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KR950013858B1 - L-트립토판의 제조방법 - Google Patents

L-트립토판의 제조방법 Download PDF

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KR950013858B1
KR950013858B1 KR1019890701058A KR890701058A KR950013858B1 KR 950013858 B1 KR950013858 B1 KR 950013858B1 KR 1019890701058 A KR1019890701058 A KR 1019890701058A KR 890701058 A KR890701058 A KR 890701058A KR 950013858 B1 KR950013858 B1 KR 950013858B1
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indole
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사토시 모리타
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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
L-트립토판의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 L-트립토판(tryptophan)의 제조방법, 특히 고정화 효소원(immobilized enzyme source)을 사용하여 L-트립토판을 연속적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
[배경기술]
L-트립토판은 아미노산의 일종으로서, 수혈액 성분으로서 의약분야에서 사용된다. 또한 사료용 첨가물로서 L-트립토판의 용도개발이 추진되고 있으며, 많은 수요가 예상되고 있다.
L-트립토판은 통상 트립토판 합성효소(synthase) 및 트립토파나제(tryptophanase)와 같은 효소를 사용하는 효소반응에 의해 제조되고 있다. 고정화 효소원을 사용하는 이들 방법은 고정화 효소원으로부터 L-트립토판을 분리 및 정제하기가 용이하기 때문에 주목을 끌고 있다.
고정화 효소원을 사용하여 L-트립토판을 공업적으로 제조하는 경우 소규모생산으로서는 회분식(배치식) 공정법을 사용할 수 있으나 대규모 생산에는 여러가지 점에서 연속 공정법이 유리하다.
연속 공정법의 성패 여부는 고정화 효소원의 활성 수명(life time)을 연장할 수 있는가에 따라 좌우된다. 고정활 효소원의 활성 수명의 연장은 고정화 효소원 자체의 개량 및/또는 반응 조건의 적절한 설정(선택)에 따라서 결정된다. 고정화 효소원 또는 효소자체의 개량이 유전자 재조합 기술등을 이용한 것이라 하더라도 만족할만한 결과는 아직 얻지 못하고 있다. 또한, 고정화 효소원 또는 효소 자체가 개량된다 할지라도, 활성 수명의 연장은 반응조건의 적절한 선택에 크게 좌우되는 것으로서 이을 위해서는 장시간이 필요하다.
아직까지 고정화 효소의 수명 연장은 달성되지 않고 있다.
[발명의 개시]
그러므로, 본 발명의 목적은 L-세린 및 인돌로부터 L-트립토판을 제조하는 방법을 제공하는 것으로서 이때 반응 조건을 적절히 선택함으로서 고정화 효소원의 활성수명이 연장되며, 이로써 제조된 L-트립토판의 농도는 증가될 수 있다.
본 발명자들의 연구결과, 반응 혼합물중에서 L-세린의 몰수가 인돌 및 L-트립토판의 총몰수 보다 과잉으로 존재한다면 고정화 효소원의 수명이 연장되며, 이로 인하여 생성된 L-트립토판의 농도가 증가한다는 것이 발견되었다.
즉, 본 발명은 고정화 효소원을 사용하여 인돌 및 L-세린을 반응시킴으로써 L-트립토판을 연속적으로 제조하는 방법을 제공하는 것으로서 반응 혼합물중에 존재하는 L-세린의 몰수가 반응 혼합물중에 존재하는 인돌 및 L-트립토판의 총몰수 보다 큰것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 의하면, 고정화 효소원의 수명은 L-트립토판의 축적량에 연장될 수 있으므로, L-트립토판은 이돌 및 L-세린으로부터 장시간 동안 연속적으로 제조될 수 있다. 또한 제조된 L-트립토판의 농도를 통상의 방법으로 제조한 농도보다 크게 증가시킬 수 있다.
[본 발명의 바람직한 실시태양]
본 발명에서 "고정화 효소원"이란 고정화 트립토판 합성요소, 트립토파나제 또는 이들 효소중 적어도 하나를 생성하는 고정화 미생물을 의미한다.
공지된 트립토판 합성효소-생성 미생물로는 에세리히아 콜리 MT-(FERMBP-19), 에세리히아 콜리 MT-10242(FERM BP-20) 및 뉴로스포라크라사(ATCC14692)를 들 수 있다. 공지된 트립토파나제-생성미생물로는 프로테우스불라리스(IFO 3167), 에세리히아 콜리(IAM 1268), 에어로박터 에어로게네스(IFO 12019) 및 클레브시엘라 뉴모니에(ATTCCF 8724)를 들 수 있다. 고정화 효소원의 제조방법 즉, 효소 또는 미생물을 고정화 시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를들면, 상기 효소 또는 미생물은 알긴산 칼슘 및 알긴산 알루미늄과 같은 알긴산염 또는 공지된 통상의 방법에 의하여 카라기난(carrageenan)과 같은 담체내에 고정화시킬 수 있다.
본 발명의 과정에서, 반응 혼합물중의 L-세린의 몰수는 인돌 및 L-트립토판의 총몰수 보다 과잉량으로 존재한다. 제조된 L-트립토판의 농도가 높은 경우 예를들어, L-트립토판이 다중 반응기를 사용하여 연속적으로 제조되는 경우 또는 반응기내에서 반응 혼합물을 순환시켜 연속적으로 제조하는 경우 L-세린의 총몰수가 인돌 및 L-트립토판의 총몰수 보다 약간만 높더라도 본 발명의 효과를 얻을 수 있지만, 공업적 방법에 적합하도록 고정화 효소원의 수명을 충분히 연장시키기 위해서는 반응 혼합물중의 L-세린의 몰수가 인돌 및 L-트립토판의 총몰수의 1.2배가 되는 것이 바람직하다. 또한, 인돌은 L-트립토판에 비하여 효소활성을 크게 억제시키므로 반응 혼합물중의 L-세린의 몰수를 인돌의 몰수의 1.5배로 하는 것이 바람직하다. 비록 L-세린의 몰수가 인돌 및 L-트립토판의 총몰수 보다 훨씬 높게 존재한다할지라도, 본 발명에 역효과를 미치지는 않는다. 따라서, L-세린의 과잉 몰수는 미반응 L-세린의 회수나 재순환에 적합하도록 적절히 선택될 수 있다. 실질적인 견지에서 볼때, 통상적으로, L-세린의 몰수는 인돌 및 L-트립토판의 총몰수의 10배를 초과하지 않는다. 라세믹 세린내의 L-세린의 함량이 본 발명에서 정의하는 범위내에 있는한 라세믹 세리을 본 발명의 과정에 도입할 수 있음을 숙지해야 한다. L-트립토판이 출발 혼합물에 함유될 필요가 없음은 물론이다.
본 반응은 25-65℃의 온도에서 실시하는 것이 바람직하지만 상기 온도로 한정되는 것은 아니다. 효소반응 속도를 높임과 동시에 L-트립토판의 용해도를 높이기 위해서는 허용 범위내에서 상기 반응을 고온으로 실시하는 것이 바람직하다.
L-트립토판은 양성 전해질이며 용해도는 pH에 따라 다르기 때문에, L-트립토판의 축적 농도를 높이기 위해서는 효소 활성이 허용되는 범위내 pH를 등전점(isoelectric point) 근처로 조절하는 것이 바람직하다. 많은 경우에 있어서 반응 혼합물의 pH는 효소의 최적 pH와는 다를 수 있으며, 따라서 고정화 효소원의 수명은 연장될 수 있다. 반응 혼합물의 pH는 통상 6 내지 11이며, 바람직하게는 6.5 내지 10.0이다.
본 발명의 방법에서는, 피리독살 인산염과 같은 조효소를 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 또한, 알긴산 칼슘 또는 알긴산 알루미늄을 고정화 담체로서 사용하는 경우에는 칼슘 이온 또는 알루미늄 이온을 첨가하여 겔의 붕괴를 방지할 수 있다.
상기 반응은 탱크 반응기를 사용하는 반복 회분식 공정 또는 연속 유동 반응 혼합물에 의해 실시되거나, 고정배드 반응기 또는 유동헤드 반응기를 사용하는 연속 유동 반응 혼합물에 의해 실시될 수 있다. 또 상기 형태의 반응기를 결합하여 사용할 수도 있다. 예를들면, 인돌 및 L-트립토판 및 이들의 총몰수 보다 과잉량의 L-세린 및 효소 활성을 촉진시킬 수 있는 상기의 성분(임의성분)을 함유하는 급액하며, 상기 반응기에서 새로 생성된 L-트립토판을 함유하는 반응 생성물 혼합액은 급액 반응 혼합물의 공급속도와 동일한 유속으로 회수한다. 후술하는 실시예 3에 제시된 바와 같이 본 발명의 특히 바람직한 양태에서 상기 반응은 다수의 일련적으로 연결된 교반탱크 반응기중에서 실시되며, 본 발명의 조건은 각각의 반응조에서 얻어진다. 이 과정에서, 반응기로부터 유출된 반응 생성 혼합물은 2차 또는 계속되는 반응기로 공급된다. 이 경우, 본 발명의 조건이 어떤 반응기에 있어서 요구조건을 충족시키지 못하게되면 이전의 반응기로부터의 반응 생성 혼합물 이외에 L-세린이 추가로 반응기에 공급된다.
본 발명의 방법에 의하면 반응 혼합물 중에 용해된 L-트립토판에 관계없이 인돌 및 L-세린으로부터 L-트립토판을 200시간 동안 지속적으로 제조할 수 있으며 따라서 고정화 효소원으 수명을 크게 연장시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면 L-트립토판의 농도를 통상의 제조방법에 비하여 높일 수 있다. 예를들면, 후술되는 다수의 반응기를 사용하여 L-트립토판을 연속적으로 제조하거나 또는 단일 반응기중에 반응 혼합물을 순환시켜 L-트립토판을 연속적으로 제조함으로써 10g/l 또는 그 이상의 농도를 갖는 L-트립토판을 얻을 수 있기 때문에, L-트립토판을 공업적으로 제조하는데 특히 유리하다.
[실시예]
본 발명은 후술되는 실시예에 근거하여 좀더 자세히 설명될 수 있다.
[실시예 1]
[고정화 효소원의 제조]
트립토판 합성효소-생성 박테리아인 에세리히아 콜리 MT-10232(FERM BP-19)를 500ml 플라스크에 함유된 하기 표 1에 나타낸 조성을 갖는 100ml의 배양 배지에 접종하여 24시간 동안 배양시켰다. 이 배양물 200ml(플라스크 2개)을 30ℓ 발효조에 함유된 하기표 2에 나타낸 조성을 갖는 15ℓ의 배양 배지에 접종한뒤, 생성된 배양배지를 35℃, pH 6.8(28% 암모니아수로 조정)로 30시간 배양하였다.
[표 1]
배양 배지의 조성
Figure kpo00001
[표 2]
증식 배지의 조성
Figure kpo00002
배양 종료후, 배양 배지를 원심 분리하여 600g(습윤중량)의 박테리아 세포를 얻었다. 상기 세포를 밀봉용기에 넣어 4℃의 냉장고에 보관하고, 고정화 효소원의 제조에 사용하였다.
상기 박테리아 세포 1부 및 생리 식염수 1부를 교반 혼합하였다. 한편 증류수 7.76중량부 및 알긴산나트륨(키분 푸드 케미파(주)에서 NSPLL이라는 상표명으로 시판) 0.24중량부를 교반하여 pH를 가성소다(NaOH)로 8.5로 조절하다.
상기 세포 현탁액 2부 및 상기 알긴산 나트륨 용액 8부를 교반 혼합한뒤 생성된 혼합물을 주사기에 공급하여 내경이 0.5mm 내지 0.8mm인 주사기의 선단으로부터 겔 용액에 적하하였다.
상기 겔 용액은 0.5몰 농도의 염화칼슘 2수화물(디히레이트)용액을 6노르말(N) 수산화칼륨 용액으로 pH를 8.5로 조절하여 10℃에서 보존 한뒤 10부의 양으로 사용하였다.
상기 혼합물을 겔 용액에 적하하여 생성된 입자를 겔 용액중에서 약 1시간 동안 교반 숙성하여 고정화 효소원을 수득했다.
[L-트립토판의 합성반응]
L-세린의 농도를 제외하고는 표 3에 제시한 것과 동일한 조성을 갖는 A, B, C 및 D용액을 제조한뒤, pH를 8.5로 조정하였다. 각각의 용액 10ml 및 상기 고정화 박테리아세포 50ml를 교반기가 장착된 500ml 유리 반응기에 넣은 뒤, 반응기를 온수욕중에 담그어 반응기의 온도를 35℃로 유지하였다.
이어서, 각 반응기에 장입 용액과 동일한 조성을 갖는 용액을 50ml/시의 유속으로 연속적으로 급액하였으며, 반응 혼합물을 동일한 유속으로 반응기로부터 연속적으로 배출시켰다. 일정시간 간격으로 반응혼합물의 부분액으로 샘플로 채취한뒤, 반응 생성액중의 L-트립토판의 농도, 잔존 인돌 농도 및 잔존 L-세린 농도를 고속 액체 크로마토그래프법을 사용하여 측정하였다. 공급한 인돌에 대해 반응기내에서 새로 생성된 L-트립토판의 수율을 측정했으며, 그 수율이 50%로 감소도는 기간 즉, 효소 활성의 반감기를 측정하여 이 결과를 효소의 수명으로서 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure kpo00003
[실시예 2]
급액 반응 혼합물의 조성물 L-트립토판 30g/l, 인돌 2g/l, 염화칼슘, 2수화물 2.5g/l, 피리독살 인산염 10mg/l, 및 L-세린을 인돌 및 L-트립토판판의 총몰수의 약 4배에 상응하는 70g/l로 하고, 반응혼합물의 pH를 10.0, 반응 온도를 40℃로 유지하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 연속반응을 실시하였다. L-트립토판의 수율의 505로 감소되는 반응시간은 650시간이었다.
[실시예 3]
본 실시예에서, 고정화 효소원의 제조방법, 반응기의 유형, 반응기 내의 혼합물의 함량 및 사용된 고정화 효소의 함량은 실시예 1과 동일하다. 그러나, 본 실시예에서는 4개의 반응기를 파이프를 통하여 일련으로 연결하여, 이전의 반응기로부터 나온 혼합물만을 다음의 반응기내로 급액하였다.
표 4에 나타낸 조성을 갖는 반응 혼합물을 48ml/시의 속도로 첫번째 반응기에 공급한뒤, 62.5g/l의 농도를 갖는 메탄올 중의 인돌 용액을 2ml/시의 속도로 첫번째 반응기로부터 4번째 반응기 모두에 적하하였다. 또한, 3번째 반응기에, 분말상 L-세린을 0.655g/시의 속도로 연속 첨가하여 L-트립토판의 합성 반응을 실시하였다. 또, 비교할 목적으로, 3번째 반응기에 첨가하지 않고 동일한 과정을 실시하였다. 이경우, 비록 3번째 반응기내의 반응은 본 발명에서 정의한 조건하에서 실시된다할지라도, 4번째 반응기에서 L-세린의 함량은 본 발명에서 정의한 최저 한계보다도 작게 나타났다.
[표 4]
Figure kpo00004
각 반응기내의 효소의 수명을 하기표 5에 나타내었다. 또한 각 반응기의 입구에서 인돌에 대한 L-세린의 몰비와 인돌 및 L-트립토판의 총량에 대한 L-세린의 몰비도 하기표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure kpo00005
만일 첫번째 반응기만을 사용하여 상기 반응을 실시한다면, L-세린이 과잉으로 존재한다할지라도 급액 반응 혼합물내의 인돌의 최대 장입은 0.125g/시이며, 따라서 반응 혼합물내의 L-트립토판의 최대 생산율은 0.2179g/시이고 그 농도는 4.36g/l이다. 이들은 산업적 방법으로는 만족스럽제 못한 것이다.
본 실시예에서 알 수 있듯이, 상기 반응을 본 발명에서 정의한 조건(즉, L-세린을 추가로 3번째 반응기에 첨가하는 것)에서 연속적으로 실시하면 고정화 세포의수명은 크게 연장될 수 있다. 한편, L-세린을 3번째 반응기에 추가로 첨가하지 않는다면, 인돌 및 L-트립토판에 대한 L-세린의 몰비는 본 발명에서 정의한 범위를 벗어나므로 고정화 세포의 수명은 만족할 만큼 연장될 수 없다.
[산업적 이용 가능성]
본 발명의 방법은 수혈액의 성분 또는 사료용 첨가물로서 유용한 L-트립토판의 산업적 연속 제조 방법에 적용될 수 있다.

Claims (3)

  1. 고정화 효소원을 사용하여 인돌 및 L-세린을 반응시킴으로써 L-트립토판을 연속적으로 제조하는 방법에 있어서, 반응 혼합물 내에서 L-세린의 몰수를 인돌 및 L-트립토판의 총몰수 보다 과잉으로 존재케 하는 것을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 L-세린의 몰수는 인돌과 L-트립토판의 총몰수의 1.2배 이상이며, 인돌의 몰수의 1.5배 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 반응은 다수의 반응기내에서 실시되며, 제 1 항에서 규정된 반응 조건이 각 반응기내에서 충족되고, 이전의 반응기로부터 유출된 반응 새성물은 두번째 및 다음의 반응기로 첨가되며, 제 1 항에서, 규정한 조건을 만족시키기 위하여 필요하다면, L-세린을 반응기에 첨가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1019890701058A 1987-10-12 1988-10-12 L-트립토판의 제조방법 Expired - Lifetime KR950013858B1 (ko)

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JP25472887 1987-10-12
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