MX2010014078A

MX2010014078A - Composiciones y metodos para inmunogenecidad mejorada de somatostatina.

Info

Publication number: MX2010014078A
Application number: MX2010014078A
Authority: MX
Inventors: Andrew R Mendelsohn; Keith N Haffer; James Larrick
Original assignee: Braasch Biotech Llc
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2011-04-11
Also published as: AU2009262243A1; WO2009158395A1; AU2009262243B2; CN102119033B; JP2011526285A; BRPI0914300B1; CN102119033A; ZA201009127B; CA2728735A1; EP2291194B1; IL209829A0; IL209829A; US8425914B2; NZ590010A; BRPI0914300B8; US20130149332A1; CO6321162A2; BRPI0914300A2; KR101627879B1; EP2291194A1

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento de deficiencia del factor 1 de crecimiento tipo insulina y/o hormona de crecimiento en un paciente en necesidad de este tratamiento. Las composiciones y métodos incluyen nuevas vacunas que proporcionan inmunogenicidad para somatostatina y dan por resultado la liberación incrementada de hormona de crecimiento y/o factor 1 de crecimiento tipo insulina, endógenamente producidos.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA INMUNOGENICIDAD MEJORADA DE SOMATOSTATINA Campo de la Invención La presente invención se refiere a tratamientos de pacientes que tienen deficiencia de hormona de crecimiento (GH) y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) . De manera más particular, la invención se refiere a tratamientos, y las composiciones y métodos comprendidos en los tratamientos, para pacientes que tienen deficiencia de GH y/o IGF-1 a través del uso de vacunas de antígeno basado en somatostatina/adyuvante .

Antecedentes de la Invención La prevención de una enfermedad infecciosa usando vacunas ha estado en práctica desde finales de 1700 (vacuna de viruela de 1798) , incluyendo el uso de vacunas para la prevención de polio, hepatitis B, influenza. Más recientemente, también se han identificado vacunas para el uso en el tratamiento de cáncer, donde la vacuna persuade al sistema inmunitario del paciente en la identificación y destrucción de células tumorales objetivo, es decir, tratamiento de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de piel, etc. Se están desarrollando otros objetivos nuevos y útiles para el tratamiento con vacunas debido a la ventaja de usar el propio sistema inmunitario del paciente para vencer Ref. 216524 el agente invasor o canceroso. En la mayoría de los casos, una vacuna combina un antígeno contra el cual se busca la inmunidad y un adyuvante para mejorar la respuesta a ese antígeno por el receptor de la vacuna.

La hormona de crecimiento es una hormona de polipéptido de 191 aminoácidos sintetizada y liberada de la glándula pituitaria anterior. En general, se considera a la hormona de crecimiento una hormona anabólica, requerida para el crecimiento/altura en niños, para incrementar la retención de calcio (resistencia ósea), para la promoción de lipólisis, para el incremento en la síntesis de proteínas, para la promoción de gluconeogénesis en el hígado y otras funciones similares. Los pacientes quienes padecen de deficiencia de hormona endógena de crecimiento, tienen frecuentemente pobre densidad ósea, masa corporal, magra, disminuida, energía reducida, y otros síntomas generales similares.

Actualmente, los pacientes que padecen de deficiencia de hormona de crecimiento se tratan con reemplazo de hormona de crecimiento, usando típicamente una hormona de crecimiento, recombinante , expresada en bacterias genéticamente manejadas. Típicamente, estos protocolos de tratamiento son extremadamente costosos (los estimados varían desde $10,000 a $30,000 por año) y dependen del reemplazo exógeno de la hormona (las inyecciones diarias son típicas, que abarcan frecuentemente 18 meses a la duración de vida del paciente) . Como resultado, se requieren terapias novedosas, no exógenas, de acción prolongada y menos costosas para pacientes que padecen de deficiencia de hormona de crecimiento .

Además, también se necesitan terapias para tratar pacientes en necesidad de niveles adicionales por arriba de línea base, de hormona de crecimiento, por ejemplo, estos pacientes requieren frecuentemente hormona adicional de crecimiento para el tratamiento de obesidad, curación de heridas, curación de quemaduras, etc.

La presente invención se refiere a la superación de uno o más de los problemas analizados anteriormente.

Sumario de la Invención Las modalidades de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento y una deficiencia de hormona de crecimiento. Para el propósito de la invención, una deficiencia de hormona de crecimiento es cualquier disminución en los niveles de la hormona de crecimiento, asociados con un estado de enfermedad o falla de crecimiento debido a la carencia de niveles y/o secreciones adecuadas de hormona de crecimiento, endógena. La deficiencia de hormona de crecimiento también incluye situaciones donde existe un nivel endógeno normal (para ese paciente) de hormona de crecimiento, pero que se cree que es ventajosa hormona de crecimiento adicional para el tratamiento de una enfermedad o condición, por ejemplo, tratamiento de obesidad, tratamiento de heridas, y tratamiento de quemaduras.

Las modalidades de la presente invención también proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento de una deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina. Para los propósitos de la invención, una deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina es cualquier disminución en los niveles del factor 1 de crecimiento tipo insulina, asociados con un estado o condición de enfermedad debido a la carencia de niveles y/o secreciones adecuadas del factor 1 de crecimiento, tipo insulina, endógeno. La deficiencia del factor 1 de crecimiento tipo insulina también incluye situaciones donde existe un nivel endógeno normal de factor 1 de crecimiento tipo insulina, pero se cree que es ventajoso factor 1 de crecimiento tipo insulina, adicional, para el tratamiento de una enfermedad o condición, por ejemplo, falla de crecimiento, diabetes tipo 1 y 2, y reparación y/o reemplazo de cartílago.

En una modalidad, se proporcionan métodos para el tratamiento de una deficiencia de hormona de crecimiento en un paciente en necesidad del mismo. Los métodos incluye administrar una cantidad inmunogénica de una vacuna de antígeno basada en somatostatina de la invención a un paciente y monitorizar y progreso del paciente. Se pueden administrar vacunaciones adicionales para facilitar el tratamiento de la deficiencia de hormona de crecimiento del paciente. Los pacientes en necesidad de este tratamiento incluyen: adultos y niños que tienen: una carencia de hormona de crecimiento, endógena, que da por resultado crecimiento insuficiente, condiciones cardíacas congénitas u otras enfermedades cardíacas similares, obesidad, pacientes en necesidad de reparación mejorada de quemaduras y pacientes en necesidad de curación mejorada de heridas.

En otra modalidad, se proporcionan métodos para el tratamiento de una deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina en un paciente en necesidad del mismo. Los métodos incluyen administrar una cantidad inmunogénica de una vacuna de antígeno basada en somatostatina, de la invención, un paciente y monitorizar el progreso del paciente. Se pueden administrar vacunaciones adicionales para facilitar el tratamiento de la deficiencia del factor 1 de crecimiento tipo insulina del paciente. Los pacientes en necesidad de este tratamiento incluyen: infantes que tienen retinopatía de pre-madurez (ROP) , adultos, y/o niños que son obesos, adultos, y/o niños que tienen diabetes tipo 1 o 2, y adultos y/o niños que tienen síndrome de Rett, perros y/o gatos que son obesos, caballos que requieren reemplazo y/o reparación de cartílago, y otros tratamientos similares.

La presente invención también proporciona nuevos polipéptidos , y los polinucleótidos que codifican para los mismos, que tienen inmunogenicidad mejorada de somatostatina para el uso en el tratamiento de un paciente que tiene una deficiencia de hormona de crecimiento o de factor 1 de crecimiento tipo insulina. Los polipéptidos de la invención incluyen somatostatina- 14 fusionada a una proteína inactivada de cloranfenicol-acetil -transferasa mediante un ligador funcionalmente optimizado. Los polipéptidos de la invención son útiles en todas las especies vertebradas debido a la naturaleza altamente conservada de la somatostatina-14 , estable para almacenamiento a largo plazo, altamente inmunogenética, y resistente a la degradación en el paciente. Como tal, los polipéptidos quiméricos de la invención proporcionan materiales altamente efectivos y de bajo costo para el uso en el tratamiento de la deficiencia de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina, en todos los vertebrados .

También, la presente invención proporciona nuevos adyuvantes para el uso en el tratamiento de un paciente en necesidad de una respuesta inmunogénica, especialmente con relación a un paciente en necesidad de un tratamiento de ya sea una deficiencia de hormona de crecimiento o deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina. Los nuevos adyuvantes de la presente son altamente efectivos y seguros para el uso en vertebrados, incluyendo humanos, perros, caballos, gatos y similares. La presente invención también proporcionan nuevas vacunas para el uso en el tratamiento de un paciente que tiene ya sea una deficiencia de hormona de crecimiento o de factor de crecimiento tipo insulina. Las vacunas son altamente efectivas y seguras para el uso en vertebrados, incluyendo humanos, perro, caballos, gatos y ¦ similares .

Estas y otras características y ventajas diferentes de la invención serán evidentes a partir de una lectura de la siguiente descripción detallada y de una revisión de las reivindicaciones anexas.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una vista esquemática ilustrativa de un plásmido pET30b CatSom de acuerdo con las modalidades de la presente invención. El plásmido incluye un marcador de resistencia de a canamicina, un operador Lac, promotor T7, secuencia codificadora de CAT, todos de acuerdo con las modalidades de la invención, también se incluyen en una región ligadora de acuerdo con la invención de la presente y una región codificadora de somatostatina de acuerdo con la invención.

La Figura 2 es un SDS-PAGE teñido, ilustrativo que muestra una banda de 28 KD que corresponde al tamaño previsto de un polipéptido de somatostatina, defectuoso de CAT, optimizado por codón, de la invención. La senda 1 es LB + IPTG, reducido, la Senda 2 es LB, reducido, la Senda 3 es LB + IPTG y la Senda 4 es LB .

La Figura 3 es una gráfica de dispersión del por ciento en peso de línea base versus vacunaciones que contienen somatostatina en ratones cruzados.

La Figura 4 es una gráfica que muestra la ingestión de alimento por grupo de ratones durante un transcurso de 7 días .

La Figura 5 es una gráfica que muestra el peso corporal medio de los grupos de tratamiento de ratones durante el transcurso de 39 días, cada grupo aprobado se muestra con una barra de error.

La Figura 6 es una gráfica que muestra el por ciento de peso corporal de línea base de grupos de tratamiento de ratones durante el transcurso de 39 días, cada grupo de prueba se muestra con una barra de error.

Breve Descripción del Listado de Secuencias SEQ ID N0:1 AGCKNFFWKTFTSC SEQ ID NO: 15 GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT SEQ ID N0:2 (His 192->Gly, His 193->Gly) Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaac attttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatat tacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcac attcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagc tggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgtt ttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaa gatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgt ttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatat ggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtg ctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgta tgcttaatgaactgcagcag SEQ ID N0:3 (His 192->Gly, His 193->Gly) Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafih ilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysq dvacygenlayf 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ggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtg ctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaa tgcttaatgaactgcagcag SEQ ID NO: 7 (once H->G) Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafih ilarlmnahpefrmairLkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiy sqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgd kv1mp1aiqvhgavcdgfhvgrm1ne1qq SEQ ID N0:8 (H->A) Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafih ilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysq dvacygenlayf kgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkv lmplaiqvhaavcdgfhvgrmlnelqq SEQ ID N0:9 tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg SEQ ID NO:10 welhrsgprprprprpefm SEQ ID NO:ll welhrsg (rp) nefm donde ?>1 SEQ ID NO:12 Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaac attttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatat tacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcac 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fapvftmgkyytqgdkv lmplaiqvhhavcdgfhvgrmlnelqqwelhrsgprprprprpefmagcknffwktftsc Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento de deficiencia de hormona de crecimiento en pacientes en necesidad de este tratamiento. Para los propósitos de la presente, y como se describe anteriormente, una deficiencia de hormona de crecimiento es cualquier disminución en los niveles de hormona de crecimiento asociados con un estado o condición de enfermedad debido a la carencia de niveles y/o secreciones adecuadas de hormona de crecimiento, endógena, en el paciente. La deficiencia de hormona de crecimiento también incluye situaciones donde existe un nivel endógeno normal de hormona de crecimiento, es decir, normal para el paciente, pero se cree que es ventajosa la hormona de crecimiento adicional al paciente para el tratamiento de una condición o enfermedad objetivo, por ejemplo, el tratamiento de obesidad, tratamiento de heridas, tratamiento de quemaduras, etc.

La present;e invención también proporciona composiciones y métodos para tratar deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina en pacientes en necesidad de este tratamiento. Para propósitos de la presente, una deficiencia de factor) 1 de crecimiento tipo insulina es cualquier deficiencia ja los niveles de factor de crecimiento tipo insulina asociados con un estado de enfermedad debido a una carencia de secreciones adecuadas del factor 1 de crecimiento tipo insulina, endógeno. La deficiencia del factor 1 de crecimiento tipo insulina también incluye situaciones donde existe un nivel normal de factor de crecimiento tipo insulina, es decir, normal para el paciente, pero es ventajoso factor 1 adicional al paciente para el i tratamiento de una enfermedad o condición, por ejemplo, I obesidad, diabetes tipo 1 y 2, y síndrome de Rett .

En una modalidad,! se proporcionan nuevos polipéptidos , y i i los polinucleótidos que codifican para los mismos, incluyendo los polipéptidos de somatostatina-14 fusionados a una proteína inactivado de cloranfenicol -acetil -transíerasa mediante un ligadór funcionalmente optimizado. Los polipéptidos quimérijos de la invención proporcionan materiales altamente efectivos y de bajo costo para el uso en el tratamiento de la deficiencia de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina.

En otra modalidad, se proporcionan nuevas composiciones adyuvantes para el uso en el tratamiento de un paciente que tiene deficiencia de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina. En una modalidad particular, se puede combinar antígeno basado en somatostatina con nuevos adyuvantes y usar en el tratamiento de la deficiencia de hormona de crecimiento o de factor 1 de crecimiento tipo insulina, relacionada a estados o condiciones de enfermedad, por ejemplo, deficiencia de crecimiento en niños, deficiencia de crecimiento en adultos, carencia de secreciones adecuadas de hormona de crecimiento endógena, curación de quemaduras, obesidad, enfermedad cardíaca, etc. Los adyuvantes de la presente se diseñan para uso óptimo en vertebrados, y en particular humanos. Los adyuvantes de la presente proporcionados para inmunogenicidad mejorada con respecto a adyuvantes convencionales, permitiendo de este modo que las vacunas incluyan menores cantidades de antígeno. Las modalidades de adyuvante de la presente son útiles con otras combinaciones de antígeno más allá de aquellas útiles en el tratamiento de deficiencias de hormona de crecimiento y/o factor 1 de crecimiento tipo insulina. Las nuevas modalidades de adyuvantes independientes por lo tanto están dentro del alcance de la presente invención pero se describirán predominantemente los adyuvantes de la presente de acuerdo con el antígeno basado en somatostatina .

En aún otra modalidad, se proporcionan vacunas que dan por resultado inmunogenicidad contra somatostatina que da por resultado la disminución de somatostatina y la remoción de este modo de una proporción de la inhibición que ejerce la somatostatina en la liberación de la hormona de crecimiento y de este modo en la liberación del factor 1 de crecimiento tipo insulina. Las modalidades de vacuna de la presente se optimizan tanto para seguridad como para función, teniendo construcciones altamente inmunogénicas de somatostatina en composiciones de adyuvante seguras y altamente efectivas. Las composiciones de la presente invención requieren cantidades relativamente más pequeñas de antígeno (en comparación a las vacunas convencionales) tienen vida mejorada en almacenamiento y son de menor costo.

Aunque la presente invención se dirija al tratamiento de deficiencia de hormona de crecimiento y/o factor 1 de crecimiento tipo insulina en humanos, se contempla que el tratamiento de esta deficiencia en otros vertebrados esté dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, los perros y gatos que muestran signos de obesidad, y los caballos que necesitan reparación o reemplazo de cartílago se pueden tratar usando las composiciones y métodos descritos en la presente.

Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de ciertos términos frecuentemente usados en la presente y no se proponen para limitar el alcance de la presente descripción.

Definiciones : "Aminoácido" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos que se presenta de forma natural así como cualquier secuencia modificada de aminoácidos. Las modificaciones pueden incluir procesos naturales tal como procesamiento pos-transduccional , pueden incluir pero no se limitan a fosforilación, ubiquitinación, acetilación, glicosilación, unión covalente de flavina, ADP-ribosilación, reticulación, yodación, metilación y similares.

"Anticuerpo" se refiere a una molécula en forma de Y que tiene un par de sitios de unión a antígeno, una región de charnela y una región constante. Los fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno (Fab) , anticuerpos quiméricos, anticuerpos que tienen una región constante humana acoplada a una región de unión al antígeno murino, y fragmentos de los mismos, así como otros anticuerpos recombinantes bien conocidos incluyen en la definición de anticuerpo de acuerdo con la presente invención .

"Aislamiento" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se ha separado o recuperado de al menos un concomitante de su ambiente natural. En algunos casos, el polinucleótido o los polipéptidos se han separado o recuperado de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de los contaminantes de su ambiente natural. Ordinariamente, los polinucleótido o polinucleótidos aislado se preparan usando al menos un paso de purificación. A este respecto, la pureza o purificación, se refiere a un polipéptido objetivo libre de al menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 95 %, 96 %, 97 % 98 % o 99 % de los polipéptidos contaminantes. La purificación de un polipéptido de los polipéptidos contaminantes se puede lograr a través de cualquier número de técnicas bien conocidas, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, y cromatografía de lectina.

"Obesidad" se refiere a un sujeto que está al menos 20 % de más de un peso corporal ideal. Para un humano, por ejemplo, el peso corporal ideal se determina por la altura, edad, sexo y constitución del sujeto. La obesidad de la presente incluye los términos: levemente obeso (20-40 % de más del peso ideal) , moderadamente obeso (40-100 % de más del peso ideal) y severamente obeso (más del 100 % del peso ideal) .

"Paciente" se refiere a un vertebrado, típicamente un mamífero, en necesidad de las composiciones y/o métodos de la presente invención, por ejemplo, un humano en necesidad de pérdida de peso, obeso, por ejemplo) o caballo en necesidad de reparación de cartílago.

"Por ciento" de identidad de secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos describe el porcentaje de la secuencia de ácido nucleico o de residuos de aminoácido que son idénticos con un polipéptido o polinucleótido de referencia. En algunos casos, las secuencias se alinean y las separaciones se introducen para lograr identidad máxima de secuencia. En algunos casos, se emplea un programa de computadora para calcular el por ciento de identidad, por ejemplo, el programa Gap ( isconsin Sequence Analysis package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin) , que usa un algoritmo de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. , 2:482-489 (cada uno de los cuales se incorpora en la presente en su totalidad como referencia) o un programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 (ver WO 00/15796) .

"Polinucleótido" se refiere a una secuencia lineal de nucleótidos. Los nucleótidos son ya sea secuencia lineal de polirubonucleótidos o de polidesoxiribonucleótidos, o una mezcla de ambos. Los ejemplos de polinucleótidos en el contexto de la presente invención incluyen, ADN de hebra individual y doble, ARN de hebra individual y doble, y moléculas híbridas que tienen ambas mezclas de ADN y ARN de hebra individual y doble. Los polinucleótidos también incluyen uno o más nucleótidos modificados y ácidos nucleicos peptídicos (PNA) .

"Proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan de manera indistinta para denotar un polímero de aminoácido o un conjunto de dos o más polímeros de aminoácido interactuantes o unidos .

"Tratamiento" o "que trata" se refiere a la mejora de un sujeto con relación a un sujeto no tratado en una situación relativamente idéntica. El tratamiento o que trata indica en general que se ha logrado un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado usando las composiciones y métodos de la presente invención. El tratamiento o que trata pueden incluir tratamientos profilácticos.

"Vacuna" se refiere a cualquier composición que pueda estimular el sistema inmunitario del sujeto vacunado para producir anticuerpos para los propósitos descritos en la presente.

Hormona de Crecimiento La hormona de crecimiento es un péptido de 191 aminoácidos producido y liberado de células somatotropas en la pituitaria anterior. Los niveles de hormona de crecimiento en el cuerpo se regulan por la hormona de liberación de hormona de crecimiento (GHRH) y somatostatina . La GHRH da por resultado la síntesis y liberación de hormona de crecimiento (estrés, ejercicio, etc., también son estimuladores conocidos de la liberación de hormona de crecimiento) en tanto que la somatostatina inhibe la liberación de la hormona de crecimiento .

En general, la hormona de crecimiento (GH) está comprendida en una variedad de funciones fisiológicas en el cuerpo, que incluyen: incremento de la altura a todo lo largo de la niñez. Incremento de la masa muscular a través de hiperplasia de sarcomero, promoción de lipólisis, promoción de gluconeogénesis en el hígado, y la implicación en homeostasis de carbohidratos. Las deficiencias de hormona de crecimiento se manifiestan típicamente por sí mismas en varios estados fisiológicos conocidos o de enfermedad, que incluyen: estatura corta/falla de crecimiento si la deficiencia se produce durante la niñez, déficit de resistencia, pérdida de masa ósea, incremento en riesgos cardiovasculares, por ejemplo, falla cardíaca crónica (Tien et al., Growth Hormone : A Promising Treatment for the Failing Heart, 2000, Pharmacotherapy 20(9): 1096-1106, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) , y otros estados similares. Además, la hormona de crecimiento complementaria a un sujeto es potencialmente útil en el tratamiento de heridas, quemaduras, obesidad y similares. Vickers et al., 2002, Adult growth hormone treatment reduces hypertension and obesity induced by an adverse prenatal environment, J. Endocrinol, 175 (3 ): 615-623 ; Ramírez et al., 1998, Is there a role for growth hormone in the clinical management or burn injuries, Growth Hormone IGF Res. Suppl . B: 99-105; and Lal et al., 2000, Growth Hormone, burns and tissue healing, Growth Hormone IGF Res. 10 Suppl. B: 539-543, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia para todos los propósitos .

Las terapias convencionales para combatir la deficiencia de hormona de crecimiento incluyen complementación al individuo afligido con hormona de crecimiento, humana, recombinante (ver, por ejemplo, Patente de los Estados unidos Nos. 4,446,235 y 4,601,980). Las terapias de complementación de hormona de crecimiento requieren típicamente inyección subcutánea de hormona de crecimiento, recombinante, en una base continua, es decir, inyecciones diarias durante al menos 18 meses son típicas, aunque un número significativo de individuos requieren tratamiento durante toda la vida. Recientemente, se han usado terapias de complementación de hormona de crecimiento en el tratamiento de Esclerosis múltiple (MS) , tratamiento de fibromialgia, tratamiento de enfermedad de Crohn y/o colitis ulcerativa, tratamiento para invertir los efectos del envejecimiento, tratamiento de quemadura, y tratamiento para estatura corta idiopática. Sin embargo, el tratamiento con terapia de hormona de crecimiento, recombinante , se ha mostrado que incrementa de forma potencial el riesgo de diabetes, cáncer de colon, etc. Además, el tratamiento de un paciente con una proteína recombinante está típicamente carente en controles internos de retroalimentación que proporcionan un ambiente de monitoreo constante y cuidado del paciente, con riesgos incrementados asociados cuando el paciente tiene una malignidad activa. Adicionalmente , la hormona de crecimiento, recombinante, es extremadamente costosa de conseguir, y pueden ser prohibitivos los costos de usar durante el transcurso de uno o más años, como lo es el regimiento de administraciones diarias mediante inyección. Como tales, las modalidades de la presente invención proporcionan un beneficio inesperado y sustancial en el tratamiento de estas condiciones o enfermedades relacionadas a deficiencia de hormona de crecimiento.

Factor 1 de Crecimiento Tipo Insulina (IGF-1) El IGF-1 es una hormona de proteína de polipéptidos similar en estructura a la insulina. El IGF-1 se produce en el hígado y otros tejidos objetivo en respuesta a hormona de crecimiento y tiene en general efectos anabólicos en la liberación. Típicamente, el IGF-1 actúa a través de la ruta de señalización de AKT (AKT que representa una familia de proteína-cinasas específicas de serina/treonina). En general, los efectos anabólicos de IGF-1 incluyen crecimiento y/o multiplicación celular así como inhibición de apoptosis en sitios objetivo.

Están comprendidos varios factores en la influencia de los niveles de IGF-1 en la circulación de un paciente, que incluyen: nivel de hormona de crecimiento, constitución genética, tiempo del día, edad, género, estado de ejercicio, estrés, índice de masa corporal, y estado de enfermedad. La deficiencia de IGF-1 se puede caracterizar por retraso o falla de crecimiento y está asociada con varias condiciones, que incluyen: obesidad, diabetes tipo 1 y 2, enfermedad cardiovascular, varios trastornos de estrés y similares.

El IGF-1 recombinante se ha usado en el tratamiento de varios de estos males, con resultados mezclados. Actualmente, está disponible en los Estados Unidos IncrelexMR (un IGF-1 recombinante producido por Tercica) para el tratamiento de trastornos objetivo, aunque han variado los resultados clínicos.

Somatostatina La somatostatina es una hormona peptídica que inhibe, entre otras cosas, la liberación de la hormona de crecimiento de la pituitaria anterior. La somatostatina regula varas funciones endrocrinas mediante la interacción con receptores de somatostatina, acoplados a proteína G en células endocrinas objetivo. La somatostatina se segrega de sitios en el hipotálamo, estomago, intestino y páncreas. El control de los niveles de somatostatina en un animal objetivo se ha identificado más recientemente como un punto de interés para incrementar la productividad de animales de granja, es decir, el control de los niveles de somatostatina mejora la producción de leche de vacas lecheras o el tamaño de los animales de granja, etc., (ver solicitud co-pendiente No. de serie 12/198,579, titulada Chloramphenicol Acetyl Transferase (CAT) - Defective Somatostatin Fusión Protein And Uses Thereof, que se incorpora en la presente como referencia para todos los propósitos) .

En estos estudios, se optimizó la productividad de animales de granja a través del uso de protocolos de vacunación con antígenos de somatostatina. En general, los animales de granja inmunizados con somatostatina tienen una ganancia promedio de área en peso de 10-20 %, un apetito reducido por 9 % y un incremento de 11 % en la eficiencia de utilización de alimento. Los animales inmunizados con somatostatina, y también su descendencia tienen proporciones correctas, y la distribución del peso de los animales entre los músculos, huesos y grasa es la misma como en los animales de control (ver Reichlin, 1987) . Sin embargo, los tratamientos alternativos de somatostatina, por ejemplo, tratamiento directo de animales objetivo con anticuerpos anti-somatostatina, han probado ser excesivamente costosos un funcionalmente menos dramático, eliminando de este modo el tratamiento directo con anticuerpos como no práctico. Muromtsev G. S., et al., 1990, Basics of agricultural biotechnology, Agropromizdat , Moscú, pp 102-106. Estos estudios, por lo tanto, indican que la inducción de la inmunogenicidad de somatostatina en un animal objetivo puede lograr resultados seguros y efectivos .

El inventor de la presente ha logrado el sorprendente inesperado resultado que la modificación de estos protocolos de vacunación incluyendo métodos y composiciones de la presente) se puede usar en el tratamiento de estados fisiológicos o de enfermedad humana, y en particular, en el tratamiento de la deficiencia de hormona de crecimiento y/o IGF-1 de humano.

Las modalidades de la presente invención proporcionan tratamientos basados en somatostatina para deficiencia de hormona de crecimiento en vertebrados, y de manera más particular, en mamíferos. Las modalidades típicas se refieren a tratamientos en humanos, perros, gatos y caballos. Los humanos y otros mamíferos inmunizados con somatostatina se tratan con vacunas de la invención (ver más adelante) para limitar o inhibir los efectos que la somatostatina nativa tiene en la liberación de la hormona de crecimiento. Por ejemplo, donde se administrará hormona de crecimiento recombinante a un paciente deficiente en la hormona de crecimiento o en necesidad de hormona de crecimiento en exceso, para tratamiento de quemaduras, terapia cardíaca, diabetes, etc., las vacunas de la invención se proporcionarán para dar por resultado liberación adicional de hormona de crecimiento endógena. Los antígenos y adyuvantes de vacuna se optimizan para el uso en vertebrados y en particular el uso en humanos y el tratamiento de enfermedades. Puesto que la somatostatina está altamente conserva en los vertebrados, las modalidades de la presente invención son útiles en producir una respuesta inmunitaria en todos los vertebrados objetivos vacunados usando los métodos y composiciones de la presente. Un beneficio significativo de la presente invención es que los pacientes vacunados pueden ir semanas a meses entre efectos de esfuerzo, permitiendo que el sistema inmunitario del paciente limite o elimina la somatostatina del sistema.

Las modalidades de la presente invención también proporcionan tratamientos basados en somatostatina para la deficiencia de IGF-1 en vertebrados, y en particular en mamífero, por ejemplo, humanos, perros, gatos, caballos y similares. Los vertebrados inmunizados con las vacunas de la invención limitan o inhiben los efectos que la somatostatina tiene los niveles de IGF-1 en ese animal. Las modalidades de tratamiento se pueden usar para tratar cualquiera número de enfermedades y/o condiciones asociadas con deficiencia de IGF-1 o donde se requiera IGF-1 adicional para mejorar la salud o condición del animal tratado.

Como tales, los aspectos de la presente invención facilitan vacunas de inmunización basadas en somatostatina al proporcionar materiales altamente inmunogénicos para el uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades y/o otras condiciones. Estos compuestos de inmunización basados en somatostatina se han optimizado para la expresión y antigenicidad .

En algunas modalidades, la somatostatina- 14 se expresa como un polipéptido quimérico de somatostatina, deficiente de CAT, optimizado por codón. Estos materiales proporcionan un producto terapéutico inesperado para el uso en el tratamiento de enfermedades basadas en deficiencia de hormona de crecimiento y de IGF-1 así como donde serían útiles niveles adicionales de ya sea hormona de crecimiento o IGF-1 en un régimen de tratamiento. Como se describe más completamente más adelante, la presente invención también proporciona adyuvantes optimizados para aumentar al máximo los efectos de los polipéptidos quiméricos de somatostatina, deficientes de CAT, optimizados por codón. Los antígenos basados en somatostatina de la invención se diseñan para proporcionar moléculas de mayor tamaño (27,000+ Daltones vs . 1,600 para somatostatina nativa), inmunogenicidad de resistencia a degradación. De esta manera, un antígeno basado en somatostatina de la invención está presente más tiempo más de ½ de vida en el paciente) con mayor efecto (mayor inmunogenicidad) , en un paciente tratado. Estos nuevos antígenos para el uso en vertebrados proporcionan exposición óptima para que responda el sistema inmunitario de un paciente .

Nuevas Modalidades de Vacuna para el Uso en el Tratamiento de Deficiencia de Hormona de Crecimiento La somatostatina tiene dos formas activas que se producen por escisión alternativa de un polipéptido. Costoff A. Section 5, Chapter 4: Structure, Synthesis, and Secretion of Somatostatin . Endocrinology : The Endocrine Páncreas. Medical College of Georgia, página 16, incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Aunque se contempla que se puede usar cualquier forma de somatostatina en las modalidades de antígeno basadas en somatostatina de la presente, se describirá en detalle la somatostatina- 14. La somatostatina-14 es un tetradecapéptido biológicamente activo producido en le hipotálamo y tracto gastrointestinal (estomago, intestino, y páncreas) . La secuencia de aminoácidos del tetradecapéptido es AGCK FFWKTFTSC (SEQ ID NO: 1) . La secuencia de la somatostatina-14 está altamente conservada entre los I 29 vertebrados (Lin XW et al. Evolution of neuroendocrine peptide systems : gonadotropin-releasing hormone and somatostatin. Com . Biochem. Physiol. C. Pharmacol . Toxicol . Endocrinol. 1998 119 (3) : 375-88) . El tetradecapéptido se codifica por una secuencia de ácido nucleico: GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT (SEQ ID NO: 15) (se señala que se pueden usar otras secuencias de ácido nucleico para codificar para SEQ ID N0:1, sin embargo, se proporciona SEQ ID NO: 15 para propósitos ilustrativos) .

Se conoce que la somatostatina- 14 tiene fuerte efecto inhibidor en un gran número de hormonas comprendidas en el crecimiento y utilización de alimento en animales. Como se describe anteriormente en la patente de los Estados Unidos No. 6,316,004 y en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 12/198,579 (cada uno incorporado en la presente como referencia para todos los uso) , se puede usar somatostatina y versiones quiméricas de somatostatina en la inmunización de animales para incrementar el peso diario y donde es apropiado, la producción de leche. Estos procedimientos de inmunización se realizaron con adyuvantes convencionales. La inmunización con somatostatina- 14 no se ha usado en el tratamiento de ningún estado particular de deficiencia de hormona de crecimiento.

Un aspecto de la invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para proteínas quiméricas que tienen actividad inmunogénicas optimizada de somatostatina . En particular, las modalidades de la invención incluyen nuevas construcciones de ácido nucleico que codifican para proteínas de fusión de CAT que tienen actividad inmunogénica para somatostatina . Estos polipéptidos se han identificado para actividad funcional óptima en procedimientos de inmunización y se usan en el tratamiento de deficiencias de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina y en particular en el tratamiento de deficiencias de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de de crecimiento tipo insulina de mamíferos.

En una modalidad, se proporciona una construcción que tiene una vista esquemática como se muestra en la Figura 1 para codificar para los polipéptidos quiméricos de la invención. Las construcciones de ácido nucleico de la invención codifican en general para una enzima de CAT inactiva sin 10 aminoácidos C-terminales e incluye uno o dos aminoácidos reemplazados por histidina. La enzima de CAT se inactiva al remover el grupo de imidazol que His 193 (His 195 en la variante canónica de CATni) . En otra modalidad, la enzima de CAT inactiva al remover los grupos imidazol tanto de His 193 como se His 192 cercano (respectivamente His 195 y His 194 para CAin) . La remoción del grupo imidazol esencial de His 193 (His 195 en CATm) del sitio activo de CAT y el reemplazo con una alanina, glicina u otro aminoácido similar da por resultado la inactivación sustancial de la enzima de CAT (ver, por ejemplo, Lewendon A et al. (1994) Replacement of catalytic histidine- 195 of chloramphenicol acetyl transferase : evidence for a general base role for glutamate . Biochemistry. 33(7): 1944-50; White et al., (2000) Characterization of Chloramphenicol and Florfenicol Resistance in Escherichia coli associated with Bovine Diarrhea. J. Clin. Micro 38(12) p4593-4598. Cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente para todos los propósitos) . Finalmente, las modalidades de la presente también pueden incluir la inactivación de la enzima de CAT a través de la remoción del grupo imidiazol de solo His 192 (His 194 para CATm) . Con respecto a His 193, el reemplazo puede ser con una alanina, glicina u otro aminoácido similar.

En algunos aspectos, el uno o más aminoácidos reemplazados de histidina se codifican por ácidos nucleicos localizados en las posiciones números 574-576 y 577-579 de SEQ ID NO: 2 (que corresponde a los aminoácidos números 192 y 193 en SEQ ID NO : 3). En algunas modalidades, las secuencias de ácido nucleico de la invención incluyen SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Las proteínas quiméricas de la invención que incluyen las construcciones reemplazadas con histidina de la presente proporcionan proteínas altamente inmunogénicas con poca o ninguna actividad de CAT, una mejora significativa con respecto a la técnica existente. Las modalidades de la enzima de CAT inactivada se unen a un polipéptido de somatostatina de la invención. Esta unió se puede hacer directamente o con un ligador (como se describe más completamente más adelante) .

La inactivación de CAT, en los sitios hisl92 y hisl93, se puede lograr mediante cualquier número de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica incluyendo mutagénesis dirigida al sitio y montaje sintético de genes. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica para histidina 193 o histidina 192 se modifican para codificar para una alanina, glicina u otro aminoácido similar. En otra modalidad, las secuencias de ácido nucleico que codifican para tanto histidina 192 como 193 se modifican para codificar para alanina, glicina u otros aminoácidos similares. Los reemplazos típicos para el polipéptido quimérico de 192 y 193 incluyen: alanina, alanina, alanina, glicina, glicina, alanina, glicina, glicina.

Las modalidades de la presente invención también incluyen las secuencias de aminoácidos para polipéptidos deficientes de CAT de la invención, incluyendo la secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 7, 8 y 3 (que corresponde a his -> gly en 193, his->ala en 193, y his-> gly en tanto 192 y 193) .

El logro que la enzima de CAT se puede inactivar y usar como una proteína portadora para la presentación de somatostatina- 14 en el tratamiento de enfermedades y/o condiciones de la presente, especialmente en mamíferos, fue un hallazgo inesperado de los inventores. Se ha descrito la CAT no inactivada como la enzima responsable de resistencia bacteriana mediada por plásmido tanto para Cloranfenicol como para Florfenicol (análogo fluorado) en múltiples aislados bacterianos gram-negativos a nivel mundial. El uso de la CAT no inactivada, como se describe en US 6316004B1, precede estos descubrimientos científicos. Como tal, de acuerdo al entendimiento actual y a las normas establecidas, el uso de CAT no inactivada estaría contraindicado debido a cuestiones de seguridad (es decir, la creación de hospedadores más resistentes a antibióticos) . El cloranfenicol se descubrió hace aproximadamente 60 años y se usó principalmente como un antibiótico. Surgieron varias cuestiones de salud de este uso que incluyen receptores del fármaco que desarrollan anemia aplástica. Además, donde se continúa usando el análogo fluorado antibiótico, por ejemplo en la industria del ganado, un incremento en las varias cepas de bacterias que llegaron a ser resistentes a antibióticos, debido a genes codificados de plásmido. Aunque se continuó usando cloranfenicol en gotas para ojos para tratar conjuntivitis bacteriana, no se usa en los estados unidos para tratar otras enfermedades portadas por bacterias. Como tal, la realización y desarrollo del uso de una enzima de CAT inactivada de cualquier manera en el mamífero, y en particular el humano, es sorprendente, donde la utilización de los beneficios basados en la proteína portadora descritos a todo lo largo de esta especificación, en tanto que evitan las cuestiones significativas de salud de la CAT activa, proporcionan mejora significativa a las vacunas descritas en la presente.

Se señala que estas mejoras relacionadas al "portador" de la CAT para el uso con moléculas pequeñas se analizan en la solicitud co-pendiente y relacionada de patente de los Estados Unidos S/N PCT/US08/68195 así como en la Patente de los Estados Unidos No. 6,316,004 ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia para todos los propósitos. En particular, los inventores de la presente encontraron inesperadamente que una enzima de CAT inactiva como una proteína portadora para somatostatina-14 puede evitar los riesgos significativos de salud asociados con la enzima en tanto que utiliza la capacidad mejorada de las proteínas quiméricas para inmunogenicidad, resistencia a degradación enzimática, vida media incrementada y captación mejoradas por los macrofagos del paciente.

Como se muestra en la Figura 1, se puede enlazar la enzima de CAT no activa a somatostatina-14 mediante un ligador o se parador de longitud variable. Se requiere el separador para asegurar la presentación de la somatostatina codificada en una superficie global. Las modalidades de separador de la presente proporcionan resistencia óptima de proteasas y exposición óptima a epítopos y han mostrado mejora inesperada con respecto a construcciones que no tienen las secuencias ligadoras de la presente invención.

Por lo tanto, las modalidades de los separadores se han optimizado en longitud y composición para asegurar la expresión de somatostatina defectuosa de CAT en varios microorganismos, y en particular en E. Coli . Las construcciones originales como se describe en la Patente de los Estado Unidos No. 6,316,004, incluyeron un separador que tiene codones raros de E. Coli y requirieron la co-expresión de ARNt raros de un segundo plásmido o plásmido auxiliar. Las modalidades de separadores de la presente remueven estos codones raros de E. Coli y remueven de este modo la necesidad de un segundo plásmido auxiliar, una mejora con respecto a la tecnología previa.

En modalidades típicas, el separador tiene una secuencia de ácido nucleico de tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg (SEQ ID NO: 9) . Un ejemplo de un separador de la invención tiene una secuencia de aminoácidos de welhrsgprprprprpefm (SEQ ID NO: 10) . Una secuencia típica de aminoácidos para un separador de la invención es welhrsgp (rp) nefm donde n>l (SEQ ID NO: 11) . Como se señala anteriormente, estas nuevas secuencias se separadoras proporcionan resistencia mejorada a proteasas (permitiendo de este modo producción incrementada en comparación a las construcciones descritas en la patente de los Estados Unidos No. 6,316,004) y exposición óptima de somatostatina- 14. Esta combinación de agregados de somatostatina a una enzima de CAT inactivada por un ligador óptimamente configurado muestran mejora inesperada cuando se usa para inmunizar pacientes objetivo para el tratamiento de enfermedades. Estas construcciones se usan como antígenos en el tratamiento de enfermedades basadas en deficiencias de hormona de crecimiento y de factor 1 de crecimiento tipo insulina .

Adicionalmente, estas construcciones quiméricas muestran estabilidad mejorada en almacenamiento en comparación a somatostatina- 14 sola. Además, los antígenos basados en somatostatina de la presente invención proporcionan mayor vida media en el paciente dada la resistencia mejorada a la degradación en estos materiales. Se señala que otros polipéptidos portadores pueden reemplazar la CAT inactivada como unida a la somatostatina. Por ejemplo, se puede combinar somatostatina- 14 con KLH, toxoide de tétano o CRM en lugar de enzima inactivada de CAT.

En las modalidades de la invención también proporcionan nuevas composiciones adyuvantes para inducción mejorada de inmunidad humoral en un paciente objetivo. Estas composiciones adyuvantes proporcionan una mejora significativa con respecto a materiales convencionales para la inducción de una respuesta humoral y son seguros para el uso en objetivos humanos. Las composiciones adyuvantes de la presente se usan con antígenos basados en somatostatina para producir vacunas de la invención. Las vacunas de la invención entonces son útiles en el tratamiento de condiciones o enfermedades basadas en deficiencias de GH y/o IGF-1.

En las modalidades de la presente, todos los componentes de las composiciones adyuvantes son de origen no animal, eliminando de este modo potencial contaminación cruzada de humanos vacunados de componentes adyuvantes potencialmente contaminados. Por ejemplo, las modalidades de la presente pueden utilizar Tween 80 libres de origen animal. De forma sorprendente, el Tween 80 libre de origen animal muestra significativamente mejores resultados en el uso de vacunas de la presente en comparación a Tween 80 de origen animal, y elimina la posibilidad de contaminación basada en animal en la vacuna, por ejemplo, Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE) . Además, el Tween 80 libre de origen animal muestra mejor capacidad para emulsionar en comparación a Tween 80 de origen animal, que proporciona un beneficio inesperado adicional para su uso de acuerdo con las modalidades de la presente .

Las modalidades de adyuvantes de la presente también están libres de benceno y otros compuestos carcinogénicos similares. Estas modalidades proporcionan un beneficio de seguridad no disponible en la mayoría de los compuestos adyuvantes convencionales. Por ejemplo, las modalidades de la presente utilizan Carbopol 974P o ácido policíclico libre de benceno.

En una modalidad, el adyuvante inmunológico comprende una base de carbopol, una base de escualeno y una solución de arabinogalactano . En más detalle, la base de Carbopol se prepara usando Carbopol 974P en agua o solución salina. La base de escualeno se prepara a partir de una combinación de escualeno, Tween 80 no de origen animal y Span 85. En algunas modalidades, la base de escualeno es MF59 (Chiron Corp., Emeryville, CA) . El arabinogalactano se disuelve en PBS o solución salina. Las composiciones adyuvantes se combinan con polipéptidos quiméricos de la invención para producir las vacunas de la invención.

En aún otra modalidad, el adyuvante inmunológico comprende una base de Carbopol, una base de escualeno y una solución de tragacantina. En más detalle, la base de Carbopol se prepara usando Carbopol 974 P en agua o solución salina. La base de escualeno se prepara a partir de una combinación de escualeno, Tween 80 no de origen animal y Span 85. La tragacantina purificada se disuelve en PBS o solución salina. Las composiciones adyuvantes se combinan con polipéptidos quiméricos de la invención para producir las vacunas de la invención .

Las combinaciones adyuvantes específicas y las concentraciones se muestran en el Ejemplo 3. Los adyuvantes de acuerdo con la presente invención son seguros y efectivos para uso en humanos, evitan productos animales, evitan hidrocarburos basados en petróleo, y evitan compuestos carcinogénicos .

Vectores y Células Hospedadoras La presente invención también se refiere a vectores que comprenden las moléculas de polinucleótido de la invención, así como células hospedadoras transformadas con estos vectores . Se puede unir cualquiera de las moléculas de polinucleótido de la invención a un vector, que incluye en general un marcador seleccionable y un origen de replicación, para la propagación del hospedador de interés. Las células hospedadoras se manejan genéticamente para incluir estos vectores y expresan de este modo los polipéptidos de la invención. En general, los vectores incluyen en la presente moléculas de polinucleótidos de la invención operablemente enlazadas a secuencias reguladoras transcripcionales o transduccionales adecuadas, tal como aquellas para células hospedadoras microbianas o virales. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, o intensificadores, sitios de unión ribosomal de ARNm, y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos están operablemente enlazadas cuando las secuencias reguladoras de la presente se refieren de forma funcional a polipéptido quimérico que codifica para los polinucleótidos de la invención.

Los vehículos típicos incluyen plásmidos, vectores de transposición de levadura, baculovirus, adenovirus inactivados, y similares. En una modalidad el vehículo es un plásmido pET30b CatSom modificado (ver Figura 1) . Las células hospedadoras objetivo para el uso en la presente incluyen hospedador bacteriano, por ejemplo, E. Coli., levadura, células insectiles SF-9, células mamíferas, plantas verdes y similares .

En una modalidad, las secuencias reguladoras incluyen un promotor T71ac, CAT, Trp, o T5 para la expresión de los polipéptidos quiméricos de la invención en E. coli u otros microbios similares. Estas secuencias reguladoras se conocen en la técnica y se usan bajo condiciones apropiadas y conocidas .

Se han construido varios plásmidos de la invención para la expresión de polipéptidos quiméricos de la invención a través de la utilización de secuencias reguladoras objetivo. Los plásmidos ilustrativos pueden incluir un promotor T71ac (ver Figura 1) .

Las células hospedadoras para la expresión de los polipéptidos quiméricos objetivo incluyen procariotas, levadura y células eucarióticas superiores. Los hospedadores procarióticos ilustrativos incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus, y Salmonella así como de los géneros Pseudomonas y Streptomyces . En modalidades típicas, la célula hospedadora es del género Escherichia y puede ser Escherichia Coli (E. coli) . Las células hospedadoras (levadura o bacterias) también se pueden usar para producir polipéptidos para producir los polipéptidos objetivo de la invención como partículas tipo virus (VLP) .

Como se muestra en los ejemplos posteriores, las construcciones de la invención proporcionan expresión óptima de somatostatina deficiente de CAT bajo una variedad de condiciones. Estas construcciones son particularmente deficientes para la expresión en hospedadores procarióticos y en particular bacterias de los géneros Escherichia .

Proteína de Fusión Libre de Endotoxina para el Uso en Vacunas de la Invención Los aspectos de la presente invención incluyen el uso de somatostatina deficiente de CAT, optimizada por codón, libre de endotoxina. En una modalidad, las proteínas inmunogénicas , quiméricas que comprenden somatostatina, de la invención, se preparan al transformar células hospedadoras con vehículos apropiados que contienen somatostatina. Como se señala anteriormente, los vehículos para el uso en la presente incluyen sistemas conocidos de plásmidos y vectores adecuados para la expresión en células objetivo, seleccionadas .

En un aspecto de la invención, las proteínas inmunogénicas , quiméricas que comprenden somatostatina se expresan en células hospedadoras objetivo. La expresión de proteínas quiméricas se realiza usando secuencias reguladoras objetivo. En algunos aspectos, los polipéptidos quiméricos se han optimizado (especialmente con respecto a secuencias separadoras descritas en la presente) para la expresión en E. Coli .

Entonces se puede purificar la proteína quimérica de acuerdo con tecnologías conocidas de purificación de proteínas, incluyendo, por ejemplo, lisis con lisozima, centrifugación diferencial de cuerpos de inclusión, cromatografía de tamiz y similares. Se pueden llevar a cabo procedimientos de replegado en cloruro de guanidina y urea a pH alcalino seguido por diálisis y liofilización.

En una modalidad, se transforman células de E. coli usando el plásmido - pET30b CatSom; que contiene somatostatina, deficiente de CAT, optimizado por codón; el pET30b CatSom que tiene secuencias reguladoras base de E. Coli, apropiadas para la expresión. En algunos casos, la fermentación de aproximadamente diez litros de estas células proporciona al menos 500 gramos y en algunos casos 600 gramos de biomasa total , que producen aproximadamente 4 - 6 gramos de proteína total . Se estima de la tinción con azul de Coomassie y plata que aproximadamente la mitad de la proteína es la proteína quimérica objetivo (ver Ejemplo 2 y Figura 2) .

En algunas modalidades de la presente, la proteína quimérica de la invención se purifica de células hospedadoras transformadas en un estado sustancialmente libre de endotoxina. La purificación adicional removerá o disminuirá la endotoxina a niveles aceptables para usos humanos de acuerdo a las normas de la administración de Fármacos y Alimentos .

Como tales, algunas modalidades de la presente se refieren a la producción de proteínas quiméricas sustancialmente libres de endotoxina para el uso en vacunas. En ciertas modalidades, los niveles de endotoxina están en o por abajo de 1 EU/ml y en otras modalidades los niveles de endotoxina se eliminan de forma sustancial, es decir, los polipéptidos quiméricos de la invención están sustancialmente libres de endotoxina.

En una modalidad, el IB recuperado de células hospedadoras lisadas se lavó múltiples veces usando un amortiguador de lavado desprovisto de endotoxina. El sedimento de IP recuperado se puede lavar de manera opcional hasta que los niveles de endotoxina estén por abajo de aproximadamente 1 EU/ml (se pueden realizar pruebas de endotoxina usando uno o más ensayos conocidos, incluyendo equipos de prueba comercialmente disponibles de MP Biochemicals , Charles River, -etc.). En algunas modalidades, el amortiguador de lavado está libre de endotoxina e incluye uno o más inhibidores de proteína proteolítica, por ejemplo, fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) . En algunas modalidades, el amortiguador de lavado es solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que tiene una cantidad inhibitoria efectiva de PMSF y/o clorhidrato de fluoruro de Aminoetil -Bencenosulfonilo (AEBSF) .

En algunos aspectos, se pueden tratar los sedimentos sustancialmente libres de endotoxina con una solución de desplegado de proteína a pH 12.5 que contiene urea y replegar en una solución de replegado de proteína que contiene una molaridad reducida de urea con arginina, glicerol y/o sacarosa. La concentración de proteína quimérica purificada se modifica para estar entre 1 y 3 mg/ml y típicamente cerca de 1.4 a 1.8 mg/ml. En algunos casos, se proporciona proteína quimérica sustancialmente libre de endotoxina a formulaciones de vacuna a aproximadamente 1.5 a 5 mg/2 mi de dosis y más típicamente de 2.0 a 3.5 mg/2 mi de dosis. Otros procedimientos de remoción de endotoxina también se pueden utilizar, por ejemplo, columnas de remoción de endotoxina de intercambio iónico, comercialmente disponibles, columnas hidrófobas, etc.

Vacunas Las vacunas de la invención son combinaciones de adyuvantes inmunológicos como se describe en la presente y antígenos objetivo útiles en la prevención o tratamiento de un estado de enfermedad humana .

La dosis farmacéutica para la modalidad de vacuna incluye en la presente 1-5 mg de polipéptido quimérico. En todas las modalidades de la presente, la vacuna debe ser estéril, fluida y estable bajo condiciones de producción y almacenamiento. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante la adición de varios agentes antibacterianos y antifungoideos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , ácido sórbico, timerosal y similares.

Típicamente las vacunas de la presente incluyen un antígeno en una cantidad de proteína total de aproximadamente 1 mg/2 mi a 3 mg/2 mi de dosis, en donde aproximadamente 5 % a 25 % de la dosis es adyuvante y más típicamente de aproximadamente 10 % a 20 % de la dosis es adyuvante. En algunas modalidades, el adyuvante constituye aproximadamente 18 % de la dosis.

Para propósitos de ilustración, los adyuvantes de la invención se combinan con un polipéptido basado en somatostatina para proporcionar una composición útil en el tratamiento de condiciones y/o enfermedades basadas en deficiencias de hormona de crecimiento y/o factor 1 de crecimiento tipo insulina de humanos. Se señala que los adyuvantes descritos en la presente se pueden combinar con otros antígenos para producir nuevas vacunas útiles en el tratamiento de otras enfermedades humanas objetivo.

Método para Tratamiento de Enfermedad Humana La invención proporciona vacunas grado farmacéutico que contienen polipéptidos quiméricos y adyuvantes de la invención. Estas vacunas se pueden administrar a pacientes que tienen una deficiencia de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina para facilitar la liberación apropiada de fuentes endógenas en el paciente.

Las vacunas de la invención se proporcionan a pacientes que tienen una deficiencia de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina. En una modalidad, las vacunas de la invención proporcionadas 1 a 2 veces, con 3 a 5 refuerzos durante el transcurso de un tratamiento. Una cantidad típica de antígeno de vacuna es de 1 a 5 mg/ml de polipéptido quimérico. Se pueden administrar vacunas por técnicas conocidas. En una modalidad, la vacuna se administra mediante inyección subcutánea. En otra modalidad, la vacuna se administra por inyección intradérmica, inyección intramuscular o infusión.

Las modalidades de vacuna de la invención pueden incluir además agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión u otros materiales similares. Por ejemplo, las modalidades pueden incluir aceites estériles, momo- o di-glicéridos sintéticos, ácidos grasos o ácidos oleicos.

Típicamente, las vacunas se preparan como soluciones acuosas, estériles. Estas soluciones son estables bajo condiciones de producción y almacenamiento. En algunos aspectos, se pueden incluir agentes adicionales en la vacuna para impedir la acción de los microorganismos, por ejemplo, agentes antibacterianos o antifungoideos . - Las soluciones de vacuna de la invención se preparan al incorporar los materiales en las cantidades requeridas (antígeno, adyuvante, otros ingredientes) y se pueden seguir por esterilización terminal, por ejemplo, mediante tratamiento con ozono y luz UV. De manera alternativa, las soluciones de vacuna de la invención se pueden preparar usando componentes individualmente esterilizados antes del montaje final (caso en el cual no se requiere esterilización terminal) .

El progreso de tratamiento para pacientes que reciben las modalidades de vacuna de la invención se puede monitorizar y se proporcionan administraciones adicionales. El incremento en l°s niveles de la hormona de crecimiento, el incremento en los niveles del factor 1 de crecimiento tipo insulina, y los beneficios funcionales (por ejemplo, pérdida aceptable de peso en un paciente obeso) son todos objetivos para el monitoreo de la efectividad del tratamiento. Además, donde se está tratando diabetes tipo 1 o 2 u obesidad, se pueden monitorizar los niveles de glucosa sanguínea, niveles de IGF-1, perfiles de lípidos, niveles de insulina, niveles de Hemoglobina Unida a Ale (HbAlc) para determinar la efectividad del tratamiento en un paciente. En base al progreso de los pacientes individuales, se pueden realizar inyecciones adicionales de vacuna usando más o menos antígeno de acuerdo con la presente invención. Además se pueden usar combinaciones alternativas de adyuvantes para modificar la respuesta de un paciente particular a la vacunación como se determine por el profesional de cuidado de la salud.

Las modalidades de la presente se pueden combinar con otras terapias convencionales para la condición o estado de enfermedad objetivo de deficiencia de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina. Por ejemplo, las vacunaciones de la invención se pueden combinar con insulina de reemplazo en el tratamiento de diabetes tipo 1, o las vacunaciones se pueden combinar con cirugía de pérdida de peso o dietas de pocas calorías en un paciente que padece de obesidad severa .

Habiendo descrito en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan solo a manera de ilustración y no se proponen que sean limitantes.

Ejemplos Se proporcionan los siguientes ejemplos solo para propósitos ilustrativos y no se proponen para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Construcción de Proteína de Fusión de Somatostatina Defectuosa en CAT El presente ejemplo ilustra la producción de una proteína de fusión de somatostatina defectuosa en CAT, de acuerdo con las modalidades de la presente invención. Se realizó la mutagénesis dirigida al sitio en el plásmido pET30b-Cat-Som para reemplazar Hisl92 y Hisl93 con residuos de glicina (después de la modificación: Glyl92 y Glyl93). La inactivación de los residuos de His 193 (y de His 192) eliminan la capacidad de enzima de CAT para aceptar protones, proporcionando de este modo inactivación completa de la CAT.

El separador en el. mismo pET30b-Cat-Som (que tiene los reemplazos de His) se optimizó por codón para la expresión por E. coli en la ausencia de moléculas coexpresadas de ARNt .

La construcción modificada de ácido nucleico de somatostatina defectuosa en CAT se muestra como SEQ ID NO: 12. La secuencia de la proteína de fusión de somatostatina defectuosa en CAT se describe como SEQ ID NO: 13, que se compara a una proteína no modificada de fusión de somatostatina-CAT (SEQ ID NO: 14) .

Ejemplo 2: Proteína de Fusión de Somatostatina Defectuosa en CAT se Puede Expresar a Altos Niveles La construcción de somatostatina defectuosa en CAT, optimizada por codón, como se describe en el Ejemplo 1, se usó para expresar la proteína de fusión en células BL21(DE3) . Se cultivaron células transformadas en LB y se indujeron con IPTG 0.4 mM durante aproximadamente tres horas. Se sedimentó un mililitro de células de una densidad de cultivo de OD 0.7, y se calentó a 70°C durante diez minutos en 100 µ? de amortiguador de muestra de SDS. Una muestra de 40 µ? de extracto celular se cargó por senda para SDS PAGE.

Como se muestra en la Figura 2, una banda de 28 KD que corresponde al tamaño provisto de una proteína de fusión de somatostatina, defectuosa en CAT, optimizada por codón fue visible en las sendas 1 (LB + IPTG, reducido) y 3 (LB + IPTG) después de una inducción con IPTG. No se ve la expresión en las sendas 2 (LB, reducido) y 4 (LB) de control. Como se espera, no hubo diferencia en el tamaño de la proteína de fusión cuando se corrió bajo condiciones normales o reductoras .

Ejemplo 3: Vacuna que Contiene Somatostatina Deficiente en CAT, Optimizada por Codón, Libre de Endotoxina Una vacuna ilustrativa de acuerdo con la presente invención : Solución de reactivo: 1. Base de Carbopol a. Disolver 0.5 gramos de Carbopol 974P en agua o solución salina. b. Mezclar y hervir para disolver. Seguido por operación en autoclave. c. Almacenar a 4°C. 2. Base de escualeno a. Mezclar 58.1 mi de escualeno, 4.6 mi de Tween 80 no de origen animal y 5.2 mi de Span 85. b. La mezcla se filtró a través de un filtro de 0.2 µ· c. Almacenar a 4°C. 3. Solución de tragacantina a. Extraer goma de tragacanto con metanol . b. Recolectar la fracción insoluble en metanol. c. Secare a temperatura ambiente. d. Almacenar a temperatura ambiente en un estado de secado . e. Adicionar 1 gramo de Tragacantina seca en agua o solución salina. f. Mezclar y hervir para disolver, seguido por operación en autoclave. g. Almacenar a 4°C.

Preparación de Vacuna 1. Los antígenos de vacuna se preparan en solución salina o PBS a 5 mg/ml o menor. 2. Adicionar 6.79 mi de base de escualeno a botella de mezclado. 3. Adicionar 10 mi de base de Carbopol a base de escualeno (CS) . 4. Mezclar bien . •5. Adicionar 10 mi de solución de Tragacantina a solución de CS . 6. Mezclar bien. 7. Antígenos de vacuna, no diluidos o diluidos para usar en solución salina o PBS, se adicionan a un volumen final de 82 mi. 8. Se adicionan 1 mi de una solución de timerosal al 1 % y se mezcla bien. 9. Almacenar la vacuna a 4°C hasta el uso.

Vacuna ilustrativa, alternativa de acuerdo con la presente invención: Soluciones de Reactivo: 1. Base de Carbopol : a. Disolver 0.5 gramos de Carbopol 974P en agua o solución salina; a. Mezclar y hervir para disolver; y someter a autoclave, b. Almacenar a 4°C. 2. Base de Escualeno: a. Mezclar 58.1 mi de escualeno, 4.6 mi de Tween 80 no de origen animal y 5.2 mi de Span 85; y filtrar a través de filtro de 0.2 µ, b. Almacenar a 4°C. 3. Solución de arabinogalactano : a. Adicionar 1-10. gramos de arabinogalactano en PBS 0 solución salina; b. Mezclar y hervir para disolver; y someter a autoclave , c. Almacenar a 4°C.

Preparación de Vacuna: 1. Se preparan antígenos de vacuna en solución salina o PBS a 5mg/ml o menos; 2. Adicionar 6.79 mi de base de escualeno a botella de mezclado; 3. Adicionar 10 mi de base de Carbopol a la base de escualeno; 4. Mezclar completamente y adicionar 10 mi de solución arabinogalactano; 5. Los antígenos de la invención, no diluidos o diluidos, para usar en solución salina o PBS, se adicionan a un volumen final de 82 mi. 6. Se adiciona 1 mi de una solución de timerosal al 1 % y la vacuna se mezcla; y 7. La vacuna se almacena a 4°C hasta el uso.

Ejemplo 4: Tratamiento de Enfermedad Cardiovascular Usando la Vacuna del Ejemplo 3 El presente Ejemplo usa ratas con disfunción de ventrículo izquierdo como se prepara en el protocolo publicado en Genentech, 1995. Se segregaron dos grupos de ratas (cada miembro de cada grupo que tiene una arteria coronaria izquierda ligada) , un primer grupo de tratamiento recibe las vacunaciones de la invención y un segundo grupo de tratamiento (sin vacunación, pero tratadas de otro modo igual) . Cada miembro del grupo de tratamiento recibe una vacunación y luego de 21 días posteriores una segunda vacunación, administrada de manera intramuscular (1 ml/dosis) . Se miden los niveles en suero de IGF-1 y los anticuerpos anti-somatostatina en el día 0, día 21 y día 42. En el día 42, también se miden los parámetros hemodinámicos en ambos grupos así como una determinación del tamaño de infarto y el índice cardíaco.

Se anticipa que el grupo de ratas que recibe las dos vacunaciones, como se describe en el Ejemplo 3, tendrá función cardíaca sustancialmente mejorada (tamaño disminuido de infarto e índice cardíaco mejorado) en comparación al grupo de control .

Ejemplo 5: Tratamiento de Obesidad Usando la Vacuna del Ejemplo 3 Un modelo de obesidad en rata como se describe en Vickers et al (2001) se usará para determinar el efecto que las vacunas de la invención tienen en la obesidad. Las ratas se alimentan con una dieta hipercalórica durante 30 a 60 días . Las ratas hipercalóricas se pesarán y se separarán en tres grupos, un grupo de control con solución salina y un grupo de vacunación continuando con una dieta hipercalórica , y un grupo de dieta calórica normal. Las ratas que reciben la vacunación recibirán 2x lml de dosis de manera intramuscular en el día cero y en el día 21. Todas las ratas se pesarán semanalmente a todo lo largo del período de estudio. En el día 42, todas las ratas se pesarán y el suero se recolecta para análisis de IGF-1, análisis de urea y los niveles de anticuerpos anti-somatostatina .

Se esperan que las ratas que reciben la vacunación como se describe en el Ejemplo 3 tendrán control sustancialmente mejorado de peso con respecto a los grupos de control con solución salina y muestran resultados séricos correspondientes que correlacionan que el control de peso es debido la modificación de la hormona de crecimiento. El grupo vacunado mostrará sustancialmente el mismo control de peso como el grupo con ingestión calórica normal.

Ejemplo 6: Tratamiento de Deficiencia de Crecimiento Usando la Vacuna del Ejemplo 3 Ratas Cox (CD) de 3 semanas de edad se vacunarán mensualmente durante 3 meses usando una dosis de 1 mi. Cada vacunación se presentará de forma intramuscular o subcutáneamente. Las ratas de control recibirán inyecciones de solución salina, usando el mismo modo de administración y el mismo volumen de material para administración. Todas las ratas se pesarán para determinar el crecimiento en una base semanal y se sangrarán a la 0 , 4, 8, 12 y 16 semanas. Se recolectarán el suero en un programa y se analizará para los niveles de IGF-1, urea y anticuerpos-somatostatina .

Se espera que las ratas CD que reciben las vacunaciones como se describe en el ejemplo 3 tendrán crecimiento sustancialmente mejorado en comparación a las ratas CD de control . Las ratas tratadas deben mostrar resultados séricos que confirmen los efectos de las vacunaciones en las ratas tratadas .

Ejemplo 7: Somatostatina Incrementada Conduce a Ganancia de Peso en Ratones Se realizaron estudios de obesidad en ratones para ver si la somatostatina administrada de manera exógena provoca ganancia de peso en ratones. Se realizó un estudio de siete días en ratones cruzados donde se combinaron tres diferentes adyuvantes inventivos con somatostatina recombinante (los adyuvantes se refieren como JH14 , JH17 y JH18) . Cada adyuvante se añadió con 1 mg/ml de somatostatina recombinantemente producida (producida en 2009) y un adyuvante (JH14) también se añadió con somatostatina producida en el 2007 a una concentración de 2.57 mg/ml. Un grupo de control de ratones recibió una inyección de solución salina estéril.

Cada ratón se pesó al inicio del estudio para determinar un peso de línea base. Las vacunaciones en cada ratón se realizaron en el día 0 por inyección IP de 0.5 mi de vacuna. Se administró somatostatina en los adyuvantes JH17 y 18 a ratones hembra y JH14 a ratones macho. Los ratones se alimentaron con una dieta normal durante el transcurso de los 7 días con cada ratón que volvió a pesar en el día 7.

Como se muestra en la Figura 3, los ratones cruzados que reciben somatostatina permanecieron saludables y mostraron pocos efectos adversos del estudio de una semana. Los ratones hembra en el grupo de JH17 tienen un incremento en el peso, en tanto que los ratones hembra JH 18 estuvieron similares en la ganancia de peso a los ratones de control. Los ratones macho en los dos grupos de JH14 (2007 y 2009) mostraron ambos ganancia de peso con respecto a los ratones macho del grupo de control. En conjunto, los hallazgos en la Figura 3 ilustran que los adyuvantes JH14, JH17 y JH18 son seguros para el uso en ratones, altamente consistentes y capaces de almacenamiento, y que la somatostatina exógenamente administradas da por resultado en general incremento de peso en un ratón objetivo, proporcionando evidencia que la somatostatina está comprendida en la ganancia de peso. Todos los efectos se presentaron dentro de varios días de inmunización IP. Esto es debido a procesamiento directo de macrófagos y linfocitos B de presentación al antígeno a una velocidad acelerada, debido a la ruta de administración, la naturaleza de los polipéptidos quiméricos y el efecto adyuvante.

Las premezclas JH14 , 17 y 18 son como se describen en esta solicitud y la solicitud de los US S/N PCT/US08/68195 , titulada Chloramphenicol Acetyl Transferase (CAT) -Defective Somatostatin Fusión Protein and Uses Thereof . La formulación final tiene 1 mg de antígeno de proteína por 1 mi de dosis. Para este trabajo, lo siguiente fueron las formulaciones: JH17 Proteína replegada 12 mi (5.86 mg/ml) PBS de Dulbecco 24.5 mi Premezcla JH17 13.4 mi Timerosal al 1 %, 0.5 mi Formaldehído al 37 I, 0.1 mi JH18 Proteína replegada 12 mi (5.86 mg/ml) PBS de Dulbecco 24.5 mi Premezcla JH18 13.4 mi Timerosal al 1 o. 0.5 mi Formaldehído al 37 g. 0.1 mi JH14 Proteína replegada 12 mi (5.86 mg/ml) PBS de Dulbecco 27.8 mi Premezcla JH14, 10 mi Timerosal al 1 % 0.5 mi, Formaldehído al 37 % 0.1 mi Se señala que las formulaciones anteriores incluyen timerosal y formaldehído para limitar la contaminación de las vacunas . Estos materiales solo se usan donde estén en uso botellas de re-entradas de múltiples dosis para dispensar la vacuna. Típicamente los protocolos de tratamiento humano y animal se envasarán en frasco de uso único, eliminando de este modo la necesidad de estos conservadores. También se señala que se usó un mayor nivel de antígeno en el lote JH14 de 2007 para producir degradación de proteína.

Ejemplo 8: Tratamiento de Obesidad en Ratones Se realizaron estudios de obesidad en ratones usando ratones de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Se obtuvieron varios ratones cruzados de la línea C57BL/6J de Jackson Laboratories, los ratones fueron: machos, mostraron obesidad severa inducida, tuvieron genética poligénica, y exhibieron obesidad de comienzo maduro. En la prueba previa Jackson Laboratories ha determinado que esta raza particular de ratones, cuando se alimenta con una dieta de alto contenido de grasa, desarrolla fenotipos de síndrome metabólico de naturaleza muy similar a aquella reportada en la población humana. Por ejemplo, los ratone C57BL/6J alimentados con una dieta de alto contenido de grasa mostrarán adiposidad visceral, resistencia a insulina, hiperinsulinemia, hiperleptinemia, resistencia a leptina hipertensión.

Se llevaron a cabo estudios para probar la efectividad de las modalidades de vacuna de la presente para tratar obesidad, es decir, incluyen limitación de ganancia de peso en alguno ratones para provocar pérdida de peso en ratones C57BL/6J. Se alimentaron ratones de seis semanas de edad con una diete de 60 % de kcal de grasa durante 6 semanas . Entonces los ratones de doce semanas de edad se dividieron en uno de cuatro grupos: el grupo 1 incluyó ratones tratados con vacuna que contiene JH14; el grupo 2 incluyó ratones tratados con la vacuna que contiene JH17 el grupo 3 incluyó ratones tratados con la vacuna que contiene JH18, y el grupo 4 incluyó ratones de control que se trataron con PBS en lugar de cualquier tipo de antígeno tipo anti-somatostatina . Los ratones en cada grupo se vacunaron usando 0.5 mi de la vacuna especificada o PBS mediante una ruta IP. Después de veitidos días, los ratones se trataron nuevamente con una segunda dosis IP usando 0.1 mi de vacuna.

A todo lo largo del transcurso del estudio (6 semanas) cada ratón se pesó dos veces por semana y se monitorizó la ingestión de alimento es decir, para asegurar que los cambios de peso no fueran debido a pérdida o incremento en la ingestión de alimento (ver Figura 4 muestra ingestión acumulativa de alimento dentro de cada uno de los 4 grupos) . Se realizó un sangrado terminal en cara ratón en la conclusión del estudio y se determinaron los niveles de IGF-1 (se terminaron los niveles en plasma de IGF-1 usando Diagnostic Systems Laboratories Inc. Active Mouse/Rat IGF-1 ELISA (DSL-10-29200) .

Como se muestra en las Figuras 5 y 6 y Tabla 1, los ratones tratado con JH14 , 17 y 18 mostraron todos una diferencia altamente significativa (p<0.0001) por análisis estadístico paramétrico y no paramétrico) en el por ciento de peso corporal final versus peso de línea base. Se observó pérdida significativa de peso en cada grupo vacunado en el período de los primeros siete días en tanto que el grupo de control mostró ligera ganancia de peso durante el mismo período de control . Una pequeña pérdida de peso también se observó después de la segunda dosis de vacuna (i/5eciraa dosis proporcionada en el día 1) se administró a los grupos JH14 , JH17 y JH18 en el día 22.

Los datos del estudio de obesidad en ratones proporcionaron las siguientes conclusiones: (1) aunque no hay una diferencia estadísticamente significativa entre JH18 y los controles en términos de IGF-1 ng/ml, hay una diferencia altamente significativa entre estos grupos (P<0.0001) por análisis estadístico paramétrico o no paramétrico en el porciento de peso corporal final versus peso de línea base; (2) en el porciento de Peso Corporal Final versus Peso de Línea Base, JH17 versus los controles produjo una diferencia estadísticamente significativa por ambas pruebas estadísticas; (3) JH18 (que tiene un nivel medio de IGF-1 de 135.8 ng/ml más que JH17) , demostró una diferencia estadísticamente significativa versus JH17 en el porciento de peso de línea base (solo por la prueba no paramétrica; (4) el antígeno de somatostatina quimérica de la invención en los adyuvantes tanto JH17 como JH18 indujo una diferencia estadísticamente significativa en el porciento de Peso Corporal Final versus Peso de Línea Base; (5) JH18 fue estadísticamente significativa en comparación con JH17 por análisis no paramétrico en términos del porciento de Peso Corporal Final versus Peso de Línea Base; (6) se pueden correlacionar los niveles de IGF-1 con una mayor pérdida de peso al final del estudio versus ambos controles y vacunas de JH17 (ver Tabla 2) ; (7) puesto que todas las vacunas tienen la misma cantidad de dosis del antígeno de somatostatina quimérica de la invención, se observó un efecto adyuvante dentro del estudio; (8) ratones macho C57BL/6J cruzados alimentados con dieta de 60 % de kcal de grasa demostraron una pérdida significativa de peso dentro de la primera semana después de la vacunación IP; y (9) la pérdida de peso mostrada en la presente persistió aún en tanto que los ratones están a una dieta con 60 % de kcal de grasa durante la duración del estudio.

Tabla 1: Peso Corporal Final versus peso de línea Base Tabla 2: Análisis estadístico de IGF-1 Se entiende para los propósitos de esta descripción que se pueden varios cambios y modificaciones a la invención que estarán dentro del alcance de la invención. Se pueden hace numerosos cambios diferentes que se sugerirán fácilmente por sí mismos a los expertos en la se abarcan en el espíritu de la invención descrita en la presente como se define en las reivindicaciones anexas. La especificación contiene numerosas citas a patentes y publicaciones. Cada una se incorpora de esta modo como referencia para todos los propósitos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Método para tratar una deficiencia de hormona de crecimiento en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: administrar una cantidad inmunogénica de una vacuna al paciente, la vacuna que comprende un antígeno basado en somatostatina y una adyuvante, en donde la vacuna administrada da por resultado un incremento de los niveles de hormona de crecimiento en el paciente que tiene la deficiencia de hormona de crecimiento.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la vacuna comprende un polipéptido quimérico de somatostatina- 14 funcionalmente unido a una enzima de CAT sustancialmente inactivada.

3. Método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el adyuvante comprende una cantidad efectiva de Carbopol 974P.

4. Método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el adyuvante comprende además escualeno y Tween 80 no de origen animal.

5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es un adulto que tiene deficiencia de crecimiento.

6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es un niño que tiene deficiencia de crecimiento.

7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente que se trata para una deficiencia de hormona de crecimiento tiene una enfermedad mucosa .

8. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente que se trata para una deficiencia de hormona de crecimiento tiene una enfermedad cardíaca .

9. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente que se trata para una deficiencia de hormona de crecimiento está obeso.

10. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es un perro obeso.

11. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es un gato obeso.

12. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es un caballo en necesidad de reparación de cartílago.

13. Método para tratar una deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina en un paciente, el método caracterizado porque comprende administrar una cantidad inmunogénica de una vacuna al paciente, la vacuna que comprende o un antígeno basado en somatostatina y un adyuvante, en donde la vacuna administradas da por resultado en un incremento en los niveles del factor- 1 de crecimiento tipo insulina en el paciente que tiene la deficiencia del factor 1 de crecimiento tipo insulina.

14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente que se trata para la deficiencia del factor 1 de crecimiento tipo insulina tiene diabetes tipo 1 o tipo 2.

15. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente que se trata para la deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina tiene un trastorno de estrés .

16. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente que se trata para la deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina tiene enfermedad cardíaca.

17. Adyuvante para el uso en una vacuna para tratar un vertebrado, caracterizado porque comprende: . una base de Carbopol 974P; una base de escualeno; y una solución de arabinogalactano; en donde el adyuvante actúa como un portador para un antígeno basado en somatostatina para el tratamiento de deficiencia de factor 1 de crecimiento tipo insulina o de hormona de crecimiento de humano en el vertebrado.

18. Adyuvante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la base de escualeno es una combinación de escualeno, Tween 80 no de origen animal y Span 85.

19. Adyuvante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el antígeno basado en somatostatina es somatostatina- 14 enlazada a una enzima de CAT sustancialmente inactivadas.

20. Adyuvante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la enzima de CAT inactivada tiene uno o más residuos de histidina tipo silvestre reemplazados con alanina, glicina u otro aminoácido similar.

21. Vacuna para el tratamiento de un paciente que tiene una deficiencia de hormona de crecimiento y/o de factor 1 de crecimiento tipo insulina, caracterizada porque comprende: una cantidad inmunogénica de antígeno basado en somatostatina; y un adyuvante que comprende al menos Carbopol 974P, escualeno y arabinogalactano .

22. Vacuna de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el antígeno basado en somatostatina es somatostatina- 14 unida a una enzima de CAT inactivada.

23. Vacuna de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la enzima de CAT inactivada tiene uno o más residuos de histidina tipo silvestre reemplazados con alanina, glicina u otro aminoácido similar.

24. Método para el tratamiento de obesidad en un paciente, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad inmunogénica de una vacuna al paciente obeso en donde la vacuna comprende un antígeno basado en somatostatina y un adyuvante; y monitorizar el progreso de tratamiento del paciente .

25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el paciente es un humano, perro, gato, o caballo.