KR960004036B1 - 세팔로스포린 c를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 세팔로스포린 c의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
본 발명은 세팔로스포린 C를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 세팔로스포린 C의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC 10679의 변이주들로서 폴리엔계 항생물질인 나이스타틴 또는 암포테리신 B에 내성을 가지며 주성분이 이성화 액당, 혼합오일, 땅콩분, 콘스팁리커인 배지에서 배양시 세팔로스포린 C를 고농도로 생산할 수 있는 미생물에 관한 것이다.
종래 미생물을 이용하여 세팔로스포린 C를 생산하는 방법의 경우 균체내에서 생성된 세팔로스포린 C가 균체외로 용이하게 분비되지 않을 경우 균체내에 세팔로스포린 C가 과도하게 축적되어 세팔로스포린 C의 생합성에 관여하는 효소들이 저해를 받아 세팔로스포린 C의 생산성이 저하될 수 있는 문제점이 있었다.
일반적으로 세균의 경우 세포막의 구조를 변화시켜 막투과성을 향상시키기 위한 방법으로 폴리믹신 B, 페니실린 G, 바시트라신 등의 항생제에 대해 내성을 가진 균주들을 얻어 이중 발효능력이 뛰어난 변이주를 획득하는 균주개발법이 이용되고 있다.
본 발명에서 이용되는 미생물은 세균이 아니고 진균이라는 점을 감안하여 진균의 생육을 저해하는 항진균제를 찾은 결과 폴리엔계 항생물질을 이용하게 되었다. 폴리엔계 항생물질은 26-28개의 락톤과 3-7개의 공역이중결합을 갖는 항생물질로 나이스타틴, 암포테리신 B, 트리코마이신 등을 예로 들수 있다. 폴리엔계 항생물질은 곰팡이나 효모에 유효하며 세균에는 무효하다. 즉, 진핵생물의 막스테롤에 영향을 주어 막투과성을 변화시켜 세팔로스포린 C의 생산성을 향상시킨다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 미생물, 즉 나이스타틴 내성주와 암포테리신 B 내성주는 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC 10679를 친주로 하여 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)등의 변이유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한 후 나이스타틴 또는 암포테리신 B가 각각 10-300㎍/ml, 0.01-0.5㎍/ml의 농도로 함유되어 있는 액체 또는 한천배지(포도당 10g/L, 아스파라긴 1g/L, 황산마그네슘 0.5g/L, 인산제 1 칼륨 0.5g/L, 인산제 2 칼륨 1g/L, pH 7.0)에서 7-10일간 배양하였다. 이때 부분의 균주들은 폴리엔계 항생물질의 농도가 높아 생육할 수 없으며 항진균제 내성이 높은 균주는 생육이 가능하므로 친주에 비해 폴리엔 항생물질의 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concetration : MIC)가 2배 이상되는 변이주를 얻을 수 있었고 이 내성주들 중에서 세팔로스포린 C의 생산성이 향상된 나이스타틴 내성주 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC10783과 암포테리신 B 내성주 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC 10784를 1992년 11월 3일 한국종균협회에 기탁하였다. 상기 균주들의 균학적성질을 폴리엔 항생물질 내성 및 세팔로스포린 C의 생산성을 제외하고는 친주의 그것과 동일하다.
본 발명 미생물의 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.
[표 1] 나이스타틴 농도에 대한 내성비교
[표 2] 암포테리신 B 농도에 대한 내성비교
(주) 사용배지 ; 한천배지
+ ; 생육, - ; 생육치 못함
이하 본 발명을 다음의 실시예에서 좀더 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
· 사용균주 : 본 발명 미생물(KFCC10783, KFCC10784)
· 1차 종배지 : 대두분 3.0%, 콘스팁리커 0.75%, 설탕 2.5%, 포도당 1.0%, 탄산칼슘 0.5%, 소포제 0.15%, pH 7.0
· 2차 종배지 : 대두분 3.0%, 땅콩분 3.0%, 콘스팁리커 1.5%, 설탕 2.5%, 포도당 1.0%, 탄산칼슘 0.5%, 소포제 0.15%, pH 6.9
· 발효배지 : 이성화액당 4.5%, 혼합오일 7.0%, 땅콩분 2.5%, 콘스팁리커 3.5%, 콘밀 1.5%, 글루텐밀 3.0%, D,L-메타오닌 0075%, 황산칼슘 1.0%, 소포제 0.1%, pH 6.9
· 1차 종배양 : 1차 종배지를 50ml 씩 500ml용량의 진탕용 삼각플라스크에 넣고 살균후 균주를 식균하여 30℃에서 220rpm으로 90-96시간 진탕배양하였다.
· 2차 종배양 : 2차 종배지를 7ℓ용량의 시험용 발효조에 각 5ℓ씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균 냉각후 1차 종배양에서 얻은 배양 완료액을 15㎖씩 접종한 다음, 공기를 매분당 0.5-1.0ℓ 공급하면서 600-900rpm으로 30℃에서 80-90시간 배양하였다.
· 발효방법 : 상기 발효배지를 30ℓ용량의 시험용 발효조에 19.4ℓ씩 분주하고 121℃에서 30분간 살균, 냉각하여 2차 종배양액을 1.6ℓ씩 접종한 후 공기를 매분당 0.5-1.0ℓ씩 공급하면서 300-600rpm 25-30℃로 배양하였다. 배양중 잔존 혼합오일 농도가 4-5%가 되면 살균된 혼합오일을 수시로 공급하였다.
추가된 혼합오일과 초기에 발효배지에 첨가된 혼합오일의 합계가 발효액량 대비 12-17%가 될 때까지 계속 배양하였다. 배양중 pH는 암모니아수를 사용하여 5.0-6.0으로 조절하였다. 배양완료후 세팔로스포린 C의 농도는 KFCC 10679RK 35.7g/L, KFCC 1078301 40.2g/L이었다.
[실시예 2]
사용균주, 1차 및 2차 종배지, 발효배지 조성과 배양방법을 실시예 1과 동일하게 행한 결과, 배양완료후 세팔로스포린 C의 농도는 KFCC 10679가 35.3g/L, KFCC 10784가 39.7%g/L이었다.
상술한 바와 같이 본 발명의 미생물들은 폴리엔계 항생물질에 대해 내성을 부여 받게 되어 막투과성이 변화됨에 따라 세팔로스포린 C의 생산농도가 향상된다는 것이 확인되었다.
Claims (4)
- 폴리엔계 항생물질인 나이스타틴의 농도가 50㎍/ml이상인 조건에서도 생육할 수 있는 세팔로스포린 C를 생산하는 미생물 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC 10783.
- 폴리엔계 항생물질인 암포테리신 B의 0.1㎍/ml이상인 조건에서도 생육할 수 있는 세팔로스포린 C를 생산하는 미생물 세팔로스포리움 아크레모니움 KFCC 10784.
- 제 1 항의 미생물을 이성화액당, 혼합오일, 땅콩분, 콘스팁리커 등이 함유된 배지중에서 배양하여 세팔로스포린 C를 채취하는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 제조방법.
- 제 2 항의 미생물을 이성화액당, 혼합오일, 땅콩분, 콘스팁리커 등이 함유된 배지중에서 배양하여 세팔로스포린 C를 채취하는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 제조방법.
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