MX2008014869A - Uso de bacterias de acido lactico seleccionadas para reducir colicos infantiles. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona ciertas cepas de bacterias de ácido láctico seleccionadas por su capacidad de promover la producción de IL-10 y por lo tanto la proliferación de las células TR CD4+CD25+, para la profilaxis y/o tratamiento del cólico infantil, un método para seleccionar tales cepas, y productos que contienen tales cepas.

Description

USO DE BACTERIAS DE ACIDO LACTICO SELECCIONADAS PARA REDUCIR COLICOS INFANTILES Campo de la invención La presente invención proporciona algunas cepas de bacterias de ácido láctico seleccionadas por su capacidad de aumentar los niveles de citosina IL-10, para profilaxis y/o tratamiento de cólico, un método para seleccionar tales cepas, y productos que contienen tales cepas. Antecedentes de la Invención A pesar del silencio en términos de prevalencia e incomodidad, la naturaleza y causas del cólico infantil han permanecido sin entenderse. La descripción de una madre de esta condición es un bebé que ha sido feliz durante el día, comienza a fruncir el ceño, su cara se toma un color rojo, contrae sus piernas, gritos y continúa llorando durante aproximadamente 2-20 minutos después de lo cual el suceso finaliza repentinamente. Se presenta una controversia incluso en los términos usados para describir la condición. Estos términos incluyen, "cólico infantil", "cólico vespertino" debido a que el dolor se confina principalmente al horario vespertino, y "cólico de tres meses" bajo el pretexto que desaparece después de aproximadamente tres meses del nacimiento (lllingworth RS. Difficulties in breastfeeding. In Ronald S. lllingworth, ed. The Normal Child. 10th edn. Harcourt (India) Pvt. Ltd. 1997; 39-44). Diferentes autores han utilizado diferentes definiciones. La definición de Wessels es que el cólico es una crisis de llanto durante tres o más horas por día durante tres días o más por semana durante un período de por lo menos tres semanas, se acepta principalmente en la literatura (Sondergaard C, Skajaa E, Henriksen TB. Fetal growth and infantile colic. Arch Dis Child Fetal-Neonatal Ed 2000; 83 (1): F44-47). Hasta la fecha, los factores causantes posibles principales se han dividido en tres grupos: trastornos psicosociales, gastrointestinales y de desarrollo neurológico. Los factores psicosociales incluyen: llanto de variante normal, efectos de comportamiento de educación anormal, y manifestación de problemas en la interacción de padre-niño. Los trastornos gastrointestinales se han implicado en el cólico debido a la posición de la pierna del niño y a las muecas durante un periodo de llanto. Los factores gastrointestinales se repasan brevemente abajo: Se ha considerado como factores causantes las técnicas de alimentación incorrectas tal como alimentación con biberón, alimentando en una posición horizontal y la carencia de alimentación después de eructar se han considerado como factores causativos. El amamantamiento en los primeros seis meses se ha encontrado que es el único factor protector. El riesgo de cólico infantil es 1.86 veces más alto entre los niños no amamantados (Saavedra MA, Dacosta JS, Garcías G, Horta BL, Tomasi E, Mendoca R. Infantile colic incidence and associated risk factors: a cohort study. Pediatr (Rio J) 2003; 79(2): 115- 122). Lothe y col. Mostraron que el cólico es sensible a la proteína de la leche de vaca (Lothe L, Lindberg T. Cow's milk whey protein elicits symptoms of infantile colic in colicky formula -fed infants: A double -blind cross over study. Pediatrics 1989; 83: 262). En un estudio reciente, se determinó que la hipersensibilidad alimenticia se podría definir como causante en solamente una minoría de los casos de cólico infantil (Hill DJ, Hosking CS. Infantile colic and food hypersensitivity. J Pediatr Gastrenterol Nutr 2000; 30 (Suppl): S67-76). Buchanan ha mostrado recientemente que un ensayo de la leche hipoalérgica en el cólico infantil no es apoyado por suficiente evidencia (Buchanan P. Effectiveness of treatment for infantile colic. Trial of hypoallergenic milk is not supported by strong enough evidence. BMJ 1998; 317(7170): 1451-1452). Los bebés con cólico infantil están probablemente en un riesgo más alto de enfermedades alérgicas. Sin embargo, en un estudio reciente, los marcadores de atopía, rinitis alérgica, asma, jadeo y variabilidad de flujo máximo, muestran ser comparables en niños con o sin cólico infantil ((Castro- Rodríguez JA, Stern DA, Halonen M, Wright AL, Holberg CJ et al. Relationship between infantile colic and Asthma/ atopy: A prospective study in an unselected population. Pediatrics 2001; 108(4): 878-882). La mala absorción de la lactosa ha sido descrita por los autores en base a las pruebas de hidrógeno en respiración (Hyams J, Geerstama M, Etienne N, Treem W. Colonic hydrogen production in infants with colic. J Pediatr 1989; 115: 592). No se ha encontrado ninguna diferencia en las concentraciones de hidrógeno estándar entre los niños con o sin cólico infantil. Sin embargo, se han encontrado que los niños que produjeron niveles más altos de metano tienen un cólico disminuido, lo cual sugiere una función de la producción de metano en su disminución (Belson A, Shetty AK, Yorgin PD, Bujanover Y, Peled Y, Dar MH, Riaf S. Colonic hydrogen elimination and methane production in infants with and without infantile colic syndrome. Dig Dis Sci 2003; 48(9): 1762-1766). Las hormonas gastrointestinales (GIT) tales como motilina, péptido intestinal vasoactivo, han mostrado ser anormalmente altas en bebés con cólico. Lothe y col. han mostrado niveles elevados del primer día de vida en bebés que desarrollaron posteriormente cólico, lo cual sugiere una fisiología anormal de GIT en el cólico infantil (Lothe L, Ivassson SA, Ekman R, Lindberg T. Motilin and infantile colic: A prospective study. Acta Pediatr Scand 1990; 79(4): 410-416). Los trastornos de desarrollo neurológico han sugerido que la obstaculización abdominal y cólico puedan ser un resultado de la hiperperistalsis. La teoría es soportada por la evidencia que el uso de agentes anticolinérgicos disminuye los síntomas del cólico (Gupta SK. Is colic a gastrointestinal disorder? Curr Opin Pediatr 2002; 14:588-92). El hecho de que la mayoría de los niños superen el cólico a los cuatro meses de edad apoya la causa del cólico relacionada al desarrollo neurológico (Barr RG. Colic and crying syndromes in infants. Pediatrics 1998;102(5 suppl E):1282-6). Un probiótico, por definición generalmente aceptada, es un complemento microbiano vivo de la alimentación que afecta benéficamente al animal anfitrión mejorando su equilibrio microbiano intestinal. Aunque originalmente se refiere al complemento alimenticio para animales de granja, la definición se aplica fácilmente a la situación humana. El consumición principal de probioticos de los humanos está en forma de alimentos a base de productos lácteos que contienen especies intestinales de lactobacilos y bifidobactérias. Es implícito en la definición que el consumo de probioticos afecta la composición de la microflora intestinal. Se propone que este efecto probiótico en el ecosistema intestinal tiene un impacto benéfico sobre el consumidor. Un número de ventajas potenciales que se presentan a partir de los cambios al entorno intestinal a través de la agencia de probioticos se han documentado incluyendo: la resistencia aumentada a enfermedades infecciosas, particularmente intestinales, duración disminuida de diarrea, reducción de la presión arterial, reducción de la concentración de colesterol en suero, reducción de alergia, estímulo de fagocitosis por leucocitos de sangre periférico, modulación de la expresión genética de citosina, efecto adyuvante, retroceso de tumores, y reducción de la producción de carcinógeno o co-carcinógeno. Christensen y col, fueron algunos de los primeros en reportar que los lactobacilos probióticos ejercen sus efectos inmunomoduladores mediante la modulación de la capacidad de promoción de Th1/Th2/Th3/Tr1/Treg de células dendríticas (DCs, por sus siglas en inglés). Mostraron que cuando las DCs de murino fueron expuestas co-cultivos de diferentes especies de Lactobacillus, incluyendo Lactoacillus reuteri, modularon de manera diferencial la producción de citosinas IL-6, IL-10, IL-12, y TNF-a, y para la sobre-regulación de MHC clase II y los marcadores superficiales CD86 de una manera dependiente de la concentración. Todos los lactobacilos sobre-regulan MHC superficiales clase II y marcadores CD86 - indicativos de la maduración de DC. Fue particularmente notable en éstos estudios que L. reuteri (cepa 12246) fue un inductor pobre de IL-12, pero cuando se co-cultivó con L. johnsonii. o L. casei, inhibe de manera diferencial la producción de señales de citosina proinflamatorias IL-12, IL-6 y TNF-a, que fueron estimuladas por las últimas dos especies. La producción de IL-10 permaneció sin alterar bajo estas condiciones. Estos hallazgos condujeron a sus conclusiones que "L. reuteri . puede contribuir a una modulación ambiental de la generación intestinal de células dendríticas que favorece la tolerancia hacia los antígenos que no tienen una "señal peligrosa" mientras que al mismo tiempo mantiene intacta la capacidad de respuesta contra los patógeno reconocidos vía una señal peligrosa similar a LPS," que "/.. reuteri puede ser un tratamiento muy dirigido potencial efectivo para la producción de la infra-regulación de IL-12 y TNF-a (e IL-6) mientras que induce IL-10 antiinflamatoria, por lo tanto representa un método terapéutico alternativo para contrarrestar el entorno de citosina intestinal por-inflamatorio", y por lo tanto "existe el potencial para que las capacidades de impulsión de Th1/Th2/Th3 sean moduladas de acuerdo a la composición de la microflora intestinal, incluyendo los probióticos injeridos". (Christensen HR, Frokiaer H, Pestka JJ (2002) Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells. J Immunol 168 171-178). Smits y col ampliaron estas observaciones y mostraron que L. reuteri tiene la capacidad de cebar las DCs para estimular la producción de células T reguladoras (TR, por sus siglas en inglés). Utilizaron tres diferentes especies de Lactobacillus co-cultivados in vitro con DCs derivadas de monocitos humanos. Dos de los lactobacilos, una cepa de L. reuteri humana (ATCC 53609) y L. casei, pero no una cepa de L. plantarum, cebaron estas DCs para estimular el desarrollo de células TR. Estas células TR demostraron producir niveles aumentados de IL-10 y pudieron inhibir la proliferación de células T del anfitrión de una manera dependiente de IL-10 (Smits HH, Engering A, van der Kleij D, de Jong EC, Schipper K, van Capel TMM, Zaat BAJ. Yazdanbakhsh M, Wierenga EA, van Kooyk Y, Kapsenberg L (2005) Selective probiotic bacteria induce IL-10-producing regulatory T cells in vitro by modulating dendritic cell function through dendritic cell-specific intercellular adhesión molecule 3 -grabbing nonintegrin. J Allergy Clin Immunol 115 1260-1267). Una de las primeras evidencias referentes a un efecto de L. reuteri administrado oralmente en el anfitrión por sí misma fue una relación aumentada de las células T CD4+/CD8+ observada en íleon del anfitrión (Walter J. Dobrogosz, NUTRAfoods 2005 4(2/3) 15-28). Valeur y col. ampliaron recientemente esta observación para incluir el íleon humano. Obtuvieron la evidencia in situ directa en sujetos humanos que mostraron (a) una distribución de células ATCC 55730 de L. reuteri específicas humanas a través del intestino humano y (b) la implicación evidente de L. reuteri ATCC 55730 en el reclutamiento y/o proliferación de células T CD4+ específicamente en las regiones iléicas de los intestinos. Concluyeron que "las adiministraciones de L. reuteri produjeron un reclutamiento de células T auxiliares CD4+ al epitelio humano. Este reclutamiento puede ser un factor en la explicación del efecto probiótico de esta cepa de L. reuteri en el humano" (Valeur N, Engel P, Carbajal N, Connolly E, Ladefoged K (2004) Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract, Appl Environ Microbiol 70 1176-1181). Los receptores tipo Toll (TLRs, por sus siglas en inglés) reconocen los motivos microbianos y activan un conjunto de genes que conduce a la producción de citosina. Tradicionalmente, los TLRs se han considerado como censores de infecciones microbianas, y su función es inducir una respuesta inflamatoria. Sin embargo, los motivos reconocidos por TLRs no son únicos para los patógeno pero son motivos generales compartidos por las clases enteras de microorganismos, y no se entiende completamente de que manera el sistema inmunológico distingue entre las bacterias comensales y patógenas vía los TLRs. Recientemente, los datos han mostrado que los TLRs, a pesar de su función en la inducción de la respuesta inflamatoria, también desempeñan una función en el mantenimiento de la homeostasis intestinal reconociendo la microflora del comensal (Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 23 de julio de 2004; 118(2):229- 41). Las cepas de una gran variedad de especies de Lactobacillus, incluyendo L. reuteri se han utilizado en formulaciones probióticas. L. reuteri es uno de los habitantes naturales del tracto gastrointestinal de los animales, y se encuentra comúnmente en los intestinos de animales sanos, incluyendo los humanos. Se conoce que tiene una actividad antimicrobiana. Ver, por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238, y 5,849,289. Cuando las células de L. reuteri se desarrollan bajo condiciones anaerobias en presencia de glicerol, producen la sustancia antimicrobiana conocida como ß-hidroxi-propionaldehído (3-HPA).

Hay una relación clara y compleja entre el sistema inmunológico intestinal y la flora comensal. Se ha demostrado recientemente que la flora endógena luminal puede iniciar el proceso esencial de la respuesta del hospedador natural y adaptante inducida por la bacteria a través de la activación receptores tipo Toll (TLRs) y receptores NOD, ubicada en las células epiteliales intestinales (Haller D, Jobin C. Interaction between resident luminal bacteria and the host: can a healthy relationship turn sour? J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 38: 123-36. Rakoff-Naholm S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 2004; 118: 229-241). En los modelos animales, las citosinas pueden iniciar una respuesta de hiper-reflejo de la neuromusculatura entérica a través de las interacciones neuro- y mio-inmunes (Milla PJ. Inflammatory cells and the regulation of gut motility. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 39: S750.). En los estudios experimentales y clínicos se ha demostrado que las cepas probióticas específicas inhiben la proliferación de las células T y reducen la secreción de las citosinas Th1 y Th2 mientras que generan de manera preferencial las citosinas represivas tales como IL-10 y TGF-ß (Rautava (Rautava S, Kalliomaki M, Isolauri E. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infants. J Allergy Clin Immunol 2002; 109: 119-121). Además, en los voluntarios humanos, L. reuteri coloniza el tracto gastrointestinal humano y puede ejercer una actividad inmunomoduladora, incluyendo el reclutamiento de células T auxiliares CD4 + en el epitelio de íleon humano (Valeur N, Engel P, Carbajal N, Connolly E, Ladefoged K. Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 1176-81). La maduración de DCs es el proceso que convierte las DCs no maduras a las células que presentan el antígeno maduro que emigran a los nodos linfáticos. Este proceso da lugar a la pérdida de la capacidad potente de absorción del antígeno que caracteriza la DC no madura y en la sobre-regulación de la expresión molecular co-estimulante y de varias citosinas (Mellman I, Steinman RM: Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell 2O01, 106:255-8. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, Pulendran B, Palucka K: Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 2000, 18:767-811). Los protocolos conocidos de maduración se basan en el ambiente en el cual se cree que las DCs se encuentran o durante la exposición a los antígenos. El mejor ejemplo de este método es el uso de un medio acondicionado al monocito (MCM, por sus siglas en inglés). El MCM es generado ¡n vitro cultivando los monocitos y después usando el fluido supernadante de cultivo como una fuente de factores de maduración. Los componentes principales en el MCM responsable de la maduración son las citosinas pro-inflamatorias interleucina-1 beta (IL-?ß), IL-6 y TNF-a (Reddy A, Sapp M, Feldman M, Subklewe M, Bhardwaj N: A monocyte conditioned médium is more effective than defined cytokines in mediating the terminal maturation of human dendritic cells. Blood 1997, 90:3640-6.). Las DCs maduras producen una variedad de citosinas, que estimulan y dirigen la respuesta de la célula de T. Dos de estas citosinas son IL-10 e IL-12. Estas citosinas tienen efectos opuestos en la dirección de la respuesta inducida de la célula de T: IL-12 induce un tipo respuesta de Th1 mientras que IL-10 inhibe tal respuesta. Por lo tanto, el estado de activación de APCs (células que presentan el antígeno), incluyendo las DCs, determina el tipo y magnitud de la respuesta de la célula T CD4+. Las APCs restantes (incluyendo las células epiteliales en el timo) pueden promover el desarrollo de las células CD4+CD25+TR. Durante la infección por los patógeno, el reconocimiento de moléculas microbianas por TLRs da lugar a la activación de las APCs. Las APCs entonces producen IL-6 y los factores solubles adicionales que juntos eliminan los efectos represivos de las células TR, permitiendo la generación eficiente de las células TE (células T efectoras) contra el patógeno. El equilibrio dinámico entre el las APCs inactivas y activadas también será influenciado por las acciones de las células TR y TE (figura 1). Pessi y col. (2000) describe la generación de IL-10 en los niños atópicos después de la administración oral de Lactobacillus rhamnosus GG. Pero al contrario la presente invención el estudio no describe específicamente las cepas con la capacidad de producir altas cantidades de IL-10, seleccionadas por su eficacia contra los trastornos y cólico (Pessi T, Sutás Y, Hurme , Isolauri E. lnterleukin-10 generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus. GG. Clin Exp Allergy. 2000 Dec; 30(12): 1804-8). Un estudio de Hermelijn y col. (2005) muestra L. reuteri y Lactobacillus casei, pero no el Lactobacillus plantarum, que caba las DCs derivadas del monocito para conducir el desarrollo de las células TR. Estas células TR producidas aumentaron los niveles de IL-10. Contrario a la presente invención, los autores no relacionan la elevación de IL-10 con la movilidad intestinal o cólico. Incluso cuando está en las cepas, los autores mencionan dos diferentes especies bacterianas que son eficientes en el aumento de los niveles IL-10. Esto es contrario a la presente invención, donde se muestra que se determinara el probiótico será más efectivo reduciendo el cólico y seleccionara en el nivel de la cepa mientras que las diferentes cepas de la misma especie tienen una diferente capacidad de ser eficaces en el aumento de los niveles de IL-10. Actualmente no existe una cura para el cólico. El paradigma de tratamiento actual para el cólico consiste en métodos farmacológicos y/o no farmacológicos, proporcionando en el mejor de los casos la reducción marginal de los síntomas. Las intervenciones terapéuticas comunes para el cólico ofrecidas a los padres se ubican dentro de cuatro categorías, incluyendo, la dietética, física, de comportamiento y farmacológica. Las manipulaciones dietéticas incluyen el consejo profesional sobre varias técnicas de alimentación, o el uso de la leche hipoalérgica, soya o fórmulas sin lactosa, y una introducción temprana a los sólidos (Lothe, L., y col. cow's milk formula as a cause of infantile colic: a double-blind study. Pediatrics 1982; 70:7-10; Forsyth B W C. Colic and the effect of changing formulas: a double- blind multiple-crossover study. J Pediatr 1989; 115,521- 6; Treem, W R, et al. Evaluation of the effect of a fiber- enriched formula on infant colic. J Pediatr 1991 ; 119695-701). Sin embargo, tampoco el uso de las fórmulas de soya, o cambios en las técnicas de alimentación operan eficazmente para cada caso de cólico. Una revisión de los datos que estudiaron estas recomendaciones mostró que el uso de fórmulas hipoalérgicas, tales como a base de aminoácido o parcialmente hidrolizadas, puede beneficiar solamente a aproximadamente el 25% de los niños (Lucassen, P L B J, y col. Infantile colic: crying time reduction with a whey hydrolysate: a double-blind, randomized placebo-controlled trial. Pediatrics 2000; 106: 1349-54; Estep, D C, y col. Treatment of infant colic with amino acid-based infant formula: a preliminary study. Acta Paediatr 2000;89:22-7). Las estrategias físicas para el control del cólico incluyen el movimiento físico de las posiciones corporales para aliviar la producción de gas/reflujo, moviendo, cambiando el pañal, aplicando presión abdominal, o dando masajes al bebé. Otros métodos incluyen crear un sentido de distracción para minimizar el conocimiento infantil del cólico tal como hablándole al niño durante el transporte en automóvil, el uso de un simulador de paseo de automóvil, vibrador de cuna, o móviles infantiles (Lipton E L. Swaddling and child care practice: historical, cultural and experimental observations. Pediatrics 1965;35:521-67; Byrne J M, Horowitz F D. Rocking as a soothing intervention: the influence of direction and type of movement. Infant Behav Dev 1981;4:207-18).

Otro método es reproducir grabaciones de sonidos que supuestamente calmen al bebé. Sin embargo, existe evidencia en la literatura médica que estos métodos no son útiles (Parkin P C, Schwartz C J, Manuel B A. Randomized controlled trial of three interventions in the management of persistent crying of infancy. Pediatrics 1993;92(2): 197-201). Estas estrategias, en el mejor de los casos, son solamente eficaces marginalmente en la disminución de los síntomas del cólico. Las recomendaciones para las intervenciones del comportamiento para el tratamiento del cólico son las terapias más inconsistentes disponibles. Algunos autores abogan por el aumento del estímulo sensorial, mientras que otros abogan por la disminución de tal estímulo (Balón A J. Management of infantile colic. Amer Pham Physician 1997; 55:235-242; Lucassen P L B J, Assendelft W J J, Gubbels J W, van Eijk T M, van Geldrop W J, Effectiveness of treatments for infantile colic: systematic review. BMJ 1998;316(5): 1563-9; and Carey W B, "Colic"-primary excessive crying as an infant-environmental interaction. Pediatr Clin North Am 1984;31:993-1005). Otras recomendaciones incluyen la respuesta temprana al llanto, o permitir que el niño llore, ofreciendo un chupón, la implementación de un horario de alimentación rutinario, usar el contacto visual y el juego interactivo. La intervención farmacológica para el tratamiento del cólico ha llevado al uso de medicaciones prescritas y no prescritas. Las medicaciones de prescripción utilizadas actualmente incluyen alcaloides y opiáceos de belladona (paregóricos), que pueden proporcionar alivio, pero están cargadas con riesgos incluyendo síntomas piramidales adicionales, disminución respiratoria, y estreñimiento. Por ejemplo, los fármacos anticolinérgicos, similares en su efecto a la atropina, por ejemplo, hiosciamina (LEVISINE®, o GASTROSED®) y diciclomina dilatan las pupilas, aumentan el ritmo cardíaco, disminuyen la producción de saliva, alivian los espasmos de los tractos gastrointestinales y urinarios, así como de los bronquios. Aunque los fármacos anticolinérgicos las únicas medicaciones de prescripción en el mercado de los Estados Unidos de Norteamérica que han mostrado constantemente tratar con eficacia el cólico infantil, desafortunadamente, hasta el 5% de los niños tratados pueden desarrollar efectos secundarios, incluyendo dificultades respiratorias, apnea, espasmos, síncope, asfixia, coma e hipotonía muscular (Williams J, Watkin-Jones R. Dicyclomine: worrying symptoms associated with its use in some small babies (BMJ 1984;288:901 ; Myers J H, Moro-Sutherland D, Shook J E. Anticholinergic poisoning in colicky infants treated with hyoscyamine sulfate. Am J Emerg Med 1997;15:532-5). Además, varios casos de muerte se han reportado en niños que tomaron diciclomina (Garriott J C, Rodríguez R, Norton L E. Two cases of death involving dicyclomine in infants. Clinical Toxicol 1984;22(5) :455-462). Las medicaciones sin prescripción que se han reportado como un tratamiento eficaz para el cólico infantil incluyen varios fármacos sedantes o inductores del sueño, incluyendo difenhidramina suprafisiológíca (alta dosis) (BENADRYL®), fenobarbital, hidrato doral, e incluso alcohol. Sin embargo, existe un potencial de efectos secundarios serios asociados a varios de estos agentes en niños con enfermedad respiratoria, limitando por lo tanto su uso extenso en el tratamiento del cólico (Balón A J. Management of infantile colic. Amer Pham Physicían 1997;55:235- 242; Gurry D. Infantile colic. Australian Pham Phys 1994;23(3):337-34632). Una medicación sin prescripción más segura para el tratamiento del cólico ha incluido en gran parte la administración de simeticona o dimetilpolisiloxaneo, un fármaco no absorbible libre, que reduce el tamaño de las burbujas de gas intestinal. La simeticona tiene un perfil muy seguro y frecuentemente se recomienda, a pesar de varios estudios que demuestran que la eficacia de la simeticona en el cólico infantil no es mejor que el placebo (Metcalf, T J, y col., Pediatrics julio 1994; 94(1) :29-34. Sferra, T J, y col., Pediatr Clin North Am abril 1996; 43(2):489-510. Danielson, B. y col., Acta Paediatr Scand mayo 1985; 74(3):446-50. Colon, A R, y col., Am Fam Physician diciembre 1989; 40(6): 122-4.). Por consiguiente, el tratamiento más común para el cólico actualmente es esperar simplemente que el bebé crezca hasta superar esta condición. Por lo tanto, actualmente hay una necesidad de compuestos y composiciones seguras y efectivas y de técnicas que prueben ser útiles para tratar el cólico en niños e infantes. Las composiciones y métodos de la presente invención, responden a esta necesidad, proporcionando el producto que puede tratar con seguridad y de manera efectiva los síntomas asociados al cólico en niños. La Solicitud de Patente EP1364483A10 describe los probióticos para el tratamiento de anormalidades neuromusculares del intestino, tales como cólico en bebés. Como un probiótico los Solicitantes mencionan varias y diferentes especies bacterianas. Esto es contrario a la presente invención donde el probiótico que es más efectivo reduciendo el cólico de es una cepa de bacterias de ácido láctico específicas seleccionadas por ser efectivas en el aumento de los niveles de IL-10 y no una especie bacteriana completa, puesto que los inventores de la presente invención han mostrado que existen diferencias sustanciales en la producción del estímulo de IL-10 también entre las cepas de la misma especie. En 2005 Savino demostró que la complementación con L. reuteri ATCC 55730 mejoró significativamente los del cólico en niños amamantados en comparación a la terapia estándar con simeticona en un periodo de 7 días de tratamiento. El índice de respuesta al tratamiento con L. reuteri fue del 95% mientras que solamente el 7% de los niños respondieron a la simeticona. Él presentó resultados en la European Society for Pediatric Research, reunida el 31 de agosto de 2005-3 de septiembre de 2005, Siena, Italia (Pediatr Res. 2005; 58 (2): 411). Aunque los resultados de Savino mostraron efectos beneficiosos, él no fue consciente de la relación entre ciertas cepas que promovieron la producción de IL-10 y la reducción de la movilidad intestinal y por lo tanto el cólico. La presente invención proporciona un método para seleccionar tales cepas mejores. Collins describió que las alteraciones de la función motriz producen una variedad de síntomas que pueden presentarse en el contexto de la inflamación o activación inmunológica en varias regiones del intestino y comprenden las entidades comunes tales como esofagitis, gastritis, y enfermedad intestinal inflamatoria idiopática (IBD, por sus siglas en inglés). Estas observaciones sugieren que la movilidad del intestino también se somete a la influencia del sistema inmunológico. En este contexto, el sistema motriz puede desempeñar una función importante en la defensa del intestino contra los estímulos nocivos presentes en el lumen (is context, the motor system may play an ¡mportant role in defending the gut against noxious stimuli present in the lumen (Collins S., The Immunomodulation of Enteric Neuromuscular Function: Implications for Motility and Inflammatory Disorders. Gastroentrology 1996; 111 :1683-1699). Esta noción es reflejada, por ejemplo, por la observación de Vantrappen y col., que mostró que el crecimiento excesivo bacteriano en el intestino delgado es acompañado por la interrupción del patrón cíclico normal de movilidad interdigestiva en el intestino delgado Vantrappen G, Jannssens J, Hellemans J, Ghoos Y. The interdigestive motor complex of normal subjects and patients with bacterial overgrowth of the small intestine. J Clin Invest 1977; 9:1158-1168). Ha sido bien conocido durante muchos años que los niveles elevados de IL-10 suprimen los sistemas inmunológicos sobre-activados. También se ha demostrado previamente que la movilidad del intestino es controlada por las señales neurológicas, que se relacionan al sistema inmunológico intestinal, y que el cólico es una consecuencia de la movilidad intestinal aumentada, por ejemplo, debido al crecimiento bacteriano excesivo. En países industrializados, las medidas higiénicas comienzan desde el proceso de natalidad, que interrumpe la capacidad de los recién nacidos de absorción de la microflora intestinal de la madre. Por consiguiente, una microflora diferente se establece en el niño. En lugar de alojar por ejemplo la Escherichia Coli y lactobacilos colonizan los recién nacidos frecuentemente están colonizados con Staphylococcus aureus y otras bacterias de la piel. Los inventores de la presente invención han hecho el hallazgo inesperado que mientras el crecimiento excesivo de las bacterias de la piel sobre-activa el sistema inmunológico del bebé, conduce a la movilidad sobre-activada del intestino y por consiguiente al cólico, un número superior de bacterias específicas del intestino, tales como L. reuteri DSM 17938, con la capacidad de promover la producción de IL-10, lleva a la maduración de la proliferación del sistema de TR es decir de las células CD4+CD25+TR. La sobre-regulación de las células CD4 + CD25+ lleva a la poca movilidad del intestino y por lo tanto a los efectos beneficiosos sobre bebés con cólico. A causa de estos hallazgos, las cepas bacterianas no patógenas fueron seleccionadas para las propiedades aumentadas de IL-10, y asombrosamente, se encontró que esta propiedad de las cepas se correlaciona a la disminución del cólico infantil. Por lo tanto la invención se refiere al uso de L. reuteri DSM 17938 para la fabricación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento del cólico, y otras cepas seleccionadas de la misma manera. Es otro objeto de la invención proporcionar los productos que contienen las cepas y para la administración a los animales, incluyendo los humanos. Otros objetos y ventajas serán mucho más evidentes a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones anexas. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona ciertas cepas de bacterias de ácido láctico seleccionadas por su capacidad de promover la producción de IL-10 y por lo tanto la proliferación de las células TR CD4 + CD25+, para la profilaxis y/o tratamiento del cólico, un método para seleccionar tales cepas, y los productos que contienen tales cepas. Otros objetos y características de la invención serán mucho más evidentes a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones anexas. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 propone la función de ciertas cepas seleccionadas de bacterias de ácido láctico en la promoción del desarrollo de células TR CD4+CD25 + . La figura 2a muestra la producción de IL-10 por las células DC en forma de gráfica de barras; La figura 2b muestra la producción de IL-10 por las células DC en una tabla. Descripción Detallada de la Invención La colonización de las bacterias de la piel en el intestino y la deficiencia de las células TR de sobre-activar el sistema inmunológico del bebé recién nacido, conduce a la movilidad sobre-activada del intestino y por lo tanto al cólico. Un número más grande de células específicas de bacterias del intestino, tales como L. reuteri DSM 17938, con la capacidad de promover la producción de IL-10, lleva a la maduración de la proliferación del sistema de TR es decir de las células TR CD4 + CD25+. Otras cepas de lactobacilos han sido reportadas previamente por muchos investigadores para inducir la producción de IL-10 por ejemplo Rautava y col. (arriba). La sobre-regulación de las células CD4 + CD25+ lleva a la poca movilidad del intestino y por lo tanto a los efectos beneficiosos sobre el cólico. Asombrosamente se encontró que las cepas que producen aproximadamente un aumento en los niveles de citosina IL-10, fueron las mismas cepas que pueden disminuir el periodo promedio de llanto (ejemplo 2). La presente invención comprende las cepas de bacterias de ácido láctico que se han seleccionado por su capacidad de reducir el cólico, incluyendo L. reuteri DSM 17938. Los productos tales como alimentos, aditivos alimenticios y formulaciones, dispositivos farmacéuticos o médicos que contienen las células enteras o componentes derivados de estas cepas, pueden ser formulados como se conoce en la técnica, e incluir generalmente un soporte ingerible según lo conocido más la cepa de Lactobacillus, o su componente derivado. Ün estudio in vitro se puede utilizar como método para seleccionar las cepas de Lactobacillus por su capacidad de estimular la producción de IL-10, es decir DCs derivadas de del monocito y de tal modo su capacidad de inducir el desarrollo de las células TR CD4 + CD25+ (ejemplo 1).

Los datos describen una indicación de un estímulo potente de IL-10 por las cepas específicas L. reuteri ATCC 55730 y L. reuteri DSM 17938, y que esta regulación es mediada por una sustancia liberada en el medio de crecimiento por estas dos cepas específicas durante el último registro/fase de crecimiento inmóvil. Por el contrario, las otras dos cepas de L. reuteri no pudieron estimular la producción relevante de IL-10. Para confirmar la importancia clínica de las cepas seleccionadas para prevenir o tratar el cólico, se realizaron estudios adicionales en niños amamantados con un diagnóstico de cólico infantil.

Las características de la presente invención serán entendidas más claramente con referencia a los siguientes ejemplos, que no se deben interpretados como limitación de la invención.

Ejemplo 1 Estudio de la capacidad probiótica de las cepas para promover la expresión de IL-10 por DC derivada del monocito Las DCs no maduras se generan a partir de los monocitos de sangre periférica (Hilkens, C. M. U., P. Kalinski, M. de Boer, and Kapsenberg. 1997. Human dendritic cells require exogenous interleukin-12-inducing factors to direct the development of naive T- helper cells toward the Thl phenotype. Blood 90: 1920) cultivado en IMDM (Life Technologies, Paisley, U.K.) que contiene containing 10% FCS HyClone, Logan, UT), GM-CSF humano recombinante (rh) (500 U/ml; Schering-Arado, Uden, Países Bajos), y rhlL-4 (250 U/ml; Pharma Biotechnologie Hannover, Hannover, Alemania) (Kalinski, P., J. H. N. Schuitemaker, C. M. U. Hilkens, E. A. Wierenga, and M. L. Kapsenberg. 1999. Final maturation of dendritic cells is associated with impaired responsiveness to IFN-? and to bacterial IL- 12 inducers: decreased ability of mature dendritic cells to produce IL- 12 during the interaction with Th cells. J. Immunol. 162:3231). Las cepas que se probarán en este ejemplo son Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacillus reuteri ATCC PTA 4660 y Lactobacillus reuteri ATCC, PTA 4964 obtenible de ATCC ((Manassas, VA, USA y DSMZ, Braunschweig, Alemania). Las cepas se cultivan en Colombia agar (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) que contiene 6.25% sangre de oveja. Los lactobacilos se incuban a 37°C en una atmósfera de 5% C02. Después de 3 días, el número de bacterias es determinado midiendo la densidad óptica en 620 nm (OD620). Comúnmente, un OD620 de 0.35 corresponde a 1 x 108 unidades de formación de colonias (cfu) para todas las cepas de prueba. El día 6, la maduración de las DCs no maduras es inducida por LPS (E coli; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y los lactobacilos de prueba en presencia de la combinación de las citosinas I L- 1 ß (25 ng/ml) y TNF-a (50 ng/ml), juntos todos se usan como factores de maduración (citosinas adquiridas de Peprotech, Rocky Hill, NJ).

La producción de citosina IL-12, IL-10, e IL-6 por DCs maduras es determinada por medio de un estímulo de 24 horas con células de plasmacitoma de ratón de expresión de ligando CD40 (J558), según lo descrito por Vieira PL, y col. (Vieira PL, de Jong EC, Wierenga EA, Kapsenberg ML, Kalinski P. Development of Thl -inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J Immunol 2000;164:4507-12). Los supernadantes se cosechan después de 24 h, y las concentraciones de IL-10 son medidas por ELISA. Para los resultados ver la tabla 2. Como se puede observar a partir de los resultados, hay una diferencia substancial en la influencia por diferentes cepas de lactobacilos en su capacidad de promover la producción de IL-10 por DCs.

Ejemplo 2 Cepas probióticas seleccionadas contra simeticona en el tratamiento del cólico infantil Los niños amamantados con una diagnóstico de cólico infantil se reclutan en el Department of Pediatric and Adolescence Science (Drottning Silvias University Hospital, Güteborg). Los pacientes con 21-90 días de edad, adecuados para la edad gestacional con un peso de nacimiento entre 2500 y 4000 g, con síntomas cólico cumplen el criterio de Wessel, y casi presentan 6 ± 1 días antes de la inscripción, para el reclutamiento en el estudio (Wessel MA, Cobb JC, Jackson EB, Harris GS, Detwiler AC. Paroxismal fussing in infancy, sometimes called "colic". Pediatrics 1954; 14: 421-35). Todos los niños reclutados son exclusivamente amamantados para reducir la variabilidad en la microflora intestinal debido a las variaciones en la dieta, que puede a su vez haber influenciado la respuesta al probiótico. Los niños son excluidos si tienen evidencia clínica de enfermedad crónica o de trastornos gastrointestinales o si habían recibido los antibióticos o probióticos una semana antes del reclutamiento. En este estudio, seleccionan de manera aleatoria los niños con cólico para recibir el probiótico o simeticona en los siguientes tratamientos: (P1) cepa ATCC 55730 de Lactobacillus reuteri también llamada SD2112, (P2) cepa DSM 17938 de Lactobacillus reuteri (depositada en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg Ib, D- 38124 Braunschweig) el 6 de febrero de 2006, bajo el tratado de Budapest (P3) cepa ATCC PTA 4660 Lactobacillus reuteri y (S) simeticona L. reuteri se administra en una dosis de 10a unidades de formación de colonias (cfu) en 5 gotas de una suspensión de aceite MCT comercialmente disponible (aceite de triglicérido de cadena medio) 30 minutos después de la alimentación, una vez al día durante 28 días. Las mayoría de los aceites de MCT son naturales, y la fuente más abundante es aceite de coco. La mayoría de los aceites de MCT se refina del aceite de coco. El aceite de MCT es un líquido de color claro sin sabor y de viscosidad baja. Esta suspensión de aceite es estable durante 21 meses a 2-8°C (según lo documentado por el fabricante, BioGaia AB, Estocolmo, Suecia) (la fuente alternativa de aceite de MCT es Akomed R, por Karlshamns AB, Karlshamn, Suecia). Durante el estudio, se dan instrucciones a los padres de mantener el producto en el refrigerador cuando no se usan. La simeticona (S) fue administrada en una dosis de 60 mg/día en 3 mi de una solución comercialmente disponible (Mylicon Infants Gas Relief Drops, J&J, 7050 Camp Hill Rd., Fort Washington, Pennsylvania, 19034-2210, USA) después de la alimentación, dos veces al día durante 28 días. En el reclutamiento, se les pidió a todas las madres seguir una dieta libre de leche de vacas según lo reportado: evitación de leche, yogur, queso fresco y fuerte, crema, mantequilla, galletas. La adherencia a la dieta se monitorea con un diario de dieta mantenida durante todo el período de tratamiento. El día 7, 14, 21 y 28 uno de los investigadores examinó la adaptación a esta dieta. El Ethical Committee at the Institution aprobó el protocolo de estudio y los niños fueron reclutados en el estudio solamente después de que el consentimiento informado por escrito fue obtenido de los padres. Visitas de seguimiento El día en el cual el pediatra vio al niño se define por primera vez como día -1. En esta ocasión cada niño experimentó un examen médico y los padres fueron entrevistados para obtener los datos antecedentes referentes al tipo de suministro, peso de nacimiento y edad gestacional, los antecedentes familiares de enfermedad gastrointestinal y atopía. Particularmente, el último se considera positivo si los niños tuvieron uno o más miembros de la familia (madre, padre y/o hermano mayor) con eczema atópica, rinitis alérgica o asma. Por otra parte, cualquier muestra y síntoma de la enfermedad atópica durante el período del estudio fue registrado. Se invitó a los padres a que también se registraran los datos referentes al periodo de llanto promedio diario y al número diario de episodios de cólico al día después del reclutamiento (día 0). El doctor asignó de manera aleatoria al niño a cualquiera de los grupos de estudio. La administración de los productos de estudio comenzó el día 1. Los padres dan la información escrita con respecto al estudio y registran el número diario de episodios de llanto inconsolables y su duración, la consistencia y frecuencia base así como cualesquiera efecto secundario observado (estreñimiento, vomito, reacción cutánea, etc.) a partir del día 0 hasta el día 28, usando un diario estructurado. Para asegurar que todos los padres observaran el periodo de llanto de una manera uniforme y para asegurar que a los niños se les administre la medicación correctamente, uno de los investigadores está siempre disponibles por el teléfono para auxiliar a los padres. Cada paciente es examinado nuevamente por el mismo pediatra los días 1, 7, 14, 21 y 28. Resultados De los 120 niños con cólico amamantados reclutados, 30 se asignan de manera aleatoria al tratamiento con L. reuterl ATCC 55730 (P1), 30 se asignan de manera aleatoria al tratamiento con L. reuteri DSM 17938 (P2), 30 se asignan de manera aleatoria al tratamiento con L. reuteri ATCC PTA 4660 (P3) y 30 a simeticona (S). No se retiró a ningún bebé debido a ningún efecto secundario relacionado al ensayo. Los grupos son similares con respecto a edad, peso de nacimiento, género, tipo de suministro, antecedentes familiares de atopía o enfermedades gastrointestinales, y a la exposición de humo de tabaco. El periodo de llanto promedio por día es similar en los grupos de tratamiento el día 0, y el día 1. Los niños que recibieron L. reuteri ATCC 55730 (P1) y DSM 17938 (P2) mostraron una reducción significativa en el periodo de llanto diario el día 7 comparado a los niños tratados con ATCC PTA 4660 y simeticona. El día 14, el periodo de llanto 21 y 28 es significativamente diferente entre los cuatro grupos de tratamiento. La diferencia entre (P1) y (S) en el periodo de llanto promedio por día del principio al final del estudio es de 82 minutos, y la diferencia entre (P2) y (S) en el periodo de llanto promedio al día del principio al final del estudio es de 83 minutos el día 28 (tabla 1). Como se puede observar a partir de los resultados los cuatro grupos de tratamiento son suficientemente uniformes antes la administración de los productos de prueba. Ya después de 7 días hay una diferencia clara a favor de las cepas ATCC 55730 y DSM 17938 de L. reuteri sobre las dos otras alternativas. Después de 28 días la diferencia ha aumente aún más. Tabla 1. Periodo de llanto (minutos promedio al día) en los grupos de L. reuteri y simeticona. Niños con L. reuteri L. reuteri L. reuteri Simeticona cólico ATCC DMS ATCC PTA N=30 55730 17938 4660 N=30 N = 30 N = 30 Día 0 206 203 204 205 Niños con L. reuteri L. reuteri L. reuteri Simeticona cólico ATCC DMS ATCC PTA N=30 55730 17938 4660 N = 30 N = 30 N = 30 Día 1 191 190 198 194 Día 7 147 148 171 172 Día 14 98 100 156 155 Día 21 75 77 150 148 Día 28 58 59 145 141 Aunque la invención se ha descrito con referencia a las modalidades específicas, será apreciado que numerosas variaciones, modificaciones, y modalidades sean posibles, y por consiguiente, todas tales variaciones, modificaciones, y modalidades se deben considerar dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un cultivo biológicamente puro de Lactobacillus reuteri DSM 17938.

2. Una composición que comprende un cultivo biológicamente puro de Lactobacillus reuteri DSM 17938.

3. Un método para reducir el cólico infantil, que comprende seleccionar una cepa bacteriana de ácido láctico que promueva la expresión de IL-10 en humanos, y administrar la cepa bacteriana a los niños diagnosticados con cólico infantil.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la cepa bacteriana de ácido láctico es una cepa de Lactobacillus reuteri.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la cepa bacteriana de ácido láctico es Lactobacillus reuteri DSM 17938.

6. Un producto para reducir el cólico infantil, que comprende una cepa de bacterias de ácido láctico seleccionadas por la capacidad de aumentar los niveles de IL-10.

7. El producto de la reivindicación 6, en donde la cepa bacteriana de ácido láctico es una cepa de Lactobacillus reuteri.

8. El producto de la reivindicación 7, en donde la cepa bacteriana de ácido láctico es Lactobacillus reuteri DSM 17938.

9. El producto de la reivindicación 7, que adicionalmente comprende un aceite de triglicérido de cadena media.