KR950008573B1 - 인간 췌장 포스포리파제 a₂에 대해 특이성을 갖는 단클론성 항체 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인간 췌장 포스포리파제 A2에 대해 특이성을 갖는 단클론성 항체

제1도는 단클론성 또는 다클론성 항체를 이용하는 방사선 면역 분석법에서의 췌장 PLA₂의 표준 곡선을 나타낸다.

본 발명은 인간 췌장 포스포리파제 A₂에 대해 특이성을 갖는 단클론성 항체, 그의 제조방법, 그것을 생산하는 하이브리도마 및 그것을 이용한 인간 췌장 포스포리파제 A₂의 분석법에 관한 것이다.

포스포리파제 A₂(이후, PLA₂로 표기한다.)는 디아실글리세로포스리피드의 2위치인 에스테르 결합을 가수분해하는 효소이다. PLA₂및 췌장에서의 분비되는 소화 효소인 PLA₂로 분류된다. 후자는 췌장 포상 세포에서 프로포스포리파제 A₂로 생산되어 췌관 중으로 분비된다. 그 후에 십이지장에서 주로 트립신에 의해 가수분해되어 7개의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노 말단 펩티드 사슬이 제거됨으로써 활성 PLA₂로 된다. 지금까지 췌장 및 췌액으로부터 인간 췌장 PLA₂분리하는 것이 보고 되어 있다. (Magee, W.L. et al, Biochem. J. 83, 17-25, 1962 ; Grataroli, R. et al. Biochimie 63, 677-684, 1981 ; Nishijima, J. et al, J. Biochem., 94, 137-147, 1983등).

췌염에 있어서, 췌장 PLA₂의 혈중 농도가 상승되는 것이 보고되어 있다. 따라서, 췌장 PLA₂의 분석은 급성 췌염을 포함하여 급성 복증을 진단하는데 이용될 수 있다.

종래에는 혈청중의 췌장 PLA₂가 효소학적으로 분석되었다. 그러나 혈청중의 췌장 PLA₂의 효소 활성이 낮기 때문에 이 분석법은 장기간의 복잡한 공정을 필요로 하게 되고, 따라서 이 분석법을 급성 복증의 진단에 임상학적으로 응용하는 것은 실질적으로 불가능하다.

췌장 PLA₂의 변역 분석법으로는 나시지마 등(Nishijima et al., J. Biochem. 94, 137-147, 1983)에 의한 방사선 면역 분석법 및 에스콜라 등(Eskola et al., Clin. Chem. 29, 1777, 1983)에 의한 형광 면역 분석법이 보고되어 있다. 상기 두 방법에 따르면 급성 췌염에서의 PLA₂의 혈중 농도는 정상 농도보다 높다. 이 사실은 급성 췌염을 포함한 급성복증의 진단에 면역 분석법을 이용할 수 있음을 시사한다.

상술한 대로, 인간췌장 PLA₂는 경우에 따라 면역학적으로 분석할 수 있다. 그러나, 상기 보고에서 이용된 항체는 다클론성 항체(토기 할혈청)이다. 다클론성 항체는 특이성, 균일성, 안정한 공급 등의 점에서 단클론성 항체보다 불리하다. 더구나 높은 친화력을 갖는 다클론성 항체가 얻어진다면 이로부터 보다 간편하고 빠른 인간 췌장 PLA₂분석법을 개발할 수 있게 된다.

본 발명은 인간 췌장 PLA₂에 대해 높은 친화력을 갖는 단클론성 항체, 그의 제조방법, 그것을 생산하는 하이브리도마 및 그것을 이용하는 인간 췌장 PLA₂의 면역 분석법을 제공한다.

항-인간 췌장 PLA₂단클론성 항체를 생산하는 본 발명의 하이브리도마는 완전히 클론화된 세포주이다.

이들을 배양함으로써 상술한 단클론성 항체가 효과적으로 제조된다. 방사선 면역 분석법 같은 면역 분석법에서 다클론적 항체를 이용함으로써 급성 췌염을 포함한 급성 복증의 신속한 진단이 가능해진다.

본 발명은 인간 췌장 PLA₂에 대해 높은 친화력을 갖는 단클론성 항체, 그의 제조방법, 그것을 생산하는 하이브리도마 및 그것을 이용하는 인간 췌장 PLA₂면역 분석법을 제공한다.

항-인간 췌장 PLA₂단클론성 항체를 생산하는 본 발명의 하이브리도마는 완전히 클론화된 세포주이다. 이들을 배양함으로써 상술한 단클론성 항체가 효과적으로 제조된다. 방사선 면역 분석법 같은 면역 분석법에서 단클론성 항체를 이용함으로써 급성 췌염을 포함한 급성 복증의 신속한 진단이 가능해진다.

본 발명은 인간 췌장 PLA₂에 대해 높은 친화력 및 특이성을 갖는 단클론성 항체 및 그것을 이용한 급성췌염 등의 진단에 효과적인 분석법을 제공한다.

본 발명자들은 상기 상황을 검토한 결과, 높은 친화력 및 특이성을 갖는 단클론성 황체를 얻었다.

본 발명의 항-인간 췌장 PLA₂단클론성 항체는 골수종 세포를 인간 췌장 PLA₂-면역화 생쥐로 부터 얻은 임파구와 융합시켜 제조한 하이브리도마에 의해 생산된다.

본 발명의 단클론성 항체를 얻기 위해서는 면역원인 인간 췌장 PLA₂를 정헤잘 필요가 있다. 정제는 상술한 보고서에 기재된 것과 같은 방법에 따라 수행할 수 있다.

생쥐같은 실험용 동물을 면역원인 정제된 인간 췌장 PLA₂로 면역화한다. 면역화화는 통상의 방법, 예를들어 생리 식염수에 용해시킨 항원을 프로인트 완전 보조액과 혼합하여 제조한 에멀션을 주사함으로써 실시 할 수 있다.

B임파구를 상술한 방법에 따라 면역화한 동물로 부터 제조하고 영구 골수종 세포주와 융합시킨다. 이 융합은 통상법(K

hler and Milstein, Nature, 256, 497, 1975)에 따라 수행할 수 있다. 수득된 하이브리도마로 부터 항-인간 췌장PLA₂항체를 생산하는 하이브리도마를 선택한다.

이 선택은 효소 면역 분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 및 방사선 면역 분석법과 같은 적절한 방법에 의해, 배양 상충액 중의 항-인간 췌장 PLA₂항체를 분석함으로써 행한다. 항-인간 췌장 PLA₂항체가 검출되는 상충액의 하이브리도마를 약 10ml의 배지에 증식시키고 동결 보존한다. 동시에 상충액을 회수하고, 상충액 중의 항체의 특성을 검사하여 목적하는 특성을 가진 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하다. 선택한 하이브리도마를 한계 회석법과 같은 통상의 방법으로 클론화하여 세포주를 확립한다. 확립된 세포주를 면역학에 쓰인 것과 동일한 종의 동물의 복강 내에 이식하여 고농도의 항체를 함유하는 복수를 얻거나 또는 배지에서 배양하여 배앙액으로 부터 항체를 얻는다.

상기 제조한 항체는 필요에 따라, 예를 들면 황산 암모늄 분획, 이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피와 같은 통상법에 따라 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 항-인간 췌장 PLA₂항췌-생산 생쥐 하이브리도마 세포주 1008-1및 1085-2와 그에 의해 생산되는 단클론성 항체 1008-1 및 1085-2는 상술한 방법에 따라 얻어진다.

상기 수득된 하이브리도마 세포주는 1987년 4월 8일 이후 부다페스트 조약하에 영국 PHLS CAMR, 포오튼 다운, 살리스베리, SP4 OJG에 위치한 유러피언 콜렌션 오브 애니멀 셀 컬쳐스(European collection of Animal Cell Cμltures, ECACC)에 다음의 수탁번호로 기탁되어 있다.

하이브리도마 1008-1: 87040803

하이브리도마 1085-2: 87040802

단클론성 항체 1008-1 및 1085-2는 다음 특성을 갖는다.

(1) 면역 글로불린 클래스 및 서브클래스 IgG₁이고 L 사슬은 k형이다.

(2) 1008-1 및 1085-2의 결합 상수는 각각 4×10¹¹M^-1및 ×10¹²M^-1이다. 둘다 모두 높은 친화력을 갖는다.

(3) 두 단클론성 항체는 모두 돼지 췌장 PLA₂및 인도 코브라 뱀독(Naga naja venom) PLA₂와 전혀 교차 반응을 일으키지 않으며, 인간 췌장 PLA₂에 대해 특이적이다.

그러므로, 본 발명의 단클론성 항체는 인간 췌장 PLA₂ 에 대해 특이성을 가지며 매우 높은 친화력을 나타낸다. 따라서, 이들은 인간 췌장 PLA₂의 면역 분석법에 매우 유용하다.

인간 혈청중의 PLA₂를 복수 1008-1A 또는 1985-2A를 이용하는 방사선 면역 분석법에 이해 측정하면 PLA₂ 농도 1008-1A를 이용하는 경우에는 정상 성인에서는 2.6±1.7ng/ml, 급성 췌염 환자에서는 44.1±34.0ng/ml이고, 1085-2A를 이용하는 경우에는 각각 0.8±0.2ng/ml 및 23.8±14.7ng/ml이다. 양자 모두에 있어서, 후자는 전자보다 명백하게 높다.

상기 결과는 본 발명의 단클론성 항체를 이용하는 방사선 면역 분석법 및 효소 면역 분석법 같은 면역 분석법을 급성 췌염의 진단에 이용할 수 있음을 시사한다. 또한, 본 발명의 단클론성 항체의 고 친화력을 이용함으로써 빠르고 간편한 인간 췌장 PLA₂면역 분석법을 개발할 수 있고, 급성 췌장의 진단에 이용할 수 있다.

이 분야의 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 것과 유사한 특성을 갖는 하이브리도마 및 단클론성 항체를 제조하는 것은 어려운 일이 아니기 때문에, 비슷한 특성을 갖는 이러한 하이브리도마 및 단클론성 항체도 본 발명의 범위내에서 포함된다.

실시예 1

항-혈청 췌장 PLA₂단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조 및 항체의 생산

(1) 항원의 제조

항원으로 사용되는 인간 췌장 PLA₂를 니시지마 등(Nishijima et al., J. Biochmistry, 94, 137-147, 1983)의 방법에 따라 인간 췌액으로 부터 정제한다.

(2) 면역화

생리 식염수에 용해시킨 인간 췌장 PLA₂(PLA₂농도 0.5mg/ml)을 동 부피의 프로인트 완전 보조제로 유화시키고, 이것 0.1ml을 BALB/c 생쥐(암컷, 생후 5주)의 등에 3주 간격으로 3회 피하 주사한다. PLA₂의 투여량은 생쥐 1마리당 25μg이다. 덧붙여, 세번째 면역화 5주후에 부스터(추가 면역 자극(면역으로서 200μl의 생리 식염수에 용해 시킨 50μg의 인간 췌장 PLA₂를 복강내 주사한다.

(3) 세포 융합

부스터 면역의 4일 후에 생쥐의 비장을 적출하고, 세포를 0.17M 염화 암모늄에서 빙내하에 5분간 보관하여 적혈구를 파괴한다. 잔류 세포를 RPMI 1640 배지에 현탁시켜 세포 융합에 이용되는 비장 임파구를 제조한다. 이어서, RPMI 1640에 현탁시킨 8-아자구아닌-내성 골수종 세포(NS-1.7×10⁷세포)를 비장 세포(1.4×10⁸세포)와 혼합하고, 이를 1000rpm에서 10분간 원심 분리한다. 상층액을 제거한 후에 RPMI 1640에 용해시킨 50% 폴리에틸렌글리콜(분자량 4000, Merck) 0.8ml를 피펫을 이용하여 교반하에 1분 동안에 세포 펠렛에 가하고, 1.5분간 더 교반한다. RPMI 1640 2ml을 2분동안 교반하에 가하고, 1분동안에2ml를 더 가한다. 이어서, 부드럽게 교반하면서 18ml의 RPMI 1640을 적가한다. 원심분리(1000rpm, 10분)후에, 상층액을 제거하고, 침전 세포를 70ml의 HAT 배지 (20%FCS, 1×10^-4히포크산틴, 4×10^-7M아미노프테린, 1.6×10^-5티미딘을 함유하는 RPMI 1640)에 현탁시키고, 이것 0.1ml을 7개의 96-웰 세포 배양 플레이트(Coaster) 각 웰에 분산시킨다. 세포 배양 플레으트에는 영양 세포로서 HAT 배지에 현탁시킨 생쥐 비장 세포(1×110⁵세포/0.1ml/웰))가 미리 넣어져 있다. 그런 다음, 2~3일 간격으로 HAT배지의 절반량을 새로운 것으로 바꾼다. 약 10일 후에, 하이브리도마의 성장을 관찰한다. 하이브리도마가 증식하는 웰의 수는 508(75%)이다.

(4)하이브리도마의 선택

하이브리도마가 증식하는 웰에 있어서, 상층액을 이용하여 ELISA 법에 의해 항-인간 췌장 PLA₂항체의 생산 유무를 검정한다. 96-웰 평편 바닥 ELISA 플레이트(Nunc)의 각 웰에 50μl의 인간 췌장 PLA₂ 용액(10ng/50μl의 0.05M 탄산 나트륨 완충액, pH 8.5)을 가하고, 4℃에서 밤새 방치하여 인간 췌장 PLA₂를 플레이트에 고정시킨다. 상층액을 제거한 후에, 0.2%소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 100μl를 가하고, 실온에서 1시간 동안 방치한다. 각 웰을 0.1%트윈 80-함유 PBS로 2회 세척하고, 하이브리도마가 증식하는 웰의 상충액 약 50μl를 가하고, 37℃에서 30분간 방치한다. 이들 웰을 2회 세척한 후에, 각 웰에 50μl의 비오티닐화 항-생쥐 면역 글로불린 항체 (Vectastain ABC kit, funakoshi Yaskuhin Kabushki Kaisha)를 가하고, 실온에서 15분간 방치한다. 2회 세척한 후에, 아비딘과 비오티닐화 양고추냉이 퍼옥시다제와의 착제 용액 50μl를 가하고 실온에서 15분간 방치한다. 이들 웰을 5회 세척하고, 기질 용액(0.02% ABTS 및 0.03% 과산화 수소를 함유하는 0.05M 시트레이트-인산며 완충액(pH 5.3)) 100μl를 가하고, 실온에서 20분간 방치한다. 최종적으로 100μl의 2mM아지드화 나트륨을 각 웰에 가하고 교반하여 플레이트 리더(plate reader, MTP-22, Corona Electic Co., Ltd.)에 의해 415nm에서의 흡광도를 측정한다.

(5) 하이브리도마의 동결 보존

상기 ELISA법에 의한 항-인간 췌장 PLA₂항체의 활성을 관찰한 각 웰의 하이브리도마를 HT 배지(상술한 HAT 배지에서 아미노프테린을 제거한 것)중에 배지 약 10ml로 증식시키고, 동결 배지(10% DMSO를 함유하는 소 혈청 알부민(1ml에 현탁시키고, -80℃에서 동결하여 보존한다. 생산된 항체의 성질을 검사하기 위하여 각 상층액을 회수하고 보존한다. 합계 85종의 하이브리도마가 보존된다.

(6) 배양 상층액의 대체 시험

상기한 하이브리도마 보존시에 회수한 상층액의 단계적 회석액(100μl)을¹²⁵I-표지화 인간 췌장 PLA₂(실시예 5(1)에 기재) 100μl 및 2% 소 감마 글로불린을 함유하는 분석용 완충액(실시예 5(1)에 기재)과 혼합하고, 실온에서 밤새 보온한다. 27% 폴리에틸렌글리콜 6000의 수용액 250μl를 가하고, 즉시 교반한다. 3000rpm에서 20분간 원심 분리한 후에, 상층액을 흡입 제거한다. 침전물의 방사능을 측정하여 항체에 결합된¹²⁵I-표지화 인간 췌장 PLA₂의 비율을 계산한다.

동시에, 2%소 감마 글로불린을 함유하는 분석용 완충액 대신에 5ng/100μl의 인간 췌장 PLA₂및 2%소감 글로불린을 함유하는 분석용 완충액 100μl를 사용하여 동일한 시험을 행하고, 침전물의₁₂₅I - 표지화 인간 췌장 PLA₂의 방사능의 감소, 측 첨가된 인간 췌장 PLA₂에 의해¹²⁵I - 표지화 인간 췌장 PLA₂가 대체된 정도를 검사한다. 대체 비율이 높은 상충액은 고 친화력의 항체를 함유하는 것으로 간주된다.

(7) 클로닝

상기 대체 시험의 결과에 의햐 고 친화력의 항체를 생산하는 것으로 생각되는 하이브리도마를 동결 시료로 부터 복원하고 한계 희석법으로 클론화한다. 96-웰 세포 배양 플레이트에 하이브리도마를 1 세포/200μl/웰의 농도로 배양한다. 상술한 ELISA법을 하이브리도마가 단일 클로니를 증식하는 상충액에 대하여 수행한다. 항-인간 췌장 PLA₂항체의 활성이 관찰되는 웰의 하이브리도마를 배양에 의해 증식시킨다.

이렇게 해서, 항-인간 췌장 PLA₂항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 1008-1 및 1085-2가 확립된다.

(8)항체를 함유하는 복수의 제조

항체를 고농도로 함유하는 복수를 제조하기 위하여, 생쥐의 복강내에 확립된 하이브리도마를 이식한다. 생쥐(BALB/c, 암컷, 10일전에 1.5ml의 프리스탄을 복강내 주사)에게 RPMI 1640에 현탁시킨 약 1×10⁷하이브리도마를 복강내 주사한다. 1~3주후에 복수를 채취하고, 복수내의 세포를 제거한다. 상충액에 아지드화 나트륨을 0.1%로 가하고 생성물을 동결 보존한다. 이렇게 해서 각각 하이브리도마 1008-1 및 1085-2에 의해 생산된 단클론성 항체를 고농도로 함유하는 복수 1008-1A 및 1085-2A가 제조된다.

(9)단클론성 항체의 정제

아피-겔 단백질 A MAPS-II 키트(Affi-gel Protein A MAPS-II Kit, BIO-RAD)에 의해 복수 1008-1A 및 1085-2A항체를 정제한다. 2ml의 겔을 이용하여 키트의 방법에 따라 각 복수 1ml씩을 정제하고 1008-1A 및 1085-2A로 부터 각각 약 2mg 및 약 5mg의 항체를 얻는다. 항체의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 검사한다.

정제된 항체 분획을 2-메르캅토에탄올로 환원시키고, 12.5% SDS 전기 영동을 행한다. 그 결과로서, 분자량 약 52,000 전후의 H 사슬 및 분자량 약 28,000전후의 L사슬의 2밴드가 관찰된다.

실시예 2

단클론성 항체의 클래스 및 서브클래스의 결정

하이브리도마에 의해 생성된 면역 글로불린의 클래스 및 서브클래스의 결정을 생쥐 면역 글로불린의 클래스 및 서브클래스에 특이적인 토끼 항체 및 퍼옥시다제-결합 염소 항-토끼 항체(MonoAn-ID EIA Kit, Zymed Laboratories)를 이용하여 상기 ELISA법에 의해 수행한다. 그 결과, 복수 1008-1A 및 1085-2A의 경우 모두 항-γ₁항체 및 항-k항체를 사용하는 경우에 발색이 관찰 된다.

실시예 3

단클론성 항체의 친화력

실시예 5(2)의 방법에 따라, 표준 곡선을 제작하고, 스캐챠드 법(Scatchard method)에 따라 각 농도의 인간 췌장 PLA₂에 대하여 종축에 침전의 방사능/상충액의 방사능을, 횡축에는 항체에 결합된 항원의 농도를 각각 플롯한다. 수득한 직선의 기울기로 부터 항체의 친화 상수를 계산한다.

실시예 4

단클론성 항체의 특이성

실시예 5(2)의 인간 췌장 PLA₂의 방사선 변역 분석법에 이용된 시료 대신에 돼지 췌장 PLA₂(Boehringer Mannheim GmbH)및 인도 코브라 뱀독 PLA₂(Sigma)를 이용하여¹²⁵I - 표지화 인간 췌장 PLA₂의 대체를 검사한다. 그 결과, 1008-1A 및 1085-2A의 경우 양자에 있어서, 기 2종류의 PLA₂를 인간 췌장 PLA₂의 50% 억제농도의 1000배로 가해도¹²⁵I - 표지화 인간 췌장 PLA₂의 대체가 전혀 관찰되지 않았다.

실시예 5

단클론성 항체를 이용한 방사선 면역 분석법

(1)¹²⁵I - 표지화 인간 췌장 PLA₂의 제작

¹²⁵I - 표지화 인간 췌장 PLA₂를 헌터와 그린우드의 공지 방법(Hunter and Greenwood, Nature 194, 459~496, 1962)에 따라 클로라민-T방법에 의해 제조한다.

시약 :

인간 췌장 PLA₂ :0.5mg/ml 1.5M 인산염 완충액 pH 7.5 Na¹²⁵I : 1mCi / 10μl (Amersham)

클로라민-T : 2mg/ml 0.5M 인산염 완충액 pH 7.5

피로아황산나트륨 : 2.5mg/ml 0.5 인산염 완충액 pH 7.4

소혈청 알부민 : 10mg/ml 0.1M 인산염 완충액 pH 7.4

KI : 100mg/ml 증류수

분석용 완충액 :

0.2%소혈청 알부민, 5mM 에틸렌디아민 테트라아세테이트, 0.01%아지드화 나트륨 및 0.9% NaC1을 함유하는 0.01M 인산염 완충액(pH 7.4)

동결 건조용 완충액 :

분석용 완충액의 5배 농도의 것

방법 :

튜브에 25μl의 0.5M인산염 완충액(pH 7.5), 10μl의 인간 췌장 PLA₂(6μg) 및 5μl의 Na¹²⁵I (500μCi)를 가하고 교반한다. 생성물에 5μl의 클로라민-T(10μg)을 가하고, 45초간 교반하고, 25μl(62.5μg)의 피로아황산 나트륨을 가하고 교반한다. 5μl(50μg)의 소혈청 알부민 및 5μl(500g)의 KI를 가하고 교반한다. 반응 혼합물을 세파덱스 G-25컬럼(1cm 직경×25cm길이)에 공급하여¹²⁵I-표지화 인간 췌장 PLA₂와¹²⁵I-이온을 분리한다.¹²⁵I-표지화 인간 췌장 PLA₂의 분획을 동결 건조용 완충액으로 2.5μCi/2ml로 희석하고, 이것 2ml을 바이얼에 분산시키고, 동결 건조하고 4℃에서 보존한다. 사용전에, 10ml의 용해용 증류수에 용해시킨다.

(2) 인간 췌장 PLA₂의 방사선 면역 분석법

시약 :

복수 희석액 : 1008-1A(분석용 완충액으로 360,000배 희석) 및 1085-2A(분석용 완충액으로 800,000배 희석)

인간 췌장 PLA₂표준액 : 인간 췌장 PLA₂를 0.1~25mg/ml의 범위로 2배 희석 농도로 함유하는 분석용 완충액

¹²⁵I - 표지화 인간 췌장 PLA₂: (1) 항에 기재.

분석용 완충액 : (1) 항에 기재.

면역 비드 : 토끼 항-생쥐 면역 글로불린(BIO-RAD), 분석용 완충액으로 희석한 1mg/ml용액으로 사용.

방법 :

튜브에 100μl의 인간 췌장 PLA₂표준액 또는 시료를 넣고 200μl의 분석용 완충액, 100μl의¹²⁵I - 표지화 인간 췌장 PLA₂및 100μl의 복수 희석액(1008-1A 또는 1085-2A)을 가한다. 혼합 후에, 실온에서 밤새 보온한다. 100μl의 면역 비이드를 가하고 실온에서 2시간 동안 방치한다. 3000rpm에서 10분간 원심 분리하고, 상충액을 제거한 후에, 감마 계수기(Aloka, ARC-600)에 의해 침전의 방사능을 측정한다. 인간 췌장 PLA₂를 이용하여 만든 표준 곡선으로 부터, 시료내의 인간 췌장 PLA₂의 농도를 계산한다.

표준 곡선

방사선 면역 분석법의 표준 곡선을 제 1 도에 나타낸다.

1008-1A 및 1085-2A를 이용하는 경우의 감도(90%억제 농도)는 각각 1.4ng/ml 및 0.3/ml인데, 이는 곡선이 고감도임을 시사한다.

인간 혈청적 분석

희석하지 않거나 또는 분석용 완충액으로 희석하여 사용한, 정상인의 혈청, 급성 췌염 환자의 혈청 및 췌장 전체를 적출해낸 환자의 혈청을 방사선 면역 분석법으로 분석한다. 결과를 표 1에 나타낸다.

단클론성 항체를 이용하여 방사선 면역 분석법에 의해 측정한 각종 종류의 인간 혈청중의 인간 췌장 PLA₂농도

[표 1]

평균±S.D.(ng/ml)

1008-1A 및 1085-2A를 이용하는 방사선 면역 분석법 모두에서 급성 췌염 환자의 혈청중의 농도는 정상인의 것 보다 높다. 따라서, 이들 두 단클론성 항체는 급성 췌염의 진단에 유용한 것으로 증명된다.

췌장 전체를 적출해낸 환자의 농도는 검출 한계 이하이기 때문에, 이들 단클론성 항체는 인간 췌장 PLA₂에 대해 매우 특이적인 것으로 증명된다.

참고 실험 : 토끼 항혈청을 이용한 방사선 면역 분석법

하기 사항을 제외하고는 실시예 5와 유사한 방법으로 토끼 항혈청을 이용하여 표준 곡선을 제작한다.

복수 희석액→항혈청 희석액 : 분석용 완충액으로 40,000배 희석.

인간 췌장 PLA₂표준액 : 인간 췌장 PLA₂를 0.39~100ng/ml의 범위로 2배 희석 농도로 함유하는 분석용 완충액.

면역 비드 : 염소 항-토끼 면역글로불린(BIO-RAD), 분석용 완충액으로 1mg/ml로 희석.

결과를 제1도에 나타낸다. 토끼 항 혈청에 의한 표준 곡선의 90% 억제 농도는 1.0ng/ml이다. 1008-1A 및 1085-2A의 값은 각각 0.4ng/ml 및 0.3ng/ml이고, 따라서 단클론성 항체 1008-1A 및 1085-2A는 토끼 항혈청 보다 더 감도가 높다.

Claims (10)

1. 친화 상수가 10¹¹M^-1이상인 인간 췌장 포스포리파제 A₂에 대해 특이성을 갖는 단클론성 항체.
2. 제 1 항에 있어서, 서브클래스가 IgG₁인 단클론성 항체.
3. 제 1항에 있어서, L사슬이 k형인 단클론성 항체.
4. 제 1항에 있어서, 돼지 췌장 포스포리파제 A₂및 인도 코브라 뱀독(Naja naja venom) 포스포리파 제 A₂와 반응하지 않는 단클론성 항체.
5. 제 1 항에 있어서, 하이브리도마 1008-1에 의해 생산된 단클론성성 항체 1008-1 및 하이브리도마 1085-2에 의해 생산된 단클론성 항체 1085-2인 단클론성 항체.
6. 제 1항 내지 제 5항중의 어느 한 항의 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
7. 제 6항에 있어서, 하이브리도마 1008-1 또는 1085-2인 하이브리도마.
8. 항-인간 췌장 포스포리파제 A₂항체-생산 B임파구와 골수종 세포를 융합하여 제조한 인간 췌장 포스포리파제 A₂에 대해 특이성을 갖는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 배양하고, 배양액으로 부터 인간 췌장 포스포리파제 A₂에 대해 특이성을 갖는 단클론성 항체를 회수함을 특징으로 하는 제1항 내지 제5항중 어느 한 항의 단클론성 항체의 제조방법.
9. 제 1항 내지 제5항중의 어느 한 항의 단클론성 항체를 이용하는 인간 췌장 포스포리파제 A₂의 면역 분석법.
10. 제 9항에 있어서, 방사선 면역 분석법인 면역 분석법.

Images