MX2010006148A - Anti-cuerpos contra el virus de la influenza y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invención provee anti-cuerpos scFv humanos y anticuerpos monoclonales que neutralizan el virus de la influenza. También provistos son métodos de tratamiento y/o prevención de una enfermedad o un desorden relacionado con la influenza, tal como la influenza aviar. La invención también provee métodos de vacunar a un paciente contra la influenza. También se proveen métodos de diagnosticar enfermedades o desórdenes relacionados con la influenza y métodos de detectar la presencia de influenza en una muestra.

Description

ANTI -CUERPOS CONTRA EL VIRUS DE LA INFLUE I MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS o por Subvención Esta invención fue realizada con apoyo del g Estados Unidos, bajo la subvención U01 A8074518 onal Institutes of Health. El gobierno de los Est e ciertos derechos en la invención.

O de la Invención Esta invención se refiere generalmente a an -virales así como a métodos para uso de los mismo cedentes Una pandemia de influenza representa una de 1 azas infecciosas agudas a la salud humana. La p uenza de 1918-1919 ocasionó 500,000 muertes estim ralización de epítopes importantes han reportado n pos neutralizantes, se necesitan estudios est lionados para desarrollar estrategias de neut ra HPAI H5N1. Los retos para el desarrollo de ectora contra HPAI H5N1 son formidables y se neces ques para impedir y tratar la infección en seres e de un enemigo siempre cambiante. Existe una ne rrollar rápidamente estrategias terapéuticas para idad en anfitriones protectores, tanto pasiva co I e .

Se han logrado tremendos avances en el c niería de anti-cuerpos humanos (Ab) . ' Las inmuno- de anti-cuerpos monoclonales (Mab) se están aho do en el estándar del cuidado en un número cada v rmedades humanas, incluyendo RSV. El desplazamien amiento de Mab humanos de novo y su uso clínico e irus de la influenza A grupo I, tal como un v uenza del cúmulo Hl . El virus de la influenza del n cúmulo Hla o un cúmulo Hlb. El anti -cuerpo mon lmente humano. En diversos aspectos, el a clonal es un anti-cuerpo bivalente, un anti -cuerpo un anti-cuerpo de una sola cadena, o un fragme os. De manera específica, tal anti-cuerpo monoclo epítope en la región del tallo de la proteíná hem , tal como el polipéptido HA1 o HÁ2. El epí al .

De manera opcional, el epítope comprende HA-2. El epítope es no lineal. En algunas ización, el epítope comprende el aminoácido en 1 38, 40, 291 del polipéptido HA1 y el aminoác ción 18, 19, 20, 21, 38, 41, 42, 45, 49, 52, 5 péptido HA2. nción funcionan para inhibir la fusión de membran l.

El anti-cuerpo monoclonal tiene una se oácidos variable, de cadena pesada, que contiene 2, 6, 12, 18, 24, 28, 32 y 36, y/o una se oácidos variable, de cadena ligera, conteniendo 4, 8, 14, 16, 20, 22, 26, 30, 34 y 38.

El anti-cuerpo monoclonal tiene una secuenci eicos variable, de cadena pesada, conteniendo las , 13, 15, 21, 23, 29, 33, 37 y 40, y/o una se os nucleicos variable, de cadena ligera, contenie OS: 3, 9, 11, 17, 19, 25, 27, 31, 35, 39 y 42.

También provisto por la invención es un a clonal de la proteína hemaglutinina anti-inf mento del mismo, donde el anti-cuerpo tiene una teniendo la secuencia de aminoácidos SYAFS, ??? SVSSYLA, RASQSLSSKYLA, TGSSSNIGNYVA, SGSSSNIGSN YLN, o TLSSGHSNYIIA; una región VL CDR2 teniendo de aminoácidos SNSDRPS, EDDRRPS , EVTKRPS , RNNDRPS RPS, DASNRAT, GASSRAT, SNNQRPS , AASSLQR, SNEQRP GSHTKGD, y/o una región VL CDR3 teniendo la se oácidos QSYDSLSAYV, QSYDTNNHAV, CSYAGHSAYV, ST SSLSAWV, QVWDSGNDRPL, QQYGSSPQV, QQYDGVPRT, QS SSPYT, ASWDDNLSG V, o ETWDTKIHV.

En un aspecto adicional, la invención prove po monoclonal anti-influenza de prot!eina hemagl mento del mismo, donde el anticuerpo tiene una se oácidos VH codificada por el gen IGHVA-69*01 d inal VH, y el aminoácido en la posición: a) 27 es 8 es treonina; c) 30 es serina; d) 31 es serina onina; f) 55 es fenilalanina; g) 58 es treonina; oína; i) 101 es serina; j) 102 es tirosina; étodo también incluye administrar un fármaco anti bidor de entrada viral o inhibidor de unión v aco anti -viral es un inhibidor de la neuraminidas mivir, o fosfato de oseltamivir, un inhibidor bidor del ácido siálico, o un canal de iones M2 tadina o rimantadina. El anti-cuerpo es administ spués de exposición a un virus de la influenza.

En otro aspecto, la invención provee un ctar la presencia de un virus de la influenza en u endo en contacto la muestra con un anti-cuerpo m se describe en la presente, y detectando la p ncia de un complejo anti-cuerpo-antíge'no, con ello resencia de un virus de la influenza en una mu tra de prueba es generalmente obtenida de san ado en la mejilla, saliva, biopsia, orina, hece ración nasal, o semen.

En consecuencia, también se incluye en la i do de producir un anti-cuerpo aislado que se liga e e a un virus patógeno envuelto, exponiendo una sol biblioteca de expresión de Fab a una proteína de rana del virus, identificando un anti -cuerpo en la se liga específicamente a dicha proteína, y aislan po de la biblioteca. De preferencia,, la proteína nmovilizada en una superficie sólida, v.gr., plá rsos aspectos, la proteína de fusión tiene glico ficadas en comparación con una proteína de f estre. Por ejemplo, la fusión es producida en un amífero, tal como una célula de insecto. La p ??, por ejemplo, es una proteína de hemaglut érica .

La invención provee además un método de va to contra un virus patógeno envuelto, tal como un I - 8 - A menos que se definan de otra manera, iños técnicos y científicos usados en la presente o significado comúnmente comprendido' por un téc ria a que pertenece esta invención. Aunque pue dos y materiales similares o equivalentes a los d resente en la práctica o en pruebas de la presente escriben mas adelante métodos y materiales adecua I publicaciones, las solicitudes de patente, patent rencias mencionadas en la presente i son incorp rencia en su totalidad. En caso de conflicto, co enté descripción, incluyendo las definiciones. riales, métodos y ejemplos son solamente ilustra enden ser limitativos.

Otros aspectos y ventajas de la inven entes a partir de la siguiente descripción detal indicaciones. o-terapia de combinación convergente para H5N1.

La figura 3 es una ilustración que m aración de secuencias de aminoácidos de las region (FR1-4) y las regiones que determinan complemen 1-3) tanto para VH como VL de los anti-cuerpos anti a invención. Las regiones FR y CDR son definidas de datos de abat. El nombre del gen VH y VL es erecha (usando la base de datos IMGT) . Los punto tidad de' secuencia con la secuencia de consenso. esentan huecos .

La figura 4 muestra neutralización in vitr pos anti-H5. (A) (panel superior) Los diez n ertidos en scFv-Fes soluble (fragmentó de una sol ?? variable enlazada con articulación, CH2 y CH3) ecto de actividad neutralizante contra los viru dotipo. Se muestra la neutralización porcentu P57 (A/Japan/ 305/57 (H2N2) ) y H6-NY98 (A /14677-13/1998 (H6N2)) . (c) Ensaye de micro-neutr los de neutralización de FIO contra H5N1 tipo silv hio/83 ("H1-OH83") ) y H2N2 (A/Ann Arbor/6/60 ("?2-aración con un mAb 21G8.6 de murino criado con . 80R (1 mg/ml de solución Ab) "<" indica un titul 0. Los resultados representan dos experimentos in La figura 5 muestra el mecanismo de neutraliz ye de inhibición de ligadura de virus usando HA d ieta de virus H5-TH04 -pseudotipo HIV-1. La li s a células en grupos tratados con Ab fue compar dura a células en ausencia de Ab (definida c uno de los tres nAbs (D8, FIO y A66) inhibió la li s a células, mientras que un mAb antirH5 de ratón, ero anti-H5Nl de hurón, ambos de los cuales inh conservación de secuencia/estructural, (a) Estr ero H5 ligado a FIO (scFv) . H5 es sumamente si uctura sin formar complejo21 (en pares RMSD (C ) = troms para dos trímeros independientes) . HA1, HA2 , e HA2 , el "péptido de fusión" (FP) , y FIO (VH y go de color. El tercer FIO está oculto detrás se que VL no hace contacto con H5. (b) Superf ?? de tallo central. Un monómero es coloreado por ectoría de FP a través del epítope (rojo) es perf ciones que no afectan la ligadura están en color ido de fusión (FP y FP1) es visible én dos monóm duos de epítope son marbetados blanco ,(HA2) o amar Acercamiento del epítope mostrando la punta de F y cadenas laterales CDR seleccionadas. De 1 rficie enterrada en la entrecara, 43% implica int ófobas . (d) Cobertura de sub-tipos HA: Hl, H5 y H9 es glicosilado en H3 y el cúmulo H7. (e) Secuenc b-tipos de HA. Los círculos indican las energías uladas: intensa=azul , intermedia=naranj a ; d avorable=negro . El resaltado de color indica conse encia dentro de cúmulos y grupos. La red de conta coidales que estabilizan la estructura fusog cada debajo de las secuencias. ripción Detallada de la Invención La influenza A es un virus de ARN de una so ntido negativo, con un genoma de ocho segmentos q roteínas. Pertenece a la familia Orthomyxovi uye los géneros del virus de la influenza A, B y ne por la antigenicidad del nucleoc psido y las pr iz. Generalmente, el virus de la influenza A est enfermedades mas severas en los seres humanos. E nfluenza A además tiene sub-tipos por dos pr ción se describe en mayor detalle mas adelante e i na de flavivirus quimérico, albúmina de suero hum un estabilizante, manitol (5%) y lactosa (4%) co olumen, e histidina (10 mM) y glutamato de potas componentes reguladores. Además de este ejemplo e invención también incluye composiciones en 1 I onentes de estos tipos son variados en iden idad, como se describe a continuación.

Estabilizantes que pueden estar present osiciones de la invención incluyen proteínas de a o. Una proteína de albúmina de suero preferida es a o humana (HSA) , ya sea en forma no recombinante o r I n ejemplo adicional de una proteína de albúmina d ede incluir en las composiciones de la invención e suero bovina. Además de las albúminas de sue I bilizantes que se pueden incluir en las composici osa, sacarosa, y fructuosa, y/o alcoholes de azú manitol y sorbitol. Como se discute adiciona I ante, en composiciones de la invención incluyend e ser preferible para esta componente estar en fa en lugar de cristalina. Además, en ciertos ejemp preferible para las composiciones de la inve uyan combinaciones de azúcares y/o alcoholes de az pio, el cual se describe adicionálmente mas osiciones de la invención pueden incluir una comb osa y manitol, con el último de preferencia estan fa. En un ejemplo, lactosa está presente en alred 2-8%, o 4-6% (v.gr., 4%), mientras que manitol est lrededor de 1-10%, 2-8%, o 4-6% (v.gr., 5%).

Como se nota anteriormente, además de estabi tes de volumen, las composiciones de la invenc uir componentes reguladores, tales como aminoá 5, o 50 mM. Además, las composiciones son general e, v.gr., 6-10, 7-9, 7.5-8.5, o 7.9-8.1.

Las composiciones de la invención también i s componentes terapéuticos activos, los cuales tes terapéuticos a base de péptidos o proteínas s, tales como vacunas de virus atenuados, vivos, n tipo del último grupo de agentes terapéuticos ( s atenuados, vivos) es las vacunas de flavivirus, as del virus de la fiebre amarilla. Un ejemplo es una vacuna del virus de la fiebre amarilla es la na YF17D (Smithburn y colaboradores, "Yellow Feve " , World Health Org., p. 238, 1956; Freestone, e boradores (editores) , Vaccines, 2da. edición, w . B. delfia, 1995) . Otras cepas de virus de la fiebre ., YF17DD {No. de acceso GenBank U17066) y YF17D-so GenBank U17067) (dos Santos y colaboradores, nesa (v.gr., SA14-14-2) , del dengue (serotipos 1 falitis de Murray Valley, de la encefalitis de St. > Occidental; de Kunjin, de la encefalitis de R us; flavivirus transmitidos por garrapatas, tales a encefalitis europea central, de la encefalitis a encefalitis rusa de primavera-verano, de enf anur Forest, de Alkhurma, de fiebre hemorrágica d rmedad de Louping, de Powassan, de Negishi, de Abs alova, de Apoi, y de Hypr; así como virus a partir civirus (v.gr., virus de la hepatitis C) .

Además de los virus enlistados anteriorment S flavivirus, flavivirus quiméricos también se pue as composiciones de la invención. Estas quime istir de un flavivirus (es decir, un flavivirus de 1 cual proteína (o proteínas) estructural ha sido r ! una proteína (o proteínas) estructural correspond falitis japonesa, u otro virus, tal como cua llos mencionados en la presente) . Los virus quimér rse a partir de. cualquier combinación de vi camente el virus contra el cual se busca inmun te de las proteínas estructurales insertadas.

Un ejemplo específico de un tipo de virus qui uede incluir en las composiciones de la invención acuna humana de fiebre amarilla, YF17D, en l eína de membrana y la proteína de envoltura plazadas con la proteína de membrana y la p ltura de otro flavivirus, tal como un virus dental, virus del dengue (serotipos 1, 2, 3 o 4) , falitis japonesa, virus de la encefalitis de St . L a encefalitis de Murray Valley, o cualquier otro f como uno de aquellos enlistados anteriormente. éricos hechos usando este enfoque han sido desig Encefalitis Japonesa SA14-14-2 (YF/JE Al .3 ; número VR-2594) .

Detalles para hacer virus quiméricos que se p a invención son provistos, por ejemplo, en las icaciones: O 98/37911 ; WO 01/39802; Chambers y c J. Virol. 73:3095-3101, 1999; WO 03/103571 ; WO 20 tente US 6,696,281 ; la patente US No. 6,184,024; ,676,936; y la patente US 6,497,884. Ejemplos e ionales ele flavivirus quiméricos que pueden estar as composiciones de la invención, y que pued ciones atenuantes particulares, se describen por 2/072835, WO 02/102828, WO 03/103571, WO 2004/ /082020, WO 2006/044857, WO 2006/1 l|6182, y la 9, 531.

Vacunas de virus adicionales que pueden esta as composiciones de la invención incluyen vacu titis B fusionadas a uno o mas péptidos de influe 2e; ver, v . gr . , WO 2005/055957), y vacunas de to icile (incluyendo, v.gr., toxoides A y/o B) .

Las composiciones descritas anteriormente os en la presente pueden estar en una forma elación, o en la forma de un líquido, tal com ués de un proceso de secado por congelación. Como ayor detalle en otros puntos en la presente, las c de la invención son particularmente ventajosas d bilidad de los componentes activos, la cual es deb e a la formulación y el proceso por el cual se ucto, el cual involucra liofilización . En ge eso incluye los siguientes pasos: congelació ario, secado secundario, y taponado. El proceso e ayor detalle mas adelante, en los ejemplos exper un ejemplo del proceso es como sigue. a a +0. l°C/minuto a una temperatura de estante ener por 800 minutos. En el paso de secado secu O permanece a 25 mT, y un paso de rampa es llevado la rampa sea a +0. l°C/minuto a una temperatura de C, mantener por 800 minutos. Si es necesario, e e mantenerse a +20°C, 25 mT hasta 24 horas adicion aponar. En el paso de taponado, la cámara es des 0.22 ym de gas nitrógeno filtrado, seco, el vacío mbar (vacío ligero) , y los tapones son empujados frascos. Un ciclo de liofilización alternativo se en la invención se resume en la siguiente tabl a 1 - Ciclo de Liofilización Alternativo Temperatura de Estante Ciclo de Congelación tes de liofilizador 5°C No enfriados ar charolas, mantener 5°C =30 a a -2.0°C/minuto -5°C 15 a a -1.0°C/minuto -40°C 60 Secado Primario r vacío a 25 mT 1 a a +0.5°C/minuto +5°C 300 a a -0.5°C/minuto 0°C j 300 Secado Secundario O 25 mT a +0.2°C/minuto +30°C 600 a a -l .0°C/minuto +5°C 9, 99 .1 Taponado asificar la cámara con 0.22 ym +20°C No as nitrógeno filtrado, seco s pasos de secado, como se describe en la presente S, un vacío puede aplicarse (v.gr., 25 mT) y la t e cambiarse gradualmente (v.gr., 0.1 a 1.0°C/ C/minuto) , por el curso de un periodo de tiempo 1,000 minutos, v.gr., 200-600 o 300-500 minuto do primario, la temperatura puede elevarse a o alr ejemplo, -30°C a +10°C, v.gr., -20°C a +5°C o -1 tras en el secado secundario, la temperatura puede o ejemplo, +5°C a +35°C, v.gr., 10°QI a 30°C, o 15 es conocido por los técnicos en la materia, estos r., temperaturas, tiempos de retención, tasas d íes de vacío) pueden cambiarse con base en, por ej itados obtenidos.

Previo a la formulación, los virus ( eras) que se pueden incluir en las composicio nción pueden hacerse usando métodos estándar en l s se introduce dentro de las células heteroploide osecha del medio en el cual se han cultivado las C s cosechado es tratado con una nucle sa (v.gr., u sa que degrada tanto ADN y ARN, tal como Benzonas ,173,418) , el virus tratado con nucleasa se concen el uso de ultrafiltración usando un filtro tenien esos moleculares de, v.gr., 500 kDa) , y el virus c ormula para propósitos de vacunación. Detalles de provistos en O 03/060088 A2 , la cual se incor enté por referencia.

Las composiciones de vacuna de la invenc nistrarse como agentes profilácticos primarios a go de* infección, o pueden usarse como agentes s . tratar a pacientes infectados. Debido a que lo nas de estas composiciones son atenuados, son parti adecuados para administración w individuos en rie Las vacunas de la invención pueden administr dos que son bien conocidos en la materia, y piadas de las vacunas a ser administradas pueden de ímente por los técnicos en la materia. Lo que se siendo una cantidad apropiada de virus a adminis rminarse por consideración de factores tales como, o y la salud general del sujeto al cual se va a a irus. Por ejemplo, los virus de la invención puede omo soluciones acuosas estériles conteniendo entre , 103 a 107, unidades infecciosas (v.gr., unidades laca o dosis infecciosas de cultivo de tejido) en osis de 0.1 a 1.0 mi, a ser administradas med plo, rutas intramuscular, sub-cutánea, o int ás, debido a que los flavivirus pueden ser Ctar a un hospedero humano mediante rutas mucosa la ruta oral (Gresikova y colaboradores, plos Experimentales Los experimentos descritos mas adelante se t en un programa de desarrollo para la formulación ón de dos vacunas, ChimeriVax- N (flavivirus uyendo proteínas de capside y no estructurales de fiebre amarilla y proteínas de pre-membrana/m ltura del virus del Nilo Occidental) y Chi vivirus quimérico incluyendo proteínas de cáp ucturales del virus de la fiebre amarilla y proteí rana/membrana y envoltura del virus de la e nesa) , pero estos enfoques se incluyen en la inv ecto a la formulación y procesamiento de otros péuticos conteniendo proteína/péptido y/o virus tan iscutió anteriormente.

Por consiguiente, en un ejemplo, una formul nción incluye histidina (aminoácido} 10 m , gl estante de -35°C, mantener por 500 minutos; °C/minuto a una temperatura de estante de -30°C/ ma i inutos; y rampa a +0. l°C/minuto a una1 temperatura 25°C, mantener por 800 minutos. En un paso ndario, el vacío permanece en 25 mT, y se somete °C/minuto a una temperatura de estante de +20°C, ma minutos. Si es necesario, el producto puede ma C, 25 mT, hasta 24 horas adicionales antes de tapó de taponado, la cámara es desgasificada con 0.22 ógeno seco, filtrado, el vacío se fija a 800 m ro) , y los tapones son empujados dentro de frasco este ejemplo, así como otras formulaciones uidos en la invención es provista, en parte, mas pio 1 - Experimento de Estudio de Liofilización de Occidental con Formulaciones de Manitol/Lactosa En el experimento descrito en el ejemplo, se a 2: Formulaciones de WNPD-045 y Temperaturas de idrio ase Componentes Adicionales ¡ anitol al 5%; Lactosa al 4%; HSA al 0.1%, Glutamato K 50 mM istidina 10 mM anitol al 5%; Lactosa al 4%; rHG-272 al 0.1%, Glutamato K 50 m istidina 10 mM anitol al 5%; Lactosa al 4%; HSA al 0.1% istidina 10 mM anitol al 5%; Lactosa al 4%; rHG-272 al 0.1% istidina 10 mM El virus se formuló mediante llevar a cabo u 0 de Volumen Clarificado de WNPD-001 hacia los reg ulación. La formulación se hizo en un BSC. La lio llevada a cabo bajo las siguientes condiciones C/minuto a una temperatura de estante de -55 °C y m minutos; cuando la temperatura del producto alea ener por 15 minutos; secar con cámara a 150 m rior a 100 mT; rampa a 0.2°C/minuto a una temp gimiento de torta considerable después de 7 días ulaciones con glutamato de potasio no experimen gimiento. Los experimentos WNPD-049 y WNPD-051 fue PFU para determinar la estabilidad del virus ulaciones. Todas las muestras se reconstituyeron ltados Todas las formulaciones parecieron muy similares I lización. Las tortas se llenaron y no parecie idas de volumen significativas. Algunas tortas se as paredes del frasco, pero esto pareció ser aléat formulaciones. La Tabla 3 muestra los rendi elación y los rendimientos a través de lio arados con el material de Volumen Clarificado u ulación. La Tabla 4 muestra los resultados del bilidad acelerada a 37°C.

Liofilización de WNPD-045 y Rendimientos de C ilidad de WNPD- Ensayo Título Días Rend. de Títul 37eC Congel do a CongelaDía 0 (-80°C) -80eC ción 045, Manitol al WNPD- 049 1.67E+05 7 103% 1.29E+ actosa al 4%, dina 10 mM, HSA 1%, Glutamato de WNPD-051 1.80E+05 14 79% 1.29E+ io 50 mM 045, Manitol al WNPD-049 5.40E+04 7 34% 7.80E+ actosa al 4%, dina 10 mM, rHG-l 0.1%, Glutama- WNPD-051 5.80E+04 14 26% 1.57E+ Potasio 50 mM 045, Manitol al WNPD-049 1.55E+05 7 96% 1.45E+ actosa al 4%, dina 10 mM, HSA WNPD-051 1.46E+05 14 64% 1.23E+ 1% 045, Manitol al WNPD-049 2.18E+05 7 135% 3.10E+ actosa al 4%, dina 10 mM, rHG- WNPD-051 3.30E+04 14 15% 7.90E+ l 0.1% a 4: Estabilidad de PD-045 a 37 °C lusiones Las formulaciones con HSA se desempeñaron i ilación.

Las formulaciones con gelatina humana rec 212, no produjeron resultados que fueran tan b ilos para HSA, pero pueden mejorar si la concen se incrementa. Estas formulaciones mostraron re s cuando se congelan a -80°C. Esto soporta a datos NPD-033 (ver mas adelante) , los cuales tuvie peraciones después de congelación en una formulaci Las formulaciones con gelatina recombinant raron pérdidas (>1 log) en los estudios de estabil ués de 14 días. 1 pio II - Desarrollo de una Vacuna Liofilizada para eriVax-WN y ChimeriVax-JE Este ejemplo describe el desarrollo y carac una formulación adecuada para vacunas Chimer eriVax-JE, así como el desarrollo y optimización s de liofilización y almacenadas a -80°C como mues ilización Para experimentos hasta W PD-070 y hasta JEP ilización se llevaron a cabo usando un sistema FT Comenzando con JEPD-145, un sistema Kinetics Lyo Los parámetros de liofilización fueron variados el plan experimental. Frascos de 3 mL fueron u s los experimentos. Típicamente, un volumen de lie e usó, sin embargo, un volumen de llenado de rimentó con y será notado cuando sea aplicable, yo de Placas ChimeriVax-WN Un ensayo de placas se usó para evaluar las es virales del proceso de liofilización y los e bilidad. Muestras ChimeriVax-WN liofi.lizadas se re n con ya sea agua para inyección (WFI) o cloruro los pozos contados para cada dilución, yo de Placas ChimeriVax-JE Un ensayo de placas se usó para evaluar las I es virales del proceso de liofilización y los e bilidad. Muestras de ChimeriVax-JE liófilizadas se ron con ya sea agua para inyección (WFI) o clorur .9% para inyección. Las muestras reconstituidas se edio JE PFU. Diluciones se colocaron en placas a en placas O-Vero sembradas a 3xl05 células por as se incubaron por 1 hora a 37°C y C02 al 5% ieron con capa de metil celulosa. Las placas se inc 12 horas a 37°C y C02 al 5% y luego sé mancharon c tal al 1% en metanol al 70%. Placas m !anchadas se ¦ i ego se contaron. Diluciones aceptable tuvieron e as por pozo y tuvieron una desviación estándar r para todos los pozos contados para cada dilución isis de Humedad Residual El análisis de humedad residual se llevó a c cción de muestra directa dentro de un equipo Coulot er. Las pruebas se hicieron el grupo dé Control de bis en Cantón, Massachusetts , Estados Unidos, de a -FRM-158-02. rimetría de Exploración Diferencial Calorimetría de Exploración Diferencial se 1 do un equipo TA Instruments Q1000.; Muestras l iaron a -70°C y luego se sometieron a rampa a 20 r resolución fue necesaria, un método modulado se dos produjeron temperaturas de transición a vidri idatos a regulador de formulación. Muestras tieron a rampa de 0°C a 120°C. Este método se uar la temperatura de transición a vidrio d ilizado y para determinar las condiciones de almac Humedad residual de material liofilizado Tg - temperatura de transición a vidrio d liofilizado Un gran número de excipientes se evaluó para de formulación tempranos. Los componentes in orados incluyen: sorbitol, manitol, sacarosa, osa, glicina, Hetastarch, Pentastarch, PEG 3350, uro de sodio, cloruro de potasio, Tween-80, ina, HEPES, TRIS, glutamato de potasio, tripoli ato de potasio. Algunas formulaciones fallaron e as aceptables y tuvieron recuperaciones virales os de 30%) después de ser liofilizadas . Recu les comenzaron a mejorar con la adición de HSA a f como un estabilizante. rimentos de HSA En el experimento W PD-021, HSA se usó pr a 5: Rendimientos de Liofilización de PD-021 El experimento JEPD-018 además exploró el ef un estabilizante en formulación liofilizada. Este só la formulación de lactosa al 4%, sorbitol al 2%, M, alanina 10 mM, y glutamato de potasio 50 mM, y concentraciones de HSA de 0%, 0.05%, 0.1%, 1%, y 2 a liofilización, las muestras se almacenaron a dio de estabilidad acelerado. La Ta ibla 6 muest encia de HSA mejora mayormente el rendimiento vir iofilización. Muestras tituladas después de 5, 12, °C mostraron remarcablemente buena recuperación ( a 6: Rendimientos de Liofilización de JEPD-018 bilidad Acelerada de 37 °C Estabilizantes recombinantes también se eval orar la posibilidad de eliminar HSA. El experiment inó el uso de HSA Recombinante de Delta Biologics a recombinante de Fibrogen (2 cepas - una de tipo a diseñada) . Los productos de Gelatina Humana r ) se usaron a concentraciones de 0.5% y 1%. a 7: Rendimientos de Liofilización de JEPD-080 bilidad Acelerada de 37 °C ación Rendimiento Rendimiento Rendimiento Rendimiento Pérdid -80°C Lio. después de después de Log desp 9 días 12 días de 12 dí a 37°C a 37°C a 37°C SA - 89% 41% ! 28% 0.55 j SA 81% 95% 32% 28% 0.56 inante elatina 81% 38% 15% 3% 1.56 a elatina 93% 93% 11% 1% 2.16 a HG 88% 101% 3% , 2% 1.64 ada) HG 70% 48% 7% 3% 1.53 ada) HG 74% 41% 14% 5% 1.30 silvestre) HG 63% 35% 15% 3% 1.48 silvestre) i similares ante reconstitución (74% sin histidin idina) , y mostraron perfiles de estabilidad simil ura 2) . A pesar de perfiles similares con y sin his ccionó como componente de formulación debido a su iadora en el rango de pH objetivo.

El experimento WNPD-045 examinó formula tol al 5%, lactosa al 4%, HSA al 0.1%, e histidina n glutamato de potasio 50 mM. Estas dos formul ilizaron y luego se incubaron a 37°C por 28 tras se tomaron en intervalos de 7 días durante la °C para crear el perfil de estabilidad mostrado e mbas formulaciones tuvieron rendimientos comparabl a liofilización (por encima de 80%) . La formu amato de potasio 50 mM mostró una mejor estabili sin. Después de 28 días, hubo una pérdida log de 0 los para la formulación con glutamato de potas ra. 1) .

El experimento WNPD-029 elaboró sobre estos tadores . Este experimentó usó una formulación base %, sorbitol al 2%, histidina 10 mM, alanina amato de potasio 50 mM, Los datos siguientes refo ficios de usar HSA como un componente estabilizan J a 8: Rendimientos de Liofilización de WNPD-029 bilidad Acelerados de 37 °C i o de Estabilidad WNPD-029 Volumen PFU/itiL , PFU Rendi Promedio Totales de n Clarificado (de WNPD-029) 0.1 4.83E+07 4.83E+06 29 lactosa/sorbitol , día' 0 ¿0 1.40E+04 1.40E+05 2. 1 29 lactosa/sorbitol, 7 días a 37°C 10 1.90E+03 1.90E+04 13. 29 lactosa/sorbitol, 14 días a 37°C 10 3.00E+0 3.00E+03 2. r 29 lactosa/sorbitol, 0.1% HSA, día 0 10 3.42E+05 3. 2E+06 70. 29 lactosa/sorbitol, 0.1% HSA, 10 3.48E+05 3 -48E+06 101 a 37°C 29 lactosa/sorbitol, 0.1% HSA, 10 1.28E+05 1.28E+06 37. inuaron usando 4% como la concentración de lactos El experimento W PD-036 comparó las sigui ulaciones: lactosa al 4%, sorbitol al 2%, histidina 10 10 mM, glutamato de potasio 50 mM, HSA al 0 lactosa al 4%, sacarosa al 3%, histidi glutamato de potasio 50 mM, HSA> al 0.1% lactosa al 4%, manitol al 3%, histidina 10 0.1% a 9: Rendimientos de Liofilización WNPD-036 y bilidad Acelerada de 37 °C o de Estabilidad WNPD-036 (de WNPD-042) PFU/mL Rendi Promedio de 36 4% lactosa, 2% sorbitol, pre-lio 2.65E+05 36 4% lactosa, 2% sorbitol, día 0 1.40E+05 52 36 4% lactosa, 2% sorbitol, 6 días a 37°C 8.76E+04 62 36 4% lactosa, 2% sorbitol, 14 días a 37°C 5.31E+04 37 excelente recuperación después de liofilización mente 0.15 de pérdida log después de dos semanas a eleccionó como candidato para investigación adi x6 que las propiedades de cristalización de manito se para acelerar el ciclo de liofilizáción. ulaciones de Un Solo Azúcar Otros experimentos exploraron usar estos men por separado. NPD-030 examinó formulaciones c mente manitol o sacarosa. Lactosa se investigó en I s formulaciones se compararon con una formulación c ombinación de dos azúcares de manitol al 5% y lac NPD-045. La estabilidad de la formulación de itol al 5%, lactosa al 4%, HSA al 0.1%, histid amato de potasio 50 mM) excedieron por mucho a quiera de las formulaciones de un solo azúcar. To ulaciones de un solo azúcar mostraron pérdidas de tos adicionales antes de comenzar el secado prima Ambos experimentos produjeron excelentes iado permitió que el manitol se cristalizara, y la orta fue aquella de una torta de manitol cristali embargo, el material templado exhibió pobre e arada con todos los experimentos, los cuales as sin templado. Muestras templadas mostraron pér 1.0 después de dos semanas de almacenamient tras que las muestras no templadas típicamente expe idas en el rango de 0.3-0.5 log para el mismo po (figura 6) .

Estos datos, acoplados con los datos a par emas de un solo azúcar, llevan a la conclusión de talino no es benéfico a la estabilidad de producto Calorimetría de Exploración Diferencial conf a cristalizado por completo.

Otra conclusión puede tomarse a partir de es actosa siempre permanece en estado amorfo cuando e . El manitol, en una formulación por si mismo, se 1 un material cristalino, sin embargo, cuando se c S azúcares, el manitol puede ser ya sea cristalino rimentos previos han mostrado la estabilidad po ientes casos: Lactosa sola (4%) - en el cual la lactosa e Manitol solo (5)% - en el cual el manitol es Lactosa (4%) y manitol (5%) templados - en manitol es cristalino y la lactosa es amorf Buena estabilidad ha sido demostrada solame ulación involucrando estos dos componentes. Cuan y manitol (5%) son liofilizados sin algún paso de o la lactosa y el manitol permanecen en el estado vacunas ChimeriVax. Un número de experimentos s caracterizar la formulación, y para crear y op I o de liofilización.

Estabilidad Líquida Datos a partir de WNPD-052, JEPD-072, y JEPD-inarse para mostrar que esta formulación p iente estabilidad en una prueba de almacenamiento po real. Ninguna pérdida de título estadísticament va debida al almacenamiento puede observarse rimentos (figura 9) . Esta formulación debería pr I bilidad adecuada a los- productos ChimeriVax cenan a -80°C antes de liofilización.

Calorimetría de Exploración Diferencial Calorimetría de Exploración Diferencial (D determinar la temperatura de transición a vidri formulación. La figura 10 muestra un termograma a partir de los experimentos JEPD-072, JEPD-087, -147, y JEPD-151, y muestra la pérdida en titulo el porcentaje de humedad residual.

Parámetros de Liofilización Los experimentos mostrados en la Tabla 10 arámetros usados al liofilizar la formulación fin ura los rendimientos virales después de liofili entaje de humedad de la torta liofilizada, la apa orta liofilizada, y datos de estabilidad acelerad ir de 1 y 2 semanas, así como el punto de tiemp ir de incubación a 37 °C. a 10: Parámetros de Liofilización para Experi ulación Final on imario 0.2 0.2 0.1 0.2 0.05 0.05 0.1 0.1 0.1 50 50 50 50 50 50 25 25 25 -20 -12 -20 -20 -20 20 -35 -2S -25 1,034 2, 100 1, 500 1,625 1 , 500 1,300 300 1,000 1,000 -30 300 , -25 300 ! -20 • 300 cundario Con base en estos ciatos, fue nécesario est o de liofilización que pudiera transferirse al ratado. JEPD-151 tuvo el rendimiento mas alto ilización, la mejor estabilidad después de 2 sema umedad residual mas baja, y produjo algunas de l as desde un punto de vista estético (figura 13) . E ilización a partir de este experimento sirvió com las especificaciones técnicas que fueron dadas al ratado . eificaciones Técnicas Estas especificaciones técnicas se basan en los tiempos de retención se extendieron para com lemas de escala potenciales con un liofilizador s especificaciones se transfirieron a Walter itute of Research para terminado de, llenado con rial de Fase I/II de ChimeriVax-WN y ChimeriVax-J -35°C, mantener por 500 minutos.

Rampa a +0. l°C/minuto a una temperatura de ~30°C, mantener por 500 minutos.

Rampa a +0. l°C/minuto a una temperatura de -25°C, mantener por 800 minutos. do Secundario Vacio permanece a 25 mT.

Rampa a +0. l°C/minuto a una temperatura de +20°C, mantener por 800 minutos.

Si es necesario, el producto puede manteners 25 mT hasta 24 horas adicionales antes de t nado Desgasificar la cámara con 0.22 µt? de gas seco, filtrado.

Fijar el vacío a 800 mbar (vacío ligero) . Empujar tapones dentro de frascos, (Gibco, # de catálogo 25030-018), y HEPES 2 Capa de Metil Celulosa - Metil Celulosa (pre por SOP # 502-066) conteniendo FBS al 5% o 1 ne, # de catálogo SH30070.03), Ix L-Gluta (Gibco, # de catálogo 25030-018), lx Antibió micótico (Gibco, # de catálogo 15240-062) Liofilizador FTS Durastop MP Liofilizador Kinetics Lyostar II Titulador Colométrico Orion Karl Fischer mo TA Instruments DSC Q1000 (ID# 8769) Incubadora Heraeus Heracell 240 (ID# 9055) Incubadora de Baja Temperatura VWR Modelo 8618 y 8617) Refrigerador VWR (ID# 8663) Fischer Scientific Isotemp (ID# 9059) ificativo en la titulación. Este ejemplo también rrollo y la optimización de un ciclo de liofilizac ado de 0.5 mL en un frasco de 3 mL. Este ci ucir tortas de apariencia aceptable, alta recup s (>70%), y baja humedad residual (<2%) . El ilizado ha demostrado excelente estabilidad a te adas, y probablemente no mostrará pérdida d ificativa cuando se almacena a condiciones de alma °C.

Los contenidos de todas las publicaciones m riormente se incorporan en la presente por referen as de realización están dentro del alcance de las r es siguientes.

Las composiciones de la invención incluyen tes terapéuticos a base de proteínas y/o virus, as s componentes estabilizantes, agentes de vol Estabilizantes que pueden estar present osiciones de la invención incluyen proteínas de a o. Una proteína de albúmina de suero preferida es a o humana (HSA) , ya sea en forma no recómbinante o r Un ejemplo adicional de una proteína de albúmina d uede incluir en las composiciones de la invención suero bovina. Además de las albúminas de su gilizantes que se pueden incluir en las composici nción son gelatinas, tales como gelatina humana tina humana recómbinante, la cual puede ser de tip señada) y gelatina porcina, caseína, PVP, y combi quier estabilizante mencionado en la presente eidos en la materia) . En el caso de albúmina de su antidad de este componente puede ser, v.gr., al -2.0%, 0.075-1.0%, O 0.1%.

Agentes de volumen que pueden estar presen osiciones de la invención pueden incluir una comb osa y manitol, con el último de preferencia estan fa. En un ejemplo, lactosa está presente en alred 2-8%, o 4-6% (v.gr., 4%), mientras que manitol est lrededor de 1-10%, 2-8%, o 4-6% (v.gr., 5%).

Como se nota anteriormente, además de estabi tes de volumen, las composiciones de la invenc uir componentes reguladores, tales como aminoá es pueden servir para contribuir al mantenimiento ivel o rango de pH particular, y/o estabilidad de emplo de un componente regulador que se puede inc osiciones de la invención es histidina, el cual p enté en las composiciones en una concentración de v.gr., 1-20, 5-15, o 10 m . Otro ejemplo de un lador es sales de metal álcali de ácido glutámico, amato de sodio o potasio, las cuales pueden estar nas del virus de la fiebre amarilla. Un ejemplo esp una vacuna del virus de la fiebre amarilla es la na. YF17D (Smithburn y colaboradores, ;"Yellow Feve " , World Health Org., p. 238 , 1956; Freestone, en boradores (editores) , Vaccines, 2da. edición, W. B. delfia, 1995) . Otras cepas de virus de la fiebre YF17DD (No. de acceso GenBank U17066) y YF17D-2 so GenBank U17067) (dos Santos y colaboradores, 5-41, 1995) , YF17D-204 France (X15067, X15062) , US (Rice y colaboradores, Science 229:726-733, 19 boradores, New Biologist 1:285-296, 1989; C 03700, pas del virus de la fiebre amarilla descritas po boradores, Vaccine 16 (9/10) :1024-1028, 1998, tam I r presentes en las composiciones de la invención.

Flavivirus adicionales que pueden estar pr composiciones de la invención incluyen otros alova, de Apoi, y de Hypr; así como virus a partir civirus (v.gr., virus de la hepatitis C) .

Además de los virus enlistados anteriorment s flavivirus, flavivirus quiméricos también se pue as composiciones de la invención. Estas quime istir de un flavivirus (es decir, un flavivirus de l cual proteína (o proteínas) estructural ha sido r una proteína (o proteínas) estructural correspondí ndo virus (es decir, una prueba o un virus prede como un flavivirus; ver, v.gr., la patente US 6,6 nte US 6,184,024; la patente US 6,676,936; y la 7,884). Por ejemplo, las quimeras pueden consis ivirus de esqueleto (v.gr., un virus de fiebre am ual las proteínas de membrana y de envoltura del sido reemplazadas con las proteínas de membrana y n segundo virus, de prueba (v.gr., virus del Nilo O eína de membrana y la proteína dé envoltura plazadas con la proteína de membrana y la p ltura de otro flavivirus, tal com un virus dental, virus del dengue (serotipos l,i 2, 3 o 4), falitis japonesa, virus de la encefalitis de St. L a encefalitis de Murray Valley, o cualquier otro f como uno de aquellos enlistados anteriormente. éricos hechos usando este enfoque han sido desig así llamados virus "ChimeriVax" . Los siguientes éricos, los cuales se hicieron usando i la tecnologí y se depositaron con la Colección Americana de C (ATCC, American Type Culture Collection) en inia, Estados Unidos bajo los términos del pest y les fueron otorgados fecha de depósito del 998, pueden usarse para hacer virus de la invenc érico de Fiebre Amarilla 17D/Dengue Tipo 2 (YF/DEN ionales de flavivirus quiméricos que pueden estar as composiciones de la invención, y que pued ciones atenuantes particulares, se describen por 2/072835, WO 02/102828, WO 03/103571, WO 2004/ /082020, WO 2006/044857, WO 2006/1 16182, y la 9,531.

Vacunas de virus adicionales que pueden esta as composiciones de la invención incluyen vac ela (v.gr., vacunas con base en virus de vacuna, 1000, ACAM2000, Vacunas Ankara Modificadas (MVA) , cunas con base en viruela del simio) , y Virus y v es (v.gr., HSV-1 y recombinantes del mismo mbinantes del mismo (ver, v.gr., la patente US 1, Además de virus, las composiciones de la ien pueden incluir péptidos o proteínas terapéu na tales como, por ejemplo, construcciones de de la invención son particularmente ventajosas d bilidad de los componentes activos, la cual es deb e a la formulación y el proceso por el cual se ucto, el cual involucra liofilización. En ge eso incluye los siguientes pasos: congelado ario, secado secundario, y taponado. El proceso e ayor detalle mas adelante, en los ejemplos exper un ejemplo del proceso es como sigue.

Ene 1 paso de congelación, los estantes de li ¡ pre-enfriados a -50°C. Una vez que ¡todas las c an, los estantes se mantienen a -50°C por 120 min de secado primario, el vacío se fija a 25 ientes pasos de rampa son llevados a cabo: °C/minuto a una temperatura de estante de -35°C, m minutos; rampa a +0. l°C/minuto a una temperatura 40°C, mantener por 500 minutos; rampa a +0.1°C/mi mbar (vacío ligero), y los tapones son empujados frascos. Un ciclo de liofilización alternativo se en la invención se resume en la siguiente tabl a 1 - Ciclo de Liofilizacion Alternativo Temperatura de Estante Ciclo de Congelación tes de liofilizador 5°C No nfriados r charolas, mantener 5°C =30 1 a a - .0°C/minuto -5°C 15 a a - 1.0°C/minuto -40°C 60 Secado Primario r vacío a 25 mT a a +0.5°C/minuto +5°C · 300 a a -0.5°C/minuto 0°C 300 Secado Secundario O 25 mT a a +0.2°C/minuto +30°C i 600 i a a -1.0°C/minuto +5°C ! 9, 99 Taponado asificar la cámara con 0.22 µp? +20°C No as nitrógeno filtrado, seco s pasos de secado, como se describe en la presente S, un vacío puede aplicarse (v.gr., 25 mT) y la t e cambiarse gradualmente (v.gr., 0.1 a 1.0°C/ C/minuto) , por el curso de un periodo de tiempo 1,000 minutos, v.gr., 200-600 o 300-500 minuto do primario, la temperatura puede elevarse a o alr ejemplo, -30°C a +10°C, v.gr., -20°C a +5°C o -1 tras en el secado secundario, la temperatura puede or ejemplo, +5°C a +35°C, v.gr., 10°C a 30°C, o 15 es conocido por los técnicos en la materia, estos r . , temperaturas, tiempos de retención, tasas d íes de vacío) pueden cambiarse con base en, por ej itados obtenidos .

Previo a la formulación, los virus { eras) que se pueden incluir en las composicio nción pueden hacerse usando métodos estándar en l s se introduce dentro de las células heteroploides osecha del medio en el cual se han cultivado las c s cosechado es tratado con una nuclea'sa (v.gr., u sa que degrada tanto ADN y ARN, tal como Benzonas ,173,418)', el virus tratado con nucleasa se concent el uso de ultrafiltración usando un filtro tenien esos moleculares de, v.gr., 500 kDa) , y el virus c rmula para propósitos de vacunación. Detalles de e provistos en WO 03/060088 A2 , la cual se incor enté por referencia.

Las composiciones de vacuna de la invenc nistrarse como agentes profilácticos primarios a a go de infección, o pueden usarse como agentes s I . tratar a pacientes infectados. Debido a que lo as de estas composiciones son atenuados, son parti adecuados para administración "individuos en ríe Las vacunas de la invención pueden administr dos que son bien conocidos en la materia, y piadas de las vacunas a ser administradas pueden de ímente por los técnicos en la materia. Lo que se siendo una cantidad apropiada de virus a adminis minarse por consideración de factores tales como, o y la salud general del sujeto al cual se va a a irus . Por ejemplo, los virus de la invención pueden omo soluciones acuosas estériles conteniendo entre ., 103 a 107, unidades infecciosas (v.gír. , unidades laca o dosis infecciosas de cultivo de tejido) en osis de 0.1 a 1.0 mi, a ser admini Istradas med i pio, rutas intramuscular, sub-cutánea, o int ás, debido a que los flavivirus pueden ser ctar a un hospedero humano mediante rutas mucosa la ruta oral (Gresikova y colaboradores, plos Experimentales Los experimentos descritos mas adelante se en un programa de desarrollo para la formulación ?? de dos vacunas, ChimeriVax-WN (flavivirus uyendo proteínas de capside y no estructurales de fiebre amarilla y proteínas de pre-membrana/ ltura del virus del Nilo Occidental) y Chi vivirus quimérico incluyendo proteínas de cáp ucturales del virus de la fiebre amarilla y proteí rana/membrana y envoltura del viru ¡s de la e nesa) , pero estos enfoques se incluyen en la inv I ecto a la formulación y procesamiento de otros i péuticos conteniendo proteína/péptido,y/o virus ta iscutió anteriormente. ; Por consiguiente, en un ejemplo; una formul nción incluye histidina (aminoácido)^ 10 mM, gl i estante de -35°C, mantener por 500 minutos; °C/minuto a una temperatura de estante; de -30°C, m inutos; y rampa a +0. l°C/minuto a una temperatura -25°C, mantener por 800 minutos. En un paso ndarlo, el vacío permanece en 25 mT, y se somete °C/minuto a una temperatura de estante de +20°C, m minutos. Si es necesario, el producto puede ma C, 25 mT, hasta 24 horas adicionales antes de tapó I de taponado, la cámara es desgasificada con 0.22 ógeno seco, filtrado, el vacío se fija a 800 m ro) , y los tapones son empujados dentro de frasco este ejemplo, así como otras formulaciones uidos en la invención es provista, en parte, mas pio 1 - Experimento de Estudio de Liofilización de Occidental con Formulaciones de Manitol/Lactosa En el experimento descrito en el ejemplo, se a 2: Formulaciones de WNPD-045 y Temperaturas de idrio i ase Componentes Adiciónales i anitol al 5%; Lactosa al 4%; HSA al 0.1%, Glutámato 50 mM 1 istidina 10 mM i 1 anitol al 5%; Lactosa al 4%; rHG-272 al 0.1%, Glutámato K 50 m istidina 10 mM anitol al 5%; Lactosa al 4%; HSA al 0.1% istidina 10 mM anitol al 5%; Lactosa al 4%; rHG-272 al 0.1% istidina 10 mM El virus se formuló mediante llev I ar a cabo. u 0 de Volumen Clarificado de WNPD-001 hacia los reg ? ulación. La formulación se hizo en un BSC. La lio llevada a cabo bajo las siguientes; condiciones C/minuto a una temperatura de estante de -55°C y m minutos; cuando la temperatura del producto alea i ener por 15 minutos; secar con cámara a 150 m i rior a 100 mT; rampa a 0.2 °C/minuto, a una temp gimiento de torta considerable después de 7 días a ulaciones con glutamato de potasio rio experimen gimiento. Los experimentos WNPD-049 y WNPD-051 fue PFU para determinar la estabilidad del virus ulaciones. Todas las muestras se reconstituyeron itados Todas las formulaciones parecieron muy similares ilización. Las tortas se llenaron y no parecie idas de volumen significativas. Algunas tortas se as paredes del frasco, pero esto pareció ser aléat formulaciones. La Tabla 3 muestra los rendi elación y los rendimientos a través de lio arados con el material de Volumen Clarificado u ulación. La Tabla 4 muestra los resultados del bilidad acelerada a 37°C.

Liofilización de WNPD-045 y Rendimientos de C ilidad de WNPD- Ensayo Título Días Rend . de Títul 37°C Congelado a CongelaDía 0 <-80°C) -80°C ción 045, Manitol al WNPD- 049 1.67E+05 7 103% 1.29E+ actosa al 4%, dina 10 mM, HSA 1% , Glutamato de WNPD- 051 1.80E+05 14 79% 1.29E+ io 50 mM 045, Manitol al WNPD-049 5.40E+04 7 34% 7.80E+ actosa al 4%, dina 10 mM, rHG-l 0.1%, Glutama- WNPD- 051 5. B0E+04 14 26% 1.57E+ Potasio 50 mM 045, Manitol al WNPD-049 1.55E+05 7 96% 1.45E+ actosa al 4%, dina 10 mM, HSA WNPD-051 1.46E+05 14 64% 1.23E+ 1% 045, Manitol al WNPD-049 2.18E+05 7 135% 3.10E+ actosa al 4%, dina 10 mM, rHG- WNPD-051 3.30E+04 14 15% 7.90E+ l 0.1% a 4: Estabilidad de WNPD-045 a 37°C lusiones Las formulaciones con HSA se desempeñaron lación .

Las formulaciones con gelatina humana rec 272, no produjeron resultados que fueran tan b ilos para HSA, pero pueden mejorar si la concen se incrementa. Estas formulaciones mostraron re S cuando se congelan a -80°C. Esto soporta a datos NPD-033 (ver mas adelante) , los cuales tuvie peraciones después de congelación en una formulaci Las formulaciones con gelatina recombinant raron pérdidas (>1 log) en los estudios de estabil ués de 14 días . pio II - Desarrollo de una Vacuna Liofilizada para eriVax-WN y ChimeriVax-JE Este ejemplo describe el desarrollo y carac una formulación adecuada, para vacunas Chimer eriVax-JE, así como el desarrollo y optimización s de liofilización y almacenadas a -80 °C como mues ilización Para experimentos hasta WNPD-070 y hasta JEP ilización se llevaron a cabo usando un sistema FT Comenzando con JEPD-145, un sistema Kinetics Lyo Los parámetros de liofilización fueron variados el plan experimental . Frascos de 3 mL fueron u s los experimentos. Típicamente, un volumen de lie e usó, sin embargo, un volumen de llenado de rimentó con y será notado cuando sea aplicable, yo de Placas ChimeriVax-WN Un ensayo de placas se usó para evaluar las es virales del proceso de liofilización y los e bilidad. Muestras ChimeriVax-WN liofilizadas se re n con ya sea agua para inyección (WFI) o cloruro S los pozos contados para cada dilución, yo de Placas ChimeriVax-JE Un ensayo de placas se usó para evaluar las es virales del proceso de liofilización y los e bilidad. Muestras de ChimeriVax-JE liofilizadas se ron con ya sea agua para inyección (WFI) o clorur .9% para inyección. Las muestras reconstituidas se edio JE PFU. Diluciones se colocaron en placas a en placas O-Vero sembradas a 3xl05 'células por as se incubaron por 1 hora a 37 °C y C02 al 5% ieron con capa de metil celulosa. Las placas se inc 12 horas a 37°C y C02 al 5% y luego se mancharon c tal al 1% en metanol al 70%. Placas manchadas se ego se contaron. Diluciones aceptables tuvieron en as por pozo y tuvieron una desviación estándar r para todos los pozos contados para cada dilución isis de Humedad Residual El análisis de humedad residual: se llevó a c cción de muestra directa dentro de un equipo Coulo er. Las pruebas se hicieron el grupo de Control de bis en Cantón, Massachusetts , Estados Unidos, de a -FRM-158-02. ri etría de Exploración Diferencial Calorimetría de Exploración Diferencial se 1 do un equipo TA Instruments Q1000. Muestras l iaron a -70°C y luego se sometieron a rampa a 20 r resolución fue necesaria, un método modulado se dos produjeron temperaturas de transición a vidri idatos a regulador de formulación. Muestras tieron a rampa de 0°C a 120°C. Este método se uar la temperatura de transición a vidrio d ilizado y para determinar las condiciones de almac ores HRV Los vectores de la invención se basan en nos, tales como el rhinovirus humano 14 (HRV14) d atógeno. La partícula de virus HRV14 y la est ma se ilustran esquemáticamente en la figura 1 tra proteínas estructurales de virus (VP1, VP2, V proteínas no estructurales (P2-A, P2-B, P2-C, P3- y 3D) , así como las ubicaciones de los sitios i ralizantes principales en HRV14 (Nims : NimI, NimI mlV) .

Un ejemplo de un clon molecular de HRV14 se en la invención es p R3.26 (Colección Am ivos de Tipo: Número ATCC: VRMC-7) . Este clon es d r detalle mas adelante, así como por Lee y colabor logy 67 (4) :2110-2122, 1993 (también ver el A encias 3) . Fuentes adicionales de HRV14 pueden usa enté con respecto a HRV14 , la invención se apli tipos de rhinovirus también.

Secuencias de antígenos pueden insertarse ores HRV, de acuerdo con la invención, en sitios d se describe adicionalmente mas adelante. En un ej encías se insertan dentro del sitio NimII de un se HRV14. NimII (Inmunógeno Neutralizante II) es nodominante en HRV14 que incluye al aminoácido 21 aminoácidos 156, 158, 159, 161, y 162 de VP2 (S a, "Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses" s of the National Public Health Institute 2/2006, andia, 2006) . En un ejemplo específico , descrito ma secuencias se insertan entre los aminoácidos 15 Las inserciones pueden hacerse en otros sitios opo NimII también. Por ejemplo, la inserción puede quiera de las posiciones 156, 158, 159, 161, o 16 iente secuencia, la cual representa los aminoácid RV14 VP1: NTPEVI KRKGDIKS (SEQ ID NO : 4 ) . Inserci quiera de los aminoácidos en esta región se incl nción. Por consiguiente, la invención incluye, po rciones entre los aminoácidos 274 y 275; 275 y 277 y 278; 278 y 279; 279 y 280; 280 y 281; 281 3; 283 y 284; 284 y 285; 285 y 286; 286 y 287; 28 y 289. Además de estas inserciones, la invenci rciones donde uno o mas (v.gr., 3, 4,' 5, 6, 7, 8 oácidos en esta región son suprimidos. Por consig ipio, la invención incluye inserciones entre los y 276; 275 y 277; 276 y 278; 277 y 279; 278 y 280; y 282; 281 y 283; 282 y 284; 283 y 285; 284 y 286; y 288; 287 y 289; 288 y 290; y 289 y 291.

Los vectores de la invención se hacen usan ndar de biología molecular, los cuales son ejempli nfluenza insertadas, en los extremos terminales oxilo. Estas secuencias enlazadoras pueden us orcionar flexibilidad a secuencias insertadas, p las secuencias insertadas presenten al epítopo in manera en la cual pueda inducir una respuesta inm plos de tales secuencias enlazadoras se propor ante. Identificación de las secuencias enlazad as con un inserto particular pueden llevarse a cab ejemplo, el método de clasificación de bibliot nción como se describe en la presenté. Brevement do, bibliotecas se construyen que tienen secuenci en una región deseada para identificación de zadoras efectivas. Virus generados a partir de la probados para viabilidad e inmunogenicidad de las rtadas, para identificar enlazadores efectivos. idos Heterólogos r. , como un politopo, en el cual los diferente en separarse por un enlazador flexible, tal como to de poliglicina de aminoácidos) , en diferen r. , los diferentes sitios Nim) , o en cualquier com ismos. Los diferentes epítopos pueden derivarse cie de patógeno, o pueden derivarse de diferente diferentes géneros. Los vectores pueden incluir idos, por ejemplo, múltiples copias de péptidos stan en la presente o combinaciones de péptidos ilos enlistados en la presente. Como un ejemplo, l en incluir péptidos M2e humanos y aviares (y/o sec enso de los mismos) .

Antígenos que pueden usarse en la invención var de, por ejemplo, agentes infecciosos tales c erias, y parásitos. Un ejemplo específico de tal ccioso es virus de la influenza, incluyendo aq especificación y en el Apéndice de Secuencias I eíficos de tales secuencias incluyen las s TEVETPIR E GCRCNDSSD (SEQ ID N0:1) ; MSLLTEVETPTR E ID NO: 5); MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD (SEQ ID NO: 6) ID NO: 2) ; SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO: 7) ; EWGCR (SEQ ID NO : 8 ) . Secuencias de M2e adiciona en usar en la invención incluyen secuencias d acelular de proteína BM2 de influenza B (consenso M O:9)), y el péptido M2e de la influenza aviar H5N TRNGWGCRCSDSSD (SEQ ID NO:6)).

Los péptidos incluidos en los vectores de la en incluir las secuencias completas, notadas ante agmentos incluyendo epítopos capaces de inducir la ológica deseada. Tales fragmentos pueden inclu mentos de aminoácidos 2-20, 3-18, 4-15, 5-12, ro estos péptidos. Además, secuencias de a ervado para influenza B (secuencia de TFNYTN PISHIRGS (SEQ ID NO:10)) . Ejemplos adic idos de influenza que pueden usarse en; la invenció roteínas a partir de los cuales se pueden der idos (v.gr. , por fragmentación) se describ /0165176, US 2003/0175290, US 2004/0055024, US 200 2004/0219170, US 2004/0223976, US 2005/004 /0003349, US 2005/0009008, US 2005/0186621, la 2,473, la patente US 5,374,717, la patente US 6,1 te US 6,720,409, la patente US 6,750,325, la 2,395, WO 93/15763, WO 94/06468, WO 94/17826, WO 96 7839, WO 99/58658, WO 02/14478, WO 2003/1 /053091, WO 2005/055957, y los Apéndices de Secue eferencias citadas en la misma) , los contenidos de corporan en la presente por referencia. Además, e las T y B inmunológicos/protectores conservados de os/veterinarios , tales como parásitos (v.gr., s virus patógenos (v.gr., virus del papiloma hum s de herpes simplex (HSV) , virus de inmunodeficien ; v.gr., gag) , y virus de hepatitis C (HCV) ) , y r. , Mycojbacterium tuberculosis, Clostridium di cobacter pylori) pueden incluirse también en los V nvención. Varios epítopos apropiados de esto genos pueden encontrarse fácilmente en la liter pio, epitopos/péptidos de protección cruzada a pa eína L2 del papilomavirus induciendo anticuerpos d ?? cruzada amplia que protegen de diferentes genot sido identificados por Schiller y colaboradores, aminoácidos 1-88, aminoácidos 1-200, o aminoácido roteína L2 de, v.gr., el virus HPV16 (WO 2006/ TCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO: 11)). Ejemplos de i ionales, así como antígenos y epítopos de estos nción son provistos en la Tabla 3. Como es notado pítopos que se usan en los vectores de la invenc epítopos de células B (es decir, epítopos neutral opos de células T (es decir, epítopos específicos udantes y T citotóxicas) .

I Los vectores de la invención se pueden egar antígenos además de antígenos derivados de pat pio, los vectores pueden usarse para entregar iados a tumores para usar en métodos inmunote ra cáncer. Numerosos antígenos asociados con t cidos en la materia y pueden administrarse de acue nción. Ejemplos de cánceres (y antígenos asociados espondientes) son como sigue: melanoma (proteín ecífreamente epítopo CTL localizado en las pos oácidos 157-165), CAMEL, MART 1, gplOO, proteínas con tirosina TRP1 y 2, y MUC1) ; adenocarcinoma lulas particulares (v.gr., células que incluyen los ligandos) en sujetos a los cuales se adrain ores .

El tamaño del péptido o proteína que se ins os vectores de la invención puede variar en longi plo, 3-1,000 aminoácidos en longitud, por ejemplo, OO, 20-55, 25-45, o 35-40 aminoácidos en longitu rmina que sea apropiado por los técnicos en la ma iguiente, péptidos en el rango de 10-25, 12-22 o cidos en longitud se pueden usar en la invenció péptidos mencionados en la presente pueden incluir :ionales o pueden reducirse en longitud, también S rminarse apropiado por los técnicos en la ma idos enlistados en la presente pueden estar prese ores de la invención como se muestra en la present ficarse mediante, v.gr., sustitución o supresión d ma del virus de la influenza (u otra fuente) ) o encías enlazadoras sintéticas) . Los péptidos uir, v.gr., 1-25, 2-20, 3-15, 4-10, o 4-8 sec oácidos en uno o ambos extremos. Como un ejemplo e éptido puede incluir 1-3 secuencias enlazador emos de terminales amino y/o carboxilo. nistración Cuando se usan en los métodos de inmuniz ores de la invención se pueden administrar como iláctico primario en adultos o niños en riesgo de un patógeno particular, tal como el virus de la vectores pueden también usarse como agentes secun ar a pacientes infectados mediante estimular una nológica contra el patógeno a partir del cual se geno de péptido. En el contexto de inmunizac e , las vacunas pueden administrarse contra sujeto ) . Otros adyuvantes adecuados para uso en admi ante la ruta mucosal (v.gr., rutas intranasa uyen la toxina lábil al calor de E. coli (LT) o tes de la misma. En el caso de virus desactivado, ntérales pueden usarse incluyendo, por I ejemplo, co inio (v.gr., un hidróxido de aluminio, fosfato de ompuesto de hidroxifosfato de aluminio) , for i sómales, adyuvantes sintéticos, tales como (v.g ptido de muramilo, lipido A de monofosforilo, o po Además, genes que codifican citoquinas vidades adyuvantes pueden insertarse dentro de lo a invención. Por ende, genes que codifican citoqu GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13, o IL-5, pueden insert genes de antígenos foráneos para producir una lta en respuestas inmunológicas acrecentadas, o p ismos o diferentes antígenos. Los métodos de comb nvención pueden incluir co-administración de v nción con otras formas del antígeno (v.gr., form ad o vehículos de entrega incluyendo proteína de titis (v.gr., partículas de núcleo de hepatitis B c éptido M2e en la superficie producida en E. coli s y colaboradores, Virus Res. 103:173-176, /055957; US 2003/0138769 Al; US 2004/014652 /0036826' Al)), o virus entero o 'parcial des rnativamente , los vectores de la presente invenc se en combinación con otros enfoques (tales como e unidad o Hbc) en una estrategia de c bador-refuer los vectores de la invención o los otros enfoq os como el cebador, seguido por el uso de otro en refuerzo, o a la inversa. Además, la invenci ategias de cebador- refuerzo empleando los vect ores pueden administrarse en la forma de gotas ñas lación de una formulación aerosolizada o nebul s pueden estar en forma liofiliada o disuelt ción o regulador fisiológicamente compatibles, ción salina o agua. Métodos de preparación y f ndar pueden usarse según se describe, por ej ngton's Pharmaceutical Sciences (18va. edición aro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pen dos Unidos. Además, determinación de una cantidad dosis apropiados puede determinarse fácilment ieos en la materia.

Los vectores de la invención pueden admin tos, tales como humanos, como vacunas vivas o des vacunas vivas pueden administrarse intranasalme dos conocidos por los técnicos en la materia (v berg y colaboradores, Am. J. Respir. Crit. Car. Me piado (v.gr., quitina o mutante LT; ver anteriorr S enfoques, puede ser ventajoso administrar m r . , 2 -3 ) dosis .

La invención se basa, en parte, en los plos experimentales .

Los contenidos de todas las publicaciones m riormente se incorporan en la presente por referen as de realización están dentro del alcance de las r es siguientes.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anti -cuerpo monoclonal aislado, d -cuerpo monoclonal se liga a un epítope en la regi a proteína hemaglutinina (HA) de un virus de la in raliza el virus de la influenza A. 2. El anti-cuerpo monoclonal de la reivind e dicho virus de la influenza es un virus de la o I . 3. El anti-cuerpo monoclonal de la reivind e dicho virus de la influenza en un virus de la in io Hl. 4. El anti-cuerpo monoclonal de la reivind e dicho virus de la influenza del cúmulo Hl es un uenza del cúmulo Hla o un virus de la influenza 5. El anti-cuerpo monoclonal de la reivin e dicho anti-cuerpo monoclonal inhibe la fusión d l y celular. 9. El anti -cuerpo monoclonal de la reivind í e dicho anti-cuerpo monoclonal compite con la li -cuerpo monoclonal D7, D8, FIO, G17, H40, A66, D80, 8 de la proteína HA. 10. El anti-cuerpo monoclonal de la reivind e dicho anti-cuerpo monoclonal es un anti-cuerpo o . 11. Un anti-cuerpo scFv aislado, donde d po se liga a un epítope de la proteína hemaglutini irus de la influenza, y neutraliza el virus de la 12. El anti-cuerpo de la reivindicación O virus de la influenza es un virus de la influenz - ope comprende el polipéptido HA1 y el polipéptido 17. El anti-cuerpo de la reivindicación 11 ope comprende el aminoácido en la posición 18, 3 polipéptido HA1 y el aminoácido en la posición 1 38, 41, 42, 45, 49, 52, 53 y 56 del polipéptido H 18. El anti-cuerpo de la reivindicación O anti-cuerpo inhibe la fusión de membrana viral 19. El anti-cuerpo monoclonal de la reivind e dicho anti-cuerpo compite con la ligadura del clonal D7, D8, FIO, G17, H40, A66, D80, E88, E90 eína HA. 20. Un método de impedir una enfermedad o ionado por un virus de la influenza, el método co nistrar a una persona en riesgo de sufrir de dicha cho desorden una cantidad terapéuticamente efectiv po monoclonal de la reivindicación 1 o el anti-cue bidor del canal de iones M2 es amantadina o riman 24. El método de la reivindicación 22, d bidor de neuraminidasa es zanamivir o fosfato de os 25. El método de la reivindicación 20 o la r 21, donde el método comprende administrar dos o pos específicos a un virus de la influenza del gr 26. El método de la reivindicación 20, la r 21 o la reivindicación 25, donde dicho método ás administrar un anti -cuerpo específico a un v uenza del grupo II. 27. El método de la reivindicación 20, d - cuerpo es administrado antes o después de expos s de la influenza. 28. El método de la reivindicación 20, d I -cuerpo es administrado en una dosis sufici ralizar dicho virus de la influenza. 31. El método de la reivindicación 30, d aco anti-viral es un inhibidor de neuráminidasa, u A., un inhibidor de ácido siálico, o un inhibidor d s M2. 32. El método de la reivindicación 31, d bidor del canal de iones M2 es amantadina o riman 33. El método de la reivindicación 31, d bidor de neuraminidasa es zanamivir o fosfato de os 34. El método de la reivindicación 29 o la r 30, donde el método comprende administrar dos o pos específicos a un virus de la influenza del g 35. El método de la reivindicación 29, la r 30 o la reivindicación 34, donde el método compre nistrar un anti-cuerpo específico a un virus de l grupo II. 36. El método de la reivindicación 29, d do además un fármaco anti-viral, un inhibidor 1, o un inhibidor de unión viral. 40. La composición de la reivindicación 0 fármaco anti -viral es un inhibidor de neurami bidor de HA, un inhibidor del ácido siálico, o un canales de iones M2. 41. El método de la reivindicación 40, d bidor del canal de iones M2 es amantadina o riman 42. El método de la reivindicación 40, d bidor de neuraminidasa es zanamivir o fosfato de OS 43. La composición de la reivindicación 38 do además uno o mas anti-cuerpos específicos a un uenza del grupo I . 44. La composición de la reivindicaci indicación 39 o la reivindicación 42, comprendiend -cuerpo especifico a un virus de la influenza del - - 95 -eína HA es producida en una célula no de mamífero 48. El método de la reivindicación 45, d eína HA es producida en células de insecto. 49. El método de la reivindicación 45, d eína HA comprende glicosilaciones modificadas en c una proteína HA tipo silvestre. 50. El método de la reivindicación 45, d eína HA está inmovilizada en dicha superficie sóli nmascarar la cabeza globular de dicha proteína HA 51. Un método de producir un anti-cuerpo a liga específicamente a una proteína hemagluti érica, que comprende (a) exponer una Fab de una s a biblioteca de expresión de Fab a dicha proteína a proteína HA está inmovilizada en una1 superficie s tificar un anti-cuerpo en dicha biblioteca qu eíficamente a dicha proteína; y (c) aislar el anti eína HA está inmovilizada en dicha superficie sóli nmascarar la cabeza globular de dicha proteína HA 56. El método de la reivindicación 51, d ioteca de expresión es una biblioteca no inmune. 57. El método de la reivindicación 51, d ioteca de expresión es una biblioteca H5 nativa. 58. Un método de vacunar un sujeto contra nfluenza, que comprende administrar a dicho eína hemaglutinina (HA) trimérica revestida o ado iz biológicamente compatible. 59. El método de la reivindicación 58, d eína HA tiene estructuras de carbohidratos no de 60. El método de la reivindicación 58, d eína HA comprende glicosilaciones modificadas en c una proteína HA tipo silvestre. 61. El método de la reivindicación 58, d -97- específicamente a dicha proteína; y (c) aisla po de la biblioteca. 63. El método de la reivindicación 62, d rficie sólida es plástica. 64. El método de la reivindicación 62, d eína de fusión de membrana es producida en una cé fero . 65. El método de la reivindicación 62, d eína de fusión de membrana tiene estructuras de car e mamífero. 66. El método de la reivindicación 62, d eína de fusión de membrana comprende glico I ficadas en comparación con una proteína de fusión silvestre. 67. El método de la reivindicación 62, d ioteca de expresión es una biblioteca; no inmune. 71. El método de la reivindicación 69, d eína de fusión comprende glicosilaciones modi aración con una proteína de fusión de membrana ti 72. Un método de detectar la presencia de nfluenza en una muestra, el método comprendiendo: a) poner en contacto la muestra con el a clonal de la reivindicación 1; y b) detectar la presencia o la ausencia de u -cuerpo-antígeno, con ello detectando la prese s de la influenza en una muestra. 73. El método de la reivindicación 72, cción ocurre in vivo, 74. El método de la reivindicación 72, tra es obtenida de sangre, pelo, frotado de mejill sia o semen. - nfluenza, y neutraliza el virus de la influenza A en La invención provee anti -cuerpos scFv human pos monoclonales que neutralizan el virus de la ién provistos son métodos de tratamiento y/o pre-enfermedad o un desorden relacionado con la infl la influenza aviar. La invención también provee ar a un paciente contra la influenza. También dos de diagnosticar enfermedades o desórdenes re la influenza y métodos de detectar la presencia de a muestra.