MX2007000332A - Generacion de plantas con contenido oleaginoso alterado. - Google Patents

Abstract

La presente invencion esta dirigida a plantas que muestran un fenotipo de contenido oleaginoso alterado debido a la expresion alterada de un acido nucleico HIO; la invencion esta ademas dirigida a metodos para genera plantas con un fenotipo de contenido oleaginoso alterado.

Description

GENERACIÓN DE PLANTAS CON CONTENIDO OLEAGINOSO ALTERADO REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. 60/585,495 presentada el 2 de julio, 2004, el contenido de la cual se incorpora aquí por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La habilidad de manipular la composición de semillas de cultivo, particularmente el contenido y composición de aceites de semilla, tienen importantes aplicaciones en las industrias agrícolas, relacionando tanto los aceites de alimentos procesados y los aceites para formar alimentos de animales. Las semillas de cultivos agrícolas contienen una variedad de constituyentes valiosos, incluyendo aceite, proteína, y almidón. El procesamiento industrial puede separar algunos o todos estos constituyentes para una venta individual en aplicaciones específicas. Por ejemplo, cerca del 60% del cultivo de fríjol de soya en Estados Unidos se tritura a través de la industria de procesamiento de soya. El procesamiento de soya produce aceite purificado, el cual se vende a un valor muy alto, mientras que el resto se vende principalmente para alimentos de ganado a un precio más bajo (U.S.

Soybean Board, 2001 Soy Stats). Las semillas de cañóla se trituran para producir aceite y el coproducto de alimento de cañóla (Cañóla Council of Canadá). Cerca del 20% de la cosecha de maíz de 1999/2000 en Estados Unidos se refino industrialmente, principalmente para la producción de almidón, etanol, y aceite (Corn Refiners Association). De esta forma, por lo general se desea aumentar al máximo el contenido oleaginoso de las semillas. Por ejemplo, las semillas de aceite procesadas tales como soya y cañóla incrementando el contenido oleaginoso absoluto de las semillas incrementará el valor de dichos granos. Para maíz procesado puede ser deseable ya sea incrementar o disminuir el contenido oleaginoso, dependiendo de la utilización de otros constituyentes principales. La disminución de aceite puede mejorar la calidad del almidón aislado a través de la reducción de los sabores no deseados asociados con la oxidación del aceite. Alternativamente, en la producción de etanol, en donde el sabor no es importante, el incremento en el contenido oleaginoso puede incrementar el valor total. En muchos granos alimenticios, tales como maíz y trigo, es deseable incrementar el contenido oleaginoso de la semilla, debido a que el aceite tiene un contenido de energía mayor que otros constituyentes de la semilla tales como carbohidratos. El procesamiento de las semillas de aceite, como en la mayoría de los negocios de procesamiento de granos, es un negocio intensivo en cuanto a capital; de esta forma los pequeños cambios en la distribución de los productos de componentes valuados como bajos a los componentes oleaginosos de alto valor pueden tener impactos sustancialmente económicos para los procesadores de granos. La manipulación biotecnológica de los aceites puede proveer una alteración en la composición y un mejoramiento en el rendimiento del aceite. Las alteraciones en la composición incluyen fríjol de soya alto oleico y aceite de maíz (patentes de E.U.A. Nos. 6,229,033 y 6,248,939), y semillas que contienen laurato (patente de E. U. A. No. 5,639,790), entre otros. El trabajo en la alteración en la composición está predominantemente enfocado en semillas de aceite procesado pero se ha extendido rápidamente a cultivos de semillas no de aceite, incluyendo maíz. Ya que existe un interés considerable en el incremento de contenido oleaginoso, la única biotecnología actualmente practicada en esta área es la tecnología de maíz alta en aceite (HOC) (DuPont, patente de E. U. A. No. 4,704,160). HOC emplea polinizadores altos en aceite desarrollados a través de la selección clásica de producción junto con hembras híbridas élite (machos estériles) en un sistema de producción referido como TopCross. El sistema alto en aceite TopCross da origen a contenido oleaginoso de grano cosechado en maíz de aproximadamente 3.5% a aproximadamente 7%, mejorando el contenido de energía del grano. Aunque ha sido provechoso, el sistema de producción HOC tiene limitaciones inherentes. Ppmero, el sistema de tener un bajo porcentaje de polinizadores responsables de un grupo de semillas del campo completo contiene riesgos inherentes, particularmente en los años de sequía. Segundo, el contenido oleaginoso en los campos HOC actuales ha estado apático en alrededor de 9% de aceite. Finalmente, el maíz alto en aceite no es principalmente un cambio bioquímico, sino más bien un mutante anatómico (tamaño del embrión incrementado) que tiene un resultado indirecto sobre el contenido oleaginoso en incremento. Por estas razones, sería especialmente valiosa una alternativa de estrategia alta en aceite, particularmente una que se deriva de una salida bioquímica alterada. Los cultivos objetivo más obvios para el mercado de aceite procesado son soya y semilla de colza, y una gran parte de trabajo comercial (por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,952,544; Solicitud PCT WO 9411516) demuestran que Arabidopsis es un modelo excelente para el metabolismo del aceite en estos cultivos. Las selecciones bioquímicas de composiciones oleaginosas de semillas han identificado los genes de Arabidopsis para muchas enzimas biosintéticas críticas y han conocido la identificación de ortólogos de gen agronómicamente importantes. Por ejemplo, las selecciones que utilizan poblaciones químicamente mutagenizadas han identificado mutantes lípidos cuyas semillas despliegan una composición de ácido graso alterado (Lemieux et al, 1990; James y Dooner, 1990). Las selecciones de mutagénesis ADN-T (Feldmann et al., 1989) que detectaron las composiciones de ácido graso alteradas identificaron los genes de desaturasa de omega 3 (FAD3) y desaturasa delta-12 (FAD2) (patente de E.U.A. No. 5,952,544; Yadav et al, 1993; Okuley et al, 1994). Una selección que se enfoca sobre el contenido oleaginoso en vez de la calidad del aceite, analizó los mutantes químicamente inducidos para semillas rugosas o la densidad de la semilla alterada, a partir de la cual el contenido oleaginoso de la semilla altera fue inferido (Focks y Benning, 1998). Otra selección, designada para identificar enzimas involucradas en la producción de ácidos grasos de cadena muy larga, identificaron una mutación en el gen que codifica aciltransferasa de diacilglicerol (DGAT) como siendo la responsable de la acumulación de glicerol de triacilo reducido en las semillas (Katavic V et al, 1995). Además se demostró que la sobre-expresión específica de las semillas de ADNc de DGAT estuvo asociada con el contenido oleaginoso de semilla incrementado (Jako et al, 2001 ). La activación de la marcación en plantas referidas como un método para generar mutaciones aleatorias a través de la inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias reguladoras (por ejemplo, un mejorador) dentro del genoma de la planta. Las secuencias reguladoras pueden actuar para mejorar la trascripción de uno o más genes de planta nativos; por consiguiente, la activación de la marcación es un método fructífero para generar ganancias de función, generalmente mutantes dominantes (ver, por ejemplo, Hayashi et al, 1992; Weigel D et al, 2000). La construcción insertada provee una etiqueta molecular para una rápida identificación de la planta nativa cuyo error en expresión causa el fenotipo mutante. La activación de la marcación también puede causar la pérdida de la función de lo fenotipos. La inserción puede dar como resultado la interrupción del gen de la planta nativa, en cuyo caso el fenotipo es generalmente recesivo. La activación de la marcación se ha utilizado en varias especies, incluyendo tabaco y Arabidopsis, para identificar muchas diferentes clases de fenotipos mutantes y de genes asociados con estos fenotipos (Wilson et al, 1996, Schaffer et al, 1998, Fridborg et al, 1999; Kardailsky et al, 1999; Christensen S et al, 1998).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona una planta transgénica que tiene un fenotipo altamente oleaginoso. La planta transgénica comprende un vector de transformación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para o es complementaria con una secuencia que codifica un polipéptido altamente oleaginoso (de aquí en adelante "HIO"). En modalidades preferidas, la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste en semilla de colza, de soya, de maíz, de girasol, de algodón, de cacao, de cártamo, de aceite de palma, de palma de coco, de lino, de ricino y de cacahuate. La invención además proporciona un método para producir aceite que comprende hacer crecer la planta transgénica y recuperar el aceite de dicha planta. La invención también proporciona una célula de planta transgénica que tiene un fenotipo altamente oleaginoso. La célula de planta transgénica comprende un vector de transformación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para o es complementaria con una secuencia que codifica para un polipéptido HIO. En modalidades preferidas, la célula de planta transgénica se selecciona del grupo que consiste en semilla de colza, de soya, de maíz, de girasol, de algodón, de cacao, de cártamo, de aceite de palma, de palma de coco, de lino, de ricino y de cacahuate. En otras modalidades, la célula de planta es una semilla, polen, propágalo o célula de embrión. La invención además proporciona pienso, comida, grano, alimento o semilla que comprende una secuencia de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido HIO. La invención también proporciona pienso, comida, grano, alimento, o semilla que comprende el polipéptido HIO, o un ortólogo del mismo. La planta transgénica de la invención se produce mediante un método que comprende introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para o es complementaria con una secuencia que codifica para un polipéptido HIO, y hacer crecer las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde la secuencia de polinucleótido HIO se expresa provocando el fenotipo altamente oleaginoso. La. invención proporciona además células de plantas obtenidas a partir de plantas transgénicas. La presente invención también proporciona un contenedor de más de alrededor de 10.000, más preferiblemente alrededor de 20.000, e incluso más preferiblemente alrededor de 40.000 semillas en donde más del 10%, más preferiblemente alrededor del 25%, más preferiblemente alrededor del 50%, e incluso más preferiblemente alrededor del 75% o más prefepblemente alrededor del 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención. La presente invención también proporciona un contenedor de más de alrededor de 10 kg, más prefepblemente alrededor de 25 kg e incluso más prefepblemente alrededor de 50 kg de semillas en donde más de alrededor del 10%, más preferiblemente alrededor del 25%, más preferiblemente alrededor del 50%, e incluso más prefepblemente alrededor del 75% o más preferiblemente alrededor del 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención. Cualquiera de las plantas o partes de las mismas de la presente invención pueden procesarse para producir un pienso, alimento, comida, o preparación oleaginosa. Una parte de la planta particularmente preferida para este propósito es una semilla. En una modalidad preferida, el pienso, alimento, comida, o preparación oleaginosa se designa para animales rumiantes. Los métodos para producir pienso, alimento, comida, y preparaciones oleaginosas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. 4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; y 6,156,227. La comida de la presente invención puede mezclarse con otras comidas. En una modalidad preferida, la comida producida de plantas de la presente invención o generadas mediante un método de la presente invención constituye más de alrededor de 0.5%, alrededor de 1 %, alrededor de 5%, alrededor de 10%, alrededor de 25%, alrededor de 50% alrededor de 75%, o alrededor de 90% en volumen o peso del componente de comida de cualquier producto. En otra modalidad, la preparación de comida puede mezclarse y puede constituir más de alrededor de 10%, alrededor de 25%, alrededor de 35%, alrededor de 50%, o alrededor de 75% de la mezcla en volumen.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica de la presente invención. Los practicantes están particularmente dirigidos a Sambrook et al, 1989, y Ausubel FM et al, 1993, para definiciones y términos de la técnica. Se entiende que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, y reactivos particulares descritos, y que éstos pueden variar. Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferirse entre varias células hospedero. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la habilidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula extraña. Muchos vectores de expresión procarióticos y eucarióticos están comercialmente disponibles. La selección de los vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de aquellos expertos en la técnica. Una construcción o secuencia de ácido nucleico "heteróloga" tiene una porción de la secuencia que no es nativa para la célula de planta en la cual se expresa. Heterólogo, con respecto a una secuencia de control se refiere a la secuencia de control (es decir, promotora, o mejoradora) que no funcionan en natural para regular el mismo gen de expresión del cual está actualmente regulada. Generalmente, las secuencias de ácido nucleico heterólogas no son endógenas para la célula o parte del genoma en la cual están presentes, y se han adicionado a la célula, a través de infección, transfección, microinyección, electroporación, o similares. Una construcción de ácido nucleico "heteróloga" puede contener una secuencia de control/secuencia de codificación de ADN en combinación que es igual que o diferente de una secuencia de control/secuencia de codificación de ADN en combinación encontrado en la planta nativa. Como se utiliza aquí, el término "gen" significa el segmento de ADN involucrado en la producción de una cadena de polipéptido, la cual puede o no puede incluir regiones que preceden y siguen la región de codificación, por ejemplo, 5' no traducida (5' UTR) o secuencias "líder" y 3' UTR o secuencias "trailer" así como las secuencias que intervienen (intrones) entre los segmentos de codificación individuales (exones) y la secuencia reguladora no transcrita. Como se utiliza aquí, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que ha sido modificada a través de la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga o que la célula se deriva de una célula así modificada. De esta forma, por ejemplo, la células recombinantes expresan genes que no se encuentran en una forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que por el contrario están anormalmente expresados, sub-expresados o no expresados para nada como un resultado de la intervención humana deliberada. Como se utiliza aquí, el término "expresión de gen" se refiere al procedimiento a través del cual el polipéptido se produce con base en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El procedimiento incluye tanto la trascripción como la traducción; por consiguiente, "expresión" se puede referir ya sea a una secuencia de polinucleótido o de polipéptido, o ambos. Algunas veces, la expresión de una secuencia de polinucleótido no conducirá a traducción de la proteína. "Sobre-expresión" se refiere a una expresión incrementada de una secuencia de polinucleótido y/o polipéptido relativa a su expresión en una planta de tipo silvestre (u otra referencia [por ejemplo no transgénica]) y puede estar relacionada con una secuencia de existencia natural o de existencia no natural. "Expresión ectópica" se refiere a la expresión en un momento, lugar y/o nivel incrementado que no ocurre naturalmente en la planta alterada o de tipo silvestre. "Sub-expresión" se refiere a una expresión disminuida de una secuencia de polinucleótido y/o polipéptido, generalmente de un gen endógeno, con relación a su expresión en una planta de tipo silvestre. Los términos "error en la expresión" y "expresión alterada" abarca la sobre-expresión, la sub-expresión y la expresión ectópica.

El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico dentro de una célula, significa "transfección", o "transformación" o "transducción" incluye la referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico dentro de una célula eucariótica o procariótica en donde la secuencia de ácido nucleico se puede incorporar dentro del genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido, o ADN mitocondrial), convertido en un replicón autónomo, o temporalmente expresado (por ejemplo, ARNm transfectado). Como se utiliza aquí "célula de planta" se refiere a cualquier célula derivada de una planta, incluyendo células de tejidos no diferenciados (por ejemplo, cayo) así como semillas de planta, polen, propágulos y embriones. Como se utiliza aquí, los términos "nativos" y "de tipo silvestre" relativos a una característica o fenotipo de planta dada se refiere a la forma en la cual la característica o fenotipo se encuentra en la misma variedad de planta en naturaleza. Como se utiliza aquí, el término "modificado" con respecto a la característica de la planta, se refiere a un cambio en el fenotipo de una planta transgénica con relación a una planta no transgénica similar. Un "fenotipo interesante (característica)" con referencia a una planta transgénica se refiere a un fenotipo observable o medible demostrado a través de T1 y/o la subsiguiente generación de la planta, que no se despliega a través de la no transgénica (es decir, una planta genotípicamente similar que ha surgido o se ha ensayado bajo condiciones similares). Un fenotipo interesante puede representar un mejoramiento en la planta o puede proveer medios para producir mejoras en otras plantas. Un "mejoramiento" es una característica que puede mejorar la utilidad de una especie de planta o variedad a través de la provisión de plantas con una calidad única y/o novedosa. Un "fenotipo de contenido oleaginoso alterado" se refiere a un fenotipo medible de una planta genéticamente modificada, en donde la planta despliega un ¡ncremento estadísticamente significativo o una disminución en el contenido oleaginoso global (es decir, el porcentaje de masa de semilla que es aceite), según comparado con la planta no modificada, similar. Un fenotipo altamente oleaginoso se refiere a un incremento en el contenido oleaginoso global. Como se utiliza aquí, una secuencia de polinucleótido "mutante" o gen difiere de la secuencia de polinucleótido de tipo silvestre correspondiente o gen ya sea en términos de secuencia o de expresión en donde la diferencia contribuye a un fenotipo o característica de la planta modificada. Con relación a una planta o línea de plantas, el término "mutante" se refiere a una planta o línea de plantas que tiene un fenotipo o característica de planta modificada, en donde el fenotipo o característica modificada está asociado con la expresión modificada de una secuencia o gen de polinucleótido de tipo silvestre. Como se utiliza aquí, el término "T1" se refiere a la generación de plantas a partir de las semillas de plantas TO. La generación T1 es el primer grupo de plantas transformadas que se pueden seleccionar a través de la aplicación de un agente de selección, por ejemplo, un antibiótico o herbicida, para el cual la planta transgénica contiene el gen resistente correspondiente. El término de "T2" se refiere a la generación de plantas a través de auto-fertilización de las flores de las plantas T1 , previamente seleccionadas como transgénicas. Las plantas T3 se generan a partir de plantas T2, etc. Como se utiliza aquí, "progenie directo" de una planta dada se deriva a partir de la semilla (o, algunas veces, otro tejido) de la planta y es la generación inmediatamente subsiguiente; por ejemplo, para un linaje dado, una planta T2 es la progenie directa de una planta T1. La "progenie indirecta" de una planta dada se deriva a partir de la semilla (u otro tejido) de la progenie directa de la planta, o de la semilla (u otro tejido) de las generaciones subsecuentes en ese linaje; por ejemplo, una planta T3 es la progenie indirecta de una planta T1. Como se utiliza aquí, el término "parte de la planta" incluye cualquier órgano o tejido de la planta, incluyendo, sin limitación, semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, vastagos, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. Las células de plantas se pueden obtener a partir de cualquier órgano o tejido de planta y cultivos preparados de los mismos. La clase de plantas que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención son generalmente tan amplios como la clase de plantas más altas sensibles a técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Como se utiliza aquí, "planta transgénica" incluye una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. El polinucleótido heterólogo puede estar ya sea establemente integrado dentro del genoma o puede ser un extra-cromosoma. Preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención está establemente integrado dentro del genoma de tal forma que el polinucleótido se pasa a las generaciones sucesivas. Una célula de planta, tejido, órgano, o planta dentro de los cuales los polinucleótidos heterólogos han sido introducidos se consideran "transformadas", "transfectadas", o "transgénicas". La progenie directa e indirecta de plantas o células de planta transformadas que también contienen el polinucleótido heterólogo también se considera transgénicas. Varios métodos para la introducción de dicha secuencia de polinucleótido deseada que codifica para la proteína deseada en células de planta están disponibles y se conocen por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: (1 ) métodos físicos tales como microinyección, electroporación, y suministro mediado por microproyectiles (biolística o tecnología de pistola génica); (2) métodos de suministro mediados por virus; y (3) métodos de transformación mediados por Agrobacterium. Los métodos más comúnmente utilizados para la transformación de células de plantas son procedimientos de transferencia de ADN mediados por Agrobacterium y la biolística o procedimiento mediado por bombardeo de microproyectiles (es decir, la pistola génica). Típicamente, se desea la transformación nuclear pero en donde se desee transformar específicamente plásticos, tal como cloroplastos o aminoplastos, los plástidos en plantas pueden ser transformados utilizando el suministro mediado por microproyectiles del polinucleótido deseado. La transformación mediada por Agrobacterium se logra a través del uso de una bacteria de suelo genéticamente modificada que pertenece al género Agrobacterium. Un número de cepas desarmadas y de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que portan los plásmidos Ti o Ri puede utilizarse para transferencia génica en plantas. La transferencia génica se realiza por medio de la transferencia de un ADN específico conocido como "T/ADN" que puede modificarse genéticamente para llevar a cabo la pieza deseada de ADN en muchas especies vegetales. La transformación genética mediada por Agrobacterium de plantas implica varios pasos. El primer paso, en donde el Agrobacterium virulento y células de plantas se ponen primero en contacto entre sí, generalmente se llama "inoculación". Después de la inoculación, el Agrobacterium y células/tejidos de plantas se hacen crecer juntas durante un período de varias horas a varios días o más bajo condiciones adecuadas para crecimiento y transferencia de ADN-T. Este paso se menciona como "cocultivo". Después del co-cultivo y suministro de ADN-T, las células de planta se tratan con agentes bactericidas o bacterioestáticos para eliminar el Agrobacterium que permanece en contacto con el explante y/o en el recipiente que contiene el explante. Si esto se realiza en ausencia de cualquier agente selectivo para promover el crecimiento preferencial de células de plantas no transgénicas contra transgénicas, entonces esto típicamente se menciona como el paso de "retrazo". Si se realiza en presencia de presión selectiva que favorece las células de plantas transgénicas, entonces esto se denomina como un paso de "selección". Cuando se utiliza un "retrazo", éste típicamente seguido por uno o más pasos de "selección". Con respecto al bombardeo de microproyectiles (patente de E.U.A. No. 5,550,318 (Adams et al); patente de E.U.A. No. 5,538,880 (Lundquist et. al.), patente de E.U.A. No. 5,610,042 (Chang ef al.); y publicación PCT WO 95/06128 (Adams et al.); cada una de las cuales se incorpora específicamente en la presente por referencia en su totalidad), las partículas se revisten con ácidos nucleicos y se suministran en células mediante una fuerza propulsora. Partículas ejemplares incluyen aquellas comprendidas de tungsteno, platino y preferiblemente, oro. Una modalidad ilustrativa de un método para suministrar ADN en células de plantas mediante aceleración es el sistema de suministro de partículas por biolística (BioRad, Hercules, CA), que puede utilizarse para impulsar partículas revestidas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de Nytex o acero inoxidable, en una superficie de filtro cubierta con células de planta monocotiledóneas cultivadas en suspensión. Las técnicas de bombardeo por microproyectil se aplican ampliamente, y pueden utilizarse para transformar virtualmente cualquier especie de planta. Ejemplos de especies que han sido transformadas mediante bombardeo por microproyectiles incluyen especies monocotiledóneas tal como maíz (publicación internacional No. WO 95/06128 (Adams et al.)), cebada, trigo (patente de E.U.A. No. No. 5,563,055 (Townsend et al.) que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad), arroz, avena, centeno, caña de azúcar y sorgo; como también un número de dicotiledóneas incluyendo tabaco, soya (patente de E.U.A. No. 5,322, 783 (Tomes et al.), que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad) girasol, cacahuate, algodón, tomate y legumbres en general (patente de E.U.A. No. 5,563,055 (Townsend et al.) que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad). Para seleccionar o registrar células de plantas transformadas con respecto a la metodología de transformación, el ADN introducido en la célula contiene un gen que funciona en un tejido de planta regenerable para producir un compuesto que se confiera tras la resistencia del tejido de planta a otro compuesto de manera tóxico. Los genes de interés para utilizarse como un marcador seleccionable, analizable o registrable puede incluir pero no se limita a GUS, proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa (LUX), genes de tolerancia a antibiótico o herbicida. Ejemplos de genes de resistencia a antibióticos incluyen las penicilinas, kanamicina (y neomicina G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprima); cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina. Las moléculas de polinucleótidos que codifican para proteínas implicadas en tolerancia herbicida son conocidas en la técnica, e incluyen pero no se limitan a una molécula de polinucleótido que codifica para 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que se describe en la patente de E.U.A. No. 5,627,061 (Barry, et al.), patente de E.U.A. No. 5,633,435 (Barry, et al.), y patente de E.U.A. No. 6,040,497 (Spencer, et al.) y aroA que se describe en la patente de E.U.A. No. 5,094,945 (Comai) para tolerancia a glifosato; una molécula de polinucleótido que codifica para bromoxinil nitrilasa (Bxn) que se descrita en la patente de E.U.A. No. 4,810,648 (Duerrschnabel, et al.) para tolerancia a bromoxinilo; una molécula de polinucleótido que codifica para una fitoeno desaturasa (ctrl) que se describe en Misawa et al (1993) Plant J. 4:833-840 y Misawa et al, (1994) Plant J. 6:481-489 para tolerancia a norflurazon; una molécula de polinucleótido que codifica para una acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) que se describe en Sathasiivan et al (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188-2193 para tolerancia a herbicidas de sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock, et al (1987) EMBO J. 6:2513-2519 para tolerancia a glufosinato y bialafos. La regeneración, desarrollo, y cultivo de plantas a partir de varios explantes transformados está bien documentado en la técnica. Este procedimiento de regeneración y crecimiento típicamente incluye los pasos de seleccionar células transformadas y cultivar aquellas células individualizadas a través de etapas usuales de desarrollo embriónico a través de la etapa de plántula de raíz. Los embriones transgénicos y semillas se regeneran de igual manera. Los brotes de raíz transgénicos resultantes de aquí en adelante se plantan en un medio de crecimiento de plantas apropiado tal como el suelo. Las células que sobreviven la exposición al agente selectivo o células que han sido registradas en positivo en una prueba de exploración, pueden cultivarse en un medio que soporta la regeneración de plantas. Las plántulas en desarrollo se transforman en una mezcla de crecimiento de planta sin suelo y se endurecen, antes de ser transferidas a un invernadero o cámara de crecimiento para maduración. La presente invención puede utilizarse con cualquier célula o tejido transformable. Por transformable como se utiliza en la presente significa una célula o tejido que es capaz de propagarse además para dar lugar a una planta. Los expertos en la técnica reconocen que el número de células o tejidos de plantas son transformables en donde después de la inserción de ADN exógeno y condiciones de cultivo apropiadas las células o tejidos de plantas pueden formarse en una planta diferenciada. El tejido adecuado para estos propósitos puede incluirse pero no se limita a embriones inmaduros, tejido escutelar, cultivos celulares en suspensión, inflorescencia inmadura, explantes nodales, tejido calloso, tejido hipocotilo, cotiledones, raíces y hojas. Cualquier medio de cultivo de planta adecuado puede utilizarse. Ejemplos de medios adecuados pueden incluir pero no se limitan a medios a base de MS (Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962) o medios a base de N6 (Chu et al., Scientia Sínica 18:659,1975) complementados con reguladores de crecimiento de plantas adicionales que incluyen pero no se limitan a auxinas, citocininas, ABA y gliberelinas. Los expertos en la técnica están familiarizados con una variedad de medios de cultivo de tejido, que cuando se complementan apropiadamente, soportan el crecimiento y desarrollo de tejido de plantas y son adecuados para transformación y regeneración de plantas. Estos medios de cultivo de tejido pueden ser adquiridos como una preparación comercial, o prepararse de manera usual y modificarse. Los expertos en la técnica están concientes que los medios y complementos de medios tales como nutrientes y reguladores de crecimiento para utilizarse en la transformación y regeneración y otras condiciones de cultivo tales como intensidad de luz durante la incubación, pH, temperaturas de incubación pueden optimizarse para la variedad particular de interés. Un experto en la técnica apreciará que, después de que se incorpore establemente un casette de expresión en plantas transgénicas y se confirme operable, puede introducirse en otras plantas mediante cruce sexual.

Cualquier número de técnicas de apareamiento estándar pueden utilizarse dependiendo de las especies a ser cruzadas.

Identificación de plantas con fenotipo de contenido oleaginoso alterado Se utilizaron la selección de activación de marcación Arabidopsis para identificar la asociación entre los genes que se identificaron y diseñaron HIO# nombrados en la columna 1 del cuadro 1 a continuación y fenotipos de contenido oleaginosos alterado (específicamente, un fenotipo altamente oleaginoso). Brevemente, y como se describe adicionalmente en los ejemplos, un gran número de plantas Arabidopsis se mutaron con el vector pSK 015, el cual comprende un ADN-T a partir del plásmido T1 de Agrobacterium tumifaciens, un elemento mejorador viral, y un gen marcador seleccionable (Weigel et al, 2000). Cuando el ADN-T se inserta dentro del genoma de las plantas transformadas, el elemento mejorador, puede originar la regulación ascendente de los genes en su proximidad, generalmente, dentro de aproximadamente 10 kilobases (kb) de los mejoradores. Las plantas T1 fueron expuestas a un agente selectivo con el fin de específicamente recuperar plantas transformadas que expresaron el marcador seleccionable y por lo tanto las inserciones de ADN-T albergadas. Para amplificar el surtido de semillas, aproximadamente 18 plantas T2 se hicieron crecer y se expusieron al agente selectivo para recuperar las plantas que expresan el marcador seleccionable y por lo tanto albergar el elemento ADN-T. La semilla T3 de estas plantas de cosechó y agrupó. El contenido oleaginoso de la semilla se estimó utilizando Espectroscopia Casi Infrarroja (NIR) como se describe en los ejemplos. Una línea de Arabidopsis que mostró un fenotipo altamente oleaginoso se identificó. La asociación del gen HIO con el fenotipo altamente oleaginoso se descubrió a través del análisis de la secuencia de ADN genómico que flanquea la inserción de ADN-T en la línea identificada. Por consiguiente, los genes HIO y/o los polipéptidos se pueden emplear en el desarrollo de plantas genéticamente modificadas que tienen un fenotipo de contenido de aceite modificado ("un fenotipo HIO"). Los genes HIO se pueden utilizar en la generación de cultivos de semillas de aceite que proveen una producción de aceite mejorada a partir del procesamiento de semillas de aceite y en la generación del cultivo de granos de alimentación para proveer una energía incrementada para la alimentación de los animales. Los genes HIO además pueden ser utilizados para incrementar el contenido oleaginoso de cultivos de especialidad oleaginosa, con el fin de aumentar la producción de los ácidos grasos inusuales deseables. Las plantas transgénicas que han sido genéticamente modificadas para expresar polipéptidos HIO se pueden utilizar en la producción de aceite, en donde las plantas transgénicas se hicieron crecer, y el aceite se obtuvo a partir de partes de planta (por ejemplo, semilla) utilizando métodos estándares. Ácidos nucleicos y polipéptidos HIQ Los genes HIO fueron descubiertos en nuestro análisis de marcado por activación y se enlistan en la columna 1 del cuadro 1. Los números de identificación de recursos de información de arabidopsis (TAIR) se proporcionan en la columna 2. La columna 3 proporciona números identificadores del Genbank (Gl#s) (Gl#18391126, Gl#30683964, y Gl#30693108) e identificadores de secuencia correspondientes (SEQ ID NOs: 1 , 3, y 5) para las secuencias de nucleótidos, y la columna 4 proporciona Gl#s (Gl#15218452, Gl#15226916, Gl#15229046) e identificadores de secuencia correspondientes (SEQ ID NOS: 2, 4, y 6) para las secuencias de polipéptidos. La columna 5 nombra la función bioquímica putativa y/o el nombre de la proteína. La columna 6 nombra los dominios de proteína conservados. La columna 7 nombra el contenido de aceite de semilla relativo de plantas que sobre-expresan el gen HIO. La columna 8 proporciona Gl# para el ácido nucleico y/o secuencias de polipéptido de genes ortólogos a partir de especies de plantas diferentes. Como se utiliza aquí, el término "polipéptido HIO" se refiere a una proteína o un fragmento HIO de longitud completa, derivado (variante) u ortólogo del mismo que es, "funcionalmente activo" lo que significa que el fragmento de proteína, derivado, y ortólogo exhiben una o más de las actividades funcionales asociadas con el polipéptido HIO de longitud completa (SEC ID NOS:2, 4, 6). En una modalidad preferida, un polipéptido HIO funcionalmente activo causa un fenotipo de contenido oleaginoso alterado cuando existe un error en la expresión en la planta. En una modalidad preferida adicional, el error en la expresión del polipéptido HIO causa un fenotipo altamente oleaginoso en una planta. En otra modalidad, el polipéptido HIO funcionalmente activo es capaz de rescatar la actividad de HIO endógena defectuosa (incluyendo deficiente) cuando se expresa en una planta o en células de planta; el polipéptido de escape puede ser de la misma o de diferentes especies como con una actividad defectuosa. En otra modalidad, un fragmento funcionalmente activo de un polipéptido HIO de longitud completa (es decir, un polipéptido nativo que tiene la secuencia de SEC ID NO:2, 4, 6 o un ortólogo de existencia natural del mismo) retiene una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HIO de longitud completa, de tal forma que la actividad de señalización, la actividad de enlace, la actividad catalítica, o la actividad de localización celular o extracelular. Un fragmento HIO preferiblemente comprende un dominio HIO, tal como un domino C- o N-terminal o catalítico, entre otros, y preferiblemente comprende por lo menos 10, preferiblemente al menos 20, más preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente por lo menos 50 aminoácidos contiguos de una proteína HIO. Los dominios funcionales de los genes HIO se nombran en la columna 6 del cuadro 1 y se pueden identificar utilizando el programa PFAM (Bateman A et al, 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262). Las variantes funcionalmente activas de los polipéptidos o fragmentos HIO de longitud completa incluyen polipéptidos con inserciones, eliminaciones, o sustituciones de aminoácido que retienen una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HIO de longitud completa. En algunos casos, las variantes se generan para cambiar el procesamiento post-traducción de un polipéptido HIO. Por ejemplo, las variantes pueden tener un transporte de proteína alterado o características de localización de proteína a proteínas alteradas de vida media comparadas con el polipéptido nativo. Como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico HIO" abarca los ácidos nucleicos con la secuencia provista en o complementaria a la secuencia de la entrada del GenBank mencionada en la columna 3 del cuadro 1 (SEC ID NO:1 , 3, 5) así como fragmentos, derivados u ortólogos funcionalmente activos de los mismos. Un ácido nucleico HIO de esta invención puede ser ADN, derivado de ADN genómico o ADNc, o ARN. En una modalidad, un ácido nucleico HIO funcionalmente activo codifica, o es complementario a un ácido nucleico que codifica un polipéptido HIO funcionalmente activo. Se incluye dentro de esta definición el ADN genómico que sirve como una plantilla para una trascripción de ARN primaria (es decir, un precursor de ARNm) que requiere de procesamiento, tal como empalme, antes de la codificación del polipéptido HIO funcionalmente activo. Un ácido nucleico HIO puede incluir otras secuencias no de codificación, las cuales pueden o no pueden estar trascritas; dichas secuencias incluyen UTRs 5' y 3', señales de poliadenilación y secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen, entre otras, según sean conocidas en la técnica. Algunos polipéptidos requieren de eventos de procesamiento, tales como la división proteolítica, la modificación covalente, etc., con el fin de convertirse en completamente activos. Por consiguiente, los ácidos nucleicos funcionalmente activos pueden codificar el polipéptido HIO maduro o pre-procesado, o una forma intermedia. Un polinucleótido HIO también puede incluir secuencias de codificación heterólogas, por ejemplo, secuencias que codifican un marcador incluido para facilitar la purificación del polipéptido fusionado o un marcador de transformación. En otra modalidad, un ácido nucleico HIO funcionalmente activo es capaz de ser utilizado en la generación de fenotipos HIO de pérdida de función, por ejemplo, a través de la supresión antisentido, co-supresión, etc. En una modalidad preferida, un ácido nucleico HIO utilizado en los métodos de esta invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica para un polipéptido HIO de por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia a la secuencia de polipéptido de la entrada de GenBank mencionada en la columna 4 del cuadro 1 (SEC ID NO:2, 4, 6). En otra modalidad, un polipéptido HIO de la invención comprende una secuencia de polipéptido con por lo menos 50% o 60% de identidad con la secuencia de polipéptido HIO de la entrada de GenBank mencionada en la columna 4 del cuadro 1 (SEC ID NO:2, 4, 6) y puede tener por lo menos 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido HIO y puede incluir un dominio de proteína conservada del polipéptido HIO, tal como el(los) dominio(s) de proteína nombrados en la columna 6 del cuadro 1. En otra modalidad, el polipéptido HIO comprende la secuencia de polipéptido con por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o más de identidad de secuencia a un fragmento funcionalmente activo del polipéptido de la entrada del GenBank mencionado en la columna 4 del cuadro 1 (SEC ID NO:2, 4, 6). En aún otra modalidad, el polipéptido HIO comprende una secuencia de polipéptido con por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de identidad con la secuencia de polipéptido de al entrada del GenBank en la columna 4 del cuadro 1 (SEC ID NO:2, 4, 6) a través de su longitud completa y comprende un(unos) dominio(s) de proteína conservado nombrado en la columna 6 del cuadro 1. En otro aspecto, la secuencia de polinucleótido HIO es por lo menos 50% a 60% idéntica y puede comprender por lo menos 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o más de secuencia de identidad sobre su longitud total para la secuencia de ácido nucleico HIO de la entrada de GenBank mencionada en la columna 3 del cuadro 1 (SEC ID NO:1 , 3, 5) o las secuencias de ácido nucleico que son complementarias con dicha secuencia de HIO. Como se utiliza aquí, "porcentaje de identidad de secuencia (%)" con respecto a una secuencia de sujeto especificada, o una porción especificada de la misma, se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia derivada candidato idéntico con los nucleótidos o aminoácidos en la secuencia tipo (o porción especificada de la misma), después de la alineación de las secuencias y la introducción de los huecos, si es necesario para lograr la identidad de secuencia de porcentaje máximo, según generado por el programa WU-BLAST-2.0a19 (Altschul et al, J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410) con parámetros de búsqueda fijados a valores por omisión. Los parámetros HSP y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen a través del programa mismo dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular contra la cual la secuencia de interés se está buscando. Un "valor de identidad %" se determina a través del número de nucleótidos con una coincidencia idéntica o aminoácidos divididos por la longitud de secuencia del cual el porcentaje de identidad se está reportando. "Similitud de secuencia de aminoácido porcentaje (%)" se determina haciendo los mismos cálculos según determinados para el % de identidad de la secuencia de aminoácido, pero incluyendo las sustituciones de aminoácido conservativas además de los aminoácidos idénticos en el cálculo. Una sustitución de aminoácido conservador es una en donde el aminoácido está sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares de tal forma que el plegado o la actividad de proteína no se afecta significativamente. Los aminoácidos aromáticos que pueden sustituirse uno por el otro son fenilalanina, triptófano, y tirosina; los aminoácidos hidrofóbicos intercambiables son leucina, isoleucina, metionina, y valina; los aminoácidos polares intercambiables son glutamina y asparagina; los aminoácidos básicos intercambiables son arginina, lisina, e histidina, los aminoácidos acídicos intercambiables son ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos pequeños intercambiables son alanina, serina, treonina cisteína y glicina. Las moléculas de ácido nucleico derivadas de las moléculas de ácido nucleico del tópico incluyen secuencias que selectivamente hibridizan la secuencia de ácido nucleico de la entrada de GenBank mencionada en la columna 3 del cuadro 1 (SEC ID NO:1 , 3, 5). La severidad de la hibridación se puede controlar a través de temperatura, resistencia iónica, pH, y la presencia de agentes de desnaturalización tales como formamida durante la hibridación y el lavado. Las condiciones rutinariamente utilizadas son bien conocidas (ver, por ejemplo, Current Protocol in Molecular Biology, Vol. 1 , Capítulo 2.10, John Wiley & Sons, Publishers (1994); Sambrook et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)). En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de hibridizar una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótido de la entrada de GenBank mencionada en la columna 3 del cuadro 1 (SEC ID NO:1 , 3, 5) bajo condiciones de hibridación severas que son: pre-hibridización de los filtros que contiene el ácido nucleico durante 8 horas durante la noche a 65°C en una solución que comprende 6x de citrato de resistencia individual (SSC) (1 X SSC es NaCI 0.15 M, citrato de Na 0.015 M; pH 7.0), solución de Denhardt 5X, 0.5% de pirofosfato de sodio y 100 µg/ml de ADN de esperma de arenque; hibridización durante 18-20 horas a 65°C en una solución que contiene 6X SSC, solución de Denhardt 1X, 100 µg/ml de ARN de levadura y 0.05% de pirofosfato de sodio; y lavado de filtros a 65°C durante 1 hora en una solución conteniendo 0.1 X SSC y 0.1 % SDS (dodeciisulfato de sodio). En otras modalidades, se utilizan condiciones moderadamente severas de hidridización que son: pretratamiento de los filtros que contienen ácido nucleico durante 6 horas a 40°C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0. 1 % PVP, 0.1 % Ficoll, 1 % BSA, y 500 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado; hibridación durante 18-20 horas a 40°C en una solución que contiene 35% de formamida 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y 10% (p/volumen) de sulfato de dextrano; seguido por lavado dos veces durante 1 hora a 55°C en una solución conteniendo 2X SSC y 0.1 % SDS. Alternativamente, las condiciones de severidad bajas se pueden utilizar que comprende: incubación durante 8 horas durante la noche a 37°C en una solución que comprende 20%, 5 x SSC, 50 mM fosfato de sodio (pH 7.6), solución de 5X Denhardt, 10% de sulfato de dextrana y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón trasquilado desnaturalizado; hibridación en el mismo regulador de pH durante 18 a 20 horas; y lavado de los filtros en 1 x SSC en aproximadamente 37°C durante 1 hora. Como un resultado de la degeneración del código genético, un número de secuencias de polinucleótido que codifican el polipéptido HIO se puede producir. Por ejemplo, los codones se pueden seleccionar para incrementar la velocidad a la cual la expresión del polipéptido ocurre en una especie huésped particular, de acuerdo con la utilización del codón óptimo dictado por el organismo del huésped particular (por ejemplo, (ver, por ejemplo, Nakamura y otros, 1999). Dichas variantes de frecuencia se pueden utilizar en los métodos de esta invención. Los métodos de la invención pueden utilizar ortólogos de Arabidopsios HIO. Los ortólogos putativos de cada uno de los genes de Arabidopsios HIO identificados en el siguiente cuadro 1 , se identifican en la columna 8 del cuadro 1. En la técnica se conocen métodos para identificar éstos y ortólogos de genes de HIO de otras especies de plantas. Normalmente, los ortólogos en diferentes especies retienen la misma función, gracias a la presencia de uno más motivos de proteína y/o estructuras tridimensionales. En la evolución, cuando un evento de duplicación de gen sigue la evolución de las especies, un sólo gen en una especie, tal como Arabidopsis, puede corresponder a múltiples genes (parálogos) en otro. Como se utiliza aquí, el término "ortólogos" abarca los parálogos. Cuando los datos de secuencia están disponibles para una especie de planta particular, los ortólogos generalmente están identificados a través del análisis de homología 3 de secuencia, tal como en el análisis BLAST, usualmente utilizando secuencias de carnada de proteína. Las secuencias son asignadas como un ortólogo potencial si la secuencia con mejores coincidencias a partir del resultado BLAST frontal recupera la secuencia de consulta original en BLAST inverso (Huynen MA y Bork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5849-5856; Huynen MA y otros., Genome Research (2000) 10: 1204-1210). Los programas para una alineación de secuencia múltiple, tales como CLUSTAL (Thompson JD y otros, 1994, Nucleic Acids Res 22: 4673-4680) se puede utilizar para resaltar las regiones conservadas y/o los residuos de proteínas ortólogas y para generar árboles filogenéticos. En un árbol filogenético que representa múltiples secuencias homologas de diversas especies (por ejemplo, recuperadas a través del análisis BLAST), las secuencias ortólogas de dos especies generalmente aparecen más cercanas al árbol con respecto a todas las otras secuencias a partir de estas dos especies. El enlazamiento estructural u otros análisis de plegado de proteínas (por ejemplo, utilizando software a través de ProCeryon, Biosciences, Salzburgo, Austria) también pueden identificar los ortólogos potenciales. Los métodos de hibridación de ácido nucleico también pueden utilizarse para encontrar genes ortólogos y son preferidos cuando los datos de secuencia no están disponibles. El PCR de degeneración y la detección de genotecas ADNc o de ADN genómico son métodos comunes para encontrar las secuencias de genes relacionados y son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook, 1989; Dieffenbach y Dveksler, 1995). Por ejemplo, los métodos para generar una genoteca ADNc a partir de especies de planta de interés y sondear la genoteca con sondas de genes parcialmente homologas se describen en Sambrook y otros. Una porción altamente conservada de la secuencia de codificación de Arabidopsois HIO se puede utilizar como una sonda. Los ácidos nucleicos ortólogos HIO pueden hibridar el ácido nucleico de la entrada del GenBank a la que se hace referencia en la columna 3 del cuadral , bajo condiciones de severidad alta, moderada o baja. Después de la amplificación o aislamiento de un segmento de un ortólogo putativo, ese segmento se puede clonar y secuenciar a través de técnicas estándares y utilizarse como una sonda para aislar un ADNc completo o un clon genómico. Alternativamente, es posible iniciar un proyecto EST para generar una base de datos de información de secuencia para las especies de planta de interés. En otro método, los anticuerpos que específicamente enlazan polipéptidos HIO conocidos se utilizan para el aislamiento ortólogo (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, 1988, 1999). El análisis Western blot puede determinar que un ortólogo HIO (es decir, una proteína ortóloga) está presente en un extracto crudo de una especie de planta particular. Cuando se observa reactividad, la secuencia que codifica el ortólogo candidato se puede aislar al seleccionar genotecas de expresión que representan las especies de planta particulares. Las genotecas de expresión se pueden construir en una variedad de vectores comercialmente disponibles, incluyendo lambda gt11 , como se describe en Sambrook, y otros, 1989. Una vez que se identifica(n) el(los) ortólogo(s) a través de cualquiera de estos medios, la(s) secuencia(s) ortóloga(s) candidato se utiliza(n) como carnada (la "consulta") para la BLAST inversa contra la secuencias de Arabidopsis u otras especies en donde las secuencias de ácido nucleico y/o polipéptido HIO han sido identificadas. Los ácidos nucleicos y polipéptidos HIO se pueden obtener utilizando cualquier método disponible. Por ejemplo, las técnicas para aislar secuencias de ADNc o ADN genómicas de interés al seleccionar genotecas de ADN o al usar reacción en cadena de polimerasa (PCR), como se describe previamente, se conocen bien en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede ser sintetizada. Se puede utilizar cualquier método conocido, tal como mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel TA y otros, 1991), para introducir los cambios deseados dentro del ácido nucleico clonado. En general, los métodos de la invención involucran la incorporación de la forma deseada de ácido nucleico HIO en un vector de expresión de planta para la transformación en células de planta, y el polipéptido HIO se expresa en la planta huésped. Una molécula de ácido nucleico HIO aislada es diferente en la forma o configuración en la cual se encuentra en forma natural y se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico HIO. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico HIO aislada incluye moléculas de ácido nucleico HIO contenidas en la célula que ordinariamente expresan HIO en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de aquella de las células naturales.

CUADRO 1 o Oí Generación de Plantas Genéticamente Modificadas con un Fenotipo de Contenido Oleaginoso Alterado Los ácidos nucleicos y polipéptidos HIO se pueden utilizar en la generación de plantas genéticamente modificadas que tienen un fenotipo de contenido oleaginoso modificado. Como se utiliza aquí, un "fenotipo de contenido oleaginoso modificado" se puede referir a un contenido oleaginoso modificado en cualquier parte de la planta; el contenido oleaginoso modificado por lo general se observa en semilla. En una modalidad preferida, la expresión alterada del gen HIO en una planta se utiliza para generar plantas con un fenotipo con alto contenido de aceite. Los métodos descritos aquí generalmente se aplican a todas las plantas. Aunque el marcado de activación y la identificación del gen se llevan a cabo en Arabidopsis, el gen HIO (o un ortólogo, variante o fragmento del mismo) se puede expresar en cualquier tipo de planta. En una modalidad preferida, la invención está dirigida a plantas productoras de aceite, que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, principalmente en semillas. Dichas especies ¡ncluyen frijol de soya (Glycine max), colza, y cañóla (incluyendo Brassica napus, B. campestris), girasol (Helianthus annus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), cacao (Teobroma cacao), cártamo (Carthamus tinctorius), aceite de palma (Elaeis guineensis), palma de coco (Cocos nucífera), lino (Linum usitatissimum), ricino (Ricinus communis) y cacahuate (Arachis hypogaea). La invención también puede estar dirigida a plantas que llevan frutas y vegetales, plantas productoras de grano, plantas productoras de nueces, especies Brassica de ciclo rápido, alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana), césped (familia Poaceae), otros cultivos de forraje, y especies silvestres que pueden ser una fuente de ácidos grasos únicos. El experto en la técnica reconocerá que existe una amplia variedad de técnicas de transformación en la técnica, y que están surgiendo continuamente nuevas técnicas. Cualquier técnica que es adecuada para una planta huésped objetivo se puede emplear dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las construcciones se pueden introducir en una variedad de formas incluyendo, pero no limitándose a, una cadena de ADN, en un plásmido, o en un cromosoma artificial. La introducción de las construcciones dentro de las células de planta objetivo se puede lograr a través de una variedad de técnicas, incluyendo, pero no limitándose, a transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, microinyección, co-precipitación de calcio-fosfato-ADN a través de bombardeo por microproyectiles, o transformación de un ácido nucleico heterólogo mediante liposoma. La transformación de la planta es preferiblemente permanente, es decir, mediante la integración de las construcciones de expresión introducidas dentro del genoma de la planta huésped para que las construcciones introducidas se pasen a generaciones de plantas sucesivas. Dependiendo del uso que se pretende, una construcción de ácido nucleico heteróloga que comprende un polinucleótido HIO puede codificar la proteína completa o una porción biológicamente activa de la misma. En una modalidad, los sistemas de vector binarios basados en Ti se pueden utilizar para transferir polinucleótidos. Los vectores binarios Agrobacterium estándares son conocidos por aquellos expertos en la técnica, y pueden estar comercialmente disponibles (por ejemplo, pBI121 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Una construcción o vector puede incluir un promotor vegetal para expresar la molécula de ácido nucleico de elección. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor vegetal. El procedimiento óptimo para la transformación de plantas con vectores Agrobacterium variará con el tipo de planta que se va a transformar. Los métodos ilustrativos para la transformación mediada por Agrobacterium incluyen la transformación de explantes de hipocotil, puntas de brotes, tallos o tejido de hojas, derivados de semilleros y/o pequeñas plantas estériles. Dichas plantas transformadas se puede reproducir sexualmente, o a través del cultivo de la célula o tejido. La transformación Agrobacterium ha sido previamente descrita para un gran número de diferentes tipos de planta y los métodos para dicha transformación se pueden encontrar en la literatura científica. De particular relevancia son los métodos para transformar cultivos comercialmente importantes, tales como colza (De Block y otros, 1989), girasol (Everett y otros, 1987), y frijol de soya (Christou y otros, 1989; Kline y otros, 1987). La expresión (incluyendo la trascripción y traducción) de HIO se puede regular con respecto al nivel de expresión, el(los) tipo(s) de tejido(s) en donde la expresión toma lugar y/o la etapa del desarrollo de expresión. Están disponibles un número de secuencias reguladoras heterólogas (por ejemplo, promotores y potenciadores) para controlar la expresión de un ácido nucleico HIO. Estas incluyen promotores constitutivos, inducibles, y regulables así como promotores y potenciadores que controlan la expresión en un tejido, o en una forma específica temporal. Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen el promotor E4 de frambuesa (patentes de E. U. A. No. 5,783,393 y 5,783,394), el promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 84:5745-5749, 1987), el promotor de octopina sintasa (OCS) (que está portado en plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de caulimovirus como el promotor de virus del mosaico en la coliflor (CaMV) 19S (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9:315-324, 1987) y el promotor CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985 y Jones JD y otros, 1992), el promotor de actina de melón (solicitud PCT publicada WO0056863), el promotor 35S de virus de mosaico de escrofularia (Patente de EUA No. 5,378,619), el promotor inducible con luz de pequeñas subunidades de ribulosa-1 , 5-bis- fosfato carboxilasa (ssRUBISCO), el promotor Adh (Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:6624-6628, 1987), el promotor de sucrosa sintasa (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:4144-4148, 1990), el promotor de complejo de gen R (Chandler et al., The Plant Cell 1 :1175-1183, 1989), el promotor de gen de proteína de unión a/b de clorofila el promotor CsVMV (Verdaguer B eí al., 1998); estos promotores han sido utilizados para crear construcciones de ADN que han sido expresados en plantas, por ej. la publicación PCT WO84/02913. Promotores ejemplares específicos de tejido incluyen los promotores E4 y E8 de tomate (patente de EUA No. 5,859,330) y el promotor del gen 2AII de tomate (Van Haaren MJJ eí al., 1993). En una modalidad preferida, la expresión de HIO está bajo el control de secuencias reguladoras a partir de genes cuya expresión está asociada con el desarrollo de la semilla y/o embriones primeros. Los genes de legumbre cuyos promotores están asociados con el desarrollo de semillas y/o embriones primeros incluyen V. faba legumin (Baumlein y otros, 1991 , Mol Gen Genet 225:121-8; Baumlein y otros, 1992, Plant J 2: 233-9), V. faba usp (Fiedler y otros, 1993, Plant Mol Biol 22: 669-79), convicilina de chícharo (Bown y otros, 1988, Biochem J 251 :717-26), lectina de chícharo (dePater y otros, 1993, Plant Cell 5: 877-86), faseolina P. vulgaris beta (Bustos y otros, 1991 , EMBO J 10:1469-79), P. vulgaris DLEC2 y PHS [beta] (Bobb y otros, 1997, Nucleic Acids Res 25:641-7), y frijol de soya beta-conglicinina, proteína de almacenamiento 7S (Chamberland y otros, 1992, Plant Mol Biol 19: 937-49). Los genes de cereal cuyos promotores están asociados con el desarrollo de las primeras semillas y embriones incluyen glutelina de arroz ("GluA-3, ?oshihara y Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol 37:107-11 ; "GluB-l", Takaiwa y otros, 1996, Plant Mol Biol 30: 1207-21 ; Washida y otros, 1999, Plant Mol Biol 40:1-12; "Gt3", Leisy y otros, 1990, Plant Mol Biol 14: 41-50), prolamina de arroz (Zhou & Fan, 1993, Transgenic Res 2:141-6), prolamina de trigo (Hammond-Kosack y otros, 1993, EMBO J 12:545-54), zein de maíz (Z4, Matzke y otros, 1990, Plant Mol Biol 14:323-32), y B-hordeinas de cebada (Entwistle y otros, 1991 , Plant Mol Biol 17:1217-31 ). Otros genes cuyos promotores están asociados con el desarrollo de las primeras semillas y embriones incluyen GL07A de palma de aceite (globulina 7S, Morcillo y otros, 2001 , Physiol Plant 112: 233-243), Brassica napus napin, proteína de almacenamiento 2S y el gen napA (Josefsson y otros, 1987, J Biol Chem 262: 12196-201 ; Stalberg y otros, 1993, Plant Mol Biol 1993 23:671-83; Ellerstrom y otros, 1996, Plant Mol Biol 32:1019-27), oleosina de Brassica napus (Keddie y otros, 1994, Plant Mol Biol 24: 327-40), oleosina de Arabidopsis (Plant y otros, 1994, Plant Mol Biol 25: 193-205), Arabidopsis FAE1 (Rossak y otros, 2001 , Plant Mol Biol 46:717-25), Cannvalia gladiata conA (Yamamoto y otros, 1995, Plant Mol Biol 27: 729-41 ), y estrictosidina sintasa de Catharanthus roseus (Str, Ouwerkerk y Memelink, 1999, Mol Gen Genet 261 : 635-43). En otra modalidad preferida, se usan las secuencias reguladoras a partir de los genes expresados durante la biosíntesis del aceite (ver, por ejemplo, patente de E. U. A. No. 5,952,544). Los promotores alternativos son de los genes de proteína de almacenamiento de planta (Bevan y otros, 1993, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342:209-15). Promotores adicionales que se pueden usar se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 5,378,619; 5,391 ,725; 5,428,147; 5,447,858; 5,608,144; 5,608,144; 5.614,399; 5,633,441 ; 5,633,435; y 4,633,436. En aún otro aspecto, en algunos casos es deseable inhibir la expresión de HIO endógeno en una célula huésped. Los métodos ilustrativos para poner en práctica este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a la supresión antisentido (Smith, y otros, 1988; van der Krol y otros, 1988); co-supresión (Napoli, y otros, 1990); ribozimas (publicación PCT WO 97/10328); y combinaciones de sentido y antisentido (Waterhouse, y otros, 1998). Los métodos para la supresión de secuencias endógenas en una célula huésped típicamente emplean la trascripción o trascripción y traducción de por lo menos una porción de la secuencia que se va a suprimir. Dichas secuencias pueden ser homologas para la codificación así como regiones no de codificación de la secuencia endógena. La inhibición antisentido se puede utilizar para la secuencia de ADNc completa (Sheehy y otros, 1988), la secuencia de ADNc parcial incluyendo los fragmentos de la secuencia de codificación 5', (Cannon y otros, 1990), o secuencias de no codificación 3' (Ch'ng y otros, 1989). Las técnicas de cosupresión pueden utilizar la secuencia de ADNc completa (Napoli y otros, 1990; van der Krol y otros, 1990), o una secuencia de ADNc parcial (Smith y otros, (1990)). Las pruebas molecular estándar y genética se pueden llevar a cabo para un análisis adicional de la asociación entre un gen y un fenotipo observado. Las técnicas ilustrativas se describen a continuación. 1. Análisis de ADN/ARN Los patrones de expresión de genes de etapa y tejido específicos en líneas mutantes contra tipo silvestre se pueden determinar, por ejemplo, a través de hibridación in situ. Los análisis del estado de metilación del gen, especialmente en las regiones reguladoras de flanqueo, se pueden llevar a cabo. Otras técnicas adecuadas incluyen la sobre-expresión, la expresión ectópica, la expresión en otras especies de planta y el knock-out génico (genética inversa, knock-out objetivo, silenciamiento del gen inducido por virus [VIGS, ver Baulcombe D, 1999]). En una aplicación preferida se utiliza perfilado de expresión, generalmente a través de análisis de microarreglo, para medir simultáneamente las diferencias o cambios inducidos en la expresión de muchos genes diferentes. Las técnicas del análisis del microarreglo son bien conocidas en la técnica (Schena M y otros, Science (1995) 270:467-470; Baldwin D y otros, 1999; Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2:53-58; van Hal NL y otros, J Biotechnol (2000) 78:271-280; Richmond T y Somerville S, Curr Opin Plant Biol (2000) 3:108-116). El perfilado de expresión de líneas marcadas individuales se puede llevar a cabo. Dichos análisis pueden identificar otros genes que están coordinadamente regulados como una consecuencia de la sobre expresión del gen de interés, lo cual puede ayudar a colocar un gen desconocido en una trayectoria particular. 2. Análisis de Producto de Gen El análisis de los productos de gen puede incluir la expresión de proteína recombinante, la producción de antisueros, la inmunolocalización, los ensayos bioquímicos para actividad catalítica u otras actividades, análisis del estado de fosforilación, y el análisis de la interacción, otras proteínas a través de ensayos doble híbrido de levadura. 3. Análisis de Trayectoria El análisis de trayectoria puede incluir la colocación de un gen o de un producto de gen dentro de una trayectoria bioquímica, metabólica o de señalización particular con base en su fenotipo de error en expresión o a través de la homología de secuencia con los genes relacionados. Alternativamente, el análisis puede comprender los cruces genéticos con líneas de tipo silvestre y otras líneas mutantes (la creación de mutantes dobles) para ordenar el gen una trayectoria, o determinar el efecto de una mutación sobre la expresión de los genes "reportero" en corriente descendente en una trayectoria.

Generación de Plantas Mutadas con Fenotipos de Contenido Oleaginoso Alterado La invención además provee un método para identificar plantas que tienen mutaciones en HIO endógeno que confiere un contenido alterado de aceite, y generan una progenie alterada de contenido de aceite de las plantas que no están genéticamente modificadas. En un método, llamado "TILLING" (para enfoque en lesiones locales inducidas en genomas, en inglés), las mutaciones se inducen en la semilla de una planta de interés, por ejemplo, utilizando el tratamiento EMS. Las plantas resultantes se cultivan y se autofertilizan, y la progenie se utiliza para preparar muestras de ADN. La PCR específica de HIO se utiliza para identificar si una planta mutada tiene una mutación HIO. Las plantas que tienen mutaciones HIO entonces pueden probarse en cuanto a un contenido oleaginoso alterado, o alternativamente, las plantas se pueden probar en cuanto a un contenido oleaginoso alterado, y después se utiliza PCR específica de HIO para determinar si una planta que tiene un contenido oleaginoso alterado tiene un gen HIO mutado. El método TILLING puede identificar las mutaciones que pueden alterar la expresión de los genes específicos o la actividad de las proteínas codificadas por estos genes (ver, Coibert y otros, (2001) Plant Physiol 126:480-484; McCallum y otros, (2000) Nature Biotechnology 18:455-457). En otro método, un método de gen candidato/sitio de característica cuantitativa (QTL) se puede utilizar en un programa de reproducción asistido por un marcador para identificar alelos de o mutaciones en el gen HIO u ortólogos de HIO que pueden conferir un contenido oleaginoso alterado (ver, Bert y otros, Theor Appl Genet. junio de 2003; 107(1 ):181 -9; y Lionneton y otros, Genome. diciembre 2002; 45 (6): 1203-15). De esta forma, en un aspecto adicional de la invención, un ácido nucleico HIO se utiliza para identificar si una planta que tiene un contenido oleaginoso alterado tiene una mutación en HIO endógeno o tiene un alelo particular que causa el contenido oleaginoso alterado. Aunque la invención ha sido descrita con referencia a métodos y modalidades específicas, se apreciará que varias modificaciones y cambios se pueden hacer sin apartarse de la invención. Todas las publicaciones citadas aquí están expresamente incorporadas por referencia para los propósitos de describir y mostrar las composiciones y metodología que se podrían utilizar en conexión con la invención. Todas las patentes, solicitudes de patentes, información de secuencias citadas con referencia a las bases de datos públicos referenciadas también se incorporan aquí por referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación de Plantas con un Fenotipo HIO a través de transformación con una construcción de marcación de activación Los mutantes se generaron utilizando el vector "ACTTAG" de marcación de activación, pSKI015 (Gl#6537289; Weigel D y otros, 2000). Los métodos estándares se utilizaron para la generación de plantas transgénicas Arabidopsis y fueron esencialmente como se describe en la solicitud publicada PCT WO 0183697. Brevemente, las plantas Arabidopsis T0 (Col-0) se transformaron con Agrobacterium que lleva el vector pSKI015, que comprende ADN-T derivado de plásmido Ti Agrobacterium, un gen marcador seleccionable resistente a herbicida, y el elemento potenciador 4X CaMV 35S. Las plantas transgénicas se seleccionaron en la generación T1 con base en la resistencia a herbicidas. Se analizó la semilla T3 por espectroscopia casi infrarroja (NIR) en el momento de la cosecha. Se capturaron espectros infrarrojos NIR utilizando un Bruker 22 N/F. Se utilizó software Bruker para calcular el contenido total de aceite en la semilla y de proteína en la semilla utilizando datos del análisis NIR y métodos de referencia de acuerdo con las intrucciones de los fabricantes. El contenido pronosticado de aceite por nuestra calibración (ren oil 1473 1d + sline.q2, Predicts Hexane Extracted Oil), que siguió el método general del procedimiento AOCS AMI-92, Oficial Methods and Recommendend Practices of the American Oil Chemists Society, 5a ed,. AOCS, Champaingn, lll, se compararon para 38,090 líneas individuales ACTTAG. Después del análisis de la composición de la semilla, se determinó la posición del elemento ACTTAG en el genoma en cada línea, mediante PCR inversa y secuenciación. En este análisis se consideraron 38,090 líneas con secuencias flanqueantes recuperadas. Como se plantaron y cultivaron 38,090 líneas durante un periodo de 12 meses, se normalizaron los valores del contendido oleaginoso en la semilla para minimizar el efecto de las diferencias ambientales que pudieran alterar el contenido oleaginoso. Se calculó el contenido promedio de aceite en la semilla y su desviación estándar, para cada línea de día plantada. El contenido de aceite en la semilla se expresó como una "distancia de desviación estándar relativa" (distancia SD) que se calculó sustrayendo el contenido promedio de aceite en la semilla para el día de plantación del contenido de aceite en la semilla por cada línea, y dividiendo la diferencia entre la desviación estándar para este día. Esta normalización permite la comparación del contenido de aceite en la semilla en semillas de plantas cultivadas en el año. Se identificaron los genes que provocan un alto fenotipo oleaginoso cuando se sobreexpresa, evaluando todos los genes afectados por los elementos ACTTAG en las 38,090 líneas. Esto se logró con el siguiente procedimiento; primero, se identificaron los genes susceptibles de ser activados por el elemento ACTTAG en cada línea, y se asignó el contenido de aceite en la semilla en cada línea para estos genes; segundo, se determinó el contenido de aceite en la semilla cuando se sobreexpresa un gen particular, promediando los valores individuales de aceite en la semilla para cada gen. Como se evaluaron 38,090 líneas y cada elemento afecta un promedio de 2.5 genes, cada gen tendrá un promedio de 4 valores de aceite en la semilla. Se determinó que los genes con la distancia SD promedio más alta son aquellos que causan un alto fenotipo de aceite en la semilla cuando son sobreexpresados.

EJEMPLO 2 Caracterización de la Inserción de ADN-T en plantas que exhiben un fenotipo de contenido oleaginoso alterado Se llevaron a cabo análisis moleculares estándares, esencialmente como se describe en la solicitud de patente PCT W0183697, para determinar el sitio de la inserción de ADN-T asociado con el fenotipo de contenido oleaginoso alterado. Brevemente, se extrajo ADN genómico de las plantas que exhibieron el fenotipo de contenido oleaginoso alterado. El PCR, utilizando los iniciadores específicos para el vector pSKI015, confirmó la presencia del potenciador 35S en plantas a partir de la línea oleaginosa HIO, y el análisis Southern blot verificó la integración genómica de ADN-T ACTTAG y demostró la presencia de una inserción de ADN-T individual en la línea transgénica. Se utilizó PCR inverso para recuperar el ADN genómico que flanqueaba la inserción T-ADN, que después se sometió al análisis de secuencia utilizando la investigación BLASTGIN y/o una investigación de la base de datos de Fuente de información de Arabidopsis (TAIR).

EJEMPLO 3 Recapitulación del fenotipo HIO Para investigar si la sobreexpresión de At1g10220 causa un alto fenotipo oleaginoso en la semilla, se comparó el contenido oleaginoso en semillas de plantas transgénicas que sobreexpresaban este gen, con el contenido oleaginoso en semillas de plantas de control no transgénicas. Para hacerlo se clonó At1g10220 en un vector de transformación de planta detrás de un promotor CsVMV específico de semilla y se transformó en plantas Arabidopsis utilizando el método de inmersión floral. El vector de transformación de planta contiene el gen nptll impulsado por el promotor RE4, para proporcionar resistencia a canamicina, y sirve como marcador elegible.

Se colocaron el placas semillas de las plantas transformadas en un medio de agar que contenía canamicina. Después de 7 días, se identificaron las plantas transgénicas como plantas verdes saludables y se transplantaron a la tierra. Germinaron plantas de control no transgénicas en un medio de agar, se dejaron crecer durante 7 días y después se transplantaron a la tierra. Se transplantaron 22 semillas transgénicas y 10 plantas de control no transgénicas, en posiciones aleatorias en la misma placa de 32 celdas. Las plantas crecieron hasta madurar, se les dejó auto fertilizarse y dar semilla. Se recolectaron las semillas de cada planta y se estimó su contenido oleaginoso mediante Espectroscopia casi infraffoja (NIR) utilizando los métodos descritos antes. En el cuadro 2 se presenta el porcentaje de aceite en las semillas cosechadas de cada planta según lo determinado por la espectroscopia NIR. El valor relativo oleaginoso se determina dividiendo el valor oleaginoso pronosticado entre el valor oleaginoso promedio en las semillas de control (i.e. las semillas de las plantas sin el transgen). El efecto de la sobreexpresión de At1g10220 en el aceite de las semillas fue probado en tres experimentos. En los 3 experimentos, las plantas que sobreexpresaban At1g10220 tenían un contenido más alto de aceite que las plantas de control cultivadas en la misma placa. En los experimentos, el contenido promedio oleaginoso en las semillas de las plantas que sobreexpresaban At1g10220 fue un 3.4% mayor que los controles sin transformar. El contenido oleaginoso de las semillas en las plantas que sobreexpresaban At1g10220 era signifiacativamentge mayor que en las plantas de control no transgéncias (ANOVA de doble sentido; P=0.0043).

CUADRO 2 5 EJEMPLO 4 Para determinar si el alto fenotipo oleaginoso pasa a la siguiente generación, se pusieron en placas semillas T2 de 7 plantas cultivadas en el experimento 3, en un medio de agar que contenía canamicina y se les dejó germinar y crecer durante 7 días. Estas ocho plantas representan 8 diferentes eventos de transformación. Se transplantaron 22 semillas resistentes a la canamicina en posiciones aleatorias en una bandeja de 32 celdas, como se describió antes. También se transplantaron diez plantas de control no transgénicas (Col-0) en la bandeja. Se cultivaron las plantas hasta madurar, se les dejó auto fertilizarse y hacer semillas. Se cosecharon semillas de cada planta y se estimó su contenido oleaginoso por espectroscopia casi infrarroja (NIR) utilizando los métodos descritos antes. En el cuadro 3 se presenta la determinación del porcentaje oleaginoso en las semillas cosechadas de cada planta por espectroscopia NIR. El valor oleaginoso relativo se determina dividiendo el valor oleaginoso pronosticado entre el valor oleaginoso promedio en las semillas de control (i.e. las semillas de las plantas sin el transgén).

Las plantas transgénicas de 5 de los 7 eventos e transformación probadas tenían significativamente más aceite que las plantas de control cultivadas en la misma placa, como lo determina una prueba T (p > 0.05).

CUADRO 3 02 91. (H 99 EJEMPLO 5 Recapitulación del fenotipo HIO Para confirmar si la sobre-expresión de At2g28630 causa un fenotipo con alto contenido de aceite de semilla, el contenido oleaginoso en semillas de plantas transgénicas que sobre-expresan este gen se comparó con el contenido oleaginoso en semillas de plantas de control no transgénicas. Para hacer esto, At2g28630 se clonó en un vector de transformación de planta detrás del promotor específico de semilla CsVMV y se transformó en plantas Arabidopsis utilizando el método de inmersión floral. El vector de transformación de la planta contiene el gen nptll impulsado por el promotor RE4, el cual provee resistencia a kanamicina, y sirve como un marcador seleccionable. Las semillas de las plantas transformadas se colocaron en placas sobre el medio de agar que contenía kanamicina. Después de 7 días, las plantas transgénicas se identificaron como plantas verdes sanas y se transplantaron a la tierra. Las plantas de control no transgénicas se germinaron sobre medio de agar, permitiendo su cultivo durante 7 días y después se transplantaron a la tierra. Se transplantaron 22 cultivos transgénicos y 10 plantas de control no transgénicas a posiciones aleatorias en la misma superficie plana de 32 celdas. Las plantas se cultivaron a la madurez, permitiendo la auto-fertilización y el establecimiento de las semillas. Las semillas se cosecharon a partir de cada planta y su contenido oleaginoso se estimó a través de espectroscopia casi infrarroja (NIR) utilizando los métodos descritos previamente. El porcentaje de aceite en la semilla cosechada de cada planta según se determina mediante espectroscopia NIR se presenta en el cuadro 4. El valor relativo de aceite se determina al dividir el valor pronosticado de aceite entre el valor promedio de aceite en la semilla de control (es decir la semilla de plantas sin el transgen). El efecto de sobre-expresión de At2g28630 sobre el aceite de semilla se probó en seis experimentos. En cuatro experimentos, las plantas que sobre-expresan At2g28630 tuvieron un contenido oleaginoso en semilla más alto que la plantas de control que crecieron en la misma superficie plana. Entre experimentos, el promedio de contenido oleaginoso en las semillas de las plantas que sobre-expresaron At2g28630 fue 2.6% mayor que el de los controles no transformados. El contenido oleaginoso de semilla en plantas que sobre-expresan At2g28630 fue significativamente más grande que para plantas de control no transgénicas (ANOVA de dos vías; P = 0.0297).

CUADRO 4 EJEMPLO 6 Para determinar si el fenotipo con alto contenido de aceite de semilla se pasa a la siguiente generación, semillas de semilla T2 de 8 plantas cultivadas en el experimento 2 fueron puestas en placas en medio de agar que contenía kanamicina y se les dejó crecer por 7 días. Estas 8 plantas representan 8 diferentes eventos de transformación. Veintidós cultivos resistentes a kanamicina se trasplantaron a posiciones aleatorias dentro de una bandeja de 32 celdas descrita arriba. Diez plantas de control no transgénicas (Col-0) también se trasplantaron Las plantas se cultivaron a la madurez, permitiendo la auto-fertilización y el establecimiento de las semillas. Las semillas se cosecharon a partir de cada planta y su contenido oleaginoso se estimó a través de espectroscopia casi infrarroja (NIR) utilizando los métodos descritos previamente. El porcentaje de aceite en la semilla cosechada de cada planta según se determina mediante espectroscopia NIR se presenta en el cuadro 4. El valor relativo de aceite se determina al dividir el valor pronosticado de aceite entre el valor promedio de aceite en la semilla de control (es decir la semilla de plantas sin el transgen). Plantas transgénicas de 2 de los 8 eventos de transformación probados tuvieron significativamente más aceite que las plantas de control cultivadas en la misma superficie plana según se determina con una prueba T (p> 0.05).

CUADRO 5 EJEMPLO 7 Recapitulación del fenotipo HIO Para confirmar si la sobre-expresión de At3g48910 causa un fenotipo con alto contenido de aceite de semilla, el contenido oleaginoso en semillas de plantas transgénicas que sobre-expresan este gen se comparó con el contenido oleaginoso en semillas de plantas de control no transgénicas.

Para hacer esto, At3g48910 se clonó en un vector de transformación de planta detrás del promotor específico de semilla CsVMV y se transformó en plantas Arabidopsis utilizando el método de inmersión floral. El vector de transformación de la planta contiene el gen nptll impulsado por el promotor RE4, el cual provee resistencia a kanamicina, y sirve como un marcador seleccionable. Las semillas de las plantas transformadas se colocaron en placas sobre el medio de agar que contenía kanamicina. Después de 7 días, las plantas transgénicas se identificaron como plantas verdes sanas y se transplantaron a la tierra. Las plantas de control no transgénicas se germinaron sobre medio de agar, permitiendo su cultivo durante 7 días y después se transplantaron a la tierra. En los primeros dos experimentos 15 plantas transgénicas se transplantaron al suelo junto con 8 piñatas no transgénicas de control. En el tercer experimento, veintidós cultivos transgénicos y 10 plantas no transgénicas de control se trasplantaron a posiciones aleatorias en la misma superficie plana de 32 celdas. Las plantas se cultivaron a la madurez, permitiendo la auto-fertilización y el establecimiento de las semillas; sn embargo, algunas plantas no sobrevivieron al trasplante. Las semillas se cosecharon a partir de cada planta y su contenido oleaginoso se estimó a través de espectroscopia casi infrarroja (NIR) utilizando los métodos descritos previamente. El porcentaje de aceite en la semilla cosechada de cada planta según se determina mediante espectroscopia NIR se presenta en el cuadro 6. El valor relativo de aceite se determina al dividir el valor pronosticado de aceite entre el valor promedio de aceite en la semilla de control (es decir la semilla de plantas sin el transgen). El efecto de sobre-expresión de At3g48910 sobre el aceite de semilla se probó en tres experimentos. En los tres experimentos, las plantas que sobre-expresan At3g48910 tuvieron un contenido oleaginoso en semilla más alto que la plantas de control que crecieron en la misma superficie plana. Entre experimentos, el promedio de contenido oleaginoso en las semillas de las plantas que sobre-expresaron At3g48910 fue 8.5% mayor que el de los controles no transformados. El contenido oleaginoso de semilla en plantas que sobre-expresan At3g48910 fue significativamente más grande que para plantas de control no transgénicas (ANOVA de dos vías; P = 0.0014).

CUADRO 6 EJEMPLO 8 Para determinar si el fenotipo con alto contenido de aceite de semilla se pasa a la siguiente generación, semillas de semilla T2 de 7 plantas cultivadas en el experimento 1 fueron puestas en placas en medio de agar que contenía kanamicina y se les dejó crecer por 7 días. Estas 8 plantas representan 8 diferentes eventos de transformación. Veintidós cultivos resistentes a kanamicina se trasplantaron a posiciones aleatorias dentro de una bandeja de 32 celdas descrita arriba. Diez plantas de control no transgénicas (Col-0) también se trasplantaron Las plantas se cultivaron a la madurez, permitiendo la auto-fertilización y el establecimiento de las semillas. Las semillas se cosecharon a partir de cada planta y su contenido oleaginoso se estimó a través de espectroscopia casi infrarroja (NIR) utilizando los métodos descritos previamente. El porcentaje de aceite en la semilla cosechada de cada planta según se determina mediante espectroscopia NIR se presenta en el cuadro 7. El valor relativo de aceite se determina al dividir el valor pronosticado de aceite entre el valor promedio de aceite en la semilla de control (es decir la semilla de plantas sin el transgen).

Plantas transgénicas de 1 de los 7 eventos de transformación probados tuvieron significativamente más aceite que las plantas de control cultivadas en la misma superficie plana según se determina con una prueba T (p> 0.05).

CUADRO 7 EJEMPLO 9 Análisis de secuencia HIO de Arabidopsis Análisis de secuencia fueron realizados con BLAST (Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), PFAM (Bateman et al., 1999, Nucleic Acids Res 27:260- 262), PSORT (Nakai K, and Horton P, 1999,Trends Biochem Sci 24:34-6), y/o CLUSTAL (Thompson JD et al, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680).

EJEMPL0 10 Explantas transformadas de colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, aceite de palma, aceite de coco, lino, ricino y cacahuate se obtienen mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens o bombardeo de micropartículas. Las plantas son regeneradas a partir de tejido transformado. Las plantas cultivadas en invernadero son entonces analizadas para niveles de expresión del gen de interés así como niveles de aceite.

EJEMPLO 11 Este ejemplo proporciona procedimientos analíticos para determina contenido oleaginoso y de proteína, diferencias en masa, composición de aminoácidos, niveles de aminoácido libre y contenido de micronutrientes de plantas transgénicas de maíz. Contenidos oleaginosos (con base en masa y como porcentaje de peso del tejido) de granos de maíz individuales de primera generación y endosperma y germen diseccionados son determinados por resonancia magnética nuclear 1H de baja resolución (NMR) (Tiwari et al, JAOCS, 51 :104-109 (1974); o Rubel, JAOCS, 71 :1057-1062 (1994)), con lo cual los tiempos de relajación NMR de muestras de grano individual se miden y los niveles de aceite son calculados con base en análisis de regresión utilizando una curva estándar generada a partir del análisis de granos de maíz con diferentes niveles de aceite según se determina gravimetrícamente después de la extracción acelerada con solvente. Análisis de un solo día de varianza y la prueba T de Student (JMP, versión 4.04, SAS Institute Inc., Cary, NC, E.U.A.) se realizan para identificar diferencias significativas entre granos transgénicos y no transgénicos según se determina mediante PCR específico a transgen. Niveles de aceite y niveles de proteína en semilla de segunda generación son determinados mediante espectroscopia NIT, con lo cual los espectros NIT de muestras de semillas en reserva cosechadas de plantas individuales son medidas y niveles de aceite y proteína son calculados con base en análisis de regresión utilizando una curva estándar generada a partir del análisis de granos de maíz con variados niveles de aceite o proteína, como se determina gravimétricamente a partir de la extracción acelerada con solvente o análisis elemental (%N) respectivamente. El análisis de una sola vía de varianza y la prueba T de Student se realizan para identificar diferencias significativas en aceite (porcentaje de peso de grano) y proteína (porcentaje de peso de grano) entre semilla de marcador positivo y plazas de marcador negativo. Los niveles de aminoácidos libres son analizados a partir de cada de los eventos transgénicos usando el siguiente procedimiento. Semillas de cada una de las partes transgénicas son trituradas individualmente en un polvo fino y aproximadamente 50 mg del polvo resultante se transfiere a un tubo centrífugo pre-pesado. El peso exacto de la muestra se registra y 1.0 ml de ácido tricloroacético al 5% es añadido a cada tubo de muestra. Las muestras son mezcladas a temperatura ambiente mediante vórtice y luego se centrifugan durante 15 minutos a 14,000 rpm en un microcentrifugador Eppendorf (Modelo 5415c, Brinkmann Instrument, Westbury, NY). Una alícuota del sobrenadante se remueve y analiza mediante HPLC (Agilent 1100) utilizando el procedimiento establecido en la publicación técnica de Agilent "Amino Acid Analysis Using the Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC", Marzo 17, 2000. La determinación cuantitativa de total de aminoácidos a partir del maíz se realiza mediante el siguiente método. Granos son molidos y aproximadamente 60 mg de la masa resultante se hidroliza con ácido utilizando HCl 6 N bajo reflujo a 100°C durante 24 horas. Las muestras son secadas y reconstituidas en HCl 0.1 N seguido mediante derivatización en pre-columna con a-ftalaldehído (OPAO para HPLC. Los aminoácidos son separados mediante una columna HPLC Zorbax Eclipse XDB-C18 de fase inversa en Agílent 1100 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA). Los aminoácidos son detectados mediante fluorescencia. Cisteína, prolina, asparagina, glutamina y triptófano no son incluidos en el tamiz de aminoácido (Henderson et al., "Rapid, Aecurate, Sensitive and Reproducible HPLC Analysis of Amino acids, Amino Acid Analysis Using Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC," Agilent Publication (2000); ver también "Measurement of Acid-Stable Amino Acids," AACC Method 0701 (American Association of Cereal Chemists, Approved Methods, 9th edition (LCCC# 95-75308)). El triptófano total es medido en granos de maíz utilizando un método de hidrólisis alcalino como el descrito (Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists-10th edition, AACC ed, (2000) 07-20 Measurement of Tryptophan Alkaline Hidrolysis). Niveles de tocoferol y tocotrienol en semillas son ensayados mediante métodos bien conocidos en la técnica. Brevemente, 10 mg de tejido de semillas se añaden a 1g de microperlas (Biospec Product Inc, Barlesville, OK) en un tubo micrófugo estéril al cual 500 µl de pirogalol al 1 % (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)/etanol han sido añadidos. La mezcla se agita durante 3 minutos en un mini Beadbeater (Biospec) a velocidad "rápida" luego se filtra a través de un filtro de 0.2 µm en un tubo de automuestreo. Los extractos filtrados son analizados mediante HPLC utilizando una columna HPLC de sílice Zorbax (4.6 mmx250 mm) con una detección fluorescente, una excitación a 290 nm, una emisión a 336 nm, y paso de banda y ranuras. La composición de solvente y condiciones en funcionamiento es como se listan a continuación con el solvente A como hexano y solvente B como metil-t-butil éter. El volumen de inyección es 20 µl, el caudal es 1.5 ml/minuto y el tiempo de funcionamiento es 12 minutos a 40°C. El gradiente de solvente es 90% solvente A, 10% solvente B durante 10 minutos; 25% solvente A, 75% solvente B durante 11 minutos; y 90% solvente A, 10% solvente B durante 12 minutos. Estándares de tocoferol en pirogalol al 1 %/etanol son pasados para comparación (a-tocoferol, ?-tocoferol, ß-tocoferol, d-tocoferol, y tocoferol (tocol)). Curvas estándares para alfa, beta, delta y gama tocoferol son calculados utilizando software Chemstation (Hewlett Packard). Estándares de tocotrienol en pirogalol al 1 %/etanol son pasados para comparación (a-tocotrienol, ?-tocotrienol, ß-tocotrienol, d-tocotrienol). Curvas estándares para a-, ß-, d-, y ?-tocotrienol son calculados utilizando software Chemstation (Hewlett Packard). Niveles de carotenoide dentro de grano de maíz transgénico son determinados mediante un protocolo estándar (Craft, Meth, Enzimo!., 213:185-205 (1992)). Plastiquinoles y filoquinones se determinan mediante protocolos estándares (Therfall eí al., Methods in Enzymology, XVIII, part C, 369-396 (1971 ); y Ramadan et al., Eur. Food Res. Technol., 214(6):521-527 (2002)).

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Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido HIO que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, ó 6, o un ortólogo del mismo, con lo cual la planta transgénica tiene un fenotipo con alto contenido de aceite en relación con plantas de control.

2.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste en colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuate.

3.- Una parte de planta obtenida a partir de la planta de conformidad con la reivindicación 1.

4.- La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque es una semilla.

5.- Comida, pienso o alimento producido a partir de la semilla de la reivindicación 4.

6.- Un método para producir aceite que comprende el cultivo de la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 y recuperar aceite de dicha planta.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado además porque el aceite se recupera de una semilla de la planta.

8.- Un método para producir un fenotipo con alto contenido de aceite en una planta, dicho método comprende: a) introducir en las células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica a un polipéptido HIO que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, ó 6, o un ortólogo del mismo; y b) cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde dicha secuencia de polinucleótidos se expresa y dicha planta transgénica muestra un fenotipo de contenido oleaginoso alterado en relación con las plantas de control.

9.- Una planta obtenida a través del método de conformidad con la reivindicación 8.

10.- La planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste en colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuate.

11.- Un método para generar una planta que tiene un fenotipo con alto contenido de aceite que comprende identificar una planta que tiene un alelo en su gen HIO que resulta en un mayor contenido oleaginoso comparado con plantas que carecen de alelo y que generan una progenie de dicha planta identificada, en donde la progenie generada hereda el alelo y tiene el fenotipo con alto contenido de aceite.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque emplea metodología de gen candidato/QTL.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque emplea la metodología TILLING.

14.- Un pienso, alimento, grano, comida o semilla que comprende un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico como se establece en SEQ ID NO: 1 , 3, ó 5.

15.- Un pienso, comida, grano, alimento o semilla que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se establece en SEQ ID NO: 2, 4, ó 6, o un ortólogo del mismo.