KR920007399B1 - 인체 생리적 활성 폴리펩티드 - Google Patents
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제1도는 종래의 토끼 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 함유한 플라스미드 삽입물의 제한 지도를 나타낸 것이다.
제2도는 종래의 토끼 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 재조합 DNA(pTNF-lac-1)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.
제3도는 종래의 토끼 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 또 다른 재조합 DNA(pTNF-lacUV5-1)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.
제4도는 본 발명의 인체생리적 활성 폴리펩티드의 유전자를 함유하는 플라스미드 부분의 제한 지도를 나타낸 것이다.
제5도는 종래의 토끼 생리적 활성 폴리펩티드의 유전자를 함유하는 플라스미드 부분의 제한 지도를 나타낸 것이다.
제6도는 본 발명의 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 재조합 DNA(pHTNF-lacUV5-1)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.
제7도는 본 발명의 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 또 다른 재조합 DNA(pHTNF-lacUV5-2)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.
본 발명은 신규의 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 데옥시리보핵산(이후 "DNA"로 약칭한다.)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 DNA를 함유하는 복재 가능한 재조합 DNA, 복재 가능한 재조합 DNA에 의해 형질 전환된 미생물 또는 세포, 이 DNA를 형질발현시킴으로써 수득된 신규의 인체 생리적 활성 폴리펩티드, 여기에 설명된 아미노산 서열을 갖는 실제로 순수한 인체 생리적 활성 폴리펩티드, 생리적 활성 폴리펩티드를 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물, 및 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 더 특별하게는, 본 발명은 인체 TNF(종양 괴사인자)를 코오딩하는 DNA, DNA의 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 갖는 인체 TNF, 재조합 DNA 기술을 이용하여 DNA로부터 인체 TNF를 제조하는 방법, 및 이 방법에 의해 수득된 생성물의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서, 아미노산 및 펩티드는 IUPAC-IUB생화학 명명법 위원회(CBN)에 의해 승인된 하기의 약어로 표시한다. 이성질체를 갖는 아미노산 등에 있어서, 하기의 약어로 표시된 것은 특별한 지시가 없는한 L-배위이다.
Gln : 글루타민 잔기
Asp : 아스파르트 산 잔기
Pro : 프롤린 잔기
Tyr : 티로신 잔기
Val : 발린 잔기
Lys : 리신 잔기
Glu : 글루탐산 잔기
Ala : 알라닌 잔기
Asn : 아스파라진 잔기
Leu : 류신 잔기
Phe : 페닐 알라닌 잔기
Gly : 글리신 잔기
His : 히스티딘 잔기
Ser : 세린 잔기
Thr : 트레오닌 잔기
Ile : 이소류신 잔기
Trp : 트립토판 잔기
Arg : 아르기닌 잔기
Met : 메티오닌 잔기
Cys : 시스테인 잔기
폴리데옥시리보 뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 하기에 약칭되는 데옥시 뉴클레오티드잔기의 서열에 의해 표시된다.
A : 2'-데옥시아데닐산 잔기
C : 2'-데옥시시티딜산 잔기
G : 2'-데옥시구아닐산 잔기
T : 티미딜산 잔기
특별한 지시가 없는한, 데옥시 뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5'말단이다.
세망 내피 조직계를 자극하는 능력을 갖는 각종 물질, 예를 들면 각종 그램-양성 박테리아 및 내독소에 의해 유도된 항종양 활성을 갖는 생리적 활성 물질이 공지되어 있다. 특히, 카스웰 등은 CD-1 스위스 생쥐로부터의 혈청을 바실루스 칼메테구에린(BCG)으로 감염시키고, 2주후 내독소를 정맥 주사하면 배양된 L-세포에 대한 세포독성을 나타낸다는 것을 발견했으며, 또한(BALB/c x C57BL/6)F1생쥐에 이식된 Meth A 육종의 출현성 괴사를 유도하는 현상을 발견하였다. 이들은 혈청 중의 활성 물질에 TNF(종양 괴사인자)라는 이름을 명명하였다. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vo1, 72(No. 9), pp 3666∼3670(1975)]. 그후, 루프 등은 카스웰 등이 제안한 상술한 방법에 따라 제조된 토끼 TNF를 혈청보다 약 2000배 정제하였다는 것을 보고하였다[J. Immuno1. Vo1, 125(N. 4), pp. 1671∼1677(1980)]. 또한, 마튜 등은 토끼 TNF를 혈청보다 약 1000배 정제하였다는 것을 보고하였다[Br. J. Cancer, Vol. 42, pp 416∼422(1980)]. 그러나, 루프 등 및 마튜 등은 정제된 TNF에 관한 종양 괴사효과를 동물 실험에서 확인하지 않았다.
일본국 특허출원 공개 명세서 제57-140725(1982)에는 세망내피 조직계를 자극할 수 있는 능력을 갖는 한가지 이상의 물질을 생쥐, 토끼 또는 기니아피그와 같은 포유 동물에 투여하고 그램 음성 박테리움으로부터의 내독소를 포유 동물에 주사함으로써, 또는 포유 동물로부터의 활성 대식 세포를 함유한 조직 배양액에 그램-음성 박테리움으로부터의 내독소를 가함으로써 유도된 항종양 활성을 갖는 단백질성(Proteinaceous)생리적 활성 물질의 분리 및 정제방법이 기재되어 있다. 이 일본국 특허출원 공개 명세서에는 또한 정제된 단백질 생리적 활성 물질의 분자량 및 동전점(겔 여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 측정된 분자량, 39,000±5,000; 동전 촛점법에 의해 측정된 동전점, pH 3.9±0.3)이 기재되어 있으나, 단백질성 생리적 활성물질의 상세한 구조는 기재되어 있지 않다.
한편, 마튜는 BCG를 토끼에 주사하고, 주사 2주 후에 토끼의 각종 조직으로부터 단핵 식세포를 수득한후, 단핵 식세포의 새포 배양액에 내독소를 가함으로써 L세포에 대한 세포독소 활성을 갖는 물질을 수득할 수 있다는 것을 보고하였다[Br. J. Cancer, Voㅣ. 44(3), pp 418∼424(1981)]. 그러나, 이 보고서에는 수득된 물질의 상세한 구조가 기재되어 있지 않으며, 더우기 수득된 물질이 혈청에서 발견된 TNF와 동일하다는 것을 나타내는 증거도 없다.
또한, TNF-같은 생활성 또는 TNF의 활성과 유사한 생활성을 갖는 인자를 보고한 다수의 문헌이 있다. 예를 들어, 리드 등은 인체 말초 혈액에 존재하는 대식세포에서[J. Immunology, Vol. 115, p. 395(1975)], 마튜 등은 인체 말초 혈액 단세포 또는 골수단구성 백혈병으로부터 고통 받는 환자로부터 유도된 백혈병 세포에서[Immunology, Vol. 44, p. 135(1981)], 디. 바바라는 엡스타인-바르 비루스에 의해 형질 전환된 인체 B세포에서[Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 80, p. 5397(1983)], 및 비. 바라트는 림파아구 1788세포주에서 이런 인자를 발견하였다.
상술한 인자들은 또한 일본국 특허출원 공개 명세서 58-15921(1983), 58-21621(1983), 58-107197(1983), 및 58-225024(1983) 및 영국 특허출원 공개명세서 제2,106,117 및 2,117,385호에 기재되어 있다. 그러나, 이런 인자들을 생성할 수 있는 세포 또는 세포주는 아직 발견되지 않고 있다. 더우기, 이 인자들은 그의 구조 및 특성을 설명하는데 많은 문제점이 있다.
이또오[일본국 특허출원 제58-251817호(1983)]는 토끼 TNF 및 토끼-TNF 생성 세포의 특성 및 구조에 대해 연구하였다. 그 결과, 그는 세망 내피 조직계를 자극할 수 있는 물질을 토끼에게 투여하고, 박테리아로부터 유도된 내독소를 토끼에 주사함으로써 L세포에 대한 세포 독소 활성을 갖는 물질을 생성할 수 있는 세포를 수득하고, L세포를 이용하여 상기의 물질을 수득하였다. 그는 또한 상기에서 수득한 세포를 사용함으로써 수득된 L세포에 대한 세포 독소 활성을 갖는 물질의 분자량 및 면역적 특성이 토끼 혈청으로부터 수득된 TNF의 것과 일치한다는 것을 확인하였다. 한편, 유전자 조작 기술의 진전에 따라, 단백질을 코오딩하는 DNA가 분리된 형태로 수득될 수 있다면 단백질의 구조가 결정될 수가 있게 되었다. 즉, 분리된 DNA의 구조가 결정될 수 있으면 단백질의 구조는 그 DNA의 구조로부터 추론될 수 있다. 더우기, 미생물 또는 세포배양액을 이용하여 단백질을 코오딩하는 DNA로부터 단백질을 제조할 수 있게 되었다. 이또오는 L세포에 대한 세포 독소 활성을 갖는 물질을 생성할 수 있는 세포에 상술한 유전자 조작기술을 적용하였다. 그 결과, 그는 토끼 TNF를 코오딩하는 DNA를 분리하여 그 DNA 및 토끼 TNF의 구조를 결정하고, 그 DNA를 사용하여 토끼 TNF를 제조하는데 성공하였다.
상기에서 설명한 바와같이, 이또오는 토끼 TNF를 제조하는 커다란 성공을 거두었다. 그러나, 그 TNF가 유래되지 않은 동물에게 TNF를 투여하는 것은 아나필락시 쇼크는 유발하기 때문에 위험하다. 이것은 TNF가 폴리펩티드이기 때문에 TNF를 이 TNF가 유래되지 않은 동물에 투여할때 TNF가 항원으로 작용하여 항체를 생성하기 때문이다. 이런 이유로해서, TNF를 인체에 투여할때, 인체로부터 유도된 TNF를 사용하는 것이 몹시 바람직하다. 그러나, 인체 TNF의 구조는 아직 성공적으로 설명되고 있지 않다. 그러므로, 인체 TNF를 코오딩하는 DNA의 구조를 결정하는 것이 상당히 요구되고 있다.
본 발명자들은 인체 TNF를 코오딩하는 DNA의 구조에 대한 광범위한 연구를 계속하였다. 그 결과, 본 발명자들은 놀랍게도 인체 폴리펩티드 유전자 및 토끼 TNF유전자가 탐침으로 토끼 cDNA를 사용함으로써 클로닝될 수 있다는 것, 인체 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA가 능란하게 분리될 수 있으며 그의 구조도 염기 서열이 서로 유사한 토끼 TNF유전자, 인체 폴리펩티드 유전자 및 토끼 cDNA를 비교함으로써 결정될 수 있다는 것, 인체 폴리펩티드를 코오딩하는 순수 DNA의 구조가 능숙하게 결정될 수 있고 그 순수 DNA를 수득할 수 있다는 것, 및 인체 폴리펩티드를 코오딩한 DNA를 사용하여 제조된 인체 폴리펩티드가 L세포에 대한 세포 독소 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.
본 발명은 이러한 신규의 발견을 기초로 한 것이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인체 TNF를 코오딩하는 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인체 TNF를 코오딩하는 DNA 및 복제가능한 형질 발현 운반자를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 재조합 DNA에 의해 형질 전환된 미생물 또는 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상술한 및 기타의 목적 및 이점등은 하기의 상세한 설명에 의해 더욱 명백해 질 것이다.
본 발명에 따라, 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 가는 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 제공된다 :
(상기식중, Gln은 글루타민 잔기, Asp는 아스파르트산 잔기, Pro는 프롤린 잔기, Tyr은 티로신 잔기, Val은 발린 잔기, Lys는 리신 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Ala는 알라닌 잔기, Asn은 아스파라진 잔기, Leu는 류신 잔기, Phe는 페닐알라닌 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ser은 세린 잔기, Thr은 트레오닌 잔기, Ile는 이소류신 잔기, Trp는 트립토판 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, Met는 메티오닌 잔기 및 Cys는 시스테인 잔기를 나타낸다.)
본 발명의 인체 생리적 활성 폴리펩티드는 또한 상술한 아미노산 서열의 N-말단에 아미노산 메티오닌이 붙은 폴리펩티드 및 상술한 아미노산 서열의 N-말단에 인체 TNF용 부분 또는 전체 시그날 펩티드가 붙은 중간체를 포함한다. 폴리펩티드의 활성을 크게 변화시키지 않고 천연 또는 인공 변이에 의해 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA구조의 일부를 변화시킬수 있다. 본 발명의 인체 생리적 활성 폴리펩티드는 상술한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 유사물에 해당하는 구조를 갖는 폴리펩티드도 포함한다. 이와같은 모든 생리적 활성 폴리펩티드는 이후 "인체 TNF"로 약칭한다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 염기 서열을 함유하는 데옥시리보핵산을 제공하는 것이다.
(상기식중, Gln은 글루타민 잔기, Asp는 아스파르트산 잔기, Pro는 프롤린 잔기, Tyr은 티로신 잔기, Val은 발린 잔기, Lys는 리신 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Ala는 알라닌 잔기, Asn은 아스파라진 잔기, Leu는 류신 잔기, Phe는 페닐알라닌 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ser은 세린 잔기, Thr은 트레오닌 잔기, Ile는 이소류신 잔기, Trp는 트립토판 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, Met는 메티오닌 잔기 및 Cys는 시스테인 잔기를 나타낸다).
본 발명의 또다른 양상은 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기 서열 및 그의 상보적 염기 서열의 군에서 선택된 하나 이상의 염기 서열을 갖는 데옥시리보헥산을 제공하는 것이다.
(상기 식중, A는 데옥시아데닐산 잔기, G는 데옥시구아닐산 잔기, C는 데옥시시티딜산 잔기 및 T는 티미딜산 잔기를 나타내며, 일반식(Ⅱ)의 좌측 말단 및 우측 말단은 각각 5'-히드록실기측 및 3'-히드록실기측으로 표시한다.)
본 발명의 DNA는 미생물 또는 세포를 배양함으로써 성숙 인체 TNF를 제조하기 위해 상술한 염기 서열의 5'-말단에 ATG가 붙은 염기 서열을 갖는 DNA를 포함한다. 본 발명의 DNA는 또한 인체 TNF의 부분 또는 전체 시그날 펩티드를 코오딩하는 5'-측면 DNA를 갖는 DNA도 포함한다.
DNA의 구조 및 그로부터 유도된 폴리펩티드의 구조는 폴리펩티드의 주요활성을 변화시키지 않는 천연 또는 인공변이에 의해 부분적으로 변화될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 DNA는 상술한 폴리펩티드의 유사체의 구조를 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 염기 서열을 가질 수 있다.
유전 코오드의 변성에 따라, 유전자로부터 제조된 폴리펩티드외 아미노산 서열을 변화시키지 않고 유전자의 염기서열중 한 염기 이상을 또 다른 종류의 염기로 치환할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 DNA는 유전 코오드의 변성에 따라 치환함으로써 변화된 어떤 염기 서열을 가질 수도 있다. 이때, 상술한 치환에 의해 수득된 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열은 상기에서 정의한 일반식(Ⅰ)의 아미노산 서열과 동일하다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 상술한 데옥시리보 핵산 및 복제 가능한 형질 발현 운반자를 함유하는 복제가능한 재조합 DNA를 제공하는 것이다. 재조합 DNA는 형질 전환된 미생물 또는 세포 배양액에서 인체 TNF의 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드를 형질 발현할 수 있다. 적당한 운반자로는 예를들면 pHTNF-lac UV5-1 및 pHTNF-lac UV5-2 형질 발현 운반자가 있다.
또한, 본 발명은 인체 TNF의 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드를 형질 발현할 수 있는 재조합 DNA에 의해 형질 전환된 미생물 또는 세포 배양액에 관한 것이다. 이런 미생물 또는 세포 또는 세포 배양액에 관한 것이다. 이런 미생물 또는 세포 배양액의 예로는 에스케리키아 콜리, 바실루스 서브틸리스, 이스트 및 고등 동물 세포가 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 (a) 상술한 일반식(Ⅱ)의 데옥시리보 핵산을 복제 가능한 형질 발현 운반자에 결찰시켜 상기 데옥시리보핵산 및 상기 복제 가능한 형질 발현 운반자를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 수득하고; (b) 미생물 또는 세포 배양액의 세포를 상기의 복제 가능한 재조합 DNA에 의해 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성하고; (c) 미생물 또는 세포 배양액의 모세포로부터 상기 형질 전환체를 선택하고; (d) 상기 형질 전환체가 상기 데옥시리보 핵산을 형질 발현하도록 배양하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 제조하고; 및 (e) 배양된 형질 전환체로부터 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 분리함을 특징으로 하는 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 방법.
본 발명의 방법에 따라, 상술한 본 발명의 폴리데옥시리보핵산을 벡타인 복제 가능한 형질 발현 운반자에 결찰시켜 상술한 폴리데옥시리보핵산을 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 수득한다. 미생물 또는 세포배양액을 상기에서 수득된 복제 가능한 재조합 DNA로 형질 전환시켜 재조합 DNA를 함유한 형질 전환된 미생물 또는 세포 배양액을 수득한다. DNA에 따라 주어진 표현형 특성에 의해 모 미생물 및 세포 배양액으로부터 형질 전환체를 분리한다. 수득된 형질 전환 미생물 또는 세포 배양액을 성장시켜 상술한 데옥시리보 핵산이 코오딩하고 있는 유전정보를 형질 발현시킴으로써 본 발명에 따른 생리적 활성 폴리펩티드를 제조한다.
더우기, 본 발명은 숙주 세포로부터 분비된 직접 형질 발현 생성물인 성숙된 형태의 인체 TNF에 관한 것이다. 성숙 인체 TNF를 수득하는 방법으로는 예를들면 시그날 펩티드로서 미생물 또는 고등동물로부터 유도된 15∼40 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 성숙 TNF의 아미노산 서열의 말단에 결합시키는 DNA서열의 형성방법이 있다.
인체 TNF는 다음과 같이 수득될 수 있다 :
1. 미합중국 매사추세트 02138 캐임 브리지 7 디비너티 애비뉴 하버드대학교 생화학 및 분자 생물학부 티. 매니아티스 교수가 제조한 박테리오파지 λ/토끼 게노믹 라이브러리 및 박테리오파지 λ/인체 게노믹 라이브러러를 사용한다. 이들 물질은 하기의 방법에 따라 제조될 수 있다[Cell, 15, p. 687(1978)] :
(1) 토끼 또는 인체 조직, 예를들면 토끼 또는 인체 이자 조직을 동결된 분말 형태로 만들고, RNA 및 단백질 물질을 분해 처리하여 침전물에 고분자량의 토끼 또는 인체 DNA를 얻는다; (2) 고분자량 DNA을 유전자 위치에 따라 임의로 부분 분해한다; (3) 생성된 DNA 단편을 15∼20킬로 염기쌍(kb) 단편이 얻어지도록 크기-분획화 한다; (4) 상기 (3)에서 생성된 단편을 λ 샤론 4A 파지 벡타를 사용하여 클로닝 한다; (5) 생성된 벡타를 DNA를 함유한 감염성 파지 입자로 생체 외에서 포장하여 상술한 토끼 또는 인체 게노믹 라이브러리를 수득한다.
2. 참고예 3에서 수득된 토끼 TNF cDNA를 피. 더블유. 제이. 리그비 등의 니크 번역 방법[J. Mol. Biol. 113, p 237(1977)]에 의해32p-표지시킨다.
3. 각 박테리오 파지 λ/토끼 게노믹 라이브러리 및 박테리오파지 λ/인체 게노믹 라이브러리를 박테리아의 가상 교회(交會)에 도포하고32p-표지된 토끼 TNF cDNA로 혼성 스크린 한다.
4. 적당한 클론으로부터 상응하는 DNA를 분리하여 제한 지도를 그리고 서던 혼성법에 의해 분석한다[E. M. Southern, J. Mol, Biol., 98, p 503(1975)]. 토끼 또는 인체 TNF 유전자를 함유한 제한 단편을 플라스미드 벡타에 서브 클로닝하고, 서열화한다.
5. 토끼 TNF cDNA의 염기 서열을 토끼 TNF 유전자의 염기 서열과 비교하여 토끼 TNF 유전자의 엑손(토끼 TNF의 아미노산 서열을 코오딩하는 염기서열) 및 인트론(토끼 TNF의 아미노산 서열을 코오딩하지 않는 염기 서열)을 결정한다.
6. 인체 TNF 유전자의 염기 서열을 토끼 TNF 유전자의 염기서열과 비교하여 인체 TNF 유전자의 엑손 및 인트론을 결정한다.
7. 토끼 TNF 유전자의 인트론을 삭제하고 그의 엑손을 결합시킴으로써 얻어진 염기 서열로부터 추론된 토끼 TNF의 아미노산 서열은 토끼 TNF cDNA의 염기 서열로부터 추론된 것과 일치한다는 것이 확인된다.
8. 인체 TNF 유전자의 인트론을 삭제하고 그의 엑손을 결합시킴으로서 얻어진 인체 TNF를 코오딩하는 DNA의 염기 서열로부터 인체 TNF의 아미노산 서열을 추론해 낸다. 인체 TNF의 아미노산 서열은 토끼 TNF의 아미노산 서열과 부분적으로 일치한다는 것이 확인된다.
9. 인체 TNF를 코오딩하는 DNA를 적당한 형질 발현운반자에 생체외에서 삽입하여 코오딩 DNA를 함유하는 재조합 DNA를 형성한다. 이 재조합 DNA를 사용하여 적당한 숙주세포를 형질 전환시키고, 이를 배양액중에서 성장시켜 필요한 인체 TNF를 형질 발현시킨다.
10. 이렇게 제조된 인체 TNF는 성숙된 형태일때 세린으로부터 시작하는 155 아미노산 잔기를 갖는다. 그의 전 서열에 시그날 펩티드를 가질때, 시그날 펩티드는 매우 소수성이다.
이후에 인체 TNF 유전자의 수득방법, 인체 TNF를 코오딩하는 DNA의 염기 서열 및 이 DNA를 이용한 인체 TNF의 제조방법을 기재한다. 그러나, 이 설명은 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 본 발명의 필수적 특성 및 기본적 개념을 변화시키지 않는 범위내에서 적당히 변형시킬 수 있다.
각 아미노산에 상응하는 코오돈(유전 코오드)의 여러가지 사용빈도로 인해 그리고 기타의 이유로 해서, 인체 TNF를 코오딩하는 DNA의 염기 서열의 부분 또는 전체 부분은 그로부터 수득된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 유기 화학적으로 합성된 인공 DNA에 의해 치환될 수 있다.
인체 TNF 프로세싱 단계에서 중간체형을 통해 성숙 TNF로 프로세싱될 수 있는 프리펩티드 또는 프리프로펩티드로서 성숙된 형태로 세포내에서 제조될 수 있다. 인체 TNF의 미성숙 형태는 인체 TNF 유전자의 염기 서열로부터 추론될 수 있다. 미성숙 또는 중간체형의 TNF를 코오딩하는 DNA를 함유한 TNF DNA는 천연 또는 인공적으로 합성된 DNA와 함께 재조합 될 수 있다.
이 방법의 일예는 5'-말단에 메티오닌 코오돈(ATG)를 삽입하고 성숙 또는 중간체 또는 미성숙 TNF DNA의 3'-말단에 TAA, TAG 및 TGA에서 선택된 적어도 하나의 스톱 코오돈을 삽입함으로써 성취될 수 있다. 메티오닌 코오돈의 존재로 인해, 성숙 또는 중간체 또는 미성숙 TNF는 적당한 프로모터의 도움으로 합성된 mRNA으로 제조될 수 있다. 그러나, TNF의 N-말단에 붙은 메티오닌 잔기는 사용된 숙주 세포의 종류에 따라 절단되거나 절단되지 않을 수 있다. 스톱 코오돈을 삽입하는 목적은 적당한 위치(일반식(Ⅰ)의 폴리펩티드의 C-말단에서 TNF DNA로부터 전사된 mRNA의 번역을 중단시키는 것이다.
이 방법의 또 다른 예는 DNA에 "시그날 서열"로 공지된 매우 소수성의 염기 서열을 가함으로써 성취될 수 있다. 이 염기 서열을 가함으로써 숙주 세포의 외부로 또는 그램-음성 박테리아의 경우 "외질(periplasm)"이라는 공간으로 TNF를 분비하는 것이 용이해진다.
출발 코오돈이 삽입된 벡타를 이용할때, 인체 TNF 및 벡타로 인한 펩티드로 구성된 융합 펩티드가 제조될 수 있다. 이 경우, 융합 펩티드는 화학적으로 또는 효소적으로 절단될 수 있다. 그렇지 않으면, 이 융합 펩티드는 인체 TNF의 주요 활성에 역효과를 나타내지 않는다면 그 자체로 이용될 수 있다.
인체 TNF DNA를 그의 5'-말단의 상류부분에서 프로모터의 유전자 서열에 연결시켜 그의 복제를 방해하지 않으며 생성 RNA의 번역에 역효과를 일으키지 않는 TNF DNA 프로모터 서열을 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 TNF DNA-프로모터 서열을 박테리아 또는 고등생물체에서 복제할 수 있는 벡타와 결합시켜 재조합 유전자를 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 재조합 유전자는 숙주로 이용된 박테리아 또는 고등 동물 세포를 형질 전환시키는데 사용될 수 있다. 이렇게 수득된 형질 전환체를 배양하여 TNF 유전자를 형질발현시킴으로써 인체 TNF를 제조할 수 있다.
에스케리키아 콜리를 상술한 숙주로 사용할때, 적당한 숙주로는 HB101(ATCC 33694), C600K(ATCC 33955), D1210, RRI(ATCC 31343), MC1061, LE392(ATCC 33572), JM101(ATCC 33876), JM83 및 X1776(ATCC 31244)와 같은 이. 콜리 K-12의 각종 변이주가 있다. 이. 콜리 숙주를 사용할때, 적당한 벡타로는 pBR322, pBR325, pBR327, pUC8, pUC9, pMB9(ATCC 37019), pJB8(ATCC 37074) 및 pKC7(ATCC 37084)와 같은 플라스미드. λgt, λB 및 샤론 4A와 같은 λ파지 및 M13파지가 있다. 이. 콜리 세포에서 TNF를 제조하기 위해, 이. 콜리의 프로모터 및 파지 유전자로부터 선택된 프로모터를 이용할 수 있다. 적당한 프로모터로는 락토오즈 분해효소(LAC), 그의 UV5 변이체, 페니실리나제(BLA) 및 트립토판 합성효소(TRP)용 유전자, λ파지 PL프로모터 및 트립토판 합성효소 및 락토오즈 분해효소의 융합 프로모터인 tac 프로모터가 있다.
바실루스 서브틸리스를 숙주로 사용할때, 적당한 숙주로는 BD170균주(ATCC 33608), BR151균주(ATCC 33677) 및 MI112균주(ATCC 33712)가 있다. 바실루스 서브틸리스 숙주를 이용할때, 적당한 벡타로는 플라스미드 pC194(ATCC 37034), pUB110(ATCC 37015), pSA2100(ATCC 37014) 및 pE194가 있다. 또한, 바실루스 서브틸리스 숙주를 이용할때 적당한 프로모터로는 클로람페니콜 아세틸화효소(CAT), 페니실리나제 및 항-에리트로마이신용 유전자가 있다.
이스트를 숙주로 사용할때, 적당한 숙주로는 RH218(ATCC 44076), SHY1(ATCC 44769), SHY3(ATCC 44771), D[31A, 483 및 830과 같은 사카로미세스 세레비시아에의 균주가 있다. 이스트 숙주를 이용할때, 적당한 벡타로는 YEp13(ATCC 37115), YEp6, YRp7 및 YIp5와 같은 플라스미드가 있다. 또한 이스트 숙주를 이용할때, 적당한 프로모터로는 산 포스파타제, 알콜 탈수소효소(ADHI), 트립토판 합성효소(TRP), 포스포글리세레이트 키나아제(PGK), 치토그롬B(COB) 및 액틴용 유전자가 있다.
고등생물 세포 배양액을 숙주로 사용할때, 적당한 숙주로는 원숭이 신장, COS 및 생쥐 C127(ATCC 1616)의 세포 배양액이 있다. 고등생물 세포 배양액 숙주를 이용할때, 적당한 벡타로는 SV40 비루스가 있다.
본 발명의 신규 인체 생리적 활성 폴리펩티드는 생체의 정상 조직에 어떤 독성도 나타내지 않고 종양의 괴사를 일으킨다. 본 발명의 활성 폴리펩티드는 공지의 방법에 따라 세포증식, 즉 악성 종양의 세포증식을 억제하는데 유용한 약학적 조성물 형태로 제제될 수 있다. 활성 폴리펩티드는 약학적으로 무독한 담체 부형제와 배합될 수 있다. 본 발명의 활성 폴리펩티드 유효량을 적당량의 부형제와 혼합하여 환자에 투여하기 좋은 약학적으로 무독한 조성물을 제조한다.
본 발명의 생리적 활성 폴리펩티드는 항종양 또는 항 비루스 치료를 위해 주사제, 안약, 비약, 흡입제, 의용제제, 경구투여, 직장투여 또는 질정으로 투여될 수 있다. 성인에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 일일투여량은 일반적으로 50∼100,000,000단위의 범위이다. 극소 투여의 경우 50∼500,000단위, 정맥 주사 및 근육주사와 같은 일반적 주사의 경우 1,000∼1,000,000단위 및 경구 투여의 경우 10,000∼100,000,000단위가 바람직하다. 일일 투여량은 환자의 증세 및 용도에 따라 증가 또는 감소할 수 있다.
상기에 사용된 "1 단위"는 L-M세포(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 CCL 1.2) 1㎖당 50%의 1×105세포가 치사될 수 있는 본 발명의 생리적 활성 폴리펩티드의 양을 의미한다. 상술한 량은 하기와 같이 측정된다. 배양 용기로는 플로우 실험실(미합중국)에서 제조한 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하며, L-M세포를 1v/v%의 태내 송아지 혈청을 함유한 이글의 최소 필수 배지[이 배지의 조성은 일본국 아사꾸라쇼텐 준노스께 나까이 등에 의한 "조직 배양액"에 설명되어 있다]에서 배양한다. 배지로 연속 희석된 시료(0.1㎖) 및 L-M 세포 현탁액(0.1㎖, 1×105세포/㎖)를 플레이트의 각 웰에 혼합하고, 5% 이산화탄소를 함유한 공기층 및 37℃에서 48시간동안 상기 플레이트를 배양한다. 배양기간이 끝난후, 20㎕의 글루타르 알데히드를 가하여 세포를 고정시킨다. 고정후, 플레이트를 증류수로 세척하여 건조시키고, 0.05%의 메틸렌블루(0.1㎖)를 가하여 생존 세포를 염색한다. 플레이트를 증류수로 철저히 세척하여 과량의 염료를 제거하고, 건조시킨다. 0.36N염산을 각 웰에 가하여 염색된 세포로부터 염료를 추출한다. 플로우 실험실에 의해 제조된 타이터 텍 물티스칸을 사용하여 665㎚에서 각 웰의 흡광도를 측정한다. 흡광도는 생존 세포의 수에 비례한다. L-M세포 1㎖당 50%의 1×105세포가 치사되는 본 발명의 생리적 활성 폴리펩티드의 양은 희석율과 흡광도를 그래프에 플로트 함으로써 수득된다.
본 발명의 생리적 활성 폴리펩티드는 적당히 비경구 투여될 수 있다. 비경구 제제에는 첨가제로서 슈크로오즈, 글리세린, 메틸셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈 등과 같은 농화제 및/또는 각종 무기염과 같은 pH 조절제를 배합할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 정제 형태로 적당히 투여될 수 있다. 정제에는 첨가제로서 녹말, 락토오즈 등과 같은 부형제를 배합할 수 있다.
동물 실험의 결과, 생쥐의 종양은 1 또는 2번 주사에 의해 대부분 완전히 치료된다. 특히 인공 신생 세포(Meth-A세포)의 일부를 각 생쥐의 피부에 이식했다. 종양이 직경 6∼7㎜로 성장했을때, 0.6㎍의 본 발명의 폴리펩티드를 주사했다. 1주후 가피가 나타났다. 2주후 털이 자랐다. 이것은 종양의 완전한 치료를 의미한다. 그후, 임신 및 성공적인 출산이 관찰되었다.
본 발명은 하기의 참고예 및 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되며, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명을 실시하는데 있어, 재조합 DNA의 형성 및 재조합 DNA를 미생물에 삽입하는 것은 특별한 지시가 없는 한 하기의 실험 보고서[문헌(1)∼(4)]에 기재된 방법에 따라 수행한다.
(1) 다까기 야스다까 유전공학의 매뉴얼, 고단-샤, 도오꾜.
(2) 다까기 야스다까 유전공학의 실험방법, 고단-샤, 도오꾜.
(3) 티, 매니아티스, 이. 에프. 프리쓰크, 제이. 샘 브룩, 본자클로닝, 콜드 스프링 하버 실험실, 뉴욕.
(4) 레이 유 등, 효소학의 방법, 101권, 아카데믹 프레스, 뉴욕.
참고예 및 실시예에 사용된 약어
MOPS : 모르폴리노프로판술폰산
LB배지 : 루리아-베르타니(Luria-Bertani)배지
DMSO : 디메틸 술폭시드
PFU : 플라크 형성 단위
EDTA : 에틸렌디아민 테트라아세트산
SDS : 소듐 도데실 설페이트
BRL : 베데스다 연구 실험실
DMT : 디메톡시트리틸
lac : 락토오즈
Tris : 트리스(히드록시메틸)아미노 메탄
XAR-5 : 이스트맨 코닥사제 시판품인 x-선 필름
1×SSC : 0.15M NaCl+0.015M 이소시트레이트, pH7
2×SSC : 0.30M NaCl+0.030M 소듐시트레이트, pH7
3×SSC : 0.45M NaCl+0.045M 소듐시트레이트, pH7
5×SSC : 0.75M NaCl+0.075M 소듐시트레이트, pH7
6×SSC : 0.9M NaCl+0.09M 소듐시트레이트, pH7
FDSS : 50%탈이온화 포름아미드+5×덴하트+5×SSPE+0.1%SDS+100㎍/㎖
[변성 송아지 흉선 DNA]
[SSPE : 0.18M NaCl+10mM NaH2PO4+1mM EDTA, pH7.4]
SM : 1ℓ당 5.8g의 NaCl, 2g의 MgSO4·7H2O, 50㎖의 1M 트리스 Cl(pH7.5) 및 5㎖의 2% 젤라틴을 함유한 파지 저장 배지
NZ-브로스 : 10g의 NZ아민, 5g의 NaCl 및 2g의 MgSO4·7H2O를 함유한 배지(NZ 아민은 흄코 쉐필드 케미칼 디비젼 어브크래프트사제 상품인 카제인의 A형 가수분해물이다)
IPTG : 이소프로필 티오갈락토시드
x-gal : 5-브로모-4-클로로-3-인들릴갈락토시드
TAE : 0.04M 트리스-아세테이트(pH8.0)-0.002M EDTA
5×덴하트 용액 : 1ℓ당 피클(Ficoll) 1000㎎, 폴리비닐피롤리돈 1000㎎ 및 BSA 1000㎎을 함유한 수용액
bp : 염기쌍
[참고예 1]
[L세포에 대한 세포 독소 활성의 평가]
하기의 참고예 및 실시예에서 제조된 생리적 활성 물질의 L세포에 대한 세포 독소 활성의 평가는 루프 등의 방법[림포킨, 2권, 이. 피크. 아카데믹프레스, 뉴욕 p 235(1980)] 또는 문헌[J. Immunol, 126, p-1279(1981)]에 기재된 방법에 따라 L929세포(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 CCL1)에 대한 세포 독소 효과를 측정함으로써 수행한다. 실시예에서 제조된 생리적 활성 물질의 세포 독소 활성의 평가 방법은 하기에 설명한다.
배양 용기로 플루우 실험실(미합중국)에서 제조된 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여, 1v/v%의 태내 송아지 혈청 및 5㎍/㎖(최종농도)의 액티노마이신 D을 함유한 이글의 최소필수배지[이 배지의 조성은 일본국 아사꾸라 쇼텐 준노스께 나까이 등에 의한 "조직 배양액"에 설명되어 있다]에서 L 929세포를 배양한다. 배지로 연속 희석된 시료(0.1㎖) 및 L 929 세포 현탁액(0.1㎖, 1×105세포)을 플레이트의 각 웰에서 혼합하고, 플레이트를 5%의 이산화탄소를 함유한 공기중 및 37℃에서 21시간동안 배양한다. 다 배양한 후, 글루타르알데히드의 20% 수용액 20㎕를 가하여 세포를 고정시킨다. 고정후, 플레이트를 증류수로 세척하고 건조시킨 다음, 0.05% 메틸렌 블루(0.1㎖)를 가하여 생존 세포를 염색한다. 플레이트를 증류수로 철저히 세척하여 과량의 염료를 제거하고 건조시킨다. 0.36N염산을 각 웰에 가하여 염색된 세포로부터 염료를 추출한다. 플로우 실험실(미합중국)에서 제조된 타이터 텍 물티스칸을 사용하여 665㎚에서 각 웰의 흡광도를 측정한다. 흡광도는 생존 세포의 수에 비례한다. 생리적 활성 물질의 세포 독소 활성(단위/㎖)은 50% 세포 독성을 일으키는 생리적 활성 물질의 상호 희석율으로 정의되며, 희석율과 흡광도를 그래프에 플로팅 함으로서 수득될 수 있다. 참고예에 사용된 "1단위"는 1㎖의 L 929 세포 당 50%의 105세포가 치사되는 토끼 TNF의 양을 의미한다.
한편, 단백질의 양은 브래포드 등의 방법[Anal. Biochem. Vol. 72, pp 248∼254(1976)]에 따라 코마시브릴리언트 블루 G 250을 단백질에 결합시키는 방법에 의해 결정한다.
[참고예 2]
[단계 1]
[토끼 혈청으로부터 TNF의 제조]
체중 2.5∼3㎏의 암컷 토끼의 귀정맥을 통해 50㎎의 포르말린-치사된 프로피오니 박테리움 아크네스(코리네 박테리움 파로븜; 웰컴 연구 실험실, 영국)를 주사한다. 8일후, 귀 정맥을 통해 100㎍의 내독소(에스케리키아 콜리 026 : B6으로부터의 리포폴리사카라이드, 디프코실험실, 미국)를 다시 주사하고 2시간후 심장으로부터 전형을 채취한다. 수거된 혈액에 100㎖당 100단위의 헤파린 소듐을 가하여, 5000rpm에서 30분간 냉각시키면서 혈액을 원심 분리하여 혈액세포 및 불용성 고체를 제거한다. 결과로서 40 토끼로부터 3×104단위/㎖의 혈청 TNF세포 독소 활성을 갖는 혈장(2.4ℓ)이 수득된다.
[단계 2]
[토끼 혈청으로부터 TNF의 부분 정제]
단계 1에서 수득된 혈장(2.4ℓ)에 24g의 셀라이트를 가한다. 생성물을 1시간동안 교반하고 여과한다. 여과액을 1.2ℓ의 0.04M 트리스-HCl 완충액(pH7.8)과 혼합하고, 0.1M NaCl을 함유한 0.04M 트리수-HCl 완충액(pH7.8)으로 충분히 평형된 DEAE-세파로즈 CL-6B 컬럼(파마시아 파인 케미칼사제 스웨덴)에 넣는다. 컬럼을 0.04M 트리스-HCl 완충액으로 세척하고, 흡착된 TNF를 0.18M NaCl을 함유한 0.04M 트리스-HCl 완충액(pH7.2)으로 용출시킨다. L세포에 대한 세포 독소 활성을 나타내는 분획을 한외 여과에 의해 농축한다. 이렇게 수득된 농축물을 5mM 인산 완충액으로 충분히 평형된 세파크릴 S-200의 컬럼(퍼마시아 파인 케미칼제, 스웨덴)에 넣고, 같은 완충액을 사용하여 겔 여과한다. 활성분획을 한외 여과에 의해 농축하여 3.5×106단위의 활성 및 18×106단위/㎎의 비활성을 갖는 정제된 TNF를 수득한다.
[단계 3]
[항-TNF항체]
단계 2에서 부분적으로 정제된 토끼 혈청 TNF를 완전한 후레운드의 보조제와 혼합(1 : 1)하고, 12주된 BALB/c 숫컷 생쥐의 등에 피하 주사한다. 최초 주사후 2 및 4주때 상기의 공정을 반복한다. 최종 주사 1주후, 전혈을 채취한다. 수거된 혈액으로부터 혈청을 수득한다.
최종 농도에서 500배 희석된 량으로 L세포에 대한 TNF의 세포 독소 활성을 평가하기 위해 상기에서 수득된 혈청을 배양 배지에 가한다. L세포에 대한 토끼 혈청 TNF의 세포 독소 활성을 참고예 1에 기재된 것과 같은 방법으로 평가한다. 토끼 혈청 TNF는 L세포에 대한 어떤 세포 독성도 나타내지 않는다는 것이 발견된다. 상기의 결과로부터, 이 단계에서 수득된 생쥐 혈청은 토끼 혈청 TNF에 대한 항체(이후 "항 TNF항체"로 약칭한다)를 함유한다는 것을 알 수 있다.
[참고예 3]
[단계 1]
[TNF-생성 세포의 제조]
암컷 토끼에 프로피오니박테리움 아크네스(코리네박테리움 파르붐; 웰컴 연구실험실, 영국)의 포르말린-치사된 세포를 정맥내 주사한다. 7일 후, 토끼를 기관 절개하고, 허파를 생리 식염수로 세척하여, 뜨는 세포를 수득한다. 수득된 세포를 생리 식염수로 세척한다. 배양 배지로 10v/v% 태내 송아지 혈청을 함유한 RPMI 1640(플로우 실험실, 미합중국)를 사용하여 5% 이산화탄소를 함유한 공기 중에서 37℃로 세포를 배양한다. 세포 배양액을 2군으로 나누고, 그중 하나에 에스케리키아 콜리로부터 유도된 내독소(에스케리키아 콜리 026 : B6로부터의 리포폴리사카라이드, 디프코 실험실, 미합중국)를 10㎍/㎖의 농도로 가한다. 같은 양의 멸균수를 또 다른 하나에 가한다. 내독소를 가한 세포 배양액의 상층액은 L세포에 대한 세포 독소 활성을 나타내며, 7시간내에 활성은 최대치에 도달한다. 이 활성은 항-TNF항체에 의해 소실되나, 정상 생쥐 혈청에 의해서는 소실되지 않는다.
한편, 내독소를 가하지 않은 세포 배양액의 상충액은 L세포에 대한 어떤 세포 독성도 나타내지 않는다.
[단계 2]
[TNF의 분자량]
내독소를 가한 단계 1에서 제조된 세포 배양액에 방사성 L-[35S]메티오닌(1300Ci/밀리몰, 아메르샴 공업사, 영국)을 더 가한다(1mCi/㎖). 라엠리의 방법[라엠리, 영국(1970), Nature(런던), Vol. 227, pp680∼685]에 따라, SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 상충액을 분석한다. 겔 농도를 12.5중량%로 조절한다. 전기 영동후, 겔을 ENHANCE
(뉴잉글랜드 뉴클리어사(미국)제 상품명)로 처리하고, 건조시킨 다음, X-선 필름(후지 RX, 후지포토 필름사 제)에 노출시킨다. 내독소 존재하의 세포 배양액의 상충액에 약 17500의 분자량을 갖는 물질이 형성되는 것이 관찰된다.
또한, 단계 1에서 제조된 각 세포 배양액의 상충액을 상술한 바와 같은 방법으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한다. 겔을 2.5% NP 40
(칼비오켐사제 표면 활성제)에서 1시간동안 진탕하고, 물에서 2시간동안 진탕한다. 진탕후, 각 이동부분을 절단 분리하고 이동 방향에 수직방향의 2㎜너비의 스트립으로 절단한다. 각 스트립을 L세포와 함께 배양하고, L세포에 대한 세포 독소 활성을 평가한다. 내독소를 함유한 세포 배양액의 상충액이 전개된 레인에서, 17500의 분자량에 해당하는 위치에 L세포에 대한 세포 독성이 관찰된다. 다른 위치에서는 세포 독성이 관찰되지 않는다.
[단계 3]
[mRNA의 추출]
단계 1에서 제조된 세포 배양액에 내독소를 가한후 2시간동안 배양하고, 원심 분리하여 세포를 수거한다. 치르원 등의 방법[Chirgwin, J. M. et al, Biochemistry Vol. 18, p 5294(1979)]에 따라, 수거된 세포로부터 세포질 RNA를 추출하고, 세포질 RNA로부터 mRNA를 추출한다. 4㎖의 4M 구아니딘 티오시아네이트 용액을 3×108세포에 가하고, 혼합물을 균질화기(모델 : AM-7, 니혼세이끼 세이샤꾸쇼제, 일본)에 의해 분쇄한다. 잔류물을 원심 분리에 의해 제거하고, 2.4g의 염화세슘을 용해시킨다. 혼합물을 2.5㎖의 5.7M 염화세슘 및 0.1M EDTA용액(pH7.5)이 미리 채워진 폴리 알로머튜브에 조심스럽게 붓고, 베크만 SW 41로우터(베크만 인스트루먼트제, 미국)를 사용하여 30,000rpm 및 20℃에서 12시간동안 초원심 분리한다. 상충액을 제거한 후, 펠릿을 1㎖의 10mM 트리스-HCl 완충액(5mM EDTA 및 1w/v% SDS함유)에 용해시킨다. 생성된 용액을 클로로포름 및 1-부탄올의 4 : 1 부피 혼합물로 추출한다. 수상에 0.05부피의 2M 소듐아세테이트 및 2.5부피의 에탄올을 가하고, -20℃에서 2시간 이상 방치하여 RNA를 침전시킨다. 침전물을 원심 분리에 의해 수거하여 건조시키고, 500㎕의 멸균수에 용해시킨다. 그 결과, 세포질 RNA용액이 수득된다.
상기에서 수득된 RNA용액을 68℃에서 2분 동안 가열한 후, 급속 냉각시킨다. 2배 농도의 10mM 트리스-EDTA완충액(pH7.4)(1mM EDTA, 0.1w/v% SDS 및 0.5M 염화리튬 함유) 500㎕를 용액에 가하고, 혼합물을 200㎎ 올리고 dT-셀룰로오즈(베데스다연구 실험실, 미합중국) 컬럼에 넣은 후, 상기와 같은 완충액(1배농도) 10㎖로 세척한다. 컬럼에 남아 있는 물질을 10mM 트리스-HCl 완충액 pH7.4, 1mM EDTA 및 0.1w/v% SDS를 함유한 용리 완충액 2㎖로 용출시킨다. 용출액에 0.05부피의 소듐아세테이트 용액 및 2.5부피의 에탄올을 가하고, 혼합물을 -20℃에서 냉각시켜 침전시킨다. 침전물을 원심분리에 의해 수거하여 올리고 dT-셀룰로오즈 컬럼에 넣고, 올리고 dT-셀룰로오즈에 흡착된 분획을 수거한다. 자외선 스펙트럼 분석에 의해 결정된 85㎍의 mRNA를 회수한다.
[단계 4]
[mRNA의 크기 분확화]
단계 3과 같은 방법에 의해 제조된 mRNA 880㎍을 250㎕의 물에 용해시키고, 생성용액을 10㎖ 5∼25% 선상 슈크로오즈 밀도 경사에 층 분리한다. 슈크로오즈 밀도 경사는 5% 슈크로오즈 및 25% 슈크로오즈를 각각 함유한 트리스 완충 용액[25mM 트리스-HCl(pH7.2), 2mM EDTA 및 1w/v% SDS]을 사용하여 ISCO 570 경사기(ISCO사제, 미합중국)에 의해 제조된다.
베크만 SW41 로우터를 사용하여 40000rpm 및 4℃에서 12시간동안 초원심 분리하고, 각 400㎕의 분획을 분획 회수 장치(베크만 인스트루먼트사제, 미합중국)에 의해 회수한 후, 에탄을 침전시킨다. 침전된 분획을 원심 분리하고, 멸균수에 용해시킨다.
[단계 5]
[mRNA의 번역 실험]
실험 보고서(예. 데라오까 히로시, 이쓰끼 미끼오 및 다나까겐따로, "단백질, 핵산, 효소", 유전공학, 엑스트라판, 1981, p 602)에 기재된 방법에 따라 크세노푸스 라에비스의 난모세포(하마마쓰 생물학 교수 물질)을 사용하여 mRNA의 번역을 수행한다. 크세노푸스 라에비스는 하마마쓰 생물학 교수 물질로부터 획득한다. 단계 4에서 수득된 분획화 mRNA를 멸균수에 용해시켜 1㎍/㎕농도로 만들고, 용액을 세포당 50nl정도의 소량으로 난모세포에 주사한다. 1㎎/㎖ 소혈청 일부만을 함유한 바쓰의 용액[7.5mM 트리스-HCl(pH7.6), 88mM NaCl, 1mM 염화칼륨, 0.33mM 질산칼슘, 0.41mM 염화칼슘, 0.82mM 황산마그네슘, 2.4mM 중탄산나트륨, 18U/㎖ 페니실린 G 및 18㎍/㎖ 스트렙토마이신]중에서 24시간동안 세포를 배양한다.
난모세포를 유리바에 의해 배양 용액중에서 파쇄시킨다. 배양액을 원심분리하고, 상층액을 L세포에 대한 세포 독소 활성을 평가한다. mRNA를 번역하여 16S크기의 최대활성침전물을 갖는 폴리펩티드를 수득한다. 이 활성은 참고예 2의 단계 3에서 수득된 항-TNF항체에 의해 제거되나, 정상 생쥐 혈청에 의해서는 제거되지 않는다.
[단계 6]
[형질 전환체의 제조]
단계 4에서 수득된 분획화 mRNA 5㎍을 사용하여 문헌(1)의 96페이지에 기재된 방법에 따라 이중가닥 DNA를 제조한다. 역전사효소로는 라이프 사이언스사의 제품을 사용한다. 이중가닥 DNA를 3.5% 폴리아크릴 아미드겔에 크기-분획화하고, 약 1000∼2000bp의 330ng 분획을 수득한다. 문헌(1)의 방법에 따라, 7ng의 이 분획을 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제(베데스다 연구실험실 제, 미합중국)를 사용하여 데옥시 C잔기를 확장시키고, PstⅠ으로 분해되고 데옥시 G 잔기로 확장된 플라스미드 pBR 322으로 어닐링한다. 이렇게 어닐링된 혼합물을 이. 콜리 K-12 균주(HB 101, ATCC 33694)에 삽입하여 균주를 형질전환시킨다. 그 결과, 12000형질전환체가 수득된다.
[단계 7]
[토끼 TNF의 부분 아미노산 서열]
참고예 2에서 부분 정제된 토끼 TNF(활성 : 5×107단위)를 단계 2에서 정제한 것과 같이 SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기영동한다. 겔의 일부를 코마시브릴리언트 블루로 염색한다. 분자량 17000에 해당하는 위치의 밴드를 겔로부터 절단하고, 1% 중탄산 암모늄으로 추출한다. 약 180㎍의 TNF를 단백질로 회수한다.
회수된 TNF 150㎍을 75㎕의 1% 중탄산 암모늄에 용해시키고, 3㎍의 TPCK 트립신(워싱톤 바이오케이칼제, 미합중국)을 가한다. 혼합물을 37℃에서 4시간동안 배양한다. 패킹 물질로 코스모실 5C8(나까라이 케미칼제, 일본)이 패킹된 고성능 액체크로마토그래피 컬럼 의해 상기 혼합물을 분획화하여 트립신으로 분해된 단편을 수득한다.
고정제 TNF 및 그의 트립신-분해 단편을 세파덱스 G-25 컬럼에 의해 탈염시키고, 동결건조시킨다. 알. 엠 헤위크 등의 방법(J. Biol. Chem, Vol. 256 pp 7990∼7997, 1981)에 따라, 정제된 TNF 및 트립신-분해 단편을 각각 N-말단으로부터 에드만 분해한다. 컬럼으로 솔팩스 ODS(이. 아이. 듀퐁, 미합중국)를 사용하여 고속 액체크로마토그래피 모델 SP8100(스팩트라피직스, 미합중국)에 의해 통상의 방법에 따라 각 단계에서 생성된 PTH-아미노산을 분석한다. 그 결과, TNF가 하기의 N-말단 아미노산 서열을 갖는 것이 발견된다.
Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-
트립신-분해 단편중의 하나는 하기의 N-말단 아미노산 서열을 갖는다.
Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala
[단계 8]
[올리고데옥시뉴클레오티드 탐침의 합성]
참고예 3의 단계 7에서 수득된 토끼 TNF의 아미노산 서열로부터 추론된 mRNA의 염기서열에 상보적인 올리고데옥시뉴클레오티드를 본 발명자에 의해 이미 보고된 개량된 포스포트리에스테르 방법["Nucleic Acid Res. "10, 1755∼1769(1982)]에 따라 합성한다. 올리고데옥시뉴클레오티드를 제조하는데 있어서, 토끼 TNF의 아미노산 서열로부터 평가된 128올리고데옥시뉴클레오티드를 5군, 즉 16, 16, 32, 32 및 32의 군으로 분류하고, 각 군의 올리고데옥시뉴클레오티드의 혼합물로 합성한다. 각 군의 수득된 올리고데옥시뉴클레오티드를 통상의 방법에 따라 탈보호하고, 세파덱스 G-50(파마시아파인 케미칼, 스웨덴)을 사용한 컬럼 크로마토그래피, 7M의 우레아를 함유한 20중량%의 폴리아크릴아미드겔에 전기영동 및 DE52(와트만사, 미합중국)를 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다. 각 군의 수득된 올리고데옥시뉴클레오티드를 0.1mM 트리스-EDTA 완충용액에 투석시킨다.
각 군의 정제된 올리고데옥시뉴클레오티드 각각을 통상의 방법에 따라 T4폴리뉴클레오티드 키나아제(베데스다 연구실험실, 미합중국) 및 γ-32P-아데노신 트리포스페이트를 사용하여 표지시키고, DE52(와트만사, 미합중국)를 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다. 방사성 물질을 약 3×108cpm/㎍의 양으로 각 군의 올리고데옥시뉴클레오티드 각각에 배합한다. 각 군의 혼합물 형태로 수득된 각 올리고데옥시뉴클레오티드 탐침은 표 1에 나타낸 바와같이 정의한다.
토끼 TNF의 아미노산 서열 일부, 토끼 TNF의 아미노산 서열로부터 평가된 mRNA의 염기서열 및 각 군의 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 탐침의 염기서열은 표 1에 나타낸다.
[표 1]
주 :
X는 A, C, G 또는 U의 리보핵산 잔기를 나타낸다.
Y는 A 또는 G의 리보핵산 잔기를 나타낸다.
M은 T 또는 C의 데옥시리보핵산 잔기를 나타낸다.
N은 A 또는 G의 데옥시리보핵산 잔기를 나타낸다.
Z는 A, C, G 또는 T의 데옥시리보핵산 잔기를 나타낸다.
참고예 3의 단계 3에 따라 수득된 TNF를 생성하는 세포의 mRNA를 1M의 글리옥살, 10mM의 NaH2PO4및 50부피%의 디메탈술폭시드를 함유한 용액으로 50℃에서 60분간 처리하고, 1.1중량%의 아가로즈겔에 전기영동하여 분획화한다. 분획화된 mRNA를 메이커의 매뉴얼에 따라 전기영동형 전이블로팅 장치의 필터(바이오래드제, 미합중국)에 전이시킨다.
장치의 필터에 있는 mRNA를 5×SSC용액 및 150㎍/㎖의 변성 살몬 스페르마토조아 DNA를 함유한 5×덴하트 용액으로 65℃에서 2시간동안 처리하고, 1×107cpm/㎖의 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드 및 5×SSC용액을 함유한 5×덴하트 용액으로 50℃에서 2시간동안 처리한다. 상기에서 수득된 필터를 6×SSC용액으로 실온, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 연속해서 4번 세척한다. XAR-5 X선 필름(이스트맨 코닥사제, 미합중국)으로 필터를 조사시킨다. 그 결과, 탐침 MJ에 의해 지정된 올리고데옥시뉴클레오티드는 mRNA와 함께 강하게 혼성되며, 이것은 mRNA에 완전히 상보적인 염기서열을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드가 탐침 MJ에 의해 지정된 올리고데옥시뉴클레오티드에 함유된다는 것을 나타낸다.
[단계 9]
[토끼의 TNF 유전자의 클로닝]
문헌(2) 162페이지에 기재된 방법에 따라, 참고예 3의 단계 6에서 수득된 형질전환체를 셀룰로오즈 필터에 전이시키고, 형질전환체의 DNA를 참고예 3의 단계 8과 같은 조건(군락 혼성법)하 참고예 3의 단계 8에서 선택된 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드(탐침 MJ)와 혼성화시킨디. 이 방법에서, 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드(탐침 MJ)와 강하게 혼성화된 49군락을 선택하고, 또 다른 니트로셀룰로오즈 필터에 더 고정시킨다. 49군락을 사용하여 더 혼성화시켜 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드(탐침 MJ)와 더 강하게 혼성화된 9군락을 선택한다.
문헌(1) 6페이지에 기술된 금속 플라스미드 분리 방법에 따라, 각 9군락으로부터 약 5㎍ 플라스미드를 수득한다. 수득된 플라스미드 각각을 메이커의 매뉴얼에 기재된 방법에 따라 제한효소,
,
,
및
(베데스다 연구실험실 U.S.A)를 사용하여 절단하고, 1중량%의 아가로즈겔에 전기영동한다. 각 제한효소로 절단함으로써 수득된 단편들의 길이를 비교한다.
이 결과는 9군락에 상응하는 9균주 모두가
및
에 의해 절단함으로써 수득된 약 50bp로 구성된 단편의 염기서열을 가지며, 9균주의 대부분이
에 의해 절단함으로써 수득된 약 200bp로 구성된 단편의 염기서열을 갖는다는 것을 나타낸다. 다시말해서, 9균주는 부분적으로 공통인 염기서열을 갖는다. 제한효소에 의한 분석결과는 제1도에 나타낸다.
하기 표 2에 기재된 플라스미드를 함유한 7균주를 용액의 광학밀도가 하기 표 2에 나타내는 값을 나타낼때까지 10㎍/㎖의 테트라시클린을 함유한 LB 배지 2㎖에서 따로 배양하고, 원심분리하여 각 균주를 수득한다. 수득된 각 균주를 2㎖의 생리식염수에 따로 가하고, 음파 파쇄한다. 수득된 용액을 원심분리하고, 수득된 상층액의 L세포에 대한 세포 독소 활성을 결정한다. 결과는 하기 표 2에 나타낸다. 공시험으로, 플라스미드 pBR322을 함유한 균주를 사용하여 상기의 방법을 반복한다. 결과는 하기 표 2에 나타낸다.
[표 2]
L세포에 대한 세포 독소 활성은 항-TNF항체에 의해 소실되나, 정상 생쥐 혈청에 의해서는 제거되지 않는다. 이것은 상술한 9군락 모두가 TNF를 코오딩한 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드를 갖는다는 것을 나타낸다.
[단계 10]
[토끼 TNF를 코오딩한 DNA의 염기서열의 결정]
플라스미드 pB 2-7 및 pR18을 함유한 이. 콜리 균주를 문헌(3) 440페이지에 기재된 10㎍/㎖의 테트라시클린을 함유한 M9 배지 1ℓ에서 배양한다. 문헌(3) 90페이지에 기재된 방법에 따라, 각 플라스미드를 약 150㎍양으로 분리한다.
각 플라스미드 삽입물의 염기서열을 막삼 등 "효소학의 방법", 55, P490(1980), 아카데믹 프레스의 막삼-길버트 화학방법에 따라 결정한다. 이렇게 결정된 염기서열은 참고예 3의 단계 7에서 결정된 부분 아미노산서열과 일치하는 것이 발견된다. 따라서 토끼 TNF의 전체서열이 밝혀진다.
[단계 11]
이 단계에서는 재조합 플라스미드 pR12를 사용하여 플라스미드를 형성하여, 프로모터로
을 사용하여 이. 콜리에 TNF를 직접 형질 발현시킨다. 그 방법은 제2도에 상세히 나타낸다. 첫번째 10㎍의 플라스미드 pR12를 10단위의
(베데스다 연구실험실, 미합중국)으로 37℃에서 2시간동안 분해하고, 4중량%의 폴리아크릴 아미드겔에 전기영동하여 630bp단편을 분리한다. 약 1㎍의 단편을 전기영동하에 의해 겔로부터 분리한다. 참고예 3의 단계 8과 같은 방법으로 제2도에 기재된 두 올리고데옥시뉴클레오티드, 즉 5'-GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3' 및 5'-CGAGAAGCTGACATG-3'을 합성한다. 올리고데옥시뉴클레오티드(약 100피코몰)의 각 5'말단을 문헌(3) 122페이지에 기재된 방법에 따라 T4폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 포스포릴화한다.
반응 완결후, 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 클로로포름으로 더 추출한다. 수득된 합성 올리고머를 0.5㎍의
630bp단편과 혼합하고, 에탄올 침전시킨다. 문헌(1) 37페이지에 기재된 방법에 따라 10단위의 T4DNA 리가아제를 사용하여 단편을 합성 올리고머와 함께 4℃에서 밤새 결찰시킨다. 반응 완결후, 반응혼합물을 에탄올 침전시키고, 20단위의
으로 37℃에서 3시간동안 분해한 후, 4중량%의 폴리아크릴 아미드겔에 전기영동하고, 전기용출에 의해 670bp단편을 회수한다. 1㎍의 시판 플라스미드 pUC-8(카탈로그 번호 4916, P-L바이오 케미칼제, 미합중국)를
으로 분해하고, 페놀로 추출한 후, 클로로포름으로 더 추출하고 에탄올 침전시켜 벡타를 수득한다.
수득된 벡타 0.5㎍을 T4DNA 리가아제를 사용하여 그의 양끝에
부위를 가지며, TNF를 코오딩하는 약 670bp를 함유한 상기의 단편과 결찰시킨다. 문헌(4) 20페이지에 기재된 방법에 따라, 상기에서 수득된 벡타를 사용하여 이. 콜리를 형질전환시키고, 1mM의 IPTG 및 0.004%(w/v)의 X-gal을 함유한 한천 배지에서 배양하여 약 200의 백색 군락을 수득한다. 이들 형질전환체중 100개로부터 플라스미드 DNA를 제조하고,
으로 분해한다.
그 결과, 15플라스미드가 목적하는
단편(약 670bp)을 함유하는 것이 발견된다. 삽입 방향을 시험하기 위해, 상기의 15플라스미드를 그의 pUC-8에 단 하나의 인지부위를 갖는
및 그의 670염기쌍 단편 부분에 단 하나의 인지 부위를 갖는
로 분해하고, 6중량% 폴리아크릴아미드겔에 전기영동한다. 그 결과, 7플라스미드가 약 140bp로 구성된 목적 단편을 가지며,
프로모터를 pUC-8에 전사하는 방향은 TNF를 코오딩한 올리고데옥시뉴클레오티드의 방향과 일치한다는 것이 결정된다.
이들 7플라스미드가 같은 서열을 가지며,
프로모터, 합성 DNA 및 cDNA사이의 교차점에 목적 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 것이 DNA 서열분석에 의해 나타난다.
프로모터로
UV5를 사용하여 TNF를 이. 콜리에 직접 형질 발현하기 위해 재조합 플라스미드 pR17를 사용하여 플라스미드를 더 형성한다. 그 방법은 제3도에 상세히 나타낸다. 먼저, 10㎍의 플라스미드 pR17을 10단위의
(베데스다 연구실험실, 미합중국)으로 37℃에서 2시간동안 분해하고, 4중량%의 폴리아크릴 아미드겔에 전기영동하여 약 630bp로 구성된 단편을 분리한다. 약 1㎍의 단편을 전기 용출에 의해 겔로부터 분리한다. 단계 8과 같은 방법에 의해, 제3도에 나타낸 두 올리고데옥시뉴클레오티드, 즉 5'-AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3' 및 5'-CGAGAAGCTGACATG-3'을 합성한다.
두 올리고데옥시뉴클레오티드(약 100피코몰)의 각 5'말단을 문헌(3) 122페이지에 기재된 방법에 따라 T4폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 포스포릴화한다. 반응 완결후, 반응 혼합물을 페놀로 추출하고, 클로로포롬으로 더 추출한다. 합성 올리고머를 플라스미드 pR17로부터 제조된
단편(약 630bp) 0.5㎍과 혼합하고, 에탄올 침전시킨다. 문헌(1) 37페이지에 기재된 방법에 따라 10단위의 T4리가아제를 사용하여 단편을 합성 올리고머와 함께 4℃에서 밤새 결찰시킨다. 반응 완결후, 반응 혼합물을 에탄올 침전시키고, 20단위의
으로 37℃에서 3시간 분해한 다음, 4중량%의 폴리아크릴 아미드겔에 전기영동하고 전기용출에 의해 단편(약 670bp)을 회수한다.
에프 풀러 "유전자"[F. Fuller, "Gene"
, pp 42∼54(1982)]에 기재된 방법에 따라, 플라스미드 pOP95-15를 제조한다.
1㎍의 pOP95-15를
으로 분해하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후, 에탄올 침전시켜 벡타를 수득한다. 0.5㎍의 상기 수득된 벡타를 합성 올리고뉴클레오티드와 TNF를 코오딩한 올리고뉴클레오티드를 결찰함으로써 수득된 단편(약 670bp)과 함께 T4DNA 리가아제를 사용하여 결찰시킨다. 문헌(4) 20페이지에 기재된 방법에 따라, 상기에서 수득된 벡타를 사용하여 이. 콜리 JM101(ATCC33876)를 형질 전환시키고, 1mM의 IPTG 및 0.004%(w/v)의 X-gal을 함유한 배지에 배양하여 약 150백색 군락을 수득한다. 이들 군락중 100개로부터 플라스미드 DNA를 제조하고,
을 분해시킨다. 그 결과, 12플라스미드가 목적
단편(약 670bp)을 함유하는 것이 발견된다. 삽입방향을 시험하기 위해 약 12플라스미드를
및
으로 분해하고, 1.5중량%의 아가로즈겔에 전기영동한다. 그 결과, 4플라스미드가 목적하는 단편(약 1280bp 및 약 2600bp)을 가지며,
UV5프로모터의 전사방향이 TNF를 코오딩하는 올리고데옥시뉴클레오티드의 것과 일치한다는 것이 발견된다.
이들 4플라스미드가 같은 서열을 가지며,
UV5프로모터, 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 및 cDNA가 서로 적당히 결합된다는 것이 염기 서열 분석에 의해 나타난다. 수득된 플라스미드는 pTNF-lac Uv5-1으로 정의한다.
[단계 12]
[이. 콜리에 의해 제조된 TNF의 정제]
단계 11에서 수득된 플라스미드를 함유한 이. 콜리 균주를 앰피실린을 함유한 LB 배지 50㎖에 37℃에서 밤새 배양한다. 균주를 100㎍/㎖의 앰피실린을 함유한 LB 배지 5ℓ에 옮기고, 37℃에서 3시간 더 배양한다. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(시그마케미칼제, 미합중국)을 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 한다. 6시간동안 더 배양하고 냉각시킨다. 균주를 원심분리에 의해 수거한다. 단계 11과 같은 방법으로, 균주를 5ℓ의 0.04M 트리스-HCl완충용액(pH7.8)이 가하고, 초음파 분쇄하여 균주단백질 용액을 수득한다. 수득된 용액은 L세포에 대해 5×107단위/ℓ의 세포 독소 활성을 갖는다.
수득된 용액을 참고예 2의 단계 2와 같은 방법으로 정제하여 1.2×106단위의 TNF를 수득한다. TNF의 비활성은 6.8×107단위/㎎이다.
[단계 13]
[생쥐에 이식된 메스 A 육종을 사용한 평가]
2×105메스 A 육종세포를 BALB/c 생쥐의 복부에 피부 이식하고, 7일후, 직경이 7∼8㎜인 종양이 있으며 자발적 중앙괴사가 없는 생쥐를 평가용으로 선택한다. 참고예 3의 단계 12에서 수득되어 생리식염수로 희석된 TNF의 시료(0.2㎖)를 꼬리 정맥을 통해 주사한다. 24시간후에 하기의 기준에 따라 시료의 활성을 평가한다.
(-) : 변화 없음.
(+) : 약한 출혈성 괴사.
(++) : 중간 정도의 출혈성 괴사(종양 표면의 약 50%이상 확장된 중앙 괴사).
(+++) : 현저한 출혈성 괴사(종양 주변을 따라 작은 생존 가장자리가 있는 대량 괴사).
시료의 주사후 20일 되었을때, 종양의 퇴화정도를 관찰하고, 하기의 방정식에 따라 회복율을 측정한다.
결과는 표 3에 나타낸다.
[표 3]
[실시예 1]
[단계 1]
[pR18, pB2-7 및 pB2-2플라스미드에 의한 이. 콜리 K12균주 MC1061의 형질전환]
이. 콜리 K12균주 MC1061의 군락을 통상의 방법에 따라 참고예 3에서 수득된 pR18, pB2-7 및 pB2-2플라스미드로 각각 형질전환시킨다. 특히, 이. 콜리 K12균주 MC1061의 군락을 배양 브로스의 광학밀도가 550㎚에서 0.3이 될때까지 LB배지에서 배양한다. 성장된 이. 콜리 배양액 50㎖를 수거하여 10mM MOPS(pH7.0) 및 10mM RbCl을 함유한 25㎖ 혼합물로 세척하고, 0.1M MOPs(PH6.5), 50mM CaCl2및 10mM RbCl을 함유한 25㎖ 혼합물에 현탁시킨다. 생성 현탁액을 30분간 빙냉키고, 원심분리한 후, 0.1M MOPS(pH6.5), 50mM CaCl2및 10mM RbCl을 함유한 상술한 혼합물 2㎖ 및 DMSO 30㎕의 혼합물에 현탁시킨다. 생성 현탁액의 200㎕ 분액에 플라스미드 DNA용액 각 10㎕를 따로 가한다. 생성혼합물 각각을 30분간 빙냉하고, 44℃에서 60초간 열충격을 준다. 그후 즉시, 37℃에서 미리 예열된 5㎖의 LB배지를 각 가열 혼합물에 가하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 수득된 배양 브로스를 각각 원심분리하여 세포 펠릿을 형성한다. 상층액을 제거한 후, LB 배지를 가하고 교반하여 각 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 생성 현탁액 각각을 30㎍/㎖ 테트라시클린을 함유한 LB한천 플레이트에 접종시키고, 37℃에서 밤새 배양한다.
그 결과, pR18, pB2-7 및 pB2-2 플라스미드에 의해 각각 형질전환된 테트라시클린 내성 형질 전환체의 군락이 수득된다.
[단계 2]
[pB2-7 및 pR18 플라스미드 DNA의 제조]
단계 1에서 수득된 pB2-7 및 pR18플라스미드에 의해 각각 형질전환된 형질전환체 각각을 (1) 형질전환체의 성장 및 플라스미드의 증식, (2) 형질전환체의 수거 및 용해; 및 (3) 플라스미드 DNA의 정제를 수행한다(미합중국 콜드스프링하버 실험실에서 출판된 티. 마니아티스, 이. 에프, 프리치 및 제이. 샘브룩의 "분자 클로닝" 88∼96페이지에 기재된 방법).
상세하게 설명하면, 각 형질전환체를 3㎍/㎖ 테트라시클린을 함유한 LB 배지에 접종하고, 세게 진탕하면서 37℃에서 배양한다. 이 단계를 반복하여 형질전환체를 성장시키고 플라스미드를 증식시킨다. 형질전환체 배양액을 4000g 및 4℃에서 10분간 원심분리하여 수거한다. 상층액은 버린다. 생성 펠릿을 100㎖의 빙냉 STE[0.1M NaCl, 10mM 트리스·Cl(pH7.8) 및 1mM EDTA]에 세척하고, 20㎎/㎖ 리소짐-10mM 트리스·Cl, pH8.0의 용액에서 비등시킴으로써 용해시킨다.
점성 생성물을 초원심분리 튜브에 옮기고 25000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 DNA용액을 수득한다. DNA용액의 부피를 측정한다. 매 1㎖마다 정확히 1g의 고체염화 세슘을 가하고, 염이 전부 용해될때까지 천천히 혼합한다. 염화 세슘용액 10㎖마다 0.8㎖의 브롬화 에티듐(10g/㎖, H2O)을 가한다. 용액의 최종 밀도는 1.55g/㎖이고, 브롬화 에티듐을 농축하면 약 600㎍/㎖이다. 염화세슘 용액을 원심분리용 튜브에 옮기고, 튜브의 나머지 부분을 경파라핀유로 채운다.
45,000rpm으로 20℃에서 36시간동안 원심분리하여 두 밴드의 DNA, 즉 선상 박테리아 DNA 및 니크 완상 플라스미드 DNA로 구성된 상부 밴드 및 닫힌 환상 플라스미드 DNA로 구성된 하부 밴드를 수득한다. 하부 밴드의 DNA를 튜브의 측면에 삽입된 피하주사기를 통해 유리튜브에 수거한다. 브롬화 에티듐을 제거하고, 수상을 TAE에 투석시킨다. 플라스미드 DNA 용액을 RN아제로 처리하고, 등량의 평형 페놀로 추출한다. TAE(pH8.0) 및 0.1% SDS로 평형된 바이오-겔 A-150의 컬럼에 수상을 층층이 넣는다. 컬럼의 DNA를 세척하고, 0.1% SDS로 TE를 처리하여 분획을 수거한다. 분획을 에탄올 침전시켜 순수한 플라스미드 DNA를 수득한다.
상기 방법을 수행함으로써, 250㎍의 순수 pB2-7 플라스미드 DNA 및 134㎍의 순수 pR18 플라스미드 DNA가 수득된다.
[단계 3]
[순수 pB2-7 및 pR18 플라스미드 DNA의 니크번역]
단계 2에서 수득된 순수 pB2-7 플라스미드 DNA로부터 40㎍을 취하여
제한 효소로 분해하고, 4% 아크릴아미드겔에 전기영동한다. 전기영동후, DNA를 염색하고, 목적하는 밴드를 절단하여
삽입물을 분리한다.
분리된
삽입물 500ng을 사용하여 티. 매니아티스등 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 72, 1184(1975)]에 따라 니크 번역을 수행한다. 니크 번역을 위해, 베데스다 연구실험실(미합중국)제의 니크 번역키트를 사용하며, 80피코몰의 방사성 dCTP를 25㎕ 반응계(400Ci/밀리몰)에 넣는다. 2.5㎕ 용액 A(dNTP의 용액), 2.5㎕ 용액 B(500ng의 시험 DNA viz,
삽입물), 5㎕ 뜨거운 dCTP(3200Ci/밀리몰), 1.3㎕ 냉 dCTP(65피코몰, 50피코몰/㎕ dCTP) 및 11.2㎕ 용액 E(H2O)으로 구성된 총 22.5㎕의 혼합물에 2.5㎕의 용액 C(DN아제 I, DNA 폴리머라제 I)를 가하고, 15℃에서 60분간 반응시킨다. 용액 D(스톱 완충액)를 반응생성물에 가하여 반응을 중단시킨다. 운반자 tRNA를 가하고, 두번 에탄올 침전시킨후, 500㎕의 물에 용해시킨다. 1㎍ DNA당의 비활성은 9.3×107cpm이다.
단계 2에서 수득된 순수 pR18 플라스미드 DNA에 대해 상술한 방법을 수행하여 니크 번역을 한다. 1㎍ DNA당의 비활성은 7×107cpm이다.
[단계 4]
[pR18 플라스미드 DNA의
삽입 단편의 제조]
80㎍의 pR18 플라스미드 DNA를
제한효소로 분해하고, 4% 폴리아크릴아미드겔에 전기영동한다.
하기의 목적하는 삽입물의 밴드를 절단하고, BND 컬럼에 의해 정제한다 :
약 640bp 3.77㎍(회수율 52%)
약 175bp 1.77㎍(회수율 50%)
상기의 약 640bp 삽입물을 pR18의 3'-단편(pR18의 3'-비번역 부분)으로 정의하고, 상기의 약 175bp 삽입물을 pR18-cfr(pR18의 코오딩 부분)으로 정의한다.
또한,
제한효소 대신
제한효소를 사용하여 상기의 방법을 반복하여 하기의 밴드를 수득한다.
약 450bP 3.65㎍(회수율 60%)
상기의 삽입물은 pR18의 5'-단편으로 정의한다.
[단계 5]
[인체 게노믹 TNF 유전자의 분리]
실시예 1의 단계 3에서 수득된32p-표지 플라스미드 pB2-7 삽입물을 혼성화 탐침으로 사용하여, 인체 DNA를 부분 분해하여 생성된 크기 단편[매니아티스 등 "세포" 15, 687(1978)]을 샤론 4A
결찰 부위[블래트너등 "사이언스" 196, 161(1977)]에 삽입함으로써 제조된 박테리오 파지 샤론 4A/인체 게노믹 라이브러리의 106플라크를 스크린한다. 벤톤과 데이비스의 클라크 혼성화 방법[Benton and Davis, "Science", 196, 180(1977)]을 사용한다. 출발 배양액중의 박테리오 파지가 전부 인체 TNF를 제조하기 위해 필요한 유전물질을 함유하지는 않기 때문에, 토끼 TNF 유전자에 상보적인 염기 서열을 갖는 탐침을 사용한다. 목적하는 유전물질을 갖는 파지 플라크의 DNA를 방사성 탐침과 배합하고, 그의 방사능을 확인한다. 라이브러리로부터 9혼성화 플라크가 분리된다.
사용된 방법 및 조건은 하기와 같다.
1) 플라크의 수 :
∼1×106플라크(∼4×104플라크/ø150㎜플레이트×25).
2) 니트로셀룰로오즈 필터에 전이 :
[벤톤 및 데이비스, 사이언스, 196, 180(1977)]
3) 혼성화 :
실시예 1의 단계 3에서 제조된 1.25×105cpm/㎖의 pB2-7 삽입 탐침을 42℃에서 19.5시간 동안 첨가.
4) 세척 :
2×SSC-0.1% SDS, 실온
침지 10분×4
침지 30분×2.
5) 노출 :
XAR-5(이스트맨 코닥사, 미합중국)
-80℃, 2강한 스크린, 39시간
상기 스크린에서, 12후보 균주를 수득한다. 상술한 방법으로 제2스크린을 수행하여 목적하는 단편을 함유한 9균주를 수득한다. 이들 균주를 사용하여 상술한 방법으로 제3스크린을 수행하여 목적하는 단편을 함유한 9균주를 수득한다. 수득된 균주를 사용하여 제4스크린을 수행하여 9균주가 목적하는 단편을 함유한다는 것을 확인한다. 목적하는 단편을 함유한 9박테리오 파지를 각각 HG-1∼HG-9로 정의한다.
[단계 6]
[토끼 게노믹 TNF 유전자의 분리]
분해된 인체 DNA 대신에 분해된 토끼 DNA[Maniatis et al, Cell, 15, 687(1978)]를 사용하여 제조된 106플라크의 박테리오 파지 샤론 4A/토끼 게노믹 라이브러리를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 단계 5와 같은 방법을 반복한다. 106플라크의 박테리오 파지 샤론 4A/인체 게노믹 라이브러리 대신에 6.7×105플라크의 박테리오 파지 샤론 4A/토끼 게노믹 라이브러리를 사용한다. 따라서, 토끼 게노믹 TNF 유전자를 함유하는 2박테리오파지 균주(RG-1 및 RG-2)를 수득한다.
[단계 7]
[인체 클론의 서던 블로팅 분석]
실시예 1의 단계 5에서 수득된 박테리오파지 HG-3, HG-6 및 HG-7을 사용하여 하기의 방법에 따라 각 박테리오 파지의 DNA를 수득한다.
6×1010세포의
LE 392(숙주세포)를 180㎖의 SM에 현탁시키고, 3×109PFU의 박테리오 파지 HG-3을 가한 후,
를 37℃에서 20분간 감염시킨다. 수득된 혼합물을 3ℓ의 NZ-브로스에 가하고, 37℃에서 23시간동안 진탕 배양한다. 60㎖의 CHCl3를 혼합물에 가하고, 30분간 더 진탕 배양한다. 최종농도가 1M이 되도록 NaCl를 혼합물에 가하여 15분간 방치하고, 원심분리하여 상층액을 수득한다. 폴리에틸렌글리콜의 농도가 10%(w/v)가 되도록 폴리에틸렌글리콜(분자량 : 약 6000)을 혼합물에 가하고, 4℃에서 22시간동안 방치한다. 원심분리에 의해 박테리오 파지를 수거한다. 수득된 박테리오 파지를 28㎖의 SM에 현탁시키고, 동 부피의 CHCl3을 가한다. 교반기에서 30초간 교반한 후, 혼합물을 원심분리하여 수상을 수득한다. SM을 수상에 가하여 총량이 30㎖가 되게 한다. 26.4g의 CsCl을 수득된 혼합물에 가하여 천천히 용해시킨 후, 초원심분리(45000rpm, 20시간)하여, 밴드 형태의 박테리오 파지를 수득한다. 수득된 박테리오 파지-함유 혼합물을 10mM NaCl-50mM 트리스(pH 8)-10mM MgCl2에 투석시킨다. EDTA, 프로테이나제 K 및 SDS를 혼합물에 가하여 그의 농도가 각각 20mM, 50㎍/㎖ 및 0.5%(w/v)가 되게 한다. 혼합물을 65℃에서 1시간 처리하고, 페놀로, 페놀 및 CHCl3의 1 : 1부피 혼합물로 및 CHCl3로 추출한다. 수득된 수상을 10mM 트리스(pH 8)-1mM EDTA에 투석시킨다. 수득된 수상의 자외선 흡수 스펙트럼은 박테리오 파지 HG-3의 순수 DNA가 수득된다는 것을 나타낸다.
박테리오 파지 HG-3의 DNA의 제조와 같은 방법을 반복하여 박테리오 파지 HG-6 및 HG-7의 DNA를 수득한다.
따라서, 292㎍의 HG-3, 1100㎍의 HG-6 및 819㎍의 HG-7이 수득된다.
서던 방법[E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503(1985)]에 따라, 수득된 DNA의 서던 블로팅 분석을 수행한다.
방법 및 조건은 하기와 같다.
1) DNA :
HG-3 825ng 각각
HG-6 935ng 각각
HG-7 685ng 각각
2) 각종 제한 효소 분해 :
10단위
, 10단위
,
10단위
+10단위
,
10단위
10단위
+10단위
10단위
37℃, 3시간
3) 전기영동 :
0.8% 아가로즈겔
TAE
28V, 15.5시간
4) 니트로셀룰로오즈 필터에 전이
[E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503(1975)]
5) 전-혼성화 :
30㎖ FDSS
42℃, 6시간
6) 혼성화
pR18의 5'-단편(1×105cpm/㎖)
(실시예 1의 단계 4에서 제조)
42℃, 14시간
7) 세척 :
2×SSC-0.1% SDS, 실온
8) 노출 :
XAR-5(이스트맥 코닥사, 미합중국)
-80℃, 2강한 스크린, 14시간
혼성화의 결과는 표 4에 나타낸다.
[표 4]
주 : "←"는 같은 단편이 혼성화되는 것을 의미한다.
[단계 8]
[토끼 클론의 서던 블로팅 분석]
박테리오 파지 HG-3, HG-6 및 HG-7 대신에 박테리오 파지 RG-1 및 RG-2를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 단계 7과 같은 방법을 반복하여 서던 블로팅 분석을 수행한다. 그 결과, pR18 5'-단편이 RG-1 및 RG-2를
,
,
,
및
으로 절단함으로써 수득된 단일 밴드 단편과 혼성화되었다는 것이 발견된다.
[단계 9]
[인체 게노믹 TNF 유전자를 함유하는 박테리아 클론의 형성]
랜디등의 방법[Biochemistry, vol, 13, 2134(1974)]을 이용하여, 상기 단계 5에서 수득된 HG-3의 DNA를 수득한다. 생성된 HG-3 DNA 33㎍을 80단위의
37℃에서 3시간 분해한다. 분해물을 1% 저융점 아가로즈겔(조건 : 1×TAE, 20V, 14.5시간)에 전기영동한다. 티. 매니아티스에 기재된 바와 같이 아가로즈겔로부터 2.9kb 밴드를 분리한다[분자 클로닝. 콜드스프링 하버실험실, p377(1982)]. 특별하게는, 2.9kb 밴드 부분의 절단된 겔을 65℃에서 15분간 가열한다. 2.9kb 길이의
-절단 HG-3, 단편(이후 "HG-3/
2.9kb 단편"이라 약칭함)을 페놀로 3번 및 또 다른 추출용매로 3번 추출함으로써 용융된 겔로부터 회수하고, 암모늄 아세테이트를 함유한 에탄올로 침전시킨다. 따라서, 637ng(수율 : 약 30%)의 HG-3/
2.9kb 단편을 수득한다.
상기에서 수득된 단편 255ng을 2.5단위의 T4리가아제를 사용하여 4℃에서 20시간 동안 56.5ng의
-절단 pUC 13[J. Messing, Methods in Enzymology, Vol, 101, 20(1983)]에 결찰시킨다.
상술한 결찰 생성물을 사용하여,
K 12 균주 JM 83을 형질전환시킨다. 특별하게는, 배양 브로스의 광학밀도가 550㎚에서 0.3이 될때까지
K12 균주 JM 83을 LB 배지에서 배양한다. 50㎖의 성장된
K12 균주 JM 83 배양액을 수거하여 25㎖의 10mM MOPS(pH 7.0)-10mM RbCl로 세척하고, 25㎖의 0.1M MOPS(pH 6.5)-50mM CaCl2-10mM RbCl에 재현탁시킨다. 현탁액을 30분간 빙냉시키고, 원심분리한 후, 2㎖의 0.1M MOPS(pH 6.5)-50mM CaCl2-10mM RbCl 및 30㎕의 DMSO의 혼합물에 재현탁시킨다.
203㎕의 현탁액에 10ng의 결찰 생성물을 함유한 10㎕의 결찰 생성물 수용액을 가한다. 혼합물을 30분간 빙냉시킨 후, 40℃에서 60초간 가열한다. 그후 즉시, 가열 혼합물에 37℃에서 예열된 LB 브로스 5㎖를 가하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 수득된 배양 브로스를 원심분리하고, 상층액을 제거한다. LB 배지를 생성된 세포 펠릿에 가하고, 30㎍/㎖ 앰피실린 및 40㎍/㎖ X-gal을 함유한 LB 플레이트에 접종시킨다. 삽입물을 갖는 플라스미드에 의해 형질전환된
K 12 균주 JM 83을 함유한 군락은 백색이며, 플라스미드 만으로 형질전환된 이. 콜리 K12 균주 JM 83을 함유한 군락은 청색이다. 수득된 백색 군락을 30㎍/㎖ 앰피실린 및 40㎍/㎖ X-gal을 함유한 플레이트에 확인을 위해 다시 접종시킨다.
상기에서 수득된 백색 군락으로부터 10군락(박테리아 클론)을 선택하고 미니-프레프 기술을 사용하여 스크린 한다.
특별하게는, 각 군락을 30㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 LB 배지에서 밤새 배양한다. 성장된 세포를 수거하여 2㎎/㎖ 리소짐-50mM 글루코즈-10mM EDTA-25mM 트리스 HCl(pH 8.0)을 함유한 용액에 현탁시킨다. 현탁액을 실온에서 5분간 방치하고, 200㎕의 0.2N NaOH-1% SDS를 가한다. 천천히 교반한후, 현탁액을 실온에서 2분간 방치한다. 그후, 150㎕의 3M 소듐 아세테이트(pH 5.2)를 가하고, -20℃에서 10분간 방치한 다음, 15분간 원심 분리하여 생성된 상층액을 회수한다. 상층액에 900㎖의 냉 에탄올을가하고, 5분간 원심분리하여 생성된 침전물을 수득한다. 수득된 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, 건조시켜 플라스미드 DNA를 얻는다. 상술한 방법에서, 10 플라스미드 DNA를 수득한다.
각 플라스미드 DNA를 10mM 트리스-0.1mM EDTA(pH 8.0)에 용해시키고,
으로 분해한 후, 제한 분석을 위해 전기영동한다. 분해 및 전기영동 조건은 하기와 같다.
분해 : 플라스미드 DNA 용액, 상기에서 제조된 양의
1/5 ;
, 3단위 ;
37℃ ; 1.5시간
전기영동 : 1% 아가로즈겔; 1×TAE; 120V; 2시간.
상기의 제한분석은 10클론중 8이 양성이라는 것을 나타낸다. 즉, 8클론은 2.9kb 단편을 갖는다. 8 양성 클론으로부터 1군락을 선택하고,
K12 균주 JM 83(pHGE)(ATCC 39656)으로 정의한다.
pB2-7 및 pR18을 갖는
대신에 이. 콜리 K 12 균주 JM 83(pHGE)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 2와 같은 방법을 반복하여 1.89㎎의 pHGE DNA를 제조한다.
[단계 10]
[
-절단 RG-1의 서브 클로닝]
상기 단계 6에서 제조된 30㎍의 RG-1을
으로 분해시킨다. 상기에서 제조된 단편 혼합물 및 0.8% 저융점 아가로즈겔을 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 9와 실제로 같은 방법에 의해, 생성 단편 혼합물로부터 약 3.5kb 길이의 단편을 회수한다. 1.0㎍의
-절단 RG-1 단편(약 3.5kb)을 수득한다.
-절단 HG-3 단편(2.9kb) 대신에 상기에서 수득된
-절단 단편(3.5kb)을 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 9와 같은 방법에 의해, 상기에서 수득된
-절단 RG-1 단편(3.5kb)을 EcoRⅠ-분해 pUC 13에 결찰시킨다. 상기에서 수득된 결찰 생성물을 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 9와 같은 방법에 의해
K12 균주 JM 83의 형질전환, 박테리아 클론의 스크린, 클론의 분해 및 전기영동을 수행한다. 수득된 클론은
K 12 균주 JM 83(pRGE)(ATCC 39655)로 정의한다.
pB2-7 및 pR18 대신에 이. 콜리 K12 균주 JM 83(pRGE)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 2와 같은 방법을 반복하여 1.70mg의 pRGE DNA를 제조한다.
[단계 11]
[pHGE 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석]
상기 단계 9에서 수득된 pHGE DNA의 제한 효소 분석을 매니아티스의 방법[분자 클로닝, 콜드스프링 하버 실험실, 98(1982)]에 따라 수행한다.
사용된 방법 및 조건은 다음과 같다.
1)
에 의한 pHGE DNA 분해
18.6㎍ pHGE DNA
64단위
37℃, 2시간
2) 에탄올 침전 : 침전
3) 침전물에 증류수의 첨가 : 1㎍/㎕
-절단 pHGE 용액의 제조
4) 각층 제한 효소로 분해 :
1㎍ pHGE/
제한 효소 : 5단위
, 5단위
4단dnl
, 3단위
, 9단위
37℃, 2시간
5) 전기영동 :
2% 아가로즈겔, 1×TAE,
28V, 14.5시간
6) 니트로셀룰로오즈 필터에 전이 :
[E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98 503(1975)]
7) 제1전-혼성화
30㎖ FDSS
42℃, 6시간
8) 제1혼성화 :
pR18의 5'-단편(5×104cpm/㎖)(상기 단계 4에서 제조)
42℃, 14시간
9) 세척 :
2×SSC-0.1% SDS 실온
침지 30분×2
10) 노출
XAR-5(이스트맨 코닥사, 미합중국)
-80℃, 2강한 스크린, 17.5시간
11) 세척 제거 :
0.5M NaOH-1.5M NaCl(침지 : 1분)
12) 노출 : 노출시간이 19시간인 것을 제외하고는 상기 10)과 같은 방법.
13) 제2전-혼성화 : 상기 7)과 같은 방법.
14) 제2혼성화 :
pB2-7 삽입물(상기 단계 3에서 제조)
42℃, 16.5시간
15) 세척 : 상기 9)와 같은 방법.
16) 노출 : 노출시간은 19.5시간인 것을 제외하고는 상기 10)과 같은 방법.
17) 세척 제거 : 상기 11)과 같은 방법.
18) 노출 : 노출시간이 20시간인 것을 제외하고는 상기 10)과 같은 방법.
19) 제3전-혼성화 : 상기 7)과 같은 방법.
20) 제3혼성화 :
pR18의 3'-단편(4.5×105cpm/㎖)
(상기 단계 4에서 제조), 42℃, 15시간
21) 세척 : 상기 9)와 같은 방법.
22) 노출 : 상기 10)과 같은 방법.
제한 효소 분석의 결과는 제4도에 나타낸다.
[단계 12]
[pRGE 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석]
pHGE 플라스미드 DNA 대신 pRGE 플라스미드 DNA를 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 11과 같은 방법에 의해, 상기 단계 10에서 제조된 pRGE 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석을 수행한다. 수득된 pRGE DNA 삽입물의 제한지도는 제5도에 나타낸다.
[단계 13]
[토끼 TNF 유전자 및 인체 TNF 유전자의 염기 서열 결정]
pB2-7을 갖는
K12 균주 MC 1061 및 pR18을 갖는 이. 콜리 K12 균주 MC 1061대신에 상기 단계 9에서 수득된
K12 균주 JM 83(pHGE) 및 상기 단계 10에서 수득된
K 12 균주 JM 83(pRGE)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 2와 같은 방법을 반복한다. 따라서, 각각 150㎍의 pRGE 플라스미드 DNA 및 pHGE 플라스미드 DNA를 수득한다.
pRGE 및 pHGE의 염기 서열을 막삼--길버트 방법에 따라 결정한다[Maxam et al, Methods in Enzymology, Vol. 55, 490(1980), Academic press].
참고예 3에서 결정된 pR-18의 염기서열을 상기에서 결정된 pRGE의 염기 서열과 비교하여 엑손 및 인트론을 포함한 토끼 TNF 유전자의 구조를 밝혀낸다. pRGE DNA 삽입물의 구조는 제5도에 나타낸다. 계속해서, pRGE의 염기 서열을 pHGE의 염기 서열과 비교하여 인트론과 엑손사이의 경계주위의 유사성 및 일치성을 연구한다. 따라서, 엑손 및 인트론을 포함한 인체 TNF 유전자의 구조를 밝혀낸다. 인체 TNF 유전자의 구조는 제4도에 나타낸다.
상기에서 얻어진 토끼 TNF 및 인체 TNF를 코오딩하는 염기 서열은 하기에 나타낸다. 이 염기 서열에서 윗줄은 토끼 TNF를 코오딩하는 염기서열(R)이고, 아랫줄은 인체 TNF를 코오딩하는 염기 서열(H)이다.
주 : "...."기호는 토끼 TNF를 코오딩하는 DNA 염기서열중 이 부분이 존재하지 않아서 이 기호의 양측에 인접한 두 코오돈이 직접 연결된 것을 의미한다.
[단계 14]
[올리고데옥시뉴클레오티드의 합성]
각 끝에 스테인레스스틸 필터가 달린 스테인레스스틸 500㎕ 반응 용기에 뉴클레오시드(2.0μM)가 숙시네이트 결합을 통해 연결된 폴리스티렌수지 20㎎을 가한다. 수지를 디클로로메탄 이소프로판올(85 : 15)에 녹인 브롬화아연(1M)으로 처리하여 디메톡시트리틸(DMT) 보호기를 제거하고, 디메틸포름아미드, 피리딘 및 아세토니트릴로 세척한 후, 질소기류하에 건조시킨다. 200㎕ 피리딘에 용해시킨 DMT-뉴클레오티드(20μM) 및 메시틸렌술포닐니트로트리아졸(60μM)의 용액을 건조된 수지에 가한다. 결합 반응을 45℃에서 20분간 진행한다. 이와 같은 탈보호 및 결합반응을 목적하는 올리고데옥시뉴클레오티드가 수지에 모일때까지 뉴클레오티드에 대해 반복한다. 수지를 처리하여 그로부터 올리고데옥시뉴클레오티드를 제거하고, 이또오, 이께, 이꾸다 및 이따구라의 방법[Nuc. Ac. Res, 10 : 1755(1982)]에 의해 정제한다.
따라서, 하기의 올리고데옥시뉴클레오티드가 수득된다.
[단계 15]
[TNF를 위한 인체 미니유전자를 함유한 M13mp9-HGE의 형성]
플라스미드 pHGE(10㎍)를
(20단위)으로 분해한다. 1% 저융점 아가로즈겔에 전기영동한 후, 2.9kb 단편을 용출시킨다. 이 단편을 M13mp9 파지의 복제형으로부터의
단편에 삽입한다. M12mp9 파지는 DNA의 단편을 주기에 특히 적당하기 때문에 선택된다. 생성물을
JM 103에 형질이전시킨다[BRL(베데스다 연구실험실, 미합중국) User Manual/M13mp7 Cloning/'Dideoxy'sequencing, 1980]. 생성물을 M13mp9-HGE로 정의한다.
[단계 16]
[M13mp9-HGE 단일가닥 DNA 및 딜리터(Deleter E3-4)를 사용한 인트론 3의 삭제]
M13mp9-HGE의 단일가닥 DNA를 BRL User Manual/M13mp7 cloning/'Dideoxy'Sequencing, 1980의 방법에 의해 제조한다.
단계 14에서 제조된 올리고데옥시뉴클레오티드 4)
를 인트론 3을 위한 딜리터로 사용한다. 인트론 3을 위한 딜리터는 "E3-4"로 정의한다.
딜리터 E3-4는 삭제된 인트론 3의 앞(엑숀 3) 및 뒤(엑숀 4)염기의 염기 서열에 상보적인 염기서열을 갖는다. 인트론 3의 삭제를 하기와 같은 웰레스 등의 보고(Science 209 : 1396(1980))에 따라 수행한다.
T4키나아제 및 ATP(3mM)를 사용하여 E3-4(164ng, 15피코몰)를 포스포릴화하고, 템플레이트 M13mp9-HGE(1.65㎍, 0.5피코몰)에 가한다. 반응 혼합물을 65℃에서 가열하고, 실온으로 5분간 냉각시킨후, 최종적으로 빙수에 냉각시킨다. dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 ATP(0.4mM)에 클레노(Klenow) 단편(5단위), Hin 완충액[Wallace 등, Nuc. Ac. Res, 9; 3647(1981)]에 녹인 T4리가아제(10단위), 10mM 트리스 HCl(pH 7.2), 2mM MgCl2및 1mM β-메르캅토 에탄올을 가한다. 반응 혼합물(최종 부피 50㎕)을 4℃에서 30분 및 실온에서 30분간 배양한다. 올리고뉴클레오티드 프라임의 반응으로부터의 DNA를 사용하여 BRL User ManuaL M13mp7 cloning/'Dideoxy'Sequencing, 1980의 방법에 따라
JM 103을 형질감염시킨다. 이 방법으로 수득된 플라크를 YT 플레이트에 찍어 넣는다[J. H. Miller, p.433, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory(1972)]. 수득된 군락을32p-표지 E3-4과 함께 55℃에서 2시간동안 혼성화한다. 이 단계에서, 딜리터를 탐침으로 사용하여 인트론이 삭제된 후의 상응하는 상보적 염기서열을 갖는 DNA의 서열을 확인한다. 딜리터로 혼성화된 군락으로부터 파지를 분리한다.
생성된 파지를 플레이트하고, 플라크를 YT 플레이트에 찍어 넣는다. 클론을32p-표지 E3-4와 함께 55℃에서 2시간동안 혼성화한다. 양성 클론을 수득하고, 파지 DNA를 서열화하여 인트론 3이 완전히 삭제된 파지를 선택한다. 이런 파지를 mp9-HGE △3-1로 정의한다.
[단계 17]
[pH TNF-lacUV5-2의 형성]
mpg-HGE △3-1의 복제형을
으로 분해한다.
단편을 분리하고,
-절단 pBR 327에 클로닝하여 플라스미드 pHGE △3-1를 수득한다. 플라스미드 pHGE △3-1을 사용하여 플라스미드를 형성함으로씨, 프로모터로
를 사용하여 TNF를
에 직접 형질발현시키는 플라스미드 △3-1을 수득한다. 이 방법은 제7도에 상세하게 나타낸다. 먼저, 10㎍의 플라스미드 pHGE △3-1을 10단위의
(베데스다 연구실험실, 미합중국)으로 37℃에서 2시간동안 분해하고, 4중량%의 폴리아크릴 아미드겔에 전기영동하여 단편을 분리한다. 전기용출에 의해 약 1㎍의 단편을 겔로부터 분리해낸다. 단계 14와 같은 방법으로, 제7도에 나타낸 두 올리고데옥시뉴클레오티드, 즉
를 합성한다. 두 올리고데옥시뉴클레오티드(약 100피코몰)의 각 5' 말단을 문헌(3) 122페이지에 기재된 방법에 따라 T4폴리뉴클레오티드 키나아제를 시용하여 포스포릴화한다. 반응 완결후, 반응 혼합물을 페놀로 추출하고, 클로로포름으로 더 추출한다. 이렇게 수득된 합성 올리고머를 플라스미드 pHGE △3-1로부터 미리 수득된
단편 0.5㎍과 혼합하고, 에탄올 침전시킨다. 이들 단편을 문헌(1) 37페이지에 기재된 방법에 따라 10단위의 T4리가아제를 사용하여 4℃에서 밤새 결찰시킨다. 반응 완결후, 혼합물을 에탄올 침전시키고, 4중량% 폴리아크릴아미드겔에 전기영동하여 전기용출시킴으로써 단편을 회수한다.
에프. 풀러의 방법[F. Fuller, "Gene" 19, pp42-54(1982)]에 따라 플라스미드 pOP 95-15를 제조한다.
1㎍의 pOP 95-15를
으로 분해하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후, 에탄올 침전시켜 벡타를 수득한다. T4DNA 리가아제를 사용하여, 0.5㎍의 수득된 벡타를 상기에서 수득된 단편과 결찰시킨다. 문헌(4) 20페이지에 기재된 방법에 따라, 상기에서 수득된 벡타를 사용하여
JM 101(ATCC 33876)을 형질전환시키고, 1mM의 IPTG 및 0.004w/v% x-gal을 함유한 한천 배지에서 배양하여 약 100 백색 군락을 수득한다.
이들 형질 전환체로부터 플라스미드 DNA를 제조하고,
으로 분해하여 이들 플라스미드가 목적하는
단편을 함유한다는 것을 확인한다. 삽입 방향을 검사하기 위해, 이들 플라스미드를
및
으로 분해하고, 1.5중량% 아가로즈겔에 전기 영동하여
프로모터의 전사 방향이 TNF를 코오딩하는 올리고데옥시뉴클레오티드의 방향과 일치하는 약 1280 염기쌍 및 약 2600 염기쌍의 단편을 함유한 플라스미드를 선택한다.
염기 서열 분석을 하면 이들 2플라스미드가 같은 염기 서열을 가지며,
프로모터, 합성된 올리고데옥시뉴클레오티드 및 DNA가 서로 적당히 결합되었다는 것이 나타난다. 수득된 플라스미드를 pHTNF-lacUV5-2로 정의한다.
pHTNF-lacUV5-2를 함유한
를 통상의 영양 배지에서 배양한다. 생성물의 TNF 활성을 바이오 어쎄이하면
프로모터 조절하에 토끼 TNF 유전자를 함유한 플라스미드 pTNF-lacUV5-1에 의해 수득된 것과 거의 같은 활성을 나타낸다.
[실시예 2]
실시예 1의 단계 1∼14에 기재된 방법에 의해 수득된 올리고데옥시뉴클레오티드 1∼4) 및 플라스미드 pHGE를 사용하여 제6도에 설명된 방법에 따라 pHTNF-lacUV5-1을 제조한다.
미생물 및 신규의 플라스미드는 플라스미드를 함유한 미생물 시료를 기탁함으로써 1984년 4월 6일에 미합중국 록빌 메릴란드의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 미생물
K-12 균주 JM 83(pRGE)의 ATCC 수탁번호는 39655이다. 미생물
K-12 균주 JM 83(pHGE)의 ATCC 수탁번호는 39656이다.
또한 상기의 미생물 이. 콜리 K-12 균주 JM 83(pRGE) 및 이. 콜리 K-12 균주 JM 83(pHGE)는 1985년 4월 24일에 한국종균협회(KFCC)에 각각 KFCC-10141 및 KFCC-10142로 기탁되어 있다.
상기에서 설명된 본 발명은 여러가지 방법으로 변화될 수 있다. 즉, 본 발명의 사상 및 범위에 어긋나지 않는한 변형될 수 있으며, 이런 변형은 하기의 특허청구의 범위내에서 명백해질 수 있다.
Claims (35)
- 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 염기서열을 함유한 데옥시리보헥산을 복제 가능한 형질 발현 운반자에 결찰시켜 상기의 데옥시리보헥산 및 상기의 복제 가능한 형질 발현 운반자를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 수득하고; (b) 상기 복제 가능한 재조합 DNA에 의해 미생물 또는 세포 배양액의 세포를 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성하고; (c) 미생물 또는 세포 배양액의 모세포로부터 상기 형질 전환체를 선택하고; (d) 형질 전환체가 상기 데옥시리보헥산을 형질 발현하도록 상기 형질 전환체를 배양하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 제조하고; 및 (e) 배양된 형질 전환체로부터 상기의 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 분리함을 특징으로 하는 TNF 활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법.
(상기 식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐 알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아로기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - (a) TNF 활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 이 DNA를 형질발현할수 있는 복제 가능한 형질발현 벡타에 결찰시켜 상기 DNA와 상기 복제 가능한 형질발현 운반자를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 수득하고; (b) 상기 복제 가능한 재조합 DNA에 의해 미생물 또는 세포 배양액의 세포를 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성하고; (c) 미생물 또는 세포 배양액의 모세포로부터 상기 형질전환체를 선택하고; (d) 형질 전환체가 상기 DNA를 형질발현하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 제조하도록 상기 형질 전환체를 배양하고, (e) 배양된 형질 전환체로부터 상기의 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 분리함을 특징으로 하는 TNF 활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 방법.
(상기 식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아로기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - 제2항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 제23항에 정의한 아미노산 서열을 갖는 플리펩티드의 유사 변이체에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 방법.
- 제2항에 있어서, DNA가 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기서열 및 이 염기서열에 상보적인 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 염기서열을 함유하 DNA인 방법
(상기 식중, A는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시티탈산잔기, 및 T는 티미밀산잔기를 나타내며, 일반식(Ⅱ)의 좌측말단 및 우측말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측을 나타낸다). - 제2항에 있어서, DNA가 유전 코오드의 변성에 따라 제24항에 정의한 DNA의 하나 이상의 염기 서열중 하나 이상의 염기를 치환함으로써 수득된 염기 서열을 함유하는 DNA인 방법.
- 제2항에 있어서, 형질전환체가 증식하고, 이어서 이 형질전환체가 상기 DNA를 형질발현하여 인체생리적 활성 폴리펩티드를 생산하도록 형질전환체를 배양하는 방법.
- (a) TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 제1DNA 및 펩티드를 코오딩하며, 상기 제1DNA의 5'-말단에 결찰된 제2DNA를 함유하는 DNA를, 이 DNA를 형질발현할 수 있는 복제 가능한 형질 발현 운반자에 결찰시켜 상기 DNA 및 상기 복제 가능한 형질발현 벡타를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 제조하고; (b) 상기 복제 가능한 재조합 DNA에 의해 미생물 또는 세포 배양액의 세포를 형질전환시켜 형질전환체를 형성하고; (c) 미생물 또는 세포배양액의 모세포로부터 상기 형질전환체를 선택하고; (d) 형질전환체가 상기 DNA를 형질발현하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드에 해당하는 하나 이상의 아미노산 서열부분을 가지며, 이 아미노산 서열 부분의 C-말단 아미노산이 폴리펩티드 생성물의 C-말단 아미노산과 일치하는 폴리펩티드 생성물을 제조하도록 상기 형질전환체를 배양하고; (e) 배양된 형질전환체로부더 상기의 폴리펩티드 생성물을 분리함을 특징으로 하는 TMF 활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 폴리펩티드 생성물이 인체 생리적 활성 폴리펩티드에 해당하는 아미노산 서열부분의 N-말단에 결합된 2DNA에서 유래된 펩티드에 해당하는 아미노산 서열 부분을 포함하며, 이 폴리펩티드 생성물을 화학적 또는 효소적으로 더 절단하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드 및 제2DNA에서 유래된 펩티드를 수득하고 제2DNA에서 유래된 펩티드로부터 생리적 활성 폴리펩디드를 분리함을 특징으로 하는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 방법.
(상기 식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser는 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - 제8항 또는 제9항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 제10항에 정의한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 유사 변이체에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 제1DNA가 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기 서열 및 이 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열을 함유한 DNA인 방법.
(상기 식중, A는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시티딜산잔기, 및 T는 티미밀산잔기를 나타내며, 일반식(Ⅱ)의 좌측 말단 및 우측말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측을 나타낸다). - 제8항 또는 제9항에 있어서, 제1DNA가 유전 코오드의 변형에 따라 제12항에 정의한 DNA의 하나이상의 염기 서열중 하나 이상의 염기를 치환함으로써 수득된 염기 서열을 함유하는 DNA인 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 제2DNA가 (ⅰ) 미생물로부터 유래되며 15∼40아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 갖는 시그날 펩티드를 코오딩하는 DNA; (ⅱ) 고등동물로부터 유래하며 15∼40아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 갖는 시그날 펩티드를 코오딩하는 DNA; (ⅲ) 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 제거된 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 중간체형의 나머지 부분에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코오딩하는 DNA로 구성된 군으로부터 선택된 DNA인 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 형질 전환체가 증식하고, 이어서 이 형질 전환체가 상기 DNA를 형질발현하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 생산하도록 형질 전환체를 배양하는 방법.
- (a) TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 제1DNA를, 지정된 펩티드를 코오딩하는 DNA를 함유하며 상기 1DNA 및 상기 지정된 펩티드를 코오딩하는 DNA를 형질발현할 수 있는 복제 가능한 형질 발현 운반자에 결찰시켜 복제 가능한 재조합 DNA를 수득하고; (b) 상기 복제 가능한 재조합 DNA에 의해 미생물 또는 세포 배양액의 세포를 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성하고; (c) 미생물 또는 세포 배의 모세포로부터 상기 형질전환체를 선택하고; (d) 형질 전환체가 상기 제1DNA 및 상기 지정된 펩티드를 코오딩하는 DNA를 발현하여 상기 인체 생리적 활성 폴리펩티드 및 상기 지정된 펩티드를 함유하는 융합 펩티드를 생산하도록 상기 형질 전환체를 배양하고; (e) 배양된 형질 전환체로부터 상기의 융합 펩티드를 분리함을 특징으로 하는 TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 상기의 융합 펩티드를 화학적 또는 효소적으로 더 절단하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드 및 지정된 펩티드를 수득하고, 지정된 펩티드로부터 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 분리함을 특징으로 하는 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산서열을 갖는 방법.
(상기 식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - 제16항 또는 제17항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 제18항에 정의한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 유사 변이체에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 제1DNA가 상기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기 서열 및 이 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 함유하는 DNA인 방법.
(상기 식중, A는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시티딜잔기, 및 T는 티미딜산잔기를 나타내며, 일반식(Ⅱ)의 좌측말단 및 우측말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측을 나타낸다). - 제16항 또는 제17항에 있어서, 제1DNA가 유전 코오드의 변성에 따라 제20항에 정의한 DNA의 하나이상의 염기 서열중 하나 이상의 염기를 치환함으로써 수득된 염기 서열을 함유하는 DNA인 방법.
- 제16항에 있어서, 형질전환체가 증식하고, 이어서 이 형질전환체가 상기 DNA를 형질발현하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 생산하도록 상기 형질전환체를 배양하는 방법.
- (a) TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA 및 복제 가능한 형질발현 운반자를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA에 의해 형질전환된 형질전환체 미생물 또는 세포 배양액을 제공하고; (b) 형질전환체가 상기 DNA를 형질발현하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 생산하도록 상기 형질전환체를 배양하고; (c) 배양된 형질전환체로부터 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 분리함을 특징으로 하는 TNF 활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 제조방법.
- 제23항에 있어서, 형질전환체가 증식하고, 이어서 이 형질 전환체가 상기 DNA를 형질발현하여 인체생리적 활성 폴리펩티드를 생산하도록 상기 형질전환체를 배양하는 방법.
- (a) 전체로서 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코오딩하는 엑손 및 인체 생리적 활성 폴리펩티드와 관련이 없는 인트론을 함유한, TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자를 인체에서 유래된 데옥시리보핵산으로부터 분리하고; (b) 상기 유전자로부터 인트론을 삭제하여 엑손을 수득하고; (c) 상기 엑손을 사용하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 형성함을 특징으로 하는, TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA의 제조방법.
- 제25항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 상기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 방법.
(상기 식중, Gln은 글루타만잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔키, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - 제25항에 있어서, 엑손 전체가 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기 서열 및 이 염기서열에 상보적인 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열을 함유하는 DNA를 함유하는 방법.
(상기식중, A는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시티딜산잔기, 및 T는 티미딜산잔기를 나타내며, 일반식(Ⅱ)의 좌측말단 및 우측말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측을 나타낸다). - (a) 전체로서 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코오딩하는 엑손 및 인체 생리적 활성 폴리펩티드와는 관련이 없는 인트론을 함유한 TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자를 인체에서 유래된 데옥시리보핵산으로부터 분리하고; (b) 상기 유전자로부터 인트론을 삭제하여 엑손을 수득하고; (c) 상기 엑손을 사용하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 형성하고; (d) 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 상기 DNA를 복제 가능한 형질 발현 벡타에 결찰시킴을 특징으로 하는 TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA의 제조방법.
- 제28항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산서열을 갖는 방법.
(상기 식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - 제29항에 있어서, DNA가 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기서열 및 이 염기 서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열을 갖는 방법.
(상기 식중, A는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시디틸산잔기, 및 T는 티미딜산잔기를 나타내며, 일반식(Ⅱ)의 좌측말단 및 우측말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측을 나타낸다). - (a) 전체로서 인체 생리적 활성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코오딩하는 엑손 및 인체 생리적 활성 폴리펩티드와는 관련이 없는 인트론을 함유한 TNF활성을 갖는 인체 생리적 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자를 인체에서 유래된 데옥시리보핵산으로부터 분리하고; (b) 상기 유전자로부터 인트론을 삭제하여 엑손을 수득하고; (c) 상기 엑손을 사용하여 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 형성하고; (d) 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 상기 DNA를 복제 가능한 형질 발현 벡타에 결찰시켜 TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA를 수득하고; (e) 상기 재조합 DNA에 의해 미생물 또는 세포 배양액의 세포를 형질전환시킴을 특징으로 하는 TNF활성을 갖는 인체 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 함유한 형질전환체 미생물 또는 세포 배양액의 제조방법.
- 제31항에 있어서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 방법.
(상기 식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - 제32항에 있어서, DNA가 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 염기 서열 및 이 염기 서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열을 갖는 방법.
(상기 식중, A는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시티딜산잔기, 및 T는 티미딜산잔기를 나타내며, 일반식(Ⅱ)의 좌측말단 및 우측말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측을 나타낸다). - 항종양 또는 항비루스에 유효한 량의 TNF활성을 갖는, 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 일체 생리적 활성 폴리펩티드를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 회석제 및/또는 부형제와 혼합함을 특징으로 하는 약학 조성물의 제조방법.
(상기 식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스테인잔기이다). - 제34항에 있이서, 인체 생리적 활성 폴리펩티드가 제34항에 정의한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 유사변이체에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 방법.
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