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KR950007215B1 - 오시딕 단위를 산화시키고 쉬프염기를 형성하여 리보솜을 비활성화시키는 당단백질을 변형시키는 방법 - Google Patents

오시딕 단위를 산화시키고 쉬프염기를 형성하여 리보솜을 비활성화시키는 당단백질을 변형시키는 방법 Download PDF

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KR950007215B1
KR950007215B1 KR1019860011019A KR860011019A KR950007215B1 KR 950007215 B1 KR950007215 B1 KR 950007215B1 KR 1019860011019 A KR1019860011019 A KR 1019860011019A KR 860011019 A KR860011019 A KR 860011019A KR 950007215 B1 KR950007215 B1 KR 950007215B1
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KR
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까셀라 피에르
부리 베르나르
까나 크자비에
Original Assignee
소시에떼아노님사노피
미셀드 야스
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Abstract

내용 없음.

Description

오시딕 단위를 산화시키고 쉬프염기를 형성하여 리보솜을 비활성화시키는 당단백질을 변형시키는 방법
제1도는 정맥주사한 천연 리신의 A사슬의 혈장이탈곡선을 나타낸다.
제2도는 정맥주사한 IT AT15E(제1곡선) 및 IT(A-1a)AT15E(제 2곡선)의 시간에 대한 혈장이탈 곡선을 나타낸다.
본 발명은 변형된 탄수화물 단위를 갖는 당단백질(또는 글리코펩티드)로부터 유도된, 단백질 합성을 억제하는 폴리펩티드 성분과 공유 결합된 최소한 1개의 항체를 함유하는 신규의 약제의 제조방법에 관한 것이다.
미합중국 특허 제4340535호 및 프랑스공화국 특허출원 제 2504010호 및 제 3516794호에는 접합체(conjugates)라 명명한 항암성물질의 제조방법이 기재되어 있는데, 상기 생성물은 세포파괴를 위해 주입된 항원에 대항하여 생성된 항체들 또는 항체 단편들과 리신(ricin)의 A사슬을 공유결합시킴으로써 수득된다.
상기 유형의 생성물은 면역독소의 속명으로 명명되어 왔고 본 출원 명세서에서도 이용된다.
또한 리신(ricin)의 A사슬을 상술한 면역독소와 유사한 접합체들이 항암성 약제로 유용하다는 것이 공지되어 있고, 특히 겔로늄 멀티플로룸으로부터 추출한 겔로닌(Eut. J. Biochem, 1981. 116, 447~454 : Cancer Res. 1984. 44, 129~133)또는 모모르디카차란티아(MOM)로부터 추출한 억제물질(미합중국 특히 4368149호)과 같은 리보솜을 비활성시키는 다른 당단백질과 항체 단편들을 공유결합에 의해 결합시킴으로써 생성된다. 리보솜을 비활성화시키는 상기 당단백질(GPIR)들은 리신의 A사슬과 유사한 특성들을 지니며, 분자량이 20,000 및 30,000 크기인 물질들이다(Cancer Survey, 1982.1, 489~520).
본 발명이 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용하는 "리보솜을 비활성화시키는 당단백질" 이란 용어는 리보솜을 비활성화시켜 결과적으로 진핵세포에서의 단백질 합성을 억제하는 거대분자 부류에 속하는 사카라이드 단위를 갖는 물질 및 동일한 비활성화 작용을 갖는 상기 물질의 단편을 정의 하는데, 리보솜을 비활성화시키는 상기 당단백질은 상기 목적을 위해 유전자형을 변형시킨 세포로부터 유도된 천연의 또는 생합성된 것일 수 있다.
또한 상기 면역독소의 세포독성은 모넨신 및 나이제리신과 같은 특정 카르복실 이오노포르, 각종 아민류또는 암모늄염과 같은 각종 보조물질에 의해 간화될 수 있다는 것이 공지되어 있다.
그러나 면역독소의 치료효과는, 활성화되는 것에 관계 없이, 면역독소간 항체부위를 통하여 생체내의 파괴되는 표적세포에 활성형으로 편재할때에만 완전히 나타날 수 있다. (모든 면역독소 활성의 발현 필수조건). 면역독소가 표적세포 위에 편재할 수 있는 능력은 표적세포에 도달할 수 있을 정도의 충분한 시간동안 및 대응하는 항원 부위에 강하게 결합할 수 있을 정도의 충분히 큰 농도로 면역독소가 활성형으로 혈류 및 세포의 유액에 존재함에 의해 최우선적으로 좌우된다.
각종 연구들이 각기 다른 동물 모델들에게 면역독소를 정맥 주사한 후의 면역독소의 혈장 이탈역학을 관찰 및 보고하였다. 주사후 생물학적 활성 면역독소의 혈장농도가 급격히 및 실제적으로 감소된다는 것이 밝혀졌다. 따라서 토끼를 사용한 대표적인 예에서 디설파이드 결합을 갖는 링크를 이용하여 리신의 A사슬과 인체 T임파세포의 항원 T65에 대항하여 생성된 단클론 성항제(항체 T101)를 결합시켜 합성한 면역독소를 사용한 모델에서, 주사후 0시에 혈류내에 존재하는 면역독소의 97%가 30분내에 소실되며 17시간내에 99.9%가 사라진다고 나타난다. 상기한 면역독소의 급격한 이탈로 인해, 면역독소가 지속기간동안 파괴시킬 세포로 운반된 많은 표적항원을 공격하는 것이 억제되므로, 완전한 세포독성 능력의 발현이 명백하게 감소된다.
또한 면역독소의 혈장이탈력학을 상응하는 비접합 항체의 혈장이탈역학과 비교하면, 공지된 바와같이 항체가 혈장내에 높은 농도로 비교적 오랜기간동안 잔류한다. 또한 극히 고도로 정제된 면역독소 제제에 있어서도, 일정한 잔류농도의 비접합 항체가 항상 존재한다. 면역독소 및 항체의 차등 이탈속도로 인해, 초기에 극히 소수 존재하던 비접합 항체가 수시간후 점차 다량이 되고, 따라서 이들 항체는 경쟁적으로 면역독소와 표적물의 결합을 강력하게 억제한다.
따라서, 표적항원과의 결합도 및 결합기간을 증대시키기 위하여 또한 결과적으로 면역독소의 치료효과를 개선시키기 위하여 활성형 면역독소의 혈장내 존재를 증가시킬 필요성이 명백하다.
또한 방사성 표지한 후 고유한 표적물을 갖지 않는 동물에 주사하여 리신의 A사슬을 함유하는 면역독소의 생체내 편재화(localiztion) 측정 실험에서 주사후 초기 2,3분후에 접합체는 우선적으로 간에 위치하는 것으로 나타난다. 리신의 A사슬을 비접합 형태로 주사할 경우에도 같은 양상이 나타난다. 이로부터 면역독소가 자체내에 함유하는 세포독성 소-단의(sub-unit)로 간에 고정된다는 것이 강력하게 주장된다. 리신의 A사슬은 특히 일부 만노스잔기가 말단에 위치한, 만노스잔기 및 N-아세틸글루코스아민잔기를 함유하는 다당류군을 갖는 당단백질임이 공지되어 있다(Agri. biol. Chem,1978.42.501). 또한 상기 말단 만노스잔기를 갖는 당단백질을 인지할 수 있는 수용기(receptor)가 간에 존재한다는 것이 알려져 있다. 또한 상기 수용기에 의해 인지되는 당단백질-수용기는 본질적으로 쿠퍼세포에 존재하는데-상기 세포에 고정됨 으로써 혈류로부터 급격히 이탈되고 고정된 당단백질은 세포를 분해한다. 상기 사항은 배타-글루쿠로니다제의 실험 및 또한 리보헥산 효소 B의 실험에 특히 잘 기재 되어 있다(Arch. Biochem. Biophys. 1978.188.418; Advances in Enzymology. published A. Meister. 뉴욕, 1974; Pediat. Res,1977,11,816).
따라서 상기 정보들로부터 리신의 A사슬을 함유하는 면역독소의 급격한 이탈은 리신의 A사슬의 만노스잔기가 간세포 특히 쿠퍼세포에 의해 인지됨에 기인하는 것을 알수 있다.
겔로닌 또는 MOM과 같은 다른 GPIR 들에 대해서 혈장이탈역학을 측정한 결과, 리신의 A사슬의 경우와 마찬가지로 동물에 정맥 주사한 후 GPIR의 혈장농도가 매우 급격히 및 실제적으로 감소되는 것으로 나타났다.
따라서 토기를 사용한 대표적인 시험에서, 생물화학 저어널(1980년, 255권, 6947∼6953페이지)에 기재된 방법으로 정제한 겔로닌을 주사할 경우, 주사후 0시에 혈류내에 존재하는 겔로닌의 93%가 1시간내에 소실 되며 24시간내에 99.99%가 사라지는 것으로 나타났다.
당단백질에 함유된 오시딕(osidic)구조를 포함해서, 오시딕 구조를 과요오드산임 이온으로 산화시키면, 일차 또는 원자의 탄소 이차 수산기 2개의 인접한 탄소원자의 탄소사슬이 절단된다. GPIR에 존재하는 고리형당류에서와 같이 2차 수산기 2개가 인접할 경우에 산화시키면 절단되는 2탄소에 2개의 알데히드기가 생성된다.
알데히드기가 일차 아민기에는 매우 반응을 잘해서 쉬프염기(schiff's base)로 알려진 이민을 형성하는 것은 잘 알려져 있다. 이와 같이, 산화반응 중에 생성되는 알데히드는 당단백질의 펩티드 사슬의 일차아민과 반응할 수 있고, 바람직하지 않는 분자내 및/또는 분자간 공유결합을 형성하여 산화물을 불안정하게 하고 종종 불용성 중합체를 형성한다.
GPIR의 탄수화물 단위가 하기에 서술된 독창적인 방법에 의해 개량되면, 생물학적 활성을 갖고 고등동물 또는 사람에 주하한 후에 혈류로부터 매우 천천히 제거되는 이중성이 있는 GPIR의 신규분자가 얻어진다. 리보솜을 바활성화시키는 성질을 갖는 신규의 개량된 GPIR은 개량됨으로 해서 생체내 활성이 연장되었고, 본 명세서에서 GPIR-La로 명명한다.
상기의 독창적인 방법은 GPIR의 오시딕 단위를, 일차아민기로 구성되고 나머지의 구조로 인해서 사용되는 반응 조건에서 퍼요오데이트 이온과 잘 반응하지 않는 과량의 보조제의 존재하에서 퍼요오데이트 이온과 반응시켜서 개량하는 것으로 이루어진다. 이와같이, 퍼요오데이트로 산화에 의해 생선된 알데히드기는 생성되는 대로 과량으로 존재하는 아미노반응제와 쉬프염기를 형성하여 보호됨으로써, GPIR의 다른 아미노기와의 바람직하지 못한 반응을 피하고 안정하고 환전히 용해하는 산물을 수득할 수 있게 해준다.
또한 이들 신규의 활성이 연장된 당단백이 항체 또는 항체 단편과 결합하면, 결과의 결합체가 면역독소의 공지된 생물학적 성질을 보유하고 완만한 혈장이탈역학을 보여준다.
그러므로 본 발명은 신규산물로서 구조가 개량된 GPIR 에 관한 것인데, 그의 탄수화물 단위는, 일차 아민기를 갖고 퍼요오데트로 산화하여 생성된 알데히드기를 차단할 수 있는 보조제의 과량 존재하에서 퍼요오데이트 이온의 작용으로 개량된다. 그리고 본 발명은 상기에 서술된 것과 같은 개량된 GPIR의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 면역독소류에 속하는 산물로, 항체 또는 항체 단편을, 천연형태 또는 수정된 형태로 하고, 탄수화물 단위가 상기의 독특한 방법으로 개량된 GPIR분자와 공유 결합시켜 수득한다.
본 발명을 수행하는데 사용된 서로다른 산물의 의미를 이하에 서술한다.
"퍼요오데이트"는 퍼요오드산염, 특히, 알칼리금속유래의 염의 수용액에 존재하는 IO4이온을 나타낸다.
상기의 염은 문헌에 메타퍼요오데이트라는 이름으로 서술된다.
"일차 아민기를 갖는 보조제"는 퍼요오데이트 이온과 사용되는 반응조건에서 잘 바응하지 않는 단일의 일차 아민기를 갖는 유기분자를 나타낸다. 예를들면, 상기 보조제는 알킬아민일 수 있는데, 필요농도에서, 염기 또는 염의 형태로, 5와 7사이의 pH에서,0과 15℃사이의 변온 조건에서 퍼요오데이트와 반응하지 않고 물에 녹는다, 상기 보조제는 또한 상기 조건을 충족시키는 a-마미노 또는 ω-아미노산일 수 있는데, 광학적으로 활성이 있거나 라세믹이고 하기와 같은 지방족 아미노산 중의 하나이다 : 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루타민산, 상기 보조제는 전술한 조건을 충족시키는 펩티드이면 어느것도 될 수 있다.
"항체"는 항체 또는 항체단편, 면역글로블린 또는 면역글로블린단편 또는 상기 물질들이 갖는 오시딕 구조를 비롯한 그들의 작용기들중 어느 것이라도 인공적으로 변형시켜 유도된 모든 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 나타내고, 단 상기 방법으로 선택된 단백질은 투여된 항원을 갖는 세포, 특히 표적세포의 표면위의 항원을 선택적으로 인지할 수 있어야 한다. 출발항체는 상기 목적으로 유전형을 변형시킨 세 포로부터 유도된 천연 또는 생합성된 것을 수 있다.
특정한 사람 표적세포에 특별히 지정된 단일항체의 제조방법은 과학 문헌에 잘 보고되어 있고, 이들 항체중 다수는 시장에서 구할 수 있다.
기호P는 모든 항체 또는 항체 단편, 모든 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편 또는 상기 물질들이 갖는 탄수화물 구조를 비롯한 그들의 작용기들중 어느 것이라도 인공적으로 변형시켜 유도된 모든 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 나타내고, 단 상기 방법으로 선택된 단백질은 투여된 항원을 갖는 세포. 특히 표적세포위의 항원을 선택적으로 인지할 수 있어야 한다. 출발단백질 P는 상기 목적으로 유전형을 변형시킨 세포로부터 유도된 천연의 또는 생합성된 것일 수 있다.
기호 GPIR은 당단백질 또는 그 단면중의 하나를 나타낸다. 단, 상기 단편이 GPIR을 특성짓는 리보솜비활성화농의 전체 또는 일부를 갖고 있으면 그들은 출발 물질로 사용될 수 있으나 천연 GPIR이 바람직하다.
기호 "GPIR-la"는 본 발명에 따라 변형된 GPIR로,GPIR과 같이 리보솜을 비활성화시키는 성질을 갖고 있으나 GPIR보다 간 생체내 활성유지기가늘 갖고 수용액내의 GPIR을 퍼요요데이트와 같은 산화제를 과량의 일차아민의 존재하에서 형성된 알데히드기를 이민기(쉬프염기)로 전환하기 위하여 처리하여 생성된 것을 나타낸다.
작업은 일반적으로 0∼15℃의 온도에서 5∼7의 pH를 갖는 수용액내에서, 바람직하게는 빛이 차단된 상태에서 수행한다; 이런 조건하에서는 반응이 0.2∼24시간 지속된다.
면역독소에서, GPIR-la부분은 "세포독성 소-단위"로 지칭되기도 한다.
기호 A-la는 자체내의 시스테인 171 및 257의 티올기들중 최소한 1개의 임의로 보호된 리신의 A사슬을 알카리금속 과요오드산염의 수용액으로 빛의 차단하의 0∼15℃온도에서0.2∼24시간 동안 처리하고, 이어서가능하다면 상기 티올기를 탈보호시킴으로써 수득된, 리모솜을 비활성화시키는 지속-작용성 당단백질을 나타낸다.
기호 P'는 상슬한 단백질 P로부터 유도된 라디칼로서, 그대로의 또는 1개이상의 자체내기를 제거하고 다른 작용기들을 임의로 보호시킴으로써 화학적으로 알맞게 변형된 라디칼을 나타낸다.
기호GPIR-la'는 상술한 단백질 GPIR-la로부터 유도된 라디칼로서, 그대로의 또는 1개의 이상의 자체내 기를 제거하고 다른 기능기들을 임의로 모호시킴으로써 화학적으로 알맞게 변형된 라디칼을 나타낸다.기호 A-la는 단백질 A-la로부터 유도된 라디칼로서, 자체내 시스테인 171 및 257의 티올기들중 최소한 1개가 제거된 것을 나타낸다.
기호 P1은 상술한 단백질 GPIR-la 및 P중 1개를 나타내며, P1은 상기 단백질에 직접 또는 공간 구조를 통해 결합되어 있는 자유 티올기를 가는다.
기호P2는 P1과는 다르며, 상술한 단백질 GPIR-la 및 P중 1개를 나타내고, 상기 P2는 자유 티올기와 반응 할 수 있는 1개 이상의 작용기를 갖는다.
기호P1는 단백질P1에 속하는 기들, 특히 SH기(시스테인), NH2(단백잴의 말단위치 또는 라이신(lysine)의 ε-위치), OH(티로신) 또는 COOH(아스파르트산 및 글루타민산와 결합하고 있는 단백질 P1의 라디칼, 또는 P1이 항체 또는 항체 단편인 경우에만 있어서는 공지의 방법에 따라 과요오드산을 이용한 반응에 의해 탄수화물 구조를 열어(opening) 유래되는 단백질 P2의 라디칼을 나타낸다.
기호P2'는 독특한 작용기인 NH2(단백질의 말단위치 또는 라이신의 ε-위치), OH(티로신) 또는 COOH(아스파르트산 및 글루타민산)과 결합하고 있는 단백질 P2의 라디칼을 나타낸다.
예를들면, P1'-SH는 시스테인의 SH기들이 유리되고 다른 작용기들이 임의로 보호된 단백질 P1(항체 또는 항체 단편 P 또는 단백질 GPIR-la일수 있음)을 나타낸다.
동일한 방법으로 P1'-CO-는 말단 카르복시기 또는 자체내의 글루타민산 및 아스파르트산들의 카르복시기들이 인공적으로 도입된 SH 기와 결합하고 있는 단백질 P1을 나타낸다.
또한 P2'-NH-는 말단 아미노기 또는 자체내 라이신의 아미노기가 단백질 P1의 티올과 결합 가능한 기와 결합하고 있는 단백질 P2(항체 또는 항체 단편P 또는 단백질 GPIR-la 일수 있음)를 나타낸다.
본 명세서내에서 E 및 E'로서 사용하는 "불활성 공간구조'란 용어는 1∼15개의 탄소원자를 함유하는 직쇄 또는 측쇄 알킬렌기와 같은 본 발명의 방법에서 사용하는 반응물들에 대해 비활성을 나타내는 2가 유기라디칼을 의미하며, 상기 라디칼은 1개이상의 이중결합을 갖고, 산소원자들에 의해 방해받을 수 있거나 또는 메톡시기, 유리 또는 에스테르화된 카르복시기, 디알킬아미노기 또는 카르바메이트들과 같은 1개 이상의 비활성 작용기들로 치환될수 있다. 또한 상기 용어는 6~15개의 탄소원자를 함유하는 아릴렌기를 나타내며, 알킬렌기에 대해 상술한 1개 이상의 비활성 작용기들로 치환될수 있다.
본 명세서내에서 Y 및 Y'로서 "공유결합이 가능한 작용기"란 표현은 단백질 P1및 P2에 속하는 기들과 반응하여 공유결합을 이룰수 있는 모든 기들을 의미한다. 따라서, -CO- 및 -(C=NH)-는 단백질의 자유아민, 티올 및 페놀성 히드록실과 결합할수 있는 알맞는 작용기들이다. 유사하게, -NH-기는 단백질의 유리 카르복시기와 결합할 수 있는 알맞은 작용기이다. =N-은 P1및 P2가 당체 또는 항체 단편인 경우에 한해서만, 퍼요오테이트 이온에 의한 산화후 단백질 P1및 P2의 탄수화물 구조의 2개의 탄소원자들과 결합할 수 있는 알맞은 작용기이다.
본 명세서내에서 Z 및 Z'로서 "단백질을 형성하는 기"란 표현은 단백질 P1및 P2를 형성하는 아미노산의 특정적인 기들로부터 유래된 라디칼을 의미하며, 예를들면 티로신 및 가능하다면 세련 아미노산의 히드록시로부터 유래된 산소원자, 말단 카르복시 또는 아스파르트산 또는 글루타민산의 유리 카르복시로 부터 유리된 카르보닐기, 라이신과 같은 단백질의 말단아민으로부터 유리된 -NH-기, 또는 시스테인의 티올로부터 유래된 황원자가 있다. 또한 상기의 동일한 표현은 P1및 P2가 항체 또는 단편인 경우에 한해서만 단백질 P1 및 P2의 탄수화물 구조들중의 1개를 퍼요오데이트 이온으로 처리하여 산화시킨 후 수득된 디알데히드구조로부터 유래된 기를 의미하기도 한다.
본 명서서내에서 X로서 "활성화 라디칼"이란 용어는 -S-S-결합과 결합하고 있으며 유리 티올과 반응하여 X-SH의 방출과 함께 디설파이드를 형성할 수 있는 기를 나타낸다. 알맞은 활성화 라디칼로는 비치환된 또는 1개 이상의 하로겐 또는 알킬, 카르복시 또는 알콕시카르보닐 라디칼로 치환된 피리딘-2-일 및 피리딘 -4-일 ; 비치환된, 또는 바람직하게는 1개 이상의 할로겐 또는 니트로, 알콕시, 카르복시 또는 알콕시카르보닐기로 치환된 페닐기 ; 또는 메톡시카르보닐과 같은 알콕시카르보닐기가 있다.
"알킬" 및 "알킬시"란 용어는 5개 이하의 탄소원자를 갖는 기를 정의 한다.
"알킬"이란 용어는 10개 이하의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 포화 지방족기를 나타내며, 알콕시 카르보닐기와 같은 1개 이상의 비활성 작용기로 치환될수 있다.
리보솜을 비활성화시키는 당단백질로서 퍼요오데이트 이온의 산화, 및 본 발명에 의한 환원의 출발물질로 사용되는 것은 리신의 A사슬과 같은 모든 GPIRs로서, 그들 자체가 세포에 고착할수 없으므로 매우 미약한 독성만을 갖고 있으나, 반면에,특정세포를 인지하는 항체와 결합한 후에는 항체가 목표세포를 일단 인지하고 나면, 그 세포에 대해 대단한 독성을 나타낸다.
대표적인 출발화합물은 리신의 A사슬, 겔로닌 및 모모르디카 차란티아(MOM)에서 추출한 물질이다.
퍼요오데이트 이온에 의한 산화반응의 출발물질로서 유용한 다른 GRIP은 다음과 같다 :
디안틴 30˙˙˙디안투스 카리오필루스(Dianthus Carypphyllus)에서 수득
디안틴 32˙˙˙디안투스카리오필루스에서 수득
아그로스틴A˙˙˙아그로스텝마 기타고(Agrostemma githago)에서 수득
아그로스틴B˙˙˙아그로스텝마 기타고에서 수득
아그로스틴C˙˙˙아그로스텝마 기타고에서 수득
HCI˙˙˙후타 크래피탄스(Hura crepitans)에서 수득
아스파라거스오피시날리스 억제제˙˙˙아스파라거스
오피시날리스(Asparagus officinalis)에서 수득 목적에 맞게 인자형을 변형시킨 세포에 의해 생합성된 동일 물질도 역시 적절한 화합물이다.
그 모체인 GRIP의 특성, 즉 리보솜을 비활성화시키는 특성의 전부 또는 일부를 갖는 상기 GPIR 단편도 또한 출발물질로서 사용 가능하다.
최소한 하나의 티올기가 보호된 천연 리신의 A사슬도 출발물질로서 바람직하다.
순수한 리신의 A사슬을 얻는 방법은 미합중국 특허 4340535호에 설명되어 있다. 겔로닌과 MOM도 설명되어 있다.
출발 GRIP의 티올기에 대한 보호는 그 티올기가 항체와의 결합에 이용되는 경우에만 필요하다. 만일 다른 작용기, 예를들어 티로신의 페놀 히드록실이 결합에 이용된다면, 티올기의 보호는 실시하지 않는다.
보호 반응은 sh기를 환원반응 또는 티올/디설파이드 교환반응에 의해 쉽게 제거될수 있는 라디칼로 치환시킬수 있는 시약, 예를들어 2.2'-디티트로-5,5'-디티오디벤조산(DTNB) 또는 3-(피리딘-2-일디설파닐)프로피온산으로 반응 시킴으로써 실시할수 있다. 이러한 처리를 실시하지 않으면 A사슬의 유리 티올기가 산화 반응 중에 없어질수 있는데, 이런 경우에 2-메캡토에탄올 같은 환원제로 반응시켜서 티올기 가 전부 재생될 수는 없다. 과량의 보호제는 투석 또는 다른 적절한 방법에 의해 제거한다.
티올이 임의로 보호된 GRIP은 퍼요오데이트 이온으로 산화시키고 동시에 일차 아민과 쉬프염기를 형성한다. 퍼요오드 산화반응 및 쉬프염기 형성에 의한 보호 반응은 중간 산성 pH, 예를들어 5와 7사이 바람직하게는 6과 6.5사이에서 수행될수 있다. GRIP이 일차아민과 혼합된 후에 퍼요오데이트를 가입한다. 퍼요오데이트는 과량으로 사용하고 ; 더욱 상세하게는, 알칼리 금속 퍼요오데이트의 농도는 향상, 산화가능한 비시날 디올의 농도보다 높아서 1~10mg/ml의 세포독성 소단위에 대해서 10~50mM이 소디움 퍼요오데이트 농도가 적절하다. 일차 아민(예를들어 L-루이신, L-알라닌, L-아르기닌 또는 L-클루타민산)도 산화될수 있는 비시날 디올의 농도보다 높아서 1 내지 10mg/ml의 세포독성 소단위에 대해서 50 내지 50mM의 일차아민 농도가 적절하다. 그러한 처리는 0과 15℃사이이 온도에서, 바람직하게는 1~5℃에서, 빛을 차단하고 0.2~24시간동안 수행한다.
반응이 끝나면, 과량의 퍼요오데이트는 그를 소모할수 있는 시약으로, 과량의 에틸렌글리콜과 같은 것으로 제거하고 부산물은 투석하여 제거한다. 반응의 최종산물은 공지방법으로 수득한다.
출발물질의 티올기가 보호된 경우, 공지의 방법, 예를들어 이미 보호된 티올기를 자유롭게 할수 있는 환원제(예, 2-메르캅토 에탄올)로 처리함으로써 탈보호시켜, 리보솜을 불활성화 시킬수 있는 신규의 지속-작용성 당단백질을 수득할수 있고, 이는 언제든지 항체와 결합되어 면역독소로 될 수 있다.
리신의 A사슬의 경우 이러한 방법으로 수득한 새로운 분자(A-1a로 표시한다)는 하기의 주특성을 갖는다 :
-천연 A사슬의 것과 별로 다르지 않은 분자량.
폴리아클리아미드 경사 전기영동법을 이용하여 상기 변화에 의해 매우 적은 양의 단백질 포리머만이 생산되고 분해된 생성물은 생산되지 않음을 알수 있다.
-1몰당 0.7이상의 자유 티올기분율.
-천연 A사슬과 구별할수 없는 리신 A사슬에 대한 토끼 항체에 대한 면역반응성.
-동량의 천연 A사슬의 활성의 50%이상인 무세포성 모델내의 단백질 합성에 대한 억제활성.
-마지막으로, 1kg의 체중당 약 0.4mg의 용량으로 토끼에게 정맥내 투여를 1회 실시한지 23시간 후의 혈류 증에 존재하는 지속-작용성 A사슬(A-1a)의 혈장농도는 같은 조건에서 측정하 천연 A사슬의 혈장농도보다 10내지 100배 높다.
상기에 서술된 대로 제조한 GPIR은 공지방법에 의해 복합체 또는 면역독소를 제조하는데 사용될수 있다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 면역독소류에 속하는 산물에 관계하는데, 이 면역독소(이하 IT로 부른다)는 한편으로 천연형태 또는 정확하게 변형되어 사용되는 항체 또는 항체 단편으로서 의도하는 목적세포가 갖고 있는 항원을 선택적으로 인지할수 있는 능력을 가진 것과, 다른 하나로서, GPIR-1a라는 리보솜을 비활성화시키는 자속 작용성 당단백질 GPIR로 상기 공개된 방법으로 수득한 것을 공유결합하여 수득할수 있고, 이들 2단백질의 결합은 디설파이드결합 또는 티오에테르 결합으로 이루어진다.
리보솜을 비활성화시키는 지속-작용성 당단백질인 GPIR-1a와 항체 P의 결합에 의해 형성된 면역독소는 하기의 통계식으로 나타낼수 있다.
[수학식 1]
P'-W-GPIR-1a' (I)
식중 P'는 있는 그대로의 또는 화학적으로 적절하게 변형된,그리고 다른 작용기가 임의로 보호된 하측 또는 항체 단면 P인 단백질의 라디칼을 나타내고, GPIR-1a'는 있는 그대로의 또는 화학적으로 적절하게 변형된 그리고 다른 작용기가 임의로 보호된 GPIR-1a인 단백질의 라디칼을 나타내며, W는 티오에테르기 또는 디설파이드기를 함유하는 2가 공유 구조를 나타내는데, 황원자가 P와 GPIR-1a의 시트테인의 것이든지 또는 P 및/또는 GPIR-1a에 속하는 상술한 기에 결합된 작용기를 운반하는 공간구조에 의해 P 및/또는 GPIR-1a에 속하는 기에 결합된 상태이다.
두 단백질 사이의 티오에테르 결합은 하기와 같은 형태를 갖는다 :
Figure kpo00001
Z,Y와 E는 하기의 정의와 동일하다.
본 발명은 바람직하게는 하기 통계적 일반식의 면역독소에 관한 것이다:
[수학식 2]
P'-W'-GPIR-1a' (II)
식중, P'와 GPIR-1a는 상기 정의와 동일하고; W'는 하기(a)~(d)중에서 선택된 공유 구조를 나타낸다. :
Figure kpo00002
Figure kpo00003
(c)일반식
-Z-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n-의 기
(d) 일반식
-(Z'-Y-E')n-S-S-E-Y-Z-의 기
식중 Z와 Z'는 같거나 다르고 단백질 GPIR-1a와 P에 속하는 기로서, GPIR-1a와 P의 티로신 잔기의 히드록실에서 유래한 산소원자, 말단 카르복실 또는 아스파르트산 및/또는 그루타민산의 유리 카르복실에서 유래한 카르복실기, GPIR-1a와 P의 말단아민 또는 라이신 잔기의 ε-위치의 아민에서 유래한 -NH-기로부터 선택된 것을 나타내며, 공유구조(b)와 (c)의 Z는 공지의 방법에 따라 과요오드산으로 P의 카르복히드레이트 구조중의 하나를 산화시켜 수득한 디알데히드 구조에서 유래한 기를 나타낼수 있다 ; Y와 Y'는 단백질 GPIR-1a와 P의 기 Z와 Z'중의 하나와 공유 결합할수 있는 작용기를 나타낸다 ; E와 E'는 불활성 공간구조를 나타내고 ; n은 0또는 1을 나타낸다.
면역독소는 상기 일반식 I와 II에 의해 단순화된 형태로 나타내지는데, 여러 가지 구조 -W-또는 -W'-가 하나 및 같은 분자 P 및/또는 GPIR-1a에 결합하여, 몇 개의 GPIR-1a가 단한개의 P에 결합되고, 여러개의 P가 단한개의 GPIR-1a에 결합되어 있다.
단백질 P 및 GPIR-1a와의 결합수는 결합 조직중에 포함되는 상기 단백질에 속하는 기의 수에 따라 결정된다. 이와같이, 통계적 일반식 I 및 II는 또한 이들 산물과 그들의 혼합물도 나타낸다 :
[수학식 3]
P'(W'-GPIR-1a')m
상기식에서 m은 정수 또는 1보다 크거나 작은 실수이다.
예를들어, 천연 리신의 소단위 A와 항체 P(예, 항체 T101)를 디설파이드(하나의 황은 리신의 지속 작용성 A사슬의 시스테인 257에 속하며, 다른 하나는 항체 P의 티로신의 페놀 산소에 옥소프로필기에 의해 결합되어 있다)를 경유하여 결합시킴으로써 형성시킨 면역독소는 하기 통계적 일반식을 갖는다.
[수학식 4]
P'(O-CO-CH2-CH2-S-S-A-1a')t
상기식중 t는 결합에 관여하는 항체(예, 항체 T101)내의 티로신의 수를 나타낸다.
이렇게 하여 수득한 면역독소는 일반식 II [P'는 상기 정의와 동일하고, 특히 결합에 관여하는 티로신의 페놀기를 제거한 항체 T101의 라디칼을 나타낸다 ; A-1a'는 시스테인 257의 티올기를 제거한 리신의 지속-작용성 A사슬의 라디칼이다 : W'는 기(c) :
[수학식 5]
-Z-Y-E-S-S(E'-T'-Z')n-
(식중 Z는 결합에 관여하는 페놀 히드록실기 산소이고, Y는 -CO-이고, E는 불활성 공간구조-CH2-CH2-이고, n은 0이다)이다.]의 생성물에 해당된다.
특히 바람직한 것은 라신의 지속-작용성 소단위 A와 단일항체 P를 함유하는 하나 또는 그 이상의 구조에 의해 형성된 면역독소로서 하기 통계식을 갖는다 :
[수학식 6]
P'(W'-A-1a')m(III)
식중 P',W'와 A-1a'는 상기 정의와 동일하고 m은 결합에 관여하는 단백질 P에 속하는 기의 수를 나타낸다.
m은 0.3~12이고, 바람직하게는 0.5~10이다. "m은 0.3~12이고, 바람직하게는 0.5~10이다"라는 표현은 결합이 항체 분자의 집단내에서 균질하게 일어나는 것이 아니기 때문에 m의 값이 통계적 수치임을 의미한다. 따라서 m은 정수가 아닐수 있다. m의 값은 사용된 항체, 특히 그 분자량에 따라 결정된다. 따라서 단편 Fab 또는 Fab'를 출발 항체 P로서 사용하는 경우, m의 값은 0.3~약 2이고; 단편 F(ab')2를 사용하는 경우 0.5~약4이고; IgG형의 항체인 경우 m의 값은 0.5~약 6이고, 항체 IgM의 경우 m의 값은 1~약12일수 있다.
그러나 m의 값이 0.5~10의 범위를 벗어나지 않도록 하는 것이 항체 P에 대한 치환정도로 바람직하다
상기구조 I와 II는 보다 일반적으로 상술한 것과 같이 단순화된 형태로 씌여진 통계적 일반식으로 나타내진다.
비슷하게 하기의 일반식 IV.V와 IX도 통계식이다. 단백질 P1과 P2가 항체 이거나 단백질 GPIR-1a이거나 간에 상관없이, 상술한 항체 P와 동일한 톡성을 갖는 단백질 P1과 P2의 집단으로부터 결합 반응물을 제조하기 때문에 n은 항상 1이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 리보솜을 비활성화시키는 당단백질과 함께 항체 사이에 디설파이드 또는 티오에테르형의 공유 결합을 갖는 지속-작용성 면역독소의 제조방법에도 관련되어 있는데, 이때 디설파이드 또는 티오에테르 결합은 리보솜을 비활성화시키는 지속-작용성 당단백질과 항체 사이에서 형성되며, 0~15℃의 암실에서, 리보솜을 비활성화시키는 티올기가 임의로 보호된 지속-작용성 당단백질을 알칼리금속 퍼요오데이트 수용액으로 일차아민 존재하에서 0.2~24시간동안 처리한후 필요에 따라 티올기를 탈보호시킴으로써 제조할수 있다.
바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 단백질 P1을 실온의 수용액내에서 또다른 단백질 P2와 반응시켜 티오에테르 또는 디설파이드 결합을 형성시킴을 특징으로 하는 구조 I를 갖는 면역독소의 제조방법에 관한 것이다. 이때, 단백질 P1은 리보솜을 불활성화시키는 지속-작용성 당단백질인 GPIR-1a 또는 항체 또는 항체 단편중의 하나로서 상기 단백질 P1에 결합된 하나이상의 자유 티올기를 직접 또는 공간구조를 경유하여 운반하며, 단백질 P2는 단백질 P1과 다르며, 리보솜을 비활성화시키는 지속-작용성 당단백질인 GPIR-1a, 또는 항체 또는 항체 단편으로서 단백질 P1의 자유 티올과 결합할수 있는 기를 운반한다.
특히 유리한 측면에 따르면, 본 발명은 일반식 P1'-(Z-Y-E)n-SH(IV)의 단백질을 시온의 수용액내에서 통계적 P2'-Z'-Y'-E'-G(V)의 단백질과 반응시킴을 특징으로 하는, 구조 II(P',W'와 GPIR-1a'는 상기 정의와 동일하다)를 갖는 면역독소의 제조방법에 관한 것이다. 상기 식중 P1'과 P2'는 상술한 단백질에 속한기에 결합된 단백질 P1과 P2의 라디칼을 나타내는데, P1과 P2과 항체 또는 분획인 경우에 단백질 P1과 P2의 리디칼은 카르보히드레이트 구조를 과요오드산으로 처리하여 오피닝 시킴으로써 수득할수 있고, Z,Z',Y.Y'E와 E'은 상기 정의와 동일하며, G는 기
Figure kpo00004
또는 기 -S-S-X(X는 활성기이다)를 나타낸다.
따라서, P와 GPIR-1a는 모두 임의로
(1) 티올기 또는 결합에 관여하는 기와
(2) 상술한 티올기와 반응하여 디설파이드 또는 티오에테르 결합을 형성할수 있는 하나 이상의 작용기를 갖는 단백질이다.
본 발명에 따르면, 상술한 티올기와 작용기는 천연 단백질 P또는 GPIR-1a에 속하거나 또는 인위적으로 단백질 P 또는 GPIR-1a에 도입된 것이다.
출발 GPIR의 티올기에 대한 보호는 그 티올기가 항체와의 결합에 이용되는 경우에만 필요하다. 만일 다른 작용기, 예를들어 티로신의 페놀 수산이 결합에 이용되면, 티올기의 보호는 실시하지 않는다.
보호반응은 SH기를 환원반응 또는 티올/디설파이드 교환반응에 의해 쉽게 제거될 수 있는 라디칼로 치환될 수 있는 시약, 예를들어 2,2'-디니트로-5,5'-디티오디벤조산(DTNB) 또는 3-(피리딘-2-일디설파닐)프로피온산으로 반응시킴으로서 실시할수 있다. 이러한 처리를 실시하지 않으면 사슬의 유리티올기가 산화반응 중에 없어질수 있는데, 이런 경우에 2-머캡토에탄올과 같은 환원제로 반응시켜서 티올기가 전부는 재생되지 않을수 있다. 과량의 보호제는 투석에 의해 제거한다.
티올이 보호된 리보솜을 비활성화시키는 당단백을 퍼요오데이트로 산화시키고 아민 존재하에서 환원시킨다. 한편으로, 세포독성 소단위가 티올을 포함하지 않거나 또는 티올이나 티올들이 결합에 사용되지 않으면, 상기 보호반응은 수행하지 않는다.
리보솜을 불활성화시키고 티올이 보호된 당단백을 퍼요오데이트 이온으로 산화시키고 아민존재하에 환원시킨다. 만일 세포독성 소단윅 티올을 함유하지 않거나 또는 결합에 티올 또는 티올들이 사용되지 않으면 위에서 서술한 보호 반응은 수행하지 않는다.
리보솜을 비활성화시키는 지속-작용성 당단백질로부터 접합제 또는 면역독소를 제조하는 것은 미합중국 특허 제4,340,535호에 기술된 방법의 범위내에서 적절하게 선택할수 있다.
만약 선택된 세포독성 소단위가 결합에 적절한 최소한 하나의 티올기를 천연적으로 함유하는 경우에는 이 기를 활성화된 디설파이드기를 운반하는 항체 또는 항체 단편들과의 반응에 유리하게 사용할수 있다. 선택된 세포독성 소단위가 결합에 적절한 티올기를 천연적으로 함유하지 않은 경우, 유리 티올을 운반하는 최소한 하나의 작용기를 퍼요오데이트 이온에 의한 산화반응 후에 상기 소단위에 공지의 방법에 따라 인위적으로 바람직하게 도입시킬수 있으며, 계속하여 상술한 방법대로 결합시킬수 있다.
상기 작용기의 도입반응은 퍼요오데이트 이온에 의한 산화단계전이나 아민 존재하의 환원반응전에 일어나는데, 이런 경우에 티올라디칼이 산화 및 아민 존재하의 환원반응 중에 보호되어야 하고, 그런 후에, 즉 산화 및 아민 존재하의 환원반응 후에 비호보화되어야 한다.
본 발명의 방법에서 GPIR-1a와 항체(또는 단편)과 화학적 결합반응은 하기와 같은 방법으로 수행할수 있다 :
-접함체의 두 성분, 즉 항체와 GPIR-1a의 각각의 생물학적 활성을 보존시키고,
-그 방법이 만족스러운 재현성과 좋은 결합율을 갖고 있음을 확인하고,
-수득한 접합체내의 GPIR-1a/항체의 비율값을 조절할수 있도록 한후,
-안정하고 수용성인 생성물을 수득한다.
이러한 특성을 갖는 방법중에서, 2단백질 사이의 결합을 형성시키는데 있어서 하나 또는 그 이상의 티올기가 관여하는 것이 바람직하다. 사실 이들 티올기는 모두 일반적인 상기 조건을 만족시키는 디설파이드 결합 또는 티오에테르 결합을 형성시키는데에 특히 바람직하다.
면역독소의 제조는 하기의 특성을 갖는다 :
-리신의 A사슬과 항체 사이의 공유 결합에는 디설파이드 라디칼이 포함되어 있고, 미합중국 특허 4,340,535호에 기술된 항체와 리신이 A사슬의 결합법에 따라 제조할수 있다.
-디설파이드 결합을 이루는 황원자중 하나는 항상 리신의 A사슬의 25-257-위치에 있는 시스테인 잔기에 속하고,
-리신의 A사슬과 항체를 연결시키는 링크(link)는 펩트드 사슬의 NH2측기 또는 말단기에서 후자에 고정되어 있다.
동일한 특성을 가지며, 항체 또는 항체 단편과 GPIR-1a와의 결합에 의해 형성되는 면역독소의 제조에 상기와 동일한 방법을 적용시킬수 있다.
항체 또는 항체 단편과 GPIR-1a와의 결합과 서로다른 작용기에서의 디설파이드 또는 티오에테르형 공유 결합에 의해 형성되는 면역독소의 제조방법은 하기에서 상세히 설명된다.
일반적으로 단백질 사이의 결합반응을 성공적으로 실시하고 무질서한 교차 결합을 제거하기 위하여는 특히 결합되는 단백질 중의 하나가 사용되는 티올 또는 티올기를 운반하고 다른 한 단백질만이 30℃를 넘지 않는 pH5~9의 수성매질에서 티올과 반응하여 안정하고 명확하게 규정된 공유 결합을 형성할수 있는 하나 이상의 기를 운반하는 것이 바람직하다.
출발물질로 이용되는 단백질 P1과 P2의 특성은 하기에 자세히 설명하였다. 공간구조 E는 실시예에서만 나타낸 바람직한 구조 R~R8로 대치될수 있다.
I-단백질 P1
이러한 단백질은 모든 경우에 있어서 결합에 관여하는 티올기를 운반하기 때문에 이 단백질 P1의 특성에 따라 상황은 변환된다.
A) 자연 상태에서, 단백질 P1은 단백질 P2와 결합 가능한 하나 이상의 티올기를 운반하고, 단백질 P1이 F(ab)'로 공지된 항체 일부이면, 이는 특별한 경우이고, 통상적으로는 펩신 존재하에서 항체를 제한적으로 단백질 분해한후, 고분자 사슬사이의 디설파이드 결합을 환원시켜 얻는다.
이는 하나 이상의 티올기가 자유로이 화학적으로 결합할수 있는 리신이 본래 A사슬의 시스테인 171 및 257잔기에 의하여 운반되는, 예를 들어 변형된 리신의 A사슬(A-1a)또는 그 유도체와 같은 GPIR-1a가 단백질 P1인 경우에도 해당된다.
이러한 모든 경우에, 천연 티올기를 운반하는 단백질 P1은 이러한 상태에서 결합에 사용될수 있다.
B) 자연 상태에서, 단백질 P1은 단백질 P2와 결합할 수 있는 티올기를 운반하지 않고, 단백질 P1이 본래의 면역 글로불린 항체 전부 또는 일부, 특별히 통상적으로 F(ab)'2또는 F(ab)라고 불리는 항체 일부이면, 이는 특별한 경우이다.
단백질 P1이 자연상태에서 결합에 사용되는 티올기를 운반하지 않는 경우는, 2개의 시스템 잔기의 각각이 알킬화하여 보호되거나 화학적으로 변형할 수 없는, 예를들면 리신의 지속 작용성 A사슬인 GPIR-1a가 단백질 P1인 경우이다.
모든 경우에, 결합 가능한 하나 이상의 티올기를 상기 분자에 인공적으로 적절히 도입할 수 있다.
하기 3가지 반응은 티올기의 도입에 적절하다.
1.첫번재 형태의 반응은 단백질의 아미노기를 아실화 시킬수 있는 S-아세틸머캡토숙신산무수물과 반응시키는 것이다. 상술한 방법(Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, 41~49, 1967)에 따라 히드록실아민과 반응시켜 아세틸 보호기를 제거하여 티올기를 유리시킬수 있다. 이와같이 보호된 형태로 도입된 티올기가 활성화된 혼합 디설파이드기와 계속해서 반응하는 경우에, 히드록실아민으로 보호기를 제거하지 않고, 반응을 수행할수 있다. 사실상, 본 발명은 목적을 달성하는 반응물을 사용하여 디설파이드 결합을 만드는 반응은 자유 티올과 같이 S-아세틸기로도 동일하게 수행할수 있다.
과학문헌에 기재된 기타의 방법으로도 티올기를 변형된 단백질에 도입시킬 수 있다.
2. 두 번째 형태의 반응은 단백질을 카르복실기를 통하여 하기식의 디설파이드 결합을 갖는 대칭성 디아미노 분자와 반응시키는 것이다.
H2N-R1-S-S-R1-NH2
식중, R1은 탄소수 2내지 5의 지방족기이다.
바람직한 반응은 카르보디이미드 및 특별히 1-에틸-3-디메틸아미노프로필-3-카르보디이미드와 같은 수용성 유도체와 같은 결합제의 존재하에서 시스타민[R1=-(CH2)2-]과 반응시켜 사용된 화학양론적 양에 따라 하기 유도체 또는 그의 혼합물중의 하나를 형성하는 것이다.
P1'-CO-NH-R1-S-S-R1-NH2(Ia)
P1'-CO-NH-R1-S-S-R1-NH-CO-P1(Ib)
이러한 종류의 반응 생성물은 하기의 2가지 방법에 사용될수 있다.
a) 상기식 Ia 또는 Ib에서, 단백질 P1이 예를들어 리신의 지속 작용성 A사슬 또는 그 유도체중의 하나와 같은 GPIR-1a이면, 얻은 반응매질은 분별할 필요없이 2-머캡토에탄올과 같은 환원제와 반응시켜 하기 일반식의 단일한 단백질 유도체를 얻는다.
P1'-CONH-R1-SH
이와같이 얻은 생성물을 투석 또는 겔여과하여 정제시킨다.
b) 상기식 Ia 및 Ib에서, 단백질 P1이 항체 또는 항체단편중의 하나이면, 얻은 반응 매질은 결합에 사용될수 있고, 이 경우에 티올/디설파이드 교환방법(예, Gilliand 와 Collier, Cancer Research, 40, 3564, 1980)이 사용될 수 있다.
3. 세 번째 형태의 반응은 항체에 천연상태로 존재하는 탄수화물 단위를 사용하여 도입하고자 하는 티올기를 운반하는 기를 고정시키는 것이다. 단백질 P를 공지의 방법에 의해 퍼요오데이트 이온으로 산화시켜 탄수화물 단위에 알데히드기를 만든다. 과량의 에틸렌글리콜을 첨가하여 반응을 종료시킨후, 부산물 및 과량의 반응물을 투석으로 제거하고, 얻은 생성물을 하기 일반식의 디설파이드 결합을 갖는 대칭성 디아미노 분자로 처리한다.
H2N-R1-S-S-R1-NH2
식중, R1은 탄소수 2내지 5의 지방족기이다. 형성된 부가 생성물을 적절한 금속 수소화물, 특별히 수소화 붕소 나트륨으로 반응시켜 2차 또는 3차 아민으로 환원시킨다. 반응은 시스타민 [R1=-(CH2)-]으로 수행하는 것이 바람직하고, 사용된 화학양론적 양에 따라 하기 유도체 또는 그 혼합물 중의 하나를 형성한다.
Figure kpo00005
얻은 반응 매질을 구조 Ia 또는 Ib에서 상술한 바와 동일하게 처리한다.
상술한 인공적으로 티올기를 도입하는 반응의 마지막 2형태(대칭성 디아미노 디설파이드 반응물을 사용하는 형태에서, 사용된 단백질 P1은 바람직하게도 자유 SH기 또는 자유 아미노기를 갖고 있지 않다.
GPIR-1a의 경우에, 이것은 본래이 SH기를 N-에틸말레이미드 또는 요오도아세트산 또는 그 유도체중의 하나의 같은 티올에 대한 통상의 시료와 반응시켜 알킬화하고, 본래의 NH2기를 Means와 Eeeney(Biochemistry 7, 2192, 1868)에 의한 방법에 따라 환원성 메틸화 반응으로 메틸화시켜 수행할 수 있다.
예를들어, 단위 몰달 6메틸기까지는 변형된 리신의 본래 A사슬에 미리 도입할수 있다. 이러한 종류의 단백질은 모두 생물학적 특성을 보유하고 있고, 특별히 진핵세포에서 리보솜의 단백질 합성을 억제하는 능력을 갖고 있다.
전술한 바와같이, 본래 유도된 SH기를 갖고 있지 않는 항체 또는 항체 일부의 경우, 더욱 일반적으로 첫 번째군의 모든 물질의 경우에, 예를 들어 Means와 Eeeney 방법에 의한 환원성 메틸화 반응을 수행시키는 것이 적절하고, 이 경우에, 항원을 전달하는 세포의 표면상에서 항원을 선택적으로 인식하는 항체의 능력을 변형시키지 않고 항체 단위몰당 평균적으로 수십개의 메틸기를 통상적으로 도입할수 있다.
II-단백질 P2
이 단백질은 단백질 P1의 티올과 반응하여 디설파이드 결합 또는 티오르 결합을 형성할수 있는 1가지 이상의 작용기를 운반하는 단백질이다. 이 작용기들은, 단백질 P2중에 인공적으로 삽입되는 것으로서, 디설파이드 결합에 의해서 또는 티오에테르 결합에 의해서 결합을 일으킬수 있는가에 따라 구별하며, 하기와 같이 선택된다.
1) 디설파이드 결합
이 경우에, 접합체의 제조 반응식을 다음과 같다.
P1'-(Z-Y-E)n-SH+P2'-Z'-Y'-E'-S-S-X →
P1'-(Z-Y-E)n-S-S-E'-Y'-Z'-P2'+X-SH
활성화된 황 원자로 치환된 단백질 P2는, 하기 반응식에 따라서, 자체적으로 활성화된 황을 운반하는 시약으로 단백질 P2자체 또는 정확히 보호시킨 단백질 P2를 치환시킴으로써 얻어진다.
P2+L=Y'-R-S-S-X →R2'-Z'-Y'=R'-S-S-X
상기 식중,
-P2는 치환될 단백질이고,
-L-Y'는 시약을 단백질에 공유 고정시키는 것이다.
작용기 L-Y'는, 치환시킬 단백질기의 성분인 아미노 산의 측쇄에 의해서 운반된 기들중의 하나의 기와 공유 결합될수 있는 기이다. 이 기들 중에서 하기 기들을 특별히 선정할 수 있다.
a) 팹티드 사슬의 아미노말단기 또는 이 단백질에 함유된 라이실 라디칼의 아미노 측기, 이경우에, L-Y'는 -카르보디이미드, 특히 1-에틸-3-디메틸아미노프로-3-카르보디이미드와 같은 수용성 유도체와 같은 결합체 존재하에서 이 단백질의 아미노기에 결합할수 있는 카르복실기 : 상기 언급된 카르보디이미드로 활성화된 3-(2-피리딜디술파닐)프로피온산이 이 목적에 사용될 수 있다.
-아미노기들과 직접 반응하여 이들을 아실화시킬 수 있는 카르복실산 염화물 ;
-아미노기들과 직접 반응하여 이들을 아실화시킬 수 있는, 오르토- 또는 파라-니트로 페닐 또는 -디니트로 페닐 에스테르, 또는 별도로 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜-디티오)프로피오네이트와 같이 아미노기와 직접 반응하여 그들을 아실화할수 있는 N-히드록시숙신아미드 에스테르와 같은 소위 "활성화된"에스테르-아민기들과 자발적으로 반응하여 아미드 결합을 생성하는 예컨대, 숙신산 무수물과 같은 디카르복실산의 내부 무수물 ; 또는 하기 반응식
Figure kpo00006
(상기식중, R3은 -R-S-SX 기임)에 따라서 단백질 P2의 아미노기와 반응하는 아미노에스테르기.
Figure kpo00007
(상기식중, R은 알킬기임)
b) 단백질에 함유된 티로실 라디칼의 페놀기, 이 경우에, L-Y'는 하기 반응식에 따라서 단백질의 페놀기와 반응하는 이마다졸-1-일카르보닐기이다.
Figure kpo00008
(상기 식중, 이미다졸-1-일은 L이고, CO기는 Y'이며, R4는 -R-S-S-X 기임).
리디칼 S-S-X는 티올 유리라디칼과 반응할수 있는 활성화된 혼합 디설파이드이다. 특히, 이 혼합디설파이드에서, X는 1가지 이상의 알킬, 할로겐 또는 카르복실라디칼로 임의로 치환된 피리딘-2-일 또는 피리딘-4-일기이고, X는, 또한 1가지 이상의 니트로 또는 카르복실기로 바람직하게 치환된 페닐기이다. 선택적으로, X는 메톡시카르보닐기와 같은 알콕시카르보닐기이다.
리디칼 R은 치환체 Y' 및 S-S-X를 동시에 운반할수 있는 공간구조를 갖는 기(상기 일반식 II에서 E로 나타낸 것)이다. 이것은, 연속 반응중에, 사용된 반응물 및 합성된 생성물을 방해하는 기들을 함유하지 않도록 선택하여야 한다.
특히, R기는 -(CH2)n-(식중, n는 1~10임)또는 선택적으로
Figure kpo00009
[식중, R6은 수소 또는 C1~C8알킬기이고, R5는
Figure kpo00010
(식중, R7은 선형 또는 측쇄 C1~C5알킬기, 특히 tert-부틸기임)과 같은 다음에 사용될 반응물에 대해 불활성인 카르바모일기와 같은 치환체임]이다. 화합물 L-Y'-R-S-S-X와 단백질 P2의 반응은, 균질 액상에서, 가장 일반적으로 물 또는 완충용액중에서 실시한다. 반응물의 가용성이 요구되는 경우에, 삼차 부탄올과 같은 3차 올코올의 경우에는 20부피%, 또는 디메틸포름아미드 또는 테트라히드로푸란의 경우에는 10부피%에 달하는 최종 농도로 수용성 유기용매를 반응 매질에 가할수 있다.
이 반응은 수분 내지 수 시간 동안에, 실온에서 실시한 후에 투석 또는 겔여과를 통해서 저분자량의 생성물, 특히 과량의 반응물을 제거시킬 수 있다.
이와같은 화합물들을 이용하는 경우에, 단백질 P1과의 결합은 30℃미만의 온도에서, 1시간~24시간동안에 PH6~8의 수용액중에서 이 두 단백질을 반복시킴으로써 실시한다. 필요에 따라서, 이와 같이하여 얻어진 수용액을 투석하여 저 분자량 생성물들을 제거시킨 다음에, 공지의 방법으로 이 접합체를 정제시킬수 있다.
2) 티오에테르 결합
이 경우에, 이 접합체는 P1'-(Z-Y-E)n-SH를 말레이미드 라디칼 1개 이상을 미리 삽입시킨 단백질 P2와 반응시켜서 제작한다.
이 반응을 반응식으로 나타내면 다음과 같다. 이것은 예로서 제시한 것이다.
Figure kpo00011
상기 식중,
-R8은 다음에 사용될 반응물들에 대해서 불활성인 C1~C15의 지방족 또는 방향족 공간구조를 갖는 기이고,
-Z'는 단백질 P2상에 치환된 작용기의 형태에 따라서 변할수 있는 기로서, 티로실 잔기의 페놀상에 에스테르가 있는 경우에 Z'는 산소, 활성화된 카르복실기를 이 단백질의 아미노기와 결합시키는 경우에 Z'는 NH, 또는 클로로메틸 케톤을 이 단백질의 아미노기와 반응시키는 경우에 Z'는 -NH-CH2임).
말레이드기 또는 기들로 치환된 단백질 P2는, 이 단백질의 적절한 기를 그 자체가 말레이미드기를 운반하는 시약으로 치환 반응시킴으로써 단백질 P2자체 또는 정확히 보호시킨 단백질 P2로부터 제조한다.
이 적합한 기들 중에서 하기 기들을 특별히 선택할 수 있다.
a) 펩티드 사슬의 아미노말단기 또는 이 단백질에 함유 라이실 잔기의 아미노측기, 이 경우에, 말레이미드 라미칼을 운반하는 반응물은 하기와 같다 :
Figure kpo00012
의 시약이다.
{상기식중, L-CO-는
-카르복실기(이 경우에, 반응은 이 카르복실기를 활성화시킨 후에 카르보디이미드, 특히 1-에틸-3-디메틸아미노프로필-3-카르보디이미드와 같은 수용성 유도체와 같은 결합제는 존재하에서 실시함):
-또는 아미노기와 직접 반응하여 이들을 아실화시키는 오르토-또는 파라-니트로페닐 또는 -디니트로 페닐 에스테르, 또는 선택적으로 N-히드록시숙신이미드에스테르와 같은 소위 "활성"에스테르이다.
이와같은 시약들의 제조방법은 문헌[Helvetica Chimica Acta 58, 531~541(1975)]을 참고한다. 이와 동류의 다른 시약들이 시판되고 있다.}
Figure kpo00013
에 따라서 단백질 P2의 아미노기와 반응할수 있는 일반식
Figure kpo00014
의 시약이다.
b) 이 단백질에 함유된 티로실 라디칼의 페놀기, 이 경우에, 말레이미드 라디칼을 운반하는 반응물은, 하기 반응식
Figure kpo00015
Figure kpo00016
에 따라서 페놀기와 반응하는 일반식 :
Figure kpo00017
의 시약이다.
이 말레이미드 운반시약과 단백질 P2의 반응은, 균질액상에서, 가장 일반적으로 물 또는 완충용액중에서 실시한다. 반응물의 가용성이 요구되는 경우에, 삼차 부탄올과 같은 3차 알코올의 경우에는 20부피%, 또는 디메틸포름아미드 또는 테트라히드로푸란의 경우에는 10부피%에 달하는 최종 농도로 수용성 유기용매를 반응매질에 가할 수 있다.
이 반응은 수분 내지 수시간 동안, 실온에서 실시한 후에 투석 또는 겔여과를 통해서 저분자량의 생성물 특히 과량의 반응물을 제거시킬수 있다. 이 공정은 보통 단백질 몰당 치환기 1~15개를 삽입시킴으로써 실현된다.
이와 같은 화합물들을 사용하는 경우에, 단백질 P1과의 결합은 30℃미만의 온도에서, 1시간-24시간 동안에 PH6~8인 수용액중에서, 이 두 단백질을 반응시킴으로써 실시한다. 필요에 따라서, 이와같이 하여 얻어진 수용액을 투석하여 저분자량 생성물들을 제거시킨 다음에 공지의 방법으로 이 접합체를 정제시킬 수 있다.
하기 일반식(VI)의 화합물은, 10°~40℃의 유기용매중에서, 하기 일반식(VII)의 화합물을 하기 일반식(VIII)의 카르보닐디이미다졸과 반응시킴으로써 제조한다.
Figure kpo00018
Figure kpo00019
Figure kpo00020
(상기 일반식들에서, G 및 E는 앞서 정의한 바와같음).
일반식 VI의 화합물은, P 및 단백질 GPIR-1a의 티로신의 히도록실의 결합제로 특히 유용하다.
다른 특징으로서, 본 발명은 통계적 일반식
GPIR-1a''-O-CO-E-G (IX)
의 신규의 생성물 제조방법에 관한 것이다.
이 일반식에서,
-GPIR-1a''는 단백질 GPIR-1a의 라디칼 또는 이 단백질의 작용기들 중의 1개를 인공적으로 변형시킴으로써 상기 GPIR-1a로부터 유도한 분자로서, 이들로부터 티로신의 페놀성 히드록실기 1개 이상을 제거한 것이며,
-산소원자는 라디칼 GPIR-1a''가 떨어진 페놀성 히드록실기에 속하는 것이며,
-E 및 G는 앞서 정의한 바와 같다.
일반식(IX)의 화합물중에서 특히 바람직한 것은, E가 -(CH2)p-(식중 p는 2~7의 정수임)기, 또는
Figure kpo00021
기이고, G가 -S-S-X 구조의 기(여기에서, X는 1가지 이상의 할로겐, 알킬, 카르복실 또는 알콕시카로보닐기로 치환 또는 비치환된 피리딘-2-일 및 피리딘-4-일기, 1가지 이상의 할로겐, 니트로, 알콕시, 카르복실 또는 알콕시 카르보닐기로 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는 알콜시카르보닐기로부터 선택된 활성 라디칼임)인 화합물이다.
일반식 IX의 생성물은 일반식
GPIR-1a''-OH
(식중, GPIR-1a''는 상기에 정의한 바와같고,히드록실기는 티오린으로 부터 GPIR-1a''-OH가 떨더진 페놀성히드록실이다)를 상기식 VI의 화합물과 10~40℃의 온도에서, 예를들면 디옥산 또는 테트라히드로푸란 등의 에테르 용매와 같은 수, 혼화성 유기용매를 임의로 함유한 수성용매중에서 반응시킴으로써 제조된다.
GPIR-1a가 리신의 지속-작용성 A사슬인 경우, 생성된 면역 독소 IT(A-1a)의 특성은 다음과 같다.
-평균 결합도는 항체 1몰당 변형된 A사슬의 몰수로 표시하여 보통 0.5~5, 특히 1~3이다.
-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 IT(A-1a)의 분리는 생성물을 분자량이 30,000달톤의 연속 증가에 의해 항체의 분자량과 다른 생성물에 해당하는 일련의 밴드로 쪼개지게 한다.
-세포형광 측정에 의해 수행된 연구는 항체가 활성화 및 결합반응 동안 어떤 실제적 분해도 일으키지 않으며 결합체 그 자체로서 지시된 물질에 대한 항원을 인지할수 있다는 것을 나타내게 한다.
-2-머캡토에탄올 존재하에 무세포 모델에서 측정한, 단백질 합성시 항체에 의해 변형 및 결합된 A사슬의 저해 활성은 그대로 유지된다.
표적 항원을 갖는 세포의 세포 모델에서의 단백질 합성 시험에서 활성제 존재하에 측정된 면역독소 IT(A-1a)의 세포독성 활성은 표적 황원을 갖지 않는 세포에서 같은 조건하에 측정한 활성보다 100배 이상이다.
예를들어, 어떤 새앙쥐 백혈구 세포의 표면에 존재하는 항원 Thy1. 2에 대한 단일클론 항체(항체 AT15E 로 표시)를 사용하여 디설파이드 결합을 함유한 링크에 의해 리신의 변형된 A-1a 사슬을 결합하여 얻어진 면역 독소(IT(A-1a)AT15E로 표시)는 음성 Thy1. 2세포에 대해서 보다 양성 Thy1. 2세포에 약 1000배 이상을 세포 독성을 나타낸다.
-마지막, A사슬로 표시된 IT(A-1a)를 토끼에게 체중 1kg당 0.4mg량으로 정맥내 투여한 후 24시간 경과하였을 때 혈류에 존재하는 IT(A-1a)의 혈장 농도는 같은 조건하에 측정된 공지의 IT의 혈장 농도보다 10~200배 더 크가. 그러므로, 토끼를 이용한 대표적인 경우, 주사후 24시간 경과하였을 때 혈류의 남아 있는 IT(A-1a)AT15E의 혈장 농도는 0시간에 존재하는 생성물의 10%이며, 이것은 같은 시간후의 상응하는 공지의 IT AT15E농도가 0.08%이므로 120배 증가한 량이다.
이것은 변형된 면역 독소에 약학적 특성에 관한 새로운 특징을 부여하는 것이다.
더욱 특별하게는, 세포 독성 소단위의 적절한 변형에 의해, 면역독소의 특이성 세포독성 특성에 이들을 방해하지 않으면서 새로운 특성, 즉 느린 혈장 제거활성을 나타내는 성질을 가할수 있다.
본 발명은, 또한 본 발명에 의해 개량된 면역독소를 주성분으로 하고 약학적으로 허용 가능한 운반체와 조합된 항암 약학 조성물로서, 주사제로 사용할수 있고, 특히 정맥주사로 사용할수 있는 것에 관한 것이다.
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
본 실시에는 소디움 퍼요오데이트로 산화시켜 변형된 리신의 A사슬을 동물에게 정맥 주사할 때, 과량의 L-루이신 존재하에서 주사 후 느리게 이탈함을 보여준다.
I-수디움 퍼요오데이트 및 L-루이신의 동시작용에 의한 리신의 A사슬의 변형
1) DTNB를 이용한 A사슬의 천연 SH의 보호반응. 리신이 A사슬은 미합중국 특허 제4 340 534호에 서술된 방법으로 제조 및 정제하였다.
20당량의 2,2'-디니트로-5,5'-디티오디벤조산(DTNB), 즉 DTNB의 125mM인산 완충용액,(이 용액을 수산화나트륨으로 pH7로 조절함), 1ml을 23ml의 리신 A사슬 용액(A사슬 1개당 0.84티올을 함유)에 7.2mg/ml의 PBS완충용액(20mM 인산 및 150mM Na Cl, pH7)에 대한 농도로 가입한다. 이용액을 4℃의 PBS 인산완충용액에서 투석하여 티올기가 보호된 A사슬 162mg을, 상기 A사슬을 6.9mg/ml함유하는 용액으로 얻는다.
2) 퍼요오데이트산화 및 티올기가 보호딘 A사슬상의 L-루이신과의 쉬프 염기 형성.
52mg/ml의 L-루이신을 30mM 인산완충용액, pH 6.5에 함유하는 용액 12ml을 11.5ml의 용액의 포함되어 있는 티올기가 보호된 A사슬 79.4mg에 가입하여 초산으로 pH를 6.5로 조절한다. 암소에서 4℃17시간 방치한다. 에틸렌글리콜의 1M 수용액 2.8ml을 가하여 반응을 정지 시킨다. 20℃에서 15분 반응시킨 후,반응액을 4℃의 PBS 완충용액에 대해 48시간 투석한다. 10,000×g로 30분간 원심분리한후, 티올기가 보호되고 오시딕 잔기가 쉬프 염기를 형성하고 산화된 A사슬 용액 28ml이 1.9mg/ml농도로 수득된다.
3) 티올기의 탈보호.
보호되고 오시딕 잔기가 변형된 1.9mg/ml의 A사슬 용액 25ml을 농축하여 10.5ml로 만들고, 0.214ml의 50% 2-머캡토에탄올을 가한다. 20℃에서 1시간 반응시킨다. 이용액을 4℃ PBS 완충용액에 대해 투석하여 2.65mg/ml 농도의 변형된 사슬 26.5mg을 얻는다.
DTNB기술을 사용하여(Methods in Enzymology, 1972,25,457(Academic Press)), 수득된 개량 A사슬이 1몰당 0.89 유리티올기를 갖는 것을 결정하였다. 개량 A사슬의 분자량은 30,000±3,000으로, 소디움도데실설페이트-폴리아크릴아미드 농도구배 전기 영동에 의해 결정되었다.
오시딕 단위가 개량된 A사슬의 앞에서 얻은 제제의 단백질 합성의 저해에 있어서의 효소 활성 및 그의 약학적 성질을 조사 하였다. II-무세포성 모델에서 측정산 지속-작용성 A사슬의 효소 활성.
리신의 A사르의 주요 생물학적 특성은 리보솜의 소-단위 60S를 분해함으로써 세포내의 단백질 합성을 억제하는 것이다.
시험관 내의 프로토콜에서는 인공적인 mRNA(폴리우리딜산)의 존재하에14C-페닐 알라닌과 함입될 수 있는 쥐간의 알맞게 보출된 서브셀룰라 분획을 사용한다. 서브세룰랄 분획의 제조 및14C-페닐알라닌과의 함입도 측정은 문헌(Biochemica Biophysica Acta, 1973, 312, 608∼615)에 기재된 방법에 따라 쥐의 간세포의 마이크로솜 분획 및 시토졸 분획 둘 다를 사용하여 수행한다. A사슬을 함유하는 시료를 0.2%의 2-머켑토에탄올 및 15ug/ml의 소혈청 알부민을 함유하는 pH 7.6의 50mM 트리스-HCI 완충액으로 알맞게 희석시킨다.
억제 물질이 존재하지 않는 대조용 매질과 비교하여, 리신의 A사슬을 함유하는 각각의 반응 매질에서 단백질과14C-페닐알라닌과의 배합 억제 백분율을 카운트 데이터를 사용하여 측정한다.
얻은 곡선으로, 방사성 표지된 전구체가 단백질로 함입되는 것을 저해하는 A사슬(천연 또는 개량)의 농도 IC50을 계산할 수 있다. IC50은 개량 A-Ia사슬에 대해 3.1010몰/ｌ로 관찰되었고, 실험에서 대조사슬의 IC50은 1010몰/ l 이었다. 측정의 정밀도를 고려해 보면, 개량함에 의해 A사슬이 활성을 거의 잃지 않았음이 명백하다.
Ⅲ-오시딕 단위가 변형된 지속-작용성 A사슬)(A=la사슬)의 약리적 성질
천연또는 개량 사슬을 토끼의 귀정맥에 1회주사 하여 투여한다. 주사한 A사슬의 양은 0.415mg/kg에 해당한다. 때때로 헤파린에 체혈한다. 혈청을 하기에 RIM-1으로 표시된 방사성 면역 측정법으로 분석한다.
상기 방법은 A사슬을 변형시키지 않고 측정할 수 있는 이점을 갖는다. 상기 측정은 미세 적정 플레이트(예:"NUNC-TSP스크린게 "Poly Labo Block, 프랑스공화국)에서 밑부분에 공동을 파는 과흡착성 스파이크를 이용하여 수향된다. 상기 스파이크는 고체상들을 형성한다. 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된 리신의 A사슬을 억제하는 암양항체(이하에서는 Acl으로 약칭함)가 고체상들이 흡착된다. 상기 측정을 위해, 10ug/ml의 Acl치을 PBS완충액에 용해시킨 용액 200ul를 공동에 분할하여 가한다. 스파이크를 먼저Acl용액과 4℃에서 24시간 동안 접촉시킨 다음 태내 송아지 혈청과 20℃에서 3시간 동안 접촉시켜 모든 고정 부위를 포화시킨다. 이어서 포화된 면역 흡착제를 각기 다르게 희석시킨 혈장 시료들 또는 농도를 알고 있는 A사슬 용액과 20℃에서 3시간 동안 접촉시켜 검정 곡선을 유도한다. PBS 완충액으로 세척한 후 면역흡착제를 리신의 A사슬을 억제하는 암양 항체와 20℃에서 2시간동안 접촉시키고, 이때 암양 항체는 친화도크로마토그래피에 의해 정제되고 방사성 표지된 것(이하에서는 Ac2로 약칭함)이다. Ac2의 방사능 표지는 그긴우드 및 헌터의 방법(Biochem. J., 1963, 89, 114)에 따라 클로르 아민 T의 존재하에 요오드 -125를사용한다 ; 방사능 표지된 Ac2항체의 고유 활성도는 5∼10마이크로 퀴리/ug이다. 106cpm의 방사능 표지된 Ac2항체 200ul을 0.1%의 소혈청 알부민을 함유하는 PBS 완충액에 도입한다. PBS 완충액에서 세척한 후스파이크를 분리하고 결합된 Ac2의 양을 방사성 계산하여 축정한다. 측정할 시료내의 A사슬의 농도는 각기 다른 알고 있는 농도의 A사슬을 도입하여 유도한 검정곡선을 참고하여 측정한다. 지속 작용성 A사슬을 동물에 주사하면, 상기의 동일한 지속 작용성 A사슬이 상응하는 검정 곡선을 유도하도록 이용된다.
상기한 방법에 의해 측정된 혈장 내의 A사슬의 농도 값은 신뢰성 및 재현 가능성을 갖는다. 검출 한계치는 1ng/ml이다. 실험들 도중 또는 사이에서의 재현 가능성을 측정하면, 농도 값에 대하여 1∼200ng/ml의 범위에서 10%이하의 변형 상수를 제공한다.
상기 실험의 결과를 곡선 형태로 나타내는데, 1시간을 단위로 하여 횡좌표에 시간을 나타내고, 0시 때의이론적인 혈장 농도의 백분율로 측정된 생성물의 혈장 농도를 종좌표 위에 로그 눈금으로 나타내어 도면을 그린다. 상기 값을 "상대 혈장 농도"(RPC)라 명명하고, 하기식을 사용하여 계산한다.
Figure kpo00022
혈장부치는 36ml/kg동물 몸무게로 계산한다. 제1도는 정맥 주사한 천연 리신의 A 사슬에 대한 시간에 따른 혈장 이탈곡선을 나타낸다. 상기 곡선(제1곡선)은 2가지 위상을 갖는데, 첫 번째 위상에서 생성물은 혈류로부터 급속히 이탈되어 주사후 3시간에는 투여량의 0.1%만이 혈장 내에 남아 있다. 두 번째 위상에서 는 느리게 감소한다.
A 스슬의 폴리사카라이드 단위를 산화시킬 경우, (A-la사슬, 제 2곡선) 이탈 프로필은 크게 변화된다. 첫 번째 이탈 위상- 생성물 대다수의 이탈이 나타남-은 실제적으로 억제되어 A사슬의 혈장 레벨이 크게 중가된다. 주사 후 20시간 때에 산회된 A사슬의 농도는 변형되지 않은 A 사슬 보다 460배 더 크다(제 2곡선).
이러한 결과는 소디움 퍼요오데이트와의 산화반응 및 L-루이신으로 부터의 쉬프염기 형성에 의한 보호 반응이 A사슬의 이탈에 필요한 인지 과정에 관여하는 당을 변형시켜, 그 점에서 변형된 A사슬의 생물학적 활성이 없이는 인지를 방해하는 것을 나타낸다.
[실시예 2]
하기 실시예는, 동물에 정맥 주사한 후, 소디움 퍼요오데이트의 산화반응 및 L-알라닌, 또는 L-글루탐산 또는 L-아르기닌 존재하에서 쉬프 염기를 형성함에 의해 변형된 A사슬이 서섯히 이탈함을 보여준다.
A)방법
실시예 1에 서술된 방법에 의해, 단 쉬프염기 반응을 글루타민산, 또는 아르기닌 또는 알라닌을 루이신대신으로 사용하여 A 사슬을 변형시킨다. 이들 각 아미노산이 가입되는 양은 사용되는 A 사슬보다, 글루탐산, 아르기닌 및 알라닌 각기에 대해 103,5×103및 104배 크다.
B) 결과
표 I 은 이들 서로 다른 변형된 A-la 사슬에 성질을 나타낸다. 천연 A사슬로 얻은 결과 및 실시예 l에 서술된 대로 L-루이신 및 소디움 퍼요데이터에 의해 변형된 A-la 사슬로 얻은 결과를 비교하기 위해 반복하였다.
[표 1]
Figure kpo00023
이들 결과는 소디움 퍼요오데이트에 의한 산화반응과 동시에 L-알라닌, L-아르기닌, 또는 L-글루탐산에 의한 쉬프 염기 형성에서 알데히드기를 동시에 보호함에 의해 생체내 A사슬의 생물학적 이탈에 필요한 인지과정에 관여하는 당을 변형시켜, 그점에서 A사슬의 리보솜 비활성화 성질도 심각하게 변화시키지 않고 연이은 결합에 사용될 수 있는 티올기를 전혀 손실하지 않고, 인지의 주요부를 방해하는 것으로 나타낸다.
[실시예 3]
새앙쥐 T세포에 대한 항체(항원 Thy1.2에 대항한 항체)를 활성화 디설파이드기로 치환하여 리신의 A-la 사슬과 사이에서 스독된 면역독소(IT로 약칭)
a) 새앙쥐 T세포에 대한 항체 또는 AT15E 항체 : Journal of Immunology (1979, 122,2491∼2498)에 기재된 방법에 따라 상기 항체가 수득된다.
b) 리신의 A-la사슬 : 실시예 1에 기재한 방법에 따라 리신의 A-la사슬이 제조된다.
c) 새앙쥐 T 세포에 대한 활성화 항체
3.62mg의 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜-디티오)-프로피오네이트를 95%에탄올 0.326ml에 녹여서 항체를 7mg/ml의 농도로 인산 완충용액 125mM, pH743.7ml에 가입한다. 혼합물을 20℃에서 30분 교반한후, 125mM인산 환충용약 pH 7에 투석하여, 단백질 용약을 4℃에서 10,000×g로 30분간 원심분리하여,96.8mg의 활성화 항체를 2.42mg/ml의 농도로 얻는다. 2-머캡토에탄올로 치환하여 유리된 2-피리딘티온에 대해 343nm에서 분광광도측정하면, 수득된 항체가 항체 1몰당 6.7활성화 혼성 디설파이드기를 갖는 것으로 밝혀진다.
d) 리신의 지속-작용성 A-la 사슬을 갖는 면역 독소의 제조
실시예 1에 서술된 대로 2.65mg/ml의 농도로 A-la 10ml을 상기의 활성화 항체용액(농도 2.42mg/ml,즉, 35.8mg의 활성화항체) 14.8ml에 가하고, 25℃에서 20시간 반응 시킨다. 용액을 원심분리하여, 겔(AcA 44겔)에 여과하여 정제하고 280nm에서 용리액의 광학밀도를 측정한다. 항체 및 변형 A사슬을 모두 함유하는 분획을 재수집하여 52ml의 면역독소 용액을 0.315mg/ml의 농도, 즉 18.25mg을 얻는다, 이용약은 0.076mg의 mlekd 항체에 결합된 변형된 A-la 사슬을 0.07mg을 함유한다. 이들 제제의 평균 결합율은, 그러므로, 항체 1몰당 A-la 사슬 1.6몰이다.
상술된 대로 얻은 리신 A-la 사슬을 갖는 면역독소에 대해 약리학적 특성 및 표적세포에 대한 특이한 세포 독소 특성을 조사한다.
[실시예 4]
본 실시예는 리신의 지속-작용성 A 사슬을 함유하는 면역독소[IT(A-la)로 약칭함]가 느린 혈장이탈 특성을 갖는 것을 보여준다.
A) 방법
실시예 3에 기재된 방법으로 제조한 접합체를 토기의 귀정맥에 1회 주사하여 투여한다. A사슬에서와 같이 주사량은 0.415mg/kg이다. 일정한 간격으로 헤파린에 체혈한다. 방사능 면역 측정 시험(하기에서는 RIM-3으로 약칭함)으로 혈장을 분석한다. Ac2용액이 생위IgG에 대한 염소 항체를 친화도 크로마토그래피로 정제하고 RIM-1 방법으로 방사능 표지시킨 용액이라는 점을 제외하고, 상기 시험은 RIM-1(실시예에 서술) 시험에 사용된 것과 동일한 방법으로 수행한다. 변형시킨 면역독소를 각기 다른 일정 농도로 도입하여 얻은 검정 곡선을 참고하여 시료 내의 변형된 면역독소의 농도를 측정한다. RIM-3 시험은 RIM-1 방법에 기재된 것과 같은 신뢰성 및 재현성을 갖는다.
비교하기 위해, 활성화 디설파이드기로 치환된 동일한 항체 AT15E을 천연 리신의A사슬과 반응시켜 수득한 집합체 IT-AT15E을 사용하여 동일한 조건하에서 대조실험을 수행한다. 상기 접합체의 제조는 실시예 3에 서술된 대로 수행한다. 상기 실험에 결과는 실시예 1의 비결합된 리신의 A사슬과 동일하게 나타난다.
B) 결과
제 2도는 IT AT15E(제1곡선) 및 IT(A-la) AT15E(제 2곡선)의 정맥 주사후 시간에 따른 혈장 이탈곡선을 나타낸다. 주사후 24시간때에 IT(A-la) AT15E활성 면역 독소의 농도는 보통의 IT AT15E 보다 120배 더 크다. 상기 결과로 부터 산화시킨 A 사슬의 새로운 약리학적 특성은 항체와 결합한 후에도 유지된다는 것이 증명된다.
[실시예 5]
본 실시예는 양성 표적세포 Thy1.2에 대한 IT(A-la) AT15E의 천연세포 독소 특성이 유지된다는 것을 증명한다.
리신의 A사슬의 기본적인 생물학적 특성은 리보솜의 소-단위 60S를 분해함으로서 단백질 합성을 억제하는 것이다.14C-루이신 배양중인 암 발생 세포와의 배합에 의한 물질의 효과를 연구할 수 있는 세포 모델을 사용하여 본 방법을 수행한다.
사용하는 세포는 항원 Thy1.2를 운반하는 인체 T백혈구로 부터 유도한 세포주 T2에 속한다. 연구할 물질의 존재하에 세포를 배양하고, 배양이 끝난 다음 상기 처리한 세포와14C-루이신의 함입도를 측정한다.
상기 측정은14C-루이신 추적자를 사용하여 단백질 합성도를 측정하는 방법(Journal of Biological Chemistry, 1974, 249(11), 3557∼3562)에 따라 수행한다. 함입된 방사성은 여과하여 분리한 전체 세포에 서 측정된다.
상기 측정을 기준으로 하여 횡좌표에 실험한 물질에서의 사슬의 몰농도를 나타내고, 종좌표에 단백질 합성에 영향을 미치는 다른 물질의 부재하에 대조용 세포에 의한 배합 백분율로서14C-루이신의 배합을 나타내어 투여량/효과 곡선을 그린다.
따라서 실험하는 각각의 물질에 대하여,14C루이신의 배합을 50% 억제하는 농도, 즉 "50% 억제 농도"(IC50)를 측정할 수 있다.
하기의 표 II는 IT-(A-la)-AT15E 및 ITAT15E와 천연 A사슬 및 비결합 A-1a 사슬의 각각 같은 시험에서 얻은 IC50값을 보여준다.
IT(A-la)AT15E가 대단히 강한 세포 독성 활성을 갖고 있어, 같은 조건에서 측정한 비결합된 변형 A-1a사슬보다 약 1000배 크고, 천연 A사슬을 함유하는 면역 독소에 해당하는 것으로 수득한 것과 동일함을 알수 있다.
[표 2]
Figure kpo00024
[실시예 6]
본 실시예는 동물에 정맥주사한 후 1) 천연 겔로닌이 빠른 이탈, 및 2) 소디움 퍼요오데이트로 L-루이신 존재하에 산화반응시켜 변형된 겔로닌의 느린 이탈을 설명한다.
A) 소디움 퍼요오데이트 및 L-루이신의 동시 작용에 이한 겔로닌의 변형
문헌(J.Biol. Chem.(1980), 255, 6947~6953)에 기재된 방법에 따라 겔로늄 멀티플로륨으로부터 겔로닌을 제조 및 정제한다. 티올기를 DTNB로 보호함을 생략하고 실시예 1에서 리신의 A사슬에 대해 서술된대로 변형반을을 수행한다.
실제로, 겔로닌의 천연 티올기를 이용한 겔로닌고 항체와의 결합은 일반적으로 일어나지 않으므로, 산화 단계후에 Cancer Res.(1984, 44, 129~133)에 기재된 방법에 따라 티올기를 인공적으로 도입한다. PBS 완충액에 용해시킨 3mg/ml의 겔로닌 용액 1ml에 물에 용해시킨 0.5M과 과요오드산나트륨 용액 21μL을 가하고, 1M 아세트산을 사용하여 ph16으로 조절한다. 어두운 곳에서, 4℃에서 16시간 동안 보온한다. 1M에틸렌 굴리콜 수용액 105μL을 가하여 반응을 정지시킨다. 20℃에서 15분 동안 보온한 후, 반응 매질을 4℃에서 PBS 완충액에 대해 투석한다. 10,000×g에서 30분 동안 원심 분리한 후, 2.5ml의 농도를 갖는 산화된 겔로닌 2.9mg이 수득된다.
라신이 A사슬과 마찬가지로 겔로닌의 주요 특성은 리보솜의 소-단위 60S를 분해하여 전핵 세포에서의 단백질 합성을 억제하는 것이다(Biochem. J., 저어널, 1982, 207, 505-509).또한 겔로닌도 과요오드산염 산화에 의한 변형으로 인해 활성이 손상되지 않는다.
B) 지속-작용성 겔로닌의 약리학적 특성
천연 겔로닐 및 상술한 방법으로 변형시킨 겔로닌을 토끼의 귀정맥에 1회 주사하여 투여한다. 겔로닌이 주사량은 0.3~0.4Ng.kg이다. 이따른 해파린 처리를 하면서 혈장 시표를 체취한다. 하기에서 RIM-2로 약칭한 방사능 면역 측정 시험을 이용하여 혈장을 분석한다.
Acl 용액이 친화도 크로마트그래피로 정제한 항-겔 로닌 토기 항체 용액이고 Ac2항체는 방사능 표시된 동일한 항체인 것을 제외하고, RIM-1 시험과 동일한 방법으로 수행한다. 방사능 표시 방법은 RIM-1에 기재한 것과 동일하다. 시료 내의 천연 겔로닌 또는 변형된 게로닌의 농도는 각기 다른 일정 농도에서 고유한 또는 변형된 겔로닌을 도입하여 만들어진 검정 곡선을 참고하여 측정한다. RIM-2시험은 RIM-1시험에 기재된 것과 동일한 신뢰성 및 재현성을 갖는다. 정맥 주사한 천연 겔로닌 및 변형된 겔로닌의 시간에 다른 혈장 이탈 곡선은, 천연 겔로닌이 천연 리신의 A사슬과 같이 매우 급속히 혈류로부터 이탈하여 24시간 후에는 혈류 존재겔로닌의 99.99%가 소실된다는 것을 보여준다. 겔로닌의 폴리사카라이드 단위를 변형시키면, 이탈 양상이 크게 변화하여, 주사후 24시간의 변형 겔로닌의 농도는 천연 겔로닌의 농도보다 300배 더 크다.
즉, 리신의 A사슬에서와 같이, 이들 결과는 소디움 퍼요오데이트 산화반응 및 L-루이신으로 인한 쉬프염기 형성반응에 의한 보호 반응이 겔로닌의 이탈에 관여하는 인지과정에 이용되는 슈가를 변형시켜 인지를 방해하는 것을 증명한다.
이들 변형된 면역독소는, 면역 독소 제조에 사용된 항체에 의해 인지될 표적 세포의 암 또는 비암 질환의 치료에 사용될수 있다. 최적 투여 조건 및 치료해야 할 질병의 성질 및 환자에 따라 경우별로 결정되어야 할 것이다. 본 발명에 의한 신규 약품은 주사, 바람직하게는 정맥 주사에 의해 투여하기 적절한 형태로 제공된다.

Claims (11)

  1. GPIR을 과량의 일차아민 존재하에서 퍼요오데이트 이온으로 처리하는 단계를 포함하는, 천연 GPIR의 리보솜-저해 및 GPIR의 생체내 지속작용성을 갖는 변형 GPIR의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, GPIR의 티올기 중 최소한 하나가 퍼요오데이트 이온으로 처리하는 중에 보호됨을 특징으로 하는 변형 GPIR의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 퍼요오데이트 이온을 빛이 차단된 0~15℃의 pH가 5~7인 수용액내에서 0.2~24시간 처리함을 특징으로 하는 변형 GPIR의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 반응액이 1~10mg/ml의 반응성 A사슬, 10~50mM 알칼린 퍼요오데이트 및 50~500mM의 일차 아민을 함유함을 특징으로 하는 변형 GPIR의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 일차 아민이 알킬아민, 아미노산 및 수용성 팹티드 중에서 선택한 지방족 아민 임을 특징으로 하는 변형 GPIR의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 아미노산이 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루타민산의 라세믹 또는 인티오머로부터 선택됨을 특징으로 하는 변형 GPIR의 제조방법.
  7. 제 2항에 있어서, 산화 반응전에, SH기를 보호하는 통상적인 시약으로 GPIR을 처리하고, 상기 SH기를 IO4 -이온 및 일차 아민으로 처리한 후에 탈보호함을 특징으로 하는 변형 GPIR의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, SH기를 보호하는 시약이 2,2'-디니트로-5,5'-디티오-디벤조산 및 3-(2-피리딜디술파닐)프로피온산에서 선택되고, SH기를 탈보호가 2-머캡토에탄올의 작용으로 수행됨을 특징으로 하는 변형 GPIR의 제조방법.
  9. 항체 및 또는 항체단편을 제 1항~제 8항중의 어느 하나에 의한 방법으로 제조한 변형 GPIR과 결합시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 생체내에서 지속작용을 갖는 면역독소의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 항체 또는 항체 단편과 변형 GPIR사이의 결합이 디설파이드 결합으로 이루어짐을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 1-에틸-3-(3-디메틸 아니노프로필)카르보디이미드로 활성화된 3-(2-피리딜디술파닐)프로피온산 또는 N-숙신이미닐-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트에서 선택된 서로다른 이작용 ; 시약에 의해 결합이 수행됨을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
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