MX2008015670A - Receptor 39 acoplado a proteina g (gpr39). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la caracterización funcional del receptor GPR39 acoplado a proteína G, y a compuestos, que modifican o regulan la actividad de la proteína GPR39; en particular, la presente invención se refiere a métodos para identificar agonistas o antagonistas de GPR39 para identificar compuestos capaces de modular el metabolismo de carbohidratos, y a los usos terapéuticos de estos compuestos, en particular al uso de GPR39 en métodos para identificar compuestos que sean capaces de mejorar el control de la glucosa en un sujeto, y que sean efectivos para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, incluyendo diabetes tipo 1 (diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), tipo 2 (diabetes mellitus no insulinodependiente), diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY) y diabetes gestacional.

Description

RECEPTOR 39 ACOPLADO A PROTEINA G (GPR39) CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la caracterización funcional del receptor GPR39 acoplado a proteína G y a compuestos, que modifican o regulan la actividad de la proteína GPR39. En particular, la presente invención se refiere a métodos para mejorar el control de la glucosa en un sujeto que necesita de dicho control, que comprende administrar al sujeto una composición que comprenda una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto capaz de modular o regular la actividad de la proteína GPR39. En otra modalidad, la presente invención se refiere a la implicación de la señalización de GPR39 en la regulación de la glucosa, y de esta manera en la glucemia observada en la diabetes y en el síndrome metabólico, incluyendo obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, dislipidemia aterogénica, hipertensión, hipertrigliceridemia y trastornos del tejido adiposo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las proteínas de unión a GTP (proteínas G) actúan como intermediarios entre la unión de ligandos tales como hormonas y otros mediadores químicos, a receptores acoplados a proteína G (GPCRs) y la activación de efectores intracelulares. Tras la unión de un ligando a un GPCR, los dominios citoplásmicos del receptor sufren cambios de conformación, que permiten la interacción del receptor con una proteína G, que a su vez permite la activación de intermediarios intracelulares tales como adenilato ciclasa, fosfolipasa C o canales de iones. Dicho sistema permite la amplificación de la señal original, ya que muchos segundos mensajeros pueden producirse en respuesta a la unión de un ligando individual al GPCR. A través de este mecanismo, las células son capaces de detectar y responder a alteraciones en su ambiente externo. Los receptores acoplados a proteína G forman una superfamilia de proteínas integrales de la membrana plasmática, cada receptor compartiendo el rasgo común de siete dominios de transmembrana hidrofóbicos, cada uno de los cuales tiene de 20 a 30 aminoácidos de longitud y que están enlazados por secuencias de aminoácidos hidrofílicas de longitud variada. El extremo amino del receptor es extracelular, con el extremo carboxi encontrado en el citoplasma de la célula. Los GPCRs se encuentran en una amplia gama de tejidos y tipos de células, y están implicados en muchos procesos fisiológicos diferentes. Son activados por una amplia gama de ligandos, por ejemplo, hormonas tales como hormona luteinizante, hormona foliculoestimulante, gonadotrofina coriónica, tirotropina, adrenocorticotropina, glucagon y vasopresina, o neurotransmisores tales como 5-HT, acetilcolina (AchR muscarínico), histamina, prostaglandinas, calcitonina, leucotrienos y Ca2+. La amplia distribución y la amplia variedad de las funciones de los GPCRs, indican que los GPCRs pueden desempeñar funciones importantes en una variedad de condiciones patológicas. Por supuesto, se ha encontrado que los GPCRs están implicados en enfermedades relacionadas con broncoconstricción, hipertensión, inflamación, alteración hormonal, diabetes, apoptosis, nocicepción, facilitación de la neurotransmisión y trastornos de tremor. Dentro de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G, los GPCRs putativos para los cuales se desconocen los ligandos naturales se denominan "receptores huérfanos". Se ha demostrado que los receptores acoplados a proteína G son objetivos de fármaco valiosos, puesto que son el objetivo de aproximadamente 50% de los fármacos vendidos en el mercado. Por lo tanto, muchos GPCRs huérfanos están siendo evaluados para identificar nuevos objetivos potenciales. Se identificó a GPR39 con base en su similitud de secuencia con el receptor de secretagogos de hormona de crecimiento (GHS-R) y los receptores de neurotensina 1 y 2 (NT-R1 y NT-R2) (McKee et al., 1997). La proteína GPR39 predicha de 453 aminoácidos contiene los 7 dominios de transmembrana característicos de los GPCRs. Por comparación de secuencia con otros GPCRs, McKee et al. (1997) encontraron que la secuencia de proteína de GPR39 es 27%, 29% y 32% idéntica a la del GSHR, MTLR1 (receptor de motilina), y el receptor 1 de neurotensina, respectivamente. El análisis Northern blot reveló que GPR39 tiene una amplia distribución en los tejidos. Se detectó un transcrito de ARN mensajero de hibridación individual de 1.8 a 2 kb, en la mayoría de las regiones del cerebro puestas a prueba. Sin embargo, además de esta especie, un transcrito alterno, de 3 kb de longitud, se observó en varios tejidos periféricos tales como el estómago e intestino delgado. En tejidos tales como el páncreas, la tiroides y el colon, esta especie de 3 kb fue el único transcrito detectado (McKee et al., 1997). Por medio de hibridación in situ por fluorescencia, McKee et al. (1997) mapearon el gen de GPR39 para 2q21-q22. Un residuo ácido en TM3 está conservado en GPR39. Se sabe que este residuo es esencial para la unión y activación del GHS-R por GHSs estructuralmente diferentes. Con base en estos estudios de distribución en los tejidos, se ha formulado la hipótesis de que GPR39 está implicado en estados de enfermedad cardiovascular (WO2001/081634 y WO2004/004279), cánceres y en particular, cánceres del cerebro tales como glioblastoma (WO2001/036685 y WO01042288), inflamación y estados de enfermedad neurológica (US 2003/232769 y WO2004/004279) y en enfermedades gastrointestinales y del hígado (WO2004/004279). Sólo recientemente se ha identificado la obestatina, el ligando putativo para GPR39 (Zhang J. V. et al, 2005). Se encontró que la obestatina suprime la ingestión de alimento y reduce las funciones gastrointestinales, incluyendo vaciamiento gástrico y motilidad yeyunal. Con base en estas acciones anorexigénicas, se ha postulado a GPR39 como un objetivo antiobesidad novedoso. Sin embargo, en ninguna de las referencias citadas, se ha provisto una función para GPR39 en la homeostasis de la energía y en particular en el metabolismo de carbohidratos.

La diabetes es causada por la ocurrencia de metabolismo anormal de glucosa, proteínas y lípidos, debido a una insuficiencia de las acciones de la insulina. Signos típicos de diabetes incluyen un incremento anormal en los niveles de glucosa en suero, insuficiencia de insulina, y una excreción de glucosa en la orina. Se reconocen varias subclases clínicas, que incluyen: tipo 1 (diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), tipo 2 (diabetes mellitus no insulinodependiente), diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY) y diabetes gestacional. Difieren en etiología, patología, genética, edad de inicio y tratamiento. La diabetes tipo 1 , la forma más severa de diabetes, da razón de 5 a 10 por ciento de la diabetes, y ocurre con más frecuencia en niños y adultos jóvenes. En esta forma de diabetes, el cuerpo no produce insulina alguna y sin inyecciones regulares de insulina, la víctima cae en coma y muere. Los individuos que sufren de diabetes tipo 1 son totalmente insulinodependientes. La diabetes tipo 2, el tipo más frecuente de diabetes, se caracteriza usualmente por inicio gradual y ocurre principalmente en personas de más de 40 años. La diabetes tipo 2 es un trastorno metabólico que resulta de la incapacidad del cuerpo para producir insulina suficiente, o para usar adecuadamente la insulina para satisfacer las necesidades del cuerpo, especialmente cuando la persona tiene sobrepeso. Es la forma más común de la enfermedad, y da razón de 90 a 95 por ciento de los casos de diabetes.

Inicialmente, la combinación de medidas dietéticas, reducción de peso y medicación oral, puede mantener la condición bajo control por un período, pero la mayoría de las personas con diabetes tipo 2 requieren finalmente inyecciones de insulina. La diabetes puede controlarse con insulina, y en algunos casos a través de dieta cuidadosa, pero existe la necesidad de un tratamiento seguro y efectivo para la diabetes con efectos secundarios mínimos y sin el procedimiento invasivo de inyección de insulina. El metabolismo deteriorado de carbohidratos, y en particular diabetes o síndrome metabólico, está asociado también con varias complicaciones, que incluyen (poli) neuropatía (periférica, autónoma, proximal, focal), nefropatía, enfermedad renal, insuficiencia renal, disfunción de la vejiga, retinopatía, complicaciones vasculares de grandes y pequeños vasos, accidente cerebrovascular, infarto al miocardio, enfermedad oclusiva de grandes vasos, enfermedad de arteria coronaria (isquémica), enfermedad vascular cerebral, insuficiencia cardiaca, enfermedad arterial periférica, hipertensión, disfunción sexual y gastroparesis. De conformidad con la presente invención, dichas complicaciones se beneficiarán también de un tratamiento del metabolismo deteriorado de carbohidratos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere a la identificación de funciones novedosas del receptor GPR39. Como se muestra en los ejemplos más adelante, mutaciones de GPR39 en mamíferos afectan las concentraciones de glucosa en sangre y designan a GPR39 como un elemento clave en la regulación del metabolismo de carbohidratos. Este descubrimiento provee una vía para nuevos procedimientos terapéuticos en el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, a través de la modulación de la actividad de GPR39. Este descubrimiento provee también nuevos métodos de identificación para identificar compuestos útiles para la prevención o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo. Por lo tanto, un primer aspecto de la invención provee el uso de la totalidad o parte de la proteína GPR39 en un método para identificar compuestos que mejoran el control de la glucosa en un sujeto, y que son efectivos para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo. En forma alternativa, la invención provee el uso de células que expresan la totalidad o parte de la proteína GPR39 en dicho método. En una modalidad específica, GPR39 es una proteína aislada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, una variante de empalme de las proteínas que tienen las SEQ ID's mencionadas anteriormente, y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% y de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. Partes de la proteína GPR39, como la frase se usó anteriormente, significa que incluyen fragmentos del polipéptido de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, dichos fragmentos siendo de por lo menos 10, por ejemplo, por lo menos 20, 30 40, 50, 75, 100 ó 150 o más aminoácidos en tamaño. Dichos fragmentos pueden derivarse de la región N-terminal de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, respectivamente. Fragmentos que incluyan la región N-terminal pueden usarse para reconstituir la porción extracelular del receptor para proveer sitios de unión al receptor. De preferencia, los fragmentos retendrán la capacidad para unirse a un agente que se sabe se une a GPR39, incluyendo el ligando natural, así como agonistas y/o antagonistas del receptor como se define más adelante, en particular reteniendo la capacidad para unirse al ligando putativo de GPR39, es decir, para unirse a la obestatina. La presente invención provee también el uso de una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para la totalidad o parte del polipéptido de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, en un método para identificar compuestos que mejoran el control de la glucosa en un sujeto, y que son efectivos para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo. Las secuencias de ácido nucleico como se usan en los métodos de la presente invención, significan que incluyen las secuencias de ácido nucleico aisladas que consisten de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y secuencias de ácido nucleico qué tienen por lo menos 80%, y de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad de secuencia, con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Los ácidos nucleicos de la invención incluyen además ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que tiene por lo menos 80% y de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad de secuencia, con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o sus complementos. De preferencia, estas secuencias hibridarán con el ácido nucleico correspondiente bajo condiciones controladas para reducir al mínimo la unión no específica. De preferencia, se prefieren condiciones de hibridación severa a moderadamente severa. Condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, para la detección de secuencias que son aproximadamente 80 a 90% idénticas, hibridación durante la noche a 42°C en Na2HPO4 0.25 M, pH 7.2, SDS a 6.5%, sulfato de dextrán a 10% y un lavado final a 55°C en 0.1 X SSC, SDS a 0.1%. Para la detección de secuencias que son más de aproximadamente 90% idénticas, condiciones adecuadas incluyen hibridación durante la noche a 65°C en Na2HPO4 0.25 M, pH 7.2, SDS a 6.5%, sulfato de dextrán a 10% y un lavado final a 60°C en 0.1X SSC, SDS a 0.1 %. Se apreciará que dichos ácidos nucleicos no necesariamente codifican para polipéptidos de "longitud completa", e incluirán de esta manera ácidos nucleicos que representen, por ejemplo, formas mutantes del gen de GPR39 en las cuales la secuencia codificante haya sido terminada prematuramente por una sustitución que resulte en un codón de detención o una mutación de estructura. Estos son también ácidos nucleicos de la invención. La invención provee también el uso de ácidos nucleicos que son fragmentos de los ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de la invención. En un aspecto, la invención provee iniciadores de ácidos nucleicos que consisten esencialmente de 15 a 50, por ejemplo, de 15 a 35, 18 a 35, 15 a 24, 18 a 30, 18 a 21 ó 21 a 24 nucleótidos, de una secuencia que codifica para un polipéptido de la invención o su complemento. Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención pueden usarse terapéuticamente para tratar enfermedad. En particular, pueden usarse para tratar enfermedades cuya patología esté asociada con la acción de receptores GPR39, en particular la asociada con la prevención y/o el tratamiento de patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo. En otro aspecto, se proveen vectores que comprenden las secuencias de dichos ácidos nucleicos, en particular, vectores de expresión que comprenden un promotor enlazado operablemente a las secuencias de ácido nucleico de la invención. Los vectores pueden ser llevados por una célula hospedera, y expresados dentro de dicha célula. Después de dicha expresión, dichas células pueden usarse en los métodos de conformidad con la invención. Como se mencionó anteriormente en la presente, es un objetivo de la invención proveer métodos de prueba para la identificación de compuestos (referidos también en lo sucesivo como agentes) que se unen a, o modulan, la actividad de polipéptidos de la invención. En particular, se contempla que dichos compuestos sean un ensamble orgánico o inorgánico de átomos de cualquier tamaño, e incluya pequeñas moléculas (menores de aproximadamente 2500 Daltons) o moléculas más grandes, tales como péptidos, polipéptidos, proteínas enteras y polinucleótidos, en donde dichos compuestos puedan usarse en métodos de tratamiento como se describió anteriormente. Puesto que los presentes inventores son los primeros en identificar a GPR39 como un receptor como un elemento clave en la regulación del metabolismo de carbohidratos, la presente invención abre la posibilidad del uso de GPR39 mismo y/o compuestos que agonizan o antagonizan este receptor en aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, la invención se extiende además a un método de tratamiento del cuerpo de un humano o animal, dicho método comprendiendo el uso de un agonista o antagonista de GPR39. Como se usa en la presente, un "agonista" se refiere a un agente que se une a GPR39 y lo activa, es decir, produciendo una respuesta farmacológica, e incluye moduladores alostéricos positivos que se unen a un sitio diferente del sitio de unión al agonista en el receptor, y que mejora la sensibilidad del receptor hacia el agonista natural del receptor. Un "antagonista", como se usa en la presente, se refiere a agentes que atenúan los efectos de un agonista para GPR39. El antagonismo puede ser competitivo y reversible (es decir, se une a una región del receptor en común con el agonista, y puede ser reemplazado con una cantidad suficientemente grande de agonista), o puede ser no competitivo y/o irreversible (es decir, el antagonista se une covalentemente al sitio de unión, y ninguna cantidad de agonista puede superar la inhibición). Otros tipos de antagonismo son antagonismo no competitivo, en donde el agente se une a un sitio alostérico del receptor, o agonismo inverso, en donde para un receptor constitutivo, como se reporta para GPR39 (Holst et al., 2004), el agente se une al sitio de unión al agonista y atenúa la actividad constitutiva del receptor. En particular, la presente invención provee un método de tratamiento de condiciones de enfermedad relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabolico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, dicho método comprendiendo aquellas condiciones en donde se requiere una disminución en los niveles de glucosa basal, administrando al humano o animal una dosificación terapéuticamente activa de un agonista del receptor GPR39. El uso de un agonista de GPR39 es de uso particular en el tratamiento del síndrome metabolico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, en particular comprendiendo el uso de un agonista de GPR39 identificable usando un método de la presente invención. En forma alternativa, en el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, dicho método comprende administrar al humano o animal una dosificación terapéuticamente activa de un antagonista del receptor GPR39, en particular comprendiendo el uso de un antagonista de GPR39 identificable usando un método de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención, se describen en la presente en más detalle.

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos para GPR39 de ratón. SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos para GPR39 de ratón.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos para GPR39 de humano. SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos para GPR39 de humano. SEQ ID NO: 5 es obestatina de humano. SEQ ID NO: 6 es obestatina de mono. SEQ ID NO: 7 es obestatina de ratón. SEQ ID NO: 8 es obestatina de rata. SEQ ID NO: 9 es obestatina de gerbo. SEQ ID NO: 10 es obestatina de cerdo. SEQ ID NO: 1 es obestatina de gato. SEQ ID NO: 12 es obestatina de perro. SEQ ID NO: 13 es obestatina de cabra. SEQ ID NO: 14 es obestatina de oveja. SEQ ID NO: 15 es obestatina de ganado. SEQ ID NO: 16 es la secuencia consenso para obestatina.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 B muestran la expresión de GPR39-LacZ en el páncreas. En el páncreas derivado de GPR39"'", se detectó expresión en los islotes de Langerhans (encerrados en un círculo), según se evidencia de la tinción azul (figura 1A, 40x). No estuvo presente tinción en el páncreas de tipo silvestre (figura 1 B, 40x). La figura 2 muestra la comparación del peso corporal de ratones GPR39"'" y WT (de tipo silvestre) seguido en animales machos y hembras de 8 a 12 hasta 16 a 20 semanas. Los datos se expresan en media ± desviación estándar. Las figuras 3A-3B muestran la comparación de la concentración de glucosa en sangre en el punto de partida en condiciones de alimentación (figura 3A) y en ayuno (figura 3B) de ratones GPR39"'" y WT, seguida en animales machos y hembras. La figura 4 muestra la comparación de la prueba de tolerancia a la glucosa de ratones GPR39"/_ y WT en ayuno, seguida en animales machos y hembras. Se determinó la concentración de glucosa en sangre a 15, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos después de la administración de glucosa, y expresada como cambio en porcentaje de los valores en el punto de partida. Los datos se expresan en media ± desviación estándar. Las figuras 5A-5B muestran la comparación de la composición del cuerpo de ratones GPR39"'" y WT seguida en ratones machos y hembras. Las masas grasa y magra se expresan en porcentaje de peso corporal. Los datos se expresan en media ± desviación estándar. La figura 6A es una alineación de las secuencias de proteína de GPR39 de humano (NP 001499), ratón (AAH85285), rata (XP 22578), perro (parcial) (XP 853332) y ganado (parcial) (XP 589836). La alineación muestra la secuencia de proteína GPR39 de humano arriba, otras especies en orden de similitud de secuencia decreciente con el humano. El nombre de cada secuencia refleja el número de acceso de la secuencia en la base de datos nr del NCBI, el símbolo del gen y el nombre de la especie. Las secuencias de perro y ganado en la alineación difieren de la secuencia de dominio público original: se removieron los aminoácidos C-terminales que carecen de similitud con otras secuencias de GPR39. El argumento es que los aminoácidos deletados fueron de resultados de secuenciación de menor calidad. La secuencia de humano se usa como referencia, y los aminoácidos están en color gris. Los aminoácidos de otras secuencias están en color, sí son similares a la secuencia de humano.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Acido nucleico El ácido nucleico como se usa en los métodos de la presente invención, incluye ADN (incluyendo ADN genómico y ADNc) y ARN. En donde el ácido nucleico de conformidad con la invención incluye ARN, debe considerarse la referencia a las secuencias ilustradas en los listados acompañantes como referencia al ARN equivalente, con U sustituyendo a T. El ácido nucleico de la invención puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. Los ácidos nucleicos de cadena sencilla de la invención incluyen ácidos nucleicos antisentido. De esta manera, se entenderá que la referencia a SEQ ID NO: 1 o secuencias que comprendan SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma, incluyen secuencias complementarias, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Lo mismo se aplica a SEQ ID NO: 3. En general, el ácido nucleico de conformidad con la presente invención se provee como un aislado, en forma aislada y/o purificada, o libre o sustancialmente libre de material con el cual está asociado en forma natural, tal como libre o sustancialmente libre de ácido nucleico que flanquee el gen en el genoma humano, salvo posiblemente una o más secuencias reguladoras para expresión. El ácido nucleico puede ser completamente o parcialmente sintético, y puede incluir ADN genómico, ADNc o ARN. En otras palabras, el término "aislado" indica que una secuencia de ocurrencia natural ha sido removida de su contexto celular normal. De esta manera, la secuencia puede estar en una solución libre de células, o puede ponerse en un contexto de ácido nucleico o ambiente celular diferente. Por lo tanto, los ácidos nucleicos reclamados en la presente pueden estar presentes como material heterólogo en células enteras o en lisados de células o en una forma parcialmente, sustancialmente o completamente purificada. La invención provee también ácidos nucleicos que son fragmentos de los ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de la invención. En un aspecto, la invención provee iniciadores de ácidos nucleicos que consisten esencialmente de 15 a 50, por ejemplo, de 15 a 35, 18 a 35, 15 a 24, 18 a 30, 18 a 21 o 21 a 24 nucleótidos, de una secuencia que codifica para un polipéptido de la invención o su complemento. El término A consiste esencialmente de = se refiere a ácidos nucleicos que no incluyen secuencia de ácido nucleico 5' o 3' adicional alguna. En otro aspecto de la invención, los ácidos nucleicos de la invención que consisten esencialmente de 15 a 30 nucleótidos como se definió anteriormente, pueden estar enlazados sin embargo en el extremo 3', pero de preferencia el extremo 5', a secuencias adicionales cortas (por ejemplo, de 4 a 15, tal como de 4 a 10 nucleótidos), a las cuales no están enlazados en forma natural. Dichas secuencias adicionales son de preferencia enlazadores que comprenden un sitio de reconocimiento de enzima de restricción que facilita la clonación cuando el ácido nucleico de la invención se usa, por ejemplo, como un iniciador de PCR. Los iniciadores de la invención son deseablemente capaces de hibridar selectivamente con ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de la invención. Por Aselectivos, se entiende selectivo con respecto a secuencias que codifican para otros receptores de purina, y en particular con respecto a receptores diferentes de receptores de adenina. La capacidad de la secuencia para hibridar selectivamente, puede determinarse por experimentación, o puede calcularse. Por ejemplo, una forma de calcular la Tm de un iniciador, es haciendo referencia a la fórmula para calcular la Tm de iniciadores para una secuencia objetivo homologa. Esta fórmula es Tm (°C) = 2(A+T) + 4(G+C) - 5.

Esto proveerá la Tm bajo condiciones de 3xSSC y SDS a 0.1 % (en donde SSC es NaCI 0.15 M, citrato de sodio 0.015 M, pH 7). Esta fórmula es generalmente adecuada para iniciadores de hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En la presente invención, esta fórmula puede usarse como un algoritmo para calcular una Tm nominal de un iniciador para una secuencia especificada derivada de una secuencia que codifica para un polipéptido de la invención. La Tm puede compararse con una Tm calculada para secuencias de GPCR de humanos y ratas, con base en el número máximo de coincidencias con cualquier parte de estas otras secuencias. Condiciones adecuadas para que un iniciador hibride con una secuencia objetivo, pueden medirse también experimentalmente. Condiciones experimentales adecuadas comprenden hibridar un iniciador candidato con ácido nucleico que codifique para un polipéptido de la invención, y ácido nucleico que codifique para otros receptores acoplados a proteína G sobre un soporte sólido bajo condiciones de hibridación de baja severidad (por ejemplo, 6xSSC a 55°C), lavando en SSC reducido y/o mayor temperatura, por ejemplo, en 0.2xSSC a 45°C, y aumentando la temperatura de hibridación progresivamente hasta determinar las condiciones de hibridación que permitan que el iniciador hibride con ácido nucleico que codifique para un polipéptido de la invención, pero no otros ácidos nucleicos que codifiquen para GPCR. Los ácidos nucleicos de la invención, en particular iniciadores, pueden poseer una marca de revelación. Marcas adecuadas incluyen radioisótopos tales como P o S, marcas fluorescentes, marcas de enzima, u otras marcas de proteína tales como biotina. Dichas marcas pueden añadirse a poiinucleotidos o iniciadores de la invención, y pueden detectarse usando técnicas conocidas per se. Los iniciadores de la presente invención pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos, tales como aquellos con estructuras de base modificadas destinadas para mejorar la estabilidad del ácido nucleico en una célula. Muchos tipos diferentes de modificación a oligonucleótidos se conocen en la técnica. Estos incluyen estructuras de base de metilfosfonato y fosforotioato, y la adición de cadenas de poliglicina o acridina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, se entenderá que los poiinucleotidos descritos en la presente pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para mejorar la actividad in vivo o la duración de vida de los poiinucleotidos de la invención. Incluidas también dentro del alcance de la invención, son secuencias antisentido basadas en las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente, de preferencia en la forma de oligonucleótidos, en particular oligonucleótidos estabilizados, o ribozimas. Pueden diseñarse oligonucleótidos antisentido para que hibriden con la secuencia complementaria de ácido nucleico, pre-ARN mensajero o ARN mensajero maduro, interfiriendo con la producción del polipéptido codificado por una secuencia de ADN objetivo dada, de modo que su expresión sea reducida o prevenida en conjunto. Las ribozimas serán diseñadas para que rompan el ARN mensajero codificado por una secuencia de ácido nucleico que codifique para el GPCR GPR39 de la invención, deseablemente en una secuencia objetivo específica para el GPCR GPR39, es decir, una que no sea común para otras secuencias de GPCR. La construcción de secuencias antisentido y su uso se describe en Peyman y Ulman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 329-376 (1992), y Zamecnik y Stephenson, P. N. A. S, 75: 280-284 (1974). La construcción de ribozimas y su uso se describe, por ejemplo, en Gibson y Shillitoe, Molecular Biotechnology 7(2): 25- 37 ( 997). En una modalidad, puede usarse ARN de la invención para la inducción de interferencia de ARN (ARNi), usando secuencias de ARN de doble cadena (ARNds) (Fire et al., Nature 391 : 806-81 1 , 1998) o secuencias de ARN de interferencia corto (ARNsi) (Yu et al., Proc Nati Acad Sci USA. 99: 6047-52, 2002). "ARNi" es el proceso por el cual el ARNds induce degradación dependiente de homología de ARN mensajero complementario. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención es hibridada por apareamiento de bases complementarias con un ácido ribonucleico "sentido" de la invención, para formar el ARN de doble cadena. Se proveen las moléculas de ácido nucleico sentido y antisentido de ARNds que corresponden a por lo menos aproximadamente 20, 25, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos o una cadena codificante de GPR39, o para sólo una porción de la misma. En una modalidad alternativa, las moléculas de ARNsi tienen 30 nucleótidos o menos de longitud, y más preferiblemente de 21 a 23 nucleótidos, con extremos salientes 3' de 2 a 3 nucleótidos característicos, que son generados por la digestión de moléculas de ARNds más largas por la ribonucleasa III. Véase, por ejemplo, Tuschl T. (Nat Biotechnol. 20: 446-48, 2002). La transcripción intracelular de pequeñas moléculas de ARN puede lograrse clonando los moldes de ARNsi en unidades de transcripción de ARN polimerasa III (Pol III), que normalmente codifican para el ARN nuclear pequeño (ARNsn) U6 o la ribonucleasa humana P ARN H 1. Dos procedimientos pueden usarse para expresar moléculas de ARNsi: en una modalidad, cadenas sentido y antisentido que constituyen al dúplex de ARNsi, son transcritas por promotores individuales (Lee, et al., Nat. Biotechnol. 20, 500-505, 2002); en una modalidad alternativa, las moléculas de ARNsi son expresadas como estructuras de ARN de horquilla de pie y bucle que dan lugar a moléculas de ARNsi después de procesamiento intracelular (Brummelkamp et al., Science 296: 550-553, 2002) (cita incorporada en la presente como referencia). El ARNds/ARNsi se administra más comúnmente uniendo cadenas de ARN sentido y antisentido in vitro antes del suministro al organismo. En una modalidad alternativa, puede llevarse a cabo ARNi (interferencia de ARN) administrando ácidos nucleicos sentido y antisentido de la invención en la misma solución sin unión antes de la administración, y puede incluso realizarse administrando los ácidos nucleicos en vehículos separados dentro de un marco de tiempo muy estrecho. Se proveen además moléculas de ácido nucleico que codifican para fragmentos, homólogos, derivados y análogos de un GPR39 o ácidos nucleicos antisentido complementarios a una secuencia de ácido nucleico de GPR39. Pueden introducirse secuencias antisentido, moléculas de ARNsi y secuencias de ribozimas de la invención, en líneas de células de mamífero en cultivo para estudiar la función del GPCR GPR39, por ejemplo, causando subregulación de este gen y observando efectos fenotípicos, o la expresión o ubicación de proteínas descritas en la presente que se asocian con el GPCR GPR39. En células en donde ocurre expresión aberrante del GPCR GPR39, dichas secuencias antisentido, de ARNsi y ribozima, pueden usarse para subregular la expresión del gen. La secuencia de ADNc del GPCR de la invención puede clonarse usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de polimerasa) estándar. Esto implica producir un par de iniciadores para extremos 5' y 3' en cadenas opuestas de SEQ ID NO: 1 , poniendo los iniciadores en contacto con ARN mensajero o ADNc obtenido de una célula cortical de mamífero, realizando una reacción en cadena de polimerasa bajo condiciones que produzcan la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción sobre un gel de agarosa), y recuperando el ADN amplificado. Los iniciadores pueden ser diseñados para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados, de modo que el ADN amplificado pueda ser clonado en un vector de clonación adecuado. Lo mismo se aplica a SEQ ID NO: 3. Polinucleótidos que no sean 100% homólogos a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, pero que codifiquen para cualquiera de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 u otros polipéptidos de la invención, pueden obtenerse de muchas formas. Por ejemplo, puede realizarse mutagénesis dirigida a sitio de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Esta es útil en donde, por ejemplo, se requieren cambios de codones silenciosos por secuencias para optimizar las preferencias de codones para una célula hospedera particular en la cual están siendo expresadas secuencias de polinucleótidos. Otros cambios de secuencia pueden desearse para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Más cambios pueden ser deseables para representar cambios de codificación particulares que se requieren para proveer, por ejemplo, sustituciones conservativas. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender secuencias adicionales en el extremo 5' o 3'. Por ejemplo, secuencias guía 5' sintéticas o naturales pueden ser unidas al ácido nucleico que codifica para polipéptidos de la invención. Las secuencias adicionales pueden incluir también regiones no traducidas 5' o 3' requeridas para la transcripción de ácido nucleico de la invención en células hospederas particulares.

Además, homólogos de GPR39 de otros animales, en particular mamíferos (por ejemplo, humanos o conejos), más particularmente primates incluyendo humano, pueden obtenerse y usarse en los métodos de la presente invención. Dichas secuencias pueden obtenerse preparando u obteniendo colecciones de ADNc obtenidas de tejidos o células en división o colecciones de ADN genómico de otras especies animales, y sondeando dichas colecciones con sondas que comprendan la totalidad o parte de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 3 bajo condiciones de severidad media a alta (por ejemplo, cloruro de sodio 0.03 M y citrato de sodio 0.03 a una temperatura de aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C). La presente invención se extiende además a una secuencia de ADN aislada que comprende secuencias que codifican para un polipéptido de la invención, pero en la cual las secuencias codificantes se dividen en hasta dos o más (de preferencia no más de cinco, por ejemplo, cuatro o tres) exones. Dichas secuencias de exones pueden ser naturales, y pueden obtenerse de clones genómicos, o sintéticos. Pueden usarse secuencias de exones en la construcción de minisecuencias de genes que comprenden ácido nucleico que codifica para polipéptidos de la invención, cuyas secuencias son interrumpidas por una o más secuencias de exones. Pueden construirse también minigenes usando exones heterólogos, derivados de cualquier fuente eucariótica.

Polipéptidos Los polipéptidos aislados usados en los métodos de la presente invención serán aquellos como se definieron anteriormente en forma aislada, libre o sustancialmente libre de material con el cual están asociados naturalmente, tales como otros polipéptidos con los cuales se encuentran en la célula. Los polipéptidos pueden formularse, de hecho, con diluyentes o adyuvantes, y aún para propósitos prácticos, pueden ser aislados - por ejemplo, los polipéptidos normalmente se mezclarán con gelatina u otros vehículos, si se usan para recubrir placas de microtítulo para su uso en inmunoensayos. Los polipéptidos pueden ser glucosilados, ya sea naturalmente o por sistemas de células eucariótícas heterólogas, o pueden ser (por ejemplo, si se producen por expresión en una célula procariótica) no glucosilados. Los polipéptidos pueden ser fosforilados y/o acetilados. Un polípéptido de la invención puede estar también en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprenderá en general el polipéptido en una preparación en la cual más de 90%, por ejemplo, 95%, 98% o 99% del polípéptido en la preparación, es un polipéptido de la invención. Los polipéptidos de la invención pueden ser modificados, por ejemplo, por la adición de residuos de histidina que facilitan su purificación, o por la adición de una secuencia de señal que promueve su secreción de una célula.

Como se muestra en la alineación en la figura 6A y cuadro A, las proteínas GPR39 de mamífero tienen una identidad de secuencia general de por lo menos 80% con la secuencia de humano o ratón. Por dicha razón, polipéptidos que tengan por lo menos 80%, por ejemplo, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, son también provistos por la presente invención. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos que son variantes de secuencia de aminoácidos, alelos, derivados o mutantes de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, respectivamente. Por ejemplo, dicho polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que difiera de aquella dada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, por una o más de adición, sustitución, deleción e inserción de uno o más (tal como de 1 a 20, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 a 10) aminoácidos. El cuadro A provee una matriz que muestra identidad, similitud y espacios entre cada secuencia. Existen más espacios entre la secuencia de perro y ganado y las demás secuencias, debido a que las primeras secuencias son parciales. Para los fragmentos traslapantes, el grado de identidad está dado por la suma del por ciento de identidad con el por ciento de espacios. Por ejemplo, para perro con humano, el grado de identidad para el fragmento traslapante es de 86%.

CUADRO A Gpr39_Mus Gpr39_Rattus GPR39_Canis GPR39_Bos GPR39 Homo 80% 79% 67% 55% Aminoácidos 87% 88% 74% 59% idénticos 0% 0% 19% 37% Aminoácidos similares Espacios de alineación Gpr39_Mus 93% 66% 53% 96% 72% 58% 0% 19% 37% Gpr39_Rattus 65% 53% 72% 57% 19% 37% GPR39 Canis 67% 73% 21% El porcentaje de identidad de secuencias de polipéptidos puede calcularse usando algoritmos disponibles comercialmente, que comparan una secuencia de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 de la presente invención) con una secuencia de consulta. Más detalles para evaluar la identidad, se describen a continuación. En donde se determine que una secuencia de consulta tiene una identidad con aquella de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 de por lo menos 80%, y de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97% o 98%, dicha secuencia siendo aquella de un polipéptido que retiene actividad de receptor GPR39, dicha secuencia forma parte de la presente invención. Un polipéptido de conformidad con la presente invención puede ser aislado y/o purificado (por ejemplo, usando un anticuerpo), por ejemplo, después de la producción por expresión de ácido nucleico codificante. El polipéptido aislado y/o purificado puede usarse en la formulación de una composición, que puede incluir por lo menos un componente adicional, por ejemplo, una composición farmacéutica que incluya un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. Un polipéptido de conformidad con la presente invención puede usarse como un inmunógeno, o de otra manera en la obtención de anticuerpos específicos. Los anticuerpos son útiles en purificación y otra manipulación de polipéptidos, identificación de diagnóstico y contextos terapéuticos. Un polipéptido de conformidad con la presente invención puede usarse en la identificación de moléculas que se unen con el mismo o modulan su actividad o función. Dichas moléculas pueden ser útiles en un contexto terapéutico (posiblemente, incluyendo contexto profiláctico). Un polipéptido o polipéptido marcado de la invención o fragmento del mismo puede ser fijado también a una fase sólida, por ejemplo, la superficie de una cavidad de inmunoensayo o varilla de aforar. Dichos polipéptidos marcados y/o inmovilizados pueden ser empacados en equipos en un contenedor adecuado junto con reactivos, controles, instrucciones y similares adecuados. Dichos polipéptidos y equipos pueden usarse en métodos de detección de anticuerpos para dichos polipéptidos presentes en una muestra, o porciones activas o fragmentos de los mismos por inmunoensayo.

Los métodos de inmunoensayo son bien conocidos en la técnica, y comprenderán en general: (a) proveer un polipéptido que comprenda un epítope unible por un anticuerpo contra dicha proteína; (b) incubar una muestra biológica con dicho polipéptido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de antígeno-anticuerpo; y (c) determinar si se forma el complejo de antígeno-anticuerpo que comprende dicho polipéptido.

Identidad de secuencia El porcentaje de identidad de secuencias de ácido nucleico y polipéptidos, puede calcularse usando algoritmos disponibles comercia Imente que comparan una secuencia de referencia con una secuencia de consulta. Los siguientes programas (provistos por el National Center for Biotechnology Information) pueden usarse para determinar homologías/identidades: BLAST, BLAST con intersticios, BLASTN y PSI-BLAST, que pueden usarse con parámetros predeterminados. El algoritmo GAP (Genetics Computer Group, Madison, Wl) usa el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas, que aumenta al máximo el número de coincidencias y reduce al mínimo el número de espacios. En general, se usan los parámetros predeterminados, con una penalización de creación de espacios de 12 y penalización de extensión de espacios de 4. Otro método para determinar la mejor coincidencia general entre una secuencia de ácido nucleico o una porción de la misma y una secuencia de consulta, es el uso del programa de cómputo FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6; 237-245 (1990)). El programa provee una alineación de secuencia global. El resultado de dicha alineación de secuencia global está en por ciento de identidad. Los parámetros adecuados usados en una búsqueda FASTDB de una secuencia de ADN para calcular el por ciento de identidad, son: matriz = unitaria, tupie (fila) k = 4, penalización por no coincidencia = 1 , penalización por unión = 30, longitud del grupo de aleatorización = 0, puntuación de limitación = 1 , penalización de espacio = 5, penalización por tamaño de espacio = 0.05 y tamaño de ventana = 500, o longitud de la secuencia de consulta en bases de nucleótidos, cualquiera que sea más corta. Parámetros adecuados para calcular el por ciento de identidad y similitud de una alineación de aminoácidos, son: matriz = PAM 150, tupie (fila) k = 2, penalización por no coincidencia = 1 , penalización por unión = 20, longitud del grupo de aleatorización = 0, puntuación de limitación = 1 , penalización de espacio = 5, penalización por tamaño de espacio = 0.05 y tamaño de ventana = 500, o longitud de la secuencia de consulta en bases de nucleótidos, cualquiera que sea más corta.

Vectores Las secuencias de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden ser incorporadas en vectores, en particular vectores de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedera compatible. De esta manera, en otra modalidad, la invención provee un método para obtener polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido aislado de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedera compatible, y haciendo crecer la célula bajo condiciones que produzcan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedera. Células hospederas adecuadas se describen a continuación con relación a vectores de expresión. De preferencia, un polinucleótido aislado de la invención en un vector es enlazado operablemente a una secuencia de control que es capaz de proveer la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedera, es decir, el vector es un vector de expresión. El término "enlazado operablemente" se refiere a una yuxtaposición, en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera deseada. Una secuencia de control "enlazada operablemente" a una secuencia codificante, es ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Pueden seleccionarse o construirse vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias de promotor, fragmentos de terminador, secuencias de poliadenüación, secuencias de intensificador, genes marcadores y otras secuencias, según sea adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, vectores virales, por ejemplo, fago, fagémido o baculovirus, cósmidos, YACs, BACs o PACs, según sea adecuado. Los vectores incluyen vectores de terapia génica, por ejemplo, vectores basados en adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus (tales como VIH o MLV) o vectores de virus alfa. Los vectores pueden proveerse con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido, y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionares, por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano, o un gen de resistencia a neomicina para un vector de mamífero. Pueden usarse vectores in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN, o pueden usarse para transfectar o transformar una célula hospedera. El vector puede ser adaptado también para su uso in vivo, por ejemplo, en métodos de terapia génica. Sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospederas, son bien conocidos. Células hospederas adecuadas incluyen bacterias, células eucarióticas tales como células de mamífero y de levadura, y sistemas de baculovirus. Líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo, incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñon de cría de hámster, células COS, y muchas otras.

Promotores y otras señales de regulación de la expresión pueden seleccionarse para que sean compatibles con la célula hospedera para la cual el vector de expresión es diseñado. Por ejemplo, promotores de levadura incluyen promotores GAL4 y ADH de S. cerevisiae, y promotores nmtl y adh de S. pombe. Promotores de mamífero incluyen el promotor de metalotioneína que puede inducirse en respuesta a metales pesados tales como cadmio. Pueden usarse también promotores virales tales como el promotor del antígeno T grande de SV40 o promotores de adenovirus. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica. Los vectores pueden incluir otras secuencias, tales como promotores o intensificadores que dirigen la expresión de las secuencias de ácido nucleico insertadas, de modo que el polipéptido es producido como una fusión y/o ácido nucleico que codifica para señales de secreción, de modo que el polipéptido producido en la célula hospedera es secretado de la célula. Vectores para la producción de polipéptidos de la invención para su uso en terapia génica, incluyen vectores que poseen una secuencia de minigen de la invención. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proveer un método para tratar condiciones anormales relacionadas con una subexpresion del GPCR GPR39 y su actividad, dicho método comprendiendo el uso de un polinucleótido que codifica para un GPCR GPR39, en particular, en un método para tratar metabolismo deteriorado de carbohidratos, tal como diabetes incluyendo complicaciones asociadas con la misma. En terapia génica, un polinucleótido aislado de la invención se usa para efectuar la producción endógena del GPCR GPR39 por las células relevantes en el sujeto. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica para un GPCR GPR39 puede ser diseñado para expresión en un vector retroviral de replicación defectuosa como se proveyó anteriormente. La construcción de expresión retroviral puede entonces aislarse e introducirse en una célula de empacado transducida con un vector de plásmido retroviral que contenga ARN que codifique para un polipéptido de la presente invención, de modo que la célula de empacado produzca ahora partículas virales infecciosas que contienen al gen de interés. Estas células productoras pueden administrarse a un sujeto para el diseño de células in vivo y expresión del polipéptido in vivo. Para una revisión de terapia génica, véase el capítulo 20 de Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, en Human Molecular Genetics, T. Strachan y A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996). Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a. edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Los vectores pueden ser transformados en una célula hospedera adecuada como se describió anteriormente, para proveer la expresión de un polipéptido de la invención. De esta manera, en otro aspecto, la invención provee un procedimiento para preparar polipéptidos de conformidad con la invención, que comprende cultivar una célula hospedera transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente, bajo condiciones que provean la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifique para los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados. Los polipéptidos pueden ser también sistemas expresados in vitro, tales como lisado de reticulocitos. Otra modalidad de la invención provee células hospederas transformadas o transfectadas con los vectores para la replicacion y expresión de los polinucleótidos de la invención. Las células se seleccionarán para que sean compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, de bacterias, levaduras, insectos o mamíferos. Las células hospederas pueden cultivarse bajo condiciones para la expresión del gen, de modo que el polipéptido codificado sea producido. Si el polipéptido es expresado acoplado a un péptido guía de señal adecuado, puede ser secretado de la célula en el medio de cultivo. Después de la producción por expresión, un polipéptido puede ser aislado y/o purificado de la célula hospedera y/o medio de cultivo, según pueda ser el caso, y usado después como se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición que puede incluir uno o más componentes adicionales, tales como una composición farmacéutica que incluya uno o más excipientes, vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables. Los polinucleótidos de conformidad con la invención pueden ser insertados también en los vectores descritos anteriormente en una orientación antisentido, para proveer la producción de ARN antisentido o ribozímas.

Pruebas Es un objetivo de la presente invención, proveer una prueba para identificar compuestos que mejoren el control de la glucosa en un sujeto y que sean efectivos para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, cuya prueba comprende: proveer la totalidad o parte de una proteína receptora GPR39 de conformidad con la invención, poner en contacto dicha proteína con un compuesto de unión putativo; y determinar si dicho compuesto es capaz de interactuar con dicha proteína. Como es sabido para GPCRs que pueden interactuar con proteínas G, así como con otras proteínas accesorias, las pruebas como se proveen en la presente pueden comprender además de la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39, proteínas G u otras proteínas accesorias. Los GPCRs son conocidos por interactuar con proteínas G, así como con otras proteínas accesorias que incluyen arrestinas, proteínas modificadoras de actividad de receptor (RAMPs), proteínas que contienen dominio PDZ, y otras. La interacción de un GPCR con dicha proteína accesoria, puede resultar en la determinación de varias propiedades biológicas importantes de un receptor, tales como transporte hacia o desde la membrana, definición de su farmacología, determinación de su estado de glucosilación o transmisión de señales a través de mecanismos que funcionan independientes del acoplamiento a proteína G (Laburthe et al., 2002). Como un ejemplo, la asociación del receptor tipo receptor de calcitonina con RAMP1 , una proteína de transmembrana individual específica, lleva a la expresión del receptor tipo receptor de calcitonina capaz de unirse al péptido relacionado con el gen de calcitonina, mientras que la asociación con RAMP2 o RAMP3 lleva a la expresión como un receptor de unión a adrenomedulina (Latchie et al., 1998). Se ha documentado una interacción similar de RAMPs para los receptores VPAC1 ; glucagon, PTH1 y PHT2 (Christopoulos et al., 2001 , 2003), sugiriendo una función más generalizada para proteínas accesorias en la modulación de la señalización de receptores acoplados a proteína G. En una modalidad de la prueba, el receptor o subunidades del receptor pueden usarse en una prueba de unión. Las pruebas de unión pueden ser competitivas o no competitivas. Dicha prueba puede acomodar la identificación rápida de un gran número de compuestos para determinar qué compuestos, si los hay, son capaces de unirse a los polipéptidos. Después, pueden llevarse a cabo pruebas más detalladas con aquellos compuestos que se encuentra se unen, para determinar además si dichos compuestos actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la invención. Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proveer un método para identificar un compuesto que mejore la regulación de la glucosa en un sujeto, y que sea efectivo para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, cuyo método comprende: (i) poner en contacto células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 de conformidad con la invención, con dicho compuesto bajo condiciones adecuadas para la unión, y (ii) detectar la unión del compuesto a dicha proteína receptora. En otra modalidad, esta invención provee un método para identificar un compuesto que mejora la regulación de la glucosa en un sujeto, y que sea efectivo para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, cuyo método comprende: (i) poner en contacto preparaciones de membrana de células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 de conformidad con la invención, con dicho compuesto bajo condiciones adecuadas para la unión, y (ii) detectar la unión del compuesto a dicha proteína receptora. En otra modalidad, la presente invención provee un método para identificar un compuesto que mejora la regulación de la glucosa en un sujeto, y que sea efectivo para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, cuyo método implica una prueba de unión competitiva en donde: (i) células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 de conformidad con la invención, son puestas en contacto con un compuesto que se sabe se une a la proteína receptora GPR39 en presencia y ausencia del compuesto que se va a poner a prueba, y (i¡) se está evaluando el efecto de dicho compuesto sobre la unión del compuesto que se sabe se une a la proteína receptora GPR39. Una disminución en la unión del compuesto que se sabe se une a la proteína receptora GPR39 en presencia del compuesto que se va a poner a prueba, es una indicación de que dicho compuesto se une a la proteína receptora GPR39. La obestatina, el ligando natural para la proteína receptora GPR39, recientemente se ha identificado (Zhang, J. V. et al., 2004 Science Vol. 310; 996-999) como otro péptido derivado de la misma prohormona como grelina. En una modalidad particular, el compuesto que se sabe se une al receptor consiste de obestatina, más en particular seleccionado de una de las secuencias de obestatina seleccionadas de SEQ ID NOs: 5 a 16, más en particular SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. En forma alternativa, la obestatina como se usa en la presente, se refiere a un péptido que tiene por lo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. En una modalidad alternativa, la prueba de unión competitiva mencionada anteriormente se realiza en preparaciones de membrana de células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 de conformidad con la invención. Métodos para preparar dichas células hospederas y para obtener preparaciones de membrana de dichas células, se describen más adelante. En una modalidad específica, la proteína receptora GPR39 en las pruebas de unión mencionadas anteriormente, es una proteína aislada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, una variante de empalme de las proteínas que tienen las SEQ ID's mencionadas anteriormente, y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% y de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. Partes de la proteína GPR39, como el término se usó anteriormente, significa que incluye fragmentos del polipéptido de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, dichos fragmentos siendo de por lo menos 0, por ejemplo, por lo menos 20, 30, 40, 50, 75, 100 ó 150 o más aminoácidos en tamaño. Dichos fragmentos pueden derivarse de la región N-terminal de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, respectivamente. Fragmentos que incluyan la región N-terminal pueden usarse para reconstituir la porción extracelular del receptor para proveer sitios de unión al receptor. De preferencia, los fragmentos retendrán la capacidad para unirse al compuesto que se sabe se une a la proteína receptora GPR39. Más en particular, los fragmentos retendrán la capacidad para unirse a la obestatina como se definió anteriormente en la presente.

Preparaciones de membrana Membranas celulares que expresan la proteína receptora de esta invención son útiles para ciertos tipos de pruebas que incluyen, pero no están restringidas a, pruebas de unión a ligando, pruebas de unión a GTP-y-S, y otras. Los detalles de preparación de dichas membranas celulares pueden determinarse en algunos casos por la naturaleza de la prueba resultante, pero típicamente implican cosechar células enteras y disolver la célula, por ejemplo, por sonicacíón en regulador de pH enfriado en hielo (por ejemplo, Tris-HCI 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4 a 4°C). El lisado crudo de células resultante es aclarado subsiguientemente de restos de células por centrifugación a baja velocidad, por ejemplo, a 200 xg por 5 minutos a 4°C. Más depuración y enriquecimiento de la membrana se hacen finalmente usando un paso de centrifugación a alta velocidad tal como, por ejemplo, 40,000 xg por 20 minutos a 4°C, y la pella de membrana resultante se lava por suspensión en regulador de pH enfriado en hielo y repitiendo el paso de centrifugación a alta velocidad. La pella de membrana lavada final se resuspende en regulador de pH de prueba. Las concentraciones de proteína se determinan mediante el método de Bradford (1976) usando albúmina de suero de bovino como un estándar. Las membranas pueden usarse de inmediato, o pueden congelarse para uso posterior.

Pruebas de unión a ligando radiomarcado Las células que expresan el receptor de esta invención, pueden usarse para identificar ligandos para dicho receptor. Las mismas pruebas pueden usarse para identificar agonistas o antagonistas del receptor que pueden usarse para una variedad de propósitos terapéuticos. Se realizan pruebas de unión a radioligando diluyendo membranas preparadas de células que expresan el receptor en un regulador de pH adecuado tal como, por ejemplo, regulador de pH de Tris 50 mM (pH = 7.4 a 0°C) conteniendo albúmina de suero de bovino a 2.1% (Sigma), aprotinina (0.005 mg/ml, Boehringer Mannheim) y obestatina (01. mM, Sigma) como inhibidores de proteasa. La concentración final de proteína en la prueba está típicamente dentro de 12 a 40 pg/ml. Las membranas se incuban entonces con ligando radiomarcado, ya sea en presencia o ausencia de ligandos competentes, en hielo por 60 minutos en un volumen total de placas de microtítulo de 96 cavidades de 250 µ?. El ligando unido es separado entonces de los ligandos libres por filtración a través de filtros GF/B pre-remojados en polietilenimina (PEI) a 0.5%, usando un dispositivo de filtración en vacío Tomtec (Wallac). Después de la adición de fluido de escintilación Ready Safe (Beckman), la radiactividad unida se cuantifica usando un contador de escintilación Trilux (Wallac) (aproximadamente 40% de eficiencia de conteo de conteos unidos). En forma alternativa, puede ser preferible colectar el ligando unido, y separar entonces el ligando del receptor usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Los datos se ajustan a curvas no lineales usando software para el ajuste de la curva, tal como GraphPad prism. De esta manera, pueden identificarse compuestos agonistas o antagonistas que se unen al receptor, puesto que inhiben la unión del ligando radiomarcado a la proteína de membrana de células que expresan dicho receptor. La unión no específica se define como la cantidad de radiactividad que queda después de la incubación de la proteína de membrana en presencia de 100 nM del péptido no marcado que corresponde al radioligando usado. En pruebas de unión por saturación en equilibrio, preparaciones de membrana o células intactas transfectadas con el receptor se incuban en presencia de concentraciones crecientes del compuesto marcado para determinar la afinidad de unión del ligando marcado. Las afinidades de unión de los compuestos no marcados pueden determinarse en pruebas de unión competitiva en equilibrio, usando una concentración fija de compuesto marcado en presencia de concentraciones variables de los ligandos de desplazamiento. En una modalidad particular, la prueba de unión a radioligando mencionada anteriormente se realiza usando obestatina radiomarcada como se definió anteriormente en la presente. La marcación de la obestatina y la unión al receptor se han descrito en Zhang, J. V. ef al. (2004 Science Vol. 310; 996-999). En resumen: Se realizó yodación de la obestatina, usando el procedimiento de lodogen (Pierce, Upland, IN). Mezclas del péptido (20 pg) y 1 mCi [125l] de Nal se transfirieron a viales de lodogen pre-recubiertos, y se incubaron por 4 minutos. El péptido marcado con 25l se aplicó a un cartucho Sep-Pak C18 (Waters) antes de la elución con acetonitrilo a 60%/TFA a 0.1 %. Para pruebas de unión a radioligando, yeyuno de rata u otros tejidos se lavaron con regulador de pH A (Hepes 20 mM, EDTA 5 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, fluoruro de amidinofenilmetansulfonilo 10 µ?, 5 mg/L de leupeptina, KCI 100 mM, pH 7.5), se cortaron en pequeñas piezas, y se homogenizaron usando un homogenizador motorizado. Los homogenizados se centrifugaron a 1 ,000 g por 5 minutos, y el sobrenadante se centrifugó a 300,000 g por 1 hora a 2°C. Las pellas (fracciones crudas de membrana) se resuspendieron con regulador de pH A sin KCI, se congelaron rápidamente bajo nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Los homogenizados de tejido se incubaron en 100 µ? de solución salina regulada en su pH con fosfato conteniendo albúmina de suero de bovino a 0.1 % por 18 horas a temperatura ambiente con concentraciones variables de obestatina-125! en presencia o ausencia de obestatina no marcada a exceso de ,000 veces. Después de la incubación, los tubos se centrifugaron por 10 minutos a 10,000 g, y las pellas se lavaron dos veces en PBS enfriada en hielo antes de la cuantificación de la radiactividad con un espectrofotómetro gamma. Se calculó la unión específica restando la unión no específica de la unión total. Para curvas de desplazamiento, una concentración fija de obestatina-125! se incubó con o sin concentraciones crecientes de obestatina u otros péptidos. Además de las pruebas de unión mencionadas anteriormente, es también un objetivo de la presente invención proveer pruebas funcionales para identificar compuestos que mejoren el control de la glucosa en un sujeto, caracterizadas porque dichos compuestos modulan la actividad de las proteínas receptoras GPR39 de conformidad con la invención. Dicha prueba comprende los pasos de: (i) poner en contacto la totalidad o partes de la proteína receptora GPR39 con el compuesto que se va a poner a prueba, y (ii) medir la actividad de la proteína receptora GPR39, en donde el cambio de actividad de GPR39 en presencia del compuesto de prueba, es una indicación de la capacidad de los compuestos para modular el metabolismo de carbohidratos. Dada la implicación observada de GPR39 en el metabolismo de carbohidratos, en todas las modalidades descritas que identifican compuestos que se unen a GPR39 y/o modulan la actividad de la misma, dichas pruebas pueden usarse para identificar compuestos que pueden afectar la homeostasis de la glucosa en un sujeto, incluyendo humanos y animales de sangre caliente.

Un compuesto que modula la actividad de un polipéptido de la invención, se refiere a un compuesto que altera la actividad del polipéptido, de modo que se comporta de manera diferente en presencia del compuesto que en ausencia del compuesto. Compuestos que afectan la modulación, incluyen agonistas y antagonistas. Un agonista abarca un compuesto que activa la función del GPCR GPR39. En forma alternativa, un antagonista incluye un compuesto que interfiere con la función del GPCR GPR39. Típicamente, el efecto de un antagonista se observa como un bloqueo de la activación del receptor inducida por el agonista; sin embargo, en el caso de GPR39, que recientemente se ha descrito como un receptor activo constitutivo, los compuestos que interfieren con la función del GPCR GPR39 incluyen también agonistas inversos, es decir, agentes que se unen al mismo sitio de unión al receptor como un agonista para ese receptor, pero que ejerce el efecto farmacológico opuesto. Antagonistas incluyen antagonistas competitivos, así como antagonistas no competitivos. Un antagonista competitivo (o bloqueador competitivo) interactúa con o cerca del sitio específico para la unión del agonista. Un antagonista o bloqueador no competitivo inactiva la función del receptor interactuando con un sitio diferente del sitio de interacción del agonista. Es de esta manera un objetivo de la presente invención, proveer un método para identificar compuestos capaces de mejorar el control de la glucosa en un sujeto, dicho método comprendiendo: (i) poner en contacto células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 con el compuesto que se va a poner a prueba, bajo condiciones que permitan la activación de dicha proteína receptora, y (ii) detectar cualquier incremento en la actividad del receptor GPR39, identificando de esta manera al compuesto de prueba como un compuesto capaz de mejorar el control de la glucosa en un sujeto. En otra modalidad, la presente invención provee un método para identificar compuestos capaces de disminuir la actividad de GPR39, dicho método comprendiendo: (i) poner en contacto células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 con el compuesto que se va a poner a prueba, bajo condiciones que permitan la activación de dicha proteína receptora, y (ii) detectar cualquier disminución en la actividad del receptor GPR39, identificando de esta manera al compuesto de prueba como un compuesto capaz de normalizar la tolerancia a la glucosa en un humano o animal, es decir, identificando al compuesto de prueba como útil en el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma. De nuevo, como para las pruebas de unión mencionadas anteriormente en la presente, las pruebas de actividad mencionadas anteriormente pueden usarse también para identificar compuestos que modularían el metabolismo de carbohidratos. Con base en el fenotipo observado en la prueba de tolerancia a la glucosa, se espera que los compuestos que incrementan la actividad de GPR39 resulten en una disminución de la tolerancia a la glucosa en sangre, y compuestos que disminuyen la actividad de GPR39 resulten en un incremento en la tolerancia a la glucosa en sangre. En una modalidad particular, la presente invención provee un método para identificar compuestos capaces de disminuir la tolerancia a la glucosa en sangre, dicho método comprendiendo: (i) poner en contacto células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 con el compuesto que se va a poner a prueba, bajo condiciones que permitan la activación de dicha proteína receptora, y (ii) detectar cualquier incremento en la actividad del receptor GPR39, identificando de esta manera al compuesto de prueba como un compuesto capaz de disminuir la tolerancia a la glucosa en sangre. El efecto de los compuestos sobre la actividad de GPR39, puede ser un incremento o disminución de la formación de un segundo mensajero intracelular que es mediado por GPR39, tal como calcio intracelular, AMPc o un producto de gen reportero. GPR39 pertenece a la clase de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Los GPCRs transmiten señales a través de las membranas celulares tras la unión del ligando. Los GPCRs unidos al ligando activan eventos de señalización intracelular mediados por proteínas G heterotriméricas, tales como activación de la vía de adenilato cíclasa o activación de la vía de fosfolipasa C-ß. Pruebas para evaluar la activación de los eventos de señalización intracelular mencionados anteriormente se conocen generalmente en la técnica, e incluyen entre otras, pruebas basadas en células para transducción de señales que comprenden factores de transcripción quiméricos inducibles por el ligando, pruebas de unión para receptores acoplados a proteína G usando análisis de la distribución de intensidad de fluorescencia, vías de señalización celular que usan nucleótidos cíclicos acoplados a luminóforos o medición de respuestas de receptores acoplados a proteína G usando un elemento de respuesta múltiple o prueba de reportero dirigido a elemento de respuesta a AMPc. Se da a continuación la descripción de varias de dichas pruebas. La presente invención provee también un bioensayo para identificar compuestos que modulan las regiones reguladoras del gen del GPCR GPR39. Dicha prueba se lleva a cabo usando células de rata o humano capaces de expresar un polipéptido de la invención (de preferencia de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4). Las células se ponen en contacto con por lo menos un compuesto en donde se conozca la capacidad de dicho compuesto para modular la región reguladora. Después, las células se monitorean para la expresión del ácido nucleico de la invención. En forma alternativa, el promotor puede ser enlazado a un gen reportero. Genes reporteros adecuados que pueden usarse incluyen, por ejemplo, el gen de cloranfenicol acetiltransferasa, el gen de luciferasa, y similares. Como lo entienden los expertos en la técnica, los métodos de bioensayo para identificar compuestos que modulan la actividad de receptores tales como los polipéptidos de la invención, requieren en general la comparación con un control. Un tipo de control es una célula o cultivo que se trata sustancialmente igual que la célula de prueba o cultivo de prueba expuesto al compuesto, con la distinción de que la célula o cultivo de control no es expuesto al compuesto. Otro tipo de célula o cultivo de control que puede usarse, es una célula o cultivo que es idéntico a las células transfectadas, la excepción siendo que la célula o cultivo de control no expresa GPCR GPR39 funcional. Por consiguiente, la respuesta de la célula transfectada puede comparare con la de la célula o cultivo de control para el mismo compuesto bajo las mismas condiciones de reacción. Tipos de pruebas particularmente preferidas, incluyen pruebas de unión y pruebas funcionales que pueden realizarse como sigue: Pruebas de unión Puede usarse la sobreexpresión de ácido nucleico que codifique para los polipéptidos de la invención en líneas de células (incluyendo células HEK 293 de mamífero, células CHO y células Sf9 de insecto), para producir preparaciones de membrana que posean dichos polipéptidos (referidas en esta sección como GPCR GPR39 por conveniencia) para estudios de unión a ligandos. Estas preparaciones de membrana pueden usarse en pruebas de unión a filtro convencionales (por ejemplo, usando equipo de prueba de filtro Brandel), o en pruebas de unión tipo proximidad de escintilación de alto rendimiento (tecnología SPA y Cytostar-T flashplate; Amersham Pharmacia Biotech), para detectar la unión del ligando radiomarcado y el desplazamiento de dichos radioligandos por competidores por el sitio de unión. La radiactividad puede medirse con un Packard Topcount, o instrumentación similar, capaz de hacer mediciones rápidas de formatos de 96, 384 o 1536 cavidades de microtítulo. La tecnología SPA/Cytostar-T está particularmente sujeta a identificación de alto rendimiento, y por lo tanto esta tecnología es adecuada para su uso como un tamiz para compuestos capaces de desplazar ligandos estándar. Otro procedimiento para estudiar la unión de ligandos a la proteína GPCR GPR39 en un ambiente que se aproxima a la situación nativa, hace uso de un efecto de resonancia de plasmones de superficie explotado por el instrumento Biacore (Malmqvist M., Biochem Soc Trans. Feb de 1999; 27 (2): 335-40). El GPCR GPR39 en preparaciones de membrana o células enteras pudo ser unido al chip biosensor de un Biacore, y pudo examinarse la unión de ligandos en presencia y ausencia de compuestos para identificar competidores del sitio de unión.

Pruebas funcionales Puesto que el GPCR GPR39 actúa por medio de G¡ o Go (proteína G inhibidora), que usualmente interactúa con GIRK (canales de potasio de rectificación hacia dentro), el flujo de iones potasio debe resultar en la activación de estos receptores. Este flujo de iones puede medirse en tiempo real, usando una variedad de técnicas que determinan los efectos agonistas o antagonistas de compuestos particulares. Por lo tanto, receptores del GPCR GPR39 recombinantes expresados en líneas de células o, por ejemplo, oocitos de Xenopus, pueden caracterizarse usando electrofisiología de canales individuales y células enteras para determinar el mecanismo de acción de compuestos de interés. Puede realizarse identificación electrofisiológica, para compuestos activos en el GPCR GPR39, usando técnicas electrofisiológicas convencionales, y cuando lleguen a estar disponibles, métodos de alto rendimiento novedosos actualmente bajo desarrollo.

Fluorescencia - Los flujos de calcio y sodio son mensurables usando varios colorantes fluorescentes sensibles a iones, incluyendo fluo-3, fluo-4, fluo-5N, rojo fura, verde de sodio, SBFI y otras sondas similares de proveedores que incluyen Molecular Probes. El influjo de calcio y sodio como resultado del GPCR GPR39 puede caracterizarse de tal manera en tiempo real, usando técnicas de formación de imágenes fluorométricas y de fluorescencia, incluyendo microscopía de fluorescencia con o sin métodos confocales láser combinados con algoritmos para el análisis de imágenes. Otro procedimiento es una prueba de identificación de alto rendimiento para compuestos activos como agonistas o moduladores que afectan el tránsito de calcio. Esta prueba se basa en un instrumento denominado un lector de placa de formación de imágenes de fluorescencia (FLIPR®), Molecular Devices Corporation). En su configuración más común, excita y mide la fluorescencia emitida por colorantes basados en fluoresceína.

Usa un láser de iones de argón para producir excitación de alta potencia a 488 nm de un fluoróforo, un sistema de óptica que explora rápidamente sobre el fondo de una placa de 96/384 cavidades, y una cámara de CCD enfriada sensible que captura la fluorescencia emitida. Contiene también una cabeza de pipeteo de 96/384 cavidades que permite que el instrumento suministre soluciones de agentes de prueba en las cavidades de una placa de 96/384 cavidades. La prueba FLIPR está diseñada para medir señales de fluorescencia de poblaciones de células antes, durante y después de la adición de compuestos, en tiempo real, de todas las 96/384 cavidades simultáneamente. La prueba FLIPR puede usarse para identificar y caracterizar compuestos funcionalmente activos en el GPCR GPR39 recombinante, por ejemplo, GPCR GPR39 de rata o humano, expresado en líneas de células. Como se describe a continuación, se midió el tránsito de calcio en células transfectadas con el GPCR GPR39 usando la prueba FLIPR que mide la activación de los receptores por varios substratos para determinar el ligando natural del receptor.

Prueba de AMP cíclico (AMPc) - La estimulación o inhibición de la formación de AMP cíclico (AMPc) mediada por el receptor, puede ponerse a prueba en células que expresan el receptor. Un ejemplo de protocolo para una prueba de AMPc, se provee a continuación. En este protocolo, células COS-7 son transfectadas transitoriamente con el gen del receptor usando el método de DEAE-dextrán, y sembradas en placas de 96 cavidades. 48 horas después de la transfección, las células se lavan dos veces con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) de Dulbecco complementada con HEPES 10 mM, glucosa 10 mM y teofilina 5 mM, y se incuban en el mismo regulador de pH por 20 minutos a 37°C, en CO5 a 5%. Se añaden compuestos de prueba, y las células se incuban por otros 10 minutos a 37°C. El medio se aspira entonces, y la reacción se interrumpe por la adición de HCI 100 mM. Las placas se almacenan a -20°C por 2 a 5 días para la medición de AMPc, las placas se descongelan, y el contenido de AMPc en cada cavidad se mide por medio de la prueba de proximidad de escintilación de AMPc (Amersham Pharmacia Biotech). La radiactividad se cuantifica usando un contador microbeta Trilux (Wallac).

Prueba microfisiométrica - Debido a que el metabolismo celular está implicado intrincadamente en una amplia gama de eventos celulares (incluyendo la activación de vías de mensajeros múltiples por el receptor), el uso de mediciones microfisiométricas del metabolismo celular puede proveer una prueba genérica de la actividad celular que surge de la activación de cualquier receptor huérfano, a pesar de los detalles de la vía de señalización del receptor. Guías generales para la expresión de receptores transitorios, preparación de células y registro microfisiométrico, se describen en otra parte (Salón, J. A. y Cwicki, J. A., 1996). Típicamente, células que expresan receptores se cosechan y se siembran a 3 x 105 células por cápsula de microfisiómetro, en medio completo 24 horas antes de un experimento. El medio se reemplaza con medio libre de suero 16 horas antes del registro, para reducir al mínimo la estimulación metabólica no específica, por factores del suero distribuidos y mal definidos. En el día del experimento, las cápsulas de células se transfieren al microfisiómetro, y se deja que alcancen el equilibrio en el medio de registro (medio 1640 del RPMI de bajo contenido de regulador de pH, sin bicarbonato, sin suero (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA) conteniendo BSA a 0.1 a 1 % libre de ácidos grasos), durante el cual se establece una medición de la actividad metabólica basal en el punto de partida. Un protocolo de registro estándar especifica una magnitud de flujo de 100 µ?/min, con un ciclo de bombeo total de 2 minutos que incluye una interrupción del flujo por 30 segundos durante la cual se hace la medición rara de acidificación. Los desafíos del ligando implican una exposición por 1 minuto 20 segundos a la muestra poco antes de que se haga la primera medición de la magnitud post-desafío, seguida de dos ciclos de bombeo adicionales por un total de 5 minutos 20 segundos de exposición a la muestra. Típicamente, fármacos en un tamiz primario son presentados a las células a concentración final de 10 µ?. Se hacen entonces experimentos de seguimiento para examinar la dependencia de compuestos activos por la dosis, desafiando secuencialmente las células con una escala de concentración de fármaco que exceda la cantidad necesaria para generar respuestas que varíen del umbral a niveles máximos. Las muestras de ligandos se agotan entonces, y las velocidades de acidificación reportadas se expresan como un porcentaje de incremento de la respuesta pico sobre la velocidad en el punto de partida observada poco antes del desafío. Los compuestos que se ha encontrado modulan la actividad de los polipéptidos de la presente invención tienen muchos usos terapéuticos, con base en el hallazgo de que GPR39 está implicada en la regulación del metabolismo de carbohidratos. Específicamente, esto incluye enfermedades relacionadas con niveles incrementados de glucosa en sangre tales como, por ejemplo, diabetes (incluyendo complicaciones asociadas de la misma), que incluye diabetes tipo 1 (diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), tipo 2 (diabetes mellitus no insulinodependiente), diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY) y diabetes gestacional. En resumen, el GPCR GPR39 y receptores relacionados pueden usarse como una herramienta valiosa para el desarrollo de fármacos en una variedad de áreas terapéuticas.

Agentes aglutinantes De esta manera, la invención provee además agentes aglutinantes novedosos, incluyendo agentes moduladores obtenidos por una prueba de conformidad con la presente invención, y composiciones que comprenden dichos agentes. Agentes que se unan al receptor y que puedan tener actividad agonista o antagonista, pueden usarse en métodos para tratar las enfermedades caracterizadas anteriormente, cuya patología se caracterice por la acción por medio del receptor GPCR GPR39, y dicho uso forma otro aspecto de la invención. Los agentes pueden administrarse como una cantidad efectiva de un agente de la invención. Puesto que muchas de las condiciones mencionadas anteriormente son crónicas y con frecuencia incurables, se entenderá que se pretende que "tratamiento" incluya el logro de una reducción en los síntomas por un período tal como algunas horas, días o semanas, y que incluya disminuir la progresión del curso de la enfermedad. Dichos agentes pueden formularse en composiciones que comprendan un agente junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El agente puede estar en la forma de un derivado fisiológicamente funcional, tal como un éster o una sal, tal como una sal ácida de adición o sal básica de metal, o un N- o S- óxido. Las composiciones pueden formularse para cualquier vía o medio de administración adecuado. Vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, incluyen aquellos usados en formulaciones adecuadas para administración oral, rectal, nasal, inhalable, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural). La elección del vehículo o diluyente dependerá, de hecho, de la vía de administración propuesta, que puede depender del agente y su propósito terapéutico. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Dichos métodos incluyen el paso de poner en asociación el ingrediente activo con el vehículo que constituya uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniformemente e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, conformando el producto. Para composiciones sólidas, pueden usarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, celulosa, derivados de celulosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. El compuesto activo como se definió anteriormente puede formularse como supositorios usando, por ejemplo, polialquilenglicoles, triglicéridos acetilados, y similares, como el vehículo. Pueden prepararse composiciones líquidas farmacéuticamente administrables, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc., un compuesto activo como se definió anteriormente, y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo tal como, por ejemplo, agua, dextrosa acuosa salina, glicerol, etanol, y similares, para formar de esta manera una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que se va a administrar puede contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes mojantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH, y similares, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina, etc. Métodos reales para preparar dichas formas de dosificación se conocen, o serán evidentes, para los expertos en la técnica; véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, decimoquinta edición, 1975. La composición o formulación que se va a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad de los compuestos activos en una cantidad efectiva para aliviar los síntomas del sujeto que está siendo tratado. Pueden prepararse formas de dosificación o composiciones que contengan el ingrediente activo en la escala de 0.25 a 95%, siendo el resto vehículo no tóxico. Para administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma por la incorporación de cualquiera de los excipientes usados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, celulosa, derivados de celulosa, croscarmelosa de sodio, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato, y similares. Dichas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y similares. Dichas composiciones pueden contener de 1 % a 95% de ingrediente activo, más preferiblemente de 2 a 50%, muy preferiblemente de 5 a 8%. La administración parenteral se caracteriza en general por inyección, ya sea subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente. Pueden prepararse formulaciones inyectables en formas convencionales, ya sea como suspensiones o soluciones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar pueden contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes mojantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH, y similares tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, acetato sódico de trietanolamina, etc. El porcentaje de compuesto activo contenido en dichas composiciones parenterales es altamente dependiente de la naturaleza específica del mismo, así como la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto. Sin embargo, son utilizables porcentajes de ingrediente activo de 0.1 % a 10% en solución, y serán mayores si la composición es un sólido que será diluido subsiguientemente a los porcentajes anteriores. De preferencia, la composición comprenderá de 0.2 a 2% del agente activo en solución. Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proveer una composición farmacéutica para el tratamiento de metabolismo deteriorado de carbohidratos en un sujeto tal como, por ejemplo, diabetes (incluyendo complicaciones asociadas de la misma), incluyendo diabetes tipo 1 (diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), tipo 2 (diabetes mellitus no insulinodependiente), diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY) y diabetes gestacional, dicha composición comprendiendo un antagonista del receptor GPR39.

Producto de diagnóstico Las presentes invenciones proveen también un producto de diagnóstico que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para la totalidad o parte de los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, (ii) una secuencia de ácido nucleico que consiste de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o (iii) una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia, y de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad de secuencia, con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Mediante el uso del ADN, ADN antisentido o ARNsi de la presente invención como sondas, puede detectarse una anormalidad génica del ADN o ARN mensajero que codifica para el receptor GPR39 o parte del mismo en mamíferos incluyendo humanos, y por lo tanto estas secuencias de ácido nucleico son agentes de diagnóstico de genes útiles para daño del ADN o ARN mensajero que codifica para el receptor GPR39 o parte del mismo, mutaciones del mismo, subexpresión del mismo o sobreexpresión del mismo. El diagnóstico de genes descrito anteriormente puede realizarse, por ejemplo, por medio de prueba de hibridación Northern públicamente conocida o prueba de PCR-SSCP. Cuando se detecte una subexpresión del receptor GPR39, puede diagnosticarse que el sujeto sufre de una enfermedad asociada con la disfunción del receptor GPR39 tal como, por ejemplo, síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo. Cuando se detecte una sobreexpresión del receptor GPR39, puede diagnosticarse que el sujeto sufre de una enfermedad asociada con la sobreexpresión del receptor GPR39 tal como, por ejemplo, diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma. La presente invención provee también un producto de diagnóstico que comprende la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39. Dicha proteína puede detectarse, por ejemplo, en una muestra adecuada, por ejemplo, una muestra de sangre, para diagnosticar subexpresión o sobreexpresión del receptor GPR39. Esta invención se entenderá mejor haciendo referencia a los detalles experimentales siguientes, pero los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que éstos son sólo ilustrativos de la invención como se describe más enteramente en las reivindicaciones más adelante. Además, a lo largo de esta solicitud, se citan varias publicaciones. La descripción de estas publicaciones se incorpora de esta manera en esta solicitud como referencia para describir más enteramente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Otras modalidades ocurrirán para los expertos en la técnica a la luz de estos ejemplos.

Materiales y métodos Ratones con expresión bloqueada de GPR39 Se obtuvieron ratones con expresión bloqueada de GPR39 de Lexicón Genetics Inc. Se logró la disolución del marco de lectura abierto de GPR39, reemplazando la región codificante del primer exón codificante del gen de GPR39 con un cassette de selección/gen reportero LacZ/MC1-Neo con IRES. Se mantuvo a los animales en una instalación de SPF que satisfacía todos los requisitos belgas y europeos para el cuidado de animales. Se alojó a los ratones por grupos en una colonia de animales con clima controlado con un ciclo de 12 horas de luz-oscuridad (luz a las 7:00, hora oficial del Este), con acceso libre a alimento y agua, a menos que se indicara de otra manera. Se tomaron medidas adecuadas para reducir al mínimo el dolor o la molestia. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los European Communities Council Directives (86/609/EEC), y fueron aprobados por el comité ético local.

Análisis histológico de la expresión de GPR39 en el páncreas Se disectó el páncreas de ratones WT (de tipo silvestre) y GPR39" _, y se realizó tinción de LacZ en portaobjetos entero. En resumen, se disectó tejido en solución de PBS en hielo, y fue fijado por 2 horas a 4°C en glutaraldehído a 0.5% en PBS. Después, el tejido se enjuagó 3 veces en PBS con agitación suave. Se realizó tinción durante la noche a 30°C en un regulador de pH de tinción complementado con 1 mg/ml de X-gal, ferricianuro de potasio 5 mM y ferrocianuro de potasio 5 mM. Después de la tinción, se enjuagó el tejido en el regulador de pH de lavado de PBS, se deshidrató en alcohol, se aclaró en xilol incluido en parafina, y se seccionó a 5 µ??. Se realizó examen histológico en secciones de tejido de 10 pm con y sin contratinción con hematoxilina y eosina de Harris.

Comparación del peso corporal en ratones WT y GPR39 Se alojó individualmente a los animales en jaulas a 22 ± 1 °C con un ciclo de 12 horas-12 horas de luz-oscuridad. Se alimentó a los animales a voluntad con una dieta estándar (22% de proteínas, 4.3% de grasa y 4% de celulosa de U.A.R., Francia). Se siguió el peso corporal en estos animales partiendo a la edad de 8 a 12 hasta 16 a 20 semanas.

Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones WT y GPR39 Se sometió a ayuno a ratones GPR39"y" y WT (machos y hembras) durante la noche (partiendo a las 5:30 p.m.), y se inyectó entonces subcutáneamente a los mismos con 2 g/kg de glucosa (solución salina a una concentración final de 200 mg/ml). Se tomaron muestras de sangre por venesección de la cola. Primero, se tomó el punto de partida antes de que se pesara a los animales, y entonces se administró glucosa. Se determinó la concentración de glucosa en sangre a 15, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos postadministración de glucosa, por medio del instrumento One Touch Ultra (Lifescan Inc., USA).

Comparación de la composición del cuerpo de ratones WT y GPR39 - Se midieron la grasa corporal y la masa muscular del cuerpo en ratones GPR39"7" y de tipo silvestre conscientes, entre las 9.00 y 11.00 a.m., por resonancia magnética nuclear (RMN) cuantitativa (analizador de RMN Minispec mq10, Bruker, Alemania). Este es un método desarrollado especialmente para la determinación rápida no invasiva de la composición del cuerpo en ratones conscientes. Se cuantificaron cuerpo magro, grasa corporal y fluido por medio de RMN. Se pesó a los animales antes de la medición de la RMN. Resultados Análisis histológico de la expresión de GPR39 en el páncreas En los ratones GPR39"'" a la mano, la región codificante del primer exón codificante es reemplazada por el gen reportero LacZ; por lo tanto, se examinó la expresión de LacZ como un indicador del patrón de expresión endógena de GPR39 en el páncreas. En el páncreas, la expresión se detectó por todos los islotes de Langerhans, la porción endocrina del páncreas en ratones GPR39"7" (figura 1A), pero no en ratones de tipo silvestre (figura 1 B).

Comparación del peso corporal en ratones WT y GPR39 ~'~ Se siguió el peso corporal en estos animales, partiendo a la edad de 8 a 12 semanas hasta 16 a 20 semanas. Los ratones GPR39"'" machos ganaron más peso que los ratones machos de tipo silvestre correspondientes (figura 2). No se observó diferencia alguna en estos ratones hembras en esta escala de edad.

Prueba de tolerancia a la glucosa en ratones WT y GPR39 Después de un período de ayuno de 16 horas, la glucosa en sangre no fue cambiada significativamente en ratones GPR39"'" (machos + hembras) en comparación con ratones de tipo silvestre (machos + hembras) (de 12 a 16 semanas). En condición de alimentación, tampoco se observó diferencia alguna en la glucosa en sangre entre ambos genotipos (figuras 3A-3B). Después de la administración de glucosa, la glucosa en sangre fue significativamente menos incrementada en ratones GPR39"'" machos en comparación con ratones machos de tipo silvestre (de 12 a 16 semanas) (P<0.05). En ratones hembras, no se observó diferencia alguna entre ambos genotipos (de 12 a 16 semanas) (figura 4).

Comparación de la composición del cuerpo de ratones WT y GPR39-y- Se midió la composición del cuerpo en ratones a la edad de 13 a 17 y 16 a 20 semanas. En los ratones de 13 a 16 semanas, no se observó diferencia alguna en la composición del cuerpo entre ambos genotipos alimentados con dieta estándar. Tres semanas después, en los mismos animales, la grasa corporal en los ratones machos GPR39"y" pareció aumentar en comparación con los ratones machos de tipo silvestre (15.76 ± 5.30% contra 1.97 ± 2.60%), mientras que la masa magra corporal pareció disminuir en los ratones machos GPR39"y" en comparación con los ratones de tipo silvestre (41.22 ± 3.41% contra 43.45 ± 1.78%) (figuras 5A-5B).

Discusión Con base en los primeros hallazgos de que el receptor GPR39 s altamente expresado en el tejido del páncreas, junto con los resultados del análisis fenotípico de ratones GPR39"y~ que muestran niveles incrementados de colesterol en ambos sexos de los ratones con expresión bloqueada de GPR39, en comparación con las carnadas de tipo silvestre (datos no publicados), debe investigarse una función posible para el receptor GPR39 en el control de la glucemia. La confirmación de la implicación de GPR39 en el control de la glucemia validaría este receptor como un buen objetivo para tratar enfermedades diabéticas que incluyen complicaciones de las mismas, y todas las enfermedades relacionadas con el síndrome metabolico. Por estas razones, el propósito del presente trabajo fue localizar primeramente el receptor GPR39 en el tejido del páncreas usando la técnica de expresión de lacZ, y después poner a prueba los ratones GPR39"'" contra ratones de tipo silvestre en la prueba de tolerancia a la glucosa. En función de estos resultados, se realizará la determinación de la concentración de insulina antes y después de la administración de glucosa en la prueba de tolerancia a la glucosa, para confirmar la función posible de GPR39 en el control de la glucemia. En paralelo a todos estos estudios, se determinó también la composición del cuerpo usando un dispositivo de RMN. Aquí también en función de los resultados preliminares, es posible que se investigue el metabolismo de los ratones GPR39"'" en comparación con ratones de tipo silvestre, en una estructura de jaula con metabolismo estándar.

REFERENCIAS Bradford, M. M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254. Hoist, B., Holliday, N. D., Bach, A., Elling C. E., Coc, H. M. y Schwartz, T. W., Common structural basis for constitutive activity of the Ghrelin receptor family. J. Biol. Chem. 2004, 279 (51 ): 53806-53817. Date Y, Nakazato M, Murakami N, Kojima M, Kanga a K, Matsukura S. Ghrelin acts ¡n the central nervous system to stimulate gastric acid secretion. Biochem Biophys Res Commun. Ene 26 de 2001 ; 280 (3): 904-7. Ghoos Y, Maes B, Geypens B, Mys G, Hiele M, Rutgeerts P y Vantrappen G. Measurement of gastric emptying rate of solids by means of a carbón labeled octanoic acid breath test. Gastroenterol. 1993; 104: 1640-7. Inui A, Asakawa A, Bowers CY, Mantovani G, Laviano A, Meguid MM, Fujimiya M. Ghrelin, appetite, and gastric motility: the emerging role of the stomach as an endocrine organ. FASEB J. Mar de 2004; 18 (3 ): 439-56. Maes B, Ghoos Y, Geypens B, Mys G, Hiele M, Rutgeerts P y Vantrappen G. The combined 3C-glycine/ 4C-octanoic acid breath test: a double carbón labeled breath test to monitor gastric emptying rate of liquids and solids. J. Nucí. Med. 1994; 35: 824-31. McKee K K, Tan C P, Palyha O C, Liu J, Feighner S D, Hreniuk D L, Smith R G, Howard A D y Van der Ploeg L H T. Cloning and characterization of two human G protein-coupled receptor genes (GPR38 and GPR39) related to the growth hormone secretagogue and neurotensin receptors. Genomics 46: 426-434, 1997. Trudel L, Tomasetto C, Rio M C, Bouin M, Plourde V, Eberling P y Poitras P (2002) Ghrelin/motilin-related peptide is a potent prokinetic to reverse gastric postoperative ileus in rat. Am. J. Physiol. 282, G948-G952.

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Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para identificar compuestos que mejoren el control de la glucosa en un sujeto y que sean efectivos para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, dicho método comprendiendo el uso de la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína receptora GPR39 está siendo seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, una variante de empalme de las proteínas que tienen las SEQ ID's mencionadas anteriormente, y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% y de preferencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque una parte de la proteína receptora GPR39 consiste de un fragmento de por lo menos 10 aminoácidos del polipéptido de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

4. - Un método para identificar un compuesto que mejora la regulación de la glucosa en un sujeto, y que sea efectivo para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, cuyo método comprende: (i) poner en contacto células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 de conformidad con la invención, con dicho compuesto bajo condiciones adecuadas para la unión, y (ii) detectar la unión del compuesto a dicha proteína receptora.

5. - Un método para identificar un compuesto que mejora la regulación de la glucosa en un sujeto, y que sea efectivo para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con un metabolismo deteriorado de carbohidratos, en particular en la prevención y/o el tratamiento de diabetes, incluyendo complicaciones asociadas de la misma, o del síndrome metabólico, incluyendo complicaciones asociadas del mismo, cuyo método comprende: (i) poner en contacto preparaciones de membrana de células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39 de conformidad con la invención, con dicho compuesto bajo condiciones adecuadas para la unión, y (ii) detectar la unión del compuesto a dicha proteína receptora.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado además porque la unión del compuesto a la proteína receptora GPR39 está siendo detectada por medio de una marca asociada directamente o indirectamente con el compuesto que se va a poner a prueba o en una prueba que implica competencia con un competidor marcado.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el competidor marcado es obestatina marcada.

8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado además porque en el paso (i), los compuestos son puestos en contacto con células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína GPR39 de conformidad con las reivindicaciones 2 y 3.

9.- Un método para identificar compuestos que modulan el metabolismo de carbohidratos, dicho método comprendiendo los pasos de: (i) poner en contacto la totalidad o partes de la proteína receptora GPR39 con el compuesto que se va a poner a prueba, y (ii) medir la actividad de la proteína receptora GPR39, en donde el cambio de actividad de GPR39 en presencia del compuesto de prueba, es una indicación de la capacidad de los compuestos para modular el metabolismo de carbohidratos.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque en el paso i), los compuestos son puestos en contacto con células hospederas que expresan la totalidad o parte de la proteína GPR39 de conformidad con las reivindicaciones 2 y 3.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado además porque la actividad de la proteína receptora GPR39 está siendo medida como la modulación de un mensajero intracelular.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el segundo mensajero intracelular es AMPc, calcio o un producto de gen reportero.

13. - El uso de una secuencia de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para la totalidad o parte de los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, (ii) una secuencia de ácido nucleico que consiste de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o (iii) una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia, con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 4. - El uso de un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 13, en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4, 5, 8, 9 ó 10. 15.- El uso de una célula hospedera que comprende una secuencia de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 13, o un vector como se reclama en la reivindicación 4, en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4, 5, 8, 9 ó 10. 6. - Una composición farmacéutica para el tratamiento de control deteriorado de la glucosa en un humano o animal, que comprende un agonista o antagonista del receptor GPR39. 17. - El uso de un agonista o antagonista de GPR39, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición de enfermedad relacionada con un metabolismo deteriorado del carbohidrato, en particular diabetes (incluyendo complicaciones asociadas de la misma), incluyendo diabetes mellitus tipo 1 (diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), tipo 2 (diabetes mellitus no insulinodependiente), diabetes juvenil de inicio en la madurez (MODY) y diabetes gestacional. 18. - Un producto de diagnóstico que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para la totalidad o parte de los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, (ii) una secuencia de ácido nucleico que consiste de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o (iii) una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia, con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. 19. - El producto de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 18, en donde en el paso (i), la parte del polipéptido es como se define en la reivindicación 3. 20. - Un producto de diagnóstico que comprende la totalidad o parte de la proteína receptora GPR39. 21. - El producto de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la proteína receptora GPR39 es como se define en la reivindicación 2, y la parte de la proteína receptora GPR39 es como se define en la reivindicación 3.