Eimeria exhibe 100% de identidad con la secuencia de nucleótido completa de la región í ¦ ITS-1 dentro de la SEC ID NO: 44.

24. Un par de cebadores de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar una región ITS-1 del genoma de una especie de Eimeria de pavo que comprende un primer y segundo cebador, en donde las secuencias de nucleótido del primer y segundo cebador respectivamente se seleccionan del grupo que consiste de SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 45 y SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47 y SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 49 y SEC ID NO: 50.

25. Un kit de amplificación por PCR que comprende dos o más pares de cebadores de PCR de la reivindicación 24.

26. El kit de la reivindicación 25, en donde para un par de cebadores de PCR las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador comprenden la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, y en donde para otro par de cebadores de PCR las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador comprenden la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.

27. El kit de la reivindicación 26, que adicionalmente comprende los pares de cebadores de PCR que comprenden las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, y SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10.

28. El kit de la reivindicación 26, que adicionalmente comprende los pares de cebadores de PCR que comprenden las secuencias de nucleótido respectivas del primer y segundo cebador de SEC ID NO: 45 y SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47 y SEC ID NO: 48, y SEC ID NO: 49 y SEC ID NO: 50.

29. Un kit de amplificación por PCR específico para E. meleagrimitis 2 que comprende un primer cebador y un segundo cebador, en donde la secuencia de nucleótido del primer cebador comprende la SEC ID NO: 11 y la secuencia de nucleótido del segundo cebador comprende la SEC ID NO: 12

30. Un método para identificar E. meleagrimitis 2 en una muestra biológica que comprende: (a) acceder a los ácidos nucleicos contenidos por una muestra biológica; (b) amplificar los ácidos nucleicos obtenidos por PCR en presencia de los cebadores del kit de amplificación por PCR de la reivindicación 27 bajo las condiciones que producirán un producto de PCR cuando los ácidos nucleicos de E. meleagrimitis 2 sean contenidos por la muestra biológica; y (c) supervisar el producto de PCR; en donde cuando el producto de PCR se detecta durante la supervisión, £. i ¦ · i meleagrimitis 2 se identifica como presente en la muestra biológica.

31. Un método para identificar el patógeno de Eimeria de pavo presente en una muestra biológica, que comprende: (a) acceder a los ácidos nucleicos contenidos por una muestra biológica; (b) amplificar los ácidos nucleicos obtenidos por PCR en presencia de los cebadores del kit de amplificación por PCR de la reivindicación 28 bajo las condiciones que producirán un producto de PCR cuando los ácidos nucleicos de Eimeria patogénica de pavo sean contenidos por la muestra biológica; y (c) supervisar el producto de PCR; en donde cuando el producto de PCR se detecta durante la supervisión, la Eimeria patogénica de pavo se identifica como presente en la muestra biológica.

32. Un método para identificar la especie de Eimeria patogénica de pavo presente en una muestra biológica, que comprende: i (a) acceder a los ácidos nucleicos contenidos por una muestra biológica; (b) amplificar los ácidos nucleicos obtenidos por PCR en presencia de los cebadores del kit de amplificación por PCR de la reivindicación 28 bajo las condiciones que producirán un producto de PCR cuando los ácidos nucleicos de Eimeria patogénica de pavo sean contenidos por la muestra biológica; (c) detectar el producto de PCR; y (d) determinar la especie de Eimeria patogénica de pavo asociada al producto de PCR detectado; en donde la determinación identifica la especie de Eimeria patogénica de pavo presente en la muestra biológica.

33. El método de la reivindicación 32, que adicionalmente comprende aislar uno o más aislados de Eimeria de pavo de la muestra biológica y determinar una o más propiedades de la Eimeria patogénica de pavo aislada, en donde las propiedades se seleccionan del grupo que consiste de su patología, patogenicidad , inmunidad cruzada, y morfometrías.