MX2007009885A - Composiciones y metodos para el almacenamiento de celulas de sangre roja. - Google Patents
Composiciones y metodos para el almacenamiento de celulas de sangre roja.Info
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Abstract
La presente invencion proporciona una composicion acuosa para el almacenamiento celulas de sangre roja, que consiste esencialmente de: adenina; dextrosa, por lo menos un azucar protector de membrana no metabolizable y un sistema regulador del pH definido especificamente. Tambien se proporcionan metodos mejorados para conservar celulas de sangre roja y metodos para incrementar la viabilidad, retencion de membrana y capacidad de recuperacion en tanto que se suprime la apoptosis, hemolisis y despeje post-reinfusion de las celulas de sangre roja almacenada que utilizan las nuevas composiciones.
Description
COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL ALMACENAMIENTO DE CÉLULAS DE SANGRE ROJA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención es concerniente en general con composiciones y métodos asociados con el almacenamiento de células de sangre roja (RBC) . En particular, es concerniente con una composición de almacenamiento de RBC mejorada y procesos y aplicaciones de la misma. La habilidad de almacenar y preservar células de sangre roja (RBC) para re-infusión posterior a pacientes es un desarrollo tecnológico relativamente reciente que fue el precursor a la práctica quirúrgica moderna. Tal conservación es científicamente engañosa y las etapas de obtener duración de almacenamiento más largo y células de sangre roja re-infusionadas de calidad más alta ha sido incrementado. Tan pronto como son recolectadas de un donador, las células de sangre roja comienzan a morir a medida que coagulan, padecen de hambre, pierden ATP, 2,3-DPG, área superficial de membrana e integridad y hemoglobina (Hb) . Rous & Turner en 1916 y Robertson en 1917 demostraron por primera vez el almacenamiento de sangre entera exitoso. Ácido-citrato-dextrosa (ACD, 1943), que comprende citrato como anti-coagulante y dextrosa como el único nutriente utilizado por células de sangre roja y solución de citrato-fosfato-dextrosa (CPD, 1957), la adición de fosfato como fuente metabólica y para retención de membrana fueron aprobados subsecuentemente para el almacenamiento de 21 días de sangre entera. CPD con adenina (CPDA-1, 1979) fue posteriormente introducido y usado para prolongar la vida en almacenamiento de sangre entera almacenada y RBC empacadas por hasta 5 semanas. Inicialmente, las composiciones de almacenamiento fueron diseñadas para ser acidas par impedir la caramelización de la glucosa durante la esterilización térmica efectuada en la etapa de producción final. En la década de 1950, la adenina fue descubierta como útil como aditivo y reemplaza la pérdida de adenina mediante desaminación. En la década de 1970 se hizo deseable remover el plasma de la sangre entera recolectada para plaquetas y para la manufactura de derivados de plasma. Sin embargo, esto condujo a una reducción en el por ciento de recuperación de las "RBC empacadas" resultante. Para circunvenir esto, se desarrollaron composiciones conocidas en el arte como soluciones aditivas (AS) para restaurar el volumen, nutrientes y otros estabilizadores de RBC útiles. Las composiciones en solución aditivas para la conservación de células de sangre roja (RBC) después de su separación de sangre entera están diseñadas para ser adaptadas específicamente a las necesidades de RBC. El desarrollo de ciertas soluciones aditivas prolongaron el almacenamiento de RBC a 6 semanas en 1981. Las células de sangre roja (RBC) almacenadas en estas soluciones, sin embargo, sufren deterioro estable después de aproximadamente 6 semanas tal como se determina por la incapacidad del 75% de tales células para sobrevivir en la circulación por 24 horas después de la reinfusión de regreso al donador humano. Se ha observado que durante el almacenamiento refrigerado continuo, la glucosa es consumida a una velocidad decreciente, a medida que la concentración de desperdicio metabólico, esto es, ácido láctico e iones de hidrógeno se incrementa. Tal disminución en la velocidad de metabolismo de glucosa conduce al agotamiento de trifosfato de adenosina (ATP) , que se correlaciona directamente con la recuperación de RBC cuando las células son devueltas a la circulación. Soluciones aditivas tales como Adsol.RTM (AS-1), Nutricel RTM (AS-3), Optisol RTM (AS-5) y ErythroSol RTM fueron diseñadas para prolongar el almacenamiento de RBC a 1-6°C. Todos los tres AS actualmente con licencia en los Estados Unidos de América, AS-1, AS-3 y AS-5, contienen solución salina, adenina, glucosa y algo de citrato y/o manitol como "protectores de membrana". AS-3 también contiene fosfato de monosodio. Cada uno de los AS con licencia en los Estados Unidos de América cumple con los requerimientos de licencia para almacenamiento de RBC a 6 semanas, pero fracasa para obtener el almacenamiento de 7 semanas. Las composición de solución aditiva de RBC actualmente con licencia fueron desarrolladas antes de la lesión de almacenamiento de RBC (definida en la presente como la suma de los efectos limitantes de sobrevivencia y/o función de almacenamiento sobre RBC) se comprendiera que es un proceso apoptótico. Casi toda la sangre entera recolectada ahora se fabrica en componentes y la fracción de RBC es almacenada como RBC empacada. Para la extracción de sangre a los sistemas de solución aditivos, las RBC son empacadas mediante centrifugación, el plasma es removido de tal manera que las RBC componen el 80% del volumen y luego 100 ml de solución de aditivo son agregados de manera estéril. Las suspensiones resultantes tienen una fracción en volumen de RBC de aproximadamente 55%. Las RBC almacenadas en las soluciones de aditivo aprobadas por la FDA convencionales pueden ser almacenadas por solamente 6 semanas con una recuperación in vivo de 24 horas aceptable. Para incrementar el tiempo de recuperación in vivo aceptable de RBC re-infusionados a pacientes después de un periodo de almacenamiento, se han realizado intentos por mejorar las soluciones de aditivo y procesos de almacenamiento. En "Studies In Red Blood Cell Preservation-7. In vivo and in vitro Studies With A Modified Phosphate-Ammonium Additive Solution", por Greenwalt et al, Vox . Sang. 65:87-94 (1993), los autores determinaron que una solución aditiva experimental (designada como EAS-2) que contiene (en mM) : 20 NH4C1, 30 Na2HP04, 2 adenina, 110 de dextrosa, 55 de manitol, formulada a un pH de 7.15, es útil para prolongar la vida en almacenamiento útil de RBC humanas del estándar actual de 5-6 semanas a un estándar mejorado de 8-9 semanas. Sin embargo, las RBC empacadas almacenadas en EAS-2 no fueron directamente infusionables sino que requirieron la remoción del sobrenadante con una etapa de lavado antes de la transfusión debido a la presencia de amoníaco en la solución aditiva. En "Studies in Red Blood Cell Preservation-8; Liquid Storage of Red Cells in Glycerol-Containing Aditive Solution", Vox. Sang. 67:139-143 (1994), Greenwalt et al. describen una solución aditiva (designada como EAS-25) que permitió el 73 por ciento de recuperación de células rojas empacadas después de nueve semanas. Sin embargo, las unidades de RBC resultantes contenían aproximadamente 1 por ciento de glicerol y así, no son seguras para transfusión en humanos en grandes cantidades. En "Extending the Storage of Red Cells at
4.degree. C", Transfus. Sci. 15:105-115 (1994) por Meryman et al., la viabilidad aceptable de RBC almacenadas en suspensiones muy diluidas a bajo hematócrito por tanto como 27 semanas fueron demostrados. Sin embargo, tales suspensiones de RBC almacenadas no fueron aceptables para infusión directa debido a su alto contenido de potasio y amoníaco y baja fracción en volumen de RBC. Los 5 litros de solución para 200 ml de RBC requeridos para producir sus efectos benéficos observados no fueron practicables clínicamente.
Con respecto los productos aprobados y disponibles comercialmente, las soluciones aditivas actualmente con licencia en los Estados Unidos de América trabajan por solamente alrededor de 6 semanas con una recuperación promedio de aproximadamente 80%. Dos soluciones aditivas actualmente con licencia en Europa trabajan por aproximadamente 7 semanas con recuperaciones promedio de 77% (ErythroSol de Baxter Healthcare, La Chatre, Francia) y 75% (manitol PAGGS de Maco Pharma) . Se puede esperar que las soluciones nuevas descritas recientemente por Kurup et al. (Vox Sang 2003: 85:253-261) tienen tiempos de almacenamiento más cortos debido a las concentraciones de ATP más bajas. En respuesta a las deficiencias en estos hallazgos previos, se desarrollaron soluciones aditivas experimentales alcalinas que contienen fosfato de disodio de volumen más bajo (EAS) que neutralizan parcialmente el efecto de recolección de sangre a soluciones anticoagulantes acidas tales como CPD (citrato-fosfato-dextrosa) y demostraron que estas concentraciones de ATP, RBC mejoradas de EAS, reducen la hemolisis y parecen disminuir los cambios morfológicos de membrana de RBC y pérdida (véase patentes estadounidenses Nos. 6,150,085 y 6,447,987 expedidas a Hess y Greenwalt, las revelaciones completas de las cuales son incorporadas plenamente en la presente por referencia) . Se demostró que varios EAS soportan entre 9 y 12 semanas de almacenamiento.
Aunque estos EAS produjeron resultados de desempeño superiores, contenían cloruro de sodio y fueron formulados para requerir un volumen relativamente grande dando como resultado mayor dilución de las RBC almacenadas, incrementando así el riesgo de hemodilución en receptores pacientes con transfusiones múltiples. Además, la presencia de cloruro de sodio creó un límite de solubilidad en cuanto a la cantidad de sales y fosfatos reguladores del pH que el sistema podría sostener a volúmenes deseables. La duración incrementada de almacenamiento de RBC sigue siendo una consideración importante durante períodos cuando la demanda es alta pero intermitente, tal como durante en tiempo de guerra y para regiones geográficas que requieren sangre que se puede someter a transfusión pero solo en una base inconsistente y esporádica. En efecto, dado el nivel actual de desperdicio reportado debido a la expiración del período de almacenamiento seguro antes de la realización de una demanda en general, el incremento de la duración de tiempo que las RBC pueden ser almacenadas de manera segura es una preocupación ubicua en marcha. Así, hay necesidad de composiciones de almacenamiento de RBC formuladas para retener o mejorar la recuperación y beneficio de desempeño en los volúmenes más bajos de soluciones aditivas convencionales. Hay una necesidad continua en el almacenamiento de sangre y arte de transfusión para el almacenamiento de RBC mejorado que da como resultado una duración de almacenamiento más larga, mejor porcentaje de recuperación y funcionamiento fisiológico mejorado de las RBC sometidas a transfusión. Consecuentemente, todavía hay necesidad de composiciones de almacenamiento de RBC mejoradas y procesos de manufactura de las mismas. También hay una necesidad continua por composiciones aditivas que permitan la suspensión de RBC a la cual la composición es agregada para ser infusionada directamente a humanos y que permita una posibilidad de recuperación post-infusión aceptable de RBC viables que poseen capacidades de funcionamiento fisiológicas mejoradas y proporciones más bajas de despeje de la circulación del paciente sometido a infusión.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Asi, la presente invención proporciona nuevas composiciones apropiadas para el almacenamiento y conservación de células de sangre roja recolectadas. Se ha descubierto sorprendentemente que al eliminar sustancialmente el cloruro de sodio de tales composiciones, previamente consideradas como esencial para la operación apropiada de composiciones de almacenamiento, proporciona un capacidad incrementada en la composición para un sistema regulador de pH mejorado, que a su vez, proporciona beneficios tanto en términos de la integridad y calidad de funcionamiento fisiológico de las células de sangre roja almacenadas y luego re-infusionadas y con respecto a la duración de tiempo que las RBC pueden ser almacenadas con retención de la posibilidad de recuperación y niveles de hemolisis requeridos bajo las leyes regulatorias para licencia. Además, las composiciones de la invención retienen su desempeño superior a volúmenes convencionales, haciéndolas particularmente apropiadas para almacenar células de sangre roja que pueden ser apuntadas para infusión a pacientes con transfusiones múltiples o con transfusiones masivas. Una modalidad de la presente invención proporciona una composición para almacenamiento de células de sangre roja a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C. La composición consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable y un sistema regulador del pH . El sistema regulador del pH comprende bicarbonato de sodio y fosfato de disodio y está presente en una cantidad suficiente para que la composición tenga un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. La composición es operable para mantener un pH de una suspensión de célula de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento, un equilibrio de reacción en la célula de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la síntesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período almacenamiento. Otra modalidad de la invención proporciona que la composición está sustancialmente libre de cloruro de sodio. Más modalidades específicas de la composición de la invención son concernientes con componentes y cantidades particulares de las mismas e intervalos para la osmolaridad y pH de las composiciones. Otras modalidades específicas son concernientes con composiciones de la invención que son operables para mantener el pH de la célula de sangre roja dentro de intervalos de valores particulares. Una modalidad adicional de la invención es concerniente con una suspensión de células de sangre roja que comprende la composición de la invención. También se proporcionan modalidades de método. Una de tales modalidades es concerniente con un método para conservar células de sangre roja (RBC) por un período de almacenamiento. El método comprende: (a) mezclar una muestra de sangre entera recolectada que contiene las RBC a ser almacenadas y plasma con una solución anticoagulante, formando mediante esto una suspensión de sangre entera recolectada; (b) tratamiento de la suspensión de sangre entera recolectada para agotar el plasma y concentrar las RBC, formando mediante esto RBC empacadas; (c) mezcla de las RBC empacadas con una cantidad de una composición suficiente para formar un suspensión de RBC que tiene aproximadamente 35% a aproximadamente 70% RBC en volumen; (d) enfriamiento de la suspensión de RBC a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C; y (e) almacenamiento de la suspensión enfriada de RBC de acuerdo con procedimientos de banco estándares. La composición consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable y un sistema regulador del pH . El sistema regulador del pH comprende bicarbonato de sodio y fosfato de disodio y está presente en una cantidad suficiente para que la composición tenga un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. La composición es operable para mantener un pH de una suspensión de célula de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en la célula de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la síntesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento. También se proporcionan modalidades más específicas. Se proporcionan modalidades adicionales que son concernientes con métodos de uso de las composiciones de la invención para mejorar el mantenimiento de membrana de célula de sangre roja (RBC) y suprimir la apóptosis de RBC durante un período de almacenamiento, para disminuir la fragilidad de células de sangre roja (RBC) y suprimir la hemolisis de RBC durante un periodo de almacenamiento y para incrementar la viabilidad de células de sangre roja (RBC) subsecuente a un periodo de almacenamiento y después de infusión a un paciente en necesidad de tal infusión y disminución de la velocidad de despeje post-infusión de las RBC por el paciente. Las composiciones y suspensiones de RBC producidas de acuerdo con la invención proporcionan un período de almacenamiento para RBC por completo que es una cantidad terapéuticamente suficiente de las RBC es recuperable y son directamente propensas a infusión a pacientes sin procesamiento adicional de acuerdo con los estándares conocidos establecidos y reconocidos para la transfusión de RBC. Estas y modalidades y aspectos adicionales de la presente invención se apreciarán más plenamente por referencia a la breve descripción de las figuras, Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas y Ejemplos proporcionados posteriormente en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una representación gráfica de los resultados de un estudio de acumulación que muestra los efectos sobre las RBC de almacenamiento como función de tiempo en semanas, 4 composiciones de solución aditivas diferentes: (1) AS-3, volumen de 110 ml (-0-); EAS-61, volumen de 170 ml (- -) ;
EAS-78, 170 ml, (-•-); y EAS-81, 110 ml, (-o-). Las composiciones que contienen bicarbonato representadas por circuios, producen concentraciones de ATP más altas, como se ilustra en el panel A, que las composiciones de volumen equivalente sin bicarbonato, representadas por los diamantes. Estas composiciones también están asociadas con concentraciones de lactato más altas (panel D) , pH extracelular e intracelular más alto (paneles E y F) y concentraciones de bicarbonato y PC02 más altas (paneles E y F) . Las composiciones de volumen más alto, representados por las figuras sólidas, demuestran hemolisis reducida y hematócrito de almacenamiento reducido, ilustrado en los paneles B y C, respectivamente. La figura 2 ilustra la recuperación in vivo de células de sangre roja muestreadas 24 horas después de la re-infusión a un sujeto para RBC almacenadas en EAS-81 por 6 semanas (n=6) , EAS-81 por 8 semanas (n=6) , en comparación con un control histórico, el estudio de licencia para AS-3 publicado por Simón et al., en 1985. Ambos estudios usaron el método de marcación individual de 51Cr.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La invención es concerniente en general con composiciones y métodos asociados con el almacenamiento de células de sangre roja (RBC) . En particular, es concerniente con nuevas composiciones de solución aditivas y métodos relacionados para el almacenamiento de RBC que han sido separadas de sangre entera recolectada en solución de citrato fosfato dextrosa (CPD) , su variante, solución de citrato fosfato doble dextrosa (CP2D) solución o mediante aféresis (remoción de sangre entera de un paciente o donador) en soluciones de citrato dextrosa acidas (ACD) o soluciones similares . Por propósitos de esta invención, el término "recuperación" es usado para indicar la fracción de RBC almacenadas que permanecen en circulación por 24 horas, después de la re-infusión al donador humano original. Como se usa en la presente, "cloruro" se refiere a cloruro aniónico. Así, el término "cloruro" incluye cloruro aniónico y las formas de sal del mismo, tales como pueden ser formadas a partir de anión (es) de cloruro y catión (es) aceptables fisiológicamente. El término "cloruro" no pretende incluir compuestos en donde el átomo de cloruro está enlazado covalentemente por ejemplo a un átomo de carbono en una molécula orgánica. Como se usa en la presente, la frase "agente regulador del pH aceptable fisiológicamente" se refiere a agentes reguladores del pH que producen cationes y aniones ya sea encontrados normalmente en la sangre, plasma o suero de un humano o que pueden ser tolerados cuando introducidos a un humano. Cationes apropiados incluyen protones, cationes de amonio y cationes de metal. Cationes de metal apropiados incluyen, pero no están limitados a, las formas catiónicas de sodio, potasio, calcio y magnesio, en donde el sodio y potasio son preferidos y el sodio es más preferido. Un catión de amonio, esto es, un compuesto de fórmula RN+ en donde R es hidrógeno o un grupo orgánico, puede ser usado en tanto que sea fisiológicamente aceptable. En una modalidad preferida, el catión es seleccionado de hidrógeno (esto es, protón) , sodio, potasio, calcio, magnesio y combinaciones de los mismos. Como se usa en la presente, "agente regulador del pH" se refiere a un agente que ajusta y regula el pH de una composición. Las composiciones de la invención reveladas en la presente son acuosas, esto es, son formuladas en agua. Un agente preferida de la invención es tratada con el fin de que esté esencialmente libre de pirógenos (esto es, sea estéril). Como se usa en la presente, "mEq/L" se refiere a la concentración de un componente particular (soluto) presente en proporción con la cantidad de agua presente. Más específicamente, mEq/L se refiere al número de miliequivalente de soluto/litro de agua. Los miliequivalentes/litro son calculados al multiplicar los moles/ litro de soluto por el número de especies cargadas (grupos) /molécula de soluto, que es luego multiplicado por un factor de 1,000. Una modalidad de la presente invención proporciona una composición acuosa para almacenamiento de células de sangre roja a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C. La composición consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable y un sistema regulador del pH. El sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente y debe incluir por lo menos un agente que proporcione aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporcione aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporcione cationes de sodio. La invención contempla que una sola sal reguladora del pH puede satisfacer más de uno de estos requerimientos. Es bien conocido en las artes de conservación de célula de sangre roja que la concentración de ATP en el sistema de suspensión de célula de sangre roja es la mejor correlación de la salud del sistema. La célula de sangre roja genera ATP or medio de glicólisis via la conversión glicolítica de d-glucosa
(dextrosa) finalmente a lactato. De aquí, la curva de concentración de lactato es un buen indicador de la síntesis de
ATP también. Sin consideración de la capacidad de conservación del sistema, las células de sangre roja tienen una extensión de vida finita y las células de sangre roja recolectadas incluyen una distribución normal de edades y proximidades de célula de sangre roja a la muerte natural. Ya que ningunas RBC nuevas están entrando al sistema de conservación, hay un límite en cuanto a la duración del período de almacenamiento máximo que proporcionará el porcentaje de recuperación post-re-infusión requerido. De aquí, la capacidad de generación de ATP del sistema como un todo disminuirá con el paso del tiempo aunque; es tipico ver un incremento inicial después de la adición de un fluido aditivo ya que proporciona nutrientes en concentraciones más altas que las naturales y las RBC sufren inicialmente "hinchamiento" que está asociado con la utilización de ATP disminuida también. Sin estar limitados por la teoría, se cree que cuando son almacenadas en solución aditiva de acuerdo con la invención, el volumen incrementado de solución de nutriente permite que una masa incrementada de sustrato sea administrada a concentraciones aceptables en tanto que proporciona soluto para dilución de productos de desperdicio metabólico reduciendo mediante esto la inhibición de retroalimentación de metabolismo de glucosa. Se postula además que otro elemento de las soluciones aditivas de la invención es que producen hinchamiento de las RBC inicialmente seguida por una reducción gradual del volumen de célula roja durante el almacenamiento. Tal proceso ha sido llamado "disminución de volumen regulado". Se tiene la hipótesis que durante este proceso ya sea la actividad de tirosina fosfatasa presente en las RBC es suprimida o la tirosina cinasa es activada. Se ha demostrado que ambas de estas enzimas son abundantes en las membranas de estas células (Zipser, Y. y Kosower, N. S. (1996) Biochem. J.
314:881; Mallozzi C. et al. (1997) FASEB J. 11:1281). Se anticipa que la fosforilación neta de la proteína de banda 3 en la membrana de RBC daría como resultado la liberación de fosfofructocinasa, aldolasa y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa en el citoplasma de su estado enlazado a banda 3 (Harrison, M. L. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4106; Cossins, A. R. y Gibson J. S. (1997) J. Exper. Biol. 200:343; Low, P. S. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:14627; Low, P. S. et al. (1995) Protoplasma 184:1961. La disponibilidad de estas tres enzimas en la ruta glicolítica se esperaría que incremente el metabolismo de glucosa mediante la RBC, promoviendo mediante esto los niveles de síntesis de ATP y concentración de ATP en las RBC. Así, el objetivo de la formulación de composiciones de soluciones aditivas es mantener la síntesis de ATP a una velocidad tan alta como sea posible por una duración larga como sea posible. Se ha descubierto que una clave para maximizar la síntesis de ATP del sistema es mantener el pH intracelular de las RBC a un nivel tan cercano a 7.2 como sea posible sin realmente alcanzarlo. Durante el almacenamiento, la concentración de ATP permanece característicamente nivelado o aún se incrementa por un período de tiempo prematuro en el almacenamiento y luego declina. Cuando la concentración de ATP de las RBC cae debajo de 2 µmol/g de Hb, la recuperación de RBC es comúnmente menor del 75%. Las RBC pierden 2,3-DPG prematuramente en el almacenamiento. La concentración de partida es característicamente de alrededor de 15 µmol/g de Hb o alrededor de 1.1 moles/mol de Hb. La concentración comúnmente cae a un décimo de la cantidad de partida en 7 a 10 días. La velocidad de síntesis de 2,3-DPG es función del pH, que ocurre en exceso a un pH mayor de 7.2 pero con rompimiento favorecido a un pH menor. Intentos por incrementar la síntesis de 2,3-DPG al incrementar el pH del sistema de almacenamiento han sido limitados por la pérdida de mol por mol de la síntesis de ATP con cada molécula de 2,3-DPG formada. Así, la elevación de las concentraciones de 2,3-DPG algo previamente considerado deseable, tiende realmente a reducir el tiempo de almacenamiento de RBC. Un ambiente más ácido disminuye el metabolismo de las RBC. El pH de 7.2 es el punto en donde un mecanismo, conocido como el cortocircuito de Rappaport (véase Hess et al. "Alkaline CPD and the preservation of red cell 2,3-DPG" (2002) Transfusión, 42:747-752, incorporado plenamente por referencia en la presente) es disparado mediante lo cual 2,3-DPG es sintetizado a partir de 1,3-DPG, consumiendo el fosfato necesario para la síntesis de ATP y adicionalmente, encauzamiento alrededor de una etapa glicolítica que produce dos de los ATP generados glicolíticamente . El efecto neto para el sistema es un agotamiento de ATP. Si el pH intracelular puede ser mantenido menor de 7.2, el cortocircuito es efectivamente cerrado y se maximiza la síntesis de ATP. En un estado natural, el cortocircuito opera a alguna extensión y la producción y mantenimiento de algo de 2,3-DPG es importante para otros eventos celulares. Sin embargo, se descubrió que por propósitos de conservación de la célula de sangre roja durante el almacenamiento fuera del ambiente in vivo, la minimización de la operación de cortocircuito es deseable. Por consiguiente, modalidades de la presente composición de la invención estipulan que el sistema regulador del pH esté presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de una suspensión de célula de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento una equilibrio de reacción en la célula de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la sintesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento. Una modalidad específica de las composiciones de la invención actuales estipula que la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de las RBC a la cual la composición ha sido agregada a un valor entre aproximadamente 6.4 y 7.4. En modalidades más específicas, la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de célula de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor entre 7.0 y menos de aproximadamente 7.2. En modalidades muy específicas, la composición es operable para mantener el pH de la célula de la suspensión de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor mayor que aproximadamente 7.1 y menor de 7.2. Los presentes inventores han formulado composiciones de solución aditiva sustancialmente libres de cloruro que producen sorprendentemente ningún efecto negativo sobre el sistema y permite la adición de cantidades incrementadas del sistema regulador del pH para proporcionar regulación del pH adicional. Una modalidad de la invención es concerniente con una composición acuosa para el almacenamiento de células de sangre roja a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C también. Esta composición comprende: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable y un sistema regulador del pH. El sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio. El sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de una suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en la célula de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la síntesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento. La composición está sustancialmente libre de iones cloruro derivados exógenamente. Como se usa en la presente, "sustancialmente libre de iones cloruro derivados exógenamente" es definido como ya sea la concentración de iones cloruro es dada que ninguna fuente de iones cloruro ha sido agregada a la composición. Modalidades adicionales son concernientes con una suspensión de células de sangre roja que comprenden cualquiera de las composiciones de la invención y modalidades en donde la suspensión es apropiada para infusión directa a un paciente en necesidad de tal infusión. Modalidades adicionales de la composición de la invención estipulan que por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio es seleccionado del grupo que consiste de bicarbonato de sodio, fosfato de disodio y combinaciones de los mismos. En una modalidad más específica, el por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato es bicarbonato de sodio. Modalidades adicionales estipulan que el por lo menos un agente que proporciona iones de fosfato es seleccionado del grupo que consiste de fosfato de sodio, fosfato de disodio, fosfato de trisodio y combinaciones de los mismos. En modalidades más específicas el por lo menos un agente que proporciona iones de fosfato es fosfato de disodio. En otras modalidades de la composición de la invención, la combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente comprenden adicionalmente por lo menos un agente que proporciona un catión aceptable fisiológicamente seleccionado del grupo que consiste de H+, potasio, amonio, magnesio y combinaciones de los mismos. En una modalidad adicional de las presentes composiciones de la invención, el por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable es manitol. Algunos alcoholes de azúcar, en particular los alcoholes de azúcar derivados de monosacárido (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol), son moléculas hidrofílicas pequeñas que parecen difundirse rápidamente a través de algunas barreras de lípido y puede jugar un papel importante en la estabilidad celular. El manitol, en particular, es un antioxidante conocidos que actúa como un depurador de radicales hidroxilo in vivo. Parece jugar un papel sustancial en el mantenimiento de la integridad de membrana celular y es considerado un azúcar protector de membrana. Otros polioles pequeños pueden también funcionar como azúcares protectores de membrana. Es significativo notar que glucosa y manitol tienen el mismo peso en mol, esto es, 180 g/mol. Los alcoholes de azúcar no son metabolizados por la célula de sangre roja. Como se usa en la presente, la osmolaridad reportada es un valor derivado empíricamente. La osmolaridad es una medida de la presión osmótica ejercida por una solución a través de una membrana semipermeable perfecta (una que permite el paso libre de agua e impide completamente el movimiento del soluto) en comparación con agua pura. La osmolaridad es dependiente del número de partículas en solución pero independiente de la naturaleza de las partículas. La osmolaridad de una solución simple es igual a la molaridad multiplicada por el número de partículas por molécula. Las soluciones reales pueden ser mucho más complejas. Las proteínas con muchos equivalentes/litro puede solamente contribuir con una pequeño cantidad a la osmolaridad, puesto que consisten de unas pocas "partículas" muy grandes. No todos los iones están libres en una solución. Los cationes pueden estar enlazados a otros aniones o a proteínas. No todo el volumen de solución es acuoso. Para ser verdaderamente exactos, todos estos factores deben estar incluidos en el cálculo. La tonicidad, un valor alternativamente relacionado con la osmolaridad y un tanto más útil para describir condiciones biocelulares, es una medida de la presión osmótica que una sustancia puede ejercer a través de una membrana celular, en comparación con el plasma sanguíneo. La osmolaridad mide el gradiente efectivo para agua suponiendo que todo el soluto osmótico es completamente impermeable. Es simplemente un conteo del número de partículas disueltas. Cada una de una solución 300 mM de glucosa y una solución 150 mM de NaCl tienen la misma osmolaridad, por ejemplo. Sin embargo, una célula colocada en cada una de estas soluciones se comportaría muy diferentemente. La tonicidad es un término funcional que describe la tendencia de una solución a resistir la expansión del volumen intracelular. Modalidades adicionales estipulan que las composiciones de la invención tienen una osmolaridad de aproximadamente 200 a aproximadamente 310 mOsm. En modalidades más especificas las composiciones tienen una osmolaridad de aproximadamente 221 a aproximadamente 280 mOsm. En una modalidad muy especifica, la osmolaridad es de aproximadamente 270 mOsm. Como se indica, las RBC metabolizan glucosa (d-glucosa = "dextrosa") para fabricar ATP. Los productos de desperdicio son lactato y protones. Los protones se acumulan, disminuyendo el pH e inhibiendo el metabolismo adicional. El bicarbonato ha sido sugerido como un sistema regulador del pH en donde se combina con los protones y en presencia de anhidrasa carbónica de RBC, es convertido a agua y dióxido de carbono. En un recipiente de almacenamiento que permite la difusión del dióxido de carbono, se impide la reacción inversa y la reacción es impulsada hacia la formación de C02. Un sistema regulador del pH a base de bicarbonato tiene capacidad considerable. El bicarbonato en concentraciones fisiológicas en la solución aditiva crea el pC02 en la solución que impulsa la difusión de hasta 1 a 2 mmoles de C02 de una bolsa de PVC de 600 ml cada semana. Sin embargo, intentos previos formular soluciones aditivas de almacenamiento de RBC con bicarbonato han fracasado con respecto a incrementar la sintesis de ATP y prolongar el período de almacenamiento efectivo. Por ejemplo, Beutler (BAG-PM) describen la adición de bicarbonato a soluciones de almacenamiento de RBC, pero fallan para controlar un alto pH que conduce al rápido agotamiento de ATP. Al descubrir que la solución salina no es un ingrediente necesario a las composiciones de solución aditiva de RBC y que la concentración de dextrosa podría ser disminuida sin efectos negativos sobre la síntesis de ATP, los presentes inventores fueron aptos de utilizar el "juego" incrementado resultante en parámetros de la solución para incrementar y ajustar finalmente el sistema regulador del pH. El sistema regulador del pH revelado actualmente proporciona no solamente un pH inicialmente apropiado a la composición de solución aditiva, sino que es apto de impartir a la suspensión de RBC un pH que a su vez modula el pH intracelular de las RBC para maximizar la síntesis de ATP. El sistema regulador de pH obtiene estos objetivos de modulación de pH en el período de almacenamiento. De aquí, la capacidad o fuerza reguladora del pH del sistema regulador del pH es controlado deliberadamente. Una modalidad de las presentes composiciones de la invención estipulan que la composición tenga un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. En modalidades más específicas, el pH es de aproximadamente 8.2 a aproximadamente 8.8. En modalidades aún más específicas, el pH de la composición es de aproximadamente 8.4 a aproximadamente 8.6 y en una modalidad muy específica el pH de la composición es de aproximadamente 8.5. Otra modalidad es concerniente con las composiciones de la invención en donde el sistema regulador del pH tiene una capacidad de regulación del pH en la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada que incrementa por al menos aproximadamente 2 mEq entre un pH de 6.5 y 7.2 en un periodo de almacenamiento de 6 semanas. El sistema regulador del pH revelado actualmente debe proporcionar una capacidad de regulación del pH de por lo menos este valor, pero es capaz de proporcionar capacidades de regulación de pH aún mayores a la suspensión de RBC prolongando mediante esto el período de almacenamiento aún más. Los presentes inventores determinaron intervalos para los ingredientes de la composición necesarios que permiten las ventajas reveladas actualmente. En una modalidad de la composición de la invención, la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 1-3 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 115 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 130 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mM. En una modalidad más específica la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, • dextrosa en una cantidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 22 a aproximadamente 40 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 mM. En una modalidad aún más específica, la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 80 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 55 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 26 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 12 mM y la composición tiene un pH de aproximadamente 8.5. La presente invención también proporciona modalidades de método. En una de tales modalidades, se proporciona un método para conservar células de sangre roja (RBC) por un período de almacenamiento. El método comprende: (a) mezclar una muestra de sangre entera recolectada que contiene las RBC a ser almacenadas y plasma con una solución anticoagulante, formando mediante esto una suspensión de sangre entera recolectada; (b) tratamiento de la suspensión de sangre entera recolectada para agotar el plasma y concentrar las RBC, formando mediante esto RBC empacadas; (c) mezclar las RBC empacadas con una cantidad de una composición acuosa suficiente para formar un suspensión de RBC que tiene aproximadamente 35% a aproximadamente 70% de RBC en volumen; (d) enfriamiento de la suspensión de RBC a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C; y (e) almacenamiento de la suspensión enfriada de RBC de acuerdo con procedimientos de banco estándar conocidos en el arte. La composición acuosa consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable; y un sistema regulador del pH . El sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluye por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio, en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de una suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en la célula de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la síntesis de 2 , 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento. La solución es divida en la manufactura para separar la dextrosa y el fosfato y bicarbonato durante la esterilización térmica. Las RBC útiles en la presente invención son aquellas que han sido separadas de su plasma y resuspendidas en una solución de anticoagulante en el curso normal de la manufactura de componentes. Dicho brevemente, una muestra de sangre entera estándar (450.+/-.45 ml) que contiene RBC y plasma es mezclada con una solución anticoagulación (aproximadamente 63 ml ) para formar un suspensión de sangre entera. Incrementos o disminuciones proporcionales en volúmenes de la solución para reflejar diferentes volúmenes de sangre de donador tales como 400.+/-. 0 ml-500. +/- .50 ml pueden también ser usados. La suspensión de sangre entera después de esto centrifugada para superior RBC del plasma sanguíneo formando mediante esto RBC empacados. El desempeño del proceso global es mejorado mediante reducción de leucocitos utilizando técnicas convencionales. Los anticoagulantes apropiados incluyen anticoagulantes convencionales conocidos para el almacenamiento de RBC. Preferiblemente; los anticoagulantes incluyen anticoagulantes de citrato que tienen un pH de 5.5 a 8.0, por ejemplo CPD, CPD de fuerza media y los semejantes. El anticoagulante más preferido es CPD. La suspensión de RBC es luego en general almacenada en bolsas de almacenamiento de sangre de cloruro de polivinilo (PVC) estándar usando ya sea la bolsa de recolección o paquetes de transferencia de PVC de diferentes tamaños dependiendo del volumen de la alícuota almacenada. La suspensión de RBC es almacenada a una temperatura de aproximadamente 1 a 6°C de acuerdo con el procedimiento de banco de sangre estándar como se describe en Clinical-Practice of Blood Transfusión editors: Petz & Swisher, Churchill-Livingston publishers, N. Y., 1981. Todos los documentos citados en la presente infra y supra son incorporados por medio de la presente por referencia. En una modalidad específica del método de la invención, la suspensión de RBC es apropiada para infusión directa a un paciente en necesidad de tal infusión. En tanto que las bolsas de almacenamiento de sangre de PVC son el estándar industrial aprobado, la presente invención contempla el almacenamiento en una amplia variedad de bolsas aptas para almacenamiento de RBC, por ejemplo, al incluir plastificantes apropiados como sea necesario. Los ingredientes relacionados con la bolsa o componente de recipiente de tecnología de almacenamiento de RBC no son discutidos en la presente pero será fácilmente evidente para aquel de habilidad ordinaria en el arte que muchas tecnologías de recipiente pueden ser empleadas para llevar a la práctica la presente invención. El soluciones aditivas de la invención pueden también ser usadas para rehidratar RBC liofilizadas o en el deshielo de sangre o componente de sangre congelado almacenado, por ejemplo RBC. En modalidades específicas del método de la invención para conservar RBC, el por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable es un alcohol de azúcar derivado de monosacárido y en una modalidad más especifica el azúcar protector de membrana no metabolizable es manitol. En modalidades adicionales del método, el por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio es seleccionado del grupo que consiste de bicarbonato de sodio, fosfato de disodio y combinaciones de los mismos. En modalidades específicas, el por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato es bicarbonato de sodio. Modalidades adicionales son concernientes con el método de la invención de conservar RBC, en donde el por lo menos un agente que proporciona iones fosfato es seleccionado del grupo que consiste de fosfato de sodio, fosfato de disodio, fosfato de trisodio y combinaciones de los mismos y en modalidades más específicas el por lo menos un agente que proporciona iones de fosfato es fosfato de disodio. En otras modalidades del método de la invención, la combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente comprende adicionalmente por lo menos un agente que proporciona un catión aceptable fisiológicamente seleccionado del grupo que consiste de H+, potasio, amoníaco, magnesio y combinaciones de los mismos. Modalidades adicionales son concernientes con el método de la invención para conservar RBC en donde la composición tiene una osmolaridad de aproximadamente 200 a aproximadamente 310 mOsm. En modalidades específicas, la osmolaridad es de aproximadamente 221 a aproximadamente 280 mOsm y en una modalidad muy específica, la osmolaridad es de aproximadamente 270 mOsm. En otras modalidades se proporcionan métodos de la invención en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. En modalidades específicas, el pH es de aproximadamente 8.2 a aproximadamente 8.8 y en modalidades más específicas, el pH de la composición es de aproximadamente 8.4 a aproximadamente 8.6. En una modalidad muy específica, el pH de la composición es de aproximadamente 8.5. Una modalidad adicional del método de la invención para conservar RBC estipula que el sistema regulador del pH tenga una capacidad reguladora del pH en la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada que incrementa por 2 mEq entre un pH de 6.5 y 7.2 en un período de almacenamiento de 6 semanas. La presente invención también proporciona modalidades del método de la invención para conservar RBC, en donde la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor de entre aproximadamente 6.4 y aproximadamente 7.4. En modalidades de método específicas, la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor entre 7.0 y menos de aproximadamente 7.2 y en modalidades de método aún más específicas la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregado a un valor mayor de aproximadamente 7.1 y menor de 7.2. También se proporcionan métodos de acuerdo con la presente invención concernientes con intervalos específicos de los ingredientes necesarios de la composición. En una modalidad de método, la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 1-3 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 115 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 130 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mM. En una modalidad más específica, la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 22 a aproximadamente 40 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 mM y en una modalidad muy específica, la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 80 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 55 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 26 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 12 mM y en donde además la composición tiene un pH de aproximadamente 8.5. De acuerdo con el método de la invención, la solución aditiva es agregada a la suspensión de RBC empacada en una cantidad suficiente para proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de RBC recuperables en la suspensión calor. Preferiblemente, el solución aditiva es agregada a un volumen que fluctúa de aproximadamente 60 ml a aproximadamente 400 ml, de preferencia aproximadamente 100 a aproximadamente 150 ml, más preferiblemente alrededor de 110 ml . La solución es usada comúnmente en una proporción en volumen de 1:4.5 de solución a sangre entera recolectada (100 ml para una recolección de sangre entera de 450 ml, 111 ml para una recolección de sangre entera de 500 ml o equivalente) . En modalidades especificas de los métodos de la invención presente para conservar RBC, la proporción en volumen de la composición a la sangre entera recolectada es de aproximadamente 1:4.5. En una modalidad más específica, el volumen de la composición es de aproximadamente 110 ml y el volumen de la sangre entera recolectada es de aproximadamente 500 ml . La fracción en volumen de RBC en la suspensión celular, esto es, después de la adición de la solución aditiva, es de aproximadamente 27 a 70% de la suspensión total. Más preferiblemente, la fracción en volumen de RBC en la suspensión celular es de aproximadamente 35 a aproximadamente 50%. Más preferiblemente, la fracción en volumen de RBC en la suspensión celular es de aproximadamente 43% de la suspensión total. En el curso del período de almacenamiento los presentes inventores monitorearon y recolectaron datos relevantes con la salud de la célula de sangre roja. Como se nota en las figuras 1 y 2, el almacenamiento de acuerdo con la presente invención dio como resultado una calidad de célula de sangre roja superior por duraciones más largas como volúmenes más pequeños. Como se nota anteriormente, la "lesión" de almacenamiento de sangre es un evento apoptótico y la membrana de célula de sangre roja sufre cambios fisiológicos y morfológicos conmensurados con la muerte celular programada. En el curso del período de almacenamiento, es conocido que el área superficial de membrana de la célula de sangre roja disminuye de tal manera que su forma cambia de la forma bicóncava que permite máxima área superficial por volumen, facilitando la difusión de gases y nutrientes, a una forma más esférica característica de una célula frágil que muere. La membrana de la célula de sangre roja es inicialmente flexible y deformable, facilitando el paso a través de los capilares pequeños. Este cambio de forma global es acompañado por la contracción de la membrana de microvesículas, formando espículas sobre la superficie externa de la célula de sangre roja, de tal manera que una célula en la etapa final de este proceso, en la observación, se asemeja a un erizo espinoso (de aquí el proceso es denominado como un cambio equinocítico y la forma final antes de la lisis es llamada un equinocito) . La fragilidad consecuente conduce inevitablemente a lisis y muerte de la célula. La determinación de la velocidad de hemolisis permite una indicación de alcance y severidad de esta actividad. Además de engendrar niveles inaceptables de hemolisis durante el almacenamiento, estos cambios morfológicos disparan mecanismos de despeje en el cuerpo del paciente del receptor después de la re-infusión de las células de sangre roja almacenadas, disminuyendo la recuperación post-infusión y disminuyendo la eficiencia de la transfusión. El empleo de las composiciones de acuerdo con la presente invención y métodos para conservar células de sangre roja que los utilizan, conduce a una fragilidad osmótica disminuida y una velocidad disminuida de hemolisis. Esto corresponde a un incremento en retención de área superficial de membrana celular y estado morfológico y por consiguiente, un incremento en la recuperación de células de sangre roja viables y una disminución en el despeje post-infusión de las células de sangre roja re-infusionadas del cuerpo del paciente del receptor. Una modalidad de la presente invención proporciona un método para mejorar el mantenimiento de membrana de célula de sangre roja (RBC) y supresión de apóptosis de RBC durante un período de almacenamiento. El método comprende almacenamiento de las RBC durante el período de almacenamiento en suspensiones a las cuales las composiciones de la invención han sido agregadas. En una modalidad especifica, la concentración microvesicular es reducida aproximadamente 75% de concentraciones observadas en células de sangre roja almacenadas por el mismo período de almacenamiento en suspensiones de RBC que comprenden AS-3. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método para disminuir la fragilidad de célula de sangre roja (RBC) y suprimir la hemolisis de RBC durante un período de almacenamiento. El método comprende almacenamiento de las RBC durante el período de almacenamiento en suspensiones a las cuales las composiciones de la invención han sido agregadas. Una modalidad adicional es concerniente con métodos para incrementar la viabilidad de células de sangre roja (RBC) subsecuente a un período de almacenamiento y después infusión a un paciente en necesidad de tal infusión y disminución de la velocidad de despeje de post-infusión de las RBC por el paciente. Los métodos comprenden almacenamiento de las RBC durante el período de almacenamiento en suspensiones a las cuales las composiciones de la invención han sido agregadas. La composición en solución aditiva de la invención confiere varias ventajas con respecto a las soluciones aditivas del arte previo. Las células de sangre roja almacenadas en la presente pueden ser almacenadas más tiempo, por lo menos 8 semanas con mejor RBC cromo-marcadas radioactivas 24 horas de recuperación in vivo, que cualquier solución con licencia actualmente. El uso de las composiciones de la invención disminuye claramente el alcance y severidad la de lesión de almacenamiento. Durante el período de almacenamiento, las células de sangre roja exhiben un intervalo aceptable de hemolisis: 0.2% a 6 semanas y 0.4% a 8 semanas, todas debajo del límite de la FDA de 1% al final de almacenamiento con licencia. Las células de sangre roja almacenadas en las soluciones aditivas de la invención exhiben menos pérdida de membrana durante el almacenamiento como se demuestra por las concentraciones más bajas de microvesículos de membrana y menos fragilidad osmótica. La conserva de la membrana durante el almacenamiento se espera que ayude a las RBC almacenadas en solución a tener mejores propiedades de flujo que las células que han perdido más membrana. La retención de la fisiología de membrana normal también suprime los mecanismos presentes en el cuerpo del paciente receptor que disparan el despeje selectivo de la circulación y destrucción de células de sangre roja. De aquí, las células de sangre roja re-infusionadas duran más tiempo en el paciente receptor y la recuperación a largo plazo mejorada de las células de sangre roja re-infusionadas es posible. Además, la sobrevivencia a más largo plazo mejorado de las células de sangre roja sometidas a infusión debe disminuir la necesidad de transfusiones repetidas disminuyendo los riesgos asociados al paciente. Las soluciones de la invención también permiten concentraciones de ATP de RBC más altas durante las últimas fases de almacenamiento, que se espera que permita mejor secreción de ATP RBC y por consiguiente flujo mejorado y longevidad mejorada después que las células son sometidas a transfusión. Pragmáticamente, las soluciones presentes son útiles en tanto que trabajan con sistemas de recolección tradicionales que recolectan sangre entera en CPD o CP2D para la producción de plasma congelado fresco y plaquetas donadoras aleatorias o para la recolección de sangre entera fresca en emergencias. Los siguientes ejemplos son proporcionados por propósitos ilustrativos solamente y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la presente invención como se define en la presente por las reivindicaciones.
EJEMPLOS Tabla 1 Composiciones de las Soluciones Aditivas Probadas
Ejemplo 1 Este ejemplo ilustra un perfil de desempeño y las ventajas de una modalidad de la composición de solución aditiva de la invención, designada como EAS-81 (véase Tabla 1) . EAS-81 y AS-3 del ejemplo comparativo (Nutricel, Pal Biomedical) son ambos provistos en volúmenes convencionales, en tanto que los ejemplos comparativos EAS-61 y EAS-76v6 son provistos en volúmenes más grandes más diluidos. Tanto EAS-81 como EAS-76v6 comprenden ambos bicarbonato. Véase figura 1, en donde las composiciones que contienen bicarbonato son representadas por círculos, en tanto que aquellas sin bicarbonato son representadas por diamantes. Las composiciones en volumen más alto son representados por figuras sólidas, en tanto que las composiciones de volumen convencional son representadas por figuras abiertas. Todos los volúmenes de las composiciones de solución aditiva revelados en la presente se entiende que son por unidad de 500 ml de sangre entera para una proporción volumétrica aproximadamente de 1:4.5. El primer ejemplo se lleva a cabo como un estudio de acumulación con el fin de evaluar el efecto de los ingredientes de la solución de almacenamiento sobre el mecanismo e integridad de la RBC en el curso de 10 semanas de almacenamiento en bolsas de PVC. La acumulación reduce la fuente más grande de variación en estudios de almacenamiento de sangre convencionales, esto es, las diferencias innatas entre las RBC de diferentes donadores. La acumulación coloca algunas de las células de cada donador en cada grupo del estudio en tanto que mantiene el tamaño de unidad convencional. Las unidades de RBC, no reactivas en la prueba de antiglobulina indirecta (IAT) son agrupadas en conjuntos de 4 unidades de ABO-idénticas . Luego cada conjunto es acumulado, mezclado y proporcionado en alícuotas para elaborar cuatro unidades acumuladas idénticas. Una unidad de cada acumulación es usada en cada uno de los cuatro brazos del estudio. Las composiciones de AS-3 y los EAS son reveladas en la Tabla 1. Los EAS son fabricados en el laboratorio a partir de adenina USP, azúcares y sales disponibles de Sigma Chemicals, St. Louis, MO y filtradas estérilmente a bolsas de almacenamiento de un litro (Code 4R2032, Baxter Healthcare, Deerfield, IL) , tal como se detalla en Hess et al. "The effects of phosphate, pH, and AS volume on RBCs stored in saline-adenine-glucose-mannitol solutions", Transfusión, volumen. 40-1000-1006, agosto 2000, incorporado plenamente en la presente por referencia. Las bolsas de almacenamiento son mantenidas a 37°C por dos semanas. Luego las soluciones son cultivadas y los cultivos incubados por otras dos semanas. La esterilidad es confirmada por la ausencia de crecimiento bacteriano y fungal por 7-14 días (SeptiCheck, Becton-Dickinson Microbiology Sistemas, Sparks, MD) y las soluciones son administradas en alícuotas en peso a bolsas de PVC de 600 ml (Código 4R2023, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) . Todas las conexiones son realizadas utilizando un dispositivo de conexión estéril (SCD 312, Terumo Medical Corp. Elkton, MD) .
Preparación de Unidad de RBC : Las unidades estándar de sangre (500 ± 55 ml) son recolectadas en 70 ml de solución de CP2D en un sistema de recolección de triple bolsa (código de item #127-23, Pall Corporation, East Hills, NY) . Las unidades son leucoreducidas con el filtro de leucoreducción integral. Las RBC empacadas son preparadas mediante centrifugación durante 5 minutos seguida por remoción de casi todos los 65 ml del plasma, después de lo cual el volumen enlistado de AS o EAS es agregado estérilmente. Las unidades son almacenadas verticales a 1-6°C por 10 semanas excepto por aproximadamente de manera semanal y mezclado y remoción de una muestra de 15 ml .
Mediciones In Vitro La leucoreducción (eliminación de células de sangre blanca del producto de sangre entera) es confirmada mediante citometría de flujo. La concentración de hemoglobina total (Hb) es medida con un analizador de hematología clínico (Hematology Cell Counter System Serie 9110+ , Baker, Allentown, PA) . El volumen de célula promedio (MCV es determinado a partir del conteo de RBC y el microhematócrito de la suspensión de almacenamiento. La Hb de sobrenadante es medida espectrofotométricamente utilizando el análisis de Drabkin modificado como se discute en Moore et al., "A micromodification of the Drabkin hemoglobin assay for measuring plasma hemoglobin in the range of 5 to 2000 mg/dl". Biochem Med 26:167-173 (1981), incorporado plenamente por referencia en la presente. El por ciento de hemolisis es determinado al medir la proporción de la Hb libre a total y el hematócrito. Las concentraciones de ATP de RBC son medidas en sobrenadantes de PRBC deproteinados . Alícuotas celulares son mezcladas con ácido tricloroacético 10% frío para precipitar la proteína de sangre, centrifugadas a 2700 x g durante 10 minutos y el sobrenadante libre de proteína congelado a -80°C hasta que es probado. El ATP es analizado enzimáticamente utilizando un equipo de prueba disponible comercialmente (Procedures 366-UV, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) . Gases de sangre, bicarbonato y pH son medidos o calculados sobre un analizador de gas de sangre (Corning 855, Ithica, NY) . Así, el pH es medido a 37°C. El sodio, potasio, cloruro, fosfato, lactato y glucosa extracelulares son medidos sobre un analizador químico programable. (Hitachi 902 Analyzer, Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) . El grado promedio de cambio de forma de RBC de discocitos a equinocitos a esferocitos es medido de acuerdo con el método de Usry, Moore y Manolo, descrito en "Morphology of stored, rejuvenated human erythrocytes" Vox Sang 28:176-183 (1975), incorporado plenamente en la presente por referencia. Los microvesículos son medidos en el sobrenadante al final de almacenamiento. El plasma es ultracentrifugado, el aglomerado de vesículas lavado tres veces en solución salina y luego la proteína total es cuantificada utilizando el método de Bradford (BioRad, Richmond, CA) . Los resultados de las pruebas de comparación de las 4 soluciones de almacenamiento de RBC son ilustrados en las figuras 1 y 2. En todas las soluciones de almacenamiento, las concentraciones de ATP en RBC se incrementaron en la primera semana de almacenamiento (figura ÍA) . En las EAS la concentración de ATP siguió elevándose en la segunda semana y siguió siendo más alta que en el AS-3 por la duración del estudio. A ocho semanas de almacenamiento y más allá, el EAS-81 exhibió concentraciones de ATP equivalentes al volumen incrementado de EAS-61, en tanto que EAS-78, que tiene tanto el volumen incrementado como el sistema regulador del pH de bicarbonato, exhibió concentraciones un tanto más altas. La hemolisis (el rompimiento de las células de sangre roja), se incrementa con la duración de almacenamiento en todas las soluciones de almacenamiento (figura lb) . En todos los tiempos, sin embargo, la hemolisis fue más alta en AS-3. Fue moderadamente reducido en EAS-81 y reducido adicionalmente en los otros EAS. No hubo ninguna reducción adicional de hemolisis con bicarbonato en las soluciones de alto volumen. Como se esperaba, un volumen de AS más bajo dio como resultado un hematócrito de almacenamiento más alto (figura lc) y volumen perdido de RBC en todas las soluciones durante el almacenamiento . Las concentraciones de lactato fueron más altas a través de todos los puntos en el tiempo en los EAS que contienen bicarbonato (figura ld) . La producción de lactato total durante 8 semanas de almacenamiento fue de 9 mM en AS-3, 12 mM en EAS-61, 13 mM en EAS-81 y 15 mM en EAS-78. El pH extra e intracelular fue también más alto en la mayoría de los puntos en el tiempo, pero las diferencias en el pH intracelular no obtienen significado estadístico (figuras le y lf) . El curso de tiempo de pérdida de bicarbonato y elevación y caída de PC02 que proporcionan la regulación en la solución de suspensión es mostrado en las figuras lg y lh. En general, la comparación del EAS-81 de la invención con las células almacenadas AS-3 revela mayor utilización de energía con concentraciones de ATP más altas ATP resultantes, menos hemolisis mejor morfología, menos microvesiculación y pH ligeramente más alto en el anterior. Los EAS más antiguos, especialmente EAS-76v6, funcionan aún mejor en ciertos aspectos, pero su volumen mayor da como resultado mayor dilución de las RBC almacenadas lo que podría dar como resultado hemodilución de receptores pacientes con múltiples infusiones .
Ejemplo 2 Este ejemplo ilustra que una formulación de EAS de la invención permite el almacenamiento de RBC en solución aditiva de volumen convencional por 8 semanas, con mejor recuperación, hemolisis más baja y conservación de membrana mejorada con respecto a la solución de almacenamiento de 6 semanas conocida. 12 sujetos voluntarios que cumplen con los criterios de donador de la Administración de Alimentos y Fármacos de los
Estados Unidos de América (FDA) y la Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre fueron seleccionados. Los sujetos donaron 500 ml (una unidad) de sangre entera, que fue recolectada en bolsa primaria CP2D (código de ítem # 127-23, Pall Corporation, East Hills, NY) y leuco-reducida con casi aproximadamente 65 ml del plasma removido. EAS-81, 110 ml, fue agregado y las soluciones de RBC empacadas fueron almacenadas verticales a 1-6°C con la mitad de las muestras (n=6) siendo almacenadas por 6 semanas y media (n=6) por 8 semanas. La semana previa al final del almacenamiento las unidades fueron muestreadas estérilmente y cultivadas. Si el cultivo no exhibía crecimiento, una alícuota pequeña de las RBC almacenadas fue marcada con 51-Cr y devuelto al donador utilizando el protocolo de Moroff para la medición de marcador individual de recuperación de RBC. Gráficas de medias y errores estándar fueron creadas y otras estadísticas descriptivas de los grupos de almacenamiento fueron calculadas utilizando los elementos de programación de programa de hoja de cálculo (Excel, Microsoft, Redmond, WA) . La producción de lactato en cada uno de los sistemas de almacenamiento fue calculada a partir de las concentraciones del comienzo y final y los volúmenes de sistema de almacenamiento fueron ajustados para tomar en cuenta la hemoglobina y el contenido de proteína en el suero. Gráficas de bloques de valores de recuperación de RBC fueron producidas utilizando SyStat Ver. 6 (SPSS Inc., Chicago, IL) . RBC leuco-reducidas almacenadas en CP2D/EAS-81 por 6 semanas tuvieron una recuperación in vivo de 24 horas autóloga promedio de 85 ± 5%, con recuperación in vivo después de 8 semanas a 87 ± 2% (figura 2). La anomalía evidente de recuperación más alta a un tiempo más largo es probablemente resultado del tamaño pequeño del estudio y la mayor variabilidad en el almacenamiento de sangre de diferentes individuos. Sin embargo estas recuperaciones son superiores a cualquier solución de almacenamiento con licencia actual y cumpliría con los criterios para licencia en los Estados Unidos de América y Europa (esto es, exhibe una recuperación mayor de 75% a recuperación y hemolisis menor de 1% para los Estados Unidos de América o una recuperación mayor de 75% y hemolisis menor de 0.8% para Europa) . La fracción de hemolisis de RBC durante este estudio fue de 0.2 ± 0.2 a seis semanas y 0.4 ± 0.2 a 8 semanas. Las concentraciones de proteína de microvesícula de RBC fueron 8 ± 4 a 6 semanas y 12 ± 6 mg/dl de RBC a 8 semanas y así sumó solo aproximadamente 5% de la pérdida de hemoglobina de RBC. El desempeño de almacenamiento superior del EAS-81 de la invención en términos tanto de duración de almacenamiento como funcionamiento fisiológico mejorado del producto sometido a infusión, parece derivarse de varias bases. En primer lugar, el nuevo sistema modulador de pH permite regulación sostenida del pH de la solución suspendida a través del período de almacenamiento probado que es suficiente para mantener un pH en el espacio intracelular suficiente para impulsar el equilibrio celular interno hacia la glicólisis y lejos de la producción que consume ATP de 2,3-DPG. Además, las concentraciones de fosfato extracelular más altas en esta formulación contribuyen hacia limitar las concentraciones de Ca++ extracelulares, que a su vez, suprimen varios procesos apoptóticos tales como enmarañamiento de fosfolípidos y deformación y pérdida de membrana. Esto conduce a recuperación post-infusión mejorada y una calidad de membrana más alta en las RBC sometidas a infusión, disminuyendo adicionalmente el disparo de mecanismos de despeje in vivo rápidos en pacientes sometidos a infusión y dando como resultado un porcentaje más alto de RBC sometidas a infusión recuperables por un período extenso más allá de la infusión. La formulación de EAS-81, que elimina NaCl en favor de incrementar la cantidad de los compuestos reguladores del pH particulares en tanto que mantiene la osmolaridad apropiada, permite una modulación del pH que dura más tiempo, más efectiva de la suspensión de solución de las RBC-aditiva, y más fosfato disponible para minimizar los eventos celulares adversos asociados con incrementar las concentraciones de Ca++ y disminuir la concentración de ATP. Además, la habilidad de formular EAS-81 en volúmenes convencionales lo hace particularmente apropiado para uso en pacientes sometidos a transfusión de manera múltiple y masiva.
Claims (58)
- REIVINDICACIONES 1. Una composición acuosa para almacenamiento de células de sangre roja a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C, caracterizada porque la composición consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable; y un sistema regulador del pH, en donde el sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio, en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de una suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en las células de sangre roja que favorecen la glicólisis con respecto a la síntesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento.
- 2. Una composición acuosa para almacenamiento de células de sangre roja a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C, la composición está caracterizada porque comprende : adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable; y un sistema regulador del pH, en donde el sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio, en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en la célula de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la síntesis de 2 , 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento, y en donde la composición está sustancialmente libre de iones cloruro derivados exógenamente.
- 3. Una suspensión de células de sangre roja caracterizada porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 1.
- 4. La suspensión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la suspensión es apropiada para infusión directa a un paciente en necesidad de tal infusión.
- 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio es seleccionado del grupo que consiste de bicarbonato de sodio, fosfato de disodio, y combinaciones de los mismos.
- 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato es bicarbonato de sodio.
- 7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el por lo menos un agente que proporciona iones de fosfato es seleccionado del grupo que consiste de fosfato de sodio, fosfato de disodio, fosfato de trisodio y combinaciones de los mismos.
- 8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el por lo menos un agente que proporciona iones de fosfato es fosfato de disodio.
- 9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente comprende adicionalmente por lo menos un agente que proporciona un catión aceptable fisiológicamente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, potasio, amonio, magnesio y combinaciones de los mismos.
- 10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable es manitol.
- 11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una osmolaridad de aproximadamente 200 a aproximadamente 310 mOsm.
- 12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la osmolaridad es de aproximadamente 221 a aproximadamente 280 mOsm.
- 13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la osmolaridad es de aproximadamente 270 mOsm.
- 14. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9.
- 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el pH es de aproximadamente 8.2 a aproximadamente 8.8.
- 16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el pH de la composición es de aproximadamente 8.4 a aproximadamente 8.6.
- 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el pH de la composición es de aproximadamente 8.5.
- 18. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sistema regulador del pH tiene una capacidad de regulación del pH en la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada que incrementa por al menos aproximadamente 2 mEq entre un pH de 6.5 y 7.2 en un período de almacenamiento de 6 semanas .
- 19. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor de entre aproximadamente 6.4 y aproximadamente 7.4.
- 20. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor de entre 7.0 y menos de aproximadamente 7.2.
- 21. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor mayor de aproximadamente 7.1 y menor de 7.2.
- 22. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 1-3 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 115 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 130 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mM.
- 23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 22 a aproximadamente 40 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 mM.
- 24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 80 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 55 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 26 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 12 mM y además en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 8.5.
- 25. Un método de conservación de células de sangre roja (RBC) por un periodo de almacenamiento, caracterizado porque comprende: (a) mezclar una muestra de sangre entera recolectada que contiene las RBC a ser almacenadas y plasma con una solución anticoagulante, formando mediante esto una suspensión de sangre entera recolectada; (b) tratamiento de la suspensión de sangre entera recolectada para agotar el plasma y concentrar las RBC, formando mediante esto RBC empacadas; (c) mezclar las RBC empacadas con una cantidad de una composición acuosa suficiente para formar una suspensión de RBC que tienen aproximadamente 35% a aproximadamente 70% de RBC en volumen; (d) enfriamiento de la suspensión de RBC a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C; y (e) almacenamiento de la suspensión enfriada de RBC de acuerdo con procedimientos de banco estándar, en donde la composición acuosa consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable; y un sistema regulador del pH, en donde el sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio, en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de una suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en la célula de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la síntesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento.
- 26. The método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la suspensión de RBC es apropiada para infusión directa a un paciente en necesidad de tal infusión.
- 27. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable es manitol.
- 28. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio es seleccionado del grupo que consiste de bicarbonato de sodio, fosfato de disodio, y combinaciones de los mismos.
- 29. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato es bicarbonato de sodio.
- 30. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato es seleccionado del grupo que consiste de fosfato de sodio, fosfato de disodio, fosfato de trisodio y combinaciones de los mismos.
- 31. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25 caracterizado porque el por lo menos un agente que proporciona iones de fosfato es fosfato de disodio.
- 32. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente comprenden adicionalmente por lo menos un agente que proporciona un catión aceptable fisiológicamente seleccionado del grupo que consiste de H+, potasio, amonio, magnesio y combinaciones de los mismos.
- 33. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición tiene una osmolaridad de aproximadamente 200 a aproximadamente 310 mOsm.
- 34. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la osmolaridad es de aproximadamente 221 a aproximadamente 280 mOsm.
- 35. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la osmolaridad es de aproximadamente 270 mOsm.
- 36. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9.
- 37. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 8.2 a aproximadamente 8.8.
- 38. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el pH de la composición es de aproximadamente 8.4 a aproximadamente 8.6.
- 39. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el pH de la composición es de aproximadamente 8.5.
- 40. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sistema regulador del pH tiene una capacidad de regulación del pH en la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada que incrementa por 2 mEq entre un pH de 6.5 y 7.2 en un período de almacenamiento de 6 semanas.
- 41. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor de entre aproximadamente 6.4 y aproximadamente 7.4.
- 42. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor de entre 7.0 y menos de aproximadamente 7.2.
- 43. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición es operable para mantener el pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición ha sido agregada a un valor mayor de aproximadamente 7.1 y menor de 7.2.
- 44. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 1-3 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 115 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 130 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mM.
- 45. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 22 a aproximadamente 40 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 70 a aproximadamente 15 mM.
- 46. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la composición comprende adenina en una cantidad de aproximadamente 2 mM, dextrosa en una cantidad de aproximadamente 80 mM, azúcar protector de membrana no metabolizable en una cantidad de aproximadamente 55 mM, bicarbonato de sodio en una cantidad de aproximadamente 26 mM y fosfato de disodio en una cantidad de aproximadamente 12 mM y además en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 8.5.
- 47. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la proporción en volumen de la composición a la sangre entera recolectada es de aproximadamente 1:4.5.
- 48. El método de conservación de RBC de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el volumen de la composición es de aproximadamente 110 ml y el volumen de la sangre entera recolectada es de aproximadamente 500 ml .
- 49. Un método para mejorar el mantenimiento de membrana de célula de sangre roja (RBC) y suprimir la apóptosis de RBC durante un período de almacenamiento, el método está caracterizado porque comprende: almacenar las RBC durante el periodo de almacenamiento en una suspensión a la cual la composición de conformidad con la reivindicación 1 ha sido agregada.
- 50. Un método para mejorar el mantenimiento de membrana de RBC y suprimir la apóptosis de RBC durante un período de almacenamiento de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque un indicator del mantenimiento de membrana es una medida de concentración de microvesículas sobre las RBC al final de un período de almacenamiento, y en donde la concentración de microvesículas es reducida por aproximadamente 50 a 75 por ciento.
- 51. Un método para disminuir la fragilidad de células de sangre roja (RBC) y suprimir la hemolisis de RBC durante un período de almacenamiento, el método está caracterizado porque comprende: almacenar las RBC durante el período de almacenamiento en una suspensión a la cual la composición de conformidad con la reivindicación 1 ha sido agregada.
- 52. Un método para incrementar la viabilidad de células de sangre roja (RBC) subsecuente a un período de almacenamiento y después de infusión a un paciente en necesidad de tal infusión y disminuir la velocidad de despeje de postinfusión de las RBC por el paciente, el método está caracterizado porque comprende: almacenar las RBC durante el período de almacenamiento en una suspensión a la cual la composición de conformidad con la reivindicación 1 ha sido agregada .
- 53. Un método para conservar células de sangre roja (RBC) por un período de almacenamiento, caracterizado porque comprende : (a) mezclar una muestra de sangre entera recolectada que contiene las RBC a ser almacenadas y plasma con una solución anticoagulante, formando mediante esto una suspensión de sangre entera recolectada; (b) tratamiento de la suspensión de sangre entera recolectada para agotar el plasma y concentrar las RBC, formando mediante esto RBC empacadas; (c) mezclar las RBC empacadas con una cantidad de una composición acuosa suficiente para formar una suspensión de RBC que tienen aproximadamente 27% a aproximadamente 70% de RBC en volumen; (d) enfriamiento de la suspensión de RBC a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C; y (e) almacenamiento de la suspensión enfriada de RBC de acuerdo con procedimientos de banco estándar, en donde la composición acuosa consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable; y un sistema regulador del pH, en donde el sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio, en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de una suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en las células de sangre roja que favorecen la glicólisis con respecto a la síntesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento.
- 54. Un método de conservación de células de sangre roja (RBC) por un período de almacenamiento, caracterizado porque comprende : (a) mezclar una muestra de sangre entera recolectada que contiene las RBC a ser almacenadas y plasma con una solución anticoagulante, formando mediante esto una suspensión de sangre entera recolectada; (b) tratamiento de la suspensión de sangre entera recolectada para agotar el plasma y concentrar las RBC, formando mediante esto RBC empacadas; (c) mezclar las RBC empacadas con una cantidad de una composición acuosa suficiente para formar una suspensión de RBC que tienen un porcentaje de RBC en volumen dentro del intervalo producido por procedimientos de banco de sangre estándar; (d) enfriamiento de la suspensión de RBC a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C; y (e) almacenamiento de la suspensión enfriada de RBC de acuerdo con procedimientos de banco estándar, en donde la composición acuosa consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable; y un sistema regulador del pH, en donde el sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio, en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de la suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en las células de sangre roja que favorecen la glicólisis con respecto a la síntesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento.
- 55. Un método para la conservación de células de sangre roja (RBC) por un período de almacenamiento, caracterizado porque comprende: (a) mezclar una muestra de sangre entera recolectada que contiene las RBC a ser almacenadas y plasma con una solución de anticoagulante, formando mediante esto una suspensión de sangre entera recolectada; (b) tratamiento de la suspensión de sangre entera recolectada para agotar el plasma y concentrar las RBC, formando mediante esto RBC empacadas; (c) mezclar las RBC empacadas con un volumen de composición acuosa que fluctúa de aproximadamente 60 ml a aproximadamente 400 ml; (d) enfriamiento de la suspensión de RBC a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C; y (e) almacenamiento de la suspensión enfriada de RBC de acuerdo con procedimientos de banco estándar, en donde la composición acuosa consiste esencialmente de: adenina; dextrosa; por lo menos un azúcar protector de membrana no metabolizable; y un sistema regulador del pH, en donde el sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato y por lo menos un agente que proporciona cationes de sodio, en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición sea operable para mantener un pH de una suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en las células de sangre roja que favorecen la glicólisis con respecto a la sintesis de 2, 3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento.
- 56. La combinación que comprende la composición de conformidad con la reivindicación 1, contenida dentro de una bolsa de almacenamiento de sangre caracterizada porque tiene un volumen suficiente para contener una solución aditiva que tiene un volumen de aproximadamente 60 ml a aproximadamente 400 ml y un volumen de sangre entera de aproximadamente 270 ml a aproximadamente 2,250 ml .
- 57. La combinación de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque el volumen de la bolsa de almacenamiento de sangre es de aproximadamente 550 ml y contiene aproximadamente 100 ml de solución aditiva y aproximadamente 450 ml de sangre entera.
- 58. Una composición acuosa con una osmolaridad de 270 mOsm para almacenamiento de células de sangre roja por un período de aproximadamente 8 semanas a aproximadamente 1 a aproximadamente 6°C, caracterizado porque la composición consiste esencialmente de: adenina 2 mM; dextrosa 80 mM; por lo menos una azúcar protector de membrana no metabolizable 55 mM tal como manitol; y un sistema regulador del pH; en donde el sistema regulador del pH comprende una combinación de agentes reguladores del pH aceptables fisiológicamente que incluyen por lo menos un agente que proporciona aniones de bicarbonato vía bicarbonato de sodio a una concentración de 26 mM, por lo menos un agente que proporciona aniones de fosfato vía fosfato de disodio a una concentración de 12 mM y por lo menos un agente que proporciona iones de sodio (ya sea bicarbonato de sodio o fosfato de disodio) , en donde el sistema regulador del pH está presente en una cantidad suficiente para que la composición mantenga un pH de una suspensión de células de sangre roja (RBC) a la cual la composición es agregada a un valor que es suficiente para establecer y mantener durante un período de almacenamiento un equilibrio de reacción en las células de sangre roja que favorece la glicólisis con respecto a la síntesis de 2,3-difosfoglicerato (DPG) a partir de 1,3-DPG, generando mediante esto una ganancia neta en síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) con respecto al equilibrio de reacción durante el período de almacenamiento.
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