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MX2009000774A - Gen novedoso de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera. - Google Patents

Gen novedoso de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera.

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MX2009000774A
MX2009000774A MX2009000774A MX2009000774A MX2009000774A MX 2009000774 A MX2009000774 A MX 2009000774A MX 2009000774 A MX2009000774 A MX 2009000774A MX 2009000774 A MX2009000774 A MX 2009000774A MX 2009000774 A MX2009000774 A MX 2009000774A
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MX
Mexico
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plant
polypeptide
sequence
nucleic acid
protein
Prior art date
Application number
MX2009000774A
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Andre R Abad
Hua Dong
Sue B Lo
Xiaomei Shi
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Pioneer Hi Bred Int
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Publication date
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Abstract

La invención proporciona ácidos nucleicos, y variantes y fragmentos de los mismos, obtenidos de cepas de Bacillus thuringiensis que codifican polipéptidos que tienen actividad plaguicida contra plagas de insectos, que incluyen Lepidóptera. Modalidades particulares de la invención proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas plaguicidas, composiciones plaguicidas, construcciones de DNA, y microorganismos transformados y plantas que comprenden un ácido nucleico de las modalidades. Estas composiciones encuentran uso en métodos para controlar plagas, especialmente plagas de insectos.

Description

GEN NOVEDOSO DE BACILLUS THURINGIENSIS CON ACTIVIDAD LEPIDÓPTERA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a ácidos nucleicos que ocurren naturalmente y recombinantes obtenidos de genes novedosos de Bacillus thuringiensis que codifican polipéptidos plaguicidas o pesticidas caracterizados por actividad plaguicida contra plagas de insectos. Las composiciones y métodos de la invención utilizan los ácidos nucleicos divulgados, y sus polipéptidos plaguicidas codificados, para controlar plagas de plantas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de insectos son un factor mayor en la pérdida de los cultivos de la agricultura mundial. Por ejemplo, la alimentación del gusano devastador, el daño de la oruga cortadora negra o el daño del barrenillo de maíz Europeo puede ser económicamente devastador para los productores de la agricultura. La pérdida de cultivos relacionada con plagas de insectos a partir de los ataques del barrenillo de maíz Europeo sobre el campo y el maíz dulce solamente, ha alcanzado aproximadamente un billón de dólares al año en el daño y los gastos de control. Tradicionalmente, el método primario para impactar las poblaciones de plagas de insectos es la aplicación de insecticidas químicos de amplio espectro. Sin embargo, los consumidores y reguladores gubernamentales igualmente están llegando a estar cada vez más interesados con los peligros ambientales asociados con la producción y uso de plaguicidas químicos sintéticos. Debido a tales problemas, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los plaguicidas más peligrosos. Así, hay interés sustancial en desarrollar plaguicidas alternativos. El control biológico de plagas de insectos de significado agrícola utilizando un agente microbiano, tales como hongos, bacterias u otras especies de insectos proporciona una alternativa ambientalmente favorable y comercialmente atractiva para los plaguicidas químicos sintéticos. Generalmente hablando, el uso de bioplaguicidas o biopesticidas presenta un menor riesgo de contaminación y peligros ambientales, y los bioplaguicidas proporcionan especificidad objetivo más grande que es característico de los insecticidas químicos de amplio espectro tradicionales. Además, los bioplaguicidas frecuentemente cuestan menos de producir y de esta manera mejoran el rendimiento económico para una amplia variedad de cultivos. Ciertas especies de microorganismos del género Bacillus se conocen que poseen actividad plaguicida contra una amplia gama de plagas de insectos que incluyen Lepidoptera, Díptera, Coleóptera, Hemíptera y otros. Bacillus thuringiensis (Bt) y Bacillus papilliae están entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenicidad de insectos también se ha atribuido a cepas de B. larvae, B. lentimorbus , B. sphaericus (Harwook, ed., ((1989) Bacillus (Plenum Press), 306) y B. cereus (WO 96/10083) . La actividad plaguicida se presenta que es concentrada en inclusiones de proteínas cristalinas parasporales , aunque las proteínas plaguicidas también se han aislado de la etapa de crecimiento vegetativo de Bacillus . Varios genes que codifican estas proteínas plaguicidas se han aislado y caracterizado (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,366,892 y 5,840,868). Los insecticidas microbianos, particularmente aquellos obtenidos de cepas de Bacillus , han desempeñado una función importante en la agricultura como alternativas al control químico de- plagas. Recientemente, los científicos de la agricultura han desarrollado plantas de cultivo con resistencia aumentada a insectos al diseñar genéticamente plantas de cultivo para producir proteínas plaguicidas a partir de Bacillus . Por ejemplo, las plantas de maíz y de algodón se han diseñado genéticamente para producir proteínas plaguicidas aisladas de las cepas de Bt (ver, por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59 ( 3 ) : 417 -425 ; Schnepf y colaboradores, (1998) Microbiol Mol Biol Rev . 62 ( 3 ) : 75-806 ) . Estos cultivos genéticamente diseñados ahora son ampliamente utilizados en la agricultura Americana y han proporcionado al granjero con una alternativa ambientalmente favorable a los métodos de control de insectos tradicionales. Además, las papas genéticamente diseñadas para contener toxinas de Cry plaguicidas se han vendido al granjero Americano. Mientras que se han probado que son muy exitosas comercialmente , estas plantas de cultivo resistentes a insectos, genéticamente diseñadas proporcionan resistencia a solo una gama reducida de las plagas de insectos económicamente importantes. Por consiguiente, aun permanece una necesidad por nuevas toxinas de Bt con un intervalo más amplio de actividad insecticida contra plagas de insectos, por ejemplo, toxinas que sean activas contra una variedad más grande de insectos del orden Lepidoptera . Además, aun permanece una necesidad por bioplaguicidas que tengan actividad contra una variedad de plagas de insectos y por bioplaguicidas que tengan actividad insecticida mejorada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para impactar plagas de insectos. Más específicamente, las modalidades de la presente invención se relacionan a métodos para impactar insectos utilizando secuencias de nucleótidos que codifican péptidos insecticidas para producir microorganismos y plantas transformadas que expresan un polipéptido insecticida de las modalidades. Tales plagas incluyen plagas agrícolamente significantes, tales como, por ejemplo: barrenillo de maíz Europeo, por ejemplo Ostrinia nubilalis Hübner. En algunas modalidades, las secuencias de nucleótidos codifican polipéptidos que son plaguicidas para por lo menos un insecto que pertenece al orden Lepidoptera. Las modalidades proporcionan un ácido nucleico y fragmentos y variantes del mismo que codifican polipéptidos que poseen actividad plaguicida contra plagas de insectos (por ejemplo SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID N0:2). La secuencia de nucleótidos de tipo silvestre (por ejemplo, que ocurre naturalmente) de las modalidades, que se obtuvo de Bt, codifica un péptido insecticida novedoso. Las modalidades además proporcionan fragmentos y variantes de la secuencia de nucleótidos divulgada que codifican polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, insecticidas). Las modalidades además proporcionan polipéptidos plaguicidas (por ejemplo, insecticidas) aislados, codificados por ya sea un ácido nucleico que ocurre naturalmente, o uno modificado (por ejemplo, mutagenizado o manipulado) de las modalidades. En ejemplos particulares, las proteínas plaguicidas de las modalidades incluyen fragmentos de proteínas y polipéptidos de longitud completa que se producen a partir de ácidos nucleicos mutagenizados diseñados para introducir secuencias de aminoácidos particulares en los polipéptidos de las modalidades. En modalidades particulares, los polipéptidos tienen actividad plaguicida aumentada con relación a la actividad del polipéptido que ocurre naturalmente del cual se derivan. Los ácidos nucleicos de las modalidades también se pueden utilizar para producir plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas transgénicas (por ejemplo, transformadas) que se caracterizan por genomas que comprenden por lo menos una construcción de nucleótidos establemente incorporada que comprende una secuencia de codificación de las modalidades operablemente enlazada a un promotor que induce la expresión del polipéptido plaguicida codificado. Por consiguiente, también se proporcionan células de plantas, tejidos de plantas, plantas y semillas transformadas de las mismas. En una modalidad particular, una planta transformada se puede producir utilizando un ácido nucleico que se ha optimizado para la expresión incrementada en una planta hospedera. Por ejemplo, uno de los polipéptidos plaguicidas de las modalidades puede ser traducido hacia atrás para producir un ácido nucleico que comprende codones optimizados para la expresión en un hospedero particular, por ejemplo una planta de cultivo tal como una planta de maíz (Zea mays) . La expresión de una secuencia de codificación por tal planta transformada (por ejemplo, dicotiledónea o monocotiledónea ) dará por resultado la producción de un polipéptido plaguicida y conferirá resistencia incrementada a insectos a la planta. Algunas modalidades proporcionan plantas transgénicas que expresan polipéptidos plaguicidas que encuentran uso en métodos para impactar varias plagas de insectos . Las modalidades además incluyen composiciones plaguicidas o insecticidas que contienen los polipéptidos insecticidas de las modalidades, y opcionalmente pueden comprender péptidos insecticidas adicionales. Las modalidades abarcan la aplicación de tales composiciones al medio ambiente de las plagas de insectos con el fin de impactar las plagas de insectos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención se dirigen a composiciones y métodos para impactar plagas de insectos, en particular plagas de plantas. Más específicamente, el ácido nucleico aislado de las modalidades, y fragmentos y variantes del mismo, comprenden secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos plaguicidas (por ejemplo, proteínas) . Las proteínas plaguicidas divulgadas son biológicamente activas (por ejemplo, plaguicidas) contra plagas de insectos tales como, pero no limitadas a, plagas de insectos del orden Lepidoptera . Las plagas de insectos de interés incluyen, pero no están limitadas a: barrenillo de maíz Europeo, por ejemplo, Ostrinia nubilalis ; gusano de mazorca de maíz, por ejemplo, Helicoverpa zeae; barrenillo de tallo común, por ejemplo, Papiapema nebris; gusano devastador, por ejemplo, Pseu aletia unipuncta ; barrenillo de maíz del sudoeste, por ejemplo, Diatraea grandiosella ; oruga cortadora negra, por ejemplo, Agrotis ípsilon; gusano devastador del otoño, por ejemplo, Spodoptera frugiperda ; gusano devastador de remolacha, por ejemplo, Spodoptera exigua; y polilla de espalda de diamante, por ejemplo, Plutella xylostella. Las composiciones de las modalidades comprenden ácidos nucleicos aislados, y fragmentos y variantes de los mismos, que codifican polipéptidos plaguicidas, casetes de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos de las modalidades, proteínas plaguicidas aisladas y composiciones plaguicidas. Algunas modalidades proporcionan polipéptidos plaguicidas modificados caracterizados por actividad insecticida mejorada contra Lepidópteros con relación a la actividad plaguicida de la proteína de tipo silvestre correspondiente. Las modalidades además proporcionan plantas y microorganismos transformados con estos ácidos nucleicos novedosos, y métodos que involucran el uso de tales ácidos nucleicos, composiciones plaguicidas, organismos transformados y productos de los mismos en el impacto de plagas de insectos. Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las modalidades se pueden utilizar para transformar cualquier organismo para producir las proteínas plaguicidas codificadas. Se proporcionan métodos que involucran el uso de tales' organismos transformados para impactar o controlar plagas de plantas. Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las modalidades también se pueden utilizar para transformar organelos tales como cloroplastos (McBride y colaboradores, (1995) Biotechnology 13:362-365; y Kota y colaboradores, (1999) Proc. Nati. Acad . Sci. USA 96:1840-1845) . Las modalidades además se relacionan a la identificación de fragmentos y variantes de la secuencia de codificación que ocurre naturalmente que codifica proteínas plaguicidas biológicamente activas. Las secuencias de nucleótidos de las modalidades encuentran uso directo en métodos para impactar plagas, particular plagas de insectos tales como plagas del orden Lepidoptera. Por consiguiente, las modalidades proporcionan nuevos procedimientos para impactar plagas de insectos que no dependen del uso de insecticidas químicos sintéticos, tradicionales. Las modalidades involucran el descubrimiento de plaguicidas biodegradables , que ocurren naturalmente y los genes que los codifican . Las modalidades además proporcionan fragmentos y variantes de la secuencia de codificación que ocurre naturalmente que también codifican polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, plaguicidas). Los ácidos nucleicos de las modalidades abarcan secuencias de ácido nucleico o de nucleótidos que se han optimizado para la expresión por las células de un organismo particular, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que se han traducido hacia atrás (es decir, traducidas inversamente) utilizando codones de planta preferidos basados sobre la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene actividad plaguicida aumentada. Las modalidades además proporcionan mutaciones que confieren propiedades mejoradas o alteradas sobre los polipéptidos de las modalidades. Ver, por ejemplo, las solicitudes norteamericanas copendientes Nos. 10/606,320, presentada el 25 de Junio del 2003 y 10/746,914, presentada el 24 de Diciembre del 2003. En la descripción que sigue, un número de términos se utilizan extensivamente. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de las modalidades . Las unidades, prefijos y símbolos pueden ser denotados en su forma SI aceptada. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' ; las secuencias de aminoácidos están escritos de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi respectivamente. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra, recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los términos definidos en lo anterior son más completamente definidos por referencia a la especificación como un conjunto. Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero de deoxiribonucleótido o ribonucleótido en forma de ya sea una sola o doble hebra, y a menos que se limite de otra manera abarca análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido) que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que hibridan a ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar a aquellos de los nucleótidos que ocurren naturalmente . Como se utiliza en la presente, los términos "que codifica" o "codificado" cuando se utilizan en el contexto de un ácido nucleico especificado significan que el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia de nucleótidos a una proteína especificada. La información mediante la cual una proteína es codificada se especifica por el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o pueden carecer de tales secuencias no traducidas de intervención (por ejemplo, como en cDNA) . Como se utiliza en la presente, "secuencia de longitud completa" en referencia a un polinucleótido especificado o su proteina codificada significa que tiene la secuencia de ácido nucleico completa o la secuencia de aminoácidos completa de una secuencia endógena nativa (no sintética) . Un polinucleótido de longitud completa codifica la forma catalíticamente activa de longitud completa de la proteína especificada. Como se utiliza en la presente, el término "antisentido" utilizado en el contexto de orientación de una secuencia de nucleótidos se refiere a una secuencia de polinucleótido que está operablemente enlazado a un promotor en una orientación donde la hebra de antisentido es transcrita. La hebra de antisentido es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno tal que la traducción del producto de transcripción endógeno es frecuentemente inhibido. Así, donde el término "antisentido" se utiliza en el contexto de una secuencia de nucleótidos particular, el término se refiere a la hebra complementaria del producto de transcripción de referencia. Los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, así como polímeros de aminoácidos que ocurren naturalmente. Los términos "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un aminoácido que es incorporado en una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido que ocurre naturalmente y, a menos que se limite de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar como aminoácidos que ocurren naturalmente . Los polipéptidos de las modalidades se pueden producir ya sea de un ácido nucleico divulgado en la presente, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándares. Por ejemplo, una proteína de las modalidades se puede producir mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante de las modalidades en una célula hospedera o apropiada, o alternativamente mediante una combinación de procedimientos ex vivo. Como se utiliza en la presente, los términos "aislado" y "purificado" se utilizan intercambiablemente para referirse a ácidos nucleicos o polipéptidos o porciones biológicamente activas de los mismos que están sustancialmente o esencialmente libres de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el ácido nucleico o polipéptido como es encontrado en su medio ambiente que ocurre naturalmente. Asi, un ácido nucleico o polipéptido aislado o purificado está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes , o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Un ácido nucleico "aislado" está generalmente libre de secuencias (tales como, por ejemplo, secuencias que codifican proteínas) que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, los ácidos nucleicos aislados pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquean los ácido nucleicos en el DNA genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Como se utiliza en la presente, el término "aislado" o "purificado" como se utiliza en la presente para referirse a un polipéptido de las modalidades significa que la proteína aislada está sustancialmente libre de material celular e incluye preparaciones de proteína que tienen menor que aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de las modalidades o porción biológicamente activa de la misma es recombinantemente producida, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas no de proteína de interés . Por toda la especificación la palabra "que comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", será entendido que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa establecida, o un grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. Como se utiliza en la presente, el término "impacto de plagas de insectos" se refiere a efectuar cambios en la alimentación, crecimiento y/o comportamiento del insecto en cualquier etapa de desarrollo, incluyendo pero no limitado a: exterminación del insecto; retardo del crecimiento; prevención de la capacidad reproductora; actividad antialimentante y los similares. Como se utiliza en la presente, los términos "actividad plaguicida" y "actividad insecticida" se utilizan sinónimamente para referirse a la actividad de un organismo o una sustancia (tal como, por ejemplo, una proteína) que se puede medir mediante, pero no está limitada a, la mortalidad de la plaga, la pérdida de peso de la plaga, repelencia de la plaga y otros cambios de comportamiento y físicos de una plaga después de la alimentación y la exposición por una duración de tiempo apropiada. Así, un organismo o sustancia que tiene actividad plaguicida impacta adversamente por lo menos un parámetro medióle en la condición de la plaga. Por ejemplo, "proteínas plaguicidas" son proteínas que exhiben actividad plaguicida por si mismas o en combinación con otras proteínas. Como se utiliza en la presente, el término "cantidad plaguicidamente efectiva" connota una cantidad de una sustancia u organismo que tiene actividad plaguicida cuando está presente en el medio ambiente de una plaga. Para cada sustancia u organismo, la cantidad plaguicidamente efectiva se determina empíricamente para cada plaga afectada en un ambiente específico. De manera similar, una "cantidad insectici.damente efectiva" se puede utilizar para referirse a una "cantidad plaguicidamente efectiva" cuando la plaga es una plaga de insectos. Como se utiliza en la presente, el término "recombinantemente .diseñado" o "diseñado" connota la utilización de la tecnología de DNA recombinante para introducir (por ejemplo, diseñar) un cambio en la estructura de proteína basada sobre un entendimiento del mecanismo de acción de la proteína y una consideración de los aminoácidos que son introducidos, suprimidos o sustituidos. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de nucleótidos mutantes" o "mutaciones" o "secuencia de nucleótidos mutagenizada" connota una secuencia de nucleótidos que se han mutagenizado o alterado para contener uno o más residuos de nucleótidos (por ejemplo, pares de bases) que no está presente en la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Tal mutagénesis o alteración consiste de una o más adiciones, supresiones o sustituciones o reemplazos de residuos de ácido nucleico. Cuando se hacen mutaciones al adicionar, remover o reemplazar un aminoácido de un sitio 'proteolítico, tal adición, remoción o reemplazo puede estar dentro o adyacente a la porción de sitio proteolítico, mientras que el objetivo de la mutación se ha realizado (es decir, mientras que se cambie la proteólisis en el sitio) . Una secuencia de nucleótidos mutante puede codificar una toxina insecticida mutante que muestra actividad insecticida mejorada o disminuida o una secuencia de aminoácidos que confiere actividad insecticida mejorada o disminuida sobre un .polipéptido que lo contiene. Como se utiliza en la presente, el término "mutante" o "mutación" en el contexto de una proteína, un polipéptido o secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia que se ha mutagenizado o alterado para contener uno o más residuos de aminoácidos que no están presentes en la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Tal mutagénesis o alteración consiste de una o más adiciones, supresiones o sustituciones o reemplazos de residuos de aminoácidos. Un polipéptido mutante · muestra actividad insecticida mejorada o disminuida, o representa una secuencia de aminoácidos que confiere actividad insecticida mejorada sobre un polipéptido que lo contiene. Asi, el término "mutante" o "mutación" se refiere a cualquiera o ambas o de la secuencia de nucleótidos mutante y los aminoácidos codificados. Los mutantes se pueden utilizar solos o en cualquier combinación compatible con otros mutantes de las modalidades o con otros mutantes. Un "polipéptido mutante" puede mostrar a la inversa una disminución en la actividad insecticida. Donde más de una mutación se adiciona a un ácido nucleico o proteína particular, las mutaciones se pueden adicionar al mismo tiempo secuencialmente ; si es secuencialmente, las mutaciones se pueden adicionar en cualquier orden adecuado. Como se utiliza en la presente, el término "actividad de insecticida mejorada" o "actividad plaguicida mejorada" se refiere a un polipéptido insecticida de las modalidades que tiene actividad insecticida aumentada con relación a la actividad de su proteína de tipo silvestre correspondiente, y/o un polipéptido insecticida que es efectivo contra un gama más amplia de insectos, y/o un polipéptido insecticida que tiene especificidad para un insecto que no es susceptible a la toxicidad de la proteina de tipo silvestre. Un descubrimiento de la actividad plaguicida mejorada o aumentada requiere una demostración de un incremento de la actividad plaguicida de por lo menos 10%, contra el objetivo de insecto, o por lo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200% o 300% o más grande incremento de actividad plaguicida con relación a la actividad plaguicida del polipéptido insecticida de tipo silvestre determinada contra el mismo insecto. Por ejemplo, se proporciona una actividad plaguicida o insecticida mejorada donde una gama más amplia o más reducida de insectos es impactada por el polipéptido con relación a la gama de insectos que es afectada por una toxina Bt de tipo silvestre. Una gama más amplia de impacto puede ser deseable donde se desea versatilidad, mientras que una gama más reducida de impacto puede ser deseable donde, por ejemplo, los insectos benéficos de otra manera podrían ser impactados por el uso o presencia de la toxina. Mientras que las modalidades no están limitadas a algún mecanismo de acción particular, una actividad plaguicida mejorada también se puede proporcionar por cambios en uno o más características de un polipéptido; por ejemplo, la estabilidad o longevidad de un polipéptido en el intestino de un insecto puede ser incrementada con relación a la estabilidad o longevidad de una proteína de tipo silvestre correspondiente . El término "toxina" como se utiliza en la presente se refiere a un pólipéptido que muestra actividad plaguicida o actividad insecticida o actividad plaguicida mejorada o actividad insecticida mejorada. Toxina "Bt" o "Bacillus thuringiensis" se propone para incluir la clase más amplia de toxinas Cry encontradas en varias cepas de Bt, que incluye tales toxinas como, por ejemplo, Cryls, Cry2s o Cry3s. Los términos "sitio proteolítico" o "sitio de segmentación" se refiere a una secuencia de aminoácidos que confiere sensibilidad a una clase de proteasas o una proteasa particular tal que un pólipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos es digerido por la clase de proteasas o proteasa particular. Un sitio proteolí ico se dice que es "sensible" a la proteasa (s) que reconoce ese sitio. Se aprecia en la técnica que la eficiencia de digestión variará, y que una disminución en la eficiencia de digestión puede conducir a un incremento en la estabilidad o longevidad del pólipéptido en un intestino del insecto. Así, un sitio proteolítico puede conferir sensibilidad a más de una proteasa o clase de proteasas, pero la eficiencia de digestión en ese sitio por varias proteasas puede variar. Los sitios proteolíticos incluyen, por ejemplo, sitios de tripsina, sitios de quimotripsina y sitios de elastasa. La investigación ha mostrado que las proteasas del intestino de insecto de Lepidópteros incluyen tripsinas, quimotripsinas y elastasas. Ver, por ejemplo, Lenz y colaboradores, (1991) ñrch. Insect Biochem. Physiol. 16:201 -212; y Hedegus y colaboradores, (2003) Arch . Insect Biochem. Physiol. 53:30-47. Por ejemplo, aproximadamente 18 tripsinas diferentes se han encontrado en el intestino medio de las larvas de Helicoverpa armígera (ver Gatehouse y colaboradores, (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27:929-944). Los sitios de sustrato proteoliticos preferidos de estas proteasas han sido investigados. Ver, por ejemplo, Peterson y colaboradores, (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25:765-77 . Se han hecho esfuerzos para entender el mecanismo de acción de las toxinas Bt y para diseñar toxinas con propiedades mejoradas. Se ha mostrado que las proteasas del intestino del insecto pueden afectar el impacto de las proteínas Bt Cry sobre el insecto. Algunas proteasas activan la proteína Cry al procesarlas a partir de una forma de "protoxina" en una forma tóxica, o "toxina". Ver, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42:1-12; y Carroll y colaboradores, (1997) J. Invertebrate Pathology 70:41-49. Esta activación de la toxina puede incluir la remoción de los péptidos N- y C-terminales de la proteína y también pueden incluir la segmentación interna de la proteína. Otras proteasas pueden degradar las proteínas Cry. Ver Oppert, ibid. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de las toxinas Cry de diferentes especificidades revela cinco bloques de secuencia altamente conservados. Estructuralmente, las toxinas comprenden tres dominios distintos que son, del N- a C-terminal: una agrupación de siete alfa-hélices implicadas en la formación de poro (referida como "dominio 1", tres láminas de beta antiparalelas implicadas en el enlace de las células (referida como "dominio 2"), y una intercalación beta (referida como "dominio 3"). La ubicación y las propiedades de estos dominios son conocidas para aquellos de habilidad en la técnica. Ver, por ejemplo, Li y colaboradores, (1991) Nature, 305:815-821 y Morse y colaboradores, (2001) Structure, 9:409-417. Cuando se hace referencia a un dominio particular, tal como el dominio 1, se entiende que los puntos de extremo exacto del dominio con respecto a una secuencia particular no son críticos mientras que la secuencia o porción de la misma incluya la secuencia que proporciona por lo menos alguna función atribuida al dominio particular. Así, por ejemplo, cuando se refiere a "dominio 1" se propone que una secuencia particular incluye una agrupación de siete alfa-hélices, pero los puntos de extremos exactos de la secuencia utilizados o referidos con respecto a esa agrupación no son críticos. Uno de habilidad en la técnica está familiarizado con la determinación de tales puntos de extremo y la evaluación de tales funciones. En un esfuerzo para mejor caracterizar y mejorar las toxinas Bt, se estudiaron cepas de la bacteria Bt. Preparaciones de cristal preparadas a partir de cultivos de las cepas de Bt se descubrieron que tienen actividad plaguicida contra el barrenillo de maíz Europeo, gusano de mazorca de maíz, y oruga cortadora negra (ver el Ejemplo 1) . Se llevó a cabo un esfuerzo para identificar las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de cristal de la cepa seleccionada y los ácidos nucleicos de tipo silvestre (es decir, que ocurre naturalmente) de las modalidades se aislaron de estas cepas bacterianas, se clonaron en un vector de expresión y se transformaron en E. coli. Dependiendo de las características de una preparación dada, se reconoció que la demostración de la actividad plaguicida algunas veces requirió el pretratamiento con tripsina para activar las proteínas plaguicidas. Así, se entiende que algunas proteínas plaguicidas requieren digestión de proteasas (por ejemplo, mediante tripsina, quimotripsina y los similares) para la activación, mientras que otras proteínas son biológicamente activas (por ejemplo, plaguicida) en la ausencia de activación . Tales moléculas pueden ser alteradas por medios descritos, por ejemplo, en las solicitudes norteamericanas Nos. 10/606,320, presentada el 25 de Junio del 2003, y 10/746,914, presentada el 24 de Diciembre del 2003. Además, las secuencias de ácido nucleico pueden ser diseñadas para codificar polipéptidos que contienen mutaciones adicionales que confieren actividad plaguicida mejorada o alterada con relación a la actividad plaguicida del polipéptido que ocurre naturalmente. Las secuencias de nucleótidos de tales ácidos nucleicos diseñados comprenden mutaciones no encontradas en la secuencia de tipo silvestre. Los polipéptidos mutantes de las modalidades generalmente se preparan mediante un proceso que involucra las etapas de: obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de familia Cry; analizar la estructura del polipéptido para identificar sitios "objetivo" particulares para la mutagénesis de la secuencia de gen implícita basado en una consideración de la función propuesta del dominio objetivo en el modo de acción de la toxina; introducir una o más mutaciones en la secuencia de ácido nucleico para producir un cambio deseado en uno o más residuos de aminoácido de la secuencia de polipéptido codificada; y analizar el polipéptido producido para la actividad plaguicida. Muchas de las toxinas insecticidas- Bt están relacionadas con varios grados por similitudes en sus secuencias de aminoácidos y estructura terciaria y medios para obtener las estructuras de cristal de las toxinas Bt con bien conocidos. La solución de estructura de cristal de alta resolución ejemplar de ambos de los polipéptidos Cry3A y Cry3B están disponibles en la literatura . La estructura resuelta del gen Cry3A (Li y colaboradores, (1991) Nature 353:815-821) proporciona discernimiento en la relación entre la estructura y la función de la toxina. Una consideración combinada de los análisis estructurales publicados de las toxinas Bt y la función reportada asociada con las estructuras particulares, porciones y los similares indican que las regiones especificas de la toxina están correlacionadas con funciones particulares y etapas discretas del modo de acción de la proteina. Por ejemplo, muchas toxinas aisladas de Bt son generalmente descritas como que comprenden tres dominios: un amontonamiento de siete hélices que está involucrado en la formación de poro, un dominio de tres láminas que se han implicado en el enlace del receptor, y una porción de intercalación beta (Li y colaboradores, (1991) Nature 305:815-821). Como se reporta en la patente norteamericana No. 7,105,332, y la ' solicitud norteamericana copendiente No. 10/746,914, presentada el 24 de Diciembre del 2003, la toxicidad de las proteínas Cry se pueden mejorar al dirigir la región localizada entre las alfa hélices 3 y 4 del dominio 1 de la toxina. Esta teoría se estableció como premisa sobre un caudal de conocimiento concerniente a toxinas insecticidas, que incluyen: 1) que las alfa hélices 4 y 5 del dominio 1 de las toxinas Cry3ñ se ha reportado que se inserta en la bicapa de lipido de las células que recubren el intestino medio de los insectos susceptibles (Gazit y colaboradores, (1998) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 95:12289-12294); 2) el conocimiento de los inventores de la ubicación de los sitios de segmentación de tripsina y quimotripsina dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteina de tipo silvestre; 3) la observación de que la proteina de tipo silvestre fue más activa contra ciertos insectos después de la activación in vitro mediante el tratamiento con tripsina o quimotripsina; y 4) reportes de que la digestión de las toxinas desde el extremo 3' dio por resultado toxicidad disminuida a los insectos. Una serie de mutaciones se puede crear y colocar en una variedad de secuencias antecedentes para crear polipéptidos novedosos que tienen actividad plaguicida aumentada o alterada. Ver, por ejemplo, las solicitudes norteamericanas Nos. 10/606,320, presentada el 25 de Junio del 2003, ahora abandonada, y 10/746,914, presentada el 24 de Diciembre del 2003. Estos mutantes incluyen, pero no están limitados a: la adición de por lo menos un sitio más sensible a la proteasa (por ejemplo, sitio de segmentación de tripsina) en la región localizada entre las hélices 3 y 4 del dominio 1; el reemplazo de un sitio sensible a proteasa original en la secuencia de tipo silvestre con un sitio sensible a proteasa diferente; la adición de múltiples sitios sensibles a proteasa en una ubicación particular; la adición de residuos de aminoácidos cerca del sitio (s) sensible a la proteasa para alterar el plegamiento del polipéptido y de esta manera aumentar la digestión del polipéptido en el sitio (s) sensible a la proteasa; y adicionar mutaciones para proteger el polipéptido de la digestión degradante que reduce la toxicidad (por ejemplo, haciendo una serie de mutaciones en donde el aminoácido de tipo silvestre es reemplazado por valina para proteger al polipéptido de la digestión. Las mutaciones se pueden utilizar individualmente o en cualquier combinación para proporcionar polipéptidos de las modalidades . De esta manera, las modalidades proporcionan secuencias que comprenden una variedad de mutaciones, tales como, por ejemplo, una mutación que comprende un sitio sensible a proteasa adicional, o uno alternativo ubicado entre las alfa-hélices 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado. Una mutación que es un sitio sensible a la proteasa adicional o alternativo puede ser sensible a varias clases de proteasas tales como serina proteasas, que incluyen tripsina y quimotripsina , o enzimas tales como elastasa. Asi, una mutación que es un sitio sensible a la proteasa adicional o alternativo puede ser diseñado de modo que el sitio es fácilmente reconocido y/o segmentado por una categoría de proteasas, tales como proteasas mamíferas o proteasas de insectos. Un sitio sensible a proteasa también puede ser diseñado para ser segmentado por una clase particular de enzimas o una enzima particular conocida que es producida en un organismo, tal como, por ejemplo, una quimotripsina producida por el gusano de mazorca de maíz Heliothis zea (Lenz y colaboradores, (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212). Las mutaciones también pueden conferir Resistencia a la digestión proteolítica , por ejemplo, a la digestión por quimotripsina en C-terminal del péptido. La presencia de un sitio sensible a proteasa adicional y/o alternativo en las secuencias de aminoácidos del polipéptido codificado puede mejorar la actividad plaguicida y/o especificidad del polipéptido codificado por los ácidos nucleicos de las modalidades. Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos de las modalidades pueden ser diseñadas recombinantemente o manipuladas para producir polipéptidos que tienen actividad insecticida mejorada o alterada y/o especificidad comparada con aquella de una toxina de tipo silvestre no modificada. Además, las mutaciones divulgadas en la presente se pueden colocar en o utilizar en conjunción con otras secuencias de nucleótidos para proporcionar propiedades mejoradas. Por ejemplo, un sitio sensible a proteasa que es fácilmente segmentado mediante la quimotripsina de insecto, por ejemplo, una quimotripsina encontrada en el gusano devastador bertha o el gusano de mazorca de maíz (Hegedus y colaboradores, (2003) Arch . Insect Biochem. Physiol. 53:30-47; y Lenz y colaboradores, (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201 -212), se puede colocar en una secuencia antecedente de Cry para proporcionar toxicidad mejorada a esa secuencia. De esta manera, las modalidades proporcionan polipéptidos tóxicos con propiedades mejoradas. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos Cry mutagenizada puede comprender mutantes adicionales que comprenden codones adicionales que introducen una segunda secuencia de aminoácidos sensible a tripsina (además del sitio de tripsina que ocurre naturalmente) en el polipéptido codificado. Un mutante de adición alternativo de las modalidades, comprende codones adicionales diseñados para introducir por lo menos un sitio sensible a proteasa diferente adicional en el polipéptido, por ejemplo, un sitio sensible a proteasa ubicado inmediatamente 5' o 3' del sitio de tripsina que ocurre naturalmente. Alternativamente, los mutantes de sustitución se pueden crear en los cuales por lo menos un codón del ácido nucleico que codifica el sitio sensible a proteasa que ocurre naturalmente es destruido y codones alternativos se introducen en la secuencia de ácido nucleico con el fin de proporcionar un sitio sensible a proteasa diferente (por ejemplo, sustituto). Un mutante de reemplazo también se puede adicionar a una secuencia Cry en la cual el sitio de segmentación de tripsina que ocurre naturalmente presente en el polipéptido codificado se destruye y un sitio de segmentación de quimotripsina o de elastasas se introduce en su lugar. Se reconoce que cualquier secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos que son sitios proteoliticos o sitios proteolí icos putativos (por ejemplo, secuencias tales como NGSR, RR o LKM) se pueden utilizar y que la identidad exacta de los codones utilizados para introducir cualquiera de estos sitios de segmentación en un polipéptido variante pueden variar dependiendo del uso, es decir, la expresión en una especie de planta particular. También se reconoce cualquiera de las mutaciones divulgadas se puede introducir en cualquier secuencia de polinucleótido de las modalidades que comprenden los codones para residuos de aminoácidos que proporcionan el sitio de segmentación de tripsina nativo que es dirigido para la modificación. Por consiguiente, las variantes de ya sea toxinas de longitud completa o fragmentos de las mismas se pueden modificar para contener sitios de segmentación adicionales o alternativas, y estas modalidades se proponen para estar abarcadas por el alcance de las modalidades divulgadas en la presente.
Seré apreciado por aquellos expertos en la técnica que cualquier mutación útil se puede adicionar a la secuencia de las modalidades mientras que los polipéptidos codificados retengan la actividad plaguicida. Asi, las secuencias también se pueden mutar de modo que los polipéptidos codificados son resistentes a la digestión proteolitica por quimotripsina . Más de un sitio de reconocimiento se puede adicionar en una ubicación particular en cualquier combinación, y múltiples sitios de reconocimiento se pueden adicionar o remover de la toxina. Asi, mutaciones adicionales pueden comprender tres, cuatro o más sitios de reconocimiento. Se va a reconocer que múltiples mutaciones pueden ser diseñadas en cualquier secuencia de polinucleótido adecuada; por consiguiente, ya sea secuencias de longitud completa o fragmentos de las mismas se pueden modificar para contener sitios de segmentación adicionales o alternativos asi como para ser resistentes a la digestión proteolitica. De esta manera, las modalidades proporcionan toxinas Cry que contienen mutaciones que mejoran la actividad plaguicida asi como composiciones y métodos mejorados para impactar las plagas utilizando otras toxinas Bt. Las mutaciones pueden proteger al polipéptido de la degradación de proteasa, por ejemplo, al remover los sitios proteoliticos putativos tales como los sitios de serina proteasa putativos y los sitios de reconocimiento de elastasa de diferentes áreas. Algunos o todos de tales sitios putativos pueden ser removidos o alterados de modo que la proteólisis en la ubicación del sitio original es disminuida. Los cambios en la proteólisis se pueden estimar al comparar un polipéptido mutante con toxinas de tipo silvestre o al comparar toxinas matantes que difieren de su secuencia de aminoácidos. Los sitios proteoli ticos putativos y sitios proteoliticos incluyen, pero no están limitados a, las siguientes secuencias: RR, un sitio de segmentación de tripsina; LKM, un sitio de quimotripsina y NGSR, un sitio de tripsina. Estos sitios pueden ser alterados mediante la adición o supresión de cualquier número y clase de residuos de aminoácido, mientras que se incrementa la actividad plaguicida del polipéptido. Asi, los polipéptidos codificados por secuencias de nucleótidos que comprenden mutaciones comprenderán por lo menos un cambio o adición de aminoácido con relación a la secuencia nativa o antecedente, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 o 280 o más cambios o adiciones de aminoácido. La actividad plaguicida de un polipéptido también puede ser mejorada mediante el truncamiento de la secuencia nativa o de longitud completa, como es conocido en la técnica.
Las composiciones de las modalidades incluyen ácidos nucleicos y fragmentos y variantes de los mismos, que codifican polipéptidos plaguicidas. En particular, las modalidades proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, o las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID N0:1, y fragmentos y variantes de la misma . También de interés son las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican las proteínas plaguicidas de las modalidades. Como se utiliza en la presente, la frase "secuencias de nucleótidos optimizadas" se refiere a ácidos nucleicos que son optimizados para la expresión en un organismo particular, por ejemplo, una planta. Las secuencias de nucleótidos optimizadas se pueden preparar para cualquier organismo de interés utilizando métodos conocidos en la técnica. Ver, for ejemplo, las solicitudes norteamericanas Nos. 10/606,320, presentada el 25 de Junio del 2003, ahora abandonada, y 10/746,914, presentada el 24 de Diciembre del 2003, que describen una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica una proteína plaguicida divulgada. En este ejemplo, la secuencia de nucleótidos se preparó mediante la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de la proteína y al cambiar la secuencia de nucleótidos para comprender codones preferidos de maíz mientras que todavía codifica la secuencia de aminoácidos misma. Este procedimiento es descrito en más detalle por Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Las secuencias de nucleótidos optimizadas encuentran uso en incrementar la expresión de una proteína plaguicida en una planta, por ejemplo plantas monocotiledóneas de la familia Gramineae (Poaceae) tales como, por ejemplo, una planta de maíz o de cereal. Las modalidades además proporcionan polipéptidos plaguicidas (por ejemplo, insecticidas) aislados codificados por ya sea un ácido nucleico que ocurre naturalmente o modificado de las modalidades. Más específicamente, las modalidades proporcionan polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, y los polipéptidos codificados por ácidos nucleicos descritos en la presente, por ejemplo aquellos expuestos en la SEQ ID N0:1, y fragmentos y variantes de los mismos. En modalidades particulares, las proteínas plaguicidas de las modalidades proporcionan polipéptidos insecticidas de longitud completa, fragmentos de polipéptidos insecticidas de longitud completa y polipéptidos variantes que se producen a partir de ácidos nucleicos mutagenizados diseñados para introducir secuencias de aminoácidos particulares en polipéptidos de las modalidades. En modalidades particulares, las secuencias de aminoácidos que se introducen en los polipéptidos comprenden una secuencia que proporciona un sitio de segmentación para una enzima tal como una proteasa. Es conocido en la técnica que la actividad plaguicida de las toxinas Bt es típicamente activada por la segmentación del péptido en el intestino del insecto por varias proteasas. Debido a que los péptidos no siempre pueden ser segmentados con eficiencia completa en el intestino de insecto, los fragmentos de una toxina de longitud completa pueden tener actividad plaguicida aumentada en comparación a la toxina de longitud completa misma. Así, alguno de los polipéptidos de las modalidades incluyen fragmentos de un polipéptido insecticida de longitud completa, y algunos de los fragmentos, variantes y mutaciones de polipéptido tendrán una actividad plaguicida aumentada con relación a la actividad del polipéptido insecticida que ocurre naturalmente del cual se derivan, particularmente si el polipéptido insecticida que ocurre naturalmente no es activado in vitro con una proteasa antes de la clasificación para la actividad. Así, la presente solicitud abarca versiones truncadas o fragmentos de las secuencias. Las mutaciones se pueden colocar en cualquier secuencia antecedente, incluyendo tales polipéptidos truncados, mientras que el polipéptido retenga la actividad plaguicida. Uno de habilidad en la técnica fue fácilmente comparado dos o más proteínas con respecto a la actividad plaguicida utilizado con los ensayos conocidos en la técnica o descritos en otra parte en la presente. Se va a entender que los polipéptidos de las modalidades se pueden producir ya sea mediante la expresión de un ácido nucleico divulgado en la presente, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándares. Es reconocido que las proteínas plaguicidas pueden ser oligoméricas y variarán en peso molecular, número de residuos, péptidos componentes, actividad contra plagas particulares, y otras características. Sin embargo, mediante los métodos dispuestos en la presente, las proteínas activas contra una variedad de plagas pueden ser aisladas y caracterizadas. Las proteínas plaguicidas de las modalidades se pueden utilizar en combinación con otras toxinas Bt u otras proteínas insecticidas para incrementar el intervalo de objetivo de insectos. Además, el uso de las proteínas plaguicidas de las modalidades en combinación con otras toxinas Bt u otros principios insecticidas de una naturaleza distinta tiene una utilidad particular para la prevención y/o manejo de resistencia de insectos. Otros agentes insecticidas incluyen inhibidores de proteasa (tipos tanto de serina como de cisterna), a-amilasa y peroxidasa.
Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos y polipéptidos codificados de esta manera también están abarcados por las modalidades. Como se utiliza en la presenta el término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido o una porción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de las modalidades. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteina que retiene la actividad biológica de la proteina de longitud completa nativa o correspondiente y por consiguiente posee actividad plaguicida. Asi, es conocido que algunas de las secuencias de polinucleótido de aminoácidos de las modalidades pueden ser referidas correctamente como tanto fragmentos como mutantes. Se va a entender que el término "fragmento", como se utiliza para referirse a secuencias de ácido nucleico de las modalidades, también abarca secuencias que son útiles como sondas de hibridación. Esta clase de secuencias de nucleótidos generalmente no codifican proteínas de fragmento que retienen la actividad biológica. Así, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica las proteínas de las modalidades.
Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de las modalidades que codifica una porción biológicamente activa de una proteina plaguicida de las modalidades codificará por lo menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100 o 1,200 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido plaguicida de las modalidades (por ejemplo, 737 aminoácidos para SEQ ID NO : 2 ) . Asi, se entiende que las modalidades también abarcan polipéptidos que son fragmentos de las proteínas plaguicidas ejemplares de. las modalidades y que tienen longitudes de por lo menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100 o 1,200 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido plaguicida de las modalidades (por ejemplo, 737 aminoácidos para SEQ ID NO:2). Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las modalidades que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente necesitan no codificar una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida. Así, un fragmento de un ácido nucleico de las modalidades puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida, o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando métodos divulgados en la presente. Una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida se puede preparar al aislar una porción de una de las secuencias de nucleótidos de las modalidades, que expresa la porción codificada de la proteina plaguicida (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vítro y al estimar la actividad de la porción codificada de la proteina plaguicida. Los ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las modalidades comprenden por lo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 1,800 o 2,000 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos divulgada en la presente (por ejemplo, 2,214 nucleótidos para la SEQ ID N0:1). Las modalidades particulares contemplan fragmentos derivados de (por ejemplo, producidos de) un primer ácido nucleico de las modalidades, en donde el fragmento codifica una toxina truncada caracterizada por actividad plaguicida. Los polipéptidos truncados codificados por los fragmentos de polinucleótido de las modalidades se caracterizan por actividad plaguicida es ya sea equivalente a, o mejorada, con relación a la actividad del polipéptido de longitud completa correspondiente codificado por el primer ácido nucleico del cual se deriva el fragmento. Se contempla que tales fragmentos de ácido nucleico de las modalidades pueden ser truncados en el extremo 3' de la secuencia de codificación de longitud completa nativa correspondiente. Los fragmentos de ácido nucleico también pueden ser truncados en ambos de los extremos 5' y 3' de la secuencia de codificación de longitud completa nativa correspondiente. El término "variantes" se utiliza en la. presente para referirse a secuencias sustancialmente similares. Para secuencias de nucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos plaguicidas de las modalidades. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente tales como estos se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como, por ejemplo, a la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y cualquiera de las técnicas de hibridación como es resumida en la presente. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas, tales como aquellas generadas, por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifica una proteína plaguicida de las modalidades, tal como una toxina mutante. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de las modalidades tendrán por lo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a aquella secuencia de nucleótidos particular como es determinado por los programas de alineación de secuencia descritos en otra parte en la presente utilizando parámetros de error. Una variante de una secuencia de nucleótidos de las modalidades pueden diferir de esa secuencia por tan pocos como 1-15 nucleótidos, tan pocos como 1-10, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o aun 1 nucleótido. Las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de las modalidades (es decir, una secuencia de nucleótidos ejemplar) también se puede evaluar mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos variante y el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia. Asi, por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido con un por ciento de identidad de secuencia dado al polipéptido a la SEQ ID NO: 2 son divulgados. El por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos polipéptidos se puede calcular utilizando programas de alineación de secuencia descritos en otra parte en la presente utilizando parámetros de error. Donde cualquier par dado de polinucleótidos de las modalidades se evalúa mediante comparación del por ciento de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que ellos codifican, el por ciento de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, generalmente por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, por lo menos aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, 99% o más identidad de secuencia . Como se utiliza en la presente, el término "proteína variante" abarca polipéptidos que son derivados de una proteína nativa mediante: supresión (llamado truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Por consiguiente, el término "proteína variante" abarca fragmentos biológicamente activos de una proteína nativa que comprende un número suficiente de residuos de aminoácidos contiguos para retener la actividad biológica de la proteína nativa, es decir, para tener actividad plaguicida. Tal actividad plaguicida puede ser diferente o mejorada con relación a la proteína nativa o puede estar sin cambio, mientras que se retenga la actividad plaguicida . Las proteínas variantes abarcadas por las modalidades son biológicamente activas, es decir, continúan presentando la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad plaguicida como es descrito en la presente. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína plaguicida nativa de las modalidades tendrá por lo menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa como es determinado por los programas de alineación de secuencia descritos en otra parte en la presente utilizando parámetros de error. Una variante biológicamente de una proteína de las modalidades pueden diferir de esa proteína por tan pocos como 1-15 residuos de aminoácido, tan pocos como 1-10, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o aun 1 residuo de aminoácido. Las modalidades además abarcan un microorganismo que es transformado con por lo menos un ácido nucleico de las modalidades, con un cásete de expresión que comprende el ácido nucleico, o con un vector que comprende el cásete de expresión. En algunas modalidades, el microorganismo es uno que se multiplica sobre plantas. Una modalidad de la invención se relaciona a proteína plaguicida encapsulada que comprende un microorganismo transformado capaz de expresar por lo menos una proteína plaguicida de las modalidades. Las modalidades proporcionan composiciones plaguicidas que comprenden un microorganismo transformado de las modalidades. En tales modalidades, el microorganismo transformado está generalmente presente en la composición plaguicida en una cantidad plaguicidamente efectiva, junto con un portador adecuado. Las modalidades también abarcan composiciones plaguicidas que comprenden una proteína aislada de las modalidades, sola o en combinación con un organismo transformado de las modalidades y/o una proteína plaguicida encapsulada de las modalidades, en una cantidad insect leídamente efectiva, junto con un portador adecuado. Las modalidades además proporcionan un método para incrementar el intervalo de objetivo de insectos al utilizar una proteína plaguicida de las modalidades en combinación con por lo menos otra o "segunda" proteína plaguicida. Cualquier proteína plaguicida conocida en la técnica se puede emplear en los métodos de las modalidades. Tales proteínas plaguicidas incluyen, pero no están limitadas a, toxinas Bt, inhibidores de proteasa, a-amilasas y peroxidasas. Las modalidades también abarcan plantas transformadas o transgénicas que comprenden por lo menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades. En algunas modalidades, la planta es establemente transformada con una construcción de nucleótidos que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en una célula de planta. Como se utiliza en la presente, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" se refiere. a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo es establemente integrado dentro del genoma de una planta transgénica o transformada tal que el polinucleótido es pasado a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante . Se va a entender que como se utiliza en la presente el término "transgénico" incluye cualquier célula, linea de célula, callo, tejido, parte de planta o planta, el genotipo de la cual se alterado mediante la presencia del ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente asi alterados asi como aquellos creados por cruzamientos sexuales o propagación asexual del transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico ) mediante métodos de reproducción de plantas convencionales o mediante eventos que ocurren naturalmente tal como la fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea. Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallaos, raices, etc.), semillas, células de planta y progenie de las mismas. Las partes de plantas transgénicas están dentro del alcance de las modalidades y comprende, por ejemplo, células de planta, protoplas os , tejidos, callos, embriones asi como flores, tallos, frutos, hojas y raices que se originan en plantas transgénicas o su progenie previamente transformada con la molécula de DNA de las modalidades y por lo tanto que consiste de por lo menos en parte de células transgénicas . Como se utiliza en la presente, el término planta incluye células de planta, protoplastos de planta, cultivo de tejido de células de planta de las cuales se pueden regenerar plantas, callos de plantas, agrupaciones de plantas, y células de plantas que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramificaciones, frutos, núcleos, mazorcas, elotes, farfollas, tallos, raices, puntas de raíz, anteras y los similares. La clase de plantas que pueden ser utilizadas en los métodos de las modalidades es generalmente tan amplio como la clase de plantas superiores disponibles para las técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Tales plantas incluyen, por ejemplo, Solanum tuberosum y Zea mays. Mientras que las modalidades no dependen sobre un mecanismo biológico particular para incrementar la resistencia de una planta a una plaga de planta, la expresión de la secuencia de nucleótidos de las modalidades en una célula de planta resulta en la producción de las proteínas plaguicidas de las modalidades en un incremento en la resistencia de la planta a una plaga de planta. Las plantas de las modalidades encuentran uso en la agricultura en métodos para impactar plagas de insectos. Ciertas modalidades proporcionan plantas de cultivo transformadas, tales como, por ejemplo, plantas de maíz, que encuentran uso en métodos para impactar plagas de insectos de la planta, tal como, por ejemplo, el barrenillo de maíz Europeo-. Una "planta o célula de planta sujeto" es una en la cual la alteración genética, tal como transformación, se ha efectuado para un gen de interés, o es una planta o célula de planta que es descendiente de una planta o célula así alterada y que comprende la alteración. Un "control" o "planta de control" o "célula de planta de control" proporciona un punto de referencia para medir los cambios en el fenotipo de la planta o célula de planta sujeto. Una planta o célula de planta de control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula de tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo como el material de partida para la alteración genética que dio por resultado la planta o célula sujeto; (b) una planta o célula de planta del mismo genotipo como el material de partida pero que se ha transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto conocido sobre el atributo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula de planta que es un segregante no transformado entre la progenie de una planta o célula de planta sujeto; (d) una planta o célula de planta genéticamente idéntica a la planta o célula de planta sujeto pero que no está expuesta con condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la planta o célula de planta sujeto misma, bajo condiciones en las cuales no es expresado el gen de interés. Un experto en la técnica fácilmente reconocerá que avance en el campo de biología molecular tal como la mutagénesis específica del sitio y aleatoria, metodologías de reacción en cadena de polimerasa y técnica de ingeniería de proteína proporcionan una recolección extensiva de herramientas y protocolos adecuados para el uso para alterar o diseñar tanto la secuencia de aminoácidos como las secuencias genéticas implícitas de proteínas de interés para la agricultura. Así, las proteínas de las modalidades pueden ser alteradas de varias maneras incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas plaguicidas se pueden preparar al introducir mutaciones en un ácido nucleico sintético (por ejemplo, molécula de DNA) . Los métodos para mutagénesis ' y alteraciones de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, cambios diseñados se pueden introducir utilizando una técnica de mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótido . Ver, por ejemplo, unkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987) Methods in Enzymol. 154:367- 382; patente norteamericana No. 4,873,192; Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), y las referencias citadas en las mismas. Las secuencias de nucleótidos mutagenizados de las modalidades pueden ser modificadas para cambiar aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 o más de los aminoácidos presentes en la secuencia primaria del polipéptido codificado. Alternativamente, aun más cambios de la secuencia nativa se puede introducir tal que la proteina codificada puede tener por lo menos aproximadamente 1% o 2%, o aproximadamente 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12% o aun aproximadamente 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, o 25%, 30%, 35% o 40% o más de los codones alterado, o de otra manera modificados comparados con la proteina de tipo silvestre correspondiente. De la misma manera, la proteina codificada puede tener por lo menos aproximadamente 1% o 2%, o aproximadamente 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, o aun aproximadamente 13%, 14%, %, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, o 25%, 30%, 35%, o 40% o más codones adicionales comparados con la proteína de tipo silvestre correspondiente. Se va a entender que las secuencias de nucleótidos mutagenizadas de las modalidades se proponen para abarcar péptidos equivalentes, biológicamente funcionales que tienen actividad plaguicida, tal como una actividad plaguicida mejorada como es determinado por las propiedades antialimentantes contra las larvas del barrenillo de maíz Europeo. Tales secuencias pueden surgir como una consecuencia de la redundancia de codón y la equivalencia funcional que son conocidos que ocurren naturalmente dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas. Un experto en la técnica reconocería que las adiciones y/o sustituciones de aminoácidos son generalmente basadas sobre la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, carga, tamaño y los similares. Los grupos de sustitución de aminoácidos ejemplares que toman varias de las características anteriores en consideración son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina . La guía en cuanto a sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteina de interés se pueden encontrar en el modelo de Dayhoff y colaboradores, (1978) Atlas of Protein Sequence y Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D. C) , incorporada en la presente por referencia. Las sustituciones conserva ivas tal como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares se pueden hacer. Asi, los genes y secuencias de nucleótidos de las modalidades incluyen ambas de las secuencias que ocurren naturalmente y forma mutante. Del mismo modo, las proteínas de las modalidades abarcan tanto proteínas que ocurren naturalmente como variaciones (por ejemplo, polipéptidos truncados) como formas modificadas (por ejemplo, mutantes) de los mismos. Tales variantes continuarán presentando la actividad plaguicida deseada. Obviamente, las mutaciones que serán hechas en las secuencias de nucleótidos que codifican la variante no deben colocar la secuencia fuera del cuadro de lectura y generalmente no crearán reacciones complementarias que podrían producir estructuras de mRNA secundaria. Ver, la publicación de solicitud de patente europea No. 75,444. Las supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteína abarcadas en la presente no se esperan que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión e inserción por adelantado al hacerlo de esta manera, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante ensayos de clasificación de rutina, tal como los ensayos de alimentación de insectos. Ver, por ejemplo, Marrone y colaboradores, (1985) J. Econ. Entomol. 78:290-293 y Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485, incorporada en la presente por referencia. Las secuencias de nucleótidos variantes y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como el entremezclado de DNA. Con tal procedimiento, una o más diferentes secuencias de codificación pueden ser manipuladas para crear una nueva proteína plaguicida que posee las propiedades deseadas. De esta manera, librerías de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionados que comprenden regiones de secuencia que tiene identidades de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinados in vi tro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este procedimiento, las secuencias de codificación de longitud completa, las porciones de secuencia que codifican un dominio de interés, o cualquier fragmento de una secuencia de nucleótidos de las modalidades puede ser entremezclado entre las secuencias de nucleótidos de las modalidades y porciones correspondientes de otras secuencias de nucleótidos Cyr conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad mejorada de interés. Las propiedades de interés incluyen, pero no están limitadas a, actividad plaguicida por unidad de proteína plaguicida, estabilidad de proteína y toxicidad a especies no objetivo particularmente humanos, ganado, y plantas y microbios que expresan los polipéptidos plaguicidas de las modalidades. Las modalidades no están limitadas por una estrategia de entremezclado particular, solamente que por lo menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades, o parte de la misma esté involucrada en tal estrategia de entremezclado. El entremezclado puede involucrar solamente secuencias de nucleótidos divulgadas en la presente o puede involucrar adicionalmente el entremezclado de las secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica. Las estrategias para el entremezclado de DNA son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Na ture 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Nature 391:288-291; y las patentes norteamericanas Nos. 5,605,793 y 5,837,458. Las secuencias de nucleótidos de las modalidades también se pueden utilizar para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras bacterias, y más particularmente otras cepas de Bacillus . De esta manera, los métodos tales como PCR, hibridación y los similares se pueden utilizar para identificar tales secuencias basado en su homología de secuencia a las secuencias expuestas en la presente. Las secuencias que son seleccionadas en base a su identidad de secuencia a las secuencias completas expuestas en la presente o a fragmentos de las mismas están abarcadas por las modalidades. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias divulgadas. El término "ortólogo" se refiere a genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como un resultado de la especiación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas comparten identidad sustancial como es definido en otra parte en la presente. Las funciones de los ortólogos son de manera frecuente altamente conservadas entre las especies. En un procedimiento de PCR, los cebadores de oligonucleótido pueden ser diseñados para el uso en las reacciones de PCR para amplificar las secuencias de DNA correspondientes a partir del cDNA o DNA genómico extraído de cualquier organismo de interés. Métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación de PCR son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), después en la presente "Sambrook". Ver también Innis y colaboradores,, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications (Academic Press, New York) ; Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Métodos conocidos de PCR incluyen, pero no están limitados a, métodos que utilizan cebadores emparejados, cebadores empalmados, cebadores específicos solos, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desigualados, y los similares. En las técnicas de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos se utiliza como una sonda que selectivamente híbrida a otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de DNA genómico clonados o fragmentos de cDNA (es decir, librerías genómicas o de cDNA) a partir de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de DNA genómicos, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA u otros oligonucleótidos , y pueden ser marcadas con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas prehibridación se pueden hacer al marcar oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias de las modalidades. Métodos para preparación de sondas para hibridación y para construcción de cDNA y librerías genómicas son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook. Por ejemplo, una secuencia completa divulgada en la presente, o una o más porciones de la misma, se pueden utilizar como una sonda capaz de hibridar específicamente a secuencias correspondientes y RNAs mensajero. Para lograr la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas a las secuencias de las modalidades y son generalmente por lo menos aproximadamente 10 o 20 nucleótidos en longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar secuencias Cyr correspondientes a partir de un organismo elegido mediante PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias de codificación adicionales a partir de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. La técnica de hibridación incluyen la clasificación de hibridación de librerías de DNA colocadas en placas (ya sea placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook) . La hibridación de tales secuencias se puede llevar bajo condiciones severas. El término "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" como se utiliza en la presente se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo a un grado detectablemente más grande que a las otras secuencias (por ejemplo, .por lo menos 2-veces, 5-veces o 10-veces arriba del antecedente. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda puede ser identificada (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajusfar para permitir alguna desigualación a la secuencia de modo que menores grados de similitud son detectados (sondeo heterólogo) . Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 o 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ion Na, de manera típica de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) en pl-¡ 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida . Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (docedil sulfato de sodio) a 37°C y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de moderada severidad ejemplar incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1.0 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado final de 0.1 X SSC a 60 a 65°C durante por lo menos aproximadamente 20 minutos. Opcionalmente, las soluciones reguladoras . de lavado pueden comprender aproximadamente SDS al 0.1% a aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, de manea usual aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm (punto de fusión térmica) se puede aproximar de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) -i- 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el DNA, "% form" es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica y pH definidos) en la cual 60% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a una sonda perfectamente igualada. Los lavados típicamente se realizan por lo menos hasta que se alcance el equilibrio y se logra un bajo nivel antecedente de hibridación, tal como durante 2 horas, 1 hora o 30 minutos. La Tm se reduce por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; así, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajusfar para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si la secuencia con =90% de identidad son buscadas, la Tm puede ser disminuida a 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que la Tm para la secuencia específica y su complemento en una intensidad iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 1, 2, 3 o 4°C menor que la Tm; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación/lavado en 6, 7, 8, 9 o 10°C menor que la Tm; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que la Tra. Utilizando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la Tm deseada para aquellos de habilidad ordinaria entenderán que las variaciones en la severidad de la hibridación y/o las soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación dan por resultado una Tm de menos que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), la concentración SSC se puede incrementar de modo que se puede utilizar a una temperatura más alta. Una guia extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Labora tory Techniques in Bíochemistry y Molecular Biology — Hybridi za tion wíth Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Ellsevier, New York); y Ausubel y colaboradores,, eds. (1995) Current Protocole in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York) . Ver también, Sambrook. Asi, las secuencias aisladas que codifican una proteína Cyr de las modalidades se hibridan bajo condiciones severas a la secuencia Cyr divulgadas en la presente, o a fragmentos de las mismas, están abarcadas por las modalidades. Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" e (e) "identidad sustancia.". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia clasificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia de cDNA o de gen de longitud completa, o la secuencia de cDNA o de gen completa. (b) Como se utiliza en la presente "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Aquellos de habilidad en la técnica entienden que para evitar una alta similitud de una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de nucleótidos una sanción de espacio es típicamente introducida y es sustraída del número de igualaciones. Los métodos de alineación de secuencia para comparaciones son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith y colaboradores, (1981) Adv. Appl . Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda para alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc . Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, como es modificada en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Las implementaciones en computadora de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics , Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin GCG, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA) . Las alineaciones utilizando estos programas se puede realizar utilizando los parámetros de error. El programa CLUSTAL es bien descrito Higgins y colaboradores, (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores, (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang y colaboradores, (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson y colaboradores, (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN está basado sobre el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra . Una tabla de residuos ponderados PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12, y una sanción de espacio de 4 se puede utilizar como el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403 están basados en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se puede realizar con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de las modalidades. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, registro = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de las modalidades. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como es descrito en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul y colaboradores, (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) pueden ser utilizados. Ver el sitio de la red de Información de National Center for Biotechnology sobre la red mundial en www . ncbi .hlm.nih.gov. La alineación también se puede realizar manualmente por inspección . A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando Ponderación de GAP de 50 y Ponderación de Longitud de of 3, y la matriz de registro nwsgapdna . cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62; o cualquier programa equivalente del mismo. El término "programa equivalente" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuos de nucleótidos o de aminoácidos idénticos y un por ciento idéntico de identidad de secuencia cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) supra, para encontrar alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y posiciones de espacio y crean la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menos espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de igualaciones para cada espacio que este inserta. Si se elige una sanción de extensión de espacio mayor que cero, GAP debe, además, hacer un aprovechamiento para cada espacio insertado de la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin GCG para secuencias de proteína son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la sanción de creación de espacio de error es 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es 3. Las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 0 a 200. Así, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP exhibe cuatro cifras de mérito para las alineaciones: calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. Relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. Por ciento de identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. Por ciento de similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro utilizada en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin GCG es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati, ñcad. Sci. USA 89:10915). (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico de polipéptido hace referencia a los residuos de las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácidos, están sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajusfar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservativas se dicen que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde se da un aminoácido idéntico, un registro de 1 y una sustitución no conservativa se le da un registro de cero, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE ( Intelligenetics , Mountain Vie , California). (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado de comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula para determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia . (e) (i) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% o más de identidad de secuencia cuando se compara con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos utilizando parámetros estándares. Uno de habilidad en la técnica reconocerá que estos valores pueden ser ajustados apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codón, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del cuadro de lectura, y los similares. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos generalmente significa la identidad de secuencias de por lo menos 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% o más identidad de secuencia. Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre si bajo condiciones severas. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que la Tm para la secuencia especifica en una intensidad iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severas abarcan temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1°C a aproximadamente 20°C menor que la Tm, dependiendo del grado de severidad deseado como es calificado de otra manera en la presente. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entré si bajo condiciones severas son todavía sustancialmente idénticos y los polipéptidos que ellos codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea utilizando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo cruzadamente con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. (e) (ii) El término "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o más identidad de secuencia de una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación especificada. La alineación óptima para estos propósitos se puede conducir utilizando el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) supra . Una indicación de que dos secuencias de péptido son sustancialmente idénticas es que' un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos resaltados contra el segundo péptido. Asi, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente por una sustitución conservativa. Péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como es mencionado en lo anterior excepto que posiciones de residuo que no son idénticas pueden diferir por cambios de aminoácidos conservativos. El uso del término "construcciones de nucleótidos" en la presente no se proponen para limitar las modalidades a construcciones de nucleótidos que comprenden DNA. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica reconocerán que construcciones de nucleótidos, particularmente polinucleótidos y oligonucleótidos compuestos de ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y deoxiribonucleótidos , también pueden ser empleados en los métodos divulgados en la presente. Las construcciones de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las modalidades adicionalmente abarcan todas las formas complementarias de tales construcciones como moléculas y secuencias. Además, las construcciones de nucleótidos, moléculas de nucleótidos y secuencias de nucleótidos de las modalidades abarcan todas las construcciones de nucleótidos, moléculas y secuencias que pueden ser empleadas en los métodos de las modalidades para formar plantas que incluyen, pero no limitadas a, aquellos comprendidos de deoxiribonucleótidos , ribonucleótidos y combinaciones de los mismos. Tales deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas que ocurren naturalmente como análogos sintéticos. Las construcciones de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las modalidades también abarcan todas las formas de construcciones de nucleótidos que incluyen, pero no limitados a, formas de una sola hebra, formas de doble hebra, horquillas, estructuras de tallo y espiral y los similares. Una modalidad adicional se relaciona a un organismo transformado tal como un organismo seleccionado del grupo que consiste de células de plantas y de insectos, bacterias, levadura, baculovirus, protozoarios , nemátodos y algas. El organismo transformado comprende: una molécula de DNA de las modalidades, un cásete de expresión que comprende la molécula de DNA, un vector que comprende el cásete de expresión, que puede ser establemente incorporado en el genoma del organismo transformado . Las secuencias de las modalidades se proporcionan en construcciones de DNA para la expresión en el organismo de interés. La construcción incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' operablemente enlazadas a una secuencia de las modalidades. El término "operablemente enlazados" como se utiliza en la presente se refiere a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia de promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de DNA correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que están enlazadas están contiguas y, donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteina contiguas y en el mismo cuadro de lectura. La construcción adicionalraente puede contener por lo menos un gen adicional para ser co-transformado en el organismo. Alternativamente, el gen(s) adicional se puede proporcionar sobre múltiples construcciones de DNA. Tal construcción de DNA se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de toxina Cry para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. La construcción de DNA adicionalmente puede contener genes marcadores seleccionables .
La construcción de DNA incluirá en la dirección 5' a 3' de transcripción: una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de DNA de las modalidades, y una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir, región de terminación) funcional en el organismo que sirve como un hospedero. La región de iniciación transcripcional (es decir, el promotor) puede ser nativa, análoga, foránea o heteróloga al organismo hospedero y la secuencia de las modalidades. Adicionalmente , el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. El término "foráneo" como se utiliza en la presente indica que el promotor no se encuentra en el organismo nativo en el cual se introduce el promotor. Donde el promotor es "foráneo" o "heterólogo" a la secuencia de las modalidades, se propone que el promotor no es el promotor nativo que ocurre naturalmente para la secuencia operablemente enlazada de las modalidades. Como se utiliza en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia de codificación operablemente enlazada a una región de iniciación de transcripción que es heteróloga a la secuencia de codificación. Donde el promotor es una secuencia nativa o natural, la expresión de la secuencia operablemente enlazada alterada de la expresión de tipo silvestre, que da por resultado alteración en el fenotipo.
La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional , puede ser nativa con la secuencia de interés de DNA operablemente enlazada, puede ser nativa con el hospedero de planta, o puede ser derivada de otra fuente (es decir, foráneo o heterólogc al promotor, la secuencia de interés, el hospedero de planta o cualquier combinación de los mismos) . Las regiones de terminación convenientes son disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991) Mol. Gen. Genet. 262:1 1-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Donde es apropiado, un ácido nucleico puede ser optimizado para la expresión incrementada en el organismo hospedero. Asi, donde el organismo hospedero es una planta, los ácidos nucleicos sintéticos pueden ser sintetizados utilizando codones preferidos de planta para la expresión mejorada. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión de la utilización de codón preferida del hospedero. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de las modalidades pueden ser expresadas en especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para tener en cuenta las preferencias de codón especificas y las preferencias de contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas ya que estas preferencias se han mostrado que difieren (Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Asi, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular puede ser derivado de secuencias de genes conocidos del maíz. La utilización del codón del maíz para 28 genes de plantas de maíz se lista en la Tabla 4 de Murray y colaboradores, supra . Los métodos están disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,380,831 y 5,436,391, y Murray y colaboradores, (1989) 17:477-498, incorporada en la presente por referencia . Modificaciones de secuencia adicionales se conocen que aumentan la expresión de gen en un hospedero celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares a transposón, y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales a la expresión del gen. El contenido de GC a la secuencia puede ajusfar niveles promedio para un hospedero celular dado, como es calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedera. El término "célula hospedera" como se utiliza en la presente se refiere a una célula que contiene un vector y soporta la aplicación y/o expresión del vector de expresión que es propuesto. Las células hospederas pueden ser células procarióticas tales como E. coli, o células eucarióticas tales levadura, células de insecto, de anfibio o mamífero, o células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Un ejemplo de una célula hospedera monocotiledónea es una célula hospedera de maíz. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras de mRNA secundarias de horquilla predichas. Los casetes de expresión adicionalmente pueden contener secuencias de guía 5' . Tales secuencias de guía pueden actuar para aumentar la traducción. Las guías de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: guías de picornavirus , por ejemplo, guía de EMCV (región de no codificación 5' de Encefalomiocarditis ) (Elroy-Stein y colaboradores, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); guía de potivirus, por ejemplo, guía de TEV (Virus de Grabado de Tabaco) (Gallie y colaboradores, (1995) Gene 165 (2) :233-238) , guía de MDMV (Virus de Mosaico Enano de Maíz), proteína que enlaza la cadena pesada de inmunoglobulxna humana (BiP) (Macejak y colaboradores, (1991) Nature 353:90-94); guía no traducida del mRNA de proteína de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores, (1987) Nature 325:622-625); guía de virus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores, (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp . 237-256); y la guía de virus moteado clorótico de maíz (Lommel y colaboradores, (1991) Virology 81 :382-385). Ver también, Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol. 84:965-968. En la preparación del cásete de expresión, los diversos fragmentos de DNA se pueden manipular para proporcionar las secuencias de DNA en la orientación apropiada y como sea apropiado, en el cuadro de lectura apropiado. Hacia este fin, adaptadores enlazadores se pueden emplear para unir los fragmentos de DNA u otras manipulaciones pueden estar involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción de DNA superfluo, remoción de sitios de restricción o los similares. Para este propósito, la mutagénesis in vit.ro, la reparación de cebador, restricción, recocido, resustituciones por ejemplo transiciones y transversiones, pueden estar involucradas . Un número de promotores se puede utilizar en la práctica de las modalidades. Los promotores se pueden seleccionar basados en el efecto deseado. Los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, preferidos de tejido, inducibles u otros promotores para la expresión en el organismo hospedero. Los promotores constitutivos adecuados para el uso en la célula hospedera de planta incluyen, por ejemplo, el promotor de núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en WO 99/43838 y la patente norteamericana No. 6,072,050; el promotor 35S de CaMV de núcleo (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:163-171); ubicuitina (Christensen y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last y colaboradores, (1991) Theor. Appl . Genet. 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente norteamericana No. 5,659,026)', y los similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos discutidos en las patentes norteamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; ,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611. Dependiendo del efecto deseado, puede ser benéfico expresar el gen desde un promotor inducible. De particular interés para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de las modalidades en planta están los promotores inducibles por lesión. Tales promotores inducibles por lesión, pueden responder al daño causado por la alimentación de insectos, e incluyen el gen inhibidor de proteinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev . Phytopath. 28:425-449; Duan y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl y wun2, patente norteamericana No. 5,428,148; winl y win2 (Stanford y colaboradores, (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl y colaboradores, (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier y colaboradores, (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp y colaboradores, (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok y colaboradores, (1994) Plant J. 6 (2 ): 141-150) ; y los similares, incorporadas en la presente por referencia. Adicionalmente, los promotores inducibles por patógenos pueden ser empleados en los métodos y construcciones de nucleótidos de las modalidades. Tales promotores inducibles por patógenos incluyen aquellos de las proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR) , que son inducidas después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 , 3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, for ejemplo, Redolfi y colaboradores, (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Ver también WO 99/43819, incorporada en la presente por referencia . De interés son los promotores que son expresados localmente en o cerca del sitio de infección de patógeno. Ver, por ejemplo, Marineau y colaboradores, (1987) Plant Mol.
Biol. 9:335-342; Matton y colaboradores, (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch y colaboradores, (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch y colaboradores, (1988) Mol. Gen. Genet . 2:93-98; y Yang (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Ver también, Chen y colaboradores, (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang y colaboradores, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner y colaboradores, (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz y colaboradores (1989) Plant Cell 1:961-968; patente norteamericana No. 5,750,386 (inducible por nematodos) y las referencias citadas en las mismas. De particular interés es el promotor inducible para el gen PRms de maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium monili forme (ver, por ejemplo, Cordero y colaboradores, (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200) . Promotores regulados químicamente se pueden utilizar para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química induce la expresión del gen, o un promotor reprimible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles químicamente son conocidos en la técnica e incluyen pero no están limitados, al maíz en el promotor In2-2, que es activado por los moderadores de herbicida de bencensul fonamida , el promotor GST de maíz, que es activado por compuestos electrofílieos hidrofóbicos que se utilizan como herbicidas pre-emergentes , el promotor PR-la de tabaco, que es activado por ácido salicilico. Otros promotores regulados químicamente de interés incluyen los promotores responsivos a esferoides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocor icoide en Schena y colaboradores, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y cNellis y colaboradores, (1998) Plant J. 1 (2 ) : 247-257 ) y los promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (ver, por ejemplo, Gatz y colaboradores, (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las patentes norteamericanas Nos. 5,814,618 y 5,789,156), incorporados en la presente por referencia. Los promotores preferidos de tejido se pueden utilizar para dirigir la expresión de proteína plaguicida aumentada dentro de un tejido de planta particular. Los promotores preferidos de tejido incluyen aquellos discutidos en Yamamoto y colaboradores, (1997) Plant J. 12(2)255-265; Ka ama t a y colaboradores, (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7) : 792-803; Hansen y colaboradores, (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3) : 337-343; Russell y colaboradores, (1997) Transgenic Res. 6 (2) : 157-168; Rinehart y colaboradores, (1996) Plant Physiol. 112 (3) : 1331-1341; Van Camp y colaboradores, (1996) Plant Physiol. 112 (2 ): 525-535 ; Canevascini y colaboradores, (1996) Plant Physiol. 112 (2 ): 513-524 ; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol. 35 ( 5 ) : 773- 78 ; Lam (1994) Results Probl . Cell Differ. 20:181-196; Orozco y colaboradores, (1993) Plant Mol Biol. 23 ( 6 ) : 1129-1138 ; Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc Nati. Acad. Sel. USA 90 (20) : 9586-9590; y Guevara -García y colaboradores, (1993) Plant J. ( 3 ) : 495-505. Tales promotores se pueden modificar, si es necesario, para la expresión débil. Los promotores preferidos de hoja son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto y colaboradores, (1997) Plant J. 12 (2 ): 255-265 ; Kwon y colaboradores, (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol. 35 ( 5 ) : 773-778 ; Gotor y colaboradores, (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco y colaboradores, (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) : 1129-1138; y Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90 ( 20 ): 9586-9590. Los promotores preferidos de raíz o específicos de raíz son conocidos y se pueden seleccionar de los muchos disponibles de la literatura o aislados de novo de varias especies compatibles. Ver, for ejemplo, Hire y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2) : 207-218 (gen de glutamina sintetasa específica de raíz de soya); eller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 ( 10) : 1051-1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GR1? 1.8 de judía verde); French) ; Sanger y colaboradores, (1990) Plant Mol. Biol . 1 ( 3 ): 33- 3 (promotor especifico de raíz del gen manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium turnefaciens) ; y Miao y colaboradores, (1991) Plant Cell 3(l) :ll-22 (clon de cDNA de longitud completa que codifica glutamina sintetasa (GS), citosólica, que es expresada en raices y nodulos de raíz de soya. Ver también Bogusz y colaboradores, (1990) Plant Cell 2 (7 ) : 633-6 1 , donde se describen dos promotores específicos de raíz aislado de genes de hemoglobina de la no legumbre fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no legumbre no fijadora de nitrógeno relacionada Trema tomentosa. Los promotores de estos genes enlazaron un gen reportador de ß-glucuronidasa y se introdujeron en tanto la no legumbre de Nicotiana tabacum como la legumbre Lotus corniculatus , y en ambos casos se preservó la actividad del promotor específico de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describen sus análisis de los promotores de los genes inductores de raíz rolC y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick.) 79 ( 1 ) : 69-76 ) . Ellos concluyeron que los determinantes de DNA aumentadores y preferidos de tejido estén disociados en esos promotores. Teeri y colaboradores, (1989) utilizó la fusión de gen lacZ para mostrar que el gen T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintasa especialmente activo en la epidermis de la punta de raíz y que el gen TR2' es específico de raíz en la planta intacta y estimulado por la lesión en el tejido de hoja, una combinación especialmente deseable de características para el uso con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8(2):343-350) . El gen TR1' fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores preferidos de raíz adicionales incluyen el promotor de gen VÍENOD-GRP3 ( uster y colaboradores, (1995) Plant Mol. Biol. 29 ( ) : 759-772 ) ; y promotor rolB (Capana y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 25 ( ): 681-691. Ver también las patentes norteamericanas Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; y 5, 023, 179. Promotores "preferidos de semilla" incluyen tanto promotores "específicos de semilla" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como promotores de proteínas de almacenamiento de semilla) así como promotores "de germinación de semilla" (aquellos promotores activos durante la germinación de las semillas). Ver Thompson y colaboradores, (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la presente por referencia. Tales promotores preferidos de semilla incluyen, pero no están limitados a, Ciml (mensaje inducido por ci toquinina ) ; cZ19Bl (zeína de 19 kDa de maíz) y milps (mio-inositol-l-fosfato sintasa) (ver la patente norteamericana No. 6,225,529, incorporada en la presente por referencia. Gamma-zeína y Glob-1 son promotores específicos de endosperma . Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a ß-faseolina de frijol, napina, ß-conglicinin , lectina de soya, cruciferina y los similares. Para monocotiledónea s , los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a, zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa de maíz, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Ver también el document O 00/12733, donde los promotores preferidos de semilla de los genes endl y end2 son divulgados; incorporada en la presente por referencia. Un promotor que tiene expresión "preferida" en un tejido particular es expresa en ese tejido un grado más grande que en por lo menos otro tejido de planta. Algunos promotores preferidos de tejido muestran · expresión casi exclusivamente en el tejido particular . Donde se desea bajo nivel de expresión, serán utilizados promotores débiles. Generalmente, el término "promotor débil" como se utiliza en la presente se refiere a un promotor que induce la expresión de una secuencia de codificación a un bajo nivel. Por expresión de bajo nivel a niveles de aproximadamente 1/1000 transcriptos a aproximadamente. 1/100,000 transcriptos a aproximadamente 1/500,000 transcriptos es propuesta. Alternativamente, se reconoce que el término "promotores débiles" también abarca promotores que inducen la expresión en solamente unas cuentas células y no en otras para dar un bajo nivel total de expresión. Donde un promotor induce la expresión en niveles inaceptablemente altos, porciones de la secuencia de promotor se pueden suprimir o modificar para disminuir los niveles de expresión . Tales promotores constitutivos débiles incluye, por ejemplo, el promotor de núcleo del promotor Rsyn7 (WO 99/43838 y la patente norteamericana No. 6,072,050), el promotor 35S de CaMV de núcleo, y los similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos divulgados en las patentes nor eamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611; incorporadas en la presente por referencia. Generalmente, el cásete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de célula transformada. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibiótico, tales como aquellos que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), asi como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tal como glufosinato amonio, bromoxinilo, imida zolinonas y 2 , 4 -diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ejemplos adicionales de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican la resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella y colaboradores, (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella y colaboradores, (1983) Nature 303:209-213; y Meijer y colaboradores, (1991) Plant Mol. Biol. 16:807- 820); estreptomicina (Jones y colaboradores, (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91); espectinomicina ( Bretagne-Sagnard y colaboradores, (1996) Transgenic Res. 5:131 -137); bleomicina ' (Hille y colaboradores, (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau y colaboradores, (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinilo (Stalker y colaboradores, (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw y colaboradores, (1986) Science 233:478-481; y las solicitudes norteamericanas Nos. de serie 10/004,357; y 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock y colaboradores, (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506- 511; Chhstopherson y colaboradores, (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao y colaboradores, (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbio!. 6:2419-2422; Barkley y colaboradores, (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu y colaboradores, (1987) Cell 48:555-566; Brown y colaboradores, (1987) Cell 49:603-612; Figge y colaboradores, (1988) Cell 52:713-722; Deuschle y colaboradores, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst y colaboradores, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle y colaboradores, (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines y colaboradores, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow y colaboradores, (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti y colaboradores, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Bairn y colaboradores, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88:5072-5076; Wyborski y colaboradores, (1991) Nucleic Acids Res. 19:46 7-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb y colaboradores, (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt y colaboradores, (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen y colaboradores, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva y colaboradores, (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka y colaboradores, (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); y Gilí y colaboradores, (1988) Nature 334:721-724. Tales descripciones son incorporadas en la presente por referencia. La lista anterior de genes marcadores seleccionadles no se propone para ser limitativa. Cualquier gen marcador seleccionable se puede utilizar en las modalidades . Los métodos de las modalidades involucran introducir un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducción" se propone para dar a entender la presentación a la planta del polinucleótido o polipéptido de una manera tal que la secuencia gana acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de las modalidades no dependen de un método particular para introducir un polinucleótido o polipéptido en una planta, solo que el polinucleótido o polipéptido gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica e incluyen pero no limitados a, métodos de transformación estables, métodos de transformación transientes y métodos mediados por virus. "Transformación estable" se propone para dar a entender que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma . "Transformación transiente" se propone para dar a entender que un polinucleótido es introducido en la planta y no se integra en el genoma de la planta o un polipéptido se introduce en una planta . Los protocolos de transformación asi como protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células de plantas y la inserción subsecuente en el genoma de la planta incluyen la microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores, (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606) , transformación mediada por Agrobacterium (patentes norteamericanas Nos. 5,563,055 y 5,981,840) , transferencia de gen directa (Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2 17-2722) , y aceleración de partículas balísticas (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; y 5,932,782; Tomes y colaboradores, (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture : Fundamental Methods, ed . Gamborg y Phillips ( Springer-Ve lag , Berlín) ; y McCabe y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926); y la transformación de Lecl (WO 00/28058) . Para la transformación de papa ver Tu y colaboradores, (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838 y Chong y colaboradores, (2000) Transgenic Research 9:71 -78. Procedimientos de transformación adicionales se pueden encontrar en eissinger y colaboradores, (1988) Ann. Rev . Genet. 22:421-477 ; Sanford y colaboradores, (1987) Particulate Science y Technology 5:27-37 (cebolla) ; Chhstou y colaboradores, (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soya) ; McCabe y colaboradores, (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soya) ; Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev . Biol. 27P: 175-182 (soya); Singh y colaboradores, (1998) Theor. Appl . Genet. 96:319-324 (soya); Datta y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores, (1988) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz) ; patentes norteamericanas Nos. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein y colaboradores, (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz) ; Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores, (1984) Nature (London) 311:763-764; patente norteamericana No. 5,736,369 (cereales); Bytebier y colaboradores, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliáceas) ; De Wet y colaboradores, (1985) in The Experimenta 1 Manipulation of Ovule Tissues, ed . Chapman y colaboradores, (Longman, New York), pp. 197-209 (polen) ; Kaeppler y colaboradores, (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores, (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por whisker) ; D' Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eiectroporacion) ; Li y colaboradores, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Chhstou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por la vía de Agrobacterium tuwefaciens) ; todas las cuales se incorporan en la presente por referencia.
En modalidades especificas, las secuencias de las modalidades se pueden proporcionar a una planta utilizando una variedad de métodos de transformación transiente. Tales métodos de transformación transiente incluyen, pero no están limitados a, la introducción de la proteína de toxina Cry o variantes y fragmentos de la misma directamente en la planta o la introducción del transcripto de toxina de Cry dentro de la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o bombardeo de partículas. Ver, por ejemplo, Crossway y colaboradores, (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura y colaboradores, (1986) Plant Sci. 44:53- 58; Hepler y colaboradores (1994) Proc . Nati. Acad. Sci. 91:2176-2180 y Hush y colaboradores, (1994) The Journal oí Cell Science 107:775-784, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Alternativamente, el polinucleótido de toxina Cry puede ser transformado transientemente en la planta utilizando técnicas conocidas en el arte. Tales técnicas incluyen el sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido de una manera que evita la liberación subsecuente del DNA. Así, la transcripción del DNA enlazado a partícula puede ocurrir, pero la frecuencia con la cual es liberado para llegar a ser integrado en el genoma es grandemente reducida. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilenimina (PEI; Sigma P3143) .
Se conocen métodos en la técnica para la inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación especifica en el genoma de la planta. En una modalidad, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra utilizando un sistema de recombinación especifico del sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Brevemente, el polinucleótido de las modalidades puede ser contenido en el cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El cásete de transferencia se introduce en una planta que tiene establemente incorporada en su genoma, un sitio objetivo que es flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Una recombinasa apropiada se proporciona y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. El polinucleótido de interés es de esta manera integrado en una posición cromosómica especifica en el genoma de la planta. Las células que se han transformado pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivadas, ya sea polinizadas con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva o inducible de la característica fenotípica deseada, identificado. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada sea establemente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas para asegurar la expresión de la característica fenotípica deseada que se ha logrado . Las secuencias de nucleótidos de las modalidades se pueden proporcionar a la planta al ponerla en contacto a la planta con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos involucran incorporar la construcción de nucleótidos de interés dentro de una molécula de DNA o RNA viral. Se reconoce que las proteínas recombinantes de las modalidades pueden ser inicialmente sintetizadas como parte de una poliproteína viral, esta última puede ser procesada mediante proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína plaguicida deseada. También se reconoce que tal poliproteína viral, que comprende por lo menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína plaguicida de las modalidades, puede tener la actividad plaguicida deseada. Tales poliproteíñas virales y las secuencias de nucleótidos que las codifican están comprendidos por las modalidades. Los métodos para proporcionar plantas con construcciones de nucleótidos y la producción de proteínas codificadas en las plantas, que involucran moléculas de DNA o RNA virales son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367 y 5,316,931; incorporadas en la presente por referencia . Las modalidades además se relacionan al material de propagación de plantas de una planta transformada de las modalidades que incluye, pero no limitado a, semillas, tubérculos, tallos bulbosos, bulbos, hojas y cortes de raices y retoños. Las modalidades se pueden utilizar para transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maiz (Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B. napus , B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Bra ssica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale,) sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucu ) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra (Setaria itálica) , mijo extendido (Eleusine coracana) ) , girasol (Helianthus annuus) , cártamo (Cartha us tinctorius) , trigo (Triticu aestivum) , soya (Glycine ax) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanum tuberosum) , cacahuates (Arachis hipogaea) , algodón (Gossypium barbadense , Gossypíum hirsutum) , camote ( Ipomoea batatus) , casava {Manihot esculenta) , café {Coffea spp.), coco {Cocos nucífera) , pina {Ananas comosus) , árboles cítricos {Citrus spp.), cacao {Theobroma cacaco) , te {Camellia sinensis) , plátano {Musa spp.), aguacate {Persea americana) , higo {Ficus casica), guayaba {Psidium guajava) , mango {Mangifera indica), olivo {Olea europaea) , papaya {Carica papaya) , anacardo {Anacardium occiden ta le) , macadamia {Macadamia integrifolia) , almendra {Prunus amygdalus) , betabeles {Beta vulgaris), caña de azúcar {Saccharum spp.), avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa) , habichuelas verdes {Phaseolus vulgaris), habas {Phaseolus limensis) , guisantes {Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) , y melón (C. meló) . Las plantas ornamentales incluyen azalea {Rhododendron spp.), hidrángea {Macrophylia hydrangea) , hibisco {Hibiscus rosasanensis) , rosas {Rosa spp.), tulipanes {Tulipa spp.), narcisos {Narcissus spp.), petunias {Petunia hybrida) , clavel {Dianthus caryophyllus) , pastora roja {Euphorbia pulcherri a) , y crisantemo. Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de las modalidades incluyen, por ejemplo, pinos tal como el pino del incienso {Pinus taeda) , pino de tala {Pinus ellíotii) , pino ponderosa {Pinus ponderosa) , pino lodgepole {Pinus contorta), y pino Monterrey (Pinus radiata) ; abeto de Douglas {Pseudotsuga menziesil) ; pinabete del occidente (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka (Picea glauca); madera roja {Sequoia sempervirens) ; abetos típicos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto de bálsamo (Abies balsames) ; y cedros tales como cedro rojo del occidente {Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis) . Las plantas de las modalidades incluyen plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica , soya, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), tales como plantas de maíz y de soya. Las hierbas de césped incluyen, pero no están limitadas a: hierba azulada anual (Poa annua) ; ballico anual (Lolium multiflorum); hierba azulada de Canadá {Poa compressa) ; cañuela Chewings {Festuca rubra); agróstida colonial (Agrostis tenuis) ; agróstida de trepadora (Agrostis palustris) ; hierba trigueña crestada {Agropyron desertorum) ; hierba trigueña alisada (Agropyron cristatum); cañuela dura (Festuca longifolia) ; hierba azulada de entucky (Poa pratensis) ; hierba de huerto (Dactylis glomerata); ballico perenne (Lolium perenne) ; cañuela roja (F'estuca rubra); agrostis alba (Agrostis alba); hierba azulada velluda (Poa trivialis) ; cañuela de pastoreo (Festuca ovina); bromo liso (Bromus inermis) ; cañuela alta (Festuca arundinacea) ; fleo (Phleum pratense); agróstida aterciopelada (Agrostis canina); hierba llorona (Pucc.inel.lia distans) ; hierba trigueña del oeste (ñgropyron simithii) ; hierba de Bermuda (Cynodon spp.); hierba de San Agustín ( Stenotaphrum secunda tum) ; hierba zoysia (Zoysia spp.);. hierba de Bahía (Paspalum nota tum) ; hierba alfombrada (Axonopus affinís) ; hierba centípeda (Eremochloa ophiuroides) ; hierba kikuyu (Pennisetum clandesinum) ; páspalo de rivera de mar (Paspalum vagina tum) ; grama azulada (Bouteloua gracilis) ; hierba de pradera (Buchloe dactyloids) ; grama de ladera (Bouteloua curtipendula) . Plantas de interés incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semilla de aceite y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Las plantas de semilla de aceite incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica , maíz, alfalfa, palma, coco, lino, ricino, olivo, etc. Las plantas leguminosas incluyen frijoles y guisantes. Los frijoles incluyen guar, algarroba, fenegreco, soya, frijoles de jardín, caupí, mungo, haba, fava bean, lentejas, garbanzo, etc . En ciertas modalidades las secuencias de ácido nucleico de las modalidades pueden ser apiladas con cualquier combinación de secuencia de polinucleótido de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de las modalidades pued,en ser apilados con cualquiera de otros polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad plaguicida y/o insecticida, tal como otras proteínas tóxicas de Bt (descritas en las patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; ¦ 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; y Geiser y colaboradores (1986) Gene 48:109), pentina (descrita en la patente norteamericana No. 5,981,722) y los similares. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples ' copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de las modalidades también pueden ser apilados con cualquier otro gen o . combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de atributos deseados incluyen, pero no limitados a, atributos deseables para alimento de animales tales como genes de alto contenido de aceites (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo hordotioninas (patentes norteamericanas Nos. 5,990,389;' 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,049); cebada de alto contenido de lisina (Williamson y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas de alto contenido de metionina (Pedersen y colaboradores, (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara y colaboradores, (1988) Gene 71 :359; y Musumura y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud norteamericana No. 10/053,410, presentada el 7 de Noviembre del 2001); y tiorredoxinas (solicitud norteamericana No. 10/005,429, presentada el 3 de Diciembre del 2001)), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los polinucleótidos de las modalidades también pueden ser apilados con atributos deseables para resistencia a enfermedades o herbicidas (por ejemplo, genes de destoxificación de fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia y a enfermedades (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; y Mindhnos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia de herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) ; y la resistencia a glifosato (gen EPSPS y gen GAT como es divulgado en las solicitudes norteamericanas Nos. de serie 10/004,357; y 10/427,692); y atributos deseables para el procesamiento o productos de proceso tal como alto contenido de aceites (por ejemplo, patente norteamericana No. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (patente norteamericana No. 5,952,544; WO 94/11516) ) ; almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPase) , sintasas de almidón (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SBE) y enzimas de desramificación de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente norteamericana No. 5.602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa, y acetoacetil-CoA reductasa ( S ch ube rt y colaboradores, (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de las modalidades con polinucleótidos que proporcionan atributos agronómicos tal como esterilidad masculina (por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5.583,210), resistencia del tallo, tiempo de florecimiento o atributos de tecnología de transformación, tal como la regulación del ciclo celular o la dirección del gen (por ejemplo O 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Estas combinaciones apiladas se pueden crear mediante cualquier método que incluye pero no limitado a la reproducción cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TOPCROSS® o transformación genética. Si los atributos se apilan al transformar genéticamente las plantas, las secuencias de polinucleótido de interés se pueden combinar en cualquier tiempo y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más atributos deseados se puede utilizar como el objetivo para introducir atributos adicionales mediante la transformación subsecuente. Los atributos se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de co-transformación con los polinucleótidos de interés proporcionados mediante cualquier combinación de cásete de transformación. Por ejemplo, si dos secuencias serán introducidas, las dos secuencias pueden ser contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidas en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de la secuencia se puede inducir mediante el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Este se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de atributos en la planta. Además se reconoce que las secuencias de polinucleótido pueden ser apiladas en una ubicación genómica deseada utilizando un sistema de recombinación especifico del sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, W099/25840 , 099/25855, y W099/25853, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Las composiciones de las modalidades encuentran uso en la protección de plantas, semillas y productos de plantas en una variedad de maneras. Por ejemplo, las composiciones se pueden utilizar en un método que involucra colocar una cantidad efectiva de la composición plaguicida en el medio ambiente de la plaga mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de rociado, espolvoreamiento, dispersión o recubrimiento o de semilla. Antes de la propagación de plantas el material (fruto, tubérculo, bulbo, tallo bulboso, granos, semillas), pero especialmente semilla, se vende como un producto comercial, este es usualmente tratado con un recubrimiento protector que comprende herbicidas, insecticidas, funguicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea conjuntamente con portadores adicionales, surfactantes , o adyuvantes promotores de la aplicación usualmente empleados en la técnica de formulación para proporcionar protección contra el daño causado por plagas bacterianas, fúngales o de animales. Con el fin de tratar la semilla, el recubrimiento protector puede ser aplicado a las semillas ya sea al impregnar los tubérculos o granos con una formulación liquida o al recubrirlos con una formulación húmeda o seca combinada. Además, en casos especiales, otros métodos de aplicación a las plantas son posibles, por ejemplo, el tratamiento dirigido a los brotes o al fruto. La semilla de planta de las modalidades que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina plaguicida de la invención se puede tratar con un recubrimiento protector de semilla que comprende un compuesto de tratamiento de semilla, tal como, por ejemplo, captan, carboxin, tiram, metalaxilo, pirimifos-metilo y otros que son comúnmente utilizados en el tratamiento de semillas. En una modalidad, un recubrimiento protector de semilla que comprende una composición plaguicida de las modalidades se utiliza solo o en combinación con uno de los recubrimientos protectores de semilla usualmente utilizados en el tratamiento de semillas. Se reconoce que los genes que codifican las proteínas plaguicidas pueden ser utilizados para transformar organismos patogénicos de insecto. Tales organismos incluyen baculovirus, hongos, protozoa rios , bacterias y nemátodos. Un gen que codifica una proteina plaguicida de las modalidades se puede introducir por la vía de un vector adecuado en un hospedero microbiano, y el hospedero aplicado al medio ambiente, o a las plantas o animales. El término "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula, significa " transíección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica donde el ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástida o DNA mitocóndrico ) , convertido en un replicón autónomo, o transientemente expresado (por ejemplo, mRNA transfectado). Los hospederos de microorganismos que son conocidos que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplana) de uno o más cultivos de interés peden ser seleccionados. Estos microorganismos se seleccionan en cuanto a ser capaces de competir exitosamente en el medio ambiente particular con el microorganismo de tipo silvestre, proporcionar mantenimiento estable y expresión del gen que expresa la proteína plaguicida, y deseablemente, proporcionar protección mejorada del plaguicida de la degradación e inactivación ambiental. Tales microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De particular interés son los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudo onas , Erwinia, Serratia, Klebsiella , Xanthomona s , S treptomyces , Rhizobium, Rhodopseudo onas , Methylius , ñgrobacterium , Acetobacter, Lactobacillus , Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongos, particularmente levadura, por ejemplo, Saccharomyces , Cryptococcus , Kluyvero yces , Sporobolomyces , Rhodotorula, y Aureobasidium . De interés particular son tales especies bacterianas de litosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens , Serratia marcescens , Acetobacter xylinum, Agrobacteria , Rhodopseudomona s spheroides, Xanthomonas campestris , Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus , Clavibacter xyli y Azotobacter vinlandir y especies de levadura de fitósfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis , R. marina, R. aurantiaca , Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. lauren tii , Saccharomyces rosei, S. pretoriensis , S. cerevisiae , Sporobolomyces rosues, S. Odorus , Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans . De particular interés son los microorganismos pigmentados. Un número de maneras están disponibles para introducir un gen que expresa la proteina plaguicida en el hospedero de microorganismo bajo condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Por ejemplo, se pueden construir casetes de expresión que incluyen las construcciones de nucleótidos de interés operablemente enlazados con las señales reguladoras de transcripción y de traducción para la expresión de las construcciones de nucleótidos, y una secuencia de nucleótidos homologa con una secuencia en el organismo hospedero, mediante lo cual ocurrirá la integración, y/o un sistema de replicación que es funcional en el hospedero, mediante lo cual ocurrirá la integración o el mantenimiento estable. Las señales reguladoras de transcripción y de traducción incluyen pero no están limitadas a, promotores, sitios de inicio de iniciación transcripcional , operadores, activadores, mejoradores, otros elementos reguladores, sitios de enlace ribosomales, un codón de iniciación, señales de terminación y los similares. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,039,523 y 4,853,331; EPO 0480762A2; Sambrook y colaboradores (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed . Maniatis y colaboradores (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Davis y colaboradores, eds . (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor., New York; y las referencias citadas en las mismas. Las células hospederas adecuadas, donde las células que contienen la proteína plaguicida serán tratadas para prolongar la actividad de las proteínas plaguicidas en la célula cuando la célula tratada es aplicada al medio ambiente de la(s) plaga (s) objetivo, puede incluir ya sea procariotas o eucariotas, normalmente siendo limitado a aquellas células que no producen sustancias tóxicas u organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen sustancias tóxicas u organismos superiores podrían ser utilizadas, donde la toxina es inestable o el nivel de aplicación suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un hospedero mamífero. Como hospederos, de particular interés serán las procariotas y las eucariotas inferiores, tales como hongos. Las procariotas ilustrativas, tanto gram negativas y gram positivas, incluyen Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, Erwinia , Shigella, Salmonella, y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae , tal como Rhizobium ; Spirillaceae , tal como photobacterium , Zy omonas , Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacilla ceae ; Pseudomonada ceaa , tal como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae . Entre las eucariotas están los hongos, tales como P ycomycetes y Ascomycetes , que incluye levadura, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces ; y levadura de Basidiomycetes , tales como Rhodotorula , Aureoba sídiu , Sporobolowyces y los similares. Características de interés particular en la selección de una célula hospedera para propósitos de la producción de proteína plaguicida incluye la facilidad de introducción del gen de proteína plaguicida en el hospedero, disponibilidad de los sistemas de expresión, eficiencia de la expresión, estabilidad de la proteína en el hospedero, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para el uso como una microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como las paredes de células gruesas, pigmentación y empaque intracelular o formación de cuerpos de inclusión; afinidad de la hoja; falta de toxicidad del mamífero; capacidad atrayente a las plagas para ingestión; facilidad de exterminación y fijación sin daño a la toxina; y los similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de formulación y manejo, economía, estabilidad de almacenamiento y los similares.
Los organismos hospederos de interés particular incluyen levadura, tales como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp. , Saccharomyces spp. , y Sporobolomyces spp. , organismos filoplanos tales como Pseudomonas spp. , Erwinia spp. , y Flavobacteriu spp. , y otros organismos de tal clase incluyendo Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae , Bacillus thuringiensis , Escherichia coli, Bacillus subtilis, y los similares. Los genes que codifican las proteínas plaguicidas de la invención se pueden introducir en microorganismos que se multiplican en plantas (epífitos) para suministrar proteínas plaguicidas a plagas objetivos potenciales. Los epífitos, por ejemplo, pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas. Las bacterias de colonización de raíz, por ejemplo, se pueden aislar de la planta de interés por métodos conocidos en la técnica. Específicamente, una cepa de Bacillus cereus que coloniza la raíz se puede aislar de las raíces de una planta (ver, por ejemplo, Haldelsman y colaboradores (1991) Appl . Environ. Microbiol . 56:713-718). Los genes que codifican las proteínas plaguicidas de la invención se pueden introducir en un Bacillus cereus de colonización de raíz mediante métodos estándares conocidos en la técnica. Los genes que codifican proteínas plaguicidas pueden ser introducidos, por ejemplo, en el Bacillus de colonización de raíz por medio de electrotransformación . Específicamente, los genes que codifican las proteínas plaguicidas se pueden clonar en un vector de lanzadera, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218). El vector de lanzadera pHT3101 que contiene la secuencia de codificación para el gen de proteína plaguicida particular puede ser, por ejemplo, transformado en el Bacillus de colonización de raíz por medio de electroporación (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218). Los sistemas de expresión pueden ser diseñados de modo que las proteínas plaguicidas son secretadas fuera el citoplasma de la bacteria gram negativa, E. coli, por ejemplo. Las ventajas de tener proteínas plaguicidas secretadas son: (1) evitar efectos citotóxicos potenciales de la proteína plaguicida expresada y (2) mejora en la eficiencia de la purificación de la proteína plaguicida, incluyendo, pero no limitado a, eficiencia incrementada en la recuperación y purificación de la proteína por volumen de caldo celular y tiempo disminuido y/o costos de recuperación y purificación por proteína unitaria. Las proteínas plaguicidas se pueden hacer para ser secretadas en E. coli, por ejemplo, mediante fusión de un péptido de señal de E. coli apropiado al extremo amino- terminal de la proteína plaguicida. Los péptidos de señal reconocidos por E. coli se pueden encontrar en proteínas ya conocidas que son secretadas en E. coli, por ejemplo la proteína OmpA (Ghrayeb y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2437-2442) . OmpA es una proteína mayor de la membrana externa de E. coli, y de esta manera su péptido de señal se piensa que es eficiente en el proceso de translocación. También, el péptido de señal OmpA no necesita ser modificado antes del procesamiento como podría ser el caso para otros péptidos de señal, por ejemplo, el péptido de señal de lipoproteína (Duffaud y colaboradores (1987) Meth. Enzymol. 153:492) . Las proteínas plaguicidas de la invención se pueden fermentar en un hospedero bacteriano y las bacterias resultantes procesadas y utilizadas como un rocío microbiano de la misma manera que las cepas de Bt se han utilizado como rocíos insecticidas. En el caso de una (s) proteína (s) plaguicida que es secretada de Bacillus , la señal de secreción se remueve o se muta utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Tales mutaciones y/o supresiones previenen la secreción de la(s) proteína (s) pesticida(s) en el medio de crecimiento durante el proceso de fermentación. Las proteínas plaguicidas son retenidas dentro de la célula, y las células luego son procesadas para producir las proteínas plaguicidas encapsuladas . Cualquier microorganismo adecuado puede ser utilizado para este propósito. Las Pseudomonas se han utilizado para expresar toxinas de Bt como proteínas encapsuladas y las células resultantes procesadas y rociadas como un insecticida (Gaertner y colaboradores (1993) in: Advanced . Engineered Pesticides, ed . Kim) . Alternativamente, las proteínas plaguicidas se producen al introducir un gen heterólogo en un hospedero celular. La expresión del gen heterólogo resulta, directamente o indirectamente en la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. Estas células luego se tratan bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula, cuando la célula es aplicada al medio ambiente de la(s) plaga (s) objetivo. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estas proteínas plaguicidas naturalmente encapsuladas luego pueden ser formuladas de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación al medio ambiente en que se hospeda una plaga objetivo, por ejemplo, la tierra, agua y el follaje de las plantas. Ver, por ejemplo EPA 0192319 y las referencias citadas en la misma. En las modalidades, un microorganismo transformado (que incluye organismos completos, células, espora (s), proteína (s) plaguicida ( s ) , componen te ( s ) plaguicida ( s ) , componente ( s ) que impactan plagas, mutante(s), células vivas o muertas y componentes de células, incluyendo mezclas de células vivas y muertas y componentes de células, e incluyendo células rotas y componente de células) o una proteina plaguicida aislada se puede formular con un portador aceptable en una (s) composición ( es ) plaguicida esto es, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo de espolvoreamiento, un gránulo dispersable, un polvo humectable, y un concentrado emulsificable, un aerosol, un gránulo impregnado, un adyuvante, una pasta recubrible y también encapsulaciones en, por ejemplo, sustancias poliméricas. Tales composiciones formuladas se pueden preparar por tales medios convencionales como desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. Tales composiciones divulgadas en lo anterior se pueden obtener mediante la adición de un agente activo en la superficie, un portador inerte, un conservador, un humectante, un estimulante de alimentación, un atrayente, un agente encapsulante, un aglutinante, un emulsificante, un tinte, un protector de UV, una solución reguladora, un agente de flujo o fertilizantes, donadores de micronutrientes u otras preparaciones que influyen en el crecimiento de la planta. Uno o más agroquimicos incluyendo, pero no limitados a, herbicidas, insecticidas, funguicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas , acaricidas, reguladores de crecimiento de plantas, auxiliares de cosecha y fertilizantes I 14 se pueden combinar con portadores, surfactantes o adyuvantes usualmente empleados en la técnica de formulación u otros componentes para facilitar el manejo del producto y la aplicación para las plagas objetivo particulares. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales, naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, pegaj osificantes , aglutinantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de las modalidades normalmente se aplican en la forma de composiciones y se pueden aplicar el área de cultivo, planta o semilla que es tratada. Por ejemplo, las composiciones de las modalidades se pueden aplicar al grano en la preparación o durante el almacenamiento en un almacén o silo de grano, etc. Las composiciones de las modalidades se pueden aplicar simultáneamente o en sucesión con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo de las modalidades o una composición agroquímica de las modalidades que contiene por lo menos una de las proteínas plaguicidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, aplicación foliar, recubrimiento de semilla y aplicación a la tierra. El número de aplicaciones y la proporción de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.
Los agentes activos en la superficie adecuados incluyen, pero no están limitados a, compuestos aniónicos tales como carboxilato de, por ejemplo, un metal; carboxilato de ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato ; mono o di-ésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol grasos o sales de tales ásteres, sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfatos de alcohol graso etoxilados; sulfato de alquilfenol etoxilado; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo, sulfonatos de alquil arilo tales como sulfonatos de alquil-benceno o sulfonatos de alquilnaftaleno inferior, por ejemplo, sulfonato de butil-naftaleno; sales de condensados de naf taleno-formaldehido sulfonados, sales de condensados de fenol-formaldehido sulfonados; sulfonatos más complejos tales como sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto de condensación sulfonado de ácido oleico con N-metil taurina; o los sulfosuccinatos de dialquilo, por ejemplo el sulfonato de sodio o succinato de dioctilo. Agentes no iónicos incluyen los productos de condensación de ásteres de ácido graso, alcoholes grasos, amidas de ácido graso o fenoles sustituidos con alquilo o alquenilo grasos con óxido de etileno, ásteres grasos o ásteres de alcohol polihidrico, por ejemplo, ásteres de ácido graso de sorbitán, productos de condensación de tales ásteres con óxido de etileno, por ejemplo, ásteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, copolimeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2 , 4 , 7 , 9-tetraetil-5-decin-4 , 7-diol , o glicoles acetilénicos etoxilados. Ejemplos de un agente activo en la superficie catiónica incluye, por ejemplo, una mono-, di-, o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato u oleato; amina que contiene oxigeno tal como un óxido de amina de polioxietilen alquilamina ; una amina enlazada a amida, preparada mediante la condensación de un ácido carboxilico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternaria. Ejemplos de materiales inertes incluyen pero no están limitados a minerales inorgánicos tales como caolín, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos o materiales botánicos tales como corcho, elotes en polvo, vainas de cacahuate, vainas de arroz, y cáscaras de nuez. Las composiciones de las modalidades pueden estar en una forma adecuada para la aplicación directa o como un concentrado de la composición primaria que requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración plaguicida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, si es concentrada o es utilizada directamente. La composición contiene de 1 a 98% de un portador inerte sólido o líquido, y 0 a 50%, de preferencia 0.1 a 50% de un surfactante. Estas composiciones serán administradas en la proporción marcada para el producto comercial, de preferencia aproximadamente 0.1 lb-5.0 Ib. por acre cuando está en forma seca o en aproximadamente 0.01 pts.-?? pts. por acre cuando está en forma liquida. En una modalidad adicional, las composiciones, asi como los microorganismos transformados y proteínas plaguicidas de las modalidades se pueden tratar antes de la formulación para prolongar la actividad plaguicida cuando se aplica al medio ambiente de una plaga objetivo mientras que el pretratamiento no sea perjudicial a la actividad plaguicida. Tal tratamiento puede ser por medios químicos y/o físicos mientras que el tratamiento no afecte perjudicialmente las propiedades de la(s) composición (es ) . Ejemplos de reactivos químicos incluyen pero no están limitados a agentes de halogenación ; aldehidos tales como formaldehído y glutaraldehído; antiinfecciosos, tales como cloruro de zefiran; alcoholes, tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tal como el fijador de Bouin y el fijador de Helly (ver, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co . ) . En otras modalidades, puede ser ventajoso tratar los polipéptidos de toxina Cry con una proteasa, por ejemplo tripsina, para activar la proteína antes de la aplicación de una composición de proteína plaguicida de las modalidades al medio ambiente de la plaga objetivo. Los métodos para la activación de protoxina mediante una proteasa de serina son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 y Carrol y Ellar (1989) Biochem J. 261:99-105, las enseñanzas de la cual son incorporadas en la presente por referencia. Por ejemplo, un protocolo de activación adecuado incluye, pero no está limitado a, combinar un polipéptido a ser activado, por ejemplo, un polipéptido Cry novedoso purificado (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NI:2), y tripsina en una relación en peso de 1/100 de proteína /tripsina en NaHC03 20 nM, pl-1 8 y al digerir la muestra a 36°C durante 3 horas. Las composiciones (incluyendo los microorganismos transformados y las proteínas plaguicidas de las modalidades) se pueden aplicar al medio ambiente de una plaga de insectos mediante, por ejemplo, rociado, atomización, espolvoreamiento, dispersión, recubrimiento o vaciado, la introducción en o sobre la tierra, la introducción en el agua de irrigación, mediante el tratamiento de semilla o la aplicación general o el espolvoreamiento en el tiempo cuando la plaga ha comenzado a aparecer o antes de la aparición de las plagas como una medida protectora. Por ejemplo, la proteína plaguicida y/o microorganismos transformados de las modalidades se pueden mezclar con grano para proteger al grano durante el almacenamiento. Generalmente es importante I 19 obtener buen control en las plagas en las etapas más tempranas del crecimiento de la planta, ya que este es el tiempo cuando la planta puede ser más severamente dañada. Las composiciones de las modalidades pueden convenientemente contener otro insecticida si esto se piensa necesario. En una modalidad, la composición se aplica directamente en la tierra, en el momento de la plantación, en forma granular de una composición de un portador y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismos transformados de las modalidades. Otra modalidad es una forma granular de una composición que comprende un agroquimico tal como, por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, un portador inerte y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismos transformados de las modalidades. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que no todos los compuestos son igualmente efectivos contra todas las plagas. Los compuestos de las modalidades exhiben actividad contra plagas de insectos, que pueden incluir plagas económicamente importantes de agronomía, bosque, invernadero, vivero, plantas ornamentales, alimento y fibra, salud pública y animal, estructura doméstica y comercial, de la casa y de productos almacenados. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera , Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera , Trichoptera , etc., particularmente Lepidoptera . Las larvas del orden Lepidoptera incluyen, pero no están limitados a, gusanos devastadores, orugas cortadoras, orugas medidoras y heliotinos en la familia Noctuidae Spodoptera f ugiperda JE Smith (gusano devastador de otoño) ; S. exigua Hubner (gusano devastador de remolacha); S. litura Fabhcius (oruga cortadora de tabaco, oruga agrupada); Mamestra configurata Walker (gusano devastador bertha); M. brassicae Linnaeus (polilla de col) ; Agrotis ípsilon Hufnagel (oruga cortadora negra); A. orthogonia Morrison (oruga cortadora del oeste); A. subterránea Fabricius (oruga cortadora granulada); Alabama argillacea Hubner (gusano de hoja de algodón) ; Trichoplusia ni Hubner (oruga medidora de col) ; Pseudoplusia includens Walker (oruga medidora de soya) ; Anticarsia gemmatalis Hubner (oruga de haba); Hypena scabra Fabricius (trébol verde); Heliothis virescens Fabricius (gusano de brote de tabaco) ; Pseudaletia unipuncta Haworth (gusano devastador) ; Athetis mindara Barnes y Mcdunnough (oruga cortadora con piel rugosa); Euxoa messoria Harris (oruga cortadora con lados oscuros) ; Barias insulana Boisduval (gusano de algodón espinoso) ; E. vittella Fabricius (gusano de algodón con manchas); Helicoverpa armígera Hübner (gusano de algodón Americano) ; /-/. zea Boddie (gusano de mazorca de maíz o gusano de algodón) ; Melanchra picta Harris (oruga zebra) ; Egira (Xylomyges) curialis Grote (oruga cortadora de cítricos); barrenillos, taladrillas, gusanos palmeados, gusanos cónicos y esqueletonizadores de la familia Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (barrenillo de maíz Europeo); Amyelois transitella Walker (gusano naranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (polilla de harina del Mediterráneo); Cadra cautella Walker (polilla de almendra); Chilo suppressalis Walker (barrenillo de tallo de arroz); C. partellus, (barrenillo de sorgo) ; Corcyra cephaloníca Stainton (polilla de arroz) ; Crambus caliginosallus Clemens (gusano palmeado de raíz de maíz) ; C. teterrel lus Zincken (gusano palmeado de hierba sedosa); Cnapha locrocis medinalis Guenee (rizador de hoja de arroz); Desmia funeralis Hübner (plegador de hoja de uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (gusano de melón); D. nitidalis Stoll (gusano de grano); Diatraea grandiosella Dyar (barrenillo de maíz del sudoeste) , D. saccharalis Fabricius (barrenillo de caña de azúcar) ; Eoreuma loftini Dyar (barrenillo de arroz Mexicano) ; Ephestia elutella Hübner (polilla de tabaco (cacao) ) ; Gallería mellonella Linnaeus (polilla encerada más grande) ; Herpetogramma licarsisa lis Walker (gusano palmeado de césped) ; Homoeosoma electellum Hulst (polilla de girasol) ; Elasmopalpus lignosellus Zeller (barrenillo de tallo de maíz más pequeño) ; Achroia grisalla Fabricius (polilla encerada más pequeña); Loxostege sticticalis Linnaeus (gusano palmeado de remolachas); Orthaga thyrisalis Walker (polilla palmeada de árbol de té) ; Maruca testula lis Geyer (barrenillo de vaina de frijol); Plodia interpunctella Hübner (polilla de harina de la India); Scirpophaga incertulas Walker (barrenillo de tallo amarillo); Udea rubigalis Guenee (amontonador de hoja de apio); y enrolladoras de la hoja, gusano de brote, gusanos de semilla y gusanos de fruta en la familia Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (gusano de brote de cabeza negra del Oeste); A. variaría Fernald (gusano de brote de cabeza negra del Este); Archips argyrospila Walker (enrollador de hoja de árbol de fruta); A. rosana Linnaeus (enrollador de hoja Europeo) ; y otras especies de Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rósslerstamm (polilla tortricida de fruto de verano) ; Cochylis hospes Walsingham (polilla de girasol franjeada); Cydia la iferreana Walsingham (gusano de avellana); C. pomonella Linnaeus (polilla distintiva); Platynota flavedana Clemens (amontonador de hoja jaspeados); P. stultana Walsingham (amontonador de hoja omnívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermóüller (polilla de vino de uva Europea) ; Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (polilla de brote de mancha ocular); Endopiza viteana Clemens (polilla de fruta pequeña de uva) ; Eupoecilia ambiguella Hübner (polilla de viña); Bonagota salubricola Meyrick (amontonador de hoja de manzana Brasileño) ; Grapholita molesta Busck (polilla de fruto oriental) ; Suleima helianthana Riley (polilla de brote de girasol); Argyrotaenia spp. ; Choristoneura spp.. Otras plagas agronómicas seleccionadas en el orden Lepidoptera incluyen, pero no están limitadas a, Alsophila pometaria Harris (oruga del otoño); ñnarsia lineatella Zeller (barrenillo de rama de durazno); Anisota senatoria J. E. Smith (gusano de roble rayado naranja); ñntheraea pernyi Guerin-Meneville (Polilla Sedosa de Roble Chino); Bombyx mori Linnaeus (gusano Sedoso); Bucculatrix thurberiella Busck (perforador de hoja de algodón); Colias eurytheme Boisduval (oruga de alfalfa); Datana integerri a Grote & Robinson (oruga de nogal) ; Dendrolimus síbiricus Tschetwerikov (polilla sedosa de Siberia), Enno os subsígnaria Hübner (medidor de olmo) ; Erannis tiliaria Harris (oruga medidora de tilo) ; Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (polilla de cola café) ; Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletonizador de hoja de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (oruga de pasto); Hyphantria cunea Drury (gusano palmeado del otoño); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiuro de tomate) ; Lambdina fiscellaría fiscellaria Hulst (saltarilla de pinabete del Este) ; L. fiscellaria lugubrosa Hulst (saltarilla de pinabete del Oeste); Leucoma salicis Linnaeus (polilla satinada); Lymantria dispar Linnaeus (polilla lagarta); Manduca quinque acula ta Haworth (polilla de esfinge de cinco manchas, gusano de antena de tomate) ; M. sexta Haworth (gusano de antena de tomate, gusano de antena de tabaco); Operophtera bru ata Linnaeus (polilla de invierno); Paleacrita vernata Peck (oruga de la primavera); Papilio cresphontes Cramer (cola de golondrina gigante, polilla naranja); Phryganidia californica Packard (gusano de roble de California); Phyllocnistis citrella Stainton (minador de hoja de cítrico); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador de hoja tentiforme manchado) ; Pieris brassicae Linnaeus (mariposa blanca grande); P. rapae Linnaeus (mariposa blanca pequeña); P. napi Linnaeus (mariposa blanca veteada verde) ; Platyptilia carduidactyla Riley (polilla de pluma de alcachofa); Plutella xylostella Linnaeus (polilla de espalda de diamante) ; Pectinophora gossypiella Saunders (gusano de algodón rosa) ; Pontia protodice Boisduval & Leconte (gusano de col del Sur) ; Sabulodes aegrotata Guenee (oruga medidora obnívora) ; Schizura concinna J. E. Smith (oruga jorobada roja); Sitotroga cerealella Olivier (polilla de grano Angoumois) ; Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (oruga procesionaria de pino) ; Tineola bisselliella Hummel (polilla de ropas tejidas); Tuta absoluta Meyrick (minador de hoja de tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (polilla de armiño) ; Heliothis subflexa Guenee; Malacosoma spp. y Orgyia spp. Las larvas y adultos del orden Coleóptera incluyen gorgojos de las familias Anthhbidae, Bruchidae y Curculionidae (que incluyen, pero no limitadas a: Anthonomus granáis Boheman (gorgojo de algodón); Lissorhoptrus oryzophilus uschel (gorgojo de agua de arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgojo de granero); S. oryzae Linnaeus (gorgojo de arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgojo de hoja de trébol); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgojo de tallo de girasol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgojo de semilla de girasol rojo); S. sordidus LeConte (gorgojo de semilla de girasol gris); Sphenophorus maidis Chittenden (bicho picudo de maíz)); escaraba j uelos , escarabajos de pepino, gusanos de raíz, escarabajos de hoja, escarabajo de papa y minadores de hoja en la familia Chrysomelidae (que incluye, pero no limitado a: Leptinotarsa decemlineata Say (escarabajo de papa de Colorado) ; Diabrotica virgifera virgifera LeConte (gusano de raíz de maíz del oeste) ; D. barberi Smith & Lawrence (gusano de raíz de maíz del norte); D. undecimpunctata howardi Barber (gusano de raíz de maíz del sur) Chaetocnema pulicaria Melsheimer (escaraba j uelo de maíz); PhylloLreta cruciferas Goeze (escarabaj uelo de maíz); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis de uva) ; Oulema melanopus Linnaeus (escarabajo de hoja de cereal); Zygogramma exclama tionis Fabricius (escarabajo de girasol)); escarabajos de la familia Coccinellidae (que incluyen, pero no limitado a: Epilachna varivestis Mulsant (escarabajo de frijol Mexicano) ) ; abejorros y otros escarabajos de la familia Scarabaeidae (que incluye, pero no limitados a: Popillia japónica Newman (escarabajo Japonés); Cyclocep ala borealis Arrow (abejorro enmascarado del norte, larva blanca); C. immacula ta Olivier (escarabajo enmascarado del sur, larva blanca); Rhizotrogus ajalis Razoumowsky (abejorro Europeo); Phyllophaga crinita Burmeister (larva blanca); Ligyrus gibbosus De Geer (escarabajo de zanahoria)); escarabajos de alfombra de la familia Dermes tidae ; cienpiés de la familia Elateridae, Eleodes spp., MelanoLus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolvs spp.; escarabajos de corteza, de la familia Scolytidae y escarabajos de la familia Tenebrionidae . Adultos e inmaduros del orden Díptera incluyen: minadores de hoja tales como Agromyza pa rvicornis Loew (minador de hoja manchado de maíz); jejenes (que incluyen, pero no limitados a: Contarinia sorghicola Coquillett (jején de sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Gehin (jején de trigo) ; Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (jején de semilla de girasol)); moscas de fruta (Tephhtidae) , Oscinella frit Linnaeus (oxinas); larvas (que incluyen, pero no limitadas a: Delía pía tura Meigen (larva de semilla de maíz); D. coarctata Fallen (mosca de bulbo de trigo); y otros Delia spp., Meromyza americana Fitch (larva de tallo de trigo) ; Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas) ; Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas domésticas más pequeñas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas de establo)); moscas de la cara, moscas de antena, moscas azules, Chryso ya spp.; Phormia spp.; y otras plagas de moscas muscoides, Tabanus spp.; moscardones Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de ganado vacuno Hypoderma spp.; moscas de ciervo Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds); y otras Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Si ulium spp.; jejenes picadores, mosquitos simúlidos, esciáridos y otros Nema Locera . Adultos y ninfas de los órdenes Hemiptera y Homoptera incluyen insectos tales como, pero no limitados a, adélgidos de la familia Adelgidae, bichos de plantas de la familia Miridae, cigarras de la familia Cicadidae, saltarillas, Empoasca spp.; de la familia Cicadellidae , langostas de plantas de las familias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae y Delphacidae, langostas de árbol de la familia Membracidae, psillidos de la familia Psyllidae, moscas blancas de la familia Aleyrodidae, áfidos de la familia Aphididae, filoxera de la familia Phylloxeridae , cocos de la familia Pseudococcidae, pulgones de las familias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae , Diaspididae, Ehococcidae, Ortheziidae, Phoenicococcidae y Margarodidae , crisopas de la familia Tingidae, chinches del bosque de la familia Pentatomidae, bichos de cincha, Blissus spp.; y otros bichos de semilla de la familia Lygaeidae, bichos de secreción de la familia Cercopidae, bichos de calabaza de la familia Coreidae, y bichos rojos y manchadores de algodón de la familia Pyrrhocoridae . Miembros agronómicamente importantes del orden Homoptera además incluyen, pero no están limitados a: Acyrthisiphon pisum 1-Iarris (áfido de guisante); Aphis craccivora Koch (áfido de caupi); A. fabae Scopoli (áfido de judia negra); A. gossypii Glover (áfido de algodón, áfido de melón); A. maidiradicis Forbes (áfido de raíz de maíz); A. pomi De Geer (áfido de manzana); A. spiraecola Patch (áfido de espirea) ; Aulacorthum solani altenbach (áfido de dedalesa); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (áfido de fresas); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (áfido de trigo Ruso); Dysaphis plantaginea Paaserini (áfido de manzana rosado) ; Eriosoma lanigerum Hausmann (áfido de manzana lanudo); Brevicoryne brassicae Linnaeus (áfido de col); Hyalopterus pruni Geoffroy (áfido de ciruela); Lipaphis erysimi Kaltenbach (áfido de nabo) ; MeLopolophium dirrhodum Walker (áfido de cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (áfido de papa); Myzus persicae Sulzer (áfido de durazno-papa, áfido de durazno verde); Nasonovia ribisnigrí Mosley (áfido de lechuga); Pemphigus spp. (áfidos de raíz y áfido de agalla); Rhopalosiphum maidis Fitch (áfido de hoja de maíz); R. padi Linnaeus (áfido de cereza-avena); Schizaphis graminum Rondani (bicho verde) ; Sípha flava Forbes (áfido de caña de azúcar amarillo); Sitobion avenae Fabricius (áfido de grano Inglés); Therioaphis maculata Buckton (áfido de alfalfa manchado); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (áfido de cítrico negro); y T. cítrícida irkaldy (áfido de cítrico café); Adelges spp. (adélgidos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de pecana); Bemisia tabaci Gennadius (mosca blanca de tabaco, mosca blanca de camote) ; B. argentifolii Bellows & Perring (mosca blanca de hoja plateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca blanca de cítrico) ; Trialeurodes abutiloneus (mosca blanca de alas con franjas) y T. vaporariorum Westwood (mosca blanca de invernadero); Empoasca fabae Harris (saltarilla de papa); Laodelphax striatellus Fallen (langosta café más pequeña); Macrolestes quadrilinea Lus Forbes (saltarilla áster) ; Nephotettix cinticeps Uhler (sasltarilla verde) ; N. nigropictus Stal (saltarilla de arroz); Nílaparvata lugens Stal (langosta café); Peregrinus maidis Ashmead (langosta de maíz); Sogatella furcifera Horvath (langosta de espalda blanca) ; Sogatodes orizicola Muir (delfácido de arroz) ; Typhlocyba pomaria McAtee (saltarilla de manzana blanca); Erythroneoura spp. (saltarillas de uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchasi Maskell (pulgón de cojín algodonoso); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgón de San José) ; Planococcus citri Risso (coco de cítrico); Pseudococcus spp. (otros complejos de coco); Cacopsylla pyricola Foerster (psilido de pera); Trioza diospyri Ashmead (persimmon psylla). Especies agronómicamente importantes del orden Hemiptera incluyen, pero no están limitadas a: Acrosternum hilare Say (bicho hediondo verde) ; Anasa tristis De Geer (bicho de carabaza); Blissus leucoptarus leucopterus Say (bicho de gorgojos); Corythuca qossypii Fabricius (bicho de encaje de algodón); Cyrtopeltis modesta Distant (bicho de tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (manchador de algodón) ; Euschistus servus Say (bicho hediondo café) ; E. variolarius Palisot de Beauvois (bicho hediondo de una manzha); Graptos tethus spp. (complejo de bichos de semilla); Leptoglossus corculus Say (bicho de semilla de pino al pie de la hoja); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (bicho de planta descolorido) ; L. Hesperus night (bicho de planta descolorido del Oeste); L. pratensis Linnaeus (bicho de prado común) ; L . rugulipennis Poppius (bicho de planta descolorido Europeo) ; Lygocoris pabulinus Linnaeus (cápsida verde común) ; Nezara viridula Linnaeus (bicho hediondo verde del sur) ; Oebalus pugnax Fabricius (bicho hediondo de arroz) ; Oncopeltus fasciatus Dallas (bicho de algodoncillo grande); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (saltarilla pulga de algodón) . Insectos incluidos en el orden Hemiptera e incluyen: Calocoris norvegicus Gmelin (bicho de fresas); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (cápsida de manzana); Cyrtopaltis odestus Distant (bicho de tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca succionadora) ; Spanagonicus a lbofasciatus Reuter (saltarilla pulga de marca blanca); Diaphnocoris chlorionis Say (bicho de planta de acacea negra); Labopidicola allii Knight (bicho de planta de cebolla); Pseudatomoscelis seriaLus Reuter (saltarilla de algodón) ; ñdelphocoris rapidus Say (bicho de planta rápido) ; Poecilocapsus linea tus Fabricius (bicho de planta de cuatro revestimientos); Nysius ericae Schilling (bicho de chinche falsa); Nysius raphanus Howard (bicho de chinche falsa); Nezara viridula Linnaeus (bicho hediondo verde del Sur) ; Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocorídae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp.; y Cimicidae spp. Adultos y larvas del orden Acari (ácaros) incluyen: Acería tosichella eifer (acaro ondeado de trigo) ; Petrobia latens üller (ácaro de trigo café); ácaros arañuelos y ácaros rojos en la familia Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro rojo Europeo) ; Tetranychus urticae och (ácaro arañuelo de dos manchas); (T. mcdanieli McGregor) (McDaniel mite) ; T. cinnabarinus Boisduval (ácaro arañuelo carmín) ; T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro arañuelo de fresas) ; ácaros planos en la familia Tenuipalpidae, Brevipa lpus lewisi McGregor (ácaro plano de cítrico) ; ácaros de tizón y brote en la familia Eriophyidae y otros ácaros de alimentación foliar y ácaros importantes en la salud humana y animal, es decir, ácaros de polvo en la familia Epidermoptidae , ácaros de folículo en la familia Demodicidae, ácaros de grano en la familia Glycyphagidae , garrapatas en el orden Ixodidae. Ixodes scapularis Say (garrapata de ciervo); I. olocyclus Neumann (garrapata de parálisis Australiana); Dermacentor variabilis Say (garrapata de perro Americana); Aniblyo ma americanum Linnaeus (garrapata de estrella solitaria); y ácaros de costra y sarna en las familias Psoroptidae, Pyemotidae, y Sarcoptidae. Las plagas de insectos del orden Thysanura incluyen Lepisma saccharina Linnaeus (lepisma); Thermobia domestica Packard (termobia). Plagas de artrópodos adicionales incluyen: arañas en el orden Araneae tales como Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (araña solitaria café) ; y la Latrodectus mactans Fabricius (araña viuda negra); y ciempiés en el orden Scutigeromorpha tal como Scutigera coleoptrata Linnaeus (ciempiés doméstico). Las plagas de insectos se pueden probar para la actividad plaguicida de composiciones de las modalidades en etapas de desarrollo tempranas, por ejemplo, como larvas u otras formas inmaduras. Los insectos se pueden criar en la oscuridad total en aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C y de aproximadamente 30% a aproximadamente 70% de humedad relativa. Los bioensayos se pueden realizar como es descrito en Czapla y Lang (1990) J. Econ . Entomol. 83 ( 6) : 2480-2485. Los métodos para criar larvas de insertos y realizar bioensayos son bien conocidos para uno de habilidad ordinaria en la técnica. Una amplia variedad de técnicas de bioensayo son conocidas para un experto en la técnica. Los procedimientos generales incluyen la adición del compuesto u organismo experimental a la fuente de dieta en un recipiente cerrado. La actividad plaguicida o pesticida se puede medir mediante, pero no está limitado a, cambios en la mortalidad, pérdida de peso, atracción, repelencia y otros cambios de comportamiento y físicos después de la alimentación y la exposición durante un período de tiempo apropiado. Los bioensayos descritos en la presente se pueden utilizar con cualquier alimentación de plaga de insectos en la etapa de larva o adulta. Los siguientes ejemplos se presentan a manera de ilustración, no a manera de limitación. EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Bioensayo para Probar la Actividad Plaguicida de la Toxina de B. thurlngiensis contra Insectos Seleccionados Se condujeron bioensayos para evaluar los efectos del péptido de toxina insecticida Bt, expuesto en la SEQ ID NO: 2, sobre el barrenillo de maíz Europeo {Ostrinia nubilalis) , gusano de mazorca de maíz {Helicoverpa zea), oruga cortadora negra (Agrotis ípsilon) y gusano devastador del otoño (Spodoptera frugiperda) . Los ensayos de alimentación se condujeron sobre una dieta artificial que contiene la proteína insecticida. La proteína insecticida se aplicó tópicamente utilizando una dieta artificial específica para lepidóptero. La toxina se aplicó en una proporción de 0.3 pg por 25 µ? de muestra por cavidad y se dejó secar. La proteína está en solución reguladora de carbonato 10 mM a un pH de 10. Una larva neonata se colocó en cada cavidad para alimentase ad libitum durante 5 días. Los resultados se expresaron como positivos para reacciones de larvas tales como atrofiamien o y/o mortalidad. Los resultados se expresaron como negativos si las larvas fueron similares al control negativo que está alimentándose de la dieta a la cual la solución reguladora anterior solamente se ha aplicado. Tabla 1: Resultados del bioensayo de alimentación para SEQ ID NO: 2 Ejemplo 2 : Determinación de LC50 y EC50 Los bioensayos se condujeron para determinar una' LC50 y EC50 del péptido de toxina insecticida, expuesto en la SEQ ID NO: 2, sobre el barrenillo de maíz Europeo (Ostrinia nubilalis) , gusano de mazorca de maíz (Halícoverpa zea), y oruga cortadora negra (Agrotis ípsilon) . Los ensayos de alimentación se conducen sobre una dieta artificial que contiene la proteína insecticida. La proteína insecticida se diluye con solución reguladora de carbonato 10 mM a pH 10 y con la dieta de insecto para dar una concentración de toxina final de 10000, 1000, 100, 10 y 1 ng/cm2. Una larva neonata se coloca en cada cavidad para alimentarse ad libitum durante 5 días. Cada bioensayo se hace con ocho duplicados en cada dosis y el bioensayo se repite tres veces. Los resultados se expresan como LC50 para mortalidad y/o EC50 al pesar las larvas supervi ientes en cada concen ración de toxina. Ejemplo 3 : Transformación del Maiz mediante Bombardeo de Partículas y Regeneración de Plantas Transgenicas Embriones de maíz inmaduros de plantas donadoras de invernadero se bombardean con una molécula de DNA que contiene la secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, SEQ ID NO:l) operablemente enlazada a un promotor de ubicuitina y el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben y colaboradores, (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialaphos. Alternativamente, el gen marcador seleccionable se proporciona sobre una molécula de DNA separada. La transformación se realiza como sigue. Las recetas de los medios se muestran enseguida.
Preparación del Tejido Objetivo Las mazorcas se despinochan y se esterilizan en la superficie con blanqueador CLOROX™ al 30% más detergente Micro al 0.5% durante 20 minutos y se enjugan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y se colocan con el lado del eje del embrión hacia abajo (lado de escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, sobre el medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en la preparación para el bombardeo. Preparación de DNA. Se hace un vector de plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, SEQ ID NO:l) operablemente enlazado a un promotor de ubicuitina. Por ejemplo, un vector de transformación adecuado comprende un promotor UBI1 de Zea mays, un 5' UTR de UBI1 y un intrón de UBI1, en combinación con un terminador Pinll. El vector adicionalmente contiene un gen marcador seleccionable PAT inducido por un promotor CAMV35S e incluye un terminador CAMV35S. Opcionalmente, el marcador seleccionable puede residir sobre un plásmido separado. Una molécula de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos de toxina así como el marcador seleccionable PAT se precipita sobre pelotillas de tungsteno de 1.1 pm (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación de CaCl2 como sigue: 100 µ? de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 µ? (1 pg) de DNA en solución reguladora de Tris EDTA (1 pg de DNA total) 100 µ? de CaCl2 2.5 10 µ? de espermidina 0.1 M Cada reactivo se adiciona secuencia Imente a una suspensión de partículas de tungsteno, mientras que se mantiene sobre el aparato formador de vórtice de multitubos. La mezcla final se sónica brevemente y se permite incubar bajo formación de vórtice constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se remueve el líquido, se lavan con 500 mi de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente el líquido se remueve, y 105 µ? de etanol al 100% se adiciona a la pelotilla de partículas de tungsteno final. Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tungsteno/DNA se sonican brevemente y 10 µ? se manchan sobre el centro de cada macroportador y se dejan secar aproximadamen e 2 minutos antes del bombardeo. Tratamiento don Pistola de Partícula Las placas de muestra se bombardean en nivel 114 en la pistola de partículas «HE34-1 o 1IHE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo en 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas /DN . Tratamiento Subsecuente Después del bombardeo, los embriones se conservan en el medio 560Y durante 2 días, luego se transfieren al medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callo resistente a la selección se transfieren al medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas) , los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para la germinación y se transfieren al cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 días después, las plantitas en desarrollo se transfieren al medio libre de hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plantitas están bien establecidas. Las plantas luego se transfieren a insertos en cajones semilleros (equivalente a maceta de 2.5") que contiene tierra de maceta y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente se cultivan 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se cultivan hasta la madurez. Las plantas se monitorean y se registran para la expresión de la toxina mediante ensayos conocidos en la técnica o como es descrito en lo anterior. Medios de Bombardeo y de Cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 mL/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0.5 mg/L de HCl de tiamina, 120.0 g/L de sacarosa, 1.0 mg/L de 2,4-D y 2.88 g/L de L-prolina (llevada a volumen con H20 di después del ajuste a pH 5.8 con KOH) ; 2.0 g/L de Gelrite™ (adicionado después de llevar a volumen con H20 di) y 8.5 mg/L de nitrato de plata (adicionado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 mL/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0.5 mg/L de HC1 de tiamina, 30.0 g/L de sacarosa, y 2.0 mg/L de 2,4-D (llevado a volumen con H20 di después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/L de Gelrite™ (adicionado después de llevar el volumen con H20 di); y 0.85 mg/L de nitrato de plata de 3.0 mg/L de Bialaphos (ambos adicionados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) . El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 mL/L de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotinico, 0.02 g/L de HC1 de tiamina, 0.10 g/L de HC1 de piridoxina, y 0.40 g/L de Glicina llevado a volumen con H20 D-I purificada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0.5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarosa y 1.0 mL/L de de ácido abscisico 0.1 mM (llevado a volumen con H20 di purificada después de ajusfar a pH 5.6); 3.0 g/L de Gelrite™ (adicionado después de llevar al volume con H20 di) y 1.0 mg/L de ácido indoleacético y 3.0 mg/L de Bialaphos (adicionado después de esterilizar el medio y enfriar a 60 C) . El medio libre de hormonas (272V) comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 mL/L de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotinico, 0.02 g/L de HC1 de tiamina, 0.10 g/L de HC1 de piridoxina, y 0.40 g/L de Glicina llevado a volumen con H20 di purificada), 0.1 g/L de mio-inositol , y 40.0 g/L de sacarosa (llevado a volumen con H20 di purificada después de ajusfar el pH a 5.6); y 6 g/L de Bacto-agar (adicionado después de llevar a volumen con H20 di purificada) , esterilizado y enfriado a 60°C. Ejemplo 4: Transformación de Maíz Mediada por Agrobacterium y Regeneración de Plantas Transgénicas Para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, SEQ ID NO:l), se puede utilizar el método de Zhao (patente norteamericana No. 5,981,840, y la publicación de patente de PCT W098/32326; los contenidos de las cuales son incorporados en la presente por referencia) . Brevemente, los embriones inmaduros se aislan del maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium bajo condiciones mediante las cuales la bacteria son capaces de transferir la secuencia de nucleótidos de toxina (SEQ ID NO:l) a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1:1a etapa de infección) . En esta etapa los embriones inmaduros se pueden sumergir en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacterium y (etapa 2: etapa de co-cultivo) . Los embriones inmaduros se pueden cultivar sobre el medio sólido después de la etapa de infección. Después de este periodo de co-cultivo se contempla una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en la presencia de por lo menos un antibiótico conocido que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de plantas (etapa 3:etapa de reposo) . Los embriones inmaduros se pueden cultivar- sobre medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas. Enseguida, los embriones inoculados se cultivan sobre el medio que contiene un agente selectivo y el callo transformado creciente se recupera (etapa 4:1a etapa de selección) . Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de células transformadas. El callo luego se regenera en plantas (etapa 5:etapa de regeneración) y los callos cultivados sobre el medio selectivo se pueden cultivar sobre el medio sólido para regenerar las plantas.
Ejemplo 5: Transformación de Embriones de Soya Embriones de soya se bombardean con un plásmido que contiene secuencia de nucleótidos de toxina de la SEQ ID N0:1 operablemente enlazada a un promotor pinll como sigue. Para inducir los embriones somáticos, los cotiledones, 3-5 mm en longitud disectados de las semillas inmaduras, esterilizadas en la superficie de una variedad de cultivo de soya apropiada se cultivan en la luz u oscuridad a 26°C sobre un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios luego se extirpan y se colocan en un medio liquido adecuado. Después de la selección repetida para agrupaciones de embriones somáticos que se multiplicaron, embriones de etapa globular, temprana, las suspensiones se mantienen como es descrito enseguida. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soya se pueden mantener en 35 mi de medio liquido sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes sobre un programa de día/noche de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soya luego pueden ser transformados mediante el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein y colaboradores, (1987) Nature (London) 327:70-73, patente norteamericana No. 4,945,050) . Un instrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de helio) se puede utilizar para estar transformaciones . Un gen marcador selecciónatele que puede ser utilizado para facilitar la transformación de soya es un transgén compuesto del promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz y colaboradores, (1983) Gene 25:179-188), y la región 3' del gen nopalina sintasa del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium turnefaciens . El cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, SEQ ID NO:l) operablemente enlazado al promotor pinll se puede aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento luego puede ser insertado en un sitio de restricción único del vector que lleva el gen marcador . A 50 µ? de una suspensión de 60 mg/mL de partículas de oro de 1 pm se adiciona (en orden) : 5 µ? de DNA (1 yg/pL) , 20 µ? de espermidina (0.1 M) , y 50 µ? de CaC12 (2.5 M) . La preparación de partículas luego se agita durante tres minutes, se gira en una microcentrífuga durante 10 segundos y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas de DNA luego se lavan una vez en 400 µ? de etanol al 70% y se resuspenden en 40 µ? de etanol anhidro. La suspensión de DNA/particulas se puede sonicar tres veces por un segundo cada una. Cinco microlitros de las partículas de oro recubiertas de DNA luego se cargan sobre cada disco macroportador . Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas de edad se coloca en una caja petri vacía de 60 x 15 mm y el líquido residual se remueve del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, aproximadamente 5-10 placas de tejido normalmente se bombardean. La presión de ruptura de membrana se ajusta en 1100 psi, y la cámara se evacuó a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca por aproximadamente 3.5 pulgadas lejos de la criba de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir a la mitad y se coloca nuevamente en líquido y se cultiva como es descrito en lo anterior. Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido se puede intercambiar con medio fresco, y siete a doce días del post-bombardeo con medio fresco que contiene 50 mg/mL de higromicina. Este medio selectivo se puede renovar semanalmente . Siete a ocho semanas después del bombardeo, el tejido transformado verde se puede observar creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Cada nueva linea se puede tratar como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego pueden ser subcultivadas y mantenidas como agrupaciones de embriones inmaduros o regenerados en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes son incorporadas en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación, patente o publicación de patente individual fura específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las modalidades.

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1, o un complemento de longitud completa de la misma; y b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:2.
  2. 2. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que se ha diseñado para la expresión en una planta.
  3. 3. Una construcción de DNA, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
  4. 4. La construcción de DNA de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque además comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo .
  5. 5. Una célula hospedera, caracterizada porque contiene la construcción de DNA de la reivindicación 3.
  6. 6. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula bacteriana .
  7. 7. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una célula de planta .
  8. 8. Una planta transgénica, caracterizada porque comprende la célula hospedera de la reivindicación 7.
  9. 9. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, plantas cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soya, betabel, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza de semilla de aceite.
  10. 10. Semilla transformada de la planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la semilla comprende la construcción de DNA.
  11. 11. Un polipéptido aislado con actividad plaguicida, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y b) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l.
  12. 12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende secuencias de aminoácidos heterologas.
  13. 13. Una composición, caracterizada porque comprende el polipéptido de la reivindicación 11.
  14. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la composición se selecciona del grupo que consiste de un polvo, material polvoriento, pelotilla, gránulo, rocío, emulsión, coloide y solución .
  15. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la composición se prepara mediante desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o una concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis .
  16. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso del polipéptido .
  17. 17. Un método para controlar una población de plaga lepidóptera, caracterizado porque comprende poner en contacto la población con una cantidad plaguicidamente efectiva de un polipéptido de la rei indicación 11.
  18. 18. Un método para exterminar una plaga lepidóptera, caracterizado porque comprende poner en contacto la plaga con, o alimentar a la plaga, una cantidad plaguicidamente efectiva de un polipéptido en la reivindicación 11. ) 149
  19. 19. Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 4 bajo condiciones en las cuales una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido es expresada, el polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y b) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1.
  20. 20. Una planta que tiene establemente incorporada en su genoma una construcción de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que tiene actividad plaguicida, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1; o un complemento de longitud completa de la misma; y b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; en donde la secuencia de nucleótidos está operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión de una secuencia de codificación en una célula de planta.
  21. 21. La planta de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la planta es una célula de planta.
  22. 22. Un método para proteger a una planta de una plaga, caracterizado porque comprende introducir en la planta o célula de la misma por lo menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos en la SEQ ID NO : 1 , o un complemento de longitud completa de la misma; y b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.
  23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros .
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