MX2008001439A - Bionconjugados antitumorales deácido hialurónico o sus derivados obtenidos por conjugación química indirecta - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un nuevo grupo de bioconjugados los cuales pueden obtenerse por medio de síntesis indirecta, por mediode un separador molecular, entreácido hialurónico y/o sus derivados y fármacos con una actividad antitumoral perteneciente a diferentes grupos, su proceso de preparación y uso en el campo oncológico. Los nuevos derivados, en relación al tipo de enlace y grado de Sustitución, tienen diferentes propiedades físico-químicas que mejoran su tolerancia y eficiencia y permiten una modulación más exacta de la dosificación, explotando un mecanismo de objetivo activo.

Description

BIOCONJUGADOS ANTITUMORALES DE ACIDO HIALURONICO O SUS DERIVADOS OBTENIDOS POR CONJUGACIÓN QUÍMICA INDIRECTA El desarrollo de un tumor, su crecimiento y progresión. hacia metástasis primaria y secundaria son procesos biológicos altamente complejos que requieren una organización secuencial de eventos celulares (órgano-selectivos) coordinados entre sí. La diseminación de células tumorales que conduce a la formación de una metástasis ocurre como un resultado de su separación del sitio de crecimiento primario seguido por su penetración en el lecho circulatorio y/o en el sistema linfático. En los últimos años, el conocimiento progresivo de procesos vitales que causan el inicio, desarrollo, diseminación e implantación de un tumor y su metástasis no solamente ha ofrecido a los investigadores la posibilidad de estudiar, sintetizar y/o experimentar nuevas moléculas químicas como nuevos agentes antitumorales sino que también ha facilitado el estudio y perfeccionamiento de nuevas terapias de tratamiento que superan los problemas relacionados con la toxicidad de fármacos antineoplásticos y, arriba de todo, un entendimiento de los mecanismos químico-biológicos que causan resistencia al fármaco anterior . Uno de los problemas principales relacionados con el tratamiento de tumores, de hecho, se refiere a la posible "resistencia" del tumor a tratamiento farmacológico después de una respuesta positiva inicial. Estas "resistencias" se asocian con variaciones biológicas /bioquímicas en el funcionamiento de la célula tumoral tales como, por ejemplo: • alteraciones en la transportación celular del fármaco; • cambios de afinidad con respecto a esto en la parte de un inhibidor metabólico posible; • incremento substancial en la capacidad de la célula por si misma para activar el fármaco. Las experimentaciones científicas recientemente publicadas (Misra et a l . , The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 (28 ): 25285-25288 ) han demostrado como el pre/co-tratamiento i n vi tro de células tumorales resistentes a algunos fármacos de quimioterapia con oligómeros de ácido hialurónico teniendo un peso molecular muy bajo, re-estableció la sensibilidad inicial de la célula al fármaco. Los datos experimentales hasta ahora obtenidos, sin embargo, no han aclarado completamente el cómo/por qué la sensibilidad a quimioterapia se re-establece, aún si se ha observado que estos oligómeros son capaces de interferir con varios eventos moleculares dentro de la célula responsable de la adquisición de resistencia al fármaco y por lo tanto del crecimiento y difusión del tumor. La acción farmacológica del oligómero anterior se vuelve posible debido a que, a medida que se une él mismo al receptor CD-44 (específicamente de ácido hialurónico), maneja el interferir negati amente con el enlace HA nativo-receptor, una interacción que es responsable de la coordinación de numerosas funciones celulares y, arriba de todo, de la célula tumoral.

A través de este enlace (e internalización subsiguiente) con su receptor presente en la membrana celular, HA de hecho participa en la activación de muchos eventos que son de importancia fundamental para la vida celular tales como, por ejemplo, la regulación de los procesos de adhesión/crecimiento y migración celular, entra al mecanismo quimiotáctico durante procesos inflamatorios, juega un papel principal en procesos de cicatrización y, como se menciona arriba, en la migración de células tumorales para la formación de metástasis. Muchos tumores sólidos, de hecho, han mostrado altas cantidades de HA que pueden facilitar consecuentemente la invasión de otros tejidos y órganos en la parte de células tumorales . Las formas tumorales tales como, por ejemplo, carcinomas, melanomas, linfomas, tumores de mama, tumores colon-rectal y pulmón, sobre-expresan el receptor de transmembrana CD-44: en estas líneas celulares, las experimentaciones efectuadas con anticuerpos ant i-receptores (que consecuentemente "bloquean" el receptor previniendo su enlace a HA nativo) han mostrado la capacidad efectiva de inhibir el crecimiento y la metástasis tumoral, demostrando así como la "interferencia" del enlace HA con su receptor causa una perturbación de numerosos eventos de importancia fundamental para la vida celular y mostrando, consecuentemente, la participación real de HA en el desarrollo de la masa tumoral. Se sabe que algunos fármacos antitumorales que se han utilizado por años en el campo oncológico con resultados clínicos satisfactorios se han modificado químicamente para : » superar el problema de su toxicidad intrínseca con el objetivo de efectuar una nueva estrategia de tratamiento consistiendo en guiar el fármaco antineoplástico directamente a la célula tumoral uniéndola a HA en que, como se describe completamente arriba, muchos fenotipos tumorales sobre-expresan el receptor CD-44 específico para HA en su superficie celular (es decir un mecanismo de objetivo activo que incrementa la eficacia celular del fármaco al reducir su toxicidad sistémica). El enlace e internalización del polímero también llevan el fármaco dentro de la célula tumoral incrementando su ericacia • incrementar su solubilidad (se ha demostrado que el enlace de fármacos liposolubles con moléculas fuertemente hidrofílicas tales como, por ejemplo, HA, incrementa considerablemente la solubilidad del fármaco por sí mismo en el sistema circulatorio) . La solubilidad de fármacos de quimioterapia en el lecho circulatorio, de hecho, representa la condición esencial de su eficacia farmacológica, algunos fármacos, sin embargo, que han probado ser extremadamente activos en varios tipos de tumores tales como, por ejemplo, captotecinas y sus derivados de irinotecan y topotecan, paclitaxel y alcaloides, derivados Vinca, como un resultado de su alta insolubilidad tienen problemas relacionados con la administración intravenosa (y, para hormonas y anti-hormonas también intramusculares) que pueden limitar y restringir su aplicación clínica. Por las razones citadas arriba (solubilidad y toxicidad) nuevos fármacos de quimioterapia se han sintetizado, que se crean del enlace químico (directo o indirecto por medio de un separador consistiendo de aminoácidos o péptidos con una cadena de aminoácidos carta) o simple asociación de algunos fármacos antineoplásticos conteniendo un anillo lactónico (tal como, por ejemplo, doxorubicinaa, paclitaxel, vincristina, vinblastina y derivados de camptotecinas ) con ácido hialurónico (HA) (patente de E.U. 6, 291, 671) . Otros conjugados comprenden fármacos antineoplásticos tales como paclitaxel y camptotecinas enlazadas a un polímero consistiendo de ácido poliglutámico posiblemente asociado con HA (patente de E.U. 5, 977 , 163) . Otros nuevos tipos de fármacos de quimioterapia también se conocen, representados por doxorubicinaa antitumoral enlazada covalentemente tanto a HA (modificado químicamente con dihidrazida) como a un vehículo tal como el polímero de hidroxi-propil-metacrilamida (solicitud de patente internacional WO 02/090390) . Nuevos fármacos de vehículo también se conocen, consistiendo de polisacáridos químicamente conjugados con cadenas de aminoácido a su vez enlazadas covalentemente a fármacos antineoplásticos tal como doxorubicinaa (patente de E.U. 5,688,931). Además, por la misma razón, otros sistemas de liberación se han perfeccionado, consistiendo, por ejemplo, en la encapsulación de doxorubicinaa en liposomas conteniendo derivados lipidíeos de HA (Peer D. et a l . , Neoplasia, 2004, 6 ( 4 ): 343-353; Eliaz R.E. et a l . , Cáncer Research, 2001, 61:2592-2601) . Se sabe, por ejemplo, que para superar los problemas de derivados de camptotecinas, para alternar su perfil farmacocinético y reducir, su toxicidad incrementando su eficacia terapéutica, irinotecan se ha conjugado con el polímero/vehículo de carboxi-metil-dext ran por medio de un separador representado por un péptido de triglicina (Satoshi Okuno et a l . , Cáncer Research, 2000, 60:2988-2995; patente de E.U. 5, 892, 043) . El profármaco resultante ha probado ser activo en su eficacia terapéutica ya que permanece en circulación por un periodo de tiempo prolongado incrementando su acumulación en la masa tumoral, reduciendo de manera contemporánea su toxicidad sistémica; para muchos de los conjugados previamente descritos, sin embargo, los datos experimentales definitivos aún no están disponibles, los cuales documentan su eficacia con respecto al fármaco no conjugado. El derivado de paclitaxel también se conoce, enlazado covalentemente a HA previamente derivado con hidrazida (patente de E . U .5 , 874 , 17 ) , o enlazado directamente a HA, o indirectamente por medio de un separador de una naturaleza variable capaz de formar diferentes tipos de enlaces químicos que incrementan la solubilidad y consecuentemente la eficacia del fármaco (solicitud de patente EP 1560854) . La presente invención describe y reivindica nuevos conjugados de HA obtenidos del enlace indirecto entre el polisacárido y fármacos antineoplásticos liposolubles tales como, por ejemplo, irinotecan y alcaloides Vinca, o con fármacos de quimioterapia solubles o parcialmente solubles tales como doxorubicinaa y productos análogos de pirimidina, para superar los problemas relacionados con su solubilidad (si está presente), su toxicidad y, arriba de todo, para re-establecer e incrementar la eficacia terapéutica del fármaco en células tumorales que han adquirido resistencia farmacológica al fármaco por sí mismas. El estado de la técnica representado por los derivados previamente descritos se sobrepasa consecuentemente en la presente ya que el Solicitante es capaz de demostrar la superioridad farmacológica de los nuevos conjugados, objeto de la presente invención, gracias a la capacidad citotóxica extremadamente alta de estos derivados hacia células neoplásticas. Esta nueva eficacia farmacológica permite la aplicación en farmacología clínica de terapias .quimioterapéuticas innovadoras, para el tratamiento de tumores primarios y/o secundarios que no responden más a cualquier tratamiento médico siguiendo la formación de Resistencia a Múltiples Fármacos (MDR) que generalmente pone en peligro la posibilidad de un tratamiento efectivo del paciente y consecuentemente, en el último análisis, reduce de manera drástica su expectativa de vida. Al resolver/superar MDR, los nuevos derivados, objeto de la presente invención, cambian el pronóstico final del paciente, permitiendo consecuentemente la solución/reducción de la patología tumoral.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención describe y reivindica un nuevo grupo de conjugados /derivados y su proceso de preparación, consistiendo de ácido hialurónico (HA) (y/o sus derivados) y fármacos antitumorales, indirectamente conjugados por medio de un puente molecular llamado "separador" consistiendo de una cadena alifática, aralifática, alicíclica o heterocíclica , lineal o ramificada con o sin heteroátomos . En particular, son objeto de la presente invención conjugados químico-farmacéuticos de ácido hialurónico y/o sus derivados obtenidos a través de un puente indirecto entre el polisacárido y un fármaco con una acción antitumoral, a través de un separador molecular que forma un enlace de amida o éster con el grupo carboxílico de HA y/o su derivado, con la provisión de que dicho separador no es una hidrazida o un polipéptido. El HA (y/o uno de sus derivados) y el fármaco, por lo tanto, se conjugan de manera indirecta por medio de uno o más enlaces covalentes del tipo amida o éster que incluyen parcial o totalmente los grupos carboxílicos del polisacárido y una función química (por ejemplo, un grupo hidroxilo, carboxilo, amina, etc.) perteneciente al separador, que .a su vez, se enlaza al fármaco antitumoral seleccionado, como se describe en detalle abajo. Los derivados que pueden obtenerse de acuerdo a la presente invención tienen diferentes propiedades físico-químicas que pueden modularse a través de la selección del tipo de enlace y grado de sustitución, para mejorar las características del fármaco de quimioterapia inicial, tales como: • solubilidad, • características mecánicas y reológicas , • resistencia a degradación hidrolítica, haciendo al nuevo conjugado más eficiente en su acción citotóxica, un derivado que tendrá un nuevo mecanismo de acción de esta manera superará la resistencia farmacológica al fármaco por sí mismo adquirida por la célula tumoral (como se describe arriba) . Como se sabe, muchos fármacos de quimioterapia antitumorales tienen una solubilidad limitada, si no es que no existente, en agua o soluciones salinas; esto significa que para su administración, debe recurrirse a aceites y solventes orgánicos que, aunque traen el fármaco en solución, tienen una toxicidad intrínseca con efectos secundarios que requieren intervenciones de medicación antes de la administración del producto. En algunos casos, para el fármaco de quimioterapia Irinotecan, la forma activa (SN38) se modifica aún químicamente (profármaco) para hacerlo soluble y para promover la liberación de su metabolito que está activo después de la administración intravenosa. Esto causa sin embargo una baja disponibilidad del metabolito SN38 en el sitio objetivo, requiriendo por lo tanto la adminis ración de altas dosificaciones citotóxicas con una amplificación consecuente de efectos secundarios indeseados .

La literatura internacional (Mathijssen RH et a l . , Clin Cáncer Res, 2001, 7:2182-2194) indica que la actividad anti-tumoral de SN38 es de 100 a 1000 veces más alta con respecto a su profármaco comercial; consecuentemente la posibilidad de conjugar SN38 con ácido hialurónico o uno de sus derivados de acuerdo a la presente invención, permite que los compuestos con una eficacia incrementada se obtengan y, gracias a la necesidad de disminuir las dosificaciones de administración, con menos efectos secundarios relacionados con la dispersión del fármaco en áreas no alcanzadas por neoplasia. La conjugación de fármacos de quimioterapia antitumoral con HA también permite que el principio activo sea "dirigido" hacia su objetivo, y consecuentemente hacia el tejido neoplástico. Por lo tanto, debe darse énfasis a un mecanismo de objetivo activo entre el conjugado y la célula neoplástica que incrementa la concentración local de fármaco próxima al área neoplástica y consecuentemente la eficacia. De esta manera, además, al reducir la distribución del derivado a los tejidos saludables, se garantiza una mayor tolerancia del producto con respecto al fármaco libre . Una segunda ventaja fundamental derivándose de la presente invención es la posibilidad, principalmente gracias a la presencia de HA químicamente modificado, de transformar de manera tecnológica el conjugado en un biomaterial tridimensional (a aplicarse localmente) procesado en varias formas tales como, por ejemplo, hidrogel, nano o microesferas o de fibras a su vez hiladas como productos tejidos o no tejidos; en este caso la matriz de polisacárido químicamente modificada está en contacto próximo con la masa tumoral, actúa como un sistema de liberación controlada del fármaco en el sitio de aplicación y por lo tanto favorece a una mayor eficiencia en la parte del fármaco por sí mismo. Una vez que la acción antineoplástica se ha ejercido, el derivado se degrada de manera natural y segura para el organismo, liberando completamente el principio activo antitumoral y ácido hialurónico. Los productos generados por la invención, ya sea en la forma de composiciones farmacéuticas clásicas o biomateriales degradables, por lo tanto se caracterizan por una mayor tolerancia con respecto al principio activo no modificado y una actividad farmacológica más alta, en algunos casos aún por varias ordenes de magnitud con respecto a aquella expresada por el principio activo que las forma; ambos efectos pueden atribuirse a la afinidad específica de ácido hialurónico hacia receptores tales como CD44 presente en células tumorales. Estos efectos se resaltan cuando el fármaco conjugado se administra en la forma de un material tridimensional, en contacto directo con la neoplásia. La combinación de estas características es tal que los derivados/conjugados de la presente invención sobrepasa de manera distinta lo que está disponible en el estado de la materia en la terapia local o sistémica de varias clases de neoplasia y de diferentes oríqenes, que también se han vuelto resistentes a terapia quimioterapéutica tradicional. El ácido hialurónico utilizado en la presente invención tiene un peso molecular que varía de 400 a 3,000,000 Da, preferentemente que varía de 5,000 a 1,000,000 Da, y aún más preferentemente de 30,000 a 500,000 Da, puede ser un origen extractor, fermentador o bios intéti co . El enlace covalente con el separador incluye el grupo carboxílico de ácido D-glucorónico de la unidad repetitiva del polímero, en un porcentaje que varía de 1 a 100% (grado de sustitución), que forma un enlace de éster o amida con el qrupo funcional del separador molecular seleccionado, que actúa consecuentemente como una conexión entre el ácido hialurónico y el fármaco quimioterapéu ico . El agente separador consiste de una cadena alifática, aralifática, alicíclica o heterocí lica , lineal o ramificada conteniendo o no conteniendo heteroátomos , que pueden comprender grupos hidroxilo, carboxilo, carbonilo , amina (con la exclusión de hidrazidas y polipéptidos), grupos epoxi, cloruros de ácidos , tioles , nitrilos , halógenos , anhídridos , isocianatos e_ isotiocianatos ; bromuros, yoduros y cloruros de ácidos carboxí loicos con una cadena alifática C2 a Cío se prefieren, y en particular bromuros tales como ácido bromopropiónico o ácido bromobutírico . El grado de sustitución preferentemente varía de 1 a 50% y aún más preferentemente de 1 a 20%; para conjugación con doxorubicinaa una sustitución de 3 a 15% es preferible mientras para conjugación con SN38 una sustitución de 1 a 10% se prefiere. Los derivados de HA que pueden utilizarse en los nuevos conjugados, objeto de la presente invención, se enlistan abajo: 1. HA salificado con bases orgánicas y/o inorgánicas teniendo un peso molecular de 50-730KDa (EP0138572B1) o un alto peso molecular 750-1230 KDa, (EP 535200 Bl) ; 2. Hyaff® : esteres de HA con alcoholes de las series alifáticas, aralifáticas , ciclo-alifáticas , aromáticas, cíclicas y heterocícucas , con un porcentaje de esterificación que pueden variar dependiendo del tipo y longitud de alcohol utilizado, de 1 a 75%, preferentemente de 30 a 50% (EP 216453 Bl); 3. Hyadd™ : amidas de HA con aminas de las series alifáticas, aralifáticas , ciclo-alifáticas , aromáticas, cíclicas y heterocícucas , con un porcentaje de amidación que varía de 1 a 10%, preferentemente 4% (EP 1095064 Bl); Derivados O-sulfatados de HA hasta el 4to grado de sulfatación (EP 0702699 Bl); ACP® : esteres internos de HA con un porcentaje de esterificación interna variando de 0.5 a 10% y preferentemente 5% (EP 0341745 Bl); Deacetilados de HA: derivados de la deacet ilación de la fracción de N- aceti 1 -glucos amina con un porcentaje de deacet ilación preferentemente variando de 0.1 a 30%, mientras todos los grupos carboxilo de HA pueden salificarse con bases orgánicas y/o inorgánicas (EP 1313772 Bl); Hyoxx TM , derivados percarboxilados de HA obtenidos de la oxidación del hidroxilo primario de la fracción de N-acetil-glucosamina con un grado de percarboxilación variando de 0.1 a 100%, preferentemente de 25 a 75%. Todos los grupos carboxílicos de HA pueden salificarse con bases orgánicas y/o inorgánicas (solicitud de patente EP 1339753) . Los fármacos utilizados en la reacción de conjugación con HA preferentemente pertenecen a las siguientes categorías: • nitrosureas , • antimetabolitos : tales como, por ejemplo, productos análogos de ácido fólico (entre los cuales están metotrexato), productos análogos de pirimidina (entre los cuales están fluorouracilo y 1-ß-D- Arabino-furanosilcitos ina : Ara-C ) , • alcaloides : tales como, por ejemplo, vincristina y vinblastina (alcaloides Vinca) y el metabolito activo de irinotecan, SN38, • antibióticos y productos análogos : tales como, por ejemplo, doxorubicinaa y epirubicina, • modificadores de respuesta biológica, • diterpenoides, • hormonas sintéticas y antihormonas: tales como, por ejemplo, extradiol. Doxoru icinaa y el metabolito de irinotecan, SN38 , son particularmente adecuados para los propósitos de la presente invención. Los fármacos identificados y ácido hialurónico (y/o uno de sus derivados) se enlazan indirectamente por medio de un separador a través de la formación de enlaces de éster con los siguientes procedimientos: 1. un grupo funcional del separador adecuadamente seleccionado (tales como por ejemplo, un grupo carboxilo, un grupo amina, un haluro, etc.), también conteniendo un segundo grupo (llamado "grupo saliente") capaz de reaccionar con la función carboxilo de HA (por ejemplo, un haluro: bromo, yodo o cloro) reacciona con un grupo funcional perteneciente a la molécula antitumoral representada, por ejemplo, por un hidroxilo, una amina, un carboxilo o un ercaptan.

La reacción puede requerir posiblemente la activación de una de las funciones incluidas por medio de un agente de activación (por ejemplo la activación de un grupo carboxilo por medio de carbodiimidas ) . En una segunda fase, por contacto directo con una sal de tetra-alquila onio (preferentemente tetrabutilamonio) de HA en un ambiente anhidro, el compuesto consistiendo del fármaco modificado reacciona dando origen a una sustitución nucleofílica del grupo saliente (por ejemplo bromuro) en el carboxilo del HA, causando la formación de un enlace de éster entre HA y separador ; 2. el grupo carboxilo de ácido hialurónico o uno de sus derivados se enlaza por unión nucleofílica a un separador adecuado que se enlaza subsiguientemente a una función de la molécula antitumoral (en todas las maneras conocidas por expertos en el campo) ; 3. el grupo carboxilo de HA o uno de sus derivados se activa con un agente de activación, por ejemplo una carbodiimida, y se reacciona con una función de hidroxilo del separador adecuadamente seleccionado, previa o subsiguientemente enlazado al fármaco (en todas las maneras conocidas por expertos en el campo) . Los fármacos identificados y ácido hialurónico (y/o uno de sus derivados) se enlazan indirectamente por medio de un separador a través de la formación de enlaces de amida con los siguientes procedimientos: 1. el grupo carboxilo de ácido hialurónico o uno de sus derivados se activa con un agente de activación tal como, por ejemplo, una carbodiimida, y se reacciona con una función de amina del separador adecuadamente seleccionado, previa o subsiguientemente enlazado al fármaco seleccionado (en todas las maneras conocidas por expertos en el campo) . Las aplicaciones oncológicas relacionándose con el uso de conjugados consistiendo de ácido hialurónico (y/o uno de sus derivados) y principio activo antitumoral se relacionan de manera cercana con la respuesta de la neoplasia al fármaco conjugado. De acuerdo con los usos contemplados, los bioconjugados por lo tanto pueden administrarse oralmente, intravenosamente, intra-arterialme te, intratecalmente , intra uscularmente , subcutáneamente, intraperitonealmente, intra-articularmente , tópicamente, transdérmica ente , loco-regional ente, o en una combinación de las mismas (por lo tanto se reivindica tanto un procedimiento de administración local como sistémico) . Las neoplasias incluidas en el tratamiento, por ejemplo, pueden ser (sin limites) tumores del páncreas, mama, colon-recto, pulmón y sistema respiratorio i n t o t o , cabeza-cuello, hígado, estómago, testículos, ovario, endometrio, próstata, vejiga, cerebro, leucemia, linfomas, melanoma, Sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, neuroblasto a y cáncer de piel. Algunos ejemplos de preparación de bioconjugados entre ácido hialurónico y/o sus derivados y fármacos de quimioterapia con una actividad antitumoral se proporcionan en la presente para propósitos puramente ilustrativos y no limitantes. Ejemplo 1: preparación de un derivado de éster de ácido hialurónico teniendo un MW de 200 kDa y SN-38 con un grado de sustitución de aproximadamente 15% (Figura 1) 199 mg de SN-38 se disuelven en 50 mi de Acetonitrilo y 383 mg de 1- ( 3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimmida (EDC), 258 mg de ácido 4-bromobutí rico y 40 mg de DMAP se agregan a la solución. El desarrollo de la solución se sigue por medio de Cromatografía TLC (fase estacionaria de sílice con indicador de fluorescencia y eluyente de cloroformo-acetonitrilo 60:40). El producto se recupera por medio de precipitación y se purifica por cromatografía en una columna de sílice utilizando cloroformo ¡metanol 99:1 como eluyente. El compuesto intermedio así obtenido se seca a temperatura ambiente bajo alto vacío. 0.84 g de sal de tetrabutilamonio de ácido hialurónico (HATBA) se disuelven en 43 mi de N-metil-2-pirrolidona (NMP) a temperatura ambiente. El compuesto intermedio se agrega a la solución y la mezcla completa se deja reaccionar a temperatura ambiente. Después de 7 días de reacción la solución se diluye con 5 mi de agua y 5 mi de cloruro de sodio saturado. La mezcla completa se deja bajo agitación por 1 hora para permitir el intercambio del sodio con el ion TBA. Se agrega subsiguientemente etanol gota a gota y el producto filamentoso obtenido se disuelve en agua, dializa y, al final, liofiliza. Ejemplo 2: preparación de un derivado de éster de ácido hialurónico (MW 31 kDa) y SN-38 con un grado de sustitución en el carboxilo de aproximadamente 10% 200 mg de SN-38 se disuelven en 50 mi de DMSO y 1.00 g de carbonato de etileno se agregan a la solución. La solución se calienta a 50°C y el desarrollo de la solución se sigue por medio de cromatografía TLC en placas de sílice. Al final de la reacción, el producto se recupera por medio de precipitación y seca a temperatura ambiente bajo un alto vacío. 175 mg de compuesto intermedio así obtenido se disuelven en una mezcla anhidra de DMSO/piridina 90:10 con 85 mg de cloruro de p-toluenosulfonilo . Cuando el compuesto intermedio se ha convertido en el toxilato correspondiente, se recupera por precipitación y disuelve en una solución de HATBA en NMP (0.68 g de polímero en 34 mi de NMP) . La mezcla completa se deja reaccionar por 7 días a temperatura ambiente. 4 mi de una solución saturada de NaCl se agrega a la solución y la mezcla se deja bajo agitación por 1 hora para permitir el intercambio del sodio con el ion TBA. Se agrega subsiguientemente etanol gota a gota y el producto filamentoso obtenido se disuelve en agua, dializa y, al final, liofiliza. Ejemplo 3: preparación de un derivado de éster de ácido hialurónico con un MW de 55 kDa con vinblastina con un grado de sustitución en el carboxilo de aproximadamente 10% 308 mg de vinblastina se disuelven en 30 mi de cloroformo y 120 mg de ácido 4-bromobutírico y 150 mg de EDC se agregan entonces. Después de un rato, se agrega agua a la solución para la eliminación del bromuro y carbodiimida. La solución orgánica se anhidra por medio de sulfato de sodio y el solvente se elimina en un rotovapor. 300 mg de compuesto intermedio así obtenido se agregan a 1.70 g de HATBA disuelto en un NMP anhidro y la solución se mantiene bajo agitación a temperatura ambiente por siete días. Al final, la mezcla completa se deja bajo agitación por 1 hora con 6 mi de solución saturada de NaCl para permitir el intercambio del sodio con el ion TBA. Se agrega subsiguientemente etanol gota a gota y el producto filamentoso obtenido se disuelve en agua, dializa y, al final, liofiliza. Ejemplo 4: preparación de un derivado de éster de ácido hialurónico con un MW de 440 kDa y 5-fluorouracil con un grado de sustitución en el carboxilo de aproximadamente 15% 680 mg de carbonato de etileno y aproximadamente 10 mg de NaOH se agregan a 510 mg de fluorouracil disuelto en 15 mi de DMF. La mezcla completa se calienta y la reacción se deja continuar por 1 hora a temperatura de reflujo. El producto recuperado por precipitación se disuelve en una mezcla anhidra de DMSO/piridina 50/50 con 1.00 g de cloruro de p-toluenosulfonil . Pespués de aproximadamente 15 horas, el producto se recupera por precipitación y agrega a una solución de HATBA disuelto en PMSO (3.60 g en 180 mi de PMSO) . La solución se mantiene bajo agitación a 38°C por aproximadamente 3 días y al final 20 mi de agua illiQ y 7 mi de una solución saturada de NaCl se agregan. La mezcla completa se deja bajo agitación por 1 hora para permitir el intercambio del sodio con el ion TBA. Se agrega subsiguientemente etanol gota a gota y el producto filamentoso obtenido se disuelve en agua, dializa y liofiliza . Ejemplo 5: preparación de un derivado de éster de ácido hialurónico con un MW de 200 kPa y 1-ß-P-Arabino-furanosilcitosina (Ara-C) con un grado de sustitución en el carboxilo de aproximadamente 18% 100 mg de Ara-C, 80 mg de EPC y 69 mg de ácido 4-bromo-butírico se disuelven en 10 mi de agua. La mezcla completa se reacciona por aproximadamente 1 hora y al final- el solvente se elimina por evaporación a presión reducida en un rotovapor. El producto se purifica por medio de separación cromatográfica de columna. El compuesto intermedio así obtenido se disuelve en una solución a 20 mg/ml de 1.10 g de HATBA en PMSO y se reacciona por 7 días a temperatura ambiente. 5 mi de una solución saturada de NaCl se agregan para recuperar el producto, permitiendo así la salificación con sodio de los carboxilos de ácido hialurónico. El polímero se precipita al agregar etanol gota a gota, y después de filtrarlo y redisolverlo en agua, se dializa para eliminar los residuos de solvente y sal y finalmente se liofiliza . Ejemplo 6: preparación de un derivado de éster de ácido hialurónico con un MW de 120 kDa y 17ß-extradiol con un grado de sustitución en el carboxilo de aproximadamente 20% 140 mg de 17 ß-extradiol se disuelven en 50 mi de DMSO y 380 mg de l-(3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimida (EDC), 262 mg de ácido 4-bromobutí rico se agregan a la solución. El producto se recupera por precipitación y purifica por cromatografía en una columna de sílice. El compuesto intermedio así obtenido se seca a temperatura ambiente bajo un alto vacío. 0.80 g de sal de tetrabutilamonio de ácido hialurónico (HATBA) se disuelven en 40 mi de N-metil-2-pirrolidona (NMP) a temperatura ambiente. El compuesto intermedio se agrega a la solución y la mezcla completa se deja reaccionar a temperatura ambiente. Después de 7 días de reacción la solución se diluye con 5 mi de agua y 5 mi de una solución saturada de cloruro de sodio. La mezcla completa se deja bajo agitación por 1 hora para permitir el intercambio del sodio con el ion TBA. Se agrega entonces etanol gota a gota y el producto filamentoso obtenido se disuelve en agua, dializa y, al final, liofiliza. Ejemplo 7: preparación del éster parcial entre ácido hialurónico 200 kDa y SN38 y auto-degradación de derivado de HA 200 mg de SN38 se disuelven en 50 mi de DMSO y 375 mg de 1- ( 3-dimetilaminpropil ) -3-etilcarbodiimida (EDC) , 330 mg de ácido 4-bromobutí rico se agregan a la solución. El desarrollo de la solución se monitorea por medio de cromatografía TLC (fase estacionaria de sílice con indicador de fluorescencia y eluyente de cloroformo-acetoni trilo 60:40). El producto se recupera por medio de precipitación y purifica por cromatografía en una columna de sílice utilizando cloroformo ¡metanol 99:1 como eluyente. El compuesto intermedio así obtenido se seca a temperatura ambiente bajo alto vacío. 0.84 g de sal de tetrabutilamonio de ácido hialurónico (HATBA) se disuelven en 43 mi de N-metil-2-pirrolidona (NMP) a temperatura ambiente. Pespués de sacar la solución para reaccionar por 7 días, 34 mg de trietilamina se agregan a la solución de reacción y la mezcla completa se agita por 30' . Una solución de 87 mg de yoduro de 2-cloro-1-metil-piridina en 10 mi de PMSO se agrega lentamente gota a gota durante un periodo de 45' y la mezcla se mantiene a 30° por 15h. Una solución consistiendo de 15 mi de agua y 0.5 g de cloruro de sodio se agrega entonces y la mezcla resultante se vierte lentamente en 300 mi de acetona bajo agitación continúa. Un precipitado se forma que se filtra y enjuaga tres veces con 25 mi de acetona-agua 5:1 y tres veces con acetona (50 mi) . El producto se seca bajo un alto vacío a 38°C. Ejemplo 8: preparación de un derivado de amida de ácido hialurónico 220 kDa con doxorubicina con un grado de sustitución en el carboxilo de aproximadamente 5% (Figura 2) 2.00 g de HATBA se disuelven en 100 mi de DMSO con un bajo contenido de agua. La solución se insufla con ácido hidroclórico gaseoso hasta remover una alícuota de la solución y diluirla con agua 1:10, el pH prueba estar entre 4.5 y 5. Carbonildiimidazol (55 mg) se agrega subsiguientemente a la solución y la mezcla completa se deja bajo agitación a temperatura ambiente por 1 h. Al final, 1.4 g de doxorubicina se agregan a la solución y la mezcla se deja reaccionar por 24 horas a temperatura ambiente. 5 mi de una solución saturada de NaCl se agregan para recuperar el producto, permitiendo así salificación con sodio de los carboxilos de ácido hialurónico. El polímero se precipita al agregar etanol gota a gota y después de filtrarlo y redisolverlo en agua, se dializa para eliminar los residuos de solvente y sal y finalmente se liofiliza . Ejemplo 9: preparación del éster parcial entre ácido hialurónico y doxorubicina y auto-degradación con condensación Ugi 500 mg de polímero obtenido de acuerdo al ejemplo 8 se disuelven en 5 mi de agua destilada. El pH de la solución se disminuye a aproximadamente 4 por la adición de ácido hidroclórico concentrado. 15 mg de di-hidrocloruro de éster etil de usina, 250 µl de solución acuosa de formaldehído a 40% y 250 µl de ciclohexilisocianuro se agregan a la solución. Pespués de 15' de reacción el gel se pone en diálisis en una solución básica de carbonato de sodio por aproximadamente 24 h y al final se dializa contra agua hasta una conductividad de la solución de menos de 40 µs. El polímero se recupera por liofilización. Ejemplo 10: preparación de un derivado de éster de ácido hialurónico con un MW de 200 kPa y Poxorubicina con un grado de sustitución en el carboxilo de aproximadamente 10% 325 mg de Hidrocloruro de Poxorubicina se disuelven en 50 mi de NMP, después de agregar 0.3 mi de Et3N, 420 mg de 1- ( 3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimmida (EPC) y 280 mg de ácido 4-bromobutírico se agregan subsiguientemente a la solución. El desarrollo de la solución se monitorea por medio de cromatografía TLC (fase estacionaria de sílice con indicador de fluorescencia y eluyente de diclorometano-metanol 80:20) . El producto se purifica por cromatografía en una columna utilizando cloroformo: metanol 99:1 como eluyente. El compuesto intermedio así obtenido se seca a temperatura ambiente bajo alto vacío. 0.75 g de sal de tetrabutilamonio de ácido hialurónico (HATBA) se disuelven en 40 mi de N-metil-2-pirrolidona (NMP) a temperatura ambiente. El compuesto intermedio se agrega a la solución y la mezcla completa se deja reaccionar a temperatura ambiente. Pespués de 7 días de re-acción la solución se diluye con 5 mi de agua y 5 mi de cloruro de sodio saturado. La mezcla completa se deja bajo agitación por 1 hora para permitir el intercambio del sodio con el ion TBA. Se agrega subsiguientemente etanol gota a gota y el producto filamentoso obtenido se disuelve en agua, dializa y, al final, liofiliza. Experimentación in vi tro : Evaluación de la actividad antiproliferativa del conj'ugado de éster HA/SN38 teniendo un grado de sustitución igual a 10% y 15%, en la línea celular de adenocarcinoma cólico HT29 Las alícuotas de los derivados obtenidos de los ejemplos 1 y 2 se caracterizan por medio de una prueba de citotoxicidad i n vi tro en una línea de células tumorales cólicas llamadas HT29. La comparación se afecta con SN38 disuelto en PMSO. Los derivados de HA se solubilizan en una solución glucosaza a 5% a una concentración de 5 mg/ml. La prueba se efectúa al depositar en una placa con 96 cavidades, 3000 células por cavidad; después de 24 horas de incubación a 37°C, las células se colocan en contacto con las soluciones y después de un adicional de 48 horas la vitalidad celular se determina por medio de un ensayo colorimét rico MTT (Pezinot F. et a l . , J. Immunol Methods, 1986, 22 (89) : 271-277 ) . Las curvas de proliferación refiriéndose a los dos conjugados de éster de HA se muestran en las gráficas (a la izquierda la actividad citotóxica del derivado a 15%, a la derecha aquella a 10%), ver figura 4. Al comparar los datos de EC50 con SN38 en dimet i lsul fóxido (PMSO) se obtienen los siguientes resultados : Los resultados i n vi t ro confirman que los nuevos derivados de HA/SN38 muestran la misma actividad citotóxica del metabolito activo SN38 que, como se describe arriba, tiene de 100 a 1,000 veces la actividad de su profármaco comercial, Irinotecan. La experimentación efectuada por lo tanto afirma una eficacia mucho más alta del nuevo derivado con respecto al fármaco de referencia actualmente utilizado en la práctica clínica. Para demostrar lo que se establece arriba con respecto a la eficacia de los nuevos conjugados (objeto de la presente invención) como fármacos antineoplásticos capaces de superar la resistencia farmacológica adquirida por células neoplásticas ya no sensibles al fármaco por sí mismas, se efectúan las siguientes experimentaciones i n vi tro : Prueba de citotoxicidad en células PHP/K12 del fármaco de quimioterapia doxorubicina en comparación con su conjugado amida con HA La línea celular utiliza derivados de ratas de la cepa BPIX tratada con 1,2-dimetilhidrazina . Estas células de hecho expresan los mismos antígenos tumorales que el adenocarcinoma de colón-recto humano y, por esta razón, se utilizan como un modelo de estudio preclínico i n vi tro para el mismo tiempo de tumor.

La línea celular de arriba también ha adquirido resistencia a tratamiento de quimioterapia (esto se llama "Resistencia a Múltiples Fármacos": MPR) . Para evaluar el grado de vitalidad celular el Ensayo de Vitalidad de la Célula VIVA/MUERTA (Molecular Probes) se utiliza, lo que permite que las células metabólicamente activas se distingan de las células muertas; las últimas emiten fluorescencia verde a un nivel nuclear mientras las células vivas emiten fluorescencia roja localizada en la membrana celular y en el citoplasma. Pespués de colorear, las células se analizan utilizando un microscopio confocal y el porcentaje de células vivas/muertas se evalúa al contar un mínimo de 500 células vivas o muertas por muestra. El conjugado de amida de doxorubicina con HA (Hydox) se utiliza para la experimentación, teniendo un grado de sustitución de 5% obtenido de acuerdo al ejemplo 8, en comparación con el fármaco como tal, a diferentes concentraciones. Figura 3: después de 48 horas de tratamiento, los resultados de la prueba VIVAS/MUERTAS representados en la figura 3, indican claramente como el conjugado Hydox es capaz de ejercer, en una manera dependiente de dosis, un efecto citotóxico en células que han adquirido una cierta resistencia a quimioterapia, mucho más alta que la doxorubicina no conjugada correspondiente, utilizada bajo las mismas concentraciones. Hydox, de hecho, también prueba estar activo a bajas concentraciones tales como 0.25 µM, mientras el fármaco de referencia en esta dosificación no tienen ningún efecto citotóxico. Al doblar la concentración, el conjugado en cuestión tiene 35% más de ci totoxicidad, por lo tanto permitiendo el uso de dosificaciones inferiores de fármaco con efectos secundarios menores en células que no responden más a las terapias quimioterapéuticas clásicas debido a resistencia adquirida a los fármacos antineoplásticos de arriba. La descripción de la invención siendo tal, es evidente que estos métodos pueden modificarse en varias maneras. Pichas modificaciones no deberían considerarse como divergentes del espíritu y perspectivas de la invención y todas las modificaciones que aparecerán evidentes a los expertos en el campo se incluyen en el alcance de las siguientes reivindicaciones .

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES 1. Conjugados químico-farmacéuticos de ácido hialurónico y/o sus derivados obtenidos a través de un enlace indirecto entre el polisacárido y un fármaco con una acción antitumoral, a través de un separador molecular que forma un enlace de éster o amida con el grupo carboxílico de HA y/o su derivado, con la condición que dicho separador no sea una hidrazida o un polipéptido.
2. 2. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el fármaco se selecciona de los siguientes grupos: nitrosureas, ant imetaboli tos , alcaloides, antibióticos y productos análogos, modificadores de respuesta biológica, diterpenoides, hormonas sintéticas y antihormonas.
3. 3. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el fármaco es un antimetabolito consistiendo de un producto análogo de pirimidina tal como fluorouracil y Ara-C.
4. 4. Conjugados químico- farmacéut icos de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el fármaco es un alcaloide tal como vincristina, vinblastina y el metabolito activo de irinotecan SN38.
5. 5. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el fármaco es un antibiótico tal como doxorubicina.
6. 6. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el fármaco es una hormona tal como extradiol.
7. 7. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el grado de sustitución en el carboxilo de ácido hialurónico y/o uno de sus derivados varía de 1 a 100% .
8. 8. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 7, en donde el fármaco es doxorubicina y el grado de sustitución en el carboxilo de ácido hialurónico del separador enlazado a doxorubicina varía de 1 a 20%.
9. 9. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 7, en donde el fármaco es SN38 y el grado de sustitución en el carboxilo de ácido hialurónico del separador enlazado a SN38 varía de 3 a 15%.
10. 10. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el ácido hialurónico y/o uno de sus derivados tiene un peso molecular que varía de 400 a 3xl06 Da.
11. 11. Compuestos químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 10, en donde el ácido hialurónico preferentemente tiene un peso molecular que varía de 5,000 a lxlO6 Da .
12. 12. Compuestos químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 11, en donde el ácido hialurónico preferentemente tiene un peso molecular que varía de 30,000 a 0.5xl06 Pa .
13. 13. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el derivado de ácido hialurónico es una sal con bases orgánicas y/o inorgánicas.
14. 14. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el derivado de ácido hialurónico es un éster de ácido hialurónico con alcoholes de las series alifáticas, aralifáticas, ciclo-alifáticas , aromáticas, cíclicas y heterocíclicas con un porcentaje de esterificación no más alto que 75%.
15. 15. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el derivado de ácido hialurónico es una amida de ácido hialurónico con aminas de las series alifáticas, aralifáticas , ciclo-alifáticas , aromáticas, cíclicas y heterocíclicas con un porcentaje de amidación que varía de 1 a 10 %.
16. 16. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el derivado de ácido hialurónico es un derivado 0-sulfatado de ácido hialurónico hasta el 4to grado de sulfatación.
17. 17. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el derivado de ácido hialurónico es un éster interno con un porcentaje de esterificación que varía de 0.5 a 10% .
18. 18. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el derivado de ácido hialurónico se obtiene por deacetilación de la fracción de N-acetilglucosamina, con un porcentaje de deacetilación que varía de 0.1 a 30%.
19. 19. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el derivado de ácido hialurónico es un derivado percarboxilado obtenido por oxidación del hidroxilo primario de la fracción de N-acetilglucosamina, con un grado de percarboxilación que varía de 0.1 a 100%.
20. 20. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el separador consiste de una cadena alifática, aralifática, alicíclica, heterocí lica, lineal o ramificada opcionalmente conteniendo heteroátomos, teniendo grupos hidroxilo, carboxilo, carbonilo, amina, epoxi, cloruros de ácidos, tioles, nitrilos, halógenos, anhídridos, isocianatos, e isotiocianatos.
21. 21. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 20, en donde el separador se representa por ácidos carboxílicos con un número de átomos de carbono que varía de 2 a 10.
22. 22. Conjugados químico- farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 21, en donde el separador es ácido bromopropiónico .
23. 23. Conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a la reivindicación 21, en donde el separador es ácido bromobut írico .
24. 24. Composiciones farmacéuticas teniendo uno o más de los conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a las reivindicaciones previas, como principio activo.
25. 25. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 24 para administración oral, intravenosa, intra-arterial, intratecal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intra-articular, tópica, transdérmica o para administración directa en el sitio de la neoplasia .
26. 26. Biomateriales tridimensionales de acuerdo a la reivindicación 1 procesados en la forma de hidrogeles, nano- y microesferas, fibras hiladas tejidas o no tejidas.
27. 27. Uso de los conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a las reivindicaciones 1-23 para la preparación de composiciones farmacéuticas a utilizarse en el campo oncológico.
28. 28. Uso de acuerdo a la reivindicación 26 para el tratamiento sistémico o local de tumores del páncreas, mama, colón-recto, pulmón y sistema respiratorio i n t o t o, cabeza-cuello, hígado, estómago, testículos, ovario, endometrio, próstata, vejiga, cerebro, leucemia, linfomas, melanoma, Sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, neuroblas toma y cáncer de piel.
29. 29. Proceso para la preparación de los conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a las reivindicaciones 1-23 por la conjugación indirecta de ácido hialurónico o uno de sus derivados y un fármaco teniendo una actividad anti-tumoral por medio de un separador que forma un enlace de éster con el grupo carboxilo de ácido hialurónico de acuerdo a los siguientes procedimientos alternativos a) , b) o c) : la) un grupo funcional del separador adecuadamente seleccionado también conteniendo un segundo grupo saliente capaz de reaccionar con la función carboxilo de HA, reacciona con un grupo funcional perteneciente a la molécula antitumoral seleccionada; lia) la reacción puede requerir posiblemente la activación de una de las funciones incluidas por medio de un agente de activación tales como carbodiimidas ; Illa) en una segunda fase, por contacto directo con una sal de tetra-alquilamonio (preferentemente amonio de tetrabutilo) de HA en un ambiente anhidro, el compuesto consistiendo del fármaco modificado reacciona dando origen a una sustitución nucleofílica del grupo saliente en el carboxilo del HA, causando la formación de un enlace de éster entre HA y separador; Ib) el grupo carboxilo de ácido hialurónico se enlaza por unión nucleofílica a un separador adecuado que se enlaza subsiguientemente a una función de la molécula antitumoral; le) el grupo carboxilo de HA se activa con un agente de activación y se reacciona con una función de hidroxilo del separador adecuadamente seleccionado, previa o subsiguientemente enlazado al fármaco.
30. 30. Proceso para la preparación de los conjugados químico-farmacéuticos de acuerdo a las reivindicaciones 1-23 por la conjugación indirecta de ácido hialurónico o uno de sus derivados y un fármaco teniendo una actividad antitumoral por medio de un separador que forma un enlace de amida con el grupo carboxilo de ácido hialurónico de acuerdo al siguiente procedimiento: el grupo carboxilo de ácido hialurónico se activa con un agente de activación y se reacciona con una función de amina del separador adecuadamente seleccionado, previa o subsiguientemente enlazado al fármaco.