KR960012063B1 - 글리콜펩티드 항생물질 pa-45052 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Description

글리코펩티드 항생물질 PA-45052 및 그의 제조방법

제1도는 PA-45052-A, PA-45052-B, PA-45052-C, PA-45052-D 및 PA-45052-E의 적외선 흡광 스펙트럼을 나타낸다.

제2도는 PA-45052-A, PA-45052--B, PA-45052-C, PA-45052-D 및 PA-45052-E의 질량분석 스펙트럼을 나타내고(#로 표시된 피크는 마커 보정용 표준 물질의 피크이다.)

제3도는 PA-45052-A, PA-45052-B, PA-45052-C 및 PA-45052-D의¹H-NMR스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 하기식의 항생물질 PA-45052, 그의 약학적으로 수용가능한 염, 그의 제조방법, 그것을 생산하는 생물 및 그것중 최소한 하나를 포함하는 성장-자극제에 관한 것이다.

(식중, R은

또는 H이고 R₁은 CH₃또는 H를 나타낸다.)

항생물질이 최근에 널리 사용됨에 따라, 복수 내약물성 세균, 특히 메티실린(methicillin)-내성세균의 출현은 심각한 문제를 야기시킨다. 메티실린-내성세균은 메티실린에 대해서 뿐만 아니라 아미노글리코시드류(aminoglycosides), 테트라시클린류(tetracyclines), 세펨류(cephems), 페니실린류(penicillins), 카르바페넴류(carbapenems) 및 마크롤리드류(macrolides)와 같은 각종 항생물질에 대해서도 내성을 보인다.

글리코펩티드, 특히 반코마이신류(vancomycins)는 메티실린-내성세균에 대해 활성을 보임이 주목된다 [Antimicrobial Agent and Chemotherapy,28, 660∼662(1985). 반코마이신은 잘 공지된 항생물질이고(일본국 특허공고 제33-8450호) 반코마이신의 신규 유사체도 발견되었다[Antimicrobial Agent and Chemotherapy,28, 660∼662(1985), The Journal of Antibiotics,37, 446∼453(1984),38, 1∼8(1985),38, 51∼57(1985), 일본국 특허공개 제60-139623, 60-199397,60-231698, 60-237099호 등]. 한편, 본 발명가들은 노카르디아(Nocardia)속에 속하는 균주가 항세균 활성력을 갖는 반코마이신 항생물질 PA-42867-A 및 PA-42867-B를 생산하고(일본국 특허공고 제61-14389호), 게다가 그의 유도체를 만든다는 (일본국 특허공고 제61-188865호) 사실을 발견했다. 그러나 본 발명의 항생물질 PA-45052는 상기 화합물의 구조와 일치하지 않는 완전히 새로운 구조를 갖는 반코마이신이다.

반코마이신과 같은 글리코펩티드 항생물질이 동물의 성장을 자극한다는 사실이 잘 공지되어 있다(예를들면, 일본국 특허공개 제57-129693, 59-2l3394, 59-213395, 60-199397, 60-231698, 60-237099, 61-122300, 61-251699, 62-126970 및 61-502335호; 미합중국 특허 제4537770 및 4558036호; 유럽 특허공고 제119575호 등). 그러나, 본 발명의 화합물이 성장-촉진 활성을 갖는다는 사실은 전혀 공지되어 있지 않다. 현재, 티오펩틴이 성장-자극제로서 시판중이다.

메티실린-내성세균으로 인한 감염의 문제는 임상분야에서 심각한데, 글리코펩티드 항생물질, 특히 반고마이신 항생물질은 그것에 효능을 갖는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 목적은 상술한 것과 같은 활성을 가지는 신규 반고마이신 항생물질을 제공하는 것인데, 그러므로써 약제의 발달에 크게 기여할 것으로 여겨진다.

본 발명은 노카르디아 오리엔탈리스(Nocardia orientalis) PA-45052를 배양함으로써 제조된, 그람-양성 세균, 특히 메티실린-내성세균에 내해 활성력을 보이고 동물의 성장을 자극하는 글리코펩티드 항생물질PA-45052-A, -B, -C, -D, -E 및 -F를 제공한다.

본 발명가들은 노카르디아 속에 속하는 균주가 강력한 항세균 작용을 갖는 하기식의 화화합물을 생산한다는 사실을 밝히고;

(식중, R은

또는 H이고, R₁은 CH₃또는 H이다)

상기 식중 R이

이고 R₁이 H인 화합물을 PR-45052-A로 명명했고, 식중 R이

이고 R₁이 H인 화합물을 PA-45052-B로 명명했고, R이 H이고 R₁이 H인 다른 화합물을 PA-45052-C로 명명했고, R이

이고 R₁이 CH₃인 다른 화합물을 PA-45052-D로 명명했으며 R이

이고 R₁이 CH₃인 다른 화합물을 PA-45052-E로 명명했고, R이 H이고, R₁이 CH₃인 다른 화합물을 PA-45052-F로 명명했다. 본 발명은 이 화합물뿐만 아니라 또한 그의 약학적으로 수용가능한 염을 포함한다. 본 명세서에 기술된 PA-45052는 주로 상기 여섯가지 화합물중 어느것을 의미하지만 몇몇 경우에는 이 화합물 모두를 명시한다.

본 발명의 화합물의 물리화학적 성질을 하기에 나타낸다. 명침 PA-45052-A(HCl), PA-45052-B(HCl), PA-45052-C(HC1), PA-45052-D(HC1), 및 PA-45052-E(HC1)은 그것 모두 염산염임을 의미한다.

·물리화학적 성질

자외선 흡광 스펙트럼

박막 크로마토그래피

메르크(Merck) 전-피복된 TLC 플레이트 실리카겔

60F254

전개용매

클로로포름 : 메탄올 : 진한 암모니아수 :

2차 부탄올 : 물(5 : 10 : 5 : 5 : 2)

발색 : 닌히드린 반응에서 양성

용해도 : 물 및 디메틸설폭시드에서 가용성, 메탄올, 및 에탄올에서 약간 가용성이고, 에테르, 벤젠, 클로로포롬 및 에틸 아세테이트에서 불용성.

성질 : 양성물질, 백색 비결정상 분말

상기 물리화학적 성질에서, 본 발명의 화합물 PA-45052는 하기 입체구조를 갖을 것으로 제안된다.

(식중 R은

또는 H 이고, R₁은 CH₃또는 H이다.)

상술한대로 화합물 PA-45052는 공지된 글리코펩티드 항생물질의 성질과 다른 성질을 갖기 때문에, 그것은 신규 글리코펩티드 항생물질로 결정되었다.

PA-45052 생산생물의 한가지로는, 토양 시료에서 분리된 PA-45052 균주를 예를 들 수 있다. 이 균주는 분류학적으로 고려해 볼때 노카르디아 오리엔탈리스와 동일한 종으로 확인되었는데, 그것은 1987년 3월 26일에 노카르디아 오리엔탈리스 PA-45052(FERM BP-1320)으로 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소(FRI, 일본국 305 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1 쪼메 1-3)에 기탁되었다. 본 명세서에서 PA-45052 생산생물은 PA-45052-A,-B,-C,-D,-E 및 -F중 최소한 한가지 화합물을 생산하는 균주를 의미한다.

균주의 균학적 성질은 하기와 같다

1) 형태학적 성질

이 균주는 효모 맥아 한천, 티로신 한천 및 베네트(Bennett's) 한천 배지에서 잘 자라고 기균사는 그것에 잘 접착하여 포자 형성은 만족스럽다. 가지는 윤생가지 없이 단순하다. 기균사는 상태적으로 길게 뻗어 있고 그 끝은 곧거나 물결꼴이다. 전자현미경으로 관찰하면, 포자는 나미가 0.3∼0.5μm이고 길이가 1.2∼1.8μm인 타원형 원통형이고, 표면 구조는 매끄러운 형태이다. 포자낭, 편모포자 및 균핵 모두 관찰할 수 없다.

2) 배지에서의 성질(28℃에서 14일 배양)

색깔은가이드 투 컬러 스탠다드(Guide To Colour Standard, Japanese Color Institute)에 따른다. 성장온도(하기 온도에서 14일동안 베네트 한천 배지에서 배양)

10℃ : 성장하지 않음.

28℃ : 성장, 기균사의 형성 및 포자 형성이 좋음.

37℃ : 성장이 좋고 기균사는 약간 형성됨.

45℃ : 성장하지 않음.

4) 탄소원의 이용

성장에 잘 이용되는 당류

L-아라비노우스, D-크실로오스, D- 클루코오스, D-프락토오스, 슈크로오스, 이노시톨, 람노오스, D-만니톨 성장에 이용되지 않는 당류

라피노아스

5) 세포벽의 조성물

디아미노피멜산은 메조 형태이다.

상기 성질로부터, 균주는 노카르디아속에 속하는 균주일 것으로 여겨진다. 문헌[''The Actinomycetes'' (Waxman, vo1. 2, 1961), ''International Journal of Systematic Bacteriology''[Report of International Streptomyces Project, Shirling and Gottlieb, Vol. 18(1968), vol. 19(1969), vo1. 22(1972)], Bergey's Manual of Determinative Bacteriology(8th edition, 1974)] 및 액티노미세스(Actinomyces) 에 관한 다른 자료로부터 이 균주와 밀접하게 관련된 종에 대해 연구하면시, 노카르디아 오리엔탈리스[하기 자료에서는 스트렙토미세스 오리엔탈리스(Streptomyces orientalis)로 표기했다. International Journal of Systematic Bacteriology vol. 18, pp. 154∼157, 1968, The Actinomycetes vol. 2, pp. 254∼255, 1961]과 가장 가까운 종임을 발견했다.

노카르디아 오리엔탈리스의 성질을 PA-45052 균주의 성질과 비교하면, 슈크로오스의 이용성을 제외하고는 중요한 대두분의 성질이 잘 일치한다. 따라서, PA-45052 균주는 노카르디아 오리엔탈리스와 동일한 종임이 확인되었고, 노카르디아 오리엔탈리스 PA-45052로 명명되었다.

상술한 PA-45052 균주 및 그의 자연 또는 인공변이체 뿐만 아니라 노카르디아속에 속하고 PA-45052-A,-B,-C,-D,-E 및/또는 -F를 생산하는 모든 균주를 사용할 수 있고 본 발명의 영역에 포함된다.

PA-45052는 통기 조건하 영양 배지내에서 PA-45052-생산 균주를 배양하고 배양 후 배양액으로부터 PA-45052를 수거함으로써 제조된다. PA-45052의 일반적인 제조방법을 하기에 기술한다.

배지의 조성물 및 조건에 대해, 항생물질의 제조에 일반적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다. 원칙적으로, 배지는 탄소원, 질소원 및 무기염을 포함한다. 비타민 및 전구체가 필요한대로 첨가될 수 있다. 탄소원으로서는 예를들면, 글루코오스, 녹말, 댁스트린, 글리세롤, 당밀 및 유기산을 한가지만으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다. 질소원으로서는 예를들면, 콩가루, 옥수수 침지액, 육즙, 효모 추출액, 면실가루, 펩톤, 밀배아, 황산암모늄 및 질산암모늄을 한가지만으로 또는 혼합물로 사용할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 게다가, 공지된 무기염으로는 예를들면, 탄산칼슘, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산구리, 염화망간, 황산아연, 염화코발트 및 인산염이 있는데, 필요에 따라 배지에 첨가한다.

배양은 일반적으로 항생물질의 제조에 사용되는 방법, 바람직하게는 액제 배양을 수행하고, 대량 제조의 목적으로는 액침 통기 배양이 적합하다. 배지의 pH가 다양한 경우에는, 탄산칼슘과 같은 임의의 완충액을 배지에 첨가할 수 있다. 배양은 약 20∼40℃, 바람직하게는 25∼32℃에서 수행하는 것이 좋다. 배양기간은 발효 규모에 의존하는데, 대량 제조에서는 5∼7일이 필요하다. 배양 동안에 거품이 많이 형성되면, 배양 전 또는 배양 동안에 식물유, 라아드 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 억제제를 적당히 첨가하는 것이 좋다.

배양후 배양액으로부터 PA-45052를 회수하기 위하여, 발효 물질을 회수하는데 통상적으로 사용되는 방법을 적절히 사용한다. 예를들면, 여과, 원심분리, 각종 이온 교환 수지 및 다른 활성 흡착제를 사용하는 흡착 또는 탈착 및 크로마토그래피, 그리고 각종 유기 용매에 의한 추출을 적절히 결합하는 것이 좋다.

분리의 목적으로 또는 인간 또는 동물용 약제로 사용하기 위하여, 때때로 PA-45052 염으로 만드는 것이 바람직하다. PA-45052와 염을 형성할 수 있는 염기로는 칼륨 및 나트륨과 같은 알칼리금속, 알루미늄 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속이 있으며, 산으로는 염산, 황산 및 질산과 같은 무기산 및 아세트산 및 푸마르산과 같은 유기산을 예로들 수 있다.

PA-45052 및 그의 약학적으로 수용 가능한 염을 항세균제의 유효 조성물로서 인간 또는 동물에 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 그것을 널리 사용되는 부형제, 안정제, 보항제, 연석제 및 계면홀성제를 사용하여 정제, 캅슐 또는 분말로 경구투여할 수 있고, 한편, 주사제, 찰제 및 좌제로서 비경구 투여할 수 있는 투여량은 치료목적, 환자의 나이 및 중세에 따라 매우 다르지만, 기본적으로 정맥내 주사로 성인에게 1일에 0.1∼10g이 바람직하다.

본 발명의 화합물 PA-45052는 그람-양성 세균, 특히 메리실린-내성 세균에 대해 강력한 항세균 활성을 보이고, 그러므로 사람 및 동물용 약제로서 효과적이다. 게다가, 그것을 고순도로 수득할 수 있기 때문에, 경구 약제 뿐만 아니라 주사제로서 사용하기에도 적합한다.

게다가, 본 발명가들은 화합물 PA-45052가 클로스트리듐(

) 속에 대해서 활성력을 갖고 동물에게 PA-45052가 첨가된 사료를 먹이면 놀랍게 성장한다는 사실을 발견하였다.

본 발명의 성장-자극제를 투여하는데, 비록 본 발명의 글리코펩티드 자체를 경구 투여할 수 있다 할지라도, 일반적으로 탈지쌀겨, 탈지콩가루, 밀겨, 고령토, 활석, 탄산칼슘, 락토오스, 물 등 또는 사료와 같은 통상적인 담체와의 혼합물 또는 상술한 혼합물을 포함하는 또는 글리코펩티드 자체만을 포함하는 물을 바람직하게 투여할 수 있다. 그것에 사용도는 글리코펩티드가 순수할 필요는 없는데 ; 예를들면 본 발명의 미생물의 부분 정제된 배양액을 사용할 수 있다. 게다가, 본 발명의 글리코펩티드의 약학적으로 수용 가능한 염을 또한 사용할 수 있는데; 예를들면, 칼륨 및 나트륨과 같은 알칼리금속, 알루미늄 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속, 염산, 황산 및 질산과 같은 무기산 및 아세트산 및 푸마르산과 같은 유기산과의 염이 있다.

본 발명의 하나 이상의 글리코펩티드를 포함하는 사료는 동물용 사료로 일반적으로 사용되는 어느 것일 수 있는데; 예를들면, 옥수수, 밀겨, 쌀, 밀, 면실케이크, 마일로, 콩케이크, 생선가루, 탈지쌀겨, 기름, 자주개자리, 탄산칼슘, 인산칼슘, 염화나트륨, 염화염소, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 B_l, 비타민 B₂, 비타민 B₆, 비타민 B_l2, 칼슘 판토테네이트, 니코틴아미드 및 폴산과 같은 비타민 및 황산마그네슘, 황산철, 황산구리, 황산아연, 황산코발트 및 요오드화칼륨과 같은 무기산의 전제 또는 부분 혼합물이 있다. 이것외에도, 또다른 항생물질, 게르미시드, 안티코카이듐 및 안텔민틱을 첨가할 수 있다.

사료에서 본 발명의 하나 이상의 글리코펩티드의 농도는 그것중 한가지만, 그것의 혼합물, 그것을 포함하는 세포 또는 그것을 포함하는 조추출액을 사용하는 경우에 사용되는 글리코펩티드로서 0.5∼100ppm(0.33∼72.0mg)일 수 있다.

본 발명의 성장-자극제는, 예를들면, 닭, 칠면조, 오리 및 메추라기 같은 가금 및 소, 말, 돼지, 양, 염소, 밍크 및 토끼와 같은 가축의 어느 동물에 일반적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 성장-자극제를 사용하는데, 동물은 일반적으로 사용되는 방법에 따라 사료를 준다.

본 발명의 성장-자극제는 동물의 성장을 촉진할 뿐만 아니라 사료 효율도 개선시킨다. 자연히, 그것은 세균에 의한 감염에도 효과적이다. 게다가, 그것은 동물에 대해 발병력이 거의 없고 동물내에 전혀 축적되지 않는 탁월한 특징을 갖는다.

본 발명 화합물을 고려하여 쥐에 주사시 LD₅₀의 값은 하기에서 나타낸다.

LD₅₀(mg/kg)

PA - 45052 - A 1000

PA - 45052 - B 1439

(참고예)

본 발명의 PA-45052를 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens)에 대한 시험관내 항미생물활성 및 구이용 병아리에 대한 성장-자극 활성에 대해 조사한다.

1. 클로스트리듐 페르프린젠스에 대한 시험관내시험

소 및 닭에서 유래된 클로스트리듐 페르프린젠스의 총 11균주를 사용한다. 민감성을 측정하는데, GAM한천 배지(Nissui)를 분석용 배지로 사용하고 한천 플레이트 희석법에 따라서 혐기성 배양(gas pack 방법)을 수행하다. MIC 값은 37℃에서 24동안 보온한 후 세균의 감지 가능한 억제가 명백히 관찰되는 농도중 최소 농도로 결정한다.

그람 양성 세균, 특히 클로스트리듐 페르프린젠스에 대항하는 항세균 활성은 시험관내 스크린에서 항생물질의 성장-자극 활성에 대한 하나의 변수인 것으로 보고되었다(Poultry Science 62, 1633∼l638, 1963 ; Poultry Science 63, 2036∼2042, 1984).

결과는 하기에 제시된다.

클로스트리듐 페르프린젠스에 대항하는 PA-45052의 시험관내 활성

2. 병아리에 대한 성장-자극 시험

구리용 병아리(arbor acre, 8일됨)에 대한 PA-45052-A, PA-45052-B 및 PA-45052-E의 성장-자극 활성을 참고 시약으로서 공징된 항생물질 티오펩틴을 사용하여 조사한다.

병아리에게 14일 동안 병아리 보육 상자에서 사료죽[조 단백질(CP) 농도 18%, 각 시료의 농도 20ppm, 다른 항생물질로 보충시키지 않음]을 먹인다. 이 시험의 방법은 하기와 같다, 병아리에게 0∼8일 동안 마루우리에서 사료(CP 농도 23%)를 먹이면서 키운 후, 병아리를 각군의 평균 중량이 동일하도록 5군(1군 24마리, 수컷 및 암컷이 각각 12마리씩)으로 나눈다. 각군에 14일 동알 PA-45052-A(20ppm), PA-45052-

B(20ppm), PA-45052-E(20ppm), 티오펩틴(20ppm) 또는 오직 사료(CP 18%) 만을 투여한다. 각군을 우리(435×600×410mm, 각 우리는 6∼7마리씩)에서 14일(병아리가 22일 될때까지) 동안 26±2℃에서 기른다. 체중 증가와 사료 효율로부터 효과를 측정한다. 결과는 하기와 같다.

병아리에 대한 성장-자극 효과

A : 평균 제중증가

SD : 표준 편차

B : 평균사료섭취

FCR : 사료효율(B/A)

괄호에서의 값은 대조군의 지수가 100일때의 지수이다.

(실시예)

본 발명은 실시예에서 상세히 기술하지만, 그러나 여기에 국한되지는 않는다.

(a) 발효 과정

0.5% 가용성 녹막, 0.5% 글루코오스, 0.5% 폴리펩톤, 0.5% 육즙, 0.25% 효모 추출액, 0.25% 염 및 탈이온수(pH 7.0, 살균진)로 구성된 800ml의 배양배지로 채워진 2ι 삼각플라스크에, 노카르디아 오리엔탈리스 PA-45052(FERM BP-1320)의 종배양 사면 접종시키고 180rpm으로 진탕하면서 28℃에서 48시간동안 배양한다. 각각 800ml의 이 배양액을 3.6% 덱스트린, 2.4% 당밀, 0.84% 박토펩톤, 0.12% L-리토신, 0.05% 안티포움 P-2000(antifoam P-2000, Dai Nippon Ink Chemicals Inc. 제품) 및 물(pH 7.0, 살균전)으로 구성된 30ι의 배양 배지로 채워진 50ι발효기에 이식시키고, 30ι/분의 통기, 0.35kg/cm²G의 내부 압력하에서 550rpm으로 교반하면서, 137시간 동안 32℃에서 배양한다.

(b) 분리 과정

상기 과정에서 수득된 배양액을 10% 수산화 나트륨으로서 pH l0.5로 조정하고 33ι의 상층액을 원심분리로 수득한다. 이 상측액을 pH 7.5로 조정한 후, 3.3/의 HP-20 컬럼(Mitsubishi Chemical Industries, Ltd. 제품)에 넣는다. 컬럼을 우선 23ι의 물로 그런 후 10ι의 15% 메탄올-0.005N 염산으로 세척하고 50% 메탄올-0.005N 염산으로 용출시킨다. 바실로스 서브틸리스(

)를 사용한 펄프 디스크 확산법에서 활성을 보이는 분획(9ι)를 합하고 pH 7로 조정한다. 분획을 진공으로 농축 및 동결 건조시켜 46.3g의 PA-45052 조분말을 수득한다.

(c) 정제 과정

PA-45052-A, -B 및 -C의 제조방법

10g의 상술한 조분말을 100ml의 물에 현탁시키고 1N 염산에 용해시켜 pH 2.0으로 조정한다. 현탁액을 100ml의 MCI 겔 CHP-209(Misubishi Chemical lndustries, Ltd.)에 넣고, MPLC로 분획에서 함량을 실험하면서 0.01N 염산, 10% 메탄올-0.01N 염산, 25% 메탄올-0.01N 염산의 순으로 용출시키고, PA-45052-A 및 -B를 포하마는 분획 및 PA-45052-C를 포함하는 분획으로 나눈다.

PA-45052-A 및 -B를 포함하는 분획을 pH 6.0으로 조정하고, 농축시킨 후 100ml의 CHP-20P에 넣고, HPLC로 함량을 시험하면서 물, 30% 메탄올-물, 50% 메탄올-물의 순으로 용출시켜 PA-45052-A를 포함하는 분획 및 PA-45052-B를 포함하는 분획을 수득한다. PA-45052-A를 포함하는 분획을 pH7.0으로 조정하고 농축시킨다. 팩트컬럼 RQ-2(Packed Column RQ-2, Fujigel Hanbal Co., Ltd. 제품)에 적용시킨 후, HPLC로 순도를 시험하면서 13% 아세토니트릴-0.05M 인산염 완충액(pH 7.0)(이하PBS로 약함) 및 15% 아세토니트릴-0.05M PHS(pH 7.0)의 순으로 용출시킨다. PA-45052-A 분획(HPLC 순도 95% 이상)을 합한 후, 혼합물을 농축시키고 12ml의 CHP-20P에 넣고, 물로 세척한 후 50% 메탄올-물로 용출시킨다. 생성물을 pH 4.0으로 조정하고, 농축 및 동결 건조시켜 198mg의 PA-45052-A(HCl) 을 수득한다.

PA-45052-B를 포함하는 분획을 pH 7.0으로 조정하고, 농축시키고 팩트 컬럼 RQ-2에 넣은 후, HPLC로 순도를 시험하면서 8% 아세토니트릴-0.05M PBS(pH 3 5) 및 10% 아세토니트릴-0.05M PBS(pH 3.5)의 순으로 용출시킨다. PA-45052-B분획(HPLC 순도 95% 이상)을 합한 후, 혼합물을 pH 7.0으로 조정하고, 농축시키고 12ml의 CHP-20P에 넣고, 물로 세척한 후 50% 메탄올-물로 용출시킨다.

그것이 색깔을 띄므로, 용액을 pH 7.0으로 다시 조정하고, 농축시킨 후, pH 4.0으로 조정하고 2ml의 CHP-20P에 넣고 0.00lN 염산으로 용출시켜 탈색시킨다. 그런 후, PA-45052-B의 분획을 수거하고, pH 7.0으로 조정하고 농축시킨다. 생성물을 12ml의 CHP-20P에 넣고, 물로 세척한 후 50% 메탄올-물로 용출시킨다. 생성물을 농축시키고, pH 4.0으로 조정한 후 동결건조시켜 290mg의 PA-45052-B(HC1)을 수득한다.

PA-45052-C를 포함하는 분획을 pH 8.5로 조정하고 100ml의 CHP-20P에 흡착시키고, 물 및 50% 메탄올-물로 세척하고 50% 메탄올-0.0lN 염산으로 용출시킨다. PA-45052-C를 포함하는 분획을 합하고 농축시킨 후, 용액을 팩트 컬럼 RQ-2에 넣고, HPLC로 순도를 시험하면서 15% 아세트니트릴-0.05M PBS(pH 3.5) 및 18% 아세토니트릴-0.05M PBS(pH 3.5)로 용출시킨다. PA-45052-C 분획(HPLC 순도 90% 이상)을 합한 후, 용액을 pH 8.0으로 조정하고, 농축시키고 12ml의 CHP-20P에 넣고, HPLC로 순도를 시험하면서 18% 아세토니트릴-0.05M PBS(pH 7.0), 21% 아세토니트릴-0.05M PBS(pH 7.0)의 순으로 용출시킨다. PA-45052-C의 분획(HPLC 순도 95% 이상)을 합하고, 용액을 농축시키고 12ml의 CHP-20P에 넣고, 물로 세척하고, 탈염시키고 50% 메탄올-물 및 50% 메탄올-0.0lN 염산의 순으로 용출시킨다. 용출액을 농축시키고, pH 2.5로 조정한 뒤 동결 건조시켜 365mg의 PA-45052-C(HC1)을 수득한다.

PA-45052-D의 제조방법

상술한 대로 20g의 PA-45052조 분말을 140ml의 물에 현탁시키고 1N 염산에 용해시켜 pH 2.0으로 조정한다. 이 용액을 100ml의 MCI겔 CHP 20P(Mitsubishi Chemical Industries, Ltd. 제품)에 넣고, HPLC로 분획을 시험하면서 0.0lN 염산으로 용출시킨다. PA-45052-B 및 -D를 포함하는 분획을 pH6.4로 조정하고, 농축시키고 CHP 20P(100ml)에 넣고, 다시 0.0lN 염산으로 용출시겨 PA-45052-B 및 -D를 포함하는 분획을 수득한다. PA-45052-B 및 -D를 포함하는 분획을 pH 7.0으로 조정하고 농축시킨 후, 팩트컬럼 RQ-2(Fujigel Hanbai Co , Ltd. 제품)에 적용시키고, 0.05M PBS(pH 7.0), 13% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0), 15% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0), 18% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0) 및 30% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0)의 순으로 용출시킨다. 30% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0)을 이용한 용출액으로부터, PA-45052-D를 포함하는 분획을 수득한다. PA-45052-D를 포함하는 분획을 농축시키고 MCI 겔 CHP 20P(10ml)에 흡착시키고, 물로 세척한 후, 25% CH₃OH-H₂O 및 50% CH₃OH-H₂O의 순으로 용출시킨다. 탈염 분획을 합하고 농축시킨다. 염산을 이용하여 pH 4.0으로 조정한 후, 동결건조시켜 PA-450562-D(665mg, 염산염)을 백색 비결정 분말로 수득한다.

PA-45052-E의 제조방법

상술한 대로 20g의 PA-45052 조분말을 140ml의 물에 현탁시키고 1N 염산에 용해시켜 pH 2.0으로 조정한다.

이 용액을 100ml의 MCI 겔 CHP 20P(Mitsubishi Chemical Iudustries, Ltd. 제품)에 넣고, 0.01N 염산, 10% 메탄올 -0.0lN 염산 및 25% 메탄올-0.0lN 염산의 순으로 용출시킨다. HPLC로 분획을 시험하면서, PA-45052-A, -B, -D 및 -E를 포함하는 분획 및 PA-45052-C 및 -F를 포함하는 분획을 수득한다. PA-45052-A, -B, -D 및 -E를 포함하는 분획을 pH 6.4로 조정하고 농축시킨 후, CHP20P(100ml)에 넣고,0.0lN 염산으로 다시 용출시켜 PA-45052-A를 포함하는 분획 및 -B, -D 및 -E를 포함하는 분획을 수득한다. -B, -D 및 -E를 포함하는 분획율 pH 7.0으로 조정하고, 농축시킨 후, 팩트 컬럼 RQ-2(Fijigel Hanbai Co., Ltd. 제품)에 넣고, 0.05M PBS(pH 7.0), 13% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0), 15% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0), 18% CH₃CN-0.05M pBS(pH 7.0) 및 30% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0)의 순으로 용출시킨다. 30% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0)을 이용한 용출액으로부터, -D를 포함하는 분획 및 -E를 포함하는 분획을 수득한다. PA-45052-E를 포함하는 분획을 농축시키고 MCI겔 CHP 20P(10ml)에 흡착시킨다. 물로 세척한 후, 25% CH₃OH-H₂O 및 50% CH₃OH-H₂O의 순으로 용출시킨다. 그런 후 -E를 포함하는 분획을 합하고 농축시킨다. 염산을 이용하여 pH 4.0으로 조정한 후, 동결 전조시켜 PA-45052-E(245mg, 염산염)을 백색 비결정 분말로 수득한다.

PA-45052-F의 제조방법

PA-45052-C 및 -F를 포함하는 분획율 pH 8.0으로 조정하고 CHP 20P(100ml)에 흡착시킨다. 물 및 50% 메탄올 용액으로 세척한 후, 50% 메탄올-0.0lN 염산으로 용출시킨다. PA-45052-C 및 -F를 포함하는 분획을 농축시키고 팩트 컬럼 RQ-2에 넣고, 15% CH₃CN-0.05M PBS(pH 3.5) 및 18% CH₃CN-0.05M PBS(pH 3.5)로 용출시켜 PA-45052-C 및 -F를 포함하는 분획을 수득한다. PA-45052-C 및 -F를 포함하는 분획을 pH 8.0으로 조정하고 농축한 후 CHP 20P(10ml)에 넣고, 18% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0), 21% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0), 30% CH₃CN-0.05M PBS(pH 7.0) 및 50% CH₃CN-0.0lN 염산의 순으로 용출시켜 PA-45052-C를 포함하는 분획 및 PA-45052-F를 포함하는 분획을 수득한다.

PA-45052-F를 포함하는 분획을 농축시키고 CHP 20P(10ml)에 흡착시키고, 물로 세척하여 탈염시킨후 50% 메탄올 용액 및 50% 메탄올-0.0lN 염산으로 용출시킨다. 농축시킨 후, pH 2.5로 조정하고 동결건조시켜 30mg의 PA-45052-F(염산염)을 수득한다.

(실시예 2)

(a) 발효 과정

0.5% 가용성 녹말, 0.5% 글루코오스, 0.5% 폴리펩톤, 0.5% 육즙, 0.25% 효모 추출액, 0.25% 염 및 탈이온수(pH 7.0, 살균전)로 구성된 800ml의 배양 배지로 채워진 2ι 삼각 플라스크에, 노카르디아 오리엔탈리스 PA-45052(FERM BP-1320)의 종배양 사면을 접종시키고 180rpm으로 진탕하면서 28℃에서 48시간 동안 배양한다. 이 배양액(800ml)을 상기와 동일한 성분으로 구성된 18ι의 배양 배지로 채워진 30ι발효기에 이식시키고, 18ι/분의 통기, 0.35kg/㎠G의 내부 압력하에서 200rpm의 교반속도로 23시간 동안 32℃에서 배양한다. 그런 후 8ι의 배양액을 2.0% 감자 녹말, 1 .0% 글루코오스, 3.0% 당밀, 1.1% 박토펩톤, 0.05% 안티포룸 P-2000(Dai Nippon Ink and Chemicals 제품) 및 물(pH 7.0 살균전)으로 구성된 165ι의 배양배지로 채워진 250ι 발효 탱크에 이식하고 165ι/분의 통기, 5psi의 내부 압력에서 350rpm의 교반속도로 32℃에서 164시간 동안 배양한다.

(b) 분리과정

상기 과정에서 수득된 배양액을 10% 수산화나트륨으로서 pH l0.5로 조정하고 140ι의 상층액을 원심분리로 수득한다. 이 상층액을 pH 7.5로 조정한 후, 15ι의 HP-20 칼럼(Mitsubishi Chemical Industries제품)에 적용시킨다. 우선 23ι의 물로 그런 후 30ι의 15% 메탄올-0.005N 염산으로 세척하고, 50% 메탄올-0.005N 염산으로 용출시킨다. 바실루스 서브틸리스를 사용한 펄프 디스크 확산법에서 활성을 보이는 53ι의 분획을 수거하고 pH 7로 조정한다. 끝으로, 이 혼합물을 진공으로 농축 및 동결 건조시켜 150.8g의 PA-45052조 분말을 수득한다.

6) 본 발명의 효과

시험관 내 항세균 활성을 하기에서 서술하는 대로 한전 희석법으로 결정한다.

① 세균 현탁액의 제조

사면상의 1루우프의 각 시험 세균을 1ml의 성강 배지(Trypto Soy Broth, Eiken Cemical Co. 제품)에 접종시키고 37℃에서 18∼20시간 보온시킨다. 스트렙토코카이(Streptococci)의 성장용으로, 3%(v/v)말 혈청이 보충된 뮐러-힌톤 브로쓰(Mueller-Hinton broth, Difco)를 사용한다. 배양액의 100배 희석액을 세균의 접종 현탁액으로 사용한다.

② 시료 용액

시료(9∼10mg)의 무게를 달고 2mg/ml의 농도로 증류수에 용해시킨다.

③ 한천 플레이트

시료 용액을 살균수(2000-0.25μg/ml)로 연속 2배 희석시킨다. 살균 플라스틱 페트리 디쉬(직경 9cm)에 0.5ml-분액의 시료 용액을 붓고, 9.5ml의 한천배지(민감성 시험 한천, Nissui)와 혼합한다. 스트렙토코카이용으로, 말 혈청을 0.5%(v/v) 공급한다.

④ MIC값의 측정

1루우프(l.0μl)의 접종 현탁액을 상술한 대로 제조된 한전 플레이트의 표면에 놓는다. 세균 성장을 37℃에서 하룻밤 동안(18∼20시간) 보온한 후 가시적으로 검사한다. 세균 성장이 완전히 억제되는 최저 농도를 MIC(최저 억제농도)로 결정한다.

결과는 표 1에 제시된다.

[표 1]

* : 메티실린-내성 세균

** : 페니실린-내성 세균

세포내 PA-45052-A,-B 및 -C의 항세균 활성은 하기 표 2에 제시된다.

시험방법 : 시험 생물을 Slc-ICR 암컷 생쥐(1군당 8마리)에 복강내로 접종하고 PA-45052-A,-B 또는 -C(2배 희석)을 한시간 후 및 5시간 후에 2회 피하 투여한다.

결과 50% 유효 투여량(ED₅₀)을 7일째 생존율로부터 계산한다.

[표 2]

* 메티실린-내성 세균

(실시예 3)

본 발명의 성장-자급제로서 각 화합물의 첨가는 하기와 같다

* 무기염의 혼합물 : 황산 망간, 황산아연, 황산구리, 황산 코발트 및 요오드화칼륨

* * 비타민 B의 혼합물 : 비타민 B_l, B₂, B₆및 B₁₂, 바이오린, 플산, 칼슘 판토테네이트

* 비타민 및 무기염의 혼합물 : 비타민 A, D₃, E, B_l, B₂, B₆, B₁₂및 K₄, 칼슘 판토테네이트, 니코틴아미드, 콜린 클로라이드, 황산 마그네슘, 황산 철, 황산 구리, 황산 아연, 황산 코발트 및 요오드화 칼륨

(4) 하나 이상의 PA-45052를 시약-보충 사료를 제조하기 위해 상기와 유사한 방법으로 혼합한다.

Claims (9)

1. 하기 일반식의 화합물 PA-45052 및 그의 약학적으로 수용 가능한 염.

   

   (식중, R은

   

   또는 H 이고 R₁은 CH₃또는 H이다.)
2. 제 1항에 있어서, R이

   

   이고, R₁이 H인 화합물 PA-45052-A.
3. 제 1항에 있어서, R이

   

   이고, R₁이 H인 화합물 PA-45052-B.
4. 제 1항에 있어서, R이 H이고 R₁이 H인 화합물 PA-45052-C.
5. 제 1항에 있어서, R이

   

   이고, R₁이 CH₃인 화합물 PA-45052-D.
6. 제 1항에 있어서, R이

   

   이고, R₁이 CH₃인 화합물 PA-45052-E.
7. 노카르디아 오리엔탈리스 종에 속하는 하나 이상의 PA-45052-A, -B, -C, -D, -E 및 -F화합물을 생산하는 균주를 배지에서 배양하고 배양 배지로부터 하나 이상의 PA-45052-A, -B, -C, -D, -E 및 -F화합물을 수거함을 특징으로 하는 하나 이상의 PA-45052-A, -B, -C, -D, -E 및 -F화합물의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상술한 생물이 노카르디아 오리엔탈리스 PA-45052인 제조방법.
9. 제1항에 내지 제6항의 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 동물용 성장-자극.

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