MX2007015036A

MX2007015036A - Polipeptidos con actividad antimicrobiana y polinucleotidos que los codifican.

Info

Publication number: MX2007015036A
Application number: MX2007015036A
Authority: MX
Inventors: Jesper Vind; Per Holse Mygind; Dorotea Raventos Segura; Hans-Henrik Kristensen Hoegenhaug; Olivier Taboureau
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2008-02-07
Also published as: ES2621568T3; AP2007004213A0; AU2006256791B2; JP2008545425A; US20100120690A1; WO2006131504A1; BRPI0609801A2; CA2607841C; NO20080067L; US7671175B2; RU2415150C2; IL186857A0; EP1891097B1; AR053402A1; NZ562801A; US20070061923A1; TW200740841A; KR20080023218A; JP5118023B2; CA2607841A1

Abstract

La presente invencion se refiere a polipeptidos aislados con actividad antimicrobiana y polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos. La invencion tambien se refiere a construcciones de acido nucleico, vectores, y celulas huesped que comprenden los polinucleotidos ademas de metodos para producir y usar los polipeptidos.

Description

POLIPEPTIDOS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBI NA Y P0LI2JUCLE0TID0S QUE LOS CODIFICAN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad antimicrobiana y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, y células huésped que comprenden los polinucleótidos además de métodos para producir y usar los polipéptidos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proveer polipéptidos con actividad antimicrobiana mejorada. Los polipéptidos pueden exhibir reducida actividad hemolitica y/o reducida citotoxicidad. Los polipéptidos también pueden exhibir reducida sensibilidad hacia cationes, tales como Ca2+, Mg2+, Na+. Los polipéptidos también pueden exhibir un espectro antimicrobiano diferente, comparado con la SEC ID N0:1. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un polipéptido con actividad antimicrobiana que comprende, de preferencia consiste en, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de la secuencia de aminoácidos : G-Xi -G-C-X2 -X ~X -X5-X6- 7-X8-X9-X?o- ??- -H-X? -X?3 -C-Xj.4 - Ref.187186 Xi5-X?ß~Xi7-Xi8-Xi9-X20-G-G-X2?-C-X22-X23-X2 -X25-X26~X27- -X28-C-X29/' en donde Xi = F, L, W o I; de preferencia Xi = F; X2 = N, R, Q, V, G, S, A, K, L, M, D, H o Y; de preferencia X2 = N, R, Q, V, G, S, A, K o Y; X3 = G, R, A o K; de preferencia X3 = G; X4 = P, A, L, V, K o R; de preferencia X4 = P, K o R; X5 = W o R; X6 = D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, C, I, R, V o Y; de preferencia X6 = D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, V o Y; X7 = E, G, A, L, C, Q o S; de preferencia X7 = E, G o S; X8 = D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, , I, M, A, C o R; de preferencia X8 = D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, W, I, M o R; X9 = D o P; de preferencia X9 = D; Xio = M, R, S, V, A, F, G, L, T, Y, W, E o K; de preferencia X10 = M, R, S, V, G, Y, L, F, T, W o K; Xn = Q, R, L, F, G, H, S, A, C, I, K, M, P, T, V, W O Y; de preferencia Xu = Q, R, L, F, G, H, S, K o Y; Xi2 = N, R, I, Y, V, K, T, Q, S, F, A, , E o H; X?3 = H, A, F, Q, T, V o L; de preferencia Xi3 = H o L; Xi4 = K, Q o R; de preferencia Xi4 = K o R; Xis = S, A, V, o F; Xi6 = I, L, M, T, o V; de preferencia X16 = I, L o V; Xi7 = K, T o R; Xis = G, H, K, A, P, F, I, Q, R, S, T, Y o N; de preferencia X?8 = G, H, R, K o N; X19 = Y, H, K, L, M, N, Q, S, V o R; de preferencia XX9 = Y o R; X20 = K, F, H, T, C o R; de preferencia X20 = K o R; X2? = Y, F, R, A, H, L, M, S o ; de preferencia X2i = Y, F, R O W; X22 = A, K, N, Q, T, E, H, I, R, S, V, G o Y; de preferencia X22 = A, K, N, Q, T, S o Y; X23 = K, R o T; de preferencia X23 = K o R; X24 = G, K, Q, E, N, S, T, A o R; de preferencia X24 = G, K, Q, A o R; X25 = G, K, H, W o R; de preferencia X25 = G, K o R; X26 = F, A, H, I, M, V, , R o L; de preferencia X26 = F o L; X27 = V, L, M, I, K, Q, R o T; de preferencia X27 = V, L, M O T; X28 = K, H, N o R; de preferencia X28 = K o R; X29 = Y, I, YRCG o YR; de preferencia X29 = Y o YR; y que tiene menos de 100% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de la SEC ID NO:l.

La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, y células huésped recombinantes que comprenden los polinucleótidos. La presente invención también se refiere a métodos para producir dichos polipéptidos con actividad antimicrobiana, que comprenden (a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La presente invención también se refiere a métodos para usar los polipéptidos de la invención. DEFINICIONES Actividad antimicrobianas El término "actividad antimicrobiana" se define en la presente como una actividad capaz de aniquilar o inhibir el crecimiento de células microbianas. En el contexto de la presente invención, por el término "antimicrobiano" pretende significar que hay un efecto bactericida y/o a bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o un efecto viricida, en donde el término "bactericida" se debe entender con capacidad para aniquilar células bacterianas. Por el término "bacteriostático" se debe entender con capacidad para inhibir el desarrollo bacteriano, es decir inhibir el desarrollo de células bacterianas. Por el término "fungicida" se debe entender con capacidad para aniquilar células fúngicas. Por el término "fungistático" se debe entender con capacidad para inhibir el desarrollo fúngico, es decir inhibir el desarrollo de células fúngicas. Por el término "viricida" se debe entender con capacidad para inactivar virus. El término "células microbianas" denota células bacterianas o fúngicas (incluso levaduras) . En el contexto de la presente invención, por el término "inhibir el desarrollo de células microbianas" pretende significar que las células están en estado de no desarrollo, es decir, que son incapaces de propagarse. Para los fines de la presente invención, la actividad antimicrobiana se puede determinar de acuerdo con el procedimiento descrito por Lehrer y otros, Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991). Alternativamente, la actividad antimicrobiana se puede determinar de acuerdo con las pautas de NCCLS de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute; antes denominado National Committee for Clinical and Laboratory Standards) . Los polipéptidos con actividad antimicrobiana pueden tener capacidad para reducir la cantidad de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) hasta 1/100 después de 24 horas (de preferencia después de 12 horas, con mayor preferencia después de 8 horas, con mayor preferencia después de 4 horas, con mayor preferencia después de 2 horas, con mayor preferencia después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20°C en una solución acuosa de 25% (p/p) ; de preferencia en una solución acuosa de 10% (p/p) ; con mayor preferencia en una solución acuosa de 5% (p/p) ; con aún mayor preferencia en una solución acuosa de 1% (p/p) ; con mayor preferencia en una solución acuosa de 0.5% (p/p); y en particular en una solución acuosa de 0.1% (p/p) de los polipéptidos con actividad antimicrobiana. Los polipéptidos con actividad antimicrobiana también pueden tener capacidad para inhibir el sobrecrecimiento de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25°C en un sustrato de desarrollo microbiano, cuando se agrega en una concentración de 1000 ppm; de preferencia cuando se agrega en una concentración de 500 ppm; con mayor preferencia cuando se agrega en una concentración de 250 ppm; con mayor preferencia aún cuando se agrega en una concentración de 100 ppm; con mayor preferencia cuando se agrega en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se agrega en una concentración de 25 ppm.

Los polipéptidos con actividad antimicrobiana pueden tener capacidad para reducir la cantidad de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) hasta 1/100 después de 24 horas (de preferencia después de 12 horas, con mayor preferencia después de 8 horas, con mayor preferencia después de 4 horas, con mayor preferencia después de 2 horas, con mayor preferencia después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20°C en una solución acuosa de 25% (p/p) ; de preferencia en una solución acuosa de 10% (p/p) ; con mayor preferencia en una solución acuosa de 5% (p/p) ; con aún mayor preferencia en una solución acuosa de 1% (p/p) ; con mayor preferencia en una solución acuosa de 0.5% (p/p); y en particular en una solución acuosa de 0.1% (p/p) de los polipéptidos con actividad antimicrobiana. Los polipéptidos con actividad antimicrobiana también pueden tener capacidad para inhibir el sobrecrecimiento de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25°C en un sustrato de desarrollo microbiano, cuando se agrega en una concentración de 1000 ppm; de preferencia cuando se agrega en una concentración de 500 ppm; con mayor preferencia cuando se agrega en una concentración de 250 ppm; con aún mayor preferencia cuando se agrega en una concentración de 100 ppm; con mayor preferencia cuando se agrega en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se agrega en una concentración de 25 ppm. Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, de preferencia al menos 40%, con mayor preferencia al menos 50%, con mayor preferencia al menos 60%, con mayor preferencia al menos 70%, con mayor preferencia al menos 80%, con mayor preferencia aún al menos 90%, con mayor preferencia al menos 95%, y con aún mayor preferencia al menos 100% de la actividad antimicrobiana del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 1 a 40 de cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274. Defensinas El término "defensina" , tal como usa en la presente, se refiere a polipéptidos reconocidos por un experto en la técnica como perteneciente a la clase de defensinas de los péptidos antimicrobianos. Para determinar si un polipéptido es una defensina de acuerdo con la invención, la secuencia de aminoácidos de preferencia se compara con los perfiles de modelo de markov ocultos (perfiles HMM) de la base de datos PFAM, mediante el uso del paquete de software HMMER gratuito (ver Ejemplo 7) . Las familias de defensinas PFAM incluyen Defensina_l o "defensina de mamíferos" (N° de acceso PF00323) , Defensina_2 o "defensina de artrópodos" (N° de acceso PF01097) , Defensina_beta o "Beta Defensina" (N° de acceso PF00711) , Defensina_joropep o "propéptido de defensina" (N° de acceso PF00879) y Gama-tionina o "familia de gama-tioninas" (N° de acceso PF00304) . Las defensinas pueden pertenecer a la clase de alfa-defensinas, la clase de beta-defensinas, la clase de teta-defensinas, las clases de defensinas de insecto o de artrópodo, o la clase de defensinas vegetales. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de una defensina de acuerdo con la invención comprende 4, 5, 6, 7, o 8 residuos de cisteína, de preferencia 4, 5, o 6 residuos de cisteína, con mayor preferencia 4 o 6 residuos de cisteína, y con mayor preferencia 6 residuos de cisteína. Las defensinas también pueden ser defensinas sintéticas que comparten las propiedades características de cualquiera de las clases de defensina. Los ejemplos de dichas defensinas incluyen, sin limitaciones, -Defensina HNP-1 (péptido neutrófilo humano) HNP-2 y HNP-3; ß-Defensina-12, Drosomicina, Heliomicina, ?l-purotionina, defensina A de insecto, y las defensinas descritas en las solicitudes de PCT WO 99/53053, WO 02/06324, WO 02/085934, PCT/DK2005/000725, PCT/DK2005/000735 y PCT/DK2006/000155. Polipéptido aislados El término "polipéptido aislado", tal como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que es al menos 20% puro, de preferencia al menos 40% puro, con mayor preferencia al menos 60% puro, con aún mayor preferencia al menos 80% puro, con mayor preferencia al menos 90% puro, y con aún mayor preferencia al menos 95% puro, determinado por SDS-PAGE. Polipéptido sustancialmente puros El término "polipéptido sustancialmente puro" denota en la presente una preparación de polipéptido que contiene como máximo 10%, de preferencia como máximo 8%, con mayor preferencia como máximo 6%, con mayor preferencia como máximo 5%, con mayor preferencia como máximo 4%, como máximo 3%, con aún mayor preferencia como máximo 2%, con mayor preferencia como máximo 1%, y con aún mayor preferencia como máximo 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el cual se asocia en estado nativo. En consecuencia, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos 92% puro, de preferencia al menos 94% puro, con mayor preferencia al menos 95% puro, con mayor preferencia al menos 96% puro, con mayor preferencia al menos 96% puro, con mayor preferencia al menos 97% puro, con mayor preferencia al menos 98% puro, con aún mayor preferencia al menos 99%, con mayor preferencia al menos 99.5% puro, y con aún mayor preferencia 100% puro en peso del material polipeptídico total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están de preferencia en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura" , es decir, que la preparación polipeptídica está esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual se asocia en estado natural. Esto se puede lograr, por ejemplo, al preparar el polipéptido mediante métodos de recombinación bien conocidos o mediante métodos de purificación clásicos. En la presente, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada." Variantes El término "variante" se define en la presente como un polipéptido antimicrobiano que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, eliminaciones, y/o truncaciones de uno o más residuos específicos de aminoácido en una o más posiciones específicas del polipéptido. Numeración de las variantes s En la presente invención, se utiliza una numeración específica de las posiciones de los residuos de aminoácidos en las variantes de polipéptido antimicrobiano. Por ejemplo, al alinear las secuencias de aminoácidos de polipéptidos antimicrobianos conocidos, es posible designar con un número de posición de aminoácido cualquier residuo de aminoácido en cualquier polipéptido antimicrobiano. Mediante el sistema de numeración originado en la secuencia de aminoácidos del polipéptido antimicrobiano descrito en SEC ID N0:1, alineado con la secuencia de aminoácidos de numerosos otros polipéptidos antimicrobianos, es posible indicar la de un residuo de aminoácido en un polipéptido antimicrobiano en regiones de homología estructural . Se pueden hacer múltiples alineaciones de secuencias de proteínas, por ejemplo, mediante "ClustalW" (Thompson, J.D. , Higgins, D.G. y Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W: Improving the sensibility of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680). Las múltiples alineaciones de secuencias de ADN se pueden realizar al usar la alineación proteica como plantilla, y reemplazar los aminoácidos con el correspondiente codón de la secuencia de ADN. Los algoritmos de comparación de secuencias en pares de uso común son adecuados para detectar similitudes entre secuencias de proteínas que no divergen más allá del punto de aproximadamente 20-30% de identidad de secuencia (Doolittle, 1992, Protein Sci . 1: 191-200; Brenner y otros, 1998, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 95, 6073-6078) . Sin embargo, proteínas verdaderamente homologas con el mismo plegamiento y función biológica similar a menudo divergen hasta el punto en que la comparación tradicional basada en las secuencias es incapaz de detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J". Mol . Biol . 295: 613-615). Se puede lograr mayor sensibilidad en la búsqueda basada en la secuencia mediante programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias de proteínas (perfiles) para analizar bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles mediante un proceso de búsqueda reiterativa de bases de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul y otros, 1997, Nucleic Acid Res . 25: 3389-3402) . Se puede lograr mayor sensibilidad aún si la familia o la superfamilia de la proteína de interés tienen uno o más representantes en las bases de datos de estructura de proteínas. Programas tales como GenTHREADER (Jones 1999, J. Mol . Biol . 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de diversas fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural, y potenciales de solvatación) como ingreso a una red neural que predice el plegamiento estructural para una secuencia incógnita. De modo similar, el método de Gough y otros, 2000, J". Mol . Biol . 313: 903-919, se puede usar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones a su vez se pueden usar para generar modelos de homología para la proteína de interés, y dichos modelos se pueden evaluar en su exactitud mediante diversas herramientas desarrolladas para tal fin. Para las proteínas de estructura conocida se dispone de diversas herramientas y recursos para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, se han alineado las estructuras de las superfamilias de proteínas SCOP, y dichas alineaciones están disponibles y se pueden descargar. Estas alineaciones se pueden usar para predecir los residuos de aminoácidos correspondientes, desde los puntos de vista estructural y funcional, en proteína dentro de la misma superfamilia estructural. Esta información, junto con la información derivada de las búsquedas de modelado y perfiles de homología, se puede usar para predecir cuáles residuos mutar al desplazar las mutaciones de interés de una proteína a un homólogo cercano o remoto. Al describir las diversas variantes de polipéptido antimicrobiano de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación se adapta para facilitar la referencia.

En todos los casos, se emplea la abreviación de aminoácido aceptada por IUPAC, de letra única o de tres letras. Para una sustitución de aminoácido se usa la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido (s) sustituidos (s) . En consecuencia, la sustitución de treonina por alanina en la posición 226 se designa "T226A"; y la sustitución de tirosina por tirosina y arginina en la posición 40 (con agregado efectivo de arginina después de tirosina) se designa "Y40YR" . Las mutaciones múltiples se separan mediante marcas de adición ("+"), por ejemplo, "G205R + S411F", que representan mutaciones en las posiciones 205 y 411 que sustituyen glicina (G) por arginina (R) , y serina (S) por fenilalanina (F) , respectivamente. Polipéptido antimicrobiano origináis El término polipéptido antimicrobiano "original" , tal como se usa en la presente significa un polipéptido antimicrobiano en el cual se hacen modificaciones, por ejemplo, sustitución (es) , inserción (es) , eliminación (es) , y/o truncación (es) , a fin de producir las variantes de polipéptido antimicrobiano de la presente invención. Este término también se refiere al polipéptido con el cual se compara y alinea una variante. El polipéptido original puede ser natural (de tipo silvestre) , o incluso puede ser una de sus variantes, preparada por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la proteína original puede ser una variante de un polipéptido natural cuya secuencia de aminoácidos de ha modificado o alterado. Un polipéptido original también puede ser una variante alélica que es un polipéptido codificados por cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico Identidads La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad" . Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del programa FASTA incluido en la versión 2. Ox del paquete del programa FASTA (ver W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988) , "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA" , Methods in Enzymology 183:63-98). La matriz de calificación usada era BLOSUM50, el margen de brecha era de -12, y el margen de extensión de brecha era de -2. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el mismo algoritmo y el paquete de software que se describió con anterioridad. La matriz de calificación usada fue la matriz de identidad, con margen de brecha de -16, y margen de extensión de brecha de -4. Alternativamente, la alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el programan Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo global de alineación descrita en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, el margen de brecha es 10, y el margen de extensión de brecha es 0.5. El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención (tal como los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO:l) y se calcula una diferente secuencia de aminoácidos como la cantidad de coincidencias exactas en una alineación de dos secuencias, dividida por la longitud (cantidad de residuos de aminoácido) de la secuencia de la presente invención; o alternativamente, el resultado de Needle rotulado "identidad más larga" se usa como porcentaje de identidad y se calcula como sigue: (residuos idénticos x 100) / (longitud de alineación - cantidad de brechas en la alineación) . El resultado se expresa como porcentaje de identidad. Fragmento polipeptídicos El término "fragmento polipeptídico" se define en la presente como un polipéptido con uno o más aminoácidos eliminados de los terminales amino y/o carboxilo de SEC ID NO: 2 o una de sus secuencias homologas, en donde el fragmento tiene actividad antimicrobiana. Subsecuencias El término "subsecuencia" se define en la presente como una secuencia de nucleótidos con uno o más nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3' de SEC ID N0:1 o una de sus secuencias homologas, en donde la subsecuencia codifica un fragmento polipeptídico con actividad antimicrobiana. Variante alélicas El término "variante alélica" denota en la presente cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica se origina naturalmente por mutación, y puede dar por resultado polimorfismos entre poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Polinucleótido sustancialmente puros El término "polinucleótido sustancialmente puro" , tal como se usa en la presente se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas por ingeniería genética. En consecuencia, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo 10%, de preferencia como máximo 8%, con mayor preferencia como máximo 6%, con mayor preferencia como máximo 5%, con mayor preferencia como máximo 4%, con mayor preferencia como máximo 3%, con aún mayor preferencia como máximo 2%, con mayor preferencia como máximo 1%, y con aún mayor preferencia como máximo 0.5% en peso de otro material de polinucleótido con el cual se asocia en estado nativo. Sin embargo, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones no traducidas 5' y 3' naturales, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos 90% puro, de preferencia al menos 92% puro, con mayor preferencia al menos 94% puro, con mayor preferencia al menos 95% puro, con mayor preferencia al menos 96% puro, con mayor preferencia al menos 97% puro, con aún mayor preferencia al menos 98% puro, con mayor preferencia al menos 99%, y con aún mayor preferencia al menos 99.5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están de preferencia en forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleótidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polinucleótido está esencialmente libre de otro material de polinucleótido con el cual se asocia en estado nativo. En la presente, el término "polinucleótido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polinucleótido aislado" y "polinucleótido en forma aislada" . Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquiera de sus combinaciones.

ADNcs El término "ADNc" se define en la presente como molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa de una molécula de ARNm madura, empalmada que se obtiene de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias intrón que suelen estar presentes en el correspondiente ADN genómico. La transcripción inicial primaria ARN es un precursor de ARNm procesado a través de un grupo de etapas, antes de aparecer como ARNm maduro empalmado. Estas etapas incluyen la remoción de secuencias intrón por un proceso denominado empalme. En consecuencia, el ADNc derivado de ARNm carece de secuencias intrón. Construcciones de ácido nucleicos El término "construcción de ácido nucleico" tal como se usa en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico, sea monocatenario o bicatenario, aislado de un gen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera tal que de otro modo no existe en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo del término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias control requeridas para la expresión de una secuencia codificadora de la presente invención. Secuencia de controls El término "secuencias de control" se define en la presente para incluir todos los componentes necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Dichas secuencias control incluyen, sin limitaciones, una secuencia guía de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia de péptido de señal, y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen un promotor, y señales de detención de transcripción y traducción. Las secuencias control se pueden proveer de ligadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la unión de las secuencias control con la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido. Ligado operativamente s El término "ligado operativamente" denota en la presente una configuración en la cual se ubica una secuencia de control en una posición adecuada relativa a la secuencia codificadora de la secuencia de polinucleótidos para que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificadora de un polipéptido. Secuencia codificador s Cuando se usa en la presente, el término "secuencia codificadora" significa una secuencia de nucleótidos, que directamente especifica la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. En general, los límites de la secuencia codificadora están determinados por un marco de lectura abierto, que por lo general comienza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativo tales como GTG y TTG. La secuencia puede codificar un ADN, ADNc, o secuencia de nucleótidos recombinante . Expresións El término "expresión" incluye cualquier etapa que interviene en la producción del polipéptido que incluye, sin limitaciones, transcripción, modificación posterior a la transcripción, traducción, modificación posterior a la traducción, y secreción. Vector de expresións El término "vector de expresión" se define en la presente como molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, y que está ligado operativamente a nucleótidos adicionales que proveen su expresión. Célula huéspeds El término "célula huésped", tal como se usa en la presente, incluye cualquier tipo celular susceptible de transformación, transfección, transducción, y similares, en donde una construcción de ácido nucleico comprende un polinucleótido de la presente invención. odificacións El término "modificación" significa en la presente cualquier modificación química del polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 40 de cualquiera de SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274 además de la manipulación genética del ADN que codifica dicho polipéptido. La(s) modificación (es) puede(n) ser sustitución (es) , eliminación (es) y/o inserción(es) del(os) aminoácido (s) , además del reemplazo de cadena(s) lateral (es) de los aminoácido; o el uso de aminoácidos no naturales con similares características en la secuencia de aminoácidos. En particular, la(s) modificación (es) puede (n) ser amidaciones, tales como la amidación del término C. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Polipéptidos con actividad antimicrobiana En un primer aspecto, la presente invención provee un polipéptido con actividad antimicrobiana que comprende, de preferencia consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad (de preferencia al menos 80% de identidad, con mayor preferencia al menos 85% de identidad, con aún mayor preferencia al menos 90% de identidad, con aún mayor preferencia al menos 95% de identidad, con mayor preferencia 97% de identidad, y en particular 100% de identidad) con los aminoácidos 1 a 40 de la secuencia de aminoácidos (I) : G-X?-G-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X?o-X??- -H-X?2-Xi3-C-Xi4-Xi5-Xi6-Xi7-Xi8-Xi9-X20-G-G-X2?-C-X22-X23-X2 -X25-X26-X27-C-X28-C-X29; en donde Xx = F, L, W o I; de preferencia Xx = F; X2 = N, R, Q, V, G, S, A, K, L, M, D, H o Y; de preferencia X2 = N, R, Q, V, G, S, A, K o Y; con mayor preferencia X2 = N, R, S o G; X3 = G, R, A o K; de preferencia X3 = G; X4 = P, A, L, V, K o R; de preferencia X4 = P, K o R; X5 = W O R; Xe = D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, C, I, R, V o Y; de preferencia X6 = D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, V o Y; con mayor preferencia X6 = D, S, A, G o N; X7 = E, G, A, L, C, Q o S; de preferencia X7 = E, G o S; X8 = D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, W, I, M, A, C o R; de preferencia X8 = D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, W, I, M o R; con mayor preferencia X8 = D, G o N; X9 = D o P; de preferencia X9 = D; Xio = M, R, S, V, A, F, G, L, T, Y, W, E o K; de preferencia X?0 = M, R, S, V, G, Y, L, F, T, W o K; con mayor preferencia X?0 = M, L, G o V; Xn = Q, R, L, F, G, H, S, A, C, I, K, M, P, T, V, W O Y; de preferencia Xu = Q, R, L, F, G, H, S, K o Y; con mayor preferencia Xu = Q, K, R o F; X?2 = N, R, I, Y, V, K, T, Q, S, F, A, W, E o H; con mayor preferencia Xi2 = N, R, V o Q; Xi3 = H, A, F, Q, T, V o L; de preferencia Xi3 = H o ; Xi4 = K, Q o R; de preferencia Xi4 = K o R; X15 = S, A, V, N o F; X?6 = I, L, M, T, W o V; de preferencia Xi6 = I, L o V; Xi7 = K, T o R; X?¡¡ = G, H, K, A, P, F, I, Q, R, S, T, Y O N; de preferencia X?8 = G, H, R, K o N; con mayor preferencia Xi8 = G o R; X?9 = Y, H, K, L, M, N, Q, S, V o R; de preferencia X19 = Y o R; X20 = K, F, H, T, C o R; de preferencia X20 = K o R; X21 = Y, F, R, A, H, L, M, S o W; de preferencia X2i = Y, F, R O W; X22 = A, K, N, Q, T, E, H, I, R, S, V, G O Y; de preferencia X22 = A, K, N, Q, T, S o Y; con mayor preferencia X22 = A, S o T; X23 = K, R o T; de preferencia X23 = K o R; X24 = G, K, Q, E, N, S, T, A o R; de preferencia X24 = G, K, Q, A o R; con mayor preferencia X24 = G o A; X25 = G, K, H, W o R; de preferencia X25 = G, K o R; X26 = F, A, H, I, M, V, W, R o L; de preferencia X26 = F o L; X27 = V, L, M, I, K, Q, R o T; de preferencia X27 = V, L, M o T; con mayor preferencia X27 = V o L; X28 = K, H, N o R; de preferencia X28 = K o R; X29 = Y, I, YRCG o YR; de preferencia X29 = Y o YR; y que tienen menos del 100% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO:l. En una modalidad, el polipéptido de la invención es un polipéptido con actividad antimicrobiana que comprende, de preferencia consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad (de preferencia al menos 80% de identidad, con mayor preferencia al menos 85% de identidad, con aún mayor preferencia al menos 90% de identidad, con aún mayor preferencia al menos 95% de identidad, con mayor preferencia 97% de identidad, y en particular 100% de identidad) con los aminoácidos 1 a 40 de la secuencia de aminoácidos (II) : G-F-G-C-X?_G-X -X3 -X -X5-X6-D-X7_X8-C-H-Xg-X?o-C-X??~S-Xi2-X?3~Xi4-Xi5-Xi6~G-G-Xi7-C-X?8-K-Xi9-Xo-X2i-X22-C-K-C-X23 ; en donde Xi = N, R, Q, V, G, S, A, K o Y; de preferencia Xx = N, R, S o G; X2 = P, K o R; X3 = W o R; X4 = D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, V O Y; de preferencia X = D, S, A, G o N; X5 = E, G O S; Xe = D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, W, I, M O R; de preferencia X6 = D, G o N; X7 = M, R, S, V, G, Y, L, F, T, W o K; de preferencia X7 = M, L, G O V; ?8 = Q, R, L, F, G, H, s, K o Y; de preferencia x8 = Q, K, R O F; X9 = N, R, I, Y, V, K, T, S, Q o H; de preferencia X9 = N, R, V o Q; Xio = H O L; Xii = K o R; Xi2 = I , L o V; Xi3 = K o R ; XX4 = G , H , R, K o N; de preferencia Xi4 = G o R; X15 = Y o R; X?6 = K O R; Xi7 = Y , F , R o W; Xiß = A, K, N, Q , T , S o Y ; de preferencia Xi8 = A, S o T ; X19 = G , K, Q , A o R; de preferencia Xi9 = G o A; X2o = G , K o R; X2? = F o L; X22 = V, L, M o T; de preferencia X22 = V o L; X23 = Y o YR; y que tienen menos del 100% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO:l. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos (I) y/o (II) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 diferencias de aminoácido, comparado con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l. De preferencia 1, 2, 3, 4, 5 o 6; con mayor preferencia 1, 2, 3, 4 o 5; con aún mayor preferencia 1, 2, 3 o 4; con aún mayor preferencia 1, 2 o 3; y con mayor preferencia 1 o 2 aminoácidos son diferentes, comparado con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos (I) y/o (II) tiene al menos 60% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO:l, de preferencia al menos 65% de identidad, al menos 70% de identidad, al menos 75% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad, o al menos 95% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO:l. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos (I) y/o (II) tiene 0, 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, de preferencia 0, 1, 2 o 3 inserciones, con mayor preferencia 0, 1 o 2 inserciones; y 0, 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, de preferencia 0, 1, 2 o 3 eliminaciones, con mayor preferencia 0, 1 o 2 eliminaciones, comparado con SEC ID NO:l o cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274. En otra modalidad, el polipéptido de la invención comprende, de preferencia consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad (de preferencia 70% de identidad, con mayor preferencia 80% de identidad, con aún mayor preferencia 85% de identidad, con aún mayor preferencia 90% de identidad, con aún mayor preferencia 95% de identidad, y con mayor preferencia 100% de identidad) con los aminoácidos 1 a 40 de cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO:225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274, de preferencia cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 117 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 O cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274. Por el término "cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 117" se pretende significar SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 35, SEC ID NO: 36, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO:40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, SEC ID NO:86, SEC ID NO:87, SEC ID NO:88, SEC ID NO:89, SEC ID NO:90, SEC ID NO: 91, SEC ID NO: 92, SEC ID NO: 93, SEC ID NO: 94, SEC ID NO: 95, SEC ID NO: 96, SEC ID NO: 97, SEC ID NO: 98, SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 100, SEC ID NO: 101, SEC ID NO: 102, SEC ID NO: 103, SEC ID NO: 104, SEC ID NO: 105, SEC ID NO: 106, SEC ID NO: 107, SEC ID NO: 108, SEC ID NO: 109, SEC ID NO: 110, SEC ID NO: 111, SEC ID NO: 112 SEC ID NO: 113, SEC ID NO: 114, SEC ID NO: 115, SEC ID NO: 116 O SEC ID NO: 117. Por el término "cualquiera de SEC ID NO: 118 a SEC ID NO 225 se pretende significar cualquiera de SEC ID NO: 118, SEC ID NO: 119, SEC ID NO: 120, SEC ID NO: 121, SEC ID NO: 122, SEC ID NO 123 SEC ID NO: 124, SEC ID NO: 125, SEC ID NO: 126, SEC ID NO 127 SEC ID NO: 128, SEC ID NO: 129, SEC ID NO: 130, SEC ID NO 131 SEC ID NO: 132, SEC ID NO: 133, SEC ID NO: 134, SEC ID NO 135 SEC ID NO: 136, SEC ID NO: 137, SEC ID NO: 138, SEC ID NO 139 SEC ID NO: 140, SEC ID NO: 141, SEC ID NO: 142, SEC ID NO 143 SEC ID NO: 144, SEC ID NO: 145, SEC ID NO: 146, SEC ID NO 147 SEC ID NO: 148, SEC ID NO: 149, SEC ID NO: 150, SEC ID O 151 SEC ID NO: 152, SEC ID NO: 153, SEC ID NO: 154, SEC ID O 155 SEC ID NO: 156, SEC ID NO: 157, SEC ID NO: 158, SEC ID O 159 SEC ID NO: 160, SEC ID NO: 161, SEC ID NO: 162, SEC ID O 163 SEC ID NO: 164, SEC ID NO: 165, SEC ID NO: 166, SEC ID O: 167 SEC ID NO: 168, SEC ID NO: 169, SEC ID NO: 170, SEC ID O: 171 SEC ID NO: 172, SEC ID NO: 173, SEC ID NO: 174, SEC ID O 175 SEC ID NO: 176, SEC ID NO: 177, SEC ID NO: 178, SEC ID O: 179 SEC ID NO: 180, SEC ID NO: 181, SEC ID NO: 182, SEC ID O: 183 SEC ID NO: 184, SEC ID NO: 185, SEC ID NO: 186, SEC ID O: 187 SEC ID NO: 188, SEC ID NO: 189, SEC ID NO: 190, SEC ID O: 191 SEC ID NO: 192, SEC ID NO: 193, SEC ID NO: 194, SEC ID NO: 195, SEC ID NO: 196, SEC ID NO: 197, SEC ID NO: 198, SEC ID NO: 199, SEC ID NO: 200, SEC ID NO: 201, SEC ID NO: 202, SEC ID NO: 203, SEC ID NO: 204, SEC ID NO: 205, SEC ID NO: 206, SEC ID NO:207, SEC ID NO:208, SEC ID NO:209, SEC ID NO: 210, SEC ID NO: 211, SEC ID NO: 212, SEC ID NO: 213, SEC ID NO: 214, SEC ID NO: 215, SEC ID NO: 216, SEC ID NO: 217, SEC ID NO: 218, SEC ID NO: 219, SEC ID NO: 220, SEC ID NO: 221, SEC ID NO: 222, SEC ID NO: 223, SEC ID NO: 224, o SEC ID NO: 225. Por el término "cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251" se pretende significar cualquiera de SEC ID NO: 226, SEC ID NO: 227, SEC ID NO: 228, SEC ID NO: 229, SEC ID NO: 230, SEC ID NO: 231, SEC ID NO: 232, SEC ID NO: 233, SEC ID NO: 234, SEC ID NO: 235, SEC ID NO: 236, SEC ID NO: 237, SEC ID NO: 238, SEC ID NO: 239, SEC ID NO: 240, SEC ID NO: 241, SEC ID NO: 242, SEC ID NO: 243, SEC ID NO: 244, SEC ID NO: 245, SEC ID NO: 246, SEC ID NO:247, SEC ID NO:248, SEC ID NO:249, SEC ID NO:250, o SEC ID NO: 251. Por el término "cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274" se pretende significar cualquiera de SEC ID NO: 252, SEC ID NO: 253, SEC ID NO: 254, SEC ID NO: 255, SEC ID NO: 256, SEC ID NO: 257, SEC ID NO: 258, SEC ID NO: 259, SEC ID NO: 260, SEC ID NO: 261, SEC ID NO: 262, SEC ID NO: 263, SEC ID NO: 264, SEC ID NO: 265, SEC ID NO: 266, SEC ID NO: 267, SEC ID NO: 268, SEC ID NO: 269, SEC ID NO: 270, SEC ID NO: 271, SEC ID NO: 272, SEC ID NO: 273, o SEC ID NO: 274.

Por el término "cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 225" se pretende significar cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 117 o cualquiera de SEC ID NO: 118 a SEC ID NO: 225. Por el término "cualquiera de SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 225" se pretende significar SEC ID NO: 2 o cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 225. Los aminoácidos que componen los polipéptidos de la invención se pueden seleccionar independientemente de las formas D o L. De preferencia, el polipéptido de la invención es un polipéptido de defensina; con mayor preferencia una alfa-defensina, una beta-defensina, o una defensina de insecto (artrópodo) . Los polipéptidos de la invención puede exhibir actividad antimicrobiana más elevada o al menos igual, de preferencia más elevada, comparado con el polipéptido de SEC ID N0:l, determinado como Concentración Inhibitoria Mínima (MIC), contra Stahylococcus carnosus ATCC51365, Stahylococcus aureus ATCC29213 o Stahylococcus aureus ATCC25923 de acuerdo con las pautas NCCLS/CLSI, protocolo M7-A6, vol. 20, No. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. En una modalidad, la presente invención se refiere variantes artificiales que comprenden una sustitución conservadora, eliminación, y/o inserción de uno o más aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274. De preferencia, los cambios de aminoácidos son de naturaleza menor, es decir sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente el plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, generalmente de uno a aproximadamente 10 aminoácidos; pequeñas extensiones aminoterminales o carboxiloterminales, tales como un residuo metionina aminoterminal ; un pequeño péptido ligador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, por ejemplo un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio fijador. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina y histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) , y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácido que no alteran en general la actividad específica son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los cambios que ocurren con mayor frecuencia son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly. Además de los 20 aminoácidos estándar, los aminoácidos no estándar (tales como 4 -hidroxiprolina, 6 -N-metillisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, y alfa-metilserina) pueden sustituir los residuos aminoácido de un polipéptido de tipo silvestre. Una cantidad limitada de aminoácidos no conservadores, aminoácidos no codificados por el código genético, y aminoácidos no naturales pueden sustituir los residuos de aminoácido. Los "aminoácidos no naturales" se modificaron después de la síntesis de proteínas, y/o tienen una estructura química en su(s) cadena (s) lateral (es) diferente de la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales se pueden sintetizar por medios químicos, y de preferencia, están disponibles en el comercio, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidíncarboxílico, dehidroprolina, 3- y 4-metilprolina, y 3 , 3-dimetilprolina. Alternativamente, los cambios de aminoácido son naturaleza tal que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos están alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares. Los aminoácidos esenciales en el polipéptido original se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis con escaneo de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula, y en las moléculas mutantes obtenidas se analiza la actividad biológica ( es decir, actividad antimicrobiana) para identificar residuos de aminoácidos esenciales para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton y otros, 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-4708. También se puede determinar la interacción biológica por el análisis físico de estructura, determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica, o rotulado por fotoafinidad, en conjunción con mutación de los aminoácidos del posible sitio de contacto. Ver, por ejemplo, de Vos y otros, 1992, Science 255: 306-312; Smith y otros, 1992, J. Mol . Biol . 224: 899-904; Wlodaver y otros, 1992, FEBS Lett . 309:59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir del análisis de las identidades con polipéptidos relacionados con un polipéptido de acuerdo con la invención. Se pueden hacer sustituciones únicas o múltiples de aminoácidos y estudiarlas mediante métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o entremezclado, seguido de un procedimiento de detección pertinente, tal como los descritos por by Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a error, presentación de fago (por ejemplo, Lowman y otros, 1991, Biochem. 30:10832-10837; patente de los Estados Unidos N° 5,223,409; WO 92/06204), y mutación dirigida a región (Derbyshire y otros, 1986, Gene 46:145; Ner y Otros, 1988, ADN 7:127). Los métodos de mutagénesis/entremezclado se pueden combinar con métodos de detección automáticos de alto rendimiento, para detectar la actividad de los polipéptidos clonados mutagenizados expresados por las células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y se determina con rapidez su secuencia mediante métodos estándar del arte. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de residuos individuales de aminoácido en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a los polipéptidos de estructura desconocida. La cantidad de sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácido de los aminoácidos 1 a 40 de cualquiera de SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274 es 10, de preferencia 9, con mayor preferencia 8, con mayor preferencia 7, con mayor preferencia como máximo 6, con mayor preferencia como máximo 5, con mayor preferencia 4, con aún mayor preferencia 3, con mayor preferencia 2, y con aún mayor preferencia 1. En otro aspecto, la presente invención provee una variante de un polipéptido antimicrobiano original, en donde el polipéptido antimicrobiano original tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l, en donde la variante tiene actividad antimicrobiana y comprende una sustitución en una o más posiciones, y en donde las sustituciones se seleccionan de: F2L, F2W o F2I; N5R, N5Q, N5V, N5G, N5S, N5A, N5K, N5L, N5M, N5D, N5H o N5Y; G6R, G6A o G6K; P7A, P7L, P7V, P7K O P7R; W8R; D9A, D9G, D9K, D9L, D9T, D9N, D9F, D9H, D9M, D9P, D9Q, D9S, D9C, D9I, D9R, D9V o D9Y; E10G, E10A, E10L, E10C, E10Q O E10S; D11F, D11G, D11N, D11V, D11Y, D11H, D11K, DHL, D11P, D11S, D11T, D11W, Dlll, D11M, D11A, D11C o D11R; D12P; M13R, M13S, M13V, M13A, M13F, M13G, M13L, M13T, M13Y, M13W, M13E o M13K; Q14R, Q14L, Q14F, Q14G, Q14H, Q14S, Q14A, Q14C, Q14I, Q14K, Q14M, Q14P, Q14T, Q14V, Q14W o Q14Y; N17R, N17I, N17Y, N17V, N17K, N17T, N17S, N17Q, N17F, N17A, N17W, N17E o N17H; H18A, H18F, H18Q, H18T, H18V o H18L; K20Q O K20R; S21A, S21V, S21N o S21F; I22L, I22M, I22T, I22W o I22V; K23R o K23T; G24H, G24K, G24A, G24P, G24F, G24I, G24Q, G24R, G24S, G24T, G24Y O G24N; Y25H, Y25K, Y25L, Y25M, Y25N, Y25Q, Y25S, Y25V o Y25R; K26F, K26H, K26T, K26C O K26R; Y29F, Y29R, Y29A, Y29H, Y29L, Y29M, Y29S O Y29W; A31K, A31N, A31Q, A31T, A31E, A31H, A31I, A31R, A31S, A31V, A31G o A31Y; K32R o K32T; G33K, G33Q, G33E, G33N, G33S, G33T, G33A o G33R; G34K, G34H, G34W o G34R; F35A, F35H, F35I, F35M, F35V, F35W, F35R o F35L; V36L, V36M, V36I, V36K, V36Q, V36R o V36T; K38H, K38N o K38R; and Y40I, Y40YRCG O Y40YR. De preferencia, el polipéptido antimicrobiano original tiene al menos 70% de identidad, con mayor preferencia al menos 80% de identidad, con aún mayor preferencia al menos 90% de identidad, y con mayor preferencia 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l. En particular, el polipéptido antimicrobiano original puede ser idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l. En una modalidad, el polipéptido antimicrobiano original es un polipéptido de defensina; con mayor preferencia una alfa defensina, una beta defensina, o una defensina de insecto (artrópodo) . De preferencia, la secuencia de aminoácidos original exhibe actividad antimicrobiana. En otra modalidad, el polipéptido antimicrobiano original tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 diferencias de aminoácido comparado con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l. De preferencia 1, 2, 3, 4, 5 o 6; con mayor preferencia 1, 2, 3, 4 o 5; con aún mayor preferencia 1, 2, 3 o 4; con aún mayor preferencia 1, 2 o 3 ; y con mayor preferencia 1 o 2 aminoácidos son diferentes, comparado con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l. Extensión N-terminal Una extensión N-terminal de los polipéptidos de la invención pueden consistir en forma adecuada de 1 a 50 aminoácidos, de preferencia 2-20 aminoácidos, especialmente 3-15 aminoácidos. En una modalidad, la extensión del péptido N-terminal no contiene un Arg (R) . En otra modalidad, la extensión N-terminal comprende un sitio de escisión kex2 o símil kex2 tal como se define más adelante. En una modalidad de preferencia, la extensión N-terminal es un péptido, que comprende al menos dos residuos de aminoácido Glu (E) y/o Asp (D) , tales como una extensión N-terminal que comprende una de las siguientes secuencias: EAE, EE, DE y DD. Sitios Kex2 Los sitios Kex2 (ver, por ejemplo, Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") y los sitios símil kex2 son sitios de reconocimiento dibásico (es decir, sitios de escisión) hallados entre la región que codifica el propéptido y la región madura de algunas proteínas . La inserción de un sitio kex2 o un sitio símil kex2 demostró en ciertos casos mejorar el correcto procesamiento de la endopeptidasa en el sitio de escisión del propéptido, lo cual da como resultado un aumento de los niveles de secreción proteica. En el contexto de la invención, la inserción de un sitio kex2 o un sitio símil kex2 da por resultado en la posibilidad de obtener la escisión en cierta posición en la extensión N-terminal que da por resultado un polipéptido antimicrobiano extendido en comparación con los aminoácidos 1 a 40 de cualquiera de SEC ID NO:2 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274. Polipéptidos fusionados Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión escindibles en los cuales otro polipéptido se fusiona en el N-terminal o el C-terminal del polipéptido de la invención o uno de sus fragmentos. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de una secuencia de nucleótidos (o una de sus porciones) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una de sus porciones) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidos en la técnica, e incluyen la ligadura de las secuencias codificadoras que codifican los polipéptidos de manera que están en marco, y que la expresión del polipéptido fusionado está bajo el control del (os) mismo (s) promotor (es) y terminador. Fuentes de polipéptidos con actividad antimicrobiana Un polipéptido de la presente invención se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. A los fines de la presente invención, el término "obtenido a partir de" , tal como se usa en la presente en conexión con determinada fuente significa que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos se producida por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado la secuencia de nucleótidos de la fuente. En un aspecto de preferencia, el polipéptido obtenido a partir de determinada fuente se secreta al espacio extracelular. Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido de bacterias grampositivas tales como un polipéptido de Bacillus, por ejemplo, un polipéptido de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis; o un polipéptido de Streptomyces, por ejemplo, un polipéptido de Streptomyces lividans o Streptomyces murinus,- o un polipéptido de bacterias gramnegativas, por ejemplo, un polipéptido de E. coli o de Pseudomonas sp.. Un polipéptido de la presente invención también puede ser un polipéptido fúngico, y con mayor preferencia un polipéptido de levadura tal como polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia; o con mayor preferencia un polipéptido fúngico filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureobas idium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma. En un aspecto de preferencia, el polipéptido es un?, polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces ovif ormis con actividad antimicrobiana. En otro aspecto de preferencia, el polipéptido es un polipéptido de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori , Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei , Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei , o Trichoderma viride . Se debe entender que para las especies antes mencionadas, la invención abarca los estados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonímicos, por ejemplo, anamorfos, sin considerar el nombre de las especies por el cual se las conoce . Los expertos en la técnica reconocerán con facilidad la identidad de los equivalentes adecuados. Las cepas de estas especies son de fácil acceso para el público en varias colecciones de cultivos, tales como American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión escindibles en los cuales otro polipéptido se fusiona en el N-terminal o el C-terminal del polipéptido o su fragmento. Se produce un polipéptido fusionado al fusionar una secuencia de nucleótidos (o una de sus porciones) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una de sus porciones) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidos en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificadoras que codifican los polipéptidos, de manera que estén en marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control del (os) mismo(s) promotor (es) y terminador. Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. En particular, la presente invención se refiere a polinucleótidos que consisten en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. Debido a la degeneración del código genético, el experto en la técnica reconocerá con facilidad que se pueden preparar varias secuencias de nucleótidos que codifican cada uno de los polipéptidos de la invención. Son bien conocidos en la técnica los nucleótidos que conforman los codones que codifican los aminoácidos de los polipéptidos de la invención. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican fragmentos de la secuencia de aminoácidos mostrada como cualquiera de SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 O cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274 que tienen actividad antimicrobiana. Una subsecuencia de los polinucleótidos es una secuencia de nucleótidos en donde se han eliminado uno o más nucleótidos del extremo 5 ' y/o 3 ' . La secuencia de nucleótidos se puede obtener por técnicas de clonación estándar usadas en ingeniería genética para reubicar la secuencia de nucleótidos desde una ubicación hasta un sitio diferente, donde es reproducido. Los procedimientos de clonación pueden incluir escisión y aislamiento de un fragmento deseado que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en un módulo vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped, donde se replican múltiples copias o clones de la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquiera de sus combinaciones. La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de un polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución, eliminación y/o inserción, comparado con los aminoácidos 1 a 40 de cualquiera de SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274. Estas variantes artificiales pueden diferir en una forma de ingeniería respecto del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo, o similares. Será evidente para los expertos en la técnica que dichas sustituciones se pueden hacer fuera de las regiones esenciales para la función de la molécula y aún así producen un polipéptido activo. Los residuos de aminoácido esenciales para la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención, y en consecuencia de preferencia no sujeto a sustitución, se puede identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis de escaneo de alanina (ver, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica se introducen mutaciones en todos los residuos con carga positiva de la molécula, y en las moléculas mutantes obtenidas se estudia la actividad antimicrobiana para identificar residuos de aminoácido que son esenciales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción también se pueden determinar por análisis de la estructura tridimensional, determinada por técnicas tales como análisis de resonancia nuclear magnética, cristalografía o rotulado por fotoafinidad (ver, por ejemplo, de Vos y otros, 1992, Science 255: 306-312; Smith y otros, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver y otros, 1992, FEBS Letters 309: 59-64). Además, se puede modificar la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención por introducción de sustituciones de nucleótido que no dan origen a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponde al uso del codón del organismo huésped pretendido para la producción del polipéptido antimicrobiano. Construcciones de ácido nucleico La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención ligado operativamente a una o más secuencias control que dirigen la expresión de la secuencia codificadora en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias control. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención se puede manipular de diversas maneras, a fin de proveer la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria según el vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son bien conocidos en la técnica. La secuencia de control puede ser una secuencia promotora adecuada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped por la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene secuencias control de transcripción que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad de transcripción en la célula huésped de elección, e incluyen promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos de la célula huésped. Son ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de construcciones del ácido nucleico de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, los promotores obtenidos del operón lac de E. coli , el gen de agarasa de Streptomyces coelicolor ( dagA) , el gen de levansacarasa de Bacillus subtilis (sacB) , el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , el gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus ( amyM) , el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens ( amyQ) , el gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , los genes de Bacillus subtilis xylA y xylB, y el gen de beta-lactamasda procarionte (Villa-Kamaroff y otros, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), además del promotor tac (DeBoer y otros, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook y otros, 1989, supra . Son ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de construcciones del ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa los promotores obtenidos de los genes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa amilasa ácidoestable Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA) , lipasa de Rhizomucor miehei , proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosafosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900) , proteasa símil tripsina de Fusarium oxisporum (WO 96/00787) , beta-glucosidasa de Trichoderma reesei , celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei , endoglucanasa II de Trichoderma reesei , endoglucanasa III de Trichoderma reesei , endoglucanasa IV de Trichoderma reesei , endoglucanasa V de Trichoderma reesei , xilanasa I de Trichoderma reesei , xilanasa II de Trichoderma reesei , beta-xilosidasa de Trichoderma reesei , además del promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores proveniente de los genes de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosafosfatoisomerasa de Aspergillus oryzae) ; y sus promotores mutantes, truncados, e híbridos . En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GALl) , alcoholdeshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) , triosafosfatoisomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPl) , metalotionina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) , y 3-fosfogliceratoquinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para las células huésped de levadura se describen en Romanos y otros, 1992, Yeast 8: 423-488. La secuencia de control también puede ser una secuencia terminador de transcripción adecuada, a secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminador está ligada operativamente al 3' terminal de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. En la presente invención se puede usar cualquier terminador funcional en la célula huésped de elección.

Los terminadores de preferencia para células huésped fúngicas filamentosas s obtienen de los genes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilatosintetasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa símil tripsina de Fusarium oxisporum. Los terminadores de preferencia para células huésped de levaduras se obtienen de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae, de citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) , y gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células huésped de levaduras se describen en Romanos y otros, 1992, supra . La secuencia de control también puede ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm de importancia para la traducción por la célula huésped. La secuencia guía está ligada operativamente al 5' terminal de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia guía funcional en la célula huésped de elección se puede usar en la presente invención. Las guías de preferencia para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA y triosafosfatoisomerasa de Aspergillus nidulans . Las guías adecuadas para células huésped de levaduras se obtienen de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3-fosfogliceratoquinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, y alcoholdeshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) . La secuencia de control también puede ser una secuencia poliadenilación, una secuencia ligada operativamente al 3' terminal de la secuencia de nucleótidos, la cual cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcripto. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación funcional en la célula huésped de elección de la presente invención. Las secuencias de poliadenilación de preferencia de células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilatosintetasa de Aspergillus nidulans, proteasa símil tripsina de Fusarium oxisporum, y alfaglucosidasa de Aspergillus niger. Las secuencias de poliadenilación útiles para las células huésped de levaduras se describen en Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. La secuencia de control también puede ser una región codificadora de péptido de señal que codifica una secuencia de aminoácidos ligada al amino terminal de un polipéptido y que dirige el polipéptido codificado por la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificadora de la secuencia de nucleótidos puede inherentemente contener una región codificadora de péptido de señal ligada naturalmente en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la región codificadora que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificadora puede contener una región codificadora de péptido de señal que es extraña a la secuencia codificadora. La región codificadora de péptido de señal extraña puede ser requerida cuando la secuencia codificadora no contiene naturalmente una región codificadora de péptido de señal. Alternativamente, la región codificadora de péptido de señal extraña puede simplemente reemplazar la región codificadora de péptido de señal natural a fin de aumentar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier región codificadora de péptido de señal que dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de una célula huésped de elección se puede usar en la presente invención. Las regiones codificadoras de péptido de señal efectivas para células huésped bacterianas son las regiones codificadoras de péptido de señal obtenidas de los genes de amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus , subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) , y prsA de Bacillus subtilis . Otros péptidos señal se describen en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. Las regiones codificadoras de péptido de señal efectivas para células huésped fúngicas filamentosas son las regiones codificadoras de péptido de señal obtenidas de los genes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, asparticoproteinasa de Rhizomucor miehei , celulasa de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa . Los péptidos señal de utilidad para células huésped de levaduras se obtienen de los genes de factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras regiones codificadoras de péptido de señal útiles se describen en Romanos y otros, 1992, supra . La secuencia de control también puede ser una región codificadora de propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos ubicada en el amino terminal de un polipéptido. El polipéptido obtenido se conoce como proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Generalmente, el propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido maduro activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La región codificadora del propéptido se puede obtener de los genes de proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT) , factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, asparticoproteinasa de Rhizomucor miehei , y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) . Cuando las regiones de péptido de señal y de propéptido están presentes en el amino terminal de un polipéptido, la región de propéptido se ubica a continuación del amino terminal de un polipéptido y la región del péptido de señal se ubica a continuación del amino terminal de la región del propéptido. También puede ser conveniente agregar secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido respecto del crecimiento de la célula huésped. Son ejemplos de sistemas reguladores los que hacen que se active o se inactive la expresión del gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluso la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores de los sistemas procariontes incluyen los sistemas operadores lac, tac, y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GALl. En hongos filamentosos se pueden usar el promotor de alfa-amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificación del gen. En sistemas eucariontes, estos incluyen el gen de dihidrofolatoreductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína en genes que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido debería estar ligado operativamente con la secuencia reguladora. Vectores de expresión La presente invención también se refiere a vectores recombinantes de expresión que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de detención de transcripción y de traducción. Los diversos ácidos nucleicos y secuencias control antes descritos se pueden unir para producir un vector recombinante de expresión que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en dichos sitios. Alternativamente, una secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede expresar por inserción de la secuencia de nucleótidos o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector adecuado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificadora se ubica en el vector de manera tal que la secuencia codificadora está ligado operativamente con las adecuadas secuencias control de la expresión. El vector recombinante de expresión puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o un virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueden llevar a cabo la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector generalmente depende de la compatibilidad el vector con la célula huésped en la que se introduce el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados . El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, al ser introducido en la célula huésped, se integra al genoma y es replicado junto con el (os) cromosoma (s) con los cuales se integró. Además, se puede usar un vector o plásmido único, o dos o más vectores o plásmidos que en conjunto contienen el total de ADN que se introduce en el genoma de la célula huésped, o un transposón. Los vectores de la presente invención de preferencia contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto provee resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similares. Son ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos los genes dai de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis , o los marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, canamicina, cloranfenicol, o tetraciclinas. Los marcadores seleccionables para células huésped de levaduras son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para usar en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, sin limitaciones, amdS (acetamidasa) , argB (ornitinacarbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricinaacetiltransferasa) , hph (higromicinafosfotransferasa) , niaD (nitratorreductasa) , pyrG (orotidina-5' -fosfatodescarboxilasa) , sC (sulfatoadeniItransferasa) , y trpC (antranilatosintetasa) , además de sus equivalentes. Se prefiere el uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus . Los vectores de la presente invención de preferencia contienen un elemento (s) que permitan la integración del vector en el genoma de célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula, con independencia del genoma. Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración al genoma por recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa al genoma de la célula huésped en una ubicación precisa en el cromosoma. A fin de aumentar la probabilidad de la integración en una ubicación precisa, de preferencia, los elementos de integración deben contener suficiente cantidad de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10,000 pares de bases, de preferencia 400 a 10,000 pares de bases, y con mayor preferencia 800 a 10,000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la correspondiente secuencia blanco, para aumentar la probabilidad de la recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia homologa con la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos codificadoras o no codificadoras. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homologa. Para la replicación autónoma, el vector también puede comprender un origen de replicación que permita al vector su replicación autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier plásmido replicador que medie la replicación autónoma funcional en una célula. El término "origen de replicación" o "plásmido replicador" se define en la presente como una secuencia de nucleótidos que permite la replicación de un plásmido o vector in vivo. Son ejemplos de orígenes de replicación bacterianos los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli , y pUBUO, pE194, pTA1060, y pAMßl que permiten la replicación en Bacillus. Son ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula huésped de levadura el origen de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 , y la combinación de ARS4 y CEN6. Son ejemplos de orígenes de replicación de utilidad en una célula fúngica filamentosa AMA1 y ANSÍ (Gems y otros, 1991, Gene 98:61-67; Cullen y otros, 1987, Nucleic Acid Research 15: 9163-9175; WO 00/24883) . Se puede lograr el aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883. Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula huésped, a fin de aumentar la producción del producto génico. Se puede lograr un aumento de la cantidad de copias del polinucleótido al integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o al incluir un gen de marcador seleccionable amplificable en el polinucleótido, en donde se pueden seleccionar las células que contienen copias amplificadas del gen de marcador seleccionable, y en consecuencia copias adicionales del polinucleótido, por cultivo de las células en presencia del adecuado agente de selección. Los procedimientos usados para ligar los elementos antes descritos para la construcción de los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y otros, 1989, supra) . Células huésped La presente invención también se refiere células huésped recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que se usan con ventaja en la producción recombinante de los polipéptidos . Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped, de manera tal que el vector se mantiene como integrante del cromosoma o como vector autoreplicante extracromosómico, como ya se describió con anterioridad. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurrieron durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su origen. La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procarionte, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucarionte. Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como las bacteria grampositivas que incluyen, sin limitaciones, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii , Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o una bacteria gramnegativa tal como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto de preferencia, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o Bacillus subtilis . En otro aspecto de preferencia, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico. La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana se puede realizar, por ejemplo, por transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), mediante el uso de células competentes (ver, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) . La célula huésped también puede ser una eucariota, por ejemplo una célula de mamífero, insecto, planta, u hongo. En un aspecto de preferencia, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongo", tal como se usa en la presente incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (definidos por Hawksworth y otros, En, Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi , 8° edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) además de Oomycota (citado en Hawksworth y otros, 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth y otros, 1995, supra) . En un aspecto de mayor preferencia, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura", tal como se usa en la presente, incluye levaduras ascoesporógenas (Endomycetales) , levaduras basidioesporógenas, y levaduras pertenecientes a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes) . Dado que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, a los fines de la presente invención, se define levadura tal como se describe en Biology and Activi ties of Yeast (Skinner, F.A. , Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc . App. Bacteriol . Symposium Series No. 9, 1980) . En un aspecto de mayor preferencia, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia . En un aspecto de mayor preferencia, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces ovif ormis . En otro aspecto de mayor preferencia, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis . En otro aspecto de aún mayor preferencia, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolitica . En otro aspecto de mayor preferencia, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongo filamentoso" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (definido por Hawksworth y otros, 1995, supra) . Los hongos filamentosos se caracterizan en general por tener una pared de micelio compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo ocurre por elongación de las hifas y el catabolismo del carbono es obligadamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae ocurre por gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo. En un aspecto de aún mayor preferencia, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobas idium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Fanerochaete , Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus , Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma . En un aspecto de aún mayor preferencia, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori , Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae . En un aspecto de aún mayor preferencia, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sa bucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En un aspecto de aún mayor preferencia, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de una cepa de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, o Ceriporiopsis subvermi spora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei , Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Fanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii , Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride . Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que incluye la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se . Los procedimientos adecuados para la transformación de las células huésped de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238 023 y Yelton y otros, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos para transformar las especies de Fusarium se describen en Malardier y otros, 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada mediante los procedimientos descritos por Becker y Guarente, En Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito y otros, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen y otros, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Métodos de producción La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula, que en su tipo silvestre tiene capacidad para producir el polipéptido, en condiciones conducentes a la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido. La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula huésped en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en frasco de agitación, y fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluso fermentaciones continua, por lotes, por lote de alimentación, o por estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales, realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permiten la expresión y/o el aislamiento del polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno, y sales inorgánicas, mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales, o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de American Type Culture Collection) . Si el polipéptido se secreta al medio nutriente, se puede recuperar el polipéptido directamente del medio. Si no se secreta el polipéptido, se puede recuperar de los lisados celulares. Los polipéptidos se pueden detectar mediante métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos. Por ejemplo, se puede usar un ensayo de actividad antimicrobiana para determinar la actividad del polipéptido tal como se describe en la presente. El polipéptido obtenido se puede recuperar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutriente mediante procedimientos convencionales, incluso, sin limitaciones, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por diversos procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, sin limitaciones, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico, cromatofocalización, y exclusión por tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo, focalización isoeléctrica de preparación) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación por sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, J . -C . Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) . Plantas La presente invención también se refiere a una planta, parte de planta, o célula de planta transgénica que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad antimicrobiana de la presente invención a fin de expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante se puede usar como tal para mejorar la calidad de un alimento o nutriente, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, la palatabilidad, y las propiedades reológicas, o destruir un factor antinutricional . La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicotiledónea) o monocotiledónea (una monocotiledónea) . Los ejemplos de plantas monocotiledóneas son pastos, tales como césped (hierba azul, Poa) , pasto forrajero tal como Festuca, Lolium, pasto templado tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, legumbres, tales como lupines, papa, remolacha azucarera, guisante, fríjol y fríjol de soya, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, semillas de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana . Los ejemplos de partes de plantas son tallos, callos, hojas, raíz, frutas, semillas y tubérculos, además de cada uno de los tej idos que comprenden dichas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. También se consideran partes de planta los compartimientos celulares específicos de las plantas, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma. Además, se considera parte de planta cualquier célula vegetal, cualquiera sea el origen del tejido. De modo similar, también se consideran partes de planta las partes de planta tales como tejidos y células específicas aisladas para facilitar la utilización de la invención, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y cubiertas de semilla. También se incluye en el alcance de la presente invención la progenie de dichas plantas, partes de planta, y células de planta. La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En suma, la planta o célula vegetal se construye por incorporación de una o más construcciones de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma de la planta huésped y propagar la planta o célula vegetal modificada obtenida en una planta o célula vegetal transgénica. La construcción de expresión es convenientemente una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención ligado operativamente con adecuadas secuencias reguladoras requeridas para la expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o parte de la planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador seleccionable de utilidad para identificar células huésped en las cuales se ha integrado la construcción de expresión, y las secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción en la planta en cuestión (esto último depende del método para introducir el ADN usado) . La selección de secuencias reguladoras, tales como las secuencias promotora y terminador y opcionalmente las secuencias señal o de tránsito se determinan, por ejemplo, sobre la base de cuándo, dónde y cómo se desea expresar el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica de desarrollo, de etapa o de tejido, y el producto génico puede ser dirigido a un tejido específico o parte de planta, tales como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Tague y otros, 1988, Plant Physiology 86: 506. Para la expresión constitutiva, se pueden usar los promotores 35S-CaMV, ubiquitina 1 de maíz, y actina 1 de arroz (Franck y otros, 1980, Cell 21: 285-294, Christensen y otros, 1992, Plant Mo . Biol . 18: 675-689; Zhang y otros, 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor proveniente de tejidos de depósitos de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de papa y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. .Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos de depósitos metabólicos tales como meristemas (Ito y otros, 1994, Plant Mol . Biol . 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina de arroz (Wu y otros, 1998, Plant y Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba proveniente de legumina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido proveniente de Vicia faba (Conrad y otros, 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor proveniente de una proteína corporal de aceite de semilla (Chen y otros, 1998, Plant y Cell Physiology 39: 935-941) , el promotor de proteína de depósito napA proveniente de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka y otros, 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), el promotor de gen de adeninametiltransferasa de virus clorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor de gen aldP proveniente de arroz (Kagaya y otros, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible por heridas tal como el promotor de papa pin2 (Xu y otros, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). De modo similar, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía, o alteraciones de salinidad o inducido por sustancias de aplicación exógena que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico, y ácido giberélico, y metales pesados. Un elemento potenciador del promotor también se puede usar para lograr mayor expresión de un polipéptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un intrón que se ubica entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu y otros, 1993, supra, describe el uso del primer intrón del gen actina 1 de arroz para aumentar la expresión. El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte de la construcción de expresión se pueden elegir entre los disponibles en la técnica. La construcción de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluso transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser y otros, 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto y otros, 1989, Nature 338: 274). En la actualidad, la transferencia génica mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, ver Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y también se puede usar para transformar monocotiledóneas, si bien a menudo se usan otros métodos de transformación para estas plantas. En la actualidad, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo con partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformante) a los callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vasil y otros, 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos tal como se describe en Omirulleh y otros, 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428. Después de la transformación, los transformantes que incorporaron la construcción de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. A menudo se designa el procedimiento de transformación para la eliminación selectiva de genes de selección durante la regeneración o en las siguientes generaciones a través del uso, por ejemplo, de cotransformación con dos construcciones ADN-T diferentes o el corte específico del gen de selección mediante una recombinasa específica. La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad antimicrobiana de la presente invención en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden un polipéptido de la presente invención. De preferencia, las composiciones están enriquecidas en dicho polipéptido. El término "enriquecido" indica que ha aumentado la actividad antimicrobiana de la composición, por ejemplo, en un factor de enriquecimiento de 1,1. Las composiciones también pueden comprender otro agente farmacéuticamente activo, tal como un agente biocida o bioestático adicional, por ejemplo otro polipéptido antimicrobiano que exhibe actividad antimicrobiana tal como se definió con anterioridad. El agente biocida puede ser un antibiótico, como los conocidos en la técnica. Las clases de antibióticos incluyen penicilinas, por ejemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de betalactamasa, cefalosporinas, por ejemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenems ; monobactams; aminoglucósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. El agente biocida may puede ser un agente antimicótico, incluso polienos, por ejemplo, anfotericina, nistatina; 5-flucosina; y azoles, por ejemplo, miconazol, cetoconazol, itraconazol y fluconazol. En una modalidad, el agente biocida es un agente químico no enzimático. En otra modalidad, el agente biocida es un agente químico no polipeptídico. Las composiciones pueden comprender un adecuado material portador. Las composiciones también pueden comprender un adecuado vehículo de provisión capaz de proveer los polipéptidos antimicrobianos de la invención al sitio deseado cuando se usan las composiciones como medicamento. Las composiciones de polipéptido se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en la forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en la forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido incluido en la composición se puede estabilizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Más adelante se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosis de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones de uso de la composición pueden ser determinadas sobre la base de métodos conocidos en la técnica. Métodos y usos La presente invención también está dirigida a métodos para el uso de los polipéptidos con actividad antimicrobiana. Los polipéptidos antimicrobianos generalmente son útiles en cualquier sitio sometido a contaminación por bacterias, hongos, levaduras o algas. En general, los sitios están en sistemas acuosos tales como sistemas de agua refrigerante, agua de enjuague de lavandería, sistemas oleosos tales como aceites de corte, lubricantes, campos de petróleo y similares, en donde se deben aniquilar los microorganismos o cuando es necesario controlar su desarrollo. Sin embargo, la presente invención también se puede usar en todas las aplicaciones para las cuales son útiles las composiciones antimicrobianas conocidas, tales como la protección de lana, látex, adhesivo, pegamento, papel, cartón, textiles, cuero, plásticos, calafateados, y alimentos. Otros usos incluyen la conservación de alimentos, bebidas, cosméticos tales como lociones, cremas, geles, ungüentos, jabones, champús, acondicionadores, antitranspirantes, desodorantes, enjuagues bucales, productos para lentes de contacto, formulaciones enzimáticas, o ingredientes alimenticios. En consecuencia, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser útiles como desinfectantes, por ejemplo, en el tratamiento de infecciones oculares y bucales, infecciones de la piel; en antitranspirantes o desodorantes; para la limpieza y desinfección de lentes de contacto y dientes (cuidado oral) . En general se considera que los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención son útiles para limpiar, desinfectar o inhibir el desarrollo microbiano en cualquier superficie. Los ejemplos de superficies que se pueden poner en contacto con ventaja con los polipéptidos antimicrobianos de la invención son superficies de equipamientos de procesos usados por ejemplo, en plantas de procesamiento de productos lácteos, químicos o farmacéuticos, sistemas sanitarios de agua, plantas de procesamiento de aceite, plantas de procesamiento de pulpa de papel, plantas de tratamiento de agua, y torres de refrigeración. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención se deberían usa en una cantidad efectiva para limpiar, desinfectar o inhibir el desarrollo microbiano en la superficie en cuestión. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención también se pueden usar para limpiar las superficies y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimentos y en cualquier superficie de preparación o provisión de alimentos, tales como hospitales, instituciones geriátricas y restaurantes. También se puede usar como agente conservador o como agente de desinfección en pinturas con base acuosa. La invención también se refiere al uso de un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención como medicamento. Además, también se puede usar un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención para la fabricación de un medicamento para controlar o combatir microorganismos tales como organismos fúngicos o bacterias, de preferencia bacterias grampositivos. La composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención se pueden usar como agentes antimicrobiano veterinario o terapéutico o preventivo humano. En consecuencia, la composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención se pueden usar en la preparación de agentes terapéuticos o preventivos veterinarios o humanos para el tratamiento de infecciones microbianas, tales como infecciones bacterianas o fúngicas, de preferencia infecciones bacterianas grampositivas. En particular, las infecciones microbianas se pueden asociar con enfermedades pulmonares que incluyen, sin limitaciones, tuberculosis, neumonía y fibrosis quística; y enfermedades de transmisión sexual que incluyen sin limitaciones, gonorrea y clamidia. La composición de la invención comprende una cantidad efectiva del polipéptido antimicrobiano de la invención. El término "cantidad efectiva", cuando se usa en la presente, pretende significar una cantidad de los polipéptidos antimicrobianos de la invención suficiente para inhibir el desarrollo de los microorganismos en cuestión. La invención también se refiere a composiciones o productos para la curación de heridas tales como vendajes, dispositivos médicos tales como, por ejemplo, catéteres y también a productos anticaspa para el cabello, por ejemplo champús . Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención se administran a un huésped que padece o está predispuesto a una infección microbiana. La administración puede ser tópica, localizada o sistémica, según el microorganismo específico, de preferencia será localizado. Por lo general, la dosis de los polipéptidos antimicrobianos de la invención serán suficientes para reducir la población microbiana en al menos aproximadamente 50%, generalmente en al menos 1 log, y puede ser en 2 o más log de eliminación. Los compuestos de la presente invención se administran en una dosis que reduce la población microbiana a la vez que minimiza los efectos secundarios. Se contempla que composición se obtiene y usa con la guía de un médico para su uso in vivo. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención son particularmente útiles para eliminar bacterias gramnegativas, incluso Pseudomonas aeruginosa, y Chlamydia trachomatis; y bacterias grampositivas, incluso estreptococos tales como Streptococcus pneumonía, S. uberis, S. hyointestinalis, S. pyogenes y S. agalactiae; y estafilococos tales como Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus y S. carnosus . Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención se pueden administrar a un huésped que padece o está predispuesto a una infección pulmonar microbiana, por ejemplo neumonía; o a la infección microbiana de una herida, por ejemplo una infección bacteriana de una herida. Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención se pueden administrar a un huésped que padece o está predispuesto a una infección cutánea, por ejemplo acné, dermatitis atópica o dermatitis seborreica; de preferencia la infección cutánea es una infección cutánea bacteriana, por ejemplo, causada por Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnés, Pi tyrosporum ovale o Malassezia fúrfur. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención también son útiles para formulaciones in vitro para aniquilar microbios, particularmente cuando no se desea introducir cantidades de antibióticos convencionales. Por ejemplo, los polipéptidos antimicrobianos de la invención se pueden agregar a preparaciones de alimentos para animales y/o humanos; o se pueden incluir como aditivo de cultivos in vitro de células, a fin de prevenir el desarrollo excesivo de microbios en cultivos tisulares.

La susceptibilidad de un microbio particular para ser eliminado mediante los polipéptidos antimicrobianos de la invención se puede determinar mediante pruebas in vitro, tal como se detalla en la sección experimental. En general, un cultivo del microbio se combina con el polipéptido antimicrobiano en concentraciones variables durante un periodo suficiente para permitir la acción de la proteína, por lo general entre aproximadamente una hora y un día. Luego se cuentan los microbios viables, y se determina el nivel de eliminación. Los microbios de interés incluyen, sin limitaciones, bacterias gramnegativas, por ejemplo: Citrobacter sp. ; Enterobacter sp. ; Escherichia sp. , por ejemplo, E. coli; Klebsiella sp. ; Morganella sp. ; Proteus sp. ; Providencia sp. ; Salmonella sp. , por ejemplo, S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp. ; Shigella sp. ; Pseudomonas sp. , por ejemplo, P. aeruginosa; Yersinia sp. , por ejemplo, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis , Y. enterocolitica; Franciscella sp. ; Pasturella sp. ; Vibrio sp. , por ejemplo, V. cholerae, V. parahemolyticus ; Campylobacter sp. , por ejemplo, C. jejuni; Haemophilus sp. , por ejemplo, H. influenzae, H. ducreyi ; Bordetella sp. , por ejemplo, B. pertussis, B. bronchiseptica , B. parapertussis ; Brucella sp. , Neisseria sp. , por ejemplo, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, etc. Other bacteria of interest include Legionella sp. , por ejemplo, L. pneumophila; Listeria sp. , por ejemplo, L. monocytogenes; Mycoplasma sp. , por ejemplo, M. hominis, M. pneumoniae ; Mycobacterium sp. , por ejemplo, M. tuberculosis, M. leprae; Treponema sp. , por ejemplo, T. pallidum; Borrelia sp. , por ejemplo, B. burgdorferi; Leptospirae sp. ; Rickettsia sp. , por ejemplo, R. rickettsii , R . typhi ; Chlamydia sp. , por ejemplo, C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psi ttaci ; Helicobacter sp . , por ejemplo, H. pylori , etc. Los patógenos no bacterianos de interés incluyen patógenos fúngicos y protozoos, por ejemplo, Plasmodia sp. , por ejemplo, P. falciparum, Trypanosoma sp. , por ejemplo, T. brucei ; shistosomes; Entaemoeba sp. , Cryptococcus sp. , Candida sp. , por ejemplo, C. albicans; etc . Se pueden emplear diversos métodos de administración. La formulación del polipéptido se puede dar por vía oral, o se puede inyectar por vía intravascular, subcutánea, peritoneal, por aerosol, por vía oftálmica, intravesical, tópica, etc. Por ejemplo, son bien conocidos en la técnica los métodos de administración por inhalación. La dosis de la formulación terapéutica tiene amplia variación, según el polipéptido antimicrobiano específico a administrar, la naturaleza de la enfermedad, la frecuencia de la administración, la forma de administración, la depuración del agente del huésped, y similares. La dosis inicial puede ser mayor, seguida de dosis de mantenimiento menores. La dosis se puede administrar incluso con la baja frecuencia de una vez por semana o cada dos semanas, o se fracciona en dosis menores y se administra una o varias veces por día, dos veces por semana, etc. para mantener un nivel de dosificación efectiva. En muchos casos, la administración oral requerirá una dosis mayor que la administrada por vía intravenosa. Los enlaces amida, además de los terminales amino y carboxilo, se pueden modificar a una mayor estabilidad con la administración oral. Por ejemplo, se puede amidar el terminal carboxilo. Formulaciones Los compuestos de la presente invención se pueden incorporar en diversas formulaciones para la administración terapéutica. Más particularmente, los compuestos de la presente invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas por combinación con portadores o diluyentes adecuados farmacéuticamente aceptables, y se pueden formular en preparaciones en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, granulos, ungüentos, cremas, espumas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas, lociones, y aerosoles. Como tales, se puede lograr la administración de los compuestos de diversas maneras, incluso administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, etc. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser sistémicos, después de la administración o se pueden ubicar mediante el uso de un implante u otra formulación que actúe para retener la dosis activa en el sitio de implantación. En una modalidad, una formulación para uso tópico comprende un agente quelante que disminuye la concentración efectiva de cationes divalentes, particularmente calcio y magnesio. Por ejemplo, se pueden incluir agentes tales como citrato, EGTA o EDTA, en donde se prefiere citrato. La concentración de citrato generalmente es de aproximadamente 1 a 10 mM. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar solos, en combinación entre sí, o se pueden usar en combinación con otros compuestos conocidos (por ejemplo, perforina, agentes antiinflamatorios, antibióticos, etc. ) . En las formas de dosificación farmacéutica, los compuestos se pueden administrara en la forma de sus sales farmacéuticamente aceptables. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ejemplificativos y de ninguna manera son limitantes. En las preparaciones orales, los compuestos se pueden usar solos o en combinación con aditivos adecuados para preparar comprimidos, polvos, granulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de papa; con ligadores, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de papa o carboximetilcelulosa de sodio; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes regulador de pH, agentes humectantes, conservadores y agentes saborizantes. Los compuestos se pueden formular en preparaciones para inyecciones por disolución, suspensión o emulsificación en un solvente acuoso o no acuoso, por ejemplo aceites vegetales u otro similar, glicéridos sintéticos de ácido alifático, esteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsificantes, estabilizantes y conservadores. Los compuestos se pueden utilizar como formulación en aerosol para ser administrados por vía inhalatoria. Los compuestos de la presente invención se pueden formular con propulsores presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Los compuestos se pueden usar como lociones, por ejemplo para prevenir la infección de quemaduras, por formulación con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsificantes, estabilizantes y conservadores. Además, los compuestos se pueden preparar como supositorios al mezclarlos con diversas bases tales como bases emulsificantes o bases hidrosolubles. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por vía rectal mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se funde a temperatura ambiente, pero se solidifican a temperatura ambiente . Se pueden proveer formas de dosificación unitaria para administración oral o rectal tales como jarabes, elixires, y suspensiones, en donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más compuestos de la presente invención. De modo similar, las formas de dosificación unitaria para administración por inyección o intravenosa pueden comprender el compuesto de la presente invención en una composición como solución en agua estéril, solución fisiológica normal u otro portador farmacéuticamente aceptable. Los implantes para las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Los implantes se formulan como microesferas, placas, etc. con polímeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, los polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero erosionable bien tolerado por el huésped. El implante que contiene los polipéptidos antimicrobianos de la invención se coloca en la proximidad del sitio de infección, de manera tal que la concentración local de agentes activos esté aumentad respecto del resto del organismo.

El término "forma de dosificación unitaria", tal como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas, adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias de la presente invención dependen del compuesto particular empleado y el efecto que se desea lograr, y la farmacodinámica asociada con el compuesto en el huésped. Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, coadyuvantes, portadores o diluyentes están a disponibilidad del público. Además, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste de pH y regulador de pH, agentes de ajuste de tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares, son de fácil acceso para el público. Las dosis típicas para la administración sistémica varían de 0.1 pg a 100 miligramos por kg de peso de sujeto por administración. Una dosis típica puede ser un comprimido ingerido de dos a seis veces por día, o una cápsula o comprimido de liberación única tomada una vez por día y que contiene un contenido proporcionalmente superior del ingrediente activo. El efecto de liberación temporal se puede obtener con materiales de la cápsula que se disuelven con distintos valores de pH, con cápsulas que liberan lentamente por presión osmótica, o por cualquier otro medio conocido de liberación controlada. Los expertos apreciarán rápidamente que los niveles de dosificación pueden variar en función del compuesto específico, la severidad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Algunos de los compuestos específicos son más potentes que otros. Las dosificaciones de preferencia para determinado compuesto son determinadas con facilidad por los expertos en la técnica por diversos medios. Un medio de preferencia consiste en medir la potencia fisiológica de determinado compuesto. El uso de liposomas como vehículo de provisión es un método de interés. Los liposomas se fusionan con las células del sitio blanco y provee los contenidos de la luz intracelular. Los liposomas se mantienen en contacto con las células durante tiempo suficiente para la fusión, por diversos medios para mantener el contacto, por ejemplo aislamiento, agentes ligadores, y similares. En un aspecto de la invención, se diseñan liposomas que se aerosolizan para la administración pulmonar. Los liposomas se pueden preparar con proteínas o péptidos purificados que median la fusión de las membranas, tales como virus Sendai o virus de la gripe, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de los lípidos formadores de liposomas conocidos, incluso lípidos catiónicos o zwiteriónicos, tales como fosfatidilcolina. El resto lipídico normalmente son lípidos neutros o ácidos, tales como colesterol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, y similares. Para preparar los liposomas se puede usar el procedimiento descrito por Kato y otros (1991) J\ Biol . Chem. 266:3361. Brevemente, los lípidos y la composición de la luz que contiene péptidos se combinan en un medio acuoso adecuado, convenientemente un medio salino en donde los sólidos totales estarán en el intervalo de aproximadamente 1-10 por ciento en peso. Después de intensa agitación durante cortos periodos, durante aproximadamente 5-60 s, el tubo se coloca en un baño de agua tibia, de aproximadamente 25-40°C y este ciclo se repite aproximadamente 5-10 veces. La composición luego se centrifuga durante un periodo conveniente, generalmente de aproximadamente 1-10 s y también se puede agitar por vórtice. El volumen luego se expande por el agregado de medio acuoso, generalmente con aumento de volumen de aproximadamente 1-2 veces, seguido de agitación y enfriado. Este método permite la incorporación en la luz de moléculas de alto peso molecular. Formulaciones con otros agentes activos Para el uso en los métodos objeto, los polipéptidos antimicrobianos de la invención se pueden formular con otros agentes farmacéuticamente activos, particularmente otros agentes antimicrobianos. Otros agentes de interés incluyen una amplia variedad de antibióticos, conocidos en la técnica. Las clases de antibióticos incluyen penicilinas, por ejemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, por ejemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenem; monobactam; aminoglucósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolinas; cloranfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. Los agentes antimicóticos también son útiles, incluso polienos, por ejemplo, anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azoles, por ejemplo, miconazol, ketoconazol, itraconazol y fluconazol. Los fármacos antituberculosos incluyen isoniazida, etambutol, estreptomicina y rifampina. También se pueden incluir citocinas en una formulación de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, por ejemplo, interferón gama, factor alfa de necrosis tumoral, interleucina 12, etc. Síntesis in vitro Los péptidos antimicrobianos de la invención se pueden preparar por síntesis in vi tro, mediante métodos convencionales conocidos en la técnica. Hay diversos aparatos de síntesis disponibles en el comercio, por ejemplo los sintetizadores automáticos de Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Al usar sintetizadores, los aminoácidos naturales pueden ser sustituidos con aminoácidos no naturales, particularmente D-isómeros (o formas D) por ejemplo, D-alanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas laterales con distintas longitudes y funciones, y similares. La secuencia particular y la forma de preparación estarán determinadas por conveniencia, economía, pureza requerida, y similares. Los enlaces químicos pueden ser provistos por diversos péptidos o proteínas que comprenden funciones convenientes para la formación de enlaces, tales como grupos amino para la formación de amidas o aminas sustituidas, por ejemplo, afinación reductora, grupos tiol para la formación de tioéter o disulfuro, grupos carboxilo para la formación de amidas, y similares. Si se desea, se pueden introducir diversos grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, lo cual permite la unión con otras moléculas o con la superficie. En consecuencia, se pueden usar cisternas para preparar tioéteres, histidinas para unirse a complejos de iones metálicos, grupos carboxilo para la formación de amidas o esteres, grupos amino para la formación de amidas, y similares. Los polipéptidos también se pueden aislar y purificar de acuerdo con métodos convencionales para la síntesis recombinante. Se puede preparar un lisado del huésped de expresión y purificar el lisado con HPLC, cromatografía por exclusión, electroforesis en gel, cromatografía por afinidad, u otra técnica de purificación. Por lo general, las composiciones usadas comprenden al menos 20% en peso del producto deseado, más habitualmente al menos aproximadamente 75% en peso, de preferencia al menos aproximadamente 95% en peso, y con fines terapéuticos, generalmente al menos aproximadamente 99.5% en peso, en relación con contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Por lo general, los porcentajes se basan en proteínas totales. Alimento para animales La presente invención también está dirigida a métodos para usar los polipéptidos con actividad antimicrobiana en alimentos para animales, además de composiciones de alimentos y aditivos de alimentos que comprenden los polipéptidos antimicrobianos de la invención. El término animal incluye todos los animales, incluso seres humanos. Los ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes, tales como vacas, ovejas y caballos. En una particular modalidad, el animal en animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo, cerdos o lechones (incluso, sin limitaciones, mamones, lechones, y cerdos) ; aves de corral tales como pavos y gallinas (incluso, sin limitaciones pollos barrilleros, ponedoras) ; terneros; y peces (incluso, sin limitaciones, salmón) . El término alimento animal o composición alimenticia animal significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada o pretendida para la ingesta por un animal . En el uso de acuerdo con la invención, el polipéptido antimicrobiano se puede dar como alimento al animal antes, después de, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esta última. En una particular modalidad, el polipéptido antimicrobiano está bien definido, en la forma que se agrega al alimento animal, o cuando se incluye en un aditivo alimenticio animal. Bien definido significa que la preparación polipeptídica antimicrobiana es al menos 50% pura tal como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño (ver Ejemplo 12 de WO 01/58275) . En otras modalidades particulares, la preparación polipeptídica antimicrobiana es al menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos 95% puro, según se determina por el presente método. Una preparación polipeptídica bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más sencillo dosificar correctamente en el alimento animal un polipéptido antimicrobiano esencialmente libre de otros polipéptidos antimicrobianos interferentes o contaminantes . El término dosificar correctamente se refiere en particular al objeto de obtener resultados consistentes y constantes, y la capacidad para optimizar la dosificación en base al efecto deseado.

Para el uso como alimento animal, sin embargo, el polipéptido antimicrobiano no necesita ser tan puro; por ejemplo, puede incluir otras enzimas, en cuyo caso se denomina preparación de polipéptido antimicrobiano. La preparación polipeptídica antimicrobiana se puede (a) agregar directamente al alimento animal (o usar directamente en un proceso de tratamiento de proteínas vegetales) , o (b) se puede usar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos nutrientes o premezclas que luego se agregan al alimento animal (o se usa en un proceso de tratamiento) . El grado de pureza antes descrito se refiere a la pureza de la preparación original de polipéptido antimicrobiano, usada de acuerdo con (a) o (b) anteriores . Las preparaciones de polipéptido antimicrobiano con purezas de este orden de magnitud se obtienen en particular mediante métodos de producción recombinantes, en donde no se obtienen con tanta facilidad y también están sujetos a variación mucho mayor entre lotes cuando el polipéptido antimicrobiano se produce por métodos tradicionales de fermentación. Obviamente, dicha preparación polipeptídica antimicrobiana se puede mezclar con otras enzimas. El término proteínas vegetales tal como se usa en la presente se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada de un vegetal, incluso proteínas modificadas y derivados proteicos. En modalidades particulares, el contenido proteico de las proteínas vegetales es de al menos 10, 20, 30, 40, 50, o 60% (p/p) . Las proteínas vegetales pueden ser derivadas de fuentes de proteínas vegetales tales como legumbres y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae) , Cruciferaceae, Chenopodiaceae , y Poaceae, tales como harina de fríjol de soya, harina de lupín y harina de semilla de colza. En una particular modalidad, la fuente de proteína vegetal es un material proveniente de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo, fríjol de soya, lupín, guisante o fríjol. En otra particular modalidad, la fuente de proteína vegetal es un material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa. Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son semilla de colza y repollo. El fríjol de soya es una fuente de proteína vegetal de preferencia. Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, y sorgo. El polipéptido antimicrobiano se puede agregar al alimento animal en cualquier forma, como polipéptido antimicrobiano relativamente puro, o en mezcla con otros componentes previstos para la adición a un alimento animal, es decir en la forma de aditivos de alimento animal, tales como las denominadas premezclas para alimento animal. En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones para usar en alimentos animales, tales como un alimento animal, y aditivos de alimentos animales, por ejemplo, premezclas . Además del polipéptido antimicrobiano de la invención, los aditivos de alimento animal de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un mineral en trazas, y/o al menos un macromineral . Además, son ingredientes aditivos del alimento los agentes colorantes, compuestos de aroma, estabilizantes, y/o al menos otra enzima seleccionada de entre las fitasas EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26; xilansas EC 3.2.1.8; galactanasas EC 3.2.1.89; y/o beta-glucanasas EC 3.2.1.4. En una particular modalidad, estas otras enzimas están bien definidas (tal como se definió con anterioridad para las preparaciones de polipéptido antimicrobiano) . Son ejemplos de otros péptidos antimicrobianos (AMP) CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Ovispirina tales como Novispirina (Robert Lehrer, 2000) , y sus variantes, o sus fragmentos que retienen actividad antimicrobiana. Son ejemplos de otros polipéptidos antifúngicos (AFP) los péptidos de Aspergillus giganteus, y Aspergillus niger, además de sus variantes y fragmento que retienen actividad antifúngica, tal como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384. Por lo general, la grasa y las vitaminas hidrosolubles, además de minerales en trazas forman parte de una premezcla prevista para la adición al alimento animal, en donde por lo general los macrominerales se agregan por separado al alimento animal. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con un polipéptido antimicrobiano de la invención, es un aditivo de alimento animal de la invención. En una particular modalidad, el aditivo de alimento animal de la invención se pretende incluir (o se prescribe como para incluir) en las dietas o los alimentos animales en niveles de 0.01 a 10.0%; más particularmente 0.05 a 5.0%; o 0.2 a 1.0% (% que significa g de aditivo por 100 g de alimento animal) . Esto vale en particular para premezclas. Las siguientes son listas no excluyentes de ejemplos de estos componentes: Los ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo, vitamina K3. Los ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo, D-pantotenato de calcio. Los ejemplos de minerales en trazas son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto. Los ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio. Los requerimientos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) se listan en la Tabla A de WO 01/58275. Los requisitos nutricionales significan que estos componentes se deben proveer en la dieta en las concentraciones indicadas. En la alternativa, el aditivo de alimento animal de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro y así sucesivamente hasta todos los trece, o hasta todos los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en una cantidad tal que provee una concentración en el alimento animal en el intervalo indicado en la columna cuatro, o la columna cinco, o la columna seis de la Tabla A.

La presente invención también se refiere a composiciones de alimento animal. Las composiciones o dietas de alimento animal tienen un contenido relativamente elevado de proteína. Las dietas de aves de corral y de cerdos se pueden caracterizar tal como se indica en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas de peces se pueden caracterizar tal como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además, dichas dietas de peces generalmente tienen un contenido lipídico crudo de 200-310 g/kg. Una composición de alimento animal de acuerdo con la invención tiene un contenido de proteínas crudas de 50-800 g/kg, y además comprende al menos un polipéptido antimicrobiano tal como se reivindica en la presente. Además, o como alternativa (al contenido de proteína cruda indicado con anterioridad) , la composición de alimento animal de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisterna de 0.1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50 g/kg. En modalidades particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de los intervalos 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5) . La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un 6,25, es decir proteína cruda (g/kg) = N (g/kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno se determina mediante el método de Kjeldahl (A.O.A.C, 1984, Official Mthods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC) . La energía metabolizable se puede calcular sobre la base de los requerimientos nutritivos de la publicación de NRC en cerdos, novena edición revisada de 1988, subcomisión de nutrición porcina, comisión sobre nutrición animal, Comisión de agricultura, Consejo de investigación nacional. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, y la Tabla europea de valores de energía para alimentos de aves de corral, Centro Spelderholt para investigación y extensión de aves de corral, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. El contenido dietarios de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas animales completas se calcula sobre la base de tablas de alimentos tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7. En una particular modalidad, la composición de alimento animal de la invención contiene al menos una proteína vegetal o fuente de proteínas tal como se definió con anterioridad. En aún otras modalidades particulares, la composición de alimento animal de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de fríjol de soya; y/o 0-10% de harina de pescado; y/o 0-20% de suero. Por ejemplo, las dietas animales se pueden fabricar como puré de alimento (no sedimentado) o alimento sedimentado. En general, los alimentos animales molidos se mezclan y se agregan cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificaciones para las especies en cuestión. Se pueden agregar enzimas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación enzimática sólida generalmente se agrega antes o durante la etapa de mezclado; y una preparación enzimática líquida por lo general se agrega después de la etapa de sedimentación. La enzima también se puede incorporar en un aditivo de alimento animal o premezcla. La concentración final de enzima en la dieta está dentro del intervalo de 0.01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo en el intervalo de 5-30 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal. El polipéptido antimicrobiano se puede administrar en una o más de las siguientes cantidades (intervalos de dosificación): 0.01-200; o 0.01-100; O 0.05-100; o 0.05-50; o 0.10-10 - donde todos estos intervalos están en mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg de alimento animal (ppm) . Para determinar los mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg de alimento animal, se purifica en polipéptido antimicrobiano a partir de la composición de alimento animal, y se determina la actividad específica del polipéptido antimicrobiano purificado mediante un ensayo pertinente (ver en actividad antimicrobiana, sustratos, y ensayos) . La actividad antimicrobiana de la composición de alimento animal como tal también se determina mediante el mismo ensayo, y en base a estas dos determinaciones se calcula la dosificación en mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg de alimento animal. Los mismos principios se aplican para la determinación de mg de proteína de polipéptido antimicrobiano en aditivos de alimento animal. Obviamente, si se dispone de una muestra del polipéptido antimicrobiano usado para preparar el aditivo de alimento animal o el alimento animal, se determina la actividad específica a partir de dicha muestra (sin necesidad de purificar el polipéptido antimicrobiano de la composición de alimento animal o el aditivo) . La presente invención también se describe con los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención. EJEMPLOS Los compuestos químicos usados como regulador de pH y sustratos son productos comerciales de al menos grado de reactivo. EJ?MPLO 1 Evaluación de concentración efectiva mínima Se analizaron tres polipéptidos antimicrobianos, que son variantes de SEC ID NO:l, para determinar su actividad antimicrobiana. Se realizó un ensayo de concentración efectiva mínima (MEC, expresado como µg/ml) contra diferentes microorganismos mediante los tres mutantes de plectasina, Y40YR, N17R y Y25R según el protocolo descrito en el libro de Methods in Molecular Biology, vol. 78, Antibacterial peptide protocol William M. Shafer, Human Press. El mutante de plectasina "Y40YR" se construyó por agregado de un residuo de arginina en el extremo de la secuencia de aminoácidos de plectasina. Los resultados demostraron aumento de la actividad de los tres péptidos antimicrobianos, comparado con la plectasina de tipo silvestre (SEC ID NO:l) contra las bacterias Bacillus subtilis, Micrococcus luteus y Staphylococcus epidermidis .

Mutación SEC ID NO: MEC contra MEC contra MEC contra B. subtilis M. luteus S . epidermis Tipo 1 0.09 1.89 0.98 silvestre Y40YR 99 0.05 0.18 0.31 N17R 95 0.07 0.32 0.59 Y25R 117 0.04 1.40 ND Tabla 1. Valores de MEC; todos los valores están en µg/ml . EJEMPLO 2 Evaluación de actividad antimicrobiana Se analizó un intervalo de polipéptidos antimicrobianos, que son variantes de SEC ID NO-.l (Plectasina), para determinar su actividad antimicrobiana por su expresión en S. cerevisae y el análisis del sobrenadante de los transformantes de levadura, por su actividad antimicrobiana contra Staphylococcus carnosus ATCC51365. Los medios y soluciones de desarrollo se prepararon tal como se describe en Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989) , Molecular cloning, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Nueva York. Se realizó ensayo de difusión radial tal como se describe en Methods in Molecular Biology, vol. 78, Antibacterial peptide protocol, William M. Shafer, Human Press.

Se sembraron 200-300 colonias de transformante de levadura en placas redondas de 14 cm que contenían 25 ml de medio de cultivo SC suplementado con 1.5% de galactosa, 0.5% de glucosa y 1.5% de agarosa. Las placas se incubaron durante tres horas a temperatura ambiente, se cubrieron con 25 ml del mismo medio de cultivo y se dejaron desarrollar durante tres días a 30° Ceisius. Luego se cubrieron las placas con 25 ml de medio de cultivo LB que contiene 1.5% de agarosa y 105 células de la cepa indicadora Staphylococcus carnosus y se incubaron a 30° Ceisius durante la noche para dejar crecer a las células bacterianas. Al día siguiente se tiñeron las placas con 1.5 mM de MTT para facilitar la visualización de las zonas claras. Las colonias de levadura creadoras de zonas claras se transfirieron a placas de microtitulación que contenían 200 µl de medio de cultivo SC suplementado con 2% de glucosa y ampicilina (100 mg/L) . Dichas placas, denominadas "placas maestras" se incubaron durante 2 días a 30° Ceisius con agitación a 450 rpm para permitir el desarrollo de levaduras. 10 µl de medio de cultivo SC de cada cavidad de las placas maestras se transfirieron a nuevas placas de microtitulación que contenían 200 µl de medio de cultivo SC con 1.5% de galactosa y 0.5% de glucosa. Estas placas se denominaron placas hijas y se incubaron durante 3 días a 30° Ceisius a 450 rpm con agitación para permitir el desarrollo de levaduras y la síntesis de péptidos. Por último se realizó un ensayo de difusión radial (RDA, por sus siglas en inglés) según el protocolo descrito en Methods in Molecular Biology a fin de analizar y cuantificar la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de levadura contra S. carnosus . Brevemente, se volcaron 30 ml de medio de base mínimo que contenía 1% de agarosa y 5xl05 cfu/ml de S. carnosus en una placa omnitray (Nunc, 242811) . Se insertó una placa Nunc TSP (#445497) inmediatamente sobre la placa, a fin de permitir la formación de un patrón de 96 cavidades. Una vez solidificado el medio, se retiró la placa TSP y se aplicaron 10 µl de muestras de sobrenadante de levadura en los agujeros. Las placas se incubaron 3 horas a 37° Ceisius y se cubrieron con 15 ml de medio de cultivo de agar LB. Por último, se incubaron las placas durante la noche a 37° Ceisius y se tiñeron con 1.5 mM de MTT para visualizar las zonas claras. La inspección y las mediciones de las zonas claras se realizaron sobre las placas . Los correspondientes clones de levadura obtenidos en las zonas claras de tamaño similar o aumentado que los clones que codifican plectasina de tipo silvestre se recuperaron de las placas maestras y se transfirieron a placas de agar que contienen medio de cultivo SC con 2% de glucosa y ampicilina (100 mg/L) . Dichas placas se incubaron otros 2 días a 30° Ceisius para permitir el desarrollo de levaduras. Luego se realizó PCR de las colonias seguido de análisis de secuencia para identificar los cambios de aminoácidos en la secuencia de plectasina. Las mutaciones y las correspondientes actividades antimicrobianas, respecto de la actividad de plectasina, se muestran en la Tabla 2. Una actividad de 2 corresponde a la actividad de plectasina. Una actividad de 3 es mejor que plectasina, y 1 es peor que plectasina.

Tabla 2. Datos de actividad antimicrobiana provenientes del ensayo de análisis de levaduras. EJEMPLO 3 Identificación de péptidos antimicrobianos con aumento de actividad antimicrobiana Se analizó un intervalo de polipéptidos antimicrobianos que son variantes de SEC ID N0:1, en el ensayo de TAPS. Se puede usar TAPS para identificar genes nuevos o mejorados que codifican péptidos capaces de aniquilar o inhibir el desarrollo de células blanco (ver solicitud de PCT WO 2004/033715) . El ensayo TAPS, un acrónimo de Trans Acting Peptide System, se basa en lograr que un huésped sensible produzca un péptido, seguido del análisis para determinar su actividad en trans respecto de una cepa indicadora. La ventaja del sistema se basa en que el péptido antimicrobiano se expresa en la bacteria gramnegativa E. coli y su actividad antimicrobiana se puede monitorear en diferentes microbios tales como gramnegativos, grampositivos o hongos. Además, TAPS ofrece la posibilidad de producir AMP correctamente plegados que contienen enlaces disulfuro en las células huésped, por lo que retienen sus actividades antimicrobianas. El enfoque TAPS requiere primero que la expresión del péptido esté bajo el control de un promotor inducible con regulación estrecha, dado que las células huésped son sensibles al péptido cuando lo producen. Segundo, el péptido producido debe ser liberado al medio para poder interactuar con el organismo blanco. El análisis TAPS se puede realizar en medio sólido o líquido. En medio sólido, se introduce inicialmente una biblioteca de plásmido en células huésped de E. coli . Es importante cultivar los transformantes en la superficie de un filtro de acetato de celulosa colocado en medio de cultivo LB sin inductor (arabinosa) para evitar la expresión del péptido antimicrobiano y en consecuencia la inhibición del crecimiento. En la siguiente etapa, el filtro que contiene las colonias, se transfiere a medio de cultivo LB que contiene inductor (0.1% de arabinosa) para permitir la síntesis peptídica. Luego se cubre la cepa blanco, por ejemplo S. carnosus, sobre la placa y se deja desarrollar durante 12-16 horas a 37° Ceisius. Por último se realiza la inspección visual de las células huéspedes capaces de reducir la proliferación de las células blanco y se recupera la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido antimicrobiano de las células huésped. Se obtiene el análisis de la secuencia de ADN de las variantes para dilucidar la naturaleza del péptido. Tal como se mencionó con anterioridad, el análisis de TAPS también se puede realizar con medio líquido. Este procedimiento requiere el uso de medios robóticos para analizar grandes cantidades de clones. En este sistema, las células huésped origami de E. coli se transforman con la biblioteca del plásmido y se plaquean en medio LB + 0.2% glucosa+ampicilina (200 mg/L) . Luego se inoculan colonias aisladas en placas de 96 o 384 cavidades que contienen 200 µl de medio TB + ampicilina (200 mg/L) y se cultivan durante la noche a 37° Ceisius. Estos cultivos luego se replican por medios robóticas y se desarrollan hasta fase exponencial hasta que el inductor (0.1% de arabinosa) se agrega para desencadenar la síntesis del péptido. La próxima etapa consiste en hidrolizar las células de manera tal que se libera el péptido al medio por hidrólisis acida en caliente. Este tratamiento consiste en agregar 1 M de regulador de pH de fosfato de sodio pH 2.3 para obtener un pH final de aproximadamente 2.3 e incubar los cultivos durante la noche a 80° Ceisius. Al día siguiente se usan alícuotas de 25 µl de los cultivos hidrolizados para realizar una prueba de actividad respecto del organismo blanco deseado. La prueba de actividad realizada fue el ensayo de difusión radial (RDA) , en donde se agregó una alícuota de los cultivos hidrolizados al medio de agarosa inoculado con la cepa blanco, S. carnosus . Los RDA obtenidos de las placas de análisis que contenían zonas claras correspondientes a clones que exhiben actividad antimicrobiana se identificaron con facilidad. Se realizaron mediciones del diámetro de las zonas claras para cuantificar la potencia de la actividad antimicrobiana de los péptidos. La actividad antimicrobiana (respecto de Staphylococcus carnosus) de las variantes estudiadas de plectasina, medidas mediante el ensayo de TAPS, se muestra en la tabla 3. La actividad antimicrobiana corresponde al tamaño de la zona clara y se clasificó como 4 > 3 > 2 > 1; en donde 4 es mejor que 1, y la actividad de tipo silvestre corresponde a 1. de TAPS. EJEMPLO 4 Evaluación de actividad antimicrobiana Se expresaron y purificaron plectasina de tipo silvestre (SEC ID NO:l) y cinco variantes de plectasina, que mostraron aumento de la actividad por el método TAPS y/o en el sistema de levaduras. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (MIC, µg/ml) para analizar su actividad antimicrobiana según las pautas de NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute; antes denominado National Committee for Clinical and Laboratory Standards) . Los resultados demostraron que todas las variantes de plectasina tenían aumento de actividad, comparado con plectasina de tipo silvestre, respecto de Stapylococcus aureus, Micrococcus luteus y Bacillus subtilis.

Tabla 4. Valores de MIC; todos los valores en µg/ml EJEMPLO 5 Evaluación de actividad antimicrobiana Se expresaron y purificaron plectasina de tipo silvestre (SEC ID NO:l) y varias variantes de plectasina. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (MIC, µg/ml) para analizar su actividad antimicrobiana según las pautas de NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute; antes denominado National Committee for Clinical and Laboratory Standards) . Los péptidos se analizaron respecto de las siguientes cepas : Staphylococcus aureus, ATCC 29213, Staphylococcus aureus, ATCC 25923 C; Staphylococcus aureus, ATCC 29737, D: Staphylococcus aureus, MRSA ST5 (2001) , aislamiento humano clínico multiresistente de Statens Serum Institut, Dinamarca; ?: Staphylococcus aureus, MRSA ST80 (2003), aislamiento humano clínico multiresistente de Statens Serum Institut, Dinamarca. Todos los valores de MIC representan un promedio de dos experimentos independientes; y todos los resultados de la Tabla 5 se expresan respecto de plectasina de tipo silvestre: 0: > 100% de MIC de plectasina de tipo silvestre; 1: 80-100% de MIC de plectasina de tipo silvestre; 2: 50-80% de MIC de plectasina de tipo silvestre; 3: < 50% de MIC de plectasina de tipo silvestre.

Tabla 5. Valores de MIC relativos; nd = no determinado. EJEMPLO 6 Evaluación de actividad antimicrobiana Se analizaron gran cantidad de péptidos antimicrobianos de la invención contra un panel de 6 cepas diferentes de Staphylococcus aureus listadas a continuación: Staphylococcus aureus, ATCC29213, MSSA, cepa de referencia de NCCLS; Staphylococcus aureus, ATCC25923, MSSA, cepa de referencia de NCCLS; Staphylococcus aureus, ATCC29737, MSSA; Staphylococcus aureus, E33235, MSSA; Staphylococcus aureus, 698-01, MRSA ST5, Str, Kan, Oxa; Staphylococcus aureus, 566-03, MRSA ST80, Oxa, Tet, Fus, Kan. S. aureus E33235, S. aureus 698-01 y S. aureus 566-03 disponibles de Statens Serum Institut, Dinamarca. Los estafilococos se expusieron a las siguientes concentraciones de péptido: 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0.5; 0.25; 0.13; 0.6; y 0.03 µg/ml. Todos los péptidos eran purificados, cuantificados por HPLC y los péptidos concentrados (>160 µg/ml) se diluyeron a 160 µg/ml en regulador de pH de dilución de péptido (0.1% BSA, 0.01% de ácido acético) . La determinación MIC se realizó esencialmente tal como se describe en las pautas de NCCLS / CLSI con caMHB. Los MIC se leyeron después de 18-24 horas de incubaciones a 37°C y se registraron junto con las CFU en la tabla siguiente. Se evaluó un total de 95 péptidos antimicrobianos de la invención por duplicado contra las 6 cepas bacterianas antes descritas . En la mayoría de las determinaciones dobles (93%) , las MIC variaron < 2 veces. Se tabuló el promedio de MIC a continuación. Si la MIC era superior a 32 µg/ml, se usó un valor de 64 para calcular el promedio.

Tabla 6. Valores promedio de MIC. EJEMPLO 7 Uso de los archivos HMM provenientes de la base de datos PFAM para identificar una defensina El análisis de secuencia mediante los perfiles de modelo oculto de markov (perfiles HMM) se puede realizar online en la Internet o localmente en una computadora con el bien conocido paquete de software HMMER, de libre disponibilidad. La versión actual es HMMER 2.3.2 de octubre de 2003. Los perfiles de HMM se pueden obtener de la bien conocida base de datos PFAM. La versión actual es PFAM 16.0 de noviembre de 2004. HMMER y PFAM están disponibles para tosas las plataformas de computación, tales como por ejemplo, Washington University en St . Louis (EE.UU.), School of Medicine (http://pfam.wustl.edu y http://hmmer.wustl.edu). Si una secuencia de aminoácidos incógnita, o uno de sus fragmentos, pertenece a una de las siguientes cinco familias de PFAM, la secuencia de aminoácidos es una defensina de acuerdo con la presente invención: • Defensina_beta o "Beta Defensina" , número de acceso: PF00711; ® Defensina_j?ropep o "Defensina propéptido" , número de acceso: PF00879; ® Defensina_l o "defensina de mamífero" , número de acceso: PF00323; o Defensina_2 o "defensina de artrópodo" , número de acceso: PF01097; ® Gama-tionina o "familia de gama tionina" , número de acceso: PF00304. Una secuencia de aminoácidos pertenece a una familia PFAM, de acuerdo con la presente invención, si genera un valor E superior a 0,1, y una calificación mayor o igual a cero, cuando la base de datos PFAM se usa online, o cuando se usa localmente el programa hmmpfam (del paquete de software HMMER) . Cuando el análisis de secuencia se realiza localmente con el programa hmmpfam, es necesario obtener (descargar) los perfiles HMM de la base de datos PFAM. Existen dos perfiles para cada familia; xxx_ls.hmm para búsquedas globales, y xxx_fs.hmm para búsquedas locales ("xxx" es el nombre de la familia) . Esto representa un total de diez perfiles para las cinco familias antes mencionadas. Estos diez perfiles se pueden usar en forma individual, o unir (agregar como apéndices) en un único perfil (con un editor de texto - los perfiles son archivos ASCII) que se pueden nombrar por ejemplo, defensin.hmm. Luego se puede evaluar una secuencia de aminoácidos incógnita mediante la siguiente línea de comando: hmmpfam -E 0.1 defensin.hmm secuencia_archivo - en donde "secuencia_archivo" es un archivo con la secuencia de aminoácidos incógnita en cualquiera de los formatos reconocidos por el paquete de software de HMMER. Si la calificación es mayor o igual a cero (0.0), y el valor E es mayor que 0.1, la secuencia de aminoácidos incógnita es una defensina de acuerdo con la presente invención. La base de datos de PFAM también se describe en Bateman y otros (2004) "The Pfam Protein Families Datábase", Nucleic Acid Research, Vol. 32 (Datábase Issue) pp. D138-D141. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Un polipéptido con actividad antimicrobiana, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO: 2 : G-X?-G-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Xg-X?o- ??_C-H- 2-X?3-C-X? -X5- Xl6~Xl7-Xl8-Xl9~X20"-G-G-X2?-C-X22-X23-X24-X25-'X26-X27-'C-X28-C-X29; en donde Xi = F, L, W o I; de preferencia Xi = F; X2 = N, R, Q, V, G, S, A, K, L, M, D, H O Y; de preferencia X2 = N, R, Q, V, G, S, A, K o Y; X3 = G, R, A o K; de preferencia x3 = G; X4 = P, A, L, V, K o R; de preferencia X = P, K o R; X5 = W o R; X6 = D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, C, I, R, V o Y; de preferencia X6 = D, A, G, K, L, T, N, F, H, M, P, Q, S, V o Y; X7 = E, G, A, L, C, Q o S; de preferencia X7 = E, G o S; X8 = D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, W, I, M, A, C O R; de preferencia X8 = D, F, G, N, V, Y, H, K, L, P, S, T, w, I, M O R;
X9 = D o P; de preferencia Xg = D; Xio = M, R, S, V, A, F, G, L, T, Y, W, E o K; de preferencia X10 = M, R, S, V, G, Y, L, F, T, W o K; Xii = Q, R, L, F, G, H, S, A, C, I, K, M, P, T, V, W o Y; de preferencia Xu = Q, R, L, F, G, H, S, K o Y; X12 = N, R, I, Y, V, K, T, Q, S, A, W, E o H; X?3 = H, A, F, Q, T, V o L; de preferencia Xi3 = H o L; i4 = K, Q o R; de preferencia Xi4 = K o R; X15 = S, A, V, N o F; Xie = I, L, M, T, W o V; de preferencia X16 = I, L o V; X?? = K, T o R; Xiß = G, H, K, A, P, F, I, Q, R, S, T, Y O N; de preferencia X?8 = G, H, R, K o N; X?9 = Y, H, K, L, M, N, Q, S, V o R; de preferencia Xi9 = Y o R; X20 = K, F, H, T, C o R; de preferencia X20 = K o R; X2? = Y, F, R, A, H, L, M, S o W; de preferencia X2i = Y, F, R o W; X22 = A, K, N, Q, T, E, H, I, R, S, V, G o Y; de preferencia X22 = A, K, N, Q, T, S o Y; X23 = K, R o T; de preferencia X23 = K o R; X24 = G, K, Q, E, N, S, T, A o R; de preferencia X24 = G, K, Q, A o R; X25 = G, K, H, W o R; de preferencia X25 = G, K o R; X2S = F, A, H, I, M, V, W, R o L; de preferencia X26 = F O L; X27 = V, L, M, I, K, Q, R o T; de preferencia X27 = V, L,
M O T; X28 = K, H, N o R; de preferencia X28 = K o R; X29 = Y, I, YRCG o YR; de preferencia X29 = Y o YR; y que tiene menos de 100% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO:l. 2. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO: 2, de preferencia al menos 90% de identidad, o al menos 95% de identidad con los aminoácidos 1 a 40 de SEC ID NO: 2. 3. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.
4. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274.
5. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; o uno de sus fragmentos con actividad antimicrobiana y que comprende 6 residuos de cisteína.
6. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 3 a SEC ID NO: 225 o cualquiera de SEC ID NO: 226 a SEC ID NO: 251 o cualquiera de SEC ID NO: 252 a SEC ID NO: 274; o uno de sus fragmentos con actividad antimicrobiana y que comprende 6 residuos de cisteína.
7. - Un polinucleótido caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8.- Una construcción de ácido nucleico caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7 ligado operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.
9. - Un vector de expresión recombinante caracterizado porque comprende la construcción del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8.
10. - Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8.
11.- Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 caracterizado porque comprende (a) cultivar la célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 10 en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
12.- Una planta, parte de planta o célula de planta transgénica, caracterizada porque ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
13. - Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido antimicrobiano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
14. - Un método para aniquilar o inhibir el desarrollo de células microbianas caracterizado porque comprende poner en contacto las células microbianas con un polipéptido antimicrobiano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
15. - Un polipéptido antimicrobiano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque se usa como medicamento, o un agente antimicrobiano veterinario o terapéutico humano o preventivo.
16. - El uso de un polipéptido antimicrobiano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un agente veterinario o terapéutico humano para el tratamiento de una infección microbiana o para uso preventivo.
17. - El uso de al menos un polipéptido antimicrobiano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en un alimento animal.