MX2007011158A

MX2007011158A - Expresion recombinante de defensinas en hongos filamentosos.

Info

Publication number: MX2007011158A
Application number: MX2007011158A
Authority: MX
Inventors: Kirk Matthew Schnorr; Mogens Trier Hansen; Hans-Henrik Kristensen Hoegenhaug
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2005-03-16
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2007-11-14
Also published as: JP2012110347A; AU2006224628B2; BRPI0608518A2; ZA200708406B; RU2007138215A; AU2006224628A1; TW200700431A; AR052703A1; WO2006097464A1; RU2404990C2; ATE529439T1; IL185443A0; NZ561009A; NO20075277L; KR20070121676A; EP1861421B1; AP2007004141A0; CN101142231A; CA2600026A1; ES2375150T3

Abstract

La presente invencion se refiere a la expresion recombinante de peptidos antimicrobianos de defensina en la fermentacion de hongos filamentosos.

Description

EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE DEFENSINAS EN HONGOS FILAMENTOSOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la expresión recombinante de péptidos antimicrobianos de defensina en hongos filamentosos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las defensinas pertenecen a una clase de péptidos antimicrobianos pequeños. Son capaces de destruir a un amplio espectro de microorganismos, algunos de los cuales son cada vez más resistentes a los antibióticos tradicionales. Por esta razón, ha adquirido un creciente interés la capacidad de producir defensinas en grandes cantidades a bajo costo. Debido a que las defensinas usualmente solo comprenden residuos de 3050 aminoácidos, con frecuencias son difíciles de producir en forma eficiente por medio de métodos de fermentación recombinante. La síntesis química de péptidos es un método alternativo, pero es demasiado caro cuando los péptidos exceden de 25-30 residuos de aminoácidos. Otra complicación es que las defensinas comprenden un patrón de cisteína distintivo, el cual es difícil de generar por síntesis química. Por consiguiente, el objeto de la presente invención es proporcionar métodos para obtener mejores niveles de expresión de los péptidos antimicrobianos de defensina en la fermentación recombinante de los hongos filamentosos. Ref.: 185605 Los inventores de la presente invención han hallado que mediante la inserción de una o más secuencias de intrón en una construcción de ácido nucleico, la cual dirige la expresión de una defensina, se puede mejorar el nivel de expresión recombinante por más de 50% en comparación al empleo de una construcción de ácido nucleico sin secuencias de intrón. Las secuencia (s) de intrón se pueden insertar en cualquier parte de la construcción del ácido nucleico, tal como en la secuencia que codifica la defensina madura, o incluso en la secuencia que codifica el péptido señal. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante de hongo filamentoso, que comprende una construcción de ácido nucleico, y la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico extraño que codifica una defensina y una o más secuencia (s) de intrón. En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para la producción en forma recombinante de una defensina en una célula huésped de hongo filamentoso, la cual incluye el cultivo de la célula huésped del hongo filamentoso que comprende una construcción de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de defensina y una o más secuencia (s) de intrón; y la recuperación del péptido de defensina . En un tercer aspecto, la invención se refiere al empleo de la construcción de ácido nucleico, la cual comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de defensina y una o más secuencia (s) de intrón, para mejorar el nivel de expresión recombinante en una célula huésped del hongo filamentoso. Definiciones Actividad antimicrobiana: El término "actividad antimicrobiana" está definido en la presente descripción como una actividad capaz de destruir o inhibir el crecimiento de las células microbianas. En el contexto de la presente invención el término " antimicrobiano" significa que existe un efecto bactericida y/o bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o virucida, donde el término "bactericida" se entiende como capaz de matar células bacterianas. El término "bacteriostático" se entiende como capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir, inhibición de crecimiento de células bacterianas. El término "fungicida" se entiende como capaz de destruir células fúngicas. El término "fungistático" se entiende como capaz de inhibir el crecimiento fúngico, es decir el inhibir el crecimiento de células fúngicas. El término "virucida" se entiende como capaz de inactivar virus. El término "células microbianas" indica células bacterianas fúngicas (incluyendo a las levaduras) . En el contexto de la presente invención el término "inhibición de crecimiento de células microbianas" significa que las células están en estado de no crecimiento, es decir, que no se pueden propagar. Para los propósitos de la presente invención, la actividad antimicrobiana se puede determinar de acuerdo con los procedimientos descritos por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991). Alternativamente, la actividad antimicrobiana se puede determinar de acuerdo con las pautas NCCLS de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute; antiguamente conocido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards) . Las defensinas que tienen actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 8 horas (con preferencia después de 4 horas, con más preferencia después de 2 horas, con mayor preferencia después de 1 hora y en particular después de 30 minutos) con incubación a 20°C en una solución acuosa con 25% (p/p) ; con preferencia en una solución acuosa con 10% (p/p) ; con más preferencia en una solución acuosa con 5% (p/p) ; aun con más preferencia en una solución acuosa al 1 % (p/p) ; con la mayor preferencia en una solución acuosa con 0.5% (p/p); y en particular en una - solución acuosa con 0.1 % (p/p) de las defensinas que tienen actividad antimicrobiana. Las defensinas que tienen actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de inhibir el desarrollo de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25°C en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se agregan en una concentración de 1000 ppm; con preferencia cuando se agregan en una concentración de 500 ppm; con más preferencia cuando se agregan en una concentración de 250 ppm; incluso con más preferencia cuando se agregan en una concentración de 100 ppm; con máxima preferencia cuando se agregan en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se agregan en una concentración de 25 ppm. Las defensinas que tienen actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 8 horas (con preferencia después de 4 horas, con más preferencia después de 2 horas, con la máxima preferencia después de 1 hora y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20°C en una solución acuosa con 25% (p/p); con preferencia en una solución acuosa con 10% (p/p) ; con más preferencia en una solución acuosa con 5% (p/p) ; aun con más con preferencia en una solución acuosa con 1 % (p/p) ; con máxima preferencia en una solución acuosa con 0.5% (p/p); y en particular en una solución acuosa con 0.1% (p/p) de las defensinas que tienen actividad antimicrobiana . Las defensinas que tienen actividad antimicrobiana también pueden ser capaces inhibir el desarrollo de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25°C en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se agregan en una concentración de 1000 ppm; con preferencia cuando se agregan en una concentración de 500 ppm, con más preferencia cuando se agregan en una concentración de 250 ppm; aun con más preferencia cuando se agregan en una concentración de 100 ppm; con máxima preferencia cuando se agregan en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se agregan en una concentración de 25 ppm. Las defensinas de la presente invención tienen al menos 20%, con preferencia al menos 40%, con más preferencia al menos 50%, con más preferencia al menos 60%, con más preferencia al menos 70%, con más preferencia al menos 80%, aun con más preferencia al menos 90%, con máxima preferencia al menos 95%, y aun con mayor preferencia al menos 100% de la actividad antimicrobiana de la defensina que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra como aminoácidos 1 a 42 de la SEC ID NO:2. ADNc: El término "ADNc" se define en la presente descripción como una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción reversa a partir de una molécula madura de ARNm con empalme obtenida de una célula eucariótica. El ADNc - carece de secuencias de intrones que están usualmente presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcripto de ARN inicial y primario es un precursor del ARNm que se procesa mediante una serie de pasos antes de la aparición como ARNm maduro con empalme. Estos pasos incluyen la eliminación de las secuencias de intrón mediante un proceso llamado empalme. El ADNc derivado del ARNm carece, en consecuencia, de cualquier secuencia de intrón. Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" tal como se emplea en la presente descripción se refiere a la molécula de ácido nucleico, de cadena simple o doble, la cual se aisla de un gen de producción natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos en una forma que no exista de otra manera en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es un sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias control requeridas para la expresión de una secuencia codificadora de la presente invención. Secuencia control: El término "secuencias control" define en la presente descripción a todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido codificador de una defensina. Cada secuencia control puede ser nativa o extraña para la secuencia codificadora de la defensina. Tales secuencias control incluyen pero sin limitaciones a un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen un promotor, y señales de detención transcripcional y traduccional. Las secuencias control se pueden proporcionar con ligadores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligadura de las secuencias control con la región codificante de la secuencia del nucleótido que codifica una defensina. Operativamente unido: El término "operativamente unido" indica en la presente descripción una configuración en la cual se coloca una secuencia control en una posición apropiada en relación con la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótidos de manera tal que la secuencia control dirige la expresión de la secuencia codificante de una defensina. Secuencia codificante: Cuando se emplea en la presente descripción el término "secuencia codificante" significa una secuencia de nucleótidos, que se dirige específicamente a la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, el cual usualmente comienza con el codón de iniciación ATG o codones de iniciación alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser un secuencia de ADN, ADNc o nucleótidos recombinantes. Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso involucrado en la producción de la defensina que incluye pero sin limitaciones a, transcripción, modificación pos-transcripcional, traducción, modificación pos-traduccional y secreción. Vector de expresión: El término "vector de expresión" se define en la presente descripción como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un péptido de defensina, y el cual está operativamente unido a nucleótidos adicionales que garantizan su expresión. Célula huésped: El término "célula huésped", tal como se emplea en la presente descripción, incluye cualquier tipo de célula susceptible a la transformación, transfección, transducción y otras similares con una construcción de ácido nucleico de la presente invención. Modificación: El término "modificación" en la presente descripción significa cualquier modificación química de la defensina. Las modificaciones pueden ser sustitución (es) , deleción (es) y/o inserción (es) de los aminoácido (s) además de los reemplazo (s) de cadenas laterales de aminoácidos; o empleo de aminoácidos no naturales con características similares en la secuencia de aminoácidos. En particular las modificación (es) pueden ser amidaciones, tales como amidación - del C-terminal. Identidad: El parentesco entre las secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describen por el parámetro "identidad". Para los propósitos de la presente invención, se determina el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos por medio del programa FASTA incluido en la versión 2. Ox del paquete del programa FASTA (ver W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; and W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). La matriz de clasificación empleada fue BLOSUM50, la penalización de apertura fue de -12, y la penalización por extensión de una apertura fue -2. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el mismo algoritmo y paquete de programa de computación tal como se describió anteriormente. La matriz de clasificación empleada fue la matriz de identidad, la penalización de apertura fue -16, y la penalización por extensión de una apertura fue -4. Alternativamente, se determina el alineamiento de dos secuencias de aminoácidos por medio del programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo del alineamiento global - - descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución empleada es BLOSUM62, la penalización de apertura es 10, y la penalización por extensión de una apertura es 0.5. El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención" ; por ej . , aminoácidos 1 a 40 de la SEC ID NO:2) y una secuencia de aminoácidos diferentes ( "secuencia extraña" ) se calcula como el número de apareamientos exactos en la superposición de un alineamiento de dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la "secuencia extraña", cualquiera que sea la más corta. El resultado se expresa como porcentaje de identidad. Un apareamiento exacto se produce cuando la "secuencia de la invención" y la "secuencia extraña" presentan residuos de aminoácidos idénticos en la misma posición de la superposición. La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos de la secuencia (por ej . , la longitud de aminoácidos 1 a 40 de la SEC ID NO:2 es 40). Defensinas La defensina de la invención es cualquier péptido antimicrobiano reconocido por un experto en el arte como perteneciente a la clase de defensina de péptidos antimicrobianos. Para determinar si un péptido antimicrobiano es una defensina de acuerdo con la invención, la secuencia de - aminoácidos es con preferencia comparada con los perfiles del modelo oculto de Markov (perfiles HMM) de la base de datos bien conocida PFAM (ver Ejemplo 6) . Las defensinas pueden pertenecer a la clase de alfa-defensina, betadefensina, theta-defensina, la defensina de artrópodos, defensina de insectos, defensina de plantas. Las defensinas pueden ser también defensinas sintéticas que comparten los rasgos característicos de cualquier clase de defensina. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de una defensina de acuerdo con la invención comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de cisteína, con preferencia 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de cisteína, con más preferencia 6, 8 o 10 residuos de cisteína, y con mayor preferencia 6 u 8 residuos de cisteína. Ejemplo de defensinas incluyen pero sin limitaciones a, a-Defensin HNP-1 (péptido de neutrófilo humano) HNP-2 y HNP-3; ß-Defensin-12, Drosomicina, Heliomicina, ?l-purotionina, defensina A de insecto, y la defensina descrita en las solicitudes de PCT WO 9953053 (RHONE POULENC AGROCHIMIE) 21.10.1999 y WO 02085934 (ENTOMED) 31.10.2002, las cuales están incorporadas en la presente descripción como referencia; o aquellas expuestas en las secuencias de aminoácidos maduros de las SEC ID NO:2, SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID N 0:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14 - y SEC ID NO: 16 - o secuencias de aminoácidos, las cuales son al menos 60%, con preferencia 70%, con más preferencia 80%, aun con más preferencia 90%, y con máxima preferencia 95% idénticas a estas secuencias. Una defensina de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente una o más modificaciones químicas en comparación con estas secuencias de aminoácidos. Las alfa-defensinas se pueden definir como péptidos antimicrobianos que comprenden la secuencia de aminoácidos: C-X?-C-X2-C-X3-C-X -C-C - donde Xi representa 1 aminoácido; con preferencia X?=Y, F, A, R, I, S, T, H o V; con más preferencia X?=Y, F, A o R; aun con más preferencia X?=Y o F; con mayor con preferencia X?=Y; X2 representa 4 o 5 aminoácidos; con preferencia X2 representa 4 aminoácidos; con más preferencia X2=Z?~Z2-Z3-Z4, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=R, T o K; con más preferencia Z?=R; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2=R, I, T, K; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3=R, P or G; Z4 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z4=G, A or R; X3 representa 9 aminoácidos, con preferencia X3=Z?-Z2-Z3-Z -Z5-Z6-Z7-G-Z8, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=K, L o R; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2=R, F, A, S o G; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3=R, G, P o T; con más preferencia Z3=R o G; Z representa cualquier aminoácido; Z4=E o Y; con preferencia Z4=E; Z5 representa cualquier aminoácido; con preferencia Zs=R, H o S; Ze representa cualquier aminoácido; con preferencia Zd=R, M o L; Z7 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z =N, S, Y o I; Z8 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z8=T, S, Y o A; X4 representa 9 aminoácidos; con preferencia X4=Z?~Z2-Z -Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=R o I; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2= K, I, Y, F o L; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3= - G, N, R o Q; Z4 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z4=G, H o N; Z5 representa cualquier aminoácido; con preferencia Zs=R o L; Z6 representa cualquier aminoácido; con preferencia Zs= I, L, M, V o R; Z7 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z =Y, W, H o F; Z8 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z8=T, R o A; Zg representa cualquier aminoácido; con preferencia Z9=L, F o R; con más preferencia Z9=L o F. Beta-defensinas se pueden definir como péptidos antimicrobianos que comprenden la secuencia de aminoácidos: C—X?_C—X2-C—X3—C-X —C—c - donde Xi representa 6 aminoácidos; con preferencia X?=Z?~Z2-Z3-Z4-Z5-Z6, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=R, V o L; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2=R, I. K o Q; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3=N o S; - - Z4 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z4=G, K o R; Z5 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z8=G; Zd representa cualquier aminoácido; con preferencia Zg=Q, I, V o F; X2 representa 3 o 4 aminoácidos; con preferencia X2 representa 4 aminoácidos; con más preferencia X2=Z?~Z -Z3-Z4, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=L, V, I, H o A; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2=P o Y; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3=S, I, N o G; Z4 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z =R, A o S; X3 representa 9 aminoácidos; con preferencia X3=Z?~Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=P; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2=G, I, R o P; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3=Y, N, P, R, F o H; Z4 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z4=T, M o Y; Z5 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z8=R o K; Zß representa cualquier aminoácido; con preferencia Z6=Q o I; Z7 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z=I o Q; Z8 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z8=S; Z9 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z9=T; X4 representa 6 aminoácidos; con preferencia X4=Z?~Z2-Z3-Z4-Z5-Z6, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=Y, F, G o L; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2=G, H, P, L, R o T; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3=G, P o R; Z representa cualquier aminoácido; con preferencia Z4=K, P, R, G o Q; Z5 representa cualquier aminoácido; con preferencia Zs=V, A, I o G; Z6 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z6=K.

Las defensinas de insectos se pueden definir como péptidos antimicrobianos que comprenden la secuencia de aminoácidos : C-X?-C-X2-C-X3-C-X4-C-X5-C - - donde Xi representa 5-16 aminoácidos; X2 representa 3 aminoácidos; con preferencia X2=Z?~Z2-Z3, donde Zi representa cualquier aminoácido; con preferencia Z?=A o H; Z2 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z2=A o R; Z3 representa cualquier aminoácido; con preferencia Z3=H; X3 representa 9-11 aminoácidos; X4 representa; 4-10 aminoácidos; Xs representa 1 aminoácido; con preferencia Xs=V, T, I, H, K, N o L. En una modalidad, la defensina de la invención presenta más de una actividad antimicrobiana seleccionada entre actividad antifúngica, actividad antibacteriana y actividad antiviral . Una defensina de la invención se puede obtener de microorganismos de cualquier género. Para los propósitos de la invención, el término "obtenido de" tal como se emplea en la presente descripción en conexión con una fuente dada, significará que la defensina codificada por una secuencia de nucleótidos se produce por la fuente o cepa en la cual la secuencia de nucleótidos de la fuente se ha insertado. En un aspecto preferido, la defensina obtenida de una fuente dada se secreta en forma extracelular.

Una defensina de la presente invención puede ser una defensina fúngica, y con más preferencia una defensina de levaduras tales como defensina de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia; o con más preferencia una defensina de hongo filamentosa tales como una defensina de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma . En un aspecto preferido, la defensina es una defensina de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis que tiene una actividad antimicrobiana . En otro aspecto preferido, la defensina es una defensina de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, - Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma Iongibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride. Se considerará que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca los estados perfectos e imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ej . , a namorfos, independientemente de los nombres de las especies por los cuales son conocidos. Los expertos en el arte reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados . Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivo, tales como el American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) . Además, tales defensinas se pueden identificar y obtener de otras fuentes que incluyen los microorganismos aislados de la naturaleza (por ej . , suelo, abonos, agua, etc.) que emplean las sondas previamente mencionadas. Las técnicas de - aislamiento de los microorganismos de sus hábitats naturales son bien conocidas en el arte. El polinucleótido se puede obtener por exámenes similares de una biblioteca genómica o de ADNc de otro microorganismo. Una vez que la secuencia de polinucleótido que codifica una defensina ha sido detectada con las sonda (s), el polinucleótido se puede aislar o clonar mediante la utilización de técnicas que son bien conocidos para los que tienen experiencia en el arte (ver, por ej . , SAMBROOK, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. ISBN 0879693096. ) . Las defensinas de la presente invención también incluyen defensinas fusionadas o defensinas fusionadas desdoblables en las cuales otra defensina está fusionada al N-terminal o el C-terminal de la defensina o un fragmento del mismo. Una defensina fusionada se produce por fusión de una secuencia de nucleótidos (o una porción de la misma) que codifica otra defensina a una secuencia de nucleótidos (o una porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para la producción de la fusión de las defensinas son conocidas en el arte, e incluyen el ligamiento de las secuencias codificantes que codifican las defensinas de manera tal que están en el marco y la expresión de la defensina fusionada está bajo control del mismo promotor (es) y terminador.

Secuencias de ácidos nucleicos La presente invención también se refiere a los polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica una defensina de la invención. Ejemplos de tales polinucleótidos incluyen pero sin limitaciones a, a aquellos descritos en la solicitud PCT WO 99/53053, las cuales están incorporadas en la presente descripción como referencia. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos se expone en la SEC ID NO:l, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:ll, SEC ID NO:13 o SEC ID NO:15 de la presente invención. En otra modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos es la región codificadora de la defensina madura de la SEC ID NO:l, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:ll, SEC ID NO:13 o SEC ID NO: 15. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican una defensina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 16, o su defesina madura, la cual difiere en la SEC ID NO:l, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:ll, SEC ID NO:13 o SEC ID NO:15 en virtud de la degeneración del código genético. Las técnicas empleadas para aislar o donar un polinucleótido que codifica una defensina son conocidas en el arte e incluyen el aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc o una combinación del mismo. La donación de los polinucleótidos que codifican las defensinas de la invención de tales ADN genómicos se pueden efectuar, por ej . , mediante la reacción en cadena de polimerasa bien conocida (PCR) o detección de anticuerpos de librerías de expresión para detectar fragmentos de ADN donados con rasgos estructurales compartidos. Ver, por ej . , Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Se pueden emplear otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como la reacción en cadena de ligasa (LCR) , transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación basada en secuencias de nucleótidos (NASBA) . Los polinucleótidos se pueden donar a partir de una cepa de Eurotium, Aspergillus, Pseudoplectania, Crassostrea, Mesobuthus u otro u organismos relacionados y de esta manera, por ejemplo, puede ser una variante alélica o especies de la región codificadora de la defensina de las secuencias de nucleótidos. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos, los cuales tienen un grado de identidad con la secuencia codificante de una defensina madura de la SEC ID NO:l, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID N0:9, SEC ID NO:ll, SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 15 de al menos 60%, con preferencia al menos 65%, con más preferencia al menos 70%, con más preferencia al menos 75%, con más preferencia al menos 80%, con más preferencia al menos 85%, con más preferencia al menos 90%, aun con más preferencia al menos 95%, y con la máxima preferencia al menos 97% de identidad, la cual codifica un polipéptido antimicrobiano de defensina. La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica una defensina de la invención puede ser necesaria para la síntesis de defensinas sustancialmente similares a la defensina. El término "sustancialmente similar" a la defensina se refiere a las formas de la defensina que no se producen naturalmente. Estas defensinas pueden diferir en algunas formas creadas a partir de la defensina aislada de su fuente nativa, por ej , variantes artificiales que difieren en la actividad específica, termoestablidad, pH óptimo u otro similar. La secuencia de la variante se puede construir sobre la base de la secuencia de nucleótidos presentados como la región codificante de la defensina de SEC ID NO:l, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 15 por ej . , una subsecuencia de la misma y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos, las cuales no dan origen a otra secuencia de aminoácidos de la defensina codificada por la secuencia de nucleótidos, pero corresponden al uso del codón del organismo huésped previsto para la producción de la enzima o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar origen a una - secuencia de aminoácido diferente. Para una descripción general de una sustitución de nucleótido, ver, por ej . , Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Será evidente para los expertos en el arte que tales sustituciones se pueden hacer por fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y producir aún una defensina activa. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad de la defensina, y en consecuencia con preferencia no sometidos a sustitución, se pueden identificar de acuerdo con los procedimientos conocidos en el arte, tales como mutagénesis dirigida a un sitio o mutagénesis por barrido de alanina (ver, por ej . , Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la ultima técnica, se introducen mutaciones en cada residuo cargado positivamente en la molécula y se examina la actividad antimicrobiana de las moléculas mutantes resultantes para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Se puede determinar los sitios de interacción mediante el análisis de la estructura tridimensional por técnicas tales como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (ver, por ej . , de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64). La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican una defensina de la invención, los cuales hibridizan bajo condiciones de rigurosidad baja, con preferencia condiciones de rigurosidad media, con más preferencia condiciones de rigurosidad media-alta, aun con más preferencia condiciones de rigurosidad alta, y con máxima preferencia condiciones de muy alta rigurosidad con (i) el péptido maduro que codifica la secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID N0:1, SEC ID N0:3, SEC ID NO: 5, SEC ID N0:7, SEC ID N0:9, SEC ID N0:11, SEC ID N0:13 o SEC ID N0:15, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la SEC ID NO:l, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID N0:11, SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 15, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de la misma (Sambrook et al., 1989, supra), tal como se define en la presente descripción. La presente invención también se refiere a los polinucleótidos obtenidos por (a) hibridización de una población de ADN bajo condiciones de baja, media, media-alta, alta o muy alta rigurosidad con (i) la defensina madura que codifica una secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID NO:l, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 15, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la SEC ID NO:l, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:ll, SEC ID NO:13 o SEC ID N0:15, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); y (b) aislamiento del polinucleótido de hibridización, el cual codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana. Construcciones de ácidos nucleicos La presente invención también se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido, que codifica una defensina de la invención operativamente unida a una o más de las secuencias control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped bajo condiciones compatible con la secuencia control. Un polinucléotido que codifica una defensina de la invención se puede manipular en una variedad de maneras para proporcionar la expresión de la defensina. La manipulación de la secuencia del polinucleótido previamente a su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de polinucleótidos que utlizan métodos de ADN recombinantes son bien conocidos en el arte. La secuencia control puede ser una secuencia de promotor apropiada, una secuencia de nucleótido que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica una defensina de la invención. La secuencia del promotor contiene secuencia de control transcripcional que median la expresión de la defensina. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótido que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección que incluyen promotores mutantes, truncados e híbridos, y se pueden obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, homólogos o heterólogos para la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped de hongo filamentoso son los promotores obtenidos de los genes para TAKA ami-lasa de Aspergillus oryzae, aspártico proteinasa de Rhizomucor miehei, alfaamilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa acida estable de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA) , lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosafosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Darla (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), betaglucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, betaxilosidasa de Trichoderma reesei, además del promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae) ; y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. Las secuencias control pueden ser también una secuencia de terminación de transcripción adecuada, un secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia de terminación está operativamente unida al 3' terminal de la secuencia de nucleótidos que codifica la defensina. Cualquiera de las secuencias de terminación funcional en la célula huésped de elección se puede emplear en la presente invención. Las secuencias de terminación preferidas para la célula huésped de hongos filamentosos se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum. La secuencia control puede ser también una secuencia líder adecuada, región no traducida de un ARNm, la cual es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente unida al 5' terminal de la secuencia de nucleótidos que codifican la defensina. Se puede emplear en la presente invención cualquier secuencia - - lider que sea funcional en la célula huésped de elección. Los líderes preferidos para las células huéspedes de los hongos filamentosos se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans. La secuencia control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al 3' terminal de la secuencia de nucleótidos y la cual, al ser transcripta, es reconocida por la célula huésped como una señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm trancripto. Se puede emplear en la presente invención cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección. Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células huéspedes de hongos filamentosos se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger. La secuencia control también puede ser una región codificante de un péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos ligada al amino terminal de una defensina y dirige la defensina codificada en la vía secretora de la célula. El extremo 51 de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede contener - - inherentemente una región codificante de un péptido señal ligado naturalmente en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la región codificante que codifica la defensina secretada. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal extraña para la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal extraña se puede requerir cuando la secuencia codificante no contiene naturalmente una región codificante del péptido señal. Alternativamente, la región codificante del péptido señal extraña puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural con el fin de aumentar la secreción de la defensina. Sin embargo, en la presente invención se puede emplear cualquier región codificante del péptido señal que dirija la expresión de defensina en la vía secretoria de una célula huésped de elección. Las regiones codificantes del péptido señal efectivas para las células huéspedes de hongos filamentosos son las regiones codificantes del péptido señal que se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, aspártico proteinasa de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa. En un aspecto preferido, la región codificante del péptido señal tiene los nucleótidos 1 a 69 de la SEC ID N0:1 que codifica los aminoácidos -55 a -33 de la SEC ID NO: 2; nucleótidos 1 a 60 de SEC ID NO: 3 que codifica los aminoácidos -48 a 29 de la SEC ID NO: 4; nucleótidos 1 a 60 de la SEC ID NO: 5 que codifica los aminoácidos 50 a 31 de la SEC ID NO: 6; nucleótidos 1 a 66 de la SEC ID NO: 7 que codifica los aminoácidos 22 a 1 de la SEC ID NO: 8; nucleótidos 1 a 72 de la SEC ID NO: 9 que codifica los aminoácidos 24 a 1 de la SEC ID NO: 10; nucleótidos 1 a 66 de la SEC ID NO: 11 que codifica los aminoácidos 22 a 1 de la SEC ID NO: 12; nucleótidos 1 a 66 de la SEC ID NO: 13 que codifica los aminoácidos 22 a 1 de la SEC ID NO: 14; o nucleótidos 1 a 54 de la SEC ID NO: 15 que codifica los aminoácidos 26 a 9 de la SEC ID NO:16. La secuencia control puede ser también una región codificante de un propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos ubicada en la posición del amino terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Un propolipéptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido maduro activo por ruptura catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener a partir de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT) , factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, aspático proteinasa de - Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) . En un aspecto preferido, la región codificante del propéptido tiene los nucleótidos 70 a 165 de la SEC ID NO:l que codifica los aminoácidos 32 a 1 de la SEC ID NO: 2; nucleótidos 61 a 144 de la SEC ID NO: 3 que codifica los aminoácidos 28 a 1 de la SEC ID NO: 4; nucleótidos 61 a 150 de la SEC ID NO: 5 que codifica los aminoácidos 30 a 1 de la SEC ID NO: 6; o nucleótidos 55 a 78 de la SEC ID NO: 15 que codifica los aminoácidos 8 a 1 de la SEC ID NO: 16. Cuando ambas regiones del propéptido y del péptido señal están presentes en el amino terminal de un polipéptido, la región del propéptido se ubica próxima al amino terminal de un polipéptido y la región del péptido señal está ubicada próxima al amino terminal de la región del propéptido. También puede ser deseable agregar secuencias regulatorias que permitan la regulación de la expresión de la defensina relacionada con el crecimiento de célula huésped. Ejemplos de sistemas regulatorios son los que causan que la expresión del gen se desarrolle o no en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluyen la presencia de un compuesto regulatorio. Los sistemas regulatorios en los sistemas procarióticos incluyen los sistemas del operador lac, tac, y trp. En las levaduras, se puede emplear el sistema ADH2 o GALl. En hongos filamentosos, se puede emplear - - el TAKA alfa amilasa promotor , el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae como secuencias regulatorias. Otros ejemplos de secuencias regulatorias son aquellas que permiten la amplificación de los genes. En los sistemas eucarióticos, se incluye el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica la defensina debería estar operativamente unida a la secuencia regulatoria. Vector de expresión La presente invención se refiere también a vectores de expresión recombinante que comprenden un polinucleótido que codifica una defensina de la invención, un promotor, y señales de detención transcripcionales y traduccionales. Los diferentes ácidos nucleicos y secuencias control descritos anteriormente se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante, el cual puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica la defensina en tales sitios. Alternativamente, un secuencia de nucleótidos que codifica una defensina de la invención se puede expresar por inserción de la secuencia de nucleótidos o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Para crear el vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de manera tal que la secuencia de codificación esté operativamente unida con las secuencias control apropiadas para la expresión. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ej . , un plásmido o virus) que se puede someter en forma conveniente a los procedimientos de ADN recombinante y pueden provocar la expresión de la secuencia del nucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en al cual se introduce el vector. Losa vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación crosómica, por ej . , un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación . Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra dentro del genoma y se replica junto con los cromosomas (s ) dentro de los cuales se ha integrado. Además, se puede emplear un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos, los cuales contienen en conjunto el ADN total que - se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón. Los vectores empleados para la expresión de las defensinas de la invención con preferencia contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un producto génico que proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a los metales pesados, prototrofía a auxótrofos y otras similares. Ejemplos de marcadores seleccionables para emplear en una célula huésped de hongos filamentosos incluye pero sin limitaciones a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidin-51 -fosfato decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), además de sus equivalentes. Los genes preferidos para emplear en una célula de Aspergillus son los genes de amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus . Los vectores con preferencia contienen un elemento (s) que permite la integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector de la célula independiente del genoma. Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de polinucleótido que codifica la defensina o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por medio de recombinación homologa en el genoma de la célula huésped en una localización precisa en los cromosoma (s) . Para aumentar la probabilidad de integración en una localización precisa, los elementos integracionales deberían con preferencia contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10.000 pares de bases, con preferencia 400 a 10.000 pares de bases, y con más preferencia 800 a 10.000 pares de bases, los cuales tienen un alto grado de identidad con la secuencia blanco correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia homologa con la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homologa. Para la replicación autónoma, el vector puede comprender adicionalmente un origen de replicación que permite al vector replicarse en forma autónoma en la célula huésped en - cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define en la presente descripción como una secuencia de nucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo. Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMAl y ANSÍ (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883) . El aislamiento del gen AMAl y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se pueden lograr de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883. Más de una copia de un polinucleótido que codifica una defensina de la invención se puede insertar en la célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Se puede obtener un aumento del número de copias del polinucleótido por integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o por inclusión del gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido cuando las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y por lo tanto, las copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar para cultivar las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos que se emplean para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son bien conocidos para los expertos en el arte (ver, por ej . , Sambrook et al., 1989, supra). Célula huésped de hongos filamentosos La célula huésped (u organismo) de la invención es un hongo filamentoso que incluye todas las formas filamentosas de las divisiones Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (tal como se define en Kirk, P.M. et al., In, Ainsworth y Bisby's Dictionary of The Fungi, 9th edición, 2001, CAB International, Wallingford, UK) . Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina y glucano y/u otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal.

Con preferencia el catabolismo de carbono es obligadamente aeróbico . En una modalidad, la célula huésped de hongos filamentosos (u organismo) pertenece al orden de Eurotiales de la subdivisión Ascomycota; con preferencia más específicamente pertenece a la familia Trichocomaceae. En una modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos (u organismo) es una célula de las siguientes especies, pero sin limitaciones, de Acremonium, Aspergillus, Emericella, Eurotium, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Eupenicillium, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma o un telemorfo, anamorfo o sinónimo del mismo. En una modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Aspergillus. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Acremonium. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Fusarium. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una Humicola. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Mucor. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una Myceliophthora. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una Neurospora. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Penicillium. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una Thielavia. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Tolypocladium. En otra modalidad aun más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Trichoderma. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra modalidad preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Fusarium de la sección Discolor (también conocido como la sección Fusarium) . Por ejemplo, la célula huésped de hongos filamentosos puede ser un Fusarium bacetridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum o Fusarium trichothecioides . En otra modalidad preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una cepa de Fusarium de la sección Elegans, por ej . , Fusarium oxysporum. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una Humicola insolens o Humicola lanuginosa. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es Mucor miehei. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Myceliophthora thermophilum. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una célula de Neurospora crassa. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es un Penicillium purpurogenum o Penicillium funiculosum (WO 00/68401) . En otra modalidad más preferida, la célula huésped de hongos filamentosos es una Thielavia terrestris. En otra modalidad más preferida, la célula de Trichodermal es Trichoderma harzianum, Trichoderma - koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. En una modalidad particular la célula huésped de hongo filamentoso es Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. En una modalidad preferida de la invención la célula huésped es una cepa deficiente en proteasa o proteasa negativa . Esta puede ser por ejemplo, la cepa deficiente en proteasa de Aspergillus oryzae JaL 125 que tiene el gen de proteasa alcalina llamado "alp" suprimido. Esta cepa se describe en WO 9735956 (NOVO NORDISK NS) 02.10.1997 , o EP 429490 (GENENCOR) 05.06.1991, o la célula huésped libre de TPAP, en particular una cepa de Aspergillus niger, descrita en WO 9614404 (NOVO NORDISK NS) 17.05.1996. Además, también las células huéspedes, especialmente las de A. niger o A. oryzae, con producción reducida del activador transcripcional (prtT) tal como se describe en WO 0168864 (NOVOZYMES NS) 20.09.2001 están específicamente contempladas de acuerdo con la invención. Intrones Los genes eucarióticos se pueden interrumpir por secuencias de intervención (intrones) que se deben modificar en precursores de transcriptos con el fin de producir ARNm funcionales. Este proceso de eliminación de un intrón es conocido como empalme de pre-ARNm. Usualmente, una secuencia - del punto de ramificación de un intrón es necesaria para el empalme del intrón mediante la formación de lazo. Las señales para empalme residen directamente en los límites de los sitios de empalme del intrón. Los límites de los sitios de empalme del intrón usualmente tienen las secuencias de intrón de consenso GT y AG en sus extremidades 5' y 31, respectivamente. Si bien no se han informado sitios de empalme 3' diferentes de AG, se han informado unas pocas excepciones al sitio de empalme 5' GT . Por ejemplo, hay precedentes en los que CT o GC se sustituyen con GT en los límites del 5'. También hay una marcada preferencia para las bases de nucleótidos ANGT para seguir a GT donde N es A, C, G o T (principalmente A o T en las especies de Saccharomyces) , pero no hay una preferencia marcada por cualquier nucleótido en particular para preceder al sitio de empalme de GT . El sitio de empalme 3' de AG es principalmente precedido por una base nucleotídica de pirimidina (Py), es decir, C o T. El número de intrones que puede interrumpir un gen fúngico varía de uno a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más intrones. Estos se pueden distribuir a lo largo del gen o situado hacia el extremo 5' o 3' de un gen. En Saccharomyces cerevisiae, los intrones se localizan principalmente en el extremo 5' del gen. Los intrones pueden tener un tamaño generalmente menor de 1 kb, y usualmente tiene un tamaño menor de 400 bp en las levaduras y - menor de 100 bp en hongos filamentosos. La secuencia del punto de ramificación del intrón de Saccharomyces cerevisiae 5' -TACTAAC-3' rara vez aparece exactamente en los intrones de los hongos filamentosos. Las extensiones de secuencia que se parecen estrecha o aproximadamente a TACTAAC se observan en puntos equivalentes en intrones de hongos filamentosos con consenso general NRCTRAC donde N es A, C, G o T, y R es A o G. Por ejemplo, la cuarta posición T es invariable en ambas secuencias de consenso putativas de Neurospora crassa y Aspergillus nidulans. Además, los nucleótidos G, A y C predominan en más del 80% de las posiciones 3, 6 y 7, respectivamente, aunque la posición 7 de Aspergillus nidulans es más flexible con solo 65% de C. Sin embargo, las posiciones 1, 2, 5 y 8 son mucho menos estrictas en Neurospora crassa y Aspergillus nidulans. Otros hongos filamentosos tienen extensiones del punto de ramificación similares en posiciones equivalentes en sus intrones, pero el muestreo es demasiado pequeño para discernir tendencias definitivas. Métodos y usos En un primer aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped recombinante de hongos filamentosos, que comprende una construcción de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico extraña que codifica una defensina y una o más secuencias de intrón. El término "secuencia de ácido nucleico extraña" significa una secuencia de ácido nucleico que se ha introducido desde el exterior (de una fuente extraña) . La célula huésped de hongos filamentosos puede ser capaz de expresar (producir) la defensina en una cantidad de al menos 150%, con más preferencia 200%, con más preferencia 250%, y con mayor preferencia 300% de la cantidad obtenida cuando se emplea una construcción de ácido nucleico sin una secuencia de intrón, tal como una secuencia de ADNc. La célula huésped de hongos filamentosos pueden crecer en un medio de crecimiento YPM por 3-5 días a 30-35 grados Celsius con agitación adecuada. Este y otros métodos adecuados para cultivar los hongos filamentosos son bien conocidos en el arte. La célula huésped de hongos filamentosos se puede emplear para la producción recombinante de defensinas. En un segundo aspecto la invención proporciona un método para la producción recombinante de una defensina en una célula huésped de hongos filamentosos, la cual incluye el cultivo de la célula huésped de hongos filamentosos que comprende una construcción de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de defensina y una o más secuencias de intrón; y la recuperación del péptido de defensina. Los métodos de recuperación adecuados son bien conocidos en el arte . La invención también se refiere al empleo de una construcción de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de defensina y una o más de las secuencias de intrón, par mejorar el nivel de expresión recombinante de la defensina en una célula huésped de hongos filamentosos. El nivel de expresión de la defensina puede ser al menos 50% superior, con preferencia al menos 75% superior, con más preferencia al menos 100% superior, aun con más preferencia al menos 125% superior, con máxima preferencia 150% superior, y en particular 200% superior en comparación con el empleo de una construcción de ácido nucleico que no comprende una secuencia de intrón, tal como una secuencia de ADNc. Alternativamente, el nivel de expresión de la defensina puede ser al menos 150%, con preferencia 200%, con más preferencia 250%, y la máxima preferencia 300% del nivel de expresión que se obtiene cuando se emplea una construcción de ácido nucleico sin una secuencia de intrón, tal como una secuencia de ADNc. El nivel de expresión se mide en gramos de proteína de defensina por litro de líquido de fermentación. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico de la invención contiene 1, 2, 3, 4 o 5 secuencias de intrón, con preferencia 1, 2, 3 o 4 secuencias de intrón, con más preferencia 1, 2 o 3 secuencias de intrón, aun con más - preferencia 1 o 2 secuencias de intrón (s), y con mayor preferencia una secuencia de intrón. En otra modalidad, la construcción de ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de defensina y al menos uno, con preferencia al menos dos, con más preferencia al menos tres, y con máxima preferencia al menos cuatro secuencias de intrón . Las secuencias de intrón se pueden localizar en el péptido señal, propéptido o péptido maduro que codifica la parte de la construcción de ácido nucleico de la invención.

Cuando la construcción de ácido nucleico contiene mas de un intrón, los intrones se pueden localizar en diferentes partes de la construcción. Las secuencias de intrón pueden localizarse en cualquier parte del gen de defensina que se transcribe en ARNm. Formulaciones farmacéuticas Las defensinas de esta invención se pueden incorporar en una variedad de formulaciones farmacéuticas para administración terapéutica. Más particularmente, las defensinas de la presente invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas por combinación con vehículos o diluyentes aceptables para uso farmacéutico y se pueden formular en preparaciones en formas sólidas, semi-sólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, granulos, ungüentos, cremas, espumas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas, lociones y aerosoles. Como tales, la administración de las defensinas se puede lograr en varias formas, que incluyen la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intraqueal, etc. De acuerdo con la invención, las defensinas son sistémicas después de la administración. Las defensinas de la invención se pueden administrar solas, en combinación con otras, o se pueden emplear en combinación con otros compuestos conocidos (por ej . , perforina, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, etc.). En las formas de dosificación farmacéutica, las defensinas se pueden administrar en la forma de sus sales aceptables para uso farmacéutico. Los métodos y excipientes siguientes son simplemente ejemplos y no son limitantes. Para preparaciones orales, las defensinas se pueden emplear solas o en combinación con aditivos apropiados para fabricar comprimidos, polvos, granulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de papa; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegran-tes, tales como almidón de maíz, almidón de papa o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se requiere, con diluyentes, agentes bufferizantes, agentes humidificantes, agentes conservantes y aromatizantes. Las defensinas se pueden formular en preparaciones para inyecciones por disolución, suspensión o emulsificación en solventes acuosos o no acuosos, tales como los aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, esteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de supensión, agentes emulsificantes, estabilizantes y conservantes . Las defensinas de la invención se pueden emplear en una formulación en aerosol para administrarse por medio de inhalación. Las defensinas se pueden formular en propelentes presurizados aceptables tales como diclorofluorometano, propano, nitrógeno y otros similares. Además, las defensinas se pueden fabricar en supositorios mediante la mezcla de una variedad de bases tales como bases emulsificantes o hidrosolubles. Las defensinas se pueden administrar por vía rectal mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carbowaxes y polietilenglicoles, que funden a temperatura corporal, y se solidifican a temperatura ambiente.

Las formas de dosis unitarias para administración oral o rectal tales como jarabes, elixires y suspensiones se pueden proporcionar donde cada unidad de dosis, por ejemplo, cucharadita, cucharada colmada, comprimido o supositorio contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene una o más defensinas de la presente invención. En forma similar, las formas de unidades de dosis para inyecciones o administración intravenosa puede comprender las defensinas de la presente invención en una composición como una solución en agua estéril, salina normal u otro vehículo aceptable par uso farmacéutico. El término "forma de unidad de dosis", tal como se emplea en la presente descripción, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos animales y humanos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de defensinas de la invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, vehículo o transportador aceptable para uso farmacéutico. Las especificaciones para estas formas de unidades de dosis de la presente invención dependen de la defensina particular empleado y el efecto que se quiere lograr, y la farmacodinámica asociada con la defensina en el huésped. Los excipientes aceptables para uso farmacéutico, t ales como vehículos, adyuvantes, transportadores o diluyentes, son - - fácilmente disponibles al público. Además, las sustancias auxiliares aceptables para uso farmacéutico tales como los agentes que ajustan pH y agentes bufferizantes, agentes que ajustan la tonicidad, estabilizantes, agentes humidificantes y otros similares, están fácilmente disponibles al público. Las dosificaciones típicas para la administración sistémica varían de 0.1 pg a 100 miligramos por kilo de peso del sujeto por administración. Una dosificación típica puede ser un comprimido tomado de dos a seis veces por día, o una cápsula o comprimido de liberación con el tiempo tomado una vez por día y que contiene una cantidad proporcionalmente superior del componente activo. El efecto de liberación con el tiempo se puede obtener por materiales de cápsulas que se disuelven a diferentes valores de pH, por cápsulas que se liberan lentamente por presión osmótica, o por cualquier otro medio conocido de liberación controlada. Los expertos en el arte apreciarán fácilmente que los niveles de dosis pueden variar en función de la defensina específica, la gravedad de los síntomas y la sensibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Algunas de las defensinas específicas son más potentes que otras. Las dosificaciones preferidas para una defensina dada son determinadas con facilidad por los expertos en el arte por una variedad de medios. Un medio preferido es medir la potencia fisiológica de una defensina dada.

El empleo de liposomas como vehículo de administración es un método de interés. Los Ipiposomas se fusionan con las células del sitio específico y liberan el contenido del lumen intracelular. Los liposomas se mantienen en contacto con las células durante suficiente tiempo para la fusión, empleando diferentes medios para mantener contacto, tal como aislamiento, agentes aglutinantes y otros similares. En un aspecto de la invención, los liposomas se diseñan para ser aerosolizados para administración pulmonar. Los liposomas se pueden preparar con proteínas o péptidos purificados que median la fusión de membranas, tales como virus Sendai o virus de la gripe, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de lípidos conocidos que forman liposomas, incluyendo lípidos catiónicos o zwitteriónicos, tales c orno fosfatidilcolina. Los lípidos restantes serán normalmente lípidos neutros o acídicos, tales como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol y otros similares. Para la preparación de liposomas, se puede emplear el procedimiento descrito por KATO, et al. Expression of hepatitis B virus surface antigen in adult rat liver. Co-introduction of DNA and nuclear protein by a simplified liposome method. J. biol. chem.. February 1991, vol.266, p.3361-3364. Brevemente, la composición de lípidos y el lumen que contiene péptidos se combinan en un medio acuoso apropiado, convenientemente un medio salino donde los sólidos - - totales estarán en el rango de aproximadamente .1-10 por ciento en peso. Después de una agitación intensa durante periodos cortos, de aproximadamente 5-60 segundos, se coloca el tubo en un baño de agua caliente, de aproximadamente 25-40°C y se repite el ciclo aproximadamente 5-10 veces. Luego se sónica la composición durante un período de tiempo conveniente, generalmente de aproximadamente 1-10 segundos y se puede agitar adicionalmente con vortex. Luego se expande el volumen por agregado de medio acuoso, generalmente por aumento del volumen en aproximadamente 1-2 veces, seguido por agitación enérgica y enfriamiento. Este método permite incorporar dentro del lumen moléculas de alto peso molecular. Formulaciones con otros agentes activos Para su empleo en los métodos, las defensinas de la invención se pueden formular con otros agentes activos para uso farmacéutico (tales como esteroides), los cuales son bien conocidos en el arte, particularmente otros agentes antimicrobianos. Otros agentes de interés incluyen una variedad de antibióticos, tales como los conocidos en el arte. Las clases de antibióticos incluyen penicilinas, por ej . penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacillina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta lactamasa, cefalosporinas, por ej . cefaclor, cefazolin, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenems; monobactams; aminoglucósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloramfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. Los agentes antimicóticos son también útiles, incluyendo polienos, por ej . amfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azotes, por e . miconazol, ketoconazol, itraconazol y fluconazol. Los fármacos antituberculosos incluyen isoniacida, etambutol, estreptomicina y rifampina. También se pueden incluir las citoquinas en una formulación de las defensinas de la invención, por ej . interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa, interleuquina 12, etc. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las presente invención está descrita adicionalmente por los siguientes ejemplos que no deberían interpretarse como una limitación al ámbito de la invención. Ejemplos Los reactivos químicos empleados como amortiguadores y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado reactivo. Ejemplo 1 Expresión de un intrón que contiene una defensina que codifica una secuencia en Aspergillus oryzae El producto de PCR digerido 361 bp BamHl-Xhol amplificado de una genoteca de ADNc de P. nigrella (SEC ID NO: 6 de WO 03044049 (NOVOZYMES NS) 30.05.2003 ) se clonó en un vector de expresión de Aspergillus, tal como se describió previamente en WO 03/044049, para dar el plásmido pMT2549. La secuencia del intrón en la secuencia codicadora Plectasin del pMT2549 se modificó mediante mutagénesis in vítro estándar y SOE para introducir una base extra simple y de esta manera crear un sitio de restricción dentro del intrón. La secuencia codificadora Plectasin (59 bp) que contiene el intrón resultante se muestra como la SEC ID NO: 17. El plásmido de expresión correspondiente se denominó pMT2647. pMT2647 se transformó dentro del Aspergillus oryzae BECh2 tal como se describió previamente en WO 03/044049. En primer lugar, 14 transformantes individuales se reaislaron dos veces, y crecieron en un medio YPM (1% de extracto de levadura, 2% de bacto peptona y 2% de maltosa) y finalmente 10 µl de muestra se analizaron en geles SDS tal como se describió previamente en WO 03/044049. Para algunos de los transformantes la cantidad de plectasina producida a partir las intensidades de tinción pareció superar considerablemente el nivel máximo estimado de 50 mg/L previamente obtenido en condiciones de crecimiento para transformantes de A. oryzae con el plásmido de expresión que codifica el ADNc libre de intrón que codifica Plectasin (ver WO 03/044049) . Mientras que varios de los 14 transformantes pMT2549 parecieron producir niveles mayores de Plectasin que los 30 mejores de los transformantes con deficiente en intrón previamente analizados en WO 03/044049, se debería tomar en cuenta que cada transformante seleccionado con acetamida representa una transformación individual y los eventos de integración producen diferencias considerables de rendimiento entre los transformantes individuales. Se sabe que tales diferencias de rendimiento se producen en sistemas basados en recombinación no homologa, y en general se consideran una consecuencia de la integración aleatoria del locus y del número de plásmidos de expresión integrados. En consecuencia se decidió comparar también la expresión de una copia única de un vector de expresión integrado en un locus definido (ver Ejemplo 2) . Ejemplo 2 Expresión de defensina en Asperpillus oryzae a partir de los integrantes de una copia única definida Para comparar directamente la expresión en A. oryzae de Plectasin a partir de ADNc con deficiente en intrón para la expresión de la secuencia que codifica Plectasin que contiene intrón, estas se transfectaron a partir de pMT2548 (ver WO 03/044049) y pMT2549 (anterior), respectivamente, en fragmentos BamHl-Xbal de aprox. 1.1 kb al fragmento BamHl-Xbal de un vector basado en pJaL485 (8,3 kb) . (ver Ejemplo 3 en WO 03008575 (NOVOZYMES NS) 30.01.2003 ). pJaL485 contiene para la selección, solo la parte del gen niaD de A. oryzaenia, D que codifica la parte C-terminal de la nitrato reductasa. Mediante una cepa huésped tal como JaL507, un derivado de JaL294 (ver Ejemplo 8 en WO 03/008575) que contiene una deleción en esta parte del gen niaD, una nitrato reductasa funcional, y así, la capacidad de crecer en nitrato como fuente de nitrógeno, se puede restaurar solo por recombinación homologa. Se ha hallado que la mayoría de los transformantes seleccionados de esta manera son en realidad integrantes de copia única que resultan de un cruzamiento homologo único. Los integrantes en tándem del sitio niaD se producen con menor frecuencia. Los plásmidos de expresión derivados pJaL485 con deficiente en intrón y con intrón se llamaron pMT2777 y pMT2836, respectivamente. Para cada uno de estos plásmidos se seleccionaron 4 transformantes de JaL507 A. oryzae y se demostró por análisis Southern que contenían una copia única del plásmido transformante integrado homólogamente al locus de niaD locus. Los transformantes derivados de pMT2777 de A. oryzae se llamaron MT2882-2885 y los transformantes derivados de pMT2836 fueron MT2886-2889. Cada uno de los transformantes MT2882-2889 crecieron en YPM tal como se describió anteriormente y 10 pl de las muestras de sobrenadantes de cultivos después de 3 y 7 días de crecimiento se analizaron por geles PAGE SDS tal como se indicó anteriormente. El resultado muestra claramente muy poca propagación entre los transformantes con cada plásmido (tal como se esperaba ya que ellos deberían ser cepas independientes pero idénticas) . Por el contrario, es evidente que el nivel de expresión en MT2886-2889 (contiene intrón) es superior que en MT2882-2885 (deficiente en intrón) . Los niveles relativos de Plectasin en las muestras del día 7 de MT28822889 se determinaron por un ensayo ELISA (ver Ejemplo 4 ) . Ejemplo 3 Aumento de expresión de defensina a partir de genes que contienen intrón en diferentes posiciones y/o diferente intrón Para facilitar la transferencia de secuencias que codifican variantes de Plectasin a partir por ej . de vectores de E. coli y S. cerevisiae a vectores de expresión de Aspergillus, se decidió relocalizar el intrón de Plectasin que está originalmente ubicado en la secuencia que codifica Plectasin madura a una posición en la secuencia que codifica el prepro-péptido. Para realizar esto, se introdujeron mutaciones en la secuencia que codifica Plectasin deficiente en intrón mediante mutagénesis in vitro que produjo u n sitio MIuNl localizado en la secuencia que codifica el péptido señal. Esto fue posible por introducir solo el sitio MluNl para permitir el cambio de un aminoácido en el péptido señal (Leul7 cambiado a Ala) . No esta predicho que este cambio de aminoácido desmejore la función del péptido señal de acuerdo con los programas de predicción de señal comúnmente usados.

La secuencia de MIuNl deficiente en intrón que contiene la secuencia que codifica Plectasin se muestra como la SEC ID NO: 18; el plásmido de expresión en Aspergillus correspondiente se denominó pMT2898. Un intrón derivado del segundo intrón de glucoamilasa de A. niger y construido de manera tal que pueda ser escindido de un plásmido pMT2374 como un SnaBl-Pvu2 55 bp (ver Ejemplo 1 en WO 03104457 (NOVOZYMES NS) 18.12.2003 ) se insertó en el sitio MIuNl del pMT2898 para dar pMT2899 en el cual se verificó que el intrón se puede insertar en la orientación apropiada. La secuencia del intrón que contiene la secuencia que codifica Plectasin de pMT2899 se muestra como la SEC ID NO:19. También, el intrón presente originalmente en la secuencia que codifica Plectasin madura se fabricó sintéticamente de manera tal que pudiera también moverse como un fragmento de SnaBl-Pvu2. Esto fue posible por alteración de sólo las últimas dos bases del intrón de una T a una C. Este intrón se transfirió también al sitio MIuNl de pMT2898 para dar pMT2900 en el cual se verificó la correcta orientación del intrón mediante secuenciación. La secuencia de Plectasin con intrón que codifica la secuencia de pMT2900 se muestra como la SEC ID NO: 20. Los plásmidos pMT2898, 2899 y 2900 se transformaron en BECh 2 de A. oryzae selecconados por crecimiento en - acetamida. Aproximadamente 20 transformantes con cada plásmido se reaislaron dos veces y crecieron en el medio YPM tal como se describió anteriormente. A partir de los geles SDS PAGE de los sobrenadantes resultó evidente que el nivel de expresión promedio de Plectasin fue considerablemente superior para las construcciones de pMT2899 y pMT2900 que contienen los transformantes con intrón en comparación con la construcción deficiente en intrón de pMT2898. Otra vez, debido a que los niveles de expresión entre los transformantes individuales seleccionados con acetamida varían ampliamente, se decidió transferir los casettes de expresión de MT2898-2900 al vector de expresión basado en niaD derivado de pJaL485 tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. Los plásmidos de expresión resultantes fueron pMT2901, pMT2902, y pMT2903 correspondientes a pMT2898, pMT2899 y pMT2900, respectivamente. Los pMT2901-2903 se transformaron en un JaL507 huésped defectuoso en niaD , tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. Varios transformantes se reaislaron para cada una de las transformaciones. Los transformantes crecieron en YPM y los sobrenadantes se corrieron en geles SDS PAGE tal como se describió anteriormente. También en este caso es obvio que el nivel de expresión es superior para las construcciones con intrón de pMT2902y pMT2903 que para los transformantes con la construcción pMT2901. Se debe probar por análisis Southern - - que los transformantes son en realidad una integrantes de una copia única, pero a partir de la experiencia la mayoría de los transformantes seleccionados por nitrato en esta muestra se puede demostrar que son integrantes de copia única, incluso si la integración en tándem no se produce. Se seleccionaron dos transformantes como cepas representativas para cada una de pMT2901 (cepas MT2946 y MT2947), pMT2902 (cepas MT2948 y MT2949) y pMT2903 (cepas MT2952 y MT2953) . Se realizó la cuantificación por ELISA de Plectasin para MT2946-2949 (ver Ejemplo 4). Ejemplo 4 ELISA competitivo-estimación de rendimiento de Plectasin en fermentaciones de Aspergillus oryzae Mediante un anticuerpo policlonal de conejo generado contra Plectasin purificado, se realizó un ensayo ELISA competitivo indirecto para estimar rendimiento de los caldos de fermentación de Aspergillus oryzae. Este tipo de ensayo es un procedimiento estándar que se aplica generalmente para cuantificar procedimiento estándar que se aplica generalmente para cuantificar cantidades de proteína/péptido dadas, mediante un antisuero generado determinado. Se emplearon el siguiente material y amortiguadores: -Plectasin - una defensina descrita en la solicitud PCT WO 03/044049; -Placa F96 MaxiSorp (Nunc, Cat. no.: 439454); -Placa de micropocillos F96 (Nunc, Cat. no.: 269787); -Leche descremada en polvo (MERCK, Cat. no.: 1.15363.0500) ; -Tween 20 (MERCK, Cat. no.: 8.22184.0500); -Anticuerpo policlonal específico de conejo para Plectasin (Novozymes); -Inmunoglobulinas de cerdo anticonejo /HRP (DAKO, P0448) ; -TMB Plus, listo para usar (KemEnTek, Cat. no.: 4390); -Ácido sulfúrico (MERCK, Cat. no.: 1.00731.1000). -PBS, pH 7,2, 1 litro: -8.00 g de NaCl, -0.20 g de KCl, -1.04 g de K2HP0 , -0.32 g de KH2P04; -Amortiguador bloqueante: PBS, 2% de leche descremada; -Amortiguador de lavado: PBS, 0.05% Tween 20; -Amortiguador de dilución: PBS, 0.5% de leche descremada, 0.05% Tween 20. Brevemente, el caldo de cultivo sin diluir y las diluciones seriadas al doble se pre-incubaron con anticuerpo policlonal 1:1000 en amortiguador de dilución. Después de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, las muestras se transfirieron a placas pre-cubiertas con Plectasin (recubiertas con 0.1 µg/ml de Plectasin y la unión residual bloqueada mediante un amortiguador bloqueante) . Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se detectó el anticuerpo unido mediante un anticuerpo secundario (HRP porcino anti-conejo) y luego un cromógeno (TMB Plus) . La detección de anticuerpo unida a Plectasin se midió mediante absorbancia a 450 nm, la cual resultó en una curva de titulación de unión de anticuerpo. A lo largo del ensayo, las placas se lavaron con un amortiguador de lavado, y las diluciones de la sustancia se realizaron tal como fue descrito por los fabricantes (DAKO & KemEnTek) . Interpretaciones: La no detección de anticuerpo unido en el pocilio significa que se ha producido la unión completa (inhibición) del anticuerpo al caldo de fermentación desconocido; mientras que la absorbancia máxima medida equivale a ausencia de inhibición por el competidor (caldo de fermentación desconocido) . De esta manera nosotros pudimos estimar las cantidades (caldos diluidos) que se necesitaron para inhibir el 50% de la unión de los pocilios. Los resultados se graficaron en la tabla siguiente. Los resultados se calcularon en forma relativa a los rendimientos medidos para los caldos de fermentación sin intrón (MT2882, MT2883, MT2884 y MT2885) . Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los resultados muestran que por medio de las construcciones de genes que contienen un intrón, los niveles de expresión aumentan aproximadamente 330% de los niveles de expresión obtenidos por medio de construcciones génicas sin intrón . Tabla 1 Ejemplo 5 Aumento de expresión de defensina de Eurotium Amstelodami Una defensina que codifica ADNc de Eurotium amstelodami se identificó en forma preliminar y la defensina se denominó Eurocina (ver Ejemplos de PCT/DK 2005/000725 (NOVOZYMES NS) ; o SEC ID NO: 3) . El ADNc se expresó en A. oryzae para dar el péptido de defensina Eurocin activo. Con el fin de aumentar el nivel de expresión, se fabricó una construcción de expresión que contiene la secuencia de ADN genómico (incluyendo dos intrones). El ADN genómico de E. amstelodami se preparó mediante un método estándar para la preparación de ADN genómico fúngico. Se emplearon aproximadamente 50 ng de AND genómico como templado en un reacción de PCR con los siguientes cebadores. Cebador A: TCTTGGATCCACCATGCACTTCACCAAGGTCTCC (SEC ID NO: 21) Cebador B: TCTTCTCGAGTTAGAAAGAACAGGTGCAGGTAC (SEC ID NO: 22) Se emplearon 10 pmoles de cada cebador en un volumen de reacción de 50 µl. La temperatura de templado fue de 55 grados Celsius y extensión a 72 grados Celsius durante 1 minuto. Se corrieron un total de 35 ciclos mediante el Expand High Fidelity PCR System (Roche) . El producto de PCR se digirió con BamHl y Xhol los cuales cortan las proyecciones introducidas por los cebadores de PCR. El digerido se corrió en gel de agarosa 2% y se aisló una banda de aproximadamente 400 bp. La banda aislada se ligó al plásmido digerido BamHlXhol pMT2786 (ver Ejemplo 2 de PCT/DK2005/000725) y se transformó en MT173 E. coli seleccionado por prototrofía de leucina. El inserto BamHl-Xhol se secuenció y se demostró que - codifica la secuencia de prepro-Eurocina corrrespondiente al ADNc previamente caracterizado (ver PCT/DK2005/000725 o SEC ID NO: 3), pero contiene además dos secuencias de intrón de 45 y 53 bases, respectivamente. La secuencia y estructura del inserto BamHl-Xhol se muestra en la SEC ID NO: 23. El plásmido de expresión de Aspergillus que contiene el inserto se llamó pMT2945. pMT2945 se transformó en BECh2 de A. oryzae tal como se describió en el Ejemplo 1, y se reaislaron 20 transformantes y fermentaron como en el Ejemplo 1. Los sobrenadantes se analizaron en geles SDS tal como se describió anteriormente. Al igual que antes, también se realizaron experimentos paralelos empleando transformantes con el plásmido de expresión pMT2935 basado en ADNc de Eurocin (ver Ejemplo 2 de PCT/DK2005/000725) . Los transformantes basados en la construcción de ADNc pMT2935 y la construcción pMT2945 que contiene el intrón produjeron bandas distintas correspondientes a Eurocin en tamaño en los geles de SDS. Se estimó que los transformantes basados en la construcción genómica pMT2945 que contiene el intrón produjeron 300-400% del nivel de expresión obtenido con los transformantes basados en la construcción de ADNc pMT2935.

Ejemplo 6 Empleo de archivos HMM de la base de datos PFAM para identificar una defensina El análisis de secuencia mediante los perfiles del modelo oculto de markov (perfiles HMM) puede llevarse a cabo en línea en Internet o localmente en computadora mediante el bien conocido paquete de programa de computación de libre disposición HMMER. La versión actual es HMMER 2.3.2 de octubre de 2003. Los perfiles HMM se pueden obtener de la bien conocida base de datos PFAM. La versión actual es PFAM 16.0 de noviembre de 2004. Ambas HMMER y PFAM están disponibles para todas las plataformas de computadoras de por ej . Washington University en St. Louis (USA), School of Medicine (http://pfam.wustl.edu and http://hmmer.wustl.edu). Si una secuencia de aminoácidos incógnita, o un fragmento de la misma, pertenece a una de las siguientes cinco familias de PFAM familias, la secuencia de aminoácidos es una defensina de acuerdo con la presente invención: • Defensina beta o "Betadefensina" , número de acceso: PF00711; • Defensina propep o "propéptido de defensina", número de acceso: PF00879; • Defensinal o "defensina de mamífero ", número de acceso: PF00323; • Defensina 2 o "defensina de artrópodos", número de acceso: PF01097; • Gamma-tionina o "familia de gamma-tioninas" , número de acceso: PF00304. Una secuencia de aminoácidos pertenece a una familia PFAM, de acuerdo con la presente invención, si esta genera un valor E superior a 0.1, y un puntaje que es mayor o igual a cero, cuando la base de datos de PFAM se emplea un línea, o cuando se emplea en forma local el programa hmmpfam (del paquete de programas de computación HMMER) . Cuando se realiza el análisis de secuencia en forma local mediante el programa "hmmpfam", es necesario obtener (descargar) los perfiles HMM de la base de datos PFAM. Existen dos perfiles para cada familia; "xxx_ls.hmm" para búsquedas glocales, y "xxx_fs.hmm" para búsquedas locales ("xxx" es el nombre de la familia). Esto hace un total de diez perfiles para las cinco familias mencionadas anteriormente . Estos diez perfiles se pueden emplear en forma individual, o unida (anexa) en un perfil único (empleando un editor de texto -los perfiles son archivos ASCII) que podría llamarse por ej . "defensin . hmm" . Una secuencia de aminoácidos incógnita se puede evaluar mediante la siguiente línea de comando : hmmpfam -E 0.1 defensina . hmm archivo de secuencia - -donde "archivo secuencia" es un archivo con la secuencia de aminoácidos incógnita en cualquiera de los formatos reconocidos por el paquete del programa de computación HMMER. Si el puntaje es mayor o igual a cero (0.0), y el valor de E es mayor que 0.1, la secuencia de aminoácido incógnita es una defensina de acuerdo con la presente invención. La base de datos PFAM se describe adicionalmente en BATEMAN, et al. The Pfam Protein Families Datábase. Nucleic acids res.. January 2004, vol.32, p.D138-D141. ISSN 0305-1048 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Célula huésped recombinante de hongos filamentosos, caracterizada porque comprende una construcción de ácido nucleico, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico extraño que codifica una defensina y una o más secuencia (s) de intrón. 2. Célula huésped de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es una célula huésped de Aspergillus. 3. Célula huésped de Aspergillus de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque es una célula huésped de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. . Célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la defensina es una alfa defensina, beta defensina, theta defensina, defensina de artrópodos, defensina de insectos o defensina de plantas . 5. Célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque es capaz de producir la defensina en una cantidad de al menos 150% de la cantidad obtenida cuando se emplea una construcción de ácido nucleico sin una secuencia de intrón. 6. Método para la producción recombinante de una defensina en una célula huésped de hongos filamentosos, caracterizado porque incluye cultivar la célula huésped de hongos filamentosos que comprende una construcción de ácido nucleico, donde la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de defensina y una o más secuencia (s) de intrón; y recuperar el péptido de defensina. 7. Método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la célula huésped de hongos filamentosos es una célula huésped de Aspergillus. 8. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la célula huésped de Aspergillus es una célula huésped de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae 9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la defensina es una alfa defensina, beta defensina, theta defensina, defensina de artrópodos, defensina de insectos o defensina de plantas . 10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque resulta en la producción de la defensina en una cantidad de al menos 150% de la cantidad obtenida cuando se emplea una construcción de ácido nucleico sin una secuencia de intrón. 11. Uso de una construcción de ácido nucleico, la cual comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de defensina y una o más secuencias de intrón, para mejorar el nivel de expresión recombinante de la defensina en una célula huésped de hongos filamentosos. 12. Uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la célula huésped de hongos filamentosos es una célula huésped de Aspergillus. 13. Uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde la célula huésped de Aspergillus es una célula huésped de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. 14. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde la defensina es una alfa defensina, beta defensina, theta defensina, defensina de artrópodos, defensina de insectos o defensina de plantas. 15. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde el nivel de expresión de la defensina es al menos 50% superior en comparación con el empleo de una construcción de ácido nucleico que no comprende una secuencia de intrón.