ME00548B - Korišćenje inhibitora il-18 za liječenje i/ili prevenciju perifernih vaskularnih bolesti - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu inhibitora IL-18 za pripremu leka za lečenje i/ili prevenciju perifernih vaskularnih bolesti. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu nekog inhibitora IL-18 za prevenciju amputacije ekstremiteta.

Description

POLJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak je iz domena vaskularnih bolesti. Preciznije, on se odnosi na upotrebu inhibitora IL-18 za lečenje i/ili prevenciju perifernih vaskularnih bolesti. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu nekog inhibitora IL-18 za prevenciju amputacije.

STANJE TEHNIKE -

Citokin interleukin 18 (IL-18) je inicijalno opisan kao faktor indukcije interferona-y (IFN-y) (Nakamura et al., 1989). On predstavlja rani signal u razvoju odgovora helper ćelija tipa 1 T limfocita. IL-18 deluje zajedno sa IL-12, IL-2, antigenima, mitogenima i eventualno nekim drugim faktorima i izaziva produkciju IFN-γ. IL-18 takođe pojačava produkciju GM-CSF i IL-2, potencira proliferaciju T ćelija indukovanih sa anti-CD3 i povećava ubijanje prirodnih ćelija ubica posredovano sa Fas.

Zreli IL-18 se proizvodi iz prekursora uz pomoć enzima koji vrši konverziju IL-1β (ICE, kaspaza-1).

Receptor IL-18 se sastoji od najmanje dve komponente IL-18R alfa i IL-18R beta, koji sarađuju u vezivanju liganda. Visoko - i nisko afinitetna mesta vezivanja za IL-18 su nađena kod mišjih T-ćelija stimulisanih sa IL-12 (Yoshimoto et al., 1998), što ukazuje na kompleks receptora sa više lanaca. Dve receptorske podjedinice koje su do sada identifikovane obe pripadaju porodici IL-1 receptora (Pamet et al., 1996; Kim et al., 2001). Transdukcija signala IL-18 podrazumeva aktivaciju NF-kB (DiDonato et al., 1997). Kompleks IL-18 receptora se sastoji od dva lanca receptora: lanca koji vezuje Ugande koji se naziva IL-18Rα lanac i lanca koji vrši transdukciju signala koji se naziva IL-18RB lanac. IL-18R alfa lanac je inicijalno izolovan kao protein na površini ćelija koji se vezuje za radiobeleženi IL-18; ovaj protein je purifikovan a njegova sekvenca amino kiselina je otkrila da je identična kao i prethodno zabeležen pojedinačni receptor koji je nazvan srodan sa proteinima IL-1 R (IL-1 Rrp) (Torigoe et al., 1997).

U novije vreme je iz ljudskog urina izolovan rastvorljivi protein koji ima visok afinitet za IL-18, a humana i mišja cDNK kao i humani gen su klonirani (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Ovaj protein je označen kao protein koji vezuje IL-18 (IL-18BP).

IL-18BP nije ekstracelularni domen jednog od poznatih IL18 receptora, već je to sekretovan prirodno cirkulišući protein. On pripada jednoj novoj porodici sekretovanih proteina koja uključuje i nekoliko proteina koje kodira Poxvirus. (Novick et al., 1999). Urinarni kao i rekombinantni IL-18BP specifično vezuju IL-18 sa visokim afinitetom i modulišu biološki afinitet IL-18.

Gen IL-18BP je lokalizovan u humanom hromozomu 11 q13, i nijedan ekson koji kodira transmembarnski domen nije nađen u 8. 3kb genomskoj sekvenci. Do sada je kod ljudi nađeno četiri povezane varijante ili izoforma IL-18BP koje su dobijene alternativnim povezivanjem mRNK. One su označene kao IL-18BP a, b, c i d, i sve dele isti N-terminus a razlikuju se po C-terminusu (Novick et al, 1999). Ovi izoformi se razlikuju po njihovoj sposobnosti vezivanja IL-18. Od ove četiri varijante, za hlL-18BP izoforme a i c se zna da imaju neutrališuću sposobnost za IL-18. Humani IL-18BP isoform se vezuje sa mišjim IL-18.

Periferni vaskularni poremećaji mogu biti arterijski (okluzivni ili funkcionalni), venski, kombinovani arteriovenski (npr. arteriovenska fistula), ili limfatički. Okluziva bolest arterija obuhvata perifernu arterijsku okluziju i Buergerovu bolest koja se takođe naziva thromboangiitis obliterans. Funkcionalni arterijski poremećaji mogu biti vazospastični (Raynaudov fenomen i bolest, akrocijanoza) ili vazodialtorni (eritromegalija). Oni mogu biti posledica lokalnog oštećenja krvnih sudova ili poremećaja aktivnosti simpatetičkog nervnog sistema, ili mogu da prate organsko vaskularno oboljenje. Venske bolesti obuhvataju vensku trombozu i varikozne vene, kombinovani arteriovenski poremećaji obuhvataju arteriovensku fistulu a limfatički poremećaji obuhvataju limfedem i lipedem.

Okluzija perifernih arterija se odnosi na okluziju dotoka krvi u ekstremitete, generalno usled aterosklerotičnih plakova (ateroma), tromba ili embolije.

Okluzija perifernih arterija može da dovede do akutne ili hronične ishemije. Akutnu ishemiju izaziva ruptura proksimalnog aterosklerotskog plaka, akutna tromboza prethodno postojeće aterosklerotične bolesti, embolija iz srca, aorte ili drugih velikih krvnih sudova ili disekcija aneurizme. Hroničnu ishemiju izaziva postepeno povećavanje ateromatoznog plaka.

Produženo povišenje hemocisteina u krvi usled oštećenja endotelijalnih ćelija predstavlja predispoziciju za prevremenu aterosklerozu aorte i njenih ogranaka, perifernih arterija, cerebralnih arterija i eventualno koronarnih arterija, lako su nivoi homocisteina obično povišeni u vezi sa drugim faktorima rizika, njih može da modifikuje ishrani kao i nadoknada B vitamina.

Klinički sindromi okluzije arterija zavise od zahvaćenog krvnog suda, obima opstrukcije, brzine progresije okluzije kao i od toga da li je kolateralni protok adekvatan.

Istorija akutne okluzije obuhvata i iznenadno javljanje jakog bola, hladnoće, utrnulosti i bledila datog ekstremiteta. Ekstremitet je hladan i bled, nema pulseva distalno od opstrukcije. Akutna okluzija može da izazove tešku ishemiju koja se manifestuje senzornim i motornim deficitom i na kraju (posle 6 do 8 h) bolnu induraciju mišića pri palpaciji.

Kod hronične okluzije, simptomi su u vezi sa podmuklim razvojem ishemije tkiva. Inicijalni simptom je intermitetntna klaudikacija. Simptomi klaudikacije su bol, grčevi, osećaj umora koji se javlja pri hodanju. Ovi simptomi se najčešće javljaju u listu ali mogu se javiti i na stopalima, butinama, kukovima ili gluteusima.

Na kraju, ishemični bol može da se javi pri mirovanju, počinjući u najdistalnijim delovima ekstremiteta kao jak bol koji ne popušta i koji se pogoršava podizanjem ekstremiteta i često onemogućava spavanje.

Nivo okluzije arterija i lokacija intermitentne klaudikacije su u bliskoj korelaciji, npr. aortoilijačna bolest često izaziva klaudikaciju gluteusa, kukova i listova a femoralni pulsevi su smanjeni ili odsutni. Kod femoropoplitealne bolesti, klaudikacija je tipična i listovima a svi pulsevi ispod femoralnog su odsutni. Kod pacijenata sa oboljenjem malih krvnih sudova (npr. thromboangiitis obliterans, diabetes mellitus), femoropoplitealni pulsevi mogu biti prisutni dok su pulsevi u stopalima odsutni. Bledilo zahvaćenog stopala posle 1 do 2 min elevacije posle čega sledi crvenilo pri oslanjanju pomaže da se potvrdi arterijska insuficijencija. Vreme venskog punjenja pri oslanjanju posle elevacije je duže od normalne granice od 15 sekundi. Ukoliko se simptomi klaudikacije jave uz dobre distalne pulseve, treba razmotriti spinalnu stenozu kao moguću diferencijalnu dijagnozu.

Stopalo zahvaćeno teškom ishemijskom je bolno, hladno i često utrnulo. U hroničnim slučajevima koža može biti suva i da se peruta uz slab rast noktiju i malja, sa pogoršanjem ishemije mogu se javiti ulceracije (tipično na prstima ili peti a ponekad na nozi), posebno posle lokalne traume. Edema obično nema osim ukoliko pacijent nije držao nogu u oslonjenom položaju radi ublažavanja bolova, međutim noga zahvaćena teškom ishemijom može biti atrofična. Ekstenzivnija okluzija može da ugrozi vijabilnost tkiva, što dovodi do nekroze ili gangrena. Ishemija sa crvenilom, bolom, otokom stopala pri oslanjanja može da simulira celulitis ili vensku insuficijenciju. Arterijski neinvazivni testovi mogu da razjasne dijagnozu.

Kao periferna vaskularna bolest, Buergerova bolest (Thromboangiitis Obliterans) je obliterativna bolest koju karakterišu inflamatorne promene na arterijama i venama srednje veličine.

Buergerova bolest se javlja kod pušača, pretežno kod muškaraca starih 20 do 40 godina. U samo 5% slučajeva javlja se kod žena. Učestalost cijanoze se značajno povećala tokom poslednjih godina zbog boljeg razumevanja kliničkih i angiografskih karakteristika ove bolesti u odnosu na arteriosclerosis obliterans.

lako uzrok nije poznat, Buergerova bolest nije dokumentovana kod nepušača, što ukazuje da je pušenje primarni etiološki faktor, možda u vidu odloženog tipa preosetljivosti ili toksičnog anginitisa. Thromboangiitis obliterans može da bude reakcija na duvan osoba sa specifičnim fenotipom zbog veće prevalencije HLA-A9 i HLA-B5 kod osoba sa ovom bolešću; ili usled autoimunog poremećaja sa ćelijski posredovanom senzitivnošću na humani kolagen tipa I i III, koji predstavljaju sastavne delove krvnih sudova.

Za razliku od ateroskleroze, Buergerova bolest ne zahvata koronarne arterije.

Ova bolest zahvata male i srednje arterije a često i površinske vene ekstremitete po segmentnom obrascu. Retko, kod uznapredovale bolesti bivaju zahvaćeni i krvni sudovi u drugim delovima tela. Patološki izgled je poput onoga kod nesupurativnog panarteritisa ili tromboze zahvaćenih krvnih sudova. Proliferacija endotelijalnih ćelija i infiltracija intime limfocitima javlja se kod akutne lezije, ali unutrašnji elastični slojevi su intaktni. Tromb postaje organizovan i kasnije se nekompletno rekanališe. Tunica media je dobro očuvana ali mogu je infiltrirati fibroblasti. Obzirom da je adventicija obično ekstenzivnije infiltrirana fibrobalsitma, starije lezije ispoljavaju periarterijsku fibrozu, koja takođe može da zahvati i obližnje vene i nerve.

Simptomi i znaci su isti kao i oni kod arterijske ishemije i superficijalnog tromboflebitisa. Javljanje je postepeno i počinje u najdistalnijim delovima krvnih sudova i napreduje proksimalno, kulminirajući distalnom gangrenom. Pacijent može da se žali na hladnoću, utrnulost, mravinjanje ili pečenje pre nego što se jave objektivni dokazi o bolesti. Raynaudov fenomen je čest. Intermitentna klaudikacija se javlja na zahvaćenom ekstremitetu (obično na luku stopala ili na nozi, ali retko na šaci, ruci ili butini). Sa težinom ishemije bol postaje perzistentan, npr. kod pregangrenoznog stanja i sa ulceracijom ili gangrenom. Često se prekomerna aktivnost simpatetičkih nerava manifestuje u vidu hladnoće, prekomernog znojenja, cijanoze zahvaćenog ekstremiteta koje verovatno izaziva jak, perzistentan bol.

Ishemijska ulceracija i gangrena, obično na jednom ili više prstiju, mogu da se jave u ranoj fazi bolesti ali nisu akutni. Neinvazivne studije su pokazale teško smanjenje protoka krvi i pritiska u zahvaćenim nožnim prstima, stopalima i prstima. Bolest napreduje proksimalno.

Još jedno periferno vaskularno oboljenje je bolest perifernih arterija, kod koje kod pacijenata sa oboljenjem perifernih arterija donjih ekstremiteta (PAD) može da dođe do progresije teške ishemije koja ugrožava zahvaćeni ekstremitet. Ishemični bol pri mirovanju, ulceracije koje ne zarastaju i gangrena su sve nagoveštaji loših ishoda. Kod ovih pacijenata postoji visok rizik od gubitka ekstremiteta. Brzo otkrivanje i evaluacija teške ishemije ekstremiteta i potom brza revaskularizacija su neophodne da bi se ekstremitet spasao i sačuvalo opšte zdravlje.

Hronična kritična ishemija ekstremiteta je krajnji rezultat okluzivnog oboljenja arterija, najčešće ateroskelroze. Osim ateroskelroze vezane za hipertenziju, hiperholesterolemiju, pušenje i dijabetes, redi uzroci hronične kritične ishemije ekstremiteta obuhvataju Buergerovu bolest ili thromboangiitis obliterans i neke oblike arteritisa.

Razvoj hronične kritične ishemije ekstremiteta obično podrazumeva više mesta sa opstrukcijom arterija koja teško smanjuje protok krvi do tkiva. Kritična ishemija tkiva se klinički manifestuje u vidu bola pri mirovanju, rana koje ne zarastaju (zbog povećanih metaboličkih zahteva zarastanja rana) ili nekrozom tkiva (gangrena).

Ishemični bol pri mirovanju se klasično opisuje kao bolno pečenje jastučića na stopalu i prstima koje se pogoršava noću dok je pacijent u krevetu. Ishemični bol pri mirovanju je lokalizovan na stopala gde je tkivo najudaljenije od srca i distalno od arterijskih okluzija. Rane koje ne zarastaju se obično nalaze na delovima stopala izloženim traumama zbog neudobne obuće ili povredama. Generalno se smatra da rana ne zarasta ukoliko ne reaguje na konzervativnu terapiju u trajanju od 4-12 nedelja koja podrazumeva redovnu promenu zavoja, izbegavanje trauma, lečenje infekcije i uklanjanje nekrotičnog tkiva.

Gangrena se obično pojavljuje na prstima stopala. Ona nastaje onda kada je dotok krvi tako mali da dolazi do spontane nekroze u najslabije prokrvljenim tkivima.

lako pažljivo planirana konzervativna terapija može da pomogne mnogim pacijentima sa kritičnom ishemijom ekstremiteta, teška priroda njihove bolesti može da dovede to toga da se operativna intervencija uzme u obzir. Hirurške intervencije obuhvataju revaskularizaciju ili amputaciju. Ukoliko pacijent želi da se podvrgne revaskularizaciji i ukoliko je prihvatljiv kandidat za operaciju, često se vrši arteriografija kako bi se izvršila dodatna procena i planirala revaskularizacija. U nekim centrima se koristi angiografija uz pomoć magnetne rezonance kao alternativna ili dopunska metoda za arteriografiju kako bi se na minimum sveo rizik od izlaganja bojama. Očuvanje ekstremiteta uz pomoć revaskularizacije je ekonomično, dovodi do boljeg kvaliteta života kod mnogih pacijenata i udruženo je sa manjim morbiditetom i ono treba da bude cilj kod većine pacijenata sa hroničnom kritičnom ishemijom ekstremiteta.

Izvodljivost revaskularizacije se određuje na osnovu nalaza arteriografije kao i na osnovu raspoloživosti konduita za bajpas. Angioplastika ili plasiranje stenta ili oba ova zahvata najuspešniji su kod kratkih, proksimalnih lezija kao što su one kod pacijenata sa kiaudiakcijom, ali malo je verovatno da to mogu da budu jedini vidovi terapije koji mogu da reše problem sa kritičnom ishemijom ekstremiteta obzirom na višestepenu prirodu okluzivne arterijske bolesti. Idealni bypass konduit je veća safenozna vena dok drugi konduiti uključuju manje safenozne vene, vene na rukama ili protetički konduit. U većini hirurških serija, trogodišnja prohodnost bajpasa arterija lista se kreće od 40 procenata kad je u pitanju protetički bajpas pa do 85 za bajpas od safenozne vene. Radi poređenja, studije vezane za konzervativnu terapiju su pokazale stopu uspeha od 25 do 49 procenata kod rana koje ne zarastaju i stopu od 50 do 80 procenata kod popravljanja ishemijskog bola pri mirovanju.

Primarna amputacija može biti indikovana kod određenih pacijenata, kao što su oni sa ekstenzivnom nekrozom tkiva, infekcijama ili lezijama koje su opasne po život a nisu pogodne za revaskularizaciju. Odluka o tome da se stanje pacijenta pažljivo prati i sačeka razvoj događaja i preduzme konzervativno zbrnjavanje ili da se izvrši revaskularizacija ili amputacija zavisi od pažljive praćene i prisutnih rizika i koristi od hirurškog zahvata u odnosu na konzervativno zbrinjavanje.

Još važnije, ona zavisi od stava pacijenata prema invazivnosti i adekvatnosti raspoloživih opcija. Čak i pacijenti koji nisu u stanju da hodaju zbog njihovog stanja mogu da smatraju da je amputacija neodgovarajuća, i nisu svi pacijenti motivisani da urade sve što je neophodno za rehabilitaciju posle amputacije. Ukoliko se donese odluka da se izvrši amputacija, nivo amputacije treba da bude takav da postoji najveća verovatnoća da će doći do zarastanja uz istovremeno davanje maksimalnih šansi pacijentu za funkcionalnu rehabilitaciju.

Dijagnoza hronične kritične ishemije ekstremiteta uključuje manifestni bol pri mirovanju, rane koje ne zarastaju i gangrenu. Ishemični bol pri mirovanju se tipično opisuje kao bolno pečenje na svodu ili distalnom delu stopala koje se javlja dok pacijent leži a nestaje kada se pacijent vrati u položaj u kome je stopalo oslonjeno. Objektivni hemodinamski parametri koji potkrepljuju dijagnozu kritične ishemije ekstremiteta uključuju zglobno-brahijalni indeks od 0. 4 ili manji, sistolni pritisak na zglobu od 50 mm Hg ili manji, ili sistolni pritisak na nožnim prstima od 30 mm Hg ili manji. Intervencija može da uključuje konzervativnu terapiju, revaskularizaciju ili amputaciju. Progresivna gangrena, rane koje se brzo povećavaju ili kontinuiran ishemični bol pri mirovanju mogu da ukazuju na ugroženost ekstremiteta i potrebu za revaskularizacijom kod pacijenata bez operativnih rizika koji to zabranjuju. Graftovi za bajpas su obično potrebni zbog višeslojnosti i distalne prirode arterijskog suženja kod kritične ishemije ekstremiteta. Kod pacijenata sa dijabetesom će verovatnije nego kod drugih pacijenata biti prisutna distalna bolest koja nije pogodna za bajpas graft. U poređenju sa amputacijom, revaskularizacija je ekonomičnija u udružena sa boljim preoperativnim morbiditetom i mortalitetom. Očuvanje ekstremiteta treba da bude cilj kod većine pacijenata sa kritičnim ishemijama ekstremiteta.

Danas, najvažniji vidovi tretmana perifernih vaskularnih bolesti uključuju invazivne tretmane kao što su angioplastika ili čak amputacija ekstremiteta. Otkrivanje lekova koji stimulišu perifernu neovaskularizaciju bez povećavanja progresije aterosklerotičnih plakova ima najveći terapijski značaj u ovoj oblasti medicine.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da inhibitor IL-18 stimuliše neovaskularizaciju posle indukcije periferne ishemije na eksperimentalnom životinjskom modelu. Neovaskularizacija se javila udružena sa aktivacijom VEGF/Akt signalizacije I bila je praćena povećanjem povećanom mobilizacijom i diferencijacijom endotelijalnih progenitorskih ćelija koštane srži.

Na osnovu ovih rezultata obezbeđeni su novi terapijski pristupi u lečenju ili prevenciji perifernih vaskularnih bolesti koji iziskuju neo- ili revaskularizaciju.

Ovaj pronalazak se stoga odnosi na upotrebu nekog inhibitora IL-18 za lečenje i/ili prevenciju perifernih vaskularnih bolesti, posebno periferne ishemije.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu nekog inhibitora IL-18 u proizvodnji leka za lečenje i/ili prevenciju kiaudikacije i gangrene.

Takođe, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu nekog inhibitora IL-18 u proizvodnji leka za prevenciju amputacije, posebno amputacije ekstremiteta.

Upotreba vektora ekspresije koji čini kodirajuću sekvencu nekog inhibitora IL-18, kao i upotreba vektora ekspresije za indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije nekog inhibitora IL-18 u ćeliji, za lečenje ili prevenciju perifernih vaskularnih bolesti takođe spada u ovaj pronalazak.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja perifernih vaskularnih bolesti koja podrazumeva primenu efektivne inhibirajuće količine nekog inhibitora IL-18 domaćinu kome je on potreban.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Si. 1: pokazuje A) Reprezentativnu mikroangiografiju desne ishemične i leve neishemične zadnje noge, 3 i 28 dana posle okluzije femoralne arterije miša. B) pokazuje ishemični/ne-ishemični angiografski skor kod miševa tretiranih sa pcDNK3-mlL18BP (IL-18BP) ili praznim plazmdom (Kontrola) tokom 3 ili 28 dana. Ove vrednosti predstavljaju srednje vrednosti ± SEM, n=7 po grupi. **p<0. 01 prema kontrolnim miševima.

SI. 2: pokazuje A) Promene izazvane ishemijom u cirkulaciji zadnjih nogu koje su praćene in vivo uz pomoć laserske Doppler vizualizacije perfuzije kod miševa sa pcDNK3-mlL18BP (IL-18 BP) ili praznim plazmidom (Kontrola). Na snimcima u boji, normalna perfuzija je prikazana crvenom bojom dok je izrazito smanjenje protoka krvi u ishemičnom zadnjem ekstremitetu prikazano plavom bojom. B) Kvantitativna evaluacija protoka krvi izražena u vidu odnosa protoka krvi u ishemičnom ekstremitetu i protoka u neishemičnom ekstremitetu. Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti ± SEM, n=7 po grupi. **p<0. 01 u odnosu na kontrolne miševe.

SI. 3: pokazuje A) Reprezentativnu western-blot analizu sadržaja VEGF proteina u ne-ishemičnoj i ishemičnoj nozi 28 dana posle okluzije femoralne arterije. B) Kvantitativna evaluacija nivoa VEGF proteina izražena u vidu odnosa sadržaja proteina u ishemičnom ekstremitetu i protoka u neishemičnom ekstremitetu.

Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti ± SEM, n=7 po grupi. **p<0. 01 u odnosu na neishemičnu kontrolu i Ϯp<0-05 u odnosu na ishemičnu kontrolu.

SI. 4: pokazuje A) Reprezentativnu vvestern-blot analizu sadržaja fosfo-Akt proteina u ne-ishemičnoj i ishemičnoj nozi, 28 dana posle okluzije femoralne arterije. B) Kvantitativna evaluacija nivoa fosfo-Akt proteina izražena u vidu odnosa sadržaja proteina u ishemičnom ekstremitetu i protoka u neishemičnom ekstremitetu. Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti ± SEM, n=7 po grupi. *p<0. 05, **p<0. 01 u odnosu na neishemičnu kontrolu i Ϯp<0-05 u odnosu na ishemičnu kontrolu.

SI. 5: A) Reprezentativni snimci EPCs (endotelijalne progenitorske ćelije) izolovanih iz koštane srži miševa bez ligature femoralne arterije (Sham) i miševa tretiranih sa pcDNK3-mlL18BP (IL-18BP) ili praznim plazmidom (Kontrola). EPC su okarakterisane kao adherentne ćelije sa dvostruko pozitivnim prebojavanjem na AcLDL-Dil i von-Willebrandov faktor (vWF) B) kvantifikacijom dvostruko pozitivnih ćelija kod miševa tretiranih sa pcDNK3-mlL18BP ili praznim plazmidom. Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti ± SEM, n=5 po grupi. ***p<0. 001, u odnosu na kontrolne miševe, ϮϮϮp<0. 001, u odnosu na miševe bez ligature femoralne arterije (Sham)

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da inhibitori IL-18 značajno povećavaju post-ishemičnu angiogenezu posle ishemije ekstremiteta bez uticaja na gustinu krvnih sudova u ne-ishemičnom ekstremitetu na in vivo mišjem modelu bolesti. Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje novi terapijski pristup lečenju ili prevenciji perifernih vaskularnih bolesti koje iziskuju pojačanu perfuziju tkiva.

To znači da je ovaj pronalazak u vezi sa upotrebom nekog inhibitora IL-18 u proizvodnji leka za lečenje i/ili prevenciju periferne vaskularne bolesti.

Termin “prevencija” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se ne samo na kompletnu prevenciju određenog efekta, već takođe i na parcijalnu ili značajnu prevenciju, slabljenje, smanjenje, umanjenje ili ublaženje tog efekta pre ili u ranoj fazi bolesti.

Termin "tretman” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svaki povoljan efekat na progresiju bolesti, uključujući slabljenje, smanjenje, umanjenje ili nestajanje patološkog razvoja posle javljanja bolesti.

Termin “periferna vaskularna bolest” u smislu u kome je ovde korišćen odnosi se na bolesti ili poremećaje koji utiču na arterije, vene, i limfne sudove ekstremiteta. Periferni vaskularni poremećaji mogu biti arterijski (okluzivni ili funkcionalni), venski, kombinovani arteriovenski (npr., arteriovenska fistula), ili limfatički. Okluziva bolest arterija uključuje okluzije perifernih arterija i thromboangiitis obliterans. Funkcionalni arterijski poremećaji mogu biti vazospastični (Raynaudov fenomen i bolest, akrocijanoza) ili vazodilatorni (eritromegalija). Oni takođe mogu biti posledica lokalnog oštećenja krvnih sudova, ili poremećaja aktivnosti simpatetičkog nervnog sistema, ili mogu da prate organsku vaskularnu bolest. Venske bolesti uključuju vensku trombozu i varikozne vene, kombinovani arteriovenski poremećaji uključuju arteriovenske fistule dok limfatički poremećaji uključuju limfedem i lipedem.

Termin periferna vaskularna bolest ima za cilj da obuhvati sve medicinske indikacije, bolesti, poremećaje ili simptome koji su opisani u "Stanju tehnike” gore.

Termin “inhibitor IL-18” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na bilo koju produkciju IL-18 koji moduliše molekule i/ili aktivnost na način koji dovodi do slabljenja, smanjenja ili delimične, značajne ili kompletno sprečene ili blokirane proizvodnje i/ili aktivnosti IL-18.

Inhibitor proizvodnje može da bude bilo koji molekul koji negativno utiče na sintezu, preradu ili maturaciju IL-18. Takvi inhibitori prema ovom pronalasku mogu biti na primer, supresori genske ekspresije interleukina IL-18, antisens mRNK koje smanjuju ili sprečavaju transkripciju IL-18 mRNK ili dovode do degradacije mRNK, proteini koji onemogućavaju ispravno presavijanje ili delimično ili značajno sprečavaju sekreciju IL-18, proteaze koje dovode do degradacije IL-18, pošto se on sintetiše, inhibitori proteaze koji dovode do cepanja pro-IL-18 kako bi se generisao zreli IL-18, kao što su inhibitori kaspaze-1, i slično.

Inhibitor delovanja IL-18 može biti neki antagonist IL-18, na primer. Antagonisti mogu da se vezuju ili sekvestriraju sam molekul IL-18 sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću za delimičnu ili značajnu neutralizaciju IL-18 ili mesta vezivanja IL-18 odgovorna za vezivanje IL-18 za njegove Ugande, (kao npr. za njegove receptore). Antagonist takođe može da inhibira putanju signalizacije IL-18, koja se aktivira unutar ćelija pri vezivanju IL-18 za njegov receptor.

Inhibitori delovanja IL-18 mogu takođe da budu solubilni IL-18 receptori ili molekuli koji oponašaju receptore ili agensi koji blokiraju receptore IL-18 ili antitela IL-18, kao što su poliklona ili monoklona antitela ili neki drugi agens ili molekul koji sprečava vezivanje IL-18 za njegova ciljana mesta, i na taj način može da umanji ili spreči iniciranje intra- ili extracelularnih reakcija posredovanih preko IL-18.

Prema jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, periferna vaskularna bolest je periferno oboljenje arterija.

“Periferno oboljenje arterija" je poremećaj koji podrazumeva sužavanje arterija na bilo kom delu tela od ruku do aorte kao i arterija nogu. Javljanje bolesti može biti iznenadno ili postepeno i ona generalno dovodi do ishemije (smanjen dotok kiseonika do oblasti koju dati krvni sud snabdeva).

Preferentno, u skladu sa ovim pronalaskom, bolest perifernih arterija se odnosi na donje ekstremitete. Oboljenje perifernih arterija ili okluzija mogu biti hronični ili akutni. Oboljenje perifernih arterija je često udruženo sa klaudikacijom.

Stoga se ovaj pronalazak dalje odnosi na upotrebu nekog inhibitora IL-18 za lečenje i/ili prevenciju klaudikacije. Klaudikacija predstavlja bol u nozi, posebno u listu koji se javlja i nestaje i izaziva hramanje. Klaudikacija se tipično može osetiti pri hodanju i povlači se pri mirovanju. Ona se iz tog razloga često naziva intermitentna klaudikacija. Obično intermitentna priroda bola kod klaudikacije je posledica privremeno neadekvatnog snabdevanja mišića noge kiseonikom. Loše snabdevanje kiseonikom je rezultat sužavanja ili okluzije arterija koje nogu snabdevaju krvlju. To ograničava snabdevanje mišića noge kiseonikom i posebno se oseća kada potrebe ovih mišića za kiseonikom porastu tokom fizičke aktivnosti ili hodanja.

Prema jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, periferna vaskularna bolest je thromboangiitis obliterans (Buergerova bolest). “Buergerova bolest” je obliterativna bolest koju karakterišu inflamatorne promene na malim i srednjim arterijama i venama i ona se često javlja kod pušača, pretežno kod muškaraca starih 20 do 40 godina.

Ova bolest zahvata male i srednje arterije a često i površinske vene na ekstremitetima po segmentalnom obrascu.

Prema još jednom preferentnom konceptu, periferna vaskularna bolest je periferna ishemija, posebno ishemija ekstremiteta. “Ishemija” podrazumeva nedovoljan dotok krvi koji je generalno posledica okluzije ili traume krvnih sudova. “Periferna ishemija” se posebno odnosi na ishemiju ekstremiteta, tj. ruku ili nogu koja dovodi do nedovoljnog snabdevanja kiseonikom odgovarajućeg tkiva ekstremiteta.

Prema još jednom konceptu ovog pronalaska, ishemija ekstremiteta je kritična ishemija ekstremiteta. “Kritična ishemija ekstremiteta” je stanje u kome je snabdevanje ekstremiteta krvlju toliko loše da ugrožava njegovo preživljavanje. Prisustvo bola pri mirovanju, ulceracija ili gangrene ukazuje na kritičnu ishemiju ekstremiteta. Gangrena je termin koji se koristi da bi se opisalo mrtvo tkivo i ona se često javlja kao posledica ili u kombinaciji sa ishemijom ekstremiteta. Neadekvatno snabdevanje krvlju izaziva ishemični ulkus.

Kritične ishemije ekstremiteta, uključujući gangrenu ili ulceracije, iziskuju revaskularizaciju kako bi se sprečila amputacija ekstremiteta. Stoga se ovaj pronalazak takođe odnosi na upotrebu inhibitora IL-18 za lečenje i/ili prevenciju gangrena i ulceracija.

Krajnja posledica periferne vaskularne bolesti, a posebno periferne ishemije, može da bude amputacija zahvaćenog ekstremiteta, posebno zahvaćenog donjeg ekstremiteta ili stopala. Revaskularizacija će dovesti do reperfuzije zahvaćenog tkiva i na taj način će pomoći proces zarastanja.

Stoga, ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu nekog inhibitora IL-18 u proizvodnji leka za prevenciju amputacije ekstremiteta, posebno donjih ekstremiteta, stopala ili nožnih prstiju.

Prema jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je odabran među inhibitorima kaspaze-1 (ICE), antitela uperenih protiv IL-18, antitela usmerenih protiv bilo koje receptorske podjedinice IL-18, inhibitora signalizacione putanje IL-18, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju receptor IL-18, i proteina koji vezuju IL-18, izoforma, muteina, fuzionisanih proteina, funkcionalnih derivata, aktivnih frakcija ili njihovih cirkularno permutovanih derivata koji inhibiraju biološku aktivnost IL-18.

Termin “proteini koji vezuju IL-18” se ovde koristi u istom značenju kao i “protein koji vezuje IL-18” ili “IL18BP". On obuhvata proteine koji vezuju IL-18 koji su definisani u WO 99/09063 ili u Novick et al., 1999, uključujući i isprepletane varijante i/ili izoforme proteina koji vezuju IL-18, kako su definisali Kim et al., 2000, koji se vezuju sa IL-18. Posebno, su korisni humani izoformi IL-18BP a i c u skladu sa ovim pronalaskom. Proteini koji su korisni prema ovom pronalasku mogu biti glikozilirani ili ne-glikozilirani, oni mogu biti izvedeni iz prirodnih izvora kao što je urin, ili se mogu preferentno produkovati rekombinantno. Rekombinantna ekspresija se može sprovesti u sistemima prokariotske ekspresije kao što je E. coli, ili u eukariotskim, a preferentno u ekspresivnim sistemima sisara. Ćelijska loza koja je posebno pogodna za ekspresiju proteina sisara je ćelijska loza ovarijuma kineskih kunića (Chinese Hamster Ovary (CHO).

U smislu u kome je ovde korišćen termin "muteini" on se odnosi na analoge IL-18BP, ili analoge virusnog IL-18BP, u kome je jedan ili više ostataka aminokiselina prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP zamenjeno ostatcima različitih amino kiselina, ili su izbrisani, ili su ostatci jedne ili više amino kiselina dodati u sekvencu prirodnog IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, bez značajne promene aktivnosti dobijenih proizvoda u odnosu na divlji tip IL-18BP ili virusni IL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikama mutageneze usmerenim ka datom mestu ili bilo kojom drugom poznatom tehnikom koja je za to pogodna.

Muteini prema ovom pronalasku uključuju proteine koje kodira neka nukleinska kiselina, kao što je DNK ili RNK, koja se hibridizuje u DNK ili RNK, koja kodira neki IL-18BP ili kodira virusni IL-18BP, kako je opisano u WO 99/09063, pod strogim uslovima. Termin "strogi uslovi" odnosi se na uslove hibridizacije i kasnijeg ispitivanja koje stručnjaci iz ove oblasti obično nazivaju "strogim". Videti Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N. Y., §§6. 3 i 6. 4 (1987, 1992), i Sambrook et al., supra. Bez ograničenja, primeri ovih strogih uslova uključuju uslove ispiranja na 12-20°C ispod izračunate Trn hibrida koji se ispituje u, npr., 2 x SSC i

0. 5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0. 1% SDS tokom 15 minuta; 0. 1 x SSC i 0. 5% SDS na 37°C tokom 30-60 minuta i potom 0. 1 x SSC i 0. 5% SDS na 68°C tokom 30-60 minuta. Stručnjaci iz ove oblasti takođe znaju da strogi uslovi takođe zavise od dužine sekvenci DNK, oligonukleotidnih proba (kao što su baze 10-40) ili mešovitih oligonukleotidnih proba. Ukoliko se koriste mešovite probe, preferentna je upotreba tetrametil amonijum hlorida (TMAC) umesto SSC. Videti gore Ausubel.

Svaki takav mutein preferentno ima sekvencu amino kiselina koja je dovoljno duplikativna kao i ona kod IL-18BP, ili dovoljno duplikativna kao i ona kod virusnog IL-18BP, tako da ima aktivnost koja se može uporediti sa aktivnošću IL-18BP. Jedna od aktivnosti IL-18BP je njegova sposobnost vezivanja IL-18. Sve dok mutein ima značajnu aktivnost vezivanja za IL-18, on se može koristiti u purifikaciji IL-18, kao na primer uz pomoć afinitetne hromatografije i stoga se može smatrati da on ima aktivnost koja je značajno slična aktivnosti IL-18BP. Iz tog razloga se može odrediti da li bilo koji dati mutein ima značajno istu aktivnost kao IL-18BP uz pomoć rutinskih eksperimenata koji podrazumevaju izlaganje tog muteina npr., jednostavnom sendvič kompeticionom eseju kako bi se odredilo da li se on vezuje ili ne vezuje za adekvatno obeleženi IL-18, kao što su radioimunoesej ili ELISA esej.

Prema jednom preferentnom konceptu, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnost ili homolognost sa sekvencom nekog IL-18BP ili virusno-kodiranog homologa IL-18BP, kako je definisano u WO 99/09063. Još poželjnije je da on ima identičnost ili homolognost od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili, što je najpreferentnije, najmanje 90%.

Muteini IL-18BP polipeptida ili muteini virusnog IL-18BPs, koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, ili nukleinska kiselina koja ih kodira, uključuju ograničenu grupu značajno odgovarajućih sekvenci kao što su supstitucioni peptidi ili polinukleotidi koje stručnjak iz ove oblasti može rutinski dobiti bez nepotrebnih eksperimenata, na osnovu teorije i uputstava koja su ovde data.

Preferentne promene muteina u skladu sa ovim pronalaskom su one koje poznajemo kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina polipeptida ili proteina IL-18BP ili virusnog IL-18BPS, mogu da obuhvataju sinonimne aminokiseline u okviru grupe koja ima dovoljno slična fizičko-hemijska svojstva da međusobna supstitucija u okviru članova jedne grupe očuva biološku funkciju molekula. (Grantham, 1974). Jasno je da insercije i delecije amino kiselina mogu da se vrše u gore-definisanim sekvencama bez menjanja njihove funkcije, posebno ukoliko te insercije i delecije obuhvataju samo mali broj amino kiselina npr., manje od trideset, a preferentno manje od deset, i ne uklanjaju ili pomeraju amino kiseline koje su ključne za funkcionalnu strukturu, npr., ostataka cisteina. Proteini i muteini koji se produkuju putem takvih delecija i/ili insercija ulaze u delokrug ovog pronalaska.

Preferentno, sinonimne grupe amino kiselina su one koje su definisane u tabeli 1. Još preferentnije, sinonimne grupe amino kiselina su one definisane u tabeli 2; a najpreferentnije, sinonimne grupe amino kiselina su one definisane u tabeli 3.

TABELA 1

Preferentne grupe sinonimnih amino kiselina

TABELA 2

Preferentnije grupe sinonimnih amino kiselina

TABELA 3

Najpreferentnije grupe sinonimnih amino kiselina

Primeri produkcije supstitucija amino kiselina u proteinima koji se mogu koristiti za dobijanja muteina polipeptida i proteina IL-18BP ili virusnog IL-18BPs, za svrhe ovog pronalaska uključuju korake svih poznatih metoda, kao što su one predstavljene u patentima SAD 4, 959, 314. 4, 588, 585 i 4. 737, 462, Mark et ai: 5, 116, 943 Koths et al., 4, 965, 195 Namen et al; 4, 879, 111 Chong et al; i 5, 017, 691 Lee et al; i proteini sa supstituisanim lizinom prikazani u patentu SAD br. 4, 904, 584 (Shaw et al).

Termin "fuzionisani protein" odnosi se na polipeptid koji čini IL-18BP, ili virusni IL-18BP, ili na neki mutein ili njegov fragment, fuzionisan sa drugim proteinom čiji je npr. boravak u telesnim tečnostima duži. IL-18BP ili virusni IL-18BP, se stoga mogu fuzionisati sa drugim proteinom, polipeptidom ili slično, npr. sa imunoglobulinom ili njegovim fragmentom.

"Funkcionalni derivati" u smislu u kom su ovde korišćeni pokrivaju derivate IL-18BPs ili virusnog IL-18BP, i njihove muteine i fuzionisane proteine, koji se mogu pripremiti iz funkcionalnih grupa koje se javljaju kao bočni lanci na ostatcima ili na N- ili C-terminalnim grupama, na način koji je poznat u ovoj struci, i oni su uključeni u ovaj pronalazak sve dok su farmaceutski prihvatljivi, tj. dok ne uništavaju aktivnost proteina koja je značajno slična aktivnosti IL-18BP, ili virusnog IL-18BPs, i dok ne prenose toksična svojstva na sastave koji ih sadrže.

Ovi derivati mogu, na primer, da obuhvate bočne lance polietilen glikola, koji mogu da maskiraju antigenska mesta i produže boravak IL-18BP ili virusnog IL-18BP u telesnim tečnostima. U druge derivate spadaju alifatični estri karboksilnih grupa, amidi karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili primarnim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih amino grupa ostataka aminokiselina koje se formiraju sa acilnim delovima (npr. Alkanoilna ili karbociklična aroilna grupa) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer onih koji potiču od serilnih ili treonilnih ostataka) koji su formirani sa acilnim delovima.

Kao "aktivne frakcije" IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, muteina i fuzionisanog proteina, ovaj pronalazak pokriva sve fragmente ili prekursore polipeptidnog lanca proteinskog molekula samog ili zajedno sa udruženim molekulina ili ostatcima koji su sa njim povezani npr., ostatci šećera ili fosfata ili agregati proteinskih molekula ostataka šećera sami za sebe, pod uslovom da navedena frakcija ima aktivnost koja je značajno slična aktivnosti IL-18BP.

Prema još jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je antitelo koje je otkriveno protiv IL-18 ili njegov receptor, IL-18R. Otkrivena antitela na bilo koju podjedinicu IL-18R, koja se nazivaju IL-18Rα i β, mogu se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom.

Antitela prema ovom pronalasku mogu biti poliklona ili monoklona, himerna, humanizovana ili čak potpuno humana. Rekombinantna antitela i njihove fragmente karakteriše visoko afinitetno vezivanje za IL-18 ili IL-18R in vivo kao i niska toksičnost. Antitela koja se mogu koristiti u ovom pronalasku karakteriše njihova sposobnost da leče pacijente tokom perioda koji je dovoljan da bi se ostvarila dobra do izvanredna regresija ili ublažavanje patogenog stanja ili simptoma ili grupe simptoma koji su u vezi sa datim patogenim stanjem kao i niska toksičnost.

Neutrališuća antitela se lako iniciraju kod životinja kao što su zečevi, koze ili miševi imunizacijom sa IL-18 ili IL-18Rα ili β. Imunizovani miševi su posebno korisni za obezbeđivanje izvora B ćelija u proizvodnji hibridoma, koji se za uzvrat kultivišu radi proizvodnje velikih količina anti-IL-18 monoklonih antitela.

Himerna antitela su molekuli imunoglobulina koje karakterišu dva ili više segmenata ili delova izvedenih iz različitih životinjskih vrsta. Generalno, varijabilni region himernih antitela se izvodi iz ne-humanih antitela sisara, kao što su mišja monoklona antitela dok se konstantni region imunoglobulina izvodi iz molekula humanog imunoglobulina. Preferentno, oba regiona i kombinacije imaju nisku imunogenost što je rutinski utvrđeno (Elliott et al., 1994). Humanizovana antitela su molekuli imunoglobulina stvoreni tehnikama genetskog inžinjeringa kod kojih se mišji konstantni regioni zamenjuju humanim pandanima dok se zadržavaju mišji regioni koji vezuju antigen. Dobijeno mišje-humano himerno antitelo preferentno ima smanjenu imunogenost i bolju farmakokinetiku kod ljudi. (Knight et al., 1993).

Stoga, prema još jednom preferentnom konceptu, antitelo IL-18 ili IL-18R je humanizovano antitelo. Preferentni primeri humanizovanih anti-IL-18 antitela su opisani na primer u Zahtevu za evropske patente EP 0 974 600.

Prema još jednom preferentnom konceptu, ovo antitelo je u potpunosti humano. Tehnologija za proizvodnju humanih antitela je detaljno opisana u npr. W000/76310, WO99/53049, US 6, 162, 963 ili AU5336100.

Jedna od metoda za pripremu potpuno humanih antitela se sastoji od “humanizacije “ mišjeg humoralnog imunog sistema, tj. proizvodnje mišjih sojeva koji mogu da proizvode humani lg (Xenomiševi), introdukcijom lokusa humanog imunoglobulina (lg) u miševe kod kojih su endogeni lg geni inaktivirani. Ovi lg lokusi su kompletni kako po pitanju njihove fizičke strukture tako i po pitanju genskog rasporeda i procesa ekspresije koji je potreban kako bi se na kraju proizveo široki imuni odgovor. Različitost antitela se primarno dobija kombinacijom rasporeda različitih V, D, i J gena prisutnih u lg lokusima. Ovi lokusi takođe sadrže rasute regulatorne elemente koji kontrolišu ekspresiju antitela, ekskluziju alela, pramenu klase i maturaciju afiniteta. Uvođenje neraspoređenih humanih lg-transgena u miševe je pokazalo da je mišja mašinerija za rekombinaciju kompatibilna sa humanim genima. Takođe, hibridomi koji vrše sekreciju antigen specifičnog hu-mAbs različitih izotipova mogu se dobiti imunizacijom Xenomiševa antigenom.

Potpuno humana antitela i metode njihove proizvodnje poznati su u ovoj stručnoj oblasti (Mendez et al (1997); Buggemann et al (1991); Tomizuka et al., (2000) Patent WO 98/24893).

Prema jednom veoma preferentnom konceptu ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je jedan IL-18BP, ili neki izoform, mutein, fuzionisani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili njihov funkcionalno permutovani derivat. Ovi izoformi, muteini, fuzionisani proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost IL-18BP, posebno vezivanje za IL-18, i poželjno je da imaju esencijalno najmanje jednu aktivnost sličnu IL-18BP. Idealno, takvi proteini imaju pojačanu biološku aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim IL-18BP. Preferentne aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja od aktivnosti IL-18BP, ili imaju dodatne prednosti, kao što su bolja stabilnost ili niža toksičnost ili imunogenost, ili je lakša njihova proizvodnja u velikim količinama, ili se lakše purifikuju.

Sekvence IL-18BP i njihovih pomešanih varijanti/izoforma mogu se uzeti iz W099/09063 ili od Novick et al., 1999, kao i od Kim et al., 2000.

Funkcionalni derivati IL-18BP mogu se konjugirati u polimere kako bi se poboljšala svojstva proteina, kao što su stabilnost, polu-život, biološka raspoloživost, podnošljivost od strane ljudskog tela ili imunogenost. Da bi se ostvario ovaj cilj, IL18-BP se može povezati npr. sa polietilenglikolom (PEG). PEGilacija se može izvršiti korišćenjem poznate metode koja je opisana u WO 92/13095, na primer.

Stoga, prema jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, inhibitori IL-18, a posebno IL-18BP su PEGilovani.

Prema još jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, inhibitor IL-18 obuhvata fuziju imunoglobulina tj. inhibitor IL-18 je fuzionisani protein koji uključuje ceo ili deo proteina koji vezuje IL-18, koji je fuzionisan sa imunoglobulinom. Metode za pravljenje imunoglobulinskih fuzionisanih proteina dobro su poznate u ovoj stručnoj oblasti, kao što su one opisane u WO 01/03737, na primer. stručnjak iz ove oblasti će razumeti da dobijeni fuzionisani protein iz ovog pronalaska zadržava biološku aktivnost IL-18BP, posebno vezivanje sa IL-18. Ta fuzija može biti direktna, ili preko kratkog veznog peptida, koji može da bude toliko kratak da mu dužina iznosi 1 do 3 ostatka amino kiselina, ili duži, na primer, dužine 13 do 20 ostataka amino kiselina. Navedeni vezni peptid može biti neki tripeptid čija je sekvenca E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili sekvenca sa 13-amino kiselina koja obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koje su uvedene između sekvence IL-18BP i sekvence imunoglobulina. Dobijeni fuzioni protein ima poboljšana svojstva, kao što su duži boravak u telesnim tečnostima (polu-život), povećana specifična aktivnost, viši nivo ekspresije, ili je purifikacija fuzionog proteina olakšana.

Prema jednom preferentnom konceptu, IL-18BP je fuzionisan za konstantni region nekog lg molekula. Preferentno, on je fuzionisan za regione teških lanaca, kao što su domeni CH2 i CH3 humanog IgG 1 ili lgG2, na primer. Dobijanje specifičnih fuzionih proteina, uključujući IL-18BP i neki deo imunoglobulina opisano je u primeru 11 u okviru WO 99/09063, na primer. Drugi izoformi lg molekula su takođe pogodni za dobijanje fuzionih proteina prema ovom pronalasku, kao što su izoformi lgG2 ili lgG4, ili druge lg klase, kao na primer IgM ili lg A. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- or homomultimerni.

U još jednom konceptu ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je upotrebljen u kombinaciji sa jednim ili više drugih molekula aktivnih u kliničkim uslovima ovog pronalaska, kao što su vazodilatatori, Ca-blokatori, aspirin, beta-blokatori i slično. Antagonisti TNF se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa nekim inhibitorom IL-18 u skladu sa ovim pronalaskom, na primer. Antagonisti TNF ispoljavaju svoju aktivnost na nekoliko načina. Prvo, antagonisti mogu da se vezuju za sekvester samog TNF molekula sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću za parcijalnu ili značajnu neutralizaciju epitopa TNF ili epitopa odgovornih za vezivanje TNF receptora (u daljem tekstu “sekvestracioni antagonisti”). A sekvestracioni antagonist može biti, na primer, neko antitelo usmereno protiv TNF.

Umesto toga, antagonisti TNF mogu da inhibiraju signalizacionu putanju TNF koju aktiviraju receptori na površini ćelija posle vezivanja TNF (u daljem tekstu “signalizacioni antagonisti”). Obe grupe antagonista su korisne kako svaka za sebe tako i zajedno, u kombinaciji sa nekim inhibitorom IL-18, u terapiji ili prevenciji periferne vaskularne bolesti.

Antagonisti TNF se lako identifikuju i procenjuju rutinskim pregledom kandidata radi utvrđivanja njihovog efekta na aktivnost nativnog TNF na osetljive ćelijske loze in vitro, na primer na humane B ćelije, kod kojih TNF izaziva proliferaciju i sekreciju imunoglobulina. Ovaj esej sadrži formulaciju TNF sa različitim dilucijama antagonista kandidata, npr. od 0. 1 do 100 puta veća molarna količina TNF je korišćena u ovom eseju, a kontrole su bile bez TNF ili samo antagonisti (Tucci et al., 1992).

Sekvestracioni antagonisti su preferentni antagonisti TNF koje treba koristiti prema ovom pronalasku. Među sekvestracionim antagonistima, preferentniji su oni polipeptidi koji vezuju TNF sa visokim afinitetom i imaju malu imunogenost. Solubilni molekuli TNF receptora i neutrališuća antitela na TNF su posebno preferentna. Na primer, solubilni TNF-RI i TNF-RII su korisni za ovaj pronalazak. Zasečene forme ovih receptora, koje čine ekstracelularne domene receptora ili njihovih funkcionalnih delova predstavljaju posebno pogodne antagoniste prema ovom pronalasku. Zasečeni solubilni TNF tip-l i tip-ll receptori su opisani u EP914431, na primer.

Zasečene forme TNF receptora su sdubiine i otkrivene su u urinu i serumu kao 30 kDa i 40 kDa TNF inhibitorni vezujući proteini, koji se nazivaju TBPI odnosno TBPII, (Engelmann et al., 1990). Istovremena, sekvencijalna ili zasebna upotreba inhibitora IL-18 sa antagonistima TNF je poželjnija prema ovom pronalasku.

Prema još jednom preferentnom konceptu, humani solubilni TNF-RI (TBPI) je antagonist TNF koji treba koristiti prema ovom pronalasku. Prirodni i rekombinantni solubilni molekuli TNF receptora i metode njihove proizvodnje opisane u Evropskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900.

Derivati, fragmenti, regioni i biološki aktivni delovi receptorskih molekula funkcionalno liče na receptorske molekule koji se takođe mogu koristiti u ovom pronalasku. Takvi biološki aktivni ekvivalenti ili derivati receptorskih molekula odnose se na deo polipeptida, ili sekvence koja kodira receptorski molekul, koja je dovoljno velika i može da vezuje TNF takvim afinitetom da je interakcija sa TNF receptorom vezanim za membranu inhibirana ili blokirana.

Inhibitor IL-18 se može koristiti istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od TNF inhibitora.

Prema još jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0. 01 do 100 mg/kg ili oko 1 do 10 mg/kg ili 2 do 5 mg/kg.

Inhibitor IL-18 prema ovom pronalasku se preferentno primenjuje sistemski, i preferentno subkutano ili intramuskularno. On se može davati svakodnevno ili svakog drugog dana. Formulacije sa produženim oslobađanjem omogućavaju redu primenu, na primer jednom nedeljno.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu vektora ekspresije koji obuhvata kodirajuću sekvencu nekog inhibitora IL-18 za pripremu leka za prevenciju i/ili lečenje periferne vaskuiarne bolesti. To znači da se pristup sa genskom terapijom razmatra kako bi se inhibitor IL-18 doveo do mesta na kome je potreban. Da bi se lečila i/ili izvršila prevencija periferne vaskuiarne bolesti, vektor genske terapije koji se sastoji od sekvence nekog inhibitora IL-18 može da se ubrizga na primer direktno u obolelo tkivo i na taj način se izbegavaju problemi koji se javljaju kod sistemskog davanja vektora genske terapije, kao što su dilucije vektora koji dolaze do ciljnih ćelija tkiva, kao i nuz pojave.

Upotreba vektora za indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije nekog inhibitora IL-18 u ćeliji koja obično ne vrši ekspresiju inhibitora IL-18, ili koja eksprimira količine ovog inhibitora koji nisu dovoljne, takođe je razmotrena prema ovom pronalasku. Ovaj vektor može da obuhvata regulatorne sekvence funkcionalne u ćelijama od kojih se želi da eksprimiraju inhibitor ili IL-18. Takve regulaltorne sekvence mogu biti promoteri ili pojačivači, na primer. Te regulatorne sekvence se mogu tada uvesti u pravi lokus na genomu homolognom rekombinacijom što će dovesti do operativne veze ove regulatorne sekvence sa genom, čiju ekspresiju je potrebno indukovati ili pojačati. Ova tehnologija se obično naziva “Endogena genska aktivacija” (EGA), i opisana je u npr. WO 91/09955.

Stručnjak iz ove oblasti će razumeti da je takođe moguće direktno prekinuti ekspresiju IL-18 bez korišćenja inhibitora IL-18, uz pomoć iste tehnike. Da bi se to uradilo, može se uvesti elemenat negativne regulacije, kao npr. neki elemanat za umirivanje, u genski lokus IL-18, što će dovesti do descedentne regulacije ili prevencije ekspresije IL-18. Stručnjak iz ove bolesti će razumeti da takva opadajuća regulacija ili umirivanje ekspresije IL-18 imaju isti efekat kao i upotreba nekog inhibitora IL-18 kako bi se sprečila i/ili tretirala bolest.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu ćelije koja je genetski modifikovana da proizvodi inhibitor IL-18 pri proizvodnji leka za lečenje i/ili prevenciju periferne vaskularne bolesti.

Inhibitor IL-18 koji treba koristiti u skladu sa ovim pronalaskom se može preferentno davati kao farmaceutska formulacija, opciono u kombinaciji sa terapijski efektivnom količinom inhibitora TNF ili nekog drugog leka koji je aktivan u lečenju ili prevenciji periferne vaskularne bolesti.

IL-18BP i njegovi izoformi, muteini, fuzionisani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularno permutovani derivati koji su gore opisani su preferentni aktivni sastojci ovih farmaceutskih formulacija.

Definicija termina “farmaceutski prihvatljiv" ima za cilj da obuhvati sve nosače koji ne utiču na efektivnost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i koji nisu toksični za domaćina kome se daju. Na primer, pri parenteralnoj administraciji, aktivni protein (proteini) mogu biti formulisani u vidu jediničnih oblika doza za injekcije u nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Aktivni sastojci farmaceutske formulacije prema ovom pronalasku mogu se davati svakom pojedincu na različite načine. Načini davanja obuhvataju intradermalni, transdermalni (npr. kod formulacija sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intraperitoneaini, intravenski, subkutani, oralni, intrakranijalni, epiduralni, površinski i intranazalni. Svi drugi terapijski efikasni načini davanja se mogu koristiti, na primer apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili putem genske terapije kod koje DNK molekul kodira aktivni agens koji je dat pacijentu (npr. preko vektora), što dovodi do ekspresije aktivnog agensa i njegove sekrecije in vivo. Osim toga, protein(i) prema ovom pronalasku mogu se davati zajedno sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, nosači, rastvarači i ekscipijenti.

Za parenteralnu administraciju (npr. intravensku, subkutanu, intramuskularnu), ovi aktivni proteini se mogu formulisati u vidu rastvora, suspenzija, emulzija ili liofilizovanog preparata zajedno sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim ekscipijentom (npr. voda, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i aditivima koji održavaju izotoničnost (npr. manitol) ili hemijsku stabilnost (npr. konzervansi ili puferi). Ova formulacija se steriliše uz pomoć uobičajenih tehnika.

Biološka raspoloživost aktivnih proteina prema ovom pronalasku takođe može da se blaži upotrebom postupaka konjugacije koji produžavaju polu-život ovog molekula u ljudskom telu, na primer vezujući molekul sa polietilenglikolom, kako je opisano u PCT Patentnom zahtevu WO 92/13095.

Terapijski efektivne količine proteina će biti u funkciji mnogih promenljivih, uključujući i tip antagonista, afinitet antagonista za IL-18, eventualne rezidualne citotoksične aktivnosti koju ispoljavaju antagonisti, načina administracije, kliničkog stanja pacijenta (uključujući i poželjnost održavanja ne-toksičnog nivoa endogene aktivnosti IL-18).

"Terapijski efektivna količina" je ona količina koja pošto se primeni dovodi do toga da inhibitor IL-18 inhibira biološku aktivnost IL-18. Prime njena doza data u vidu jedne ili više doza nekom pojedincu će se razlikovati u zavisnosti od različitih faktora, uključujući i farmakokinetička svojstva IL-18 inhibitora, način davanja, stanje i karakteristike pacijenta (pol, starost, telesna težina, zdravlje, veličina), obima simptoma, istovremenih tretmana, učestalosti lečenja kao i željenog efekta. Podešavanje i manipulacija ustanovljenim opsezima uglavnom zavise od sposobnosti stručnjaka iz ove oblasti kao i od in vitro i in vivo metode određivanja inhibicije IL-18 kod nekog pojedinca.

Prema ovom pronalasku, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0. 001 do 100 mg/kg iii oko 0. 01 do 10 mg/kg telesne težine ili oko 0. 1 do 5 mg/kg telesne težine ili oko 1do 3 mg/kg telesne težine ili oko 2 mg/kg telesne težine.

Način davanja koji je preferentan prema ovom pronalasku je subkutani. Intramuskularna adminstracija je takođe preferentna prema ovom pronalasku. Da bi se inhibitor IL-18 primenio direktno na mesto svog delovanja, njegova lokalna primena je takođe preferentna.

Prema daljim preferentnim konceptima, inhibitor IL-18 se daje svakodnevno ili svakog drugog dana.

Dnevne doze se obično daju u podeljenim dozama ili u obliku sa produženim oslobađanjem koji je efikasan za dobijanje željenih rezultata. Druga ili naredne administracije se mogu vršiti u dozama koje će biti iste, manje ili veće od inicijalne ili prethodne doze koja je data određenoj osobi. Druga ili naredna administracija se može izvršiti tokom ili pre javljanja bolesti.

Prema ovom pronalasku, inhibitor IL-18 se može davati profilaktički ili terapijski nekoj osobi pre, istovremeno ili posle drugih terapijskih režima ili agenasa. (npr. režimi sa više lekova), u terapijski efektivnoj količini, posebno sa TNF inhibitorom i/ili drugim vaskularnim protektivnim agensom. Aktivni agensi koji se daju istovremeno sa drugim terapijskim agensima mogu se davati u istim ili različitim sastavima.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu za pripremu farmaceutskog sastava koji uključuje mešavinu efektivne količine inhibitora IL-18 i/ili TNF antagonista sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja periferne vaskularne bolesti, koja uključuje davanje farmaceutski efektivne količine inhibitora IL-18, opciono u kombinaciji sa farmaceutski efektivnom količinom TNF antagonista, pacijentu kome je to potrebno.

Pošto smo u potpunosti opisali ovaj pronalazak, stručnjacima iz ove oblasti je jasno da se on može primenjivati u okviru širokog spektra ekvivalentnih parametara, koncentracija i uslova bez odstupanja od ideje i obima ovog pronalaska i bez nepotrebnih eksperimenata.

lako je ovaj pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifičnim konceptima, jasno je da su moguće i dalje modifikacije. Ova primena ima za cilj da pokrije sve varijacije, upotrebe ili adaptacije ovog pronalaska uz generalno poštovanje principa ovog pronalaska i uključujući ona odstupanja od podataka koji su ovde dati koja spadaju u okvir poznate ili uobičajene prakse u stručnoj oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak i koja se mogu primeniti uz poštovanje suštinskih karakteristika koje su ranije navedene kako sledi u zahtevima.

Sva literatura iz koje su ovde citirani podatci, uključujući članke ili apstrakte iz časopisa, objavljene ili neobjavljene patentne zahteve iz SAD ili drugih zemalja, izdate patente u SAD ili u inostranstvu kao i sve druge reference u celosti su ovde navedene, uključujući sve podatke, tabele, slike i tekstove date u navedenoj literaturi. Osim toga, ceiokupan sadržaj literature koja je citirana ovde takođe je uključen u reference.

Pozivanje na korake iz poznatih metoda, korake iz konvencionalnih metoda, poznate metode ili konvencionalne metode ne podrazumeva ni na koji način priznanje da je bilo koji aspekt, opis ili koncept ovog pronalaska otkriven, obrađen ili naznačen u relevantnoj stručnoj oblasti.

Prethodni opis specifičnih koncepata toliko otkriva u celini opštu prirodu ovog pronalska da drugi, primenom znanja iz struke (uključujući i sadržaj literature koja je ovde citirana), lako mogu da modifikuju i/ili prilagode te specifične koncepte za različite primene, bez nepotrebnog eksperimentisanja i bez odstupanja od opšteg koncepta ovog pronalska. Stoga, takve varijacije i modifikacije treba da budu u okviru značenja i opsega ekvivalenata otkrivenih koncepata, zasnovanih na učenju i smernicama koje su ovde predstavljene. Treba imati u vidu da fraze i terminologija koji su ovde korišćeni radi opisa nisu ograničavajući, tako da termine i fraze koji su korišćeni u ovoj specifikaciji stručnjak iz ove oblasti treba da tumači u kontekstu učenja i uputstava koja su ovde data, u kombinaciji sa saznanjima koje takav stručnjak iz ove oblasti već ima.

PRIMERI

Primer 1: Inhibicija IL-18 smanjuje perifernu ishemiju

Metode:

Uvođenje ishemije zadnjih nogu

Muški C57BL/6J miševi (lffa Creddo, Lyon, France) podvrgnuti su hirurškom zahvatu kako bi se izazvala unilateralna ishemija zadnjih ekstremiteta. Životinje su anestezirane inhalacijom izofurana. Ligatura je urađena na desnoj femoralnoj arteriji, 0. 5 cm proksimalno od grananja safenozne i poplitealne arterije. Miševi (7 životinja po grupi) su potom čuvane pod specifičnim apatogenim uslovima tokom 3 ili 28 dana. Da bi se ispitala uloga IL-18BP u angiogenezi izazvanoj ishemijom, jednoj grupi miševa je ubrizgano 60 pg mišjeg plazmida koji vrši eskpresiju IL-18BP, pcDNK3-mlL18BP u oba tiibijalna kranijalna mišića, kako je prethodno opisano (Mallat et al., 2001). Kontrolnim miševima je ubrizgana ista doza kontrolnog praznog plazmida. Transkutani električni impulsi (8 električnih impulsa kvadratnih talasa od 200 V/cm, 20 ms trajanje na 2 Hz) je primenjeno uz pomoć PS-15 elektropulsatora (Genetronics) primenom dve pločaste elektrode od nerđajućeg čelika koje su postavljene na udaljenosti od 4. 2 do 5. 3 mm, sa obe strane noge. Ovakva strategija je korišćena zato što se prethodno pokazalo da ona povećava nivoe IL-18BP u plazmi, umanjenje aktivnost IL-18 u plazmi i inhibira razvoj-aterosklerotičnih plakova i njihovu progresiju. (Mallat et al., 2001).

Kvantifikacija angiogeneze

Mikroangiografija

Gustina krvnih sudova je procenjena uz pomoć visoko definitivne mikroangiografije na kraju terapijskog perioda, kako je prethodno opisano (Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001). Ukratko, miševi su anestezirani (inhalacija izofurana) i kontrastno sredstvo (Barium sulfat, 1 g/ml) je ubrizgano preko katetera koji je uveden u abdominalnu aortu. Snimci (3 po životinji) dobijeni uz pomoć digitalnog rentgenskog transdjusera su prikupljeni kako bi se stekao kompletan uvid u stanje zadnjih ekstremiteta.

Gustina krvnih sudova je izražena u vidu procenta piksela po snimku na kome su se nalazili krvni sudovi iz oblasti koja je kvantifikovana. Zona kvanifikacije je oivičena mestom ligature na femoralnoj arteriji, kolenom, ivicom femura i spoljašnjom granicom ekstremitera.

Kapilarna gustina

Mikroangiografska analiza je završena procenom kapilarnih gustina u ishemičnim i ne-ishemičnim mišićima, kako je prethodno opisano (Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001). Smrznuti preseci tkiva (7pm) su inkubirani sa monoklonim antitelima pacova usmerenim protiv CD31 (20pg/ml, Pharmingen) kako bi se identifikovali kapiiari. Imunoboje su vizualizovane uz pomoć vizualizacionih sistema sa avidin-biotin peroskidazom izvedenom iz rena. (Vectastain ABC kit elite, Vector Laboratories). Kapilarne gustine su izračunate na nasumično odabranim poljima neke određene površine uz pomoć Histolab softvera (Microvision).

Laser Doppler perfuzioni snimci

Da bi se obezbedili funkcionalni dokazi o promenama vaskularizacije izazvanim ishemijom, izvršeni su eksperimenti Laser Doppler perfuzionim snimcima, kako je prethodno opisano (Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001). Ukratko, višak dlake je uklonjen sa ekstremiteta uz pomoć kreme za depilaciju pre snimanja, a miševi su postavljeni na grejnu ploču na temperaturi od 37°C kako bi se na minimum svele temperaturne varijacije. Bez obzira na to, da bi se uzele u obzir promenljive, uključujući i ambijentalno osvetljenje i temperaturu, izračunata perfuzija je izražena u vidu odnosa ishemičnog prema ne-ishemičnom ekstremitetu.

Statistička analiza

Rezultati su izraženi u vidu srednje vrednosti ± SEM. Jednosmerna analiza varijanse ANOVA je korišćena za poređenje svakog parametra. Post hoc poređenje uz pomoć Bonferonnijevog testa je izvršeno kako bi se utvrdilo koje grupne razlike utiču na ukupno značajan ANOVA. Vrednost p<0. 05 je smatrana statistični značajnom.

Rezultati:

Mikroangiografija

Dana 3, odnosi angiografkkih skorova ishemičnog/ne-ishemičnog ekstremiteta nisu bili izmenjeni ni kod jedne grupe (SI. 1). Nasuprot tome, 28 dana, angiografski skor je pokazao 1. 6-puta veće povećanje kod miševa tretiranih sa IL-18BP u poređenju sa kontrolnim životinjama (p<0. 01).

Kapilarna gustina

Mikroangiografski podatci su potvrđeni analizom kapilarne gustine posle CD31 prebojavanja. Na dan 28, kapilarna gustina ishemičnog ekstremiteta kontrolnih miševa bila je manja nego ona kod neishemičnog ekstremiteta (415±31 prema 688±42 krvna suda/mm2, p<0. 01), Međutim, kapilarna gustina ishemičnog ekstremiteta miševa tretiranih sa IL-18BP bila je značajno veća (povećanje za 1. 4-puta) nego kod kontrolnih miševa (588±48 prema 415±31 krvna suda/mm2, p=0. 01) i nije se razlikovala od nivoa koji je zabeležen kod neishemičnog ekstremiteta.

Laser doppler snimanje perfuzije

Merenje mikroangiografske i kapilarne gustine bilo je udruženo sa promenama perfuzije krvi. Do oporavka protoka krvi u zadnjim ekstremitetima došlo je kako kod tretiranih tako i kod netretiranih miševa. Međutim, kod miševa tretiranih sa IL-18BP veće povećanje protoka krvi (perfuzija stopala) bilo je evidentno do 28 dana u poređenju sa kontrolnim životinjama (1. 5-puta, p<0. 01, Slika 2).

Primer 2: Regulacija nivoa proteina VEGF, fosfo-Akt i eNOS

Metod:

Ekspresija VEGF, fosfo-Akt i eNOS (endotelijalni protein azot oksidne sinteaze) je utvrđena uz pomoć western-blot testa ishemične i ne-ishemične noge, kako je prethodno opisano (Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001).

Rezultati:

VEGF. Trećega dana, nisu zabeležene nikakve promene u nivou VEGF proteina između ishemične I neishemične noge, ni kod jedne grupe. Na dan 28, kod kontrolnih miševa, sadržaj VEGF proteina se povećavao u ishemičnoj nozi u poređenju sa neishemičnom, ali ova razlika nije dostigla statističku značajnost. Na suprot tome, nivo

VEGF proteina ishemičnog ekstremiteta bio je značajno povišen za 120% kod miševa tretiranih sa IL-18BP u poređenju sa kontrolnim životinjama (p<0. 05) (Slika 3).

Fosfo-Akt. Trećega dana, nivo fosfo-Akt proteina bio je nepromenjen kod ishemičnih i ne-ishemičnih zadnjih ekstremiteta bez obzira na tretman. Dana 28, kod kontrolnih miševa je sadržaj fosfo-Akt proteina bio povećan za 60% kod ishemičnih zadnjih ekstremiteta u odnosu na neishemične (p<0. 01). Ovo povećanje sadržaja fosfo-Akt kod ishemičnog ekstremiteta bilo je dvostruko kod miševa tretiranih sa IL-18BP (110% povećanje, p<0. 05 u poređenju sa povećanjem kod ishemične noge kontrolnih miševa) (Slika 4).

eNOS. Trećega dana, sadržaj eNOS proteina nije bio izmenjen kod ishemične (107±8 % prema 103±24%) i ne- ishemične noge (100±12% prema 94±21%) kod kontrolnih odnosno životinja tretiranih sa IL-18BP. Dana 28, kod kontrolnih miševa su svi eNOS bili povećani za 55% u ishemčnoj nozi u odnosu na nesihemičnu (155±8% prema 100±11 %, p<0. 05). Na takvo povećanje nije uticao tretman sa IL-18BP (160±12%, P=0. 61 prema ishemičnoj kontroli).

Primer 3: Efekat IL-18BP na EPCs (endotelijalne progenitorske ćelije)

Metode:

Analiza uz pomoć floucitometrije

Smatra se da EPCs ćelije potiču iz Sca-1-pozitivnih hematopoetičnih progenitorskih ćelija (Takahashi et al., 1999). Procenat mononuklearnih ćelija koje vrše ekspresiju EPCs markera proteina Sca-1 određen je uz pomoć floucitometrije. Sedam dana posle ishemije krvi izolovane su mononuklearne ćelije iz periferne krvi (300 µl) i koštane srži miševa tretiranih bilo sa praznim pcDNK3 µlazmidom ili sa pcDNK3-mlL18BP µlazmidom (n=5 po grupi). Ćelije koštane srži su dobijene ispitanjem tibija i femura. Mononuklearne ćelije male gustine su izolovane centrifugiranjem prema gradijentu gustine uz pomoć Ficolla. Mononuklearne ćelije su potom inkubirane sa fluorescein izotiocijanatom (FITC) konjugiranim sa monoklonim antitelima na Sca-1 (D7, BD Pharmingen). Antitela identična sa izotipom su sličila kao kontrola.

EPC Esej za diferencijaciju

Odmah posle izolacije, 5. 106 mononuklearnih. ćelija izvedenih iz koštane srži je takođe stavljeno na posude za kultivaciju od 35 mm koje su premazane µlazma vitronektinom pacova (Sigma) i želatinom (0. 1%) i održavane u endotelijalnom bazalnom medijumu (EBM2, Bio vvhittaker). Posle 4 dna u kulturi, neadherentne ćelije su uklonjene a adherentne ćelije su podvrgnute imunohemičnim analizama.

Da bi otkrilo preuzimanje acetiliranog lipoproteina niske gustine obeleženog sa i-dioktadeci! 3. 3. 3'. 3’- tetrameuiindokarbccijanin-labe'ed (AcLDL-Dil), ćelije su inkubirane sa AcLDL-Dil (Tebu) na 37°C tokom 1 sata. Ćelije su potom fiksirane sa 2% paraformaldehidom, inkubirane sa primarnim poliklonim zečjum antiteliuma usmerenim protiv von-Wi!! brandovog faktora (vWF) (DAKO) tokom 1 sata, i sa FITC-obeleženim monoklonim antizečjim IgG (H+L) tokom 30min (Coulter). Dvostruko prebojene ćelije pozitivne kako na AcLDL-Dil tako i na vWF su procenjene kao EPCs, i one su prebrojavanje u svakom otvoru. Tri nezavisna istraživača su procenjivala broj EPC po svakom otvoru prebrojavanjem tri nasumično odabrana polja-visokog napona. Rezultati su potom izraženi u vodu procenta ukupnog broja monoklOonih ćelija.

Rezultati:

Smatra se da EPC potiču iz Sca-1 pozitivnih mononuklearnih ćelija (Takahashi et a!., 1999). Procenat Sca-1 pozitivnih mononuklearnih ćelija u perifernoj krvi ostao je nepromenjen kod miševa tretiranih sa IL-18BP u odnosu na kontrolne životinje (31, 5±13% prema 28. 5±13%).

Slično tome, ukupan broj Sca-1 pozitivnih mononuklearnih ćelija izolovanih iz koštane srži nije se razlikovalo kod miševa tretiranih sa IL-18BP I kontrolnih životinja (4. 35±0. 95% prema 5. 87±0. 22%). Takođe, tretman sa IL-18BP nije uticao na ukupni broj mononuklearnih ćelija periferne krvi ili koštane srži (podatci nisu prikazani).

EPC su izolovane i kultivisane iz monunuklearnih ćelija koštane srži i okarakterisane kao dvostruko prebijene ćelije pozitivne na AcLDL-Dil i vWF. Procenat ćelija sa dvostruko pozitivnim prebojavanjem bio je skoro nedektabilan kod ne ishemičnih životinja (<5%, n=4). Ishemija je izazvala izrazito povećanje procenta ćelija sa dvostrukim prebojavnjem na AcLDL-Dil i vWF (48±3%, p<0. 001 prema ne ishemičnim životinjama). Takav efekat je dalje proširen tretmanom sa IL-18BP (48±3% kod kontrolnih životinja prema 85±2% kod miševa tretiranih sa IL-18BPi, p<0. 001) (Slika 5). Stoga, kako izgleda tretman sa IL-18BP stimuliše diferencijaciju mononuklearnih ćelija u EPC a ne dovodi do povećanja broja cirkulišućih progenitorskih ćelija.

Claims (22)

1.    Upotreba nekog inhibitora IL-18 u proizvodnji leka za lečenje i/ili prevenciju periferne vaskularne bolesti.

2.    Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time da periferna vaskularna bolest predstavlja oboljenje perifernih arterija.

3.    Upotreba prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time da periferna vaskularna bolest predstavlja perifernu vaskularnu bolest donjih ekstremiteta.

4.    Upotreba    nekog    inhibitora    IL-18    u    proizvodnji    leka    za lečenje i/ili prevenciju klaudikacije.

5.    Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, naznačena time da je periferna vaskularna bolest Buergerova bolest (Thromboangiitis Obliterans).

6.    Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, naznačena time da je periferna vaskularna bolest periferna Ishemija.

7.    Upotreba prema zahtevu 6, naznačena time da ishemija ekstremiteta predstavlja kritičnu ishemiju ekstremiteta.

8.    Upotreba    nekog    inhibitora    IL-18    u    proizvodnji    leka    za lečenje i/ili prevenciju of gangrene i/ili ulceracije.

9.    Upotreba    nekog    inhibitora    IL-18    u proizvodnji leka    za prevenciju amputacije ekstremiteta.

10.    Upotreba prema bilo kom zahtevu od 1 do 9, naznačena time da je inhibitor IL-18 odabran između nekog inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitela na IL-18, antitela na bilo koju receptorsku podjedinicu IL-18, inhibitora signalizacione putanje IL-18, antagonista IL-18 koji je u kompeticiji sa IL-18 i blokira receptor IL-18 i neki protein koji vezuje IL-18 ili izoforma, muteina, fuzionisanog proteina, funkcionalnog derivata, aktivne frakcije ili njihovih cirkularno permutovanih derivata koji inhibiraju biološku aktivnost IL-18.

11.    Upotreba prema zahtevu 10, naznačena time da je inhibitor IL-18 neko antitelo usmereno protiv IL-18.

12.    Upotreba prema zahtevu 10, naznačena time da je inhibitor IL-18 neko antitelo usmereno protivi L-18 receptora α.

13.    Upotreba prema zahtevu 10, naznačena time da je inhibitor IL-18 neko antitelo usmereno protiv IL-18 receptora β.

14.    Upotreba prema bilo kom zahtevu od 10 do 13, naznačena time da je antitelo IL-18 humanizovano ili humano antitelo.

15.    Upotreba prema zahtevu 10, naznačena time da je inhibitor IL-18 bilo koji protein koji vezuje IL-18, ili neki njegov izoform, mutein, fuzionisani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutovani derivat koji inhibira biološku aktivnost IL-18.

16.    Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, naznačena time da je inhibitor IL-18 glikoziliran na jednom ili više mesta.

17.    Upotreba prema zahtevu 10, naznačena time da dati fuzionisani protein obuhvata i fuziju nekog imunoglobulina (lg).

18.    Upotreba prema zahtevu 10, naznačena time da funkcionalni derivat obuhvata najmanje jednu grupu koja je spojena sa jednom ili više funkcionalnih grupa, koje se javljaju kao jedan ili više bočnih lanaca na ostatcima amino kiselina.

19.    Upotreba prema zahtevu 18, naznačena time da je ova grupa zapravo polietilenska grupa.

20.    Upotreba vektora ekspresije koji uključuje kodirajuću sekvencu nekog inhibitora IL-18 za pripremu leka za lečenje i/ili prevenciju periferne vaskularne bolesti.

21.    Upotreba vektora ekspresije za indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije nekog inhibitora IL-18 u ćeliji za pripremu leka za lečenje i/ili prevenciju periferne vaskularne bolesti.

22. Metoda lečenja periferne vaskularne bolesti, koja obuhvata administraciju neke efektivne količine inhibitora IL-18 domaćinu kome je potrebna.