ME01043B - Metode za prećišćavanje fsh-a - Google Patents

Abstract

Metoda za purifi kaciju rekombinantnog FSH ili neke varijante FSH koja podrazumevapodvrgavanje tečnosti koja sadrži FSH: afinitetnoj hromatografiji sa prebojavanjem;(1) hromatografi ji sa hidrofobnom reakcijom; i(2) hromatografi ji obmute fazekoje se mogu primijenti po bilo kom redosljedu.Patent sadrži još 23 patentna zahtjeva.

Description

Polje tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na polje purifikacije hormona koji stimuliše folikule (FSH).

Stanje tehnike

Hormon koji stimuliše folikule (FSH) je protein koji se može primenjivati u vidu injekcija koji spada u klasu gonadotropina. FSH se koristi za lečenje neplodnosti i reproduktivnih poremećaja kod pacijenata ženskog i muškog pola.

U prirodi, FSH proizvodi hipofiza. Za farmaceutsku upotrebu, FSH može da se proizvodi rekombinantno (rFSH) ili se može izolovati iz urina postmenopauzalnih žena (rFSH).

FSH se koristi kod pacijentkinja za izazivanje ovulacije (01) kao i za kontrolisanu hiperstimulaciju ovarijuma (COH) kod asistiranih reproduktivnih tehnologija (ART). Kod jednog tipičnog terapijskog režima za izazivanje ovulacije, pacijent dobija dnevne injekcije FSH ili neke varijante (oko 75 do 300 IJ FSH/dan) tokom perioda od oko 6 do oko 12 dana. Kod tipičnog terapijskog režima za kontrolisanu hiperstimulaciju ovarijuma, pacijent dobija svakodnevne injekcije FSH ili neke varijante (oko 150-600 IJ FSH/dan) tokom perioda od oko 6 do oko 12 dana.

FSH se takođe koristi za izazivanje spermatogeneze kod muškaraca koji pate od oligospermije. Režim kod koga se koristi 150 IJ FSH 3 puta nedeljno u kombinaciji sa 2500 IJ hCG dva puta nedeljno je uspešan u postizanju poboljšanja broja spermatozoida kod muškaraca koji pate od hipogonadotropnog hipogonadizma [Burgues et al.; Subkutana samoadministracija visoko prečišćenog hormona koji stimuliše folikule i humanog horionskog gonadotropina za lečenje muškog hipogonadotropnog hipogonadizma. Španska Kolaborativna grupa za muški hipogonadotropni hipogonadizam; Hum. Reprod.; 1997,12, 980-6],

Zbog značaja FSH u lečenju poremećaja fertiliteta, poželjno je obezbeđivanje FSH visoke čistoće i visoko specifične aktivnosti. FSH tretman iziskuje ponovljene injekcije. Preparati sa visoko prečišćenim FSH se mogu davati subkutano, što omogućava samoadministraciju od strane pacijenta a time sa povećava podobnost za pacijente i njihova saradnja.

Lynch et al. [Ekstrakcija i purifikacija humanog pituitamog hormona koji stimuliše folikule i luteinizirajućeg hormona; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19] opisuju jednu metodu za

purifikaciju humanog pituitamog FSH. Ova metoda uključuje hromatografiju sa razmenom anjona i katjona, imunoafmitnu ekstrakciju i hromatografiju sa isključivanjem po veličini. Za ovu metodu se kaže da dovodi do toga da pituitami FSH ima specifičnu aktivnost od 4,990 U (imunoesej)/mg, sa 16 IJ/mg LH. Sadržaj proteina je određen ili na osnovu suve težine ili u rastvoru apsorpcijom na 280 nm (pod pretpostavkom daje A280) cm /a 1 g/1 je jednako 1).

WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) opisuje jedan proces za purifikaciju humanog urinamog FSH počevši od urinamih ekstrakta koji se nazivaju humani menopauzalni gonadotropini (hMG). U ovom procesu se koristi hromatografija sa izmenom jona sa anjonitnom smola na nedeljnoj bazi tipa DEAE posle čega sledi afinitetna hromatografija na smoli koja ima jedan derivat antrahinona koji služi kao ligand. Za ovaj proces se navodi da daje urinami FSH bez LH i da ima specifičnu aktivnost od 6,870 IJ (imunoesej)/mg. Sadržaj proteina je određen tako što je pretpostavljeno da vodeni rastvor od 1 mg/ml proteina ima optičku gustinu od 0.62 na 277 nm, u kvarcnim kivetama sa družinom putanje od 1 cm.

WO 00/63248 (Institute Massone SA) opisuje jedan proces za purifikaciju gonadotropina, uključujući FSH, iz humanog urina. Ovaj proces uključuje sledeće korake: hromatografiju sa izmenom jona sa nekom snažnom katjonskom smolom tipa sulfopropila, hromatografiju sa izmenom jona sa nekom snažnom anjonskom smolom i hromatografiju sa hidrofobnom reakcijom (HIC). Preparat FSH koji ima specifičnu aktivnost od 8,400 IJ/mg (Steelman-Pohleyeva metoda: Esej hormona koji stimuliše folikule zasnovan na povećanju sa humanim horionskim gonadolropinom; Endocrinology, 1953, 53, 604-616) i manje od 1 IJ LH (metoda povećanja težine semenih kesica pacova: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Ada Endocrinol, 1964, 47, 409) biološka aktivnost na 75 IJ FSH se navodno dobija. Sadržaj proteina je ispitan Lowryjevom metodom [O.H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951,795,265].

US 5,990,288 (Musick et al.) opisuje jednu metodu za purifikaciju FSH iz bioloških uzoraka, kao što su humane hipofize ili humani postmenopauzalni urin. U ovom procesu se koristi hromatografija sa izmenom katjona na Fractogel EMD SO3-650M, posle čega sledi afinitetna hromatografija sa prebojavanjem na smoli Mimetic Orange 1, a zatim sledi korak hromatografije sa hidrofobnom reakcijom na smoli Bakerbond Wide Pore Hl-Propyl. Za ovaj proces se navodi da daje humani pituitami FSH koji ima specifičnu aktivnost od 7,066 IJ (imunoesej)/mg a manju od 1 IJ (imunoesej)/mg LH, i urinami FSH koji ima specifičnu aktivnost od 6,298 IJ (imunoesej)/mg a manju od 3 IJ (imunoesej)/mg of LH. Sadržaj proteina je određen apsorpcijom na 280 nm (pod pretpostavkom daje A280!™ za 1 g/1 jednako 1).

Chiba et al. [Izolacija i parcijalna karakterizacija LH, FSH i TSH iz hipofize pasa; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] opisuju jednu tehniku za purifikaciju gonadotropina iz hipofize pasa, uključujući FSH, uz pomoć afmitetne hromatografije sa konkanavalinom (Con), hromatografije sa hidrofobnom reakcijom (HIC) i hromatografije sa imobilisanim metalnim jonima sa Cu++. Navedeno je da dobijeni FSH ima specifičnu aktivnost od 2.17 IJ/g proteina primenom radioreceptorskog eseja za FSH za merenje biološke aktivnosti i uz pomoć BioRad kita za proteinski esej (BioRad Laboratories CA USA) za određivanje sadržaja proteina.

WO 88/10270 (Institute di Ricerca Cesare Serono SPA) opisuje jednu metodu za purifikaciju humanog FSH iz urina. Ovaj proces uključuje imunohromatografiju sa FSH-specifičnim imobilisanim monoklonim antitelima vezanim za Sefarozu 4B uz pomoć divinil sulfona, posle čega sledi HPLC obrnute faze. Dobijeni FSH ne sadrži LH i druge uriname proteine i ima specifičnu aktivnost od 6,200 IJ/mg liofilizovanog praha (Steelman-Pohley-jeva metoda). Ovaj preparat je bio prvi preparat FSH koji je bio pogodan za subkutanu administraciju zbog njegove čistoće.

I dalje ostaje potreba za novim metodama za purifikaciju FSH i varijanti FSH. Posebno, postoji potreba za metodama purifikacije kojim bi se izbegla upotreba skupih koraka imunoafinitetne hromatografije.

Kratak prikaz pronalaska

Cilj ovog pronalaska je da se obezbedi jedna nova metoda za purifikaciju rekombinantnog FSH ili neke rekombinantne varijante FSH.

U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje jednu metodu za purifikaciju rekombinantnog humanog FSH ili neke varijante FSH, počevši od tečnosti koja sadrži sirovi FSH, uključujući sledeće korake:

(1) afinitetna hromatografija sa prebojavanjem;

(2) hromatografija sa hidrofobnom reakcijom; i

(3) hromatografija obrnute faze; koje se mogu sprovesti po bilo kom redosledu.

Kratak opis crteža

Slika 1 ilustruje ovaj pronalazak, to jest proces purifikacije koji obuhvata korake:

• afmitetnu hromatografiju sa prebojavanjem,

• hromatografiju sa hidrofobnom reakcijom,

• hromatografiju obrnute faze,

Slika 2 prikazuje dijagram toka jednog specifičnog aspekta ovog pronalaska, tj. procesa

purifikacije koji uključuje korake:

• ultrafiltracije/dijafiltracije,

• hromatografije sa izmenom anjona,

• afinitetne hromatografije sa prebojavanjem,

• hromatografije sa hidrofobnom reakcijom,

• hromatografije obrnute faze,

• hromatografije sa izmenom anjona,

• nanofiltracije,

• ultrafiltracije/dijafiltracije;

Skraćenice

U opisu ovih pronalaska su korišćene sledeće skraćenice:

DF: dijafiltracija

FSH: hormon koji stimuliše folikule; r-FSH: rekombinantni FSH; hFSH: humani FSH; r-hFSH: rekombinantni humani FSH BV: Zapremina podloge DEAE: đietilaminoetil ELISA: enzimski povezan imunoesej DAC: afinitetna hromatografija sa prebojavanjem IMAC: afinitetna hromatografija sa imobilisanim metalnim jonima OD: optička gustina

HIC: Hromatografija sa hidrofobnom reakcijom HPLC : visoko efikasna tečna hromatografija IRMA: imunoradiometrijski esej KD ili kD: kiloDalton

HCP: protein ćelija domaćina, proteini koji potiču iz ćelija domaćina koje se koriste

ekspresiju f FSH

IPC: hiprocesne kontrole

IEF: izoelektrično fokusiranje

PES: polietersulfon

RP-HPLC: visoko efikasna tečna hromatografija obrnute faze

Q FF: izmena anjona na Q Sefarozi FF

RT: Sobna temperatura

UF: ultrafiltracija

WFI: voda za injekcije

Detaljni opis ovog pronalaska

Ovaj pronalazak obezbeđuje jednu metodu za purifikaciju rekombinantnog humanog FSH ili neke varijante rekombinantnog FSH počevši od neke tečnosti koja sadrži sirovi FSH, uključujući sledeće korake:

(1) afmitetna hromatografija sa prebojavanjem

(2) hromatografija sa hidrofobnom reakcijom; i

(3) hromatografija obrnute faze; koji se mogu primeniti po bilo kom redosledu.

Metod purifikacije ovog pronalaska omogućava dobij anje rekombinantnog FSH u masi visoke čistoće koji se potom može formulisati u gotov lek npr. Gonal-F (Serono). On ima tu prednost da obezbeđuje visok stepen čistoće bez upotrebe imunoafinitetne hromatografije. Sirovi FSH koji čini početni materijal za purifikaciju prema ovom pronalasku sastoji se od ubranih ćelijskih kultura koje sadrže rekombinantni FSH.

Prema jednom preferentnom aspektu, antioksidans ili neka slobodna amino kiselina ili dipeptid sa antioksidansnim ili efektima čistača uključen je u neke ili sve korake metode purifikacije prema ovom pronalasku. Preciznije, taj antioksidans je prisutan u bilo kom puferu koji je korišćen za purifikaciju i/ili koncentrisanje i/ili filtriranje r-hFSH. Taj antioksidans sprečava oksidaciju FSH tokom prerade. Preferentni antioksidans je L-metionin. Poželjno je da se L-metionin koristi u koncentraciji od ili oko 10-100 mM. Dalji primeri antioksidanasa uključuju t-butil-4-metoksi-fenol, 2,6-bis(l,l-dimetiletil)-4-metil fenol; kalijum ili natrijum bimeta-bisulfit, natrijum bisulfit. Primeri slobodnih amino kiselina i dipeptida sa antioksidansnim ili efektima čistača su histidin, taurin, glicin, alanin, kamozin, anserin, 1-metilhistidin ili njihove kombinacije.

Tipično se početni materijal prvo prečišćava a zatim opciono koncentriše (npr. upotrebom ultrafiltracije) i/ili se vrši izmena pufera (npr. putem koraka dijafiltracije) pre nego što se uvedene u prvi hromatografski korak.

U koracima hromatografije, mogu se koristiti smole na bazi polimera i na bazi agaroze. Takođe se može koristiti hromatografija sa membranom, kod koje se smola zamenjuje nekom funkcionalizovanom membranom.

Ova 3 koraka purifikacije u okviru ovog pronalaska (tj. afmitetna hromatografija sa prebojavanjem, hromatografija sa hidrofobnom reakcijom, hromatografija obrnute faze) su u daljem tekstu detaljnije prikazana.

Korak afinitetne hromatografije sa prebojavanjem (1)

Ova metoda ovog pronalaska obuhvata korak afinitetne hromatografije sa prebojavanjem (1).

Prema jednom preferentnom aspektu, korak afinitetne hromatografije sa prebojavanjem se sprovodi upotrebom smole koja ima kao imobilisani ligand jedinjenje boje koje je dobro poznato stručnjaku iz ove oblasti, tj. Cibacron Blue F3G-A. Termin "imobilisan" dobro razumeju stručnjaci iz ove oblasti i on znači daje taj ligand izveden u smislu daje hemijski povezan sa datom smolom. Posebno preferentna smola je Blue Sefaroza FF (koja se može nabaviti od Amersham Biosciences Ine.). Tehničke karakteristike Blue Sefaroze FF su sledeće:

Jasno je da se ova metoda može primeniti sa nekim alternativnim smolama koje imaju slične karakteristike. Primeri alternativnih smola uključuju: Toyopeari AF-blue-HC-650M (Tosoh Bioscience), Toyopeari SuperButil 550, Toyopeari Fenil 650, Blue Cellthru BigBead (Sterogene), SvvellGel Blue (Pierce), Cibachrome blue 3GA-agarose 100 (Sigma), Affi-Gel Blue (BioRad), Econo-Pac blue punjenje (Bio-Rad), Blue Sefaroza HP (Amersham), Cibacron Blue 3GA (Sigma).

Korak elucije imobilisane afinitetne hromatografije sa prebojavanjem je poželjno sprovesti uz primenu fosfatnog pufera, a posebno je poželjno da to bude natrijum fosfat. pH eluenta treba da bude oko 6.0 ili oko 11.5, a poželjnije je da bude oko 6.5 do oko 8, a posebno je poželjno da bude oko 7.0. U alternativne pufere adekvatne za održavanje pH 7.0 spadaju sledeći: MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES. Pufer za eluciju za korak afinitetne hromatografija sa prebojavanjem treba poželjno da sadrži neku so kako bi se povećala provodljivost, najbolje NaCl.

Prema jednom posebno preferentnom aspektu, proizvod koji sadrži pufere za korak afinitetne hromatografija sa prebojavanjem (ekvilibracija, pranje i elucija) sadrži antioksidans, kao što je L-metionin. Dalji primeri antioksidanasa uključuju t-butil-4-metoksifenol, 2,6-bis(l,l-dimetiletil)-4-mctil fenol; kalijum ili natrijum bimetabisulfit, natrijum bisulfit.

Korak hromatografije sa hidrofobnom interakcijom (2)

Ova metoda takođe obuhvata korak hromatografije sa hidrofobnom reakcijom (2). Prema jednom preferentnom aspektu, hromatografija sa hidrofobnom reakcijom se sprovodi sa nekom smolom kao što je Toyopearl Butil 65OM (koja se može nabaviti od Tosoh Biosep Ine.).

Jasno je da korak (2) može da se sprovede upotrebom alternativnih smola, koje imaju slične karakteristike. Alternativne smole koje se mogu koristiti su sledeće: Fenil Sefaroza 6 Brzi protok (low sub); Fenil Sefaroza 6 Brzi protok (high sub); Butil Sefaroza4 Brzi protok; Oktil Sefaroza 4 Brzi protok; Fenil Sefaroza Visoka efikasnost; SOURCE 15ETH; SOURCE 15ISO; SOURCE 15PHE sve od Amersham Biosciences (800) 526-3593; (videti www.amershambiosciences.com). Još neke dodatne smole su: Hydrocell C3 ili C4; Hydrocell Fenil od BioChrom Labs Ine. (812) 234-2558; (videti www.biochrom.com)

Vezivanje za HIC smolu se postiže u puferu velike pro vodljivosti koji se dobija dodavanjem soli (NaCI, (NH4)2S04 ili Na2S04 na primer). Elucija u koraku hromatografije sa hidrofobnom reakcijom se preferentno sprovodi smanjenjem provodljivosti mobilne faze (smanjenjem koncentracije soli), upotrebom pufera koji ima pH od oko 6 do oko 8, preferentnije oko 6.5 do oko 7.5, najpreferentnije oko 7). Jedan posebno preferentan sistem sadrži natrijum fosfat za puferovanje preferentno na pH od oko 7 i amonijum sulfat. Alternativni puferi su gore pomenuti.

Prema jednom posebno preferentnom aspektu, puferi koji sadrže ovaj proizvod za korak (2) za HIC (ekvilibracija, ispiranje, elucija) sadrže antioksidans, kao što jeL-metionin. Alternativni antioksidansi su gore pomenuti.

Korak hromatografije obrnute faze (31

Ova metoda ovog pronalaska takođe obuhvata korak hromatografije obrnute faze (RPC) (3). RPC se preferentno sprovodi upotrebom smole kao što je SOURCE 30 RPC (koja se može

nabaviti od Amersham Biosciences). Jasno je da se korak (3) može sprovesti upotrebom alternativnih smola koje su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti i koje imaju slične karakteristike.

Hromatografija se preferentno sprovodi puferovanjem u mobilnoj fazi pri blago baznoj pH, na primer na oko pH 7-8.5, preferentnije na ili oko 7.5 ili 7.6. Prema jednom preferentnom aspektu, vrsta za puferovanje je amonijum acetat. Alternativni puferi adekvatni za pH na ili oko 7.6 uključuju: BES, MOPS, Fosfat, TES, HEPES. Rastvori pufera korišćeni u ovom koraku takođe mogu da sadrže neki organski modifikator čija je koncentracija modulisana za različite faze koraka hromatografije korak (punjenje, ispiranje, elucija i regeneracija). Prema jednom preferentnom aspektu, takav organski modifikator je neki organski rastvarač koji se može mešati sa vodom, preferentno neki alkohol (kao što je metanol, etanol, itd.), najpreferentnije 2- propanol (izo-propanol).

Prema jednom posebno preferentnom aspektu, puferi koji sadrže ovaj proizvod za korak RPC (ekvilibracija, ispiranje, elucija) sadrže antioksidans, kao što je L-metionin. Alternativni antioksidansi su gore pomenuti.

Korak 0 - opciona dalja purifikaciia - hromatografija sa izmenom iona

Osim tri glavna koraka purifikacije koja su gore prikazana, ovaj pronalazak može da uključuje i dodatne korake purifikacije.

Prema jednom aspektu, metod purifikacije kod ovog pronalaska uključuje jedan preliminarni korak hromatografije sa izmenom jona (0) koji se preferentno sprovodi sa nekom snažnom smolom za izmenu anjona, posebno preferentno sa nekom kvatemamom amonijačnom smolom kao što je Q Sefaroza FF (koja se može nabaviti od Amersham Biosciences), koja ima sledeće karakteristike:

Alternativno, korak hromatografije sa izmenom jona (0) se može sprovesti upotrebom smole

kao sto je Fractogel EMD TMAE HICAP (koja se može nabaviti od Merck KGaA, Darmstadt Germany), ili neke smole koja ima slične karakteristike, videti dole:

Korak hromatografije sa iztnenom jona se preferentno sprovodi upotrebom nekog pufera koji ima blago alkalnu pH (npr. od ili oko 7.2 do oko 9.0, ili oko 8.0 do oko 9.0, najpreferentnije oko 8.5). U pogodne pufere spadaju, na primer boratni pufer, trietanolamin /iminodisirćetna kiselina Tris, amonijum acetat, tricin, bicin, TES, HEPES, TAPS. Najpreferentniji je boratni pufer, na pH od oko 8.5. Elucija iz smole za jonsku izmenu se postiže povećanjem provodljivosti mobilne faze dodavanjem soli, preferentno NaCI. Prema jednom posebno preferentnom aspektu puferi koji sadrže ovaj proizvod za hromatografiju sa izmenom jona (ekvilibracija, ispiranje, elucija) sadrže antioksidans, preferentno L-metionin. Alternativni antioksidansi su gore pomenuti.

Tako, prema jednom preferentnom aspektu, ova metoda ovog pronalaska obuhvata sledeće korake:

(0) hromatografija sa izmenom anjona, preferentno na nekoj snažnoj smoli za izmenu jona [preferentno kvatemarnoj amonijačnoj smoli, kao stoje Q Sefaroza FF ili Fractogel EMD TMAE];

(1) afinitetna hromatografija sa prebojavanjem [preferentno na Blue Sefarozi FF];

(2) hromatografija sa hidrofobnom reakcijom [preferentno na Toyopearl Butil 650M];

(3) hromatografija obrnute faze [preferentno na Source 30 RPC].

Opcioni korak dalje purifikacije M) - ultrafiltraciie/diialiltraciie

Pre koraka hromatografiju sa izmenom jona (0), može biti poželjno sprovođenje koraka ultrafiltracije, kako bi se koncentrisao sirovi FSH. Ultrafiltracija (ili dijafiltracija) se preferentno sprovodi upotrebom membrane čija je vređnost oko 3-10 kD, najpreferentnije oko 8 kD.

Opcioni korak dalje purifikacije (4) - hromatografija sa izmenom aniona

Prema jednom dodatnom prcferentnom aspektu, ova metoda ovog pronalaska takođe obuhvata drugi korak hromatografije sa izmenom anjona (4). Preferentna smola je Fractogel EMD TMAE HICAP (koja se može nabaviti od Merck KGaA, Darmstadt Germany), ili smole koje imaju slične karakteristike, kako je gore pomenuto. Alternativno drugi korak hromatografije sa izmenom anjona se može sprovesti na Q Sefarozi FF, ili drugim smolama koje imaju slične karakteristike, kako je gore pomenuto.

Koraci hromatografije sa izmenom anjona, afinitetne hromatografije sa prebojavanjem, hromatografije sa hidrofobnom reakcijom (HIC), hromatografije obrnute faze i drugi korak hromatografije sa izmenom anjona se mogu sprovesti po bilo kom redosledu, iako je poželjnije da se prvo sprovodi korak hromatografije sa izmenom anjona. Preostali koraci afinitetne hromatografije sa prebojavanjem, hromatografije sa hidrofobnom reakcijom (HIC), i opcione druge hromatografije sa izmenom anjona se mogu sprovesti po bilo kom redosledu, iako je poželjno da se prati dole navedeni redosled:

(0) hromatografija sa izmenom anjona, (1) afinitetna hromatografija sa prebojavanjem, (2) hromatografija sa hidrofobnom reakcijom (HIC), (3) hromatografija obrnute faze RPC; i

(4) druga hromatografija sa izmenom anjona.

Opcioni korak dalje purifikaciie(5) - ultrafiltraciia/diiafiltraciia

Prema jednom dodatnom preferentnom aspektu, posle bilo kog koraka hromatografije (posebno posle koraka hromatografije obrnute faze), uzorak FSH se podvrgava koraku koncentracije. Preferentno se ovaj korak sprovodi upotrebom ultrafiltracije u kombinaciji sa dijafiltracijom kako bi se dobila masa željenog sastava. Ultrafiltracija (ili dijafiltracija) se preferentno sprovodi uz pomoć membrane čija se vređnost kreće na oko 3-10 kD, najpreferentnije na oko 5 kD.

Prema jednom posebno preferentnom aspektu, sledeći koraci se sprovode prema dole prikazanom redosledu:

(-1) Ultrafiltracija (preferentno sa membranom čija je granična vređnost na oko 8 kD),

(0) Hromatografija sa izmenom anjona (preferentno upotrebom kolone sa Q Sefaroze FF);

(1) afinitetna hromatografija sa prebojavanjem (preferentno upotrebom kolone sa Blue Sefarozom FF);

(2) hromatografija sa hidrofobnom reakcijom (H1C) (preferentno sa upotrebom kolone sa Butil 650M c);

(3) hromatografija obrnute faze (RPC) (preferentno sa upotrebom kolone Source 30 RFC);

(4) hromatografija sa izmenom anjona na nekoj snažno baznoj smoli za izmenu anjona peferentno sa upotrebom TMAE hicap smole); i

(5) ultrafiltracija (preferentno sa membranom čija je vrednost oko 5 kD).

Može biti poželjno da se uzorak FSH podvrgne koraku nanofiltracije, posebno u vidu koraka za čišćenje virusa, tj. radi smanjenja rizika od kontaminacije preparata FSH virusima ili česticama nalik na viruse iz ćelijske kulture. Nanofiltracija se može uraditi u bilo kom stadijumu procesa purifikacije, međutim, posebno je preferentno da se nanofiltracija izvrši posle drugog koraka hromatografije sa izmenom jona, ili posle hromatografije obrnute faze ili posle hromatografije sa hidrofobnom reakcijom. Nanofiltracija se može izvršiti više puta, na primer može se sprovesti dva puta.

Prema jednom posebno preferentnom aspektu, ova metoda ovog pronalaska obuhvata sledeće korake:

(-1) Ultrafiltracija (preferentno sa membranom čija je vrednost oko 8 kD),

(0) Hromatografija sa izmenom anjona (preferentno sa Q Sefarozom FF),

(1) Afinitetna hromatografija sa prebojavanjem (preferentno sa Blue Sefarozom FF),

(2) Hromatografija sa hidrofobnom reakcijom (HIC) (preferentno sa Butil

650M),

(3) Hromatografija obrnute faze (RPC) (preferentno sa Source 30 RPC),

(4) Hromatografija sa izmenom anjona na snažno baznoj smoli za izmenu anjona

(preferentno TMAE hicap smola);

(4‘) Nanofiltracija,

(5) Ultrafiltracija (preferentno sa membranom čija je vrednost 5 kD).

Prednost ovog pronalaska je da je metoda purifikacije oslobođena skupog koraka imuno-afinitetne hromatografija i da bez obzira na to daje FSH visoke čistoće i specifične bioaktivnosti. Takođe, purifikovani FSH iz ovog pronalaska ne sadrži neželjena onečišćenja koja daje imuno afinitetna hromatografija (npr. imunoglobuline isprane iz smole)

Čuvanje/Liofilizacija

Tečni sastav dobijen iz procesa purifikacije kako je gore opisano i koji sadrži purifikovani FSH može se zamrznuti radi čuvanja takav kakav je ili se posle purifikacije eluat može podvrgnuti liofilizacionom sušenju zamrzavanjem kako bi se eliminisao rastvarač. Dobijena tečnosti ili liofilizovani proizvod se naziva "FSH u rasutom stanju".

FSH formulacije

FSH ili neka varijanta FSH iz ovog pronalaska ili purifikovana prema ovoj metodi iz ovog pronalaska može se formulisati za injekcije, intramuskulame ili subkutane, preferentno subkutane. Ova formulacija FSH se može osušiti zamrzavanjem, kada se potom rastvara u vodi za injekcije neposredno pre injekcije. Formulacija FSH takođe može biti tečna formulacija, a u tom slučaju se direktno injiciran, bez prethodnog rastvaranja.

Formulacija FSH može biti u vidu pojedinačne doze ili višestruke doze. Ukoliko je u pitanju višestruka doza, ona treba poželjno da sadrži neki bakteriostatski agens, kao što je na primer, benzil alkohol, meta-kresol, timol ili fenol, preferentno benzil alkohol ili meta-kresol. Formulacije u vidu pojedinačne doze mogu takođe da sadrže neki bakteriostatski agens.

FSH iz ovog pronalaska se može formulisati sa poznatim eksipijensima i stabilizatorima, na primer sa saharozom i manitolom. Ona takođe može da sadrži i antioksidans, kao što je metionin. Ona dalje može da sadrži neki surfaktant, kao što je TWEEN (preferentno TWEEN 20), ili Pluronic (preferentno Pfuronic F68).

U jednoj posebno preferentnoj formulaciji sa više doza, FSH proizveden ovom metodom ovog pronalaska formulisan je rastvaranjem u vodi za injekcije sa saharozom, fosfatnim puferom (pH 7), Pluronic F68, metioninom i meta-kresolom ili benzil alkoholom.

Jedna posebno preferentna tečna formulacija sa više doza rekombinantnog FSH za subkutane ili intramuskulame injekcije je sledeća:

Indikacije

FSH iz ovog pronalaska pogodan je za upotrebu kod svih tretmana kod kojih je indikovan FSH. On je posebno pogodan za subkutanu administraciju za izazivanje ovulacije, kontrolisanu hiperstimulaciju ovarijuma kod asistiranih reproduktivnih tehnologija kao i kod Iečenja oligospermije. Može se koristiti zajedno sa drugim gonadotropinima kao što su LH i hCG. Takođe se može koristiti sa drugim jedinjenjima koja pojačavaju odgovor na FSH, kao što su klomifen citrat, inhibitori aromataze, kao što su Anastrozol, Letrozol, Fadrozol i YM-511.

Sekvence:

SEQID NO. 1: humani glikoprotein, a-podjedinica;

SEQ ID NO. 2: hFSH P-podjedinica SEQ ID NO. 3: hFSH P-podjedinica varijanta 1 SEQ ID NO. 4: hFSH p-podjedinica varijanta 2 SEQ ID NO. 5: hFSH p-podjeđinica varijanta 3

Hormon koji stimuliše folikule, ili FSH, kako je ovde korišćen odnosi se na humani FSH (hFSH) proizveden kao zreli protein pune dužine. FSH je dimer koji se sastoji od alfa-podjedinice humanog glikoproteina i beta-podjedinice humanog FSH. Sekvenca proteina alfa podjedinice humanog glikoproteina data je u SEQ ID NO: 1 dok je sekvenca proteina beta podjedinice humanog FSH data u SEQ ID NO: 2. Upotreba termina "rekombinantni" se odnosi na preparate FSH koji su proizvedeni upotrebom rekombinantne tehnologije DNK (videti na primer WO 85/01958). Jedan primer metode ekspresije FSH uz primenu rekombinantne tehnologije je transfekcija eukariotskih ćelija sa sekvencama DNK koje enkodiraju neku alfa i beta podjedinicu FSH, bez obzira da li je obezbeđena na jednom vektori ili dva vektora gde svaka podjedinica ima zaseban promoter, kako je opisano u evropskim patentima br. EP 0 211 894 i EP 0 487 512. DNK koja enkodira FSH može biti cDNK ili ona može da sadrži introne. Još jedan primer upotrebe rekombinantne tehnologije u proizvodnji FSH je primena homologne rekombinacije radi insercije nekog heterolognog regulatomog segmenta u operativnu vezu sa endogenim sekvencama koje enkodiraju jednu ili obe pođjedinice FSH, kako je opisano u evropskom patentu br. EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). Takođe su razmotrene metode kao što su one objavljene u WO 99/57263 (transkariotske terapije), gde je jedna od podjedinica ubačena heterologno u ćeliju a druga podjedinica je eksprimirana aktivacijom genomskih sekvenci heterolognog regulatomog segmenta homolognom rekombinacijom. Ova metoda ovog pronalaska može da se koristi za purifikaciju eksprimiranog FSII sa upotrebom ovih i drugih metoda.

Izraz "rekombinantna ćelija" se odnosi na ćeliju proizvedenu insercijom heterologne DNK, uključujući bilo koju gore pomenutu metodu genetske manipulacije.

Preferentno se FSH proizvodi u ćelijama ovarijuma kineskih hrčaka (CHO) kod kojih je izvršena transfekcija vektorom ili vektorima koji obuhvataju DNK koja kodira alfa-podjedinicu humanog glikoproteina i beta-pođjedinicu FSH. DNK koja enkodira alfa i beta-podjedinice može biti prisutna na istom ili na različitim vektorima.

Izraz "FSH varijanta" ima za cilj da obuhvati one molekule koji se razliku po sekvenci amino kiselina, obrascu glikozilacije ili po među-vezama podjedinica iz humanog FSH ali ispoljavaju aktivnost FSH. Primeri uključuju CTP-FSH, modifikovani rekombinantni FSH sa produženim delovanjem koji se sastoji od a-podjedinice divljeg tipa i nekog hibrida (p-podjedinica kod koje je karboksi-terminalni peptid hCG fuzionisan sa C-terminalnim delom p-podjeđinice FSH, kako su opisali LaPolt et cd.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520ili Klein et al.; Razvoj i karakterizacija agonista rekombinantnog hFSH sa produženim dejstvom; Human Reprod. 2003,18, 50-56]. Takođe je uključen i CTP-FSH sa jednim lancem, molekul sa jednim lancem koji se sastoji od sledećih sekvenci (od N-terminalnog do C-terminalnog kraja):

što je naznačeno time da PFSH označava p-podjedinicu FSH, phCG CTP (113-145) označava karboksi terminalni peptid hCG dok aFSH označava a-podjedinicu FSH, kako su opisali Klein et al. [Farmakokinetika i farmakodinamika jednolančanog rekombinantnog humanog hormona koji stimuliše folikule koji sadrži karboksiterminalni peptid humanog horionskog gonadotropina kod rezus majmuna, Fertility & Sterility, 2002, 77,1248-1255]. U druge primere varijanti FSH spadaju molekuli koji imaju dodatna mesta glikozilacije inkorporirana u a- i/ili p-podjedinicu, kako je objavljeno u WO 01/58493 (Maxygen) i molekule FSH sa SS vezama između podjedinica, kako je objavljeno u WO 98/58957. Dalji primeri varijanti FSH uključuju himeme molekule koji sadrže sekvence iz FSH i sekvence iz hCG ili LH, kao što su oni opisani u WO 91/16922 i WO 92/22568.

Varijante FSH koje se ovde pominju takođe uključuju karboksi-terminalne delecije beta podjedinica koje su kraće od zrelih proteina pune dužine sa SEQ ID NO:2. Karboksi-terminalne delecije humanih beta podjedinica su date u SEQ 1DS NOS: 3,4, i 5. Jasno je da karboksi-terminalne varijante beta lanca formiraju kompleks sa nekom poznatom alfa podjedinicom kako bi formirali neku varijantu FSH heterodimera.

Prema jednom preferentnom aspektu, FSH se proizvodi rekombinantno u ćelijama CHO, bilo u serumu ili u medijumu bez seruma.

Prema jednom preferentnom aspektu, purifikovani FSH proizveden prema ovoj metodi ovog pronalaska pogodan je za subkutanu administraciju, što omogućava samo-administracija od strane pacijenta.

Izraz "sirovi rekombinantni FSH" se odnosi supematant ćelijske kulture iz rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju FSH, pre nego što se on podvrgne bilo kom hromatografskom koraku. Ovaj izraz obuhvata sirovi oblik supematanta (kako je izolovan iz ćelija) kao i konccntrisani i/ili filtrirani i/ili ultrafiltrirani supematant.

Termin "biološka aktivnost" vezan za aktivnost FSH, odnosi se na sposobnost FSH formulacije da izazove biološke odgovore udružene sa FSH, kao što je povećanje težine ovarijuma kod Steelman-Pohley-evog eseja [Esej hormona koji stimuliše folikule zasnovan na augmentaciji sa humanim horionskim gonadotropinom; Endocrinology; 1953, 53,604-616], ili rast folikula kod pacijentkinja. Rast folikula se kod pacijentkinja može proceniti uz pomoć ultrazvuka, na primer, u smislu broja folikula koje imaju srednji prečnik od oko 16 mm 8. dana stimulacije. Biološka aktivnost se procenjuje u odnosu na prihvaćeni standard za FSH.

Sadržaj LH u nekom preparatu FSH može se izmeriti, na primer, upotrebom LH-specifičnog imunoeseja, kao što jc Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finland).

Termin "specifična aktivnost" u vezi sa FSH, označava biološku aktivnost u IJ ovog preparata u nekom priznatom biološkom eseju za FSH, kao što je Steelman Pohley-jev bioesej [podeljeno količinom proteina, koja se određuje nekim esejom za ukupni sadržaj proteina, kao što je Lowry-jev esej [O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr i R.J. Ranđall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J.R. Dulley i P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64:136], Bradfordov esej [Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248] ili apsorbancom na 280 nm.

Preferentno, FSH dobijen ovim pronalaskom ima specifičnu aktivnost veću kod oko 8000 IJ/mg, preferentnije veću od oko 9000 IJ/mg, Čak preferentnije veću od oko 10000 IJ/mg, čak preferentnije od oko 14000 IJ/mg što je naznačeno time da se biološka aktivnost meri Steelman-Pohley-jevim bioesejom a sadržaj proteina se meri uz pomoć SE-HPLC

Uzorci FSH se mogu analizirati po pitanju njihove čistoće u različitim stadijumima ove procedure, upotrebom na primer, tehnika kao što su one dole navedene:

r-hFSH kvantifikacija/slobođna alfa podjedinica/ćistoća / oksidirani oblici: RP-HPLC

Kako je gore pomenuto, FSH je heterodimemi glikoprotein, koji se sastoji od a i P podjedinice. Može doći do određene disocijacije podjedinica, a to se može pratiti posmatranjem količine slobodnih ot-podjedinica prisutnih u jednom uzorku. Osim toga, FSH podjedinice mogu da podlegnu oksidaciji. Oksidirane kontaminante mogu da se kvantifikuju primenom RP-HPLC, dok se slobodne podjedinice mogu proceniti uz pomoć SDS-PAGE.

Kvantifikacija r-hFSH: Imunoesej

Sadržaj FSH se može odrediti u nekom uzorku upotrebom imunoesej a specifičnog za FSH, kao stoje DELFIA FSH imunoesej.

Ukupni protein: Bradford esej, Lowry Esej, Apsorbanca na 280 nm

Kao i bilo koji drugi proteinski preparat, ukupni sadržaj proteina se može odrediti upotrebom tehnika kao što su Bradford esej, Lowry esej ili apsorbancom na 280 nm. Obrazac izoforma: 1EF

Kako je gore pomenuto, FSH je glikoprotein koji ima višestruke ostatke oligosaharida spojene na različitim mestima na obe podjedinice. Ovi ostatci oligosaharida mogu da se granaju u različitom stepenu i mogu biti kapirani ostatcima sijalinske kiseline. Ostatci sijalinske kiseline su negativno naelektrisani (pri neutralnoj pll). Razlike u kapiranju dovode do heterogenosti, sa mešavinom vrsta koje imaju različite izoelektrične tačke (pl). Ovo se može proceniti upotrebom tehnike koja vrši separaciju po naelektrisanju, kao što je izoelektrično fokusiranje (IEF)

Protein ćelija domaćina (HCP)

Protein ćelija domaćina se može analizirati upotrebom ELISA eseja. Na primer, antitela se mogu odgajiti na "maketi kulture", što je kultura ćelija domaćina bez FSH gena.

PRIMERI

Ovaj pronalazak će sada biti ilustruvan sa dva primera.

Odgovarajući dijagami toka koji ilustriju pomenuta dva primera data su na Slici 1 i 2. Dobijeni purifikovani r-hFSH je nazvan "rasuti r-hFSH".

PRIMER 1 (cf Slika 1)

Korak CO: Afinitetna hromatografiia sa preboiavanjem na Blue Sepharosi

Početni FSH materijal za purifikaciju pripremljen je iz ubranih ćelja iz kulture koje sadrže rckombinantni FSH, tj. FSH koji je proizveden rekombinantno uz ćelija CHO bilo u medijumu sa serumom ili bez seruma. Afinitetna hromatografija sa kolonom za prebojavanje (Blue Sefaroza FF smola) je prvo ekvilibrisana puferom niske provodljivosti na pH 8.5 koji sadrži L-metionin. Tečnost koja sadrži FSH je potom direktno naneta na smolu. Posle unošenja, nevezani materijal je ispran upotrebom pufera za ekvilibraciju. FSH je na kraju eluiran ispiranjem kolone puferom od natrijum fosfata na pH 7.0, koji sadrži NaCI i L-metionin. Pul za eluciju je direktno obrađen do narednog koraka. Ovaj korak je sproveden na 2-8°C.

Korak (2): Hromatografiia sa hidrofobnom reakcijom (HIC) na Tovopearl Butil 650M

Eluat Blue Sefaroze FF iz koraka (1) je nanet na Toyopearl Butil 650M kolonu ekvilibrisanu sa natrijum fosfatnim puferom, pH 7.0, koji sadrži amonijum sulfat i L-metionin. Nevezani materijal je ispran puferom za ekvilibraciju. FSH eluiran istim puferom ali sa smanjenom koncentracijom amonijum sulfata. Ovaj eluat je obrađen u narednom koraku. Ovaj korak je urađen na sobnoj temperaturi (RT)

Korak (3): Obrnuta faza na Source 30 RPC

HIC eluat (iz koraka (2)) je prvo kondicioniran dodavanjem IPA (izopropanol). Source 30RPC kolona je ekvilibrisana amonijum acetatnim puferom, pFI 7.6, koji sadrži L-metionin, i 2-propanol u koncentraciji koja je ekvivalentna onoj koju ima kondicionirani uneti materijal. Posle ispiranja nevezanog materijala puferom za ekvilibraciju, smola je isprana amonijum acetatnim puferom, pH 7.6, koji sadrži L-metionin, i povećanu koncentraciju 2-propanola. FSH je na kraju eluiran daljim povećavanjem koncentracije 2-propanola. Elucioni pul je na kraju razblažen uz mešanje vodom koja sadrži L-metionin. Ovaj razblaženi pul je prerađen u naredni korak. Ovaj korak se obavlja na sobnoj temperaturi (RT).

Ukoliko se poštuje gore navedena procedura, faktor purifikacije - tj. odnos čistoće FSH u purifikovanom uzorku u odnosu na čistoću FSH u početnom materijalu (sirovi FSH) - iznosi oko 40.000.

PRIMER 2 (cf Slika 2)

Korak (-1): Ultrafiltraciia/Diiafiltraciia koncentrisanog r-hFSH

Sve operacije su obavljene u rashlađenim uslovima (2-8°C). Sirovi FSH koji čini početni materijal za purifikaciju izveden je iz urbane ćelijske kulture koja sadrži rekombinantni FSH.

Klarifikacija

Sirovi r-hFSH je prvo filtriran preko filtera od 0.5 um (kao što su Pali Profile II filteri ili ekvivalentni).

Ultrafiltracija

Klarifikovani sirovi materijal je prvo koncentrisan ultrafiltracijom upotrebom polieter sulfomske membrane od 10KD. Koncentrisani retentat je potom dijafiltriran kroz najmanje 5 dijavolumena boratnog pufera, pFI 8.5 koji sadrži L-metionin kao antioksidans. Provodljivost i pH ovog retentata su merene kako bi se pratilo napredovanje đijafiltracije. Retentat je zatim dalje koncentrisan pre drenaže sistema. Aparat za ultra-filtraciju je na kraju ispran puferom za dijafiltraciju a tečnost preostala posle ispiranja je pomešana sa dobijenim retentatom. Ovaj pul je prebačen u naredni korak.

Filtracija

Koncentrisani produkt je filtriran preko polieter sulfonskog filtera od 0.2 um (ili ekvivalentnog).

Korak (0); Izmena aniona na O Sefarozi FF

Filtrirani materijal je potom nanet na snažnu smolu za izmenu anjona (Q-sefaroza FF) koja je ekvilibrisana sa natrijum boratnim puferom, pH 8.5, koji sadrži L-metionin. Posle unošenja, kolona je isprana puferom za ekvilibraciju kako bi se isprao sav nevezani materijal. Kolona je tada eluirana natrijum boratnim puferom pH 8.5, koji sadrži NaCI (kako bi se povećala provodljivost) i L-metionin (kao antioksidans). Elucija prikupljenog pula je obrađena afinitetnom hromatografijom sa prebojavanjem.

Korak (1): Dve afinitctna hromatografija na Blue Sefarozi

Afinitetna hromatografija sa prebojavanjem sa kolonom (Blue Sefaroza FF smola) je prvo ekvilibrisana puferom za eluciju iz koraka sa Q-Sefarozom FF. Uhvaćeni eluat je potom direktno nanet na ovu smolu. Posle unošenja, nevezani materijal je ispran primenom ekvilibracije pufera. FSH je na kraju eluiran ispiranjem kolone sa natrijum fosfatnim puferom na pH 7.0 koji sadrži NaCI i L-metionin. Elucioni pul je direktno prerađen u naredni koral Ovaj korak je sproveden na 2-8°C.

Korak (2): Hromatografija sa hidrofobnom interakcijom na Tovopearl Butil 650M

Eluat Blue sefaroze FF je unet u kolonu sa Toyopearl Butil 650M koja je ekvilibrisana natrijum fosfatnim puferom, pH 7.0, koji sadrži amonijum i L-metionin. Nevezani materijal je ispran puferom za ekvilibraciju. FSH je eluiran istim puferom, ali sa smanjenom koncentracijom amonijum sulfata. Ovaj eluat je prerađen u naredni korak. Ovaj korak je sproveden na sobnoj temperaturi (RT).

Korak (3): Obrnuta faza na Source 30 RPC

HIC eluat (iz koraka (2)) je prvo kondicioniran dodavanjem IPA (izopropanol). Kolona Source 30RPC je ekvilibrisana amonijum acetatnim puferom, pH 7.6, koji sadrži L-metionin i 2-propanol u koncentraciji koja je ekvivalentna koncentraciji kondicioniranog unetog materijala materijal. Posle ispiranja nevezanog materijala puferom za ekvilibraciju, ova smola je ispirana amonijum acetatnim puferom, pH 7.6, koji sadrži L-metionin i povećanu koncentraciju 2-propanola. FSH je na kraju eluiran daljim povećavanjem koncentracije 2-propanola. Ovaj elucioni pul je na kraju razblažen uz mešanje, vodom koja sadrži L-metionin. Razblaženi pul je prerađen u naredni korak. Ovaj korak je sproveden na sobnoj temperaturi (RT).

Korak (4) hromatografiia sa izmcnom koia na Fractogel EMP TMAE hicap smoli

Kolona sa Fractogel EMD TMAE hicap je prvo ekvilibrisana natrijum boratnim puferom, pH 8.5, koji sadrži L-metionin. Razblaženi post-RPC materijal (iz koraka (3) je nanet na kolonu. Nevezani materijal je ispran upotrebom ekvilibracionog pufera. FSH eluiran iz kolone povećava koncentraciju soli na linearan način. Ovaj korak je sproveden na 2-8°C.

Korak (4*) Nanofiltraciia

Ovaj eluat iz koraka sa Fractogel EMD-TMAE (4) je nanet direktno na uređaj za nanofiltraciju od 20nm pod pritiskom od 3 bara u uslovima azota. Ovaj filtrat je obrađen do narednog koraka. Operacija je obavljena na 2-8°C.

Korak (51 Ultrafiltraciia rasute supstance

Nanofiltrirani FSH materijal je koncentrisan filtracijom sa tangencijalnim protokom na polieter sulfonskoj membrani od 5KD. Kada je ovaj retentat dostigao oko jedne polovine inicijalne zapremine, materijal je zamenjen puferom dijafiltracijom sa WFI.

Čistoća uzoraka

Određena je čistoća uzoraka FSH posle koraka purifikacije:

Biološka aktivnost uzoraka

Biološka aktivnost purifikovanog r-hFSH je merena primenom Steelman-Pohley-jeve metode povećanja težine ovarijuma. Specifična aktivnost je izračunata upotrebom biološke aktivnosti koja je podeljena sa sadržajem FSH koji je određen uz pomoć SE-HPLC metode, kako je dole opisano.

Specifičnu aktivnost finalnog dobijenog proizvoda u rasutom stanju je tipično između lO'OOO to 17'000 IJ/mg. Egzemplarne vrednosti 2 uzorka finalnog FSH u rasutom stanju dobijenog primenom metoda iz Primera 2 date su na Tabeli 1.

Tabela 2. Specifična aktivnost rasutog purifikovanog rhFSH iz ovog pronalaska

Claims (24)

1. Metoda za purifikaciju rekombinantnog FSH ili neke varijante FSH koja podrazumeva podvrgavanje tečnosti koja sadrži FSH: (1)    afinitetnoj hromatografiji sa prebojavanjem; (2)    hromatografiji sa hidrofobnom reakcijom; i (3)    hromatografiji obrnute faze; koje se mogu primeniti po bilo kom redosledu.

2.    Metoda iz zahteva 1, što je naznačeno time da se afinitetna hromatografija sa prebojavanjem iz koraka (1) sprovodi sa nekom smolom koja ima imobilisani Cibacron Blue F3G-A.

3.    Metoda iz zahteva 1 ili 2, što je naznačeno time daje smola koja je korišćena za afinitetnu hromatografiju sa prebojavanjem iz koraka (1) Blue Sefaroza FF.

4.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 do 3, što je naznačeno time da se afinitetna hromatografija sa prebojavanjem iz koraka (1) sprovodi uz upotrebu pufera od natrijum fosfata na pH oko 6.5 do 11.5 kao eluenta.

5.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 do 4, što je naznačeno time da se hromatografija sa hidrofobnom reakcijom (HIC) iz koraka (2) se sprovodi primenom Toyopearl Butil 650M, ili neke smole koja ima slične karakteristike.

6.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 do 5, što je naznačeno time da se hromatografija sa hidrofobnom reakcijom iz koraka (2) sprovodi uz pomoć natrijum fosfata / amonijum sulfata kao eluenta.

7.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 do 6, što je naznačeno time da se korak hromatografije obrnute faze iz koraka (3) sprovodi upotrebom Source 30 RPC kao smole.

8.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 to 7, što je naznačeno time da se korak obrnute faze hromatografija iz koraka (3) se sprovodi sa upotrebom amonijum acetata sa 2- propanolom kao eluentom.

9.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 to 8, što je naznačeno time da se koraci sprovede sledećim redosledom: (1)    afinitetna hromatografija sa prebojavanjem; (2)    hromatografija sa hidrofobnom reakcijom; i zatim (3)    hromatografija obrnute faze.

10.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 do 9, što uključuje i korak hromatografije sa izmenom anjona (0).

11.    Metoda iz zahteva 10, stoje naznačeno time da se korak hromatografije sa izmenom anjona sprovodi pre koraka(l), (2) i (3).

12.    Metoda iz zahteva 11, što je naznačeno time da se koraci sprovode sledećim redosledom: (0)    hromatografija sa izmenom anjona; (1)    afinitetna hromatografija sa prebojavanjem; (2)    hromatografija sa hidrofobnom reakcijom; i (3)    hromatografija obrnute faze.

13.    Metoda iz zahteva 10,11 ili 12, stoje naznačeno time da se hromatografije sa izmenom anjona iz koraka (0) sprovodi sa smolom Q Sefaroza FF ili Fractogel EMD TMAE HiCap smolom.

14.    Metoda iz bilo kog zahteva od 10 do 13, što je naznačeno time da se hromatografiju sa izmenom jona iz koraka (0) sprovodi upotrebom boratnog pufera kao eluenta.

15.    Metoda iz zahteva 14, što je naznačeno time da boratni pufer ima pH od oko 8.5.

16.    Metoda iz bilo kog zahteva od 10 do 15, koja dalje obuhvata drugi korak hromatografije sa izmenom anjona (4).

17.    Metoda iz zahteva 16, što je naznačeno time da se drugi korak hromatografije sa izmenom anjona iz koraka (4) sprovodi posle koraka (1), (2) i (3).

18.    Metoda iz zahteva 17, što je naznačeno time da se koraci sprovode sledećim redosledom: (0)    Hromatografija sa izmenom anjona; (1)    Afinitetna hromatografija sa prebojavanjem; (2)    Hromatografija sa hidrofobnom reakcijom; (3)    Hromatografija obrnute faze; i (4)    Hromatografija sa izmenom anjona

19.    Metoda iz bilo kog zahteva od 16 do 18, što je naznačeno time da se drugi korak hromatografije sa izmenom anjona iz koraka (4) sprovodi primenom Fractogel EMD TMAE HiCap smole ili Q SefarozaFF smole.

20.    Metoda iz zahteva 16 do 19, što je naznačeno time da se drugi korak hromatografije sa izmenom anjona iz koraka (4) sprovodi uz primenu boratnog pufera i gradijenta povećanja koncentracije NaCI.

21.    Metoda iz bilo kog zahteva od 16 do 20, koja obuhvata korak nanofiltracije (4'), sprovedeni drugi korak hromatografije sa izmenom anjona (4).

22.    Metoda iz zahteva 21, koja obuhvata korak ultrafiltracije (5), posle koraka nanofiltracije (4').

23.    Metoda iz bilo kog zahteva od 1 do 22, stoje naznačeno time da bilo koji eluent i/ili pufer može da sadrži neki antioksidans, posebno L-metionin.

24. Metoda za purifikaciju humanog rekombinantnog FSH koji uključuje korake podvrgavanja FSH: (-1) ultrafiltraciji; (0) hromatografiji sa izmenom anjonanaQ Sefarozi FF sa boratom /NaCl, i L- metioninom sa pll od oko 8.5 kao eluentom; (1) Podvrgavanje eluata iz koraka (0) koraku afmitetne hromatografija sa prebojavanjem na Blue Sefarozi FF i sa fosfatom, NaCI, L-metioninom, na pH od oko 7 kao eluenata; (2) podvrgavanje eluata iz koraka(l) koraku hromatografije sa hidrofobnom reakcijom na Toyopearl Butil 650M, sa fosfatom, amonijum sulfatom, L-metioninom na pH of od oko 7 kao eluenta; (3) podvrgavanje eluata iz koraka (2) koraku hromatografije obrnute faze na Source 30 RPC sa amonijum acetatom, L-metioninom, sa 2-propanolom na pH oko 7.6 kao eluenta; (5) podvrgavanje eluata iz koraka (3) koraku hromatografije sa izmenom anjona na Fractogel (6) EMD TMAE hicap smoli, sa boratom, L-metioninom, na pH od ili oko 8.5 i NaCI; (4’) podvrgavanje eluata iz koraka(4) koraku nanofiltracije i (7) Podvrgavanje permeata iz koraka (4*) koraku ultrafiltracije.