KR920006881B1

KR920006881B1 - 프리파스타틴(plipastatin)의 제조방법

Info

Publication number: KR920006881B1
Application number: KR1019850009104A
Authority: KR
Inventors: 하마오 우메자와; 다까아끼 아오야기; 도미오 다께우찌; 마사 하마다; 히로시 나가나와; 야스히꼬 무라오까; 다까아끼 니시끼오리
Original assignee: 자이단 호오진 비세이부쓰 가가꾸 겡뀨우가이; 이찌가와 도꾸지
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1985-12-04
Publication date: 1992-08-21
Also published as: EP0192828A3; PT81615A; AU583553B2; EP0192828A2; GR852894B; DK564785A; ES549565A0; US4742155A; AU5030785A; EP0192828B1; JPS61134398A; ZA859315B; HUT40707A; HU193838B; ES8701197A1; KR860005027A; PT81615B; DK564785D0; DE3582791D1; ATE63318T1

Abstract

내용 없음.

Description

프리파스타틴(PLIPASTATIN)의 제조방법

제1도는 50℃ 디메틸술폭사이드 -d₆중에서 측정한 본 발명 프리파스타틴 A₁의 NMR 스팩트럼도.

제2, 3 및 4도는 제1도와 동일 조건하에서 측정한 프리파스타틴 A₂, B₁및 B₂의 NMR 스팩트럼도이다.

본 발명은 포스폴리파제 A₂, C 및 D에 대해 효소 억제활성을 나타내며, 또 면역억제제 또는 타입 Ⅰ 항 알레르기제로서 유용되는 신규의 생기적 활성물질인 프리파스타틴(PLPASTATIN)에 관한 것이다.

아실기를 갖는 팹티드류가 공지되었으며, 예를 들어 일본국 특공소 59-95252호에 기술되어 있다.

부신피질 스테로이드와 세포독성 면역억제제가 지금까지 면역억제제로 사용되어 왔다. 또한 항 히스타민제가 항알레르기제로 지금까지 사용되어 왔다.

종래의 모든 면역억제제는 인체의 조혈(造血)기관에 대해 강한 독성을 갖게 되며, 따라서 독성이 낮은 면역억제제의 개발이 지속적으로 요구되어 왔다. 인체의 면역계통은 매우 복잡하기 때문에 새로운 작용기구를 나타내는 면역억제제가 강력하게 요청되어 왔다. 또한 타입 Ⅰ알레르기성 반응억제에 만족할만한 약제가 지금까지는 없었기 때문에 타입 Ⅰ알레르기성 장애에 대한 새로운 약제의 개발이 요구되었다.

본 발명은 다음 일반식(Ⅰ)의 신규한 생리적 활성물질인 프리파스타틴에 관한 것이다.

상기 식에서, R₁은 -C₁₃H₂₇또는 -C₁₄H₂₉, R₂는 Ala 또는 Val, 또 약어 Glu, Orn, Tyr, Thr, Pro, Gln, Ile, Ala 및 Val는 각각 글루탐산, 오르니틴, 티로신, 트레오닌, 프롤린, 글루타민, 이소로이신, 알라닌 및 발린을 의미한다. 본 발명은 또한 프리파스타딘염에 관한 것이며 또 프리파스타틴 및 그 염의 제조방법에 관한 것이다. 프리파스타틴은 독성이 낮고 또 새로운 작용기구를 갖는 면역억제제 또는 항알레르기성 약제로서 유용될수 있다.

본 발명 프리파스타틴에는 다음 4개의 화합물이 포함된다. 일반식(Ⅰ)에서 R₂가 Ala인 화합물들을 이후 A군 화합물로 칭하고 또 R₂가 Val인 화합물들을 B군 화합물로 칭한다.

(1) 프리파스타틴 A₁

(2) 프리파스타틴 A₂

(3) 프리파스타틴 B₁

(4) 프리파스타틴 B₂

본 발명 프리파스타틴의 제조는 바실러스속(Bacillus 屬) 에 속하는 프리파스타틴 생산 균주를 배양해서 배양육즙 내에서 프리파스타틴을 생산 축적하고 또 이어 이 배양육즙으로부터 프리파스타틴을 분리해서 진행시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "프리파스타틴 생산균주"는 1개 이상의 일반식(Ⅰ) 화합물을 생산할수 있는 능력을 지닌 균주를 의미한다. 이같은 균주에는 일본국 도오교 시나가와구 소재의 The Institute of Microbial Chemistry 보유의 토양시료로부터 단리해낸 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) BMG302-fF67이 포함된다. 이 균주는 1984년 9월 12일 일본국 소재의 The Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology 에 기탁해서 기탁번호 FERM P-7843이 부여되었으며, 이어 특허 수속상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거 동기관에 1985년 11월 8일자로 재기탁해서 기탁 번호 FERM BP-934가 부여되었다. (한국과학기술원, KCTC 8179P 1978. 1. 29 기탁)

이 균주의 균(菌) 특성을 다음에 기술하였다.

균주 BMG302-fF67의 균 특성:

1. 세포형태학

(ⅰ) 약 1.0×2.6 미크론의 크기를 갖는 간상체(桿狀體)

(ⅱ) 고유적인 다형성(多形性)은 관측되지 않음.

(ⅲ) 균체에서 돌출하는 편모를 갖고 있으며 운동성임.

(ⅳ) 중심부에서 약 0.6×2.0 미크론의 크기를 갖으며 또 내열성인 타원형 포자아포. 세포팽윤은 관측되지 않음.

(ⅴ) 균주 그램염색 양성.

(ⅵ) 내산성 없음.

2. 각종 배지에서의 성장 [육즙 젤라틴 천자배양(穿刺培養)을 제외하고는 30℃에서 배양함]

(ⅰ) 육즙 아가 판상배지 배양

불규칙한 뿌리형태 주변을 갖는 둔탁 불투명하고 거의 원형인 콜로니. 배양 3일경에 콜로니표면에 주름이 나타남. 확산성 색소 없음.

(ⅱ) 육즙 아가 사면판상 배지 배양

세포가 배지표면에서 확산 성장해서 불투명 둔탁한 담황갈색 콜로니를 형성함. 배양 3일경에 주름이 나타나서 둔탁한 표면을 이룸.확상성 색소 없음.

(ⅲ) 육즙 액상 배지 배양

배양 1일째에 배지표면이 얇은 막으로 덮히게 되고 또 배양 5일째에는 세포들이 시험한 바닥으로 침전하기 시작함.

(ⅳ)육즙 젤라틴 천자배지 배양

배양 1일째에 배지표면에 얇은 막이 형성되고 또 골반입구형태의 젤라틴 액화가 20℃와 30℃에서 모두 개시된다. 이액화는 배양 7일째 거의 종료되었다.

(ⅴ) 리트머스 밀크(Litmus milk)]

배양 2일째에 BCP 밀크 배지에서는 팹톤화가 개시되었으며, 또 7일째에 이 팹톤화가 종료되었다. 알카리반응. 응결되지 않음.

3. 생리적 특성(별도로 명시하지 않은 경우 배양온도는 30℃이다).

(ⅰ) 질산염 환원 : 양성

(ⅱ) 탈질화 반응(Komagata등의 방법) : 양성

(ⅲ) MR 시험 : 음성

(ⅳ) VP 시험 : 양성

(ⅴ) 인돌의 생성 : 음성

(ⅵ) 유화수소의 생성 : 음성

(ⅶ) 전분의 가수분해 : 양성

(ⅷ) 시트르산의 이용(Koser's 배자와 Chrisensen's 배지에서) : 양성

(ⅸ) 무기질소원의 이용 (질산칼륨 및 황산암모늄) : 양성

(ⅹ) 염료의 생성(King A 및 King B 배지, Eiken) : 황색 색소 소량 생성

(ⅹⅰ) 우레아제(우레아 배지, Eiken) : 음성

(ⅹⅱ) 옥시다제 : 음성

(ⅹⅲ) 카탈라제 : 양성

(ⅹⅳ) 성장범위 : 10 내지 37℃에서 성장. 50℃에서 성장않음. 27 내지 37℃에서 최적 성장; pH 5.0 내지 pH 9.0에서 성장, pH 6.0 내지 pH 8.0에서 최적 성장

(ⅹⅴ) 산소에 대한 태도 : 조건 혐기성

(ⅹⅵ) O-F 시험(Hugh-Leifson 방법) : 발효형(그러나 가스는 생성되지 않음)

(ⅹⅶ) 당류중에서 산 및 가스 생성(Hugh-Leifson 방법) : 모든 당류에서 음성.

(ⅹⅷ) 7% NaCl 함유 배지에서의 성장 : 양성

전술한 특성을 요약하면 BMG 302-fF67 균주는 포자아포, 균체에서 돌출한 편모와 유동성을 갖고 있는 조건 혐기성의 그램양성 간상체이다. 포자아포는 타원형이며 또 그 위치는 중앙이다. 이는 내열성이고 세포팽윤이 관측되지 않았으며 내산성 또한 관측할수 없다.

이 균주는 아가 배지상에 불규칙한 주변을 갖는 불투명한 콜로니를 생성시키며; 이 배지 표면에서 확산 성장하고; 젤라틴을 액화시키며; 밀크롤 팹톤화하고; 질산염을 환원시키며; 탈질화반응 양성; MR 시험 음성; VP 시험 양성; 인돌 또는 황화수소를 생성시키지 않고; 전분을 가수분해시키며; 시트르산을 이용하고; 우레아제반응 음성; 옥시다제반응 음성; 카탈라제반응 음성이며; pH 5.0 내지 9.0(최적 pH 범위 : 6.0 내지 8.0)에서 10내지 37℃(최적범위 : 27 내지 37℃)범위에서 성장하고; 글루코스를 발효 분해시켜서 산을 제조하며; D-글루코스, D-푸럭토스 및 슈크로스로부터 BTB 지시약에는 양성이지만 BCP 지시약에는 음성을 나타낼 정도량의 산을 생성시키지만, 가스는 발생시키지 않고; L-아라비노스, D-키실로스, D-만노오스, D-가락토스, 말토오스, 락토오스, 트레할로스, D-소르비톨, 이노시톨, D-만니톨, 글리세롤 및 전분으로부터의 산과 가스를 생성시키지 않으며; 도 7% 염화나트륨 함유 배지에서 성장하였다.

"Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology" 제8판(R.E.Burhanan ＆ N.E.Gibbons, The Williams Wilkins Company, Balitmore, 1974)에 의하면, 이들 특성으로 균주 BMG 302-fF67이 바실러스 속(屬)에 속한다는 것을 알수 있다. 포자아포형성에서 세포팽윤이 원인이 되지 않고, 운동성이며 글루코스로부터 아세토인(asetoin)을 생성시키고 또 L-아라비노스, D-크실로스 및 D-만니톨로부터 산을 생성시키지 않는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)는 균주 BMG 302-fF67과 밀접한 관련이 있는 것처럼 보인다. 바실러스 투링기엔시스는 곤충들에 대해 병원성이기 때문에(Bergey's Manual, supra, 536페이지 참조) 균주 BMG302-fF67과는 구별될수 있다. 균주 BMG302-fF67의 특성은 다음 표에서와 같이 바실러스 세레우스와 바실러스 코아굴란스의 특성과 비교될수 있다. [Bergey's Manual, supra, and "Igaku Saikin Dotei No Tebiki", 2판, 197페이지, Kindai Shuppan(이는 T. Sakasaki에 의한 Cowan ＆ Steel "Cowan ＆ Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria(2nd ed.) "의 일본어 번역문이다) 참조].

[균주 BMG302-fF67과 이와 유사한 균종의 특성비교]

죽 : +는 시료의 90내지 100%가 양성

-는 시료의 90 내지 100%가 음성

d는 시료의 11 내지 89%가 양성.

표에 도시한 바와같이, 균주 BMG302-fF67은 50℃에서 성장하지 않는다. 이 균주는 젤라틴 가수분해와 7% NaCl 함유 배지에서의 성장이 양성임을 감안할 때 바실러스, 코아굴란스 보다는 바실러스 세레우스에 더 유사하다. 이 균주는 또한 기타 특성에 있어서도 바실러스 코아굴란스와는 아주 다르다. 따라서 균주 BMG302-fF67은 바실러스 세레우스 BMG302-fF67로서 명명하였다.

본 발명 방법은 다음에서 보다 상세하게 설명하였다.

본 발명 방법에 의해 프리파스타틴을 제조하기 위해서는 전술한 균주를 우선 박테리아용으로 유효한 영양분을 함유하는 배지에서 호기적으로 배양시킨다. 박테리아 배양에서 사용되는 선행 영양분을 영양원으로 사용할수 있다. 예를 들어, 글리세린과 같은 폴리알코올, 지방은 물론 글루코스, 락토오스, 슈크로스, 스타치, 말토오스, 당밀 등의 당류와 같은 탄화수소류를 단독 또는 결합해서 탄소원으로 사용할수 있다. 사용할 수 있는 무기 및 유기질소원의 전형적인 예로는 염화암모늄, 황산암모늄, 우레아, 질산암모늄, 질산나트륨, 펩톤, 육(肉)추출액, 이스트추출액, 건조이스트, 옥수수침지액, 콩제품, 목화씨유 케이크, 오오트밀, 카사미노산, 박토소이튼, 가용성 식물단백질 및 이들의 혼합물을 들수 있다.

필요한 경우, 아미노산과 같은 본 발명 균주의 성장과 프리파스타틴 생성을 증가시킬수 있는 유기물질과 무기물질은 물론 염화나트륨, 황산마그네슘, 황산구리, 황산철, 황산아연, 염화망간, 탄산칼슘 및 인산칼슘과 같은 무기염을 첨가해줄수도 있다.

배양의 바람직한 방법은 액체배양방법, 특히 심부 스피터배양방법이다.

배양은 10 내지 37℃, 바람직하게는 25 내지 30℃온도에서 또 pH 5.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0, 보다 바람직하게는 거의 중성 pH에서 진행시키는 것이 이상적이다. 생리학적 활성물질 프리파스타틴은 액체배양법으로 통상 1일 또는 2일간 배양을 진행시켜 배양 육즙내에 생산 축적된다. 이 배양을 배양육즙 내에 생산된 프리파스타틴 양이 최대가 된 경우에 정지시킨다. 이들 세포를 여과 제거하고 또 이어 목적하는 생성물을 수득 여과액으로부터 분리해서 정제해준다.

배양과 정제단계를 통해서 프리파스타틴의 생산 감시는 다음 방법에 따라 안티포스포리파제 D 활성을 측정함으로서 성취할 수가 있다.

안티포스포리파제 D 활성의 측정은 A. 오꾸야마, T. 니시키로리, T. 아오야기 및 H. 우메자와 저술의 Biochmeistry international, 4, 417, 1982에 기술된 Okuyama등의 방법으로 진행시킨다.

디팔미토일포스파티딜 콜린(DPC)(200mM)과 콜린-메틸¹⁴C-DPC(4×10⁴dpm)을 1mM 염화칼슘 함유의 50mM 트리스-염산 완충액(pH 5.7) 390㎕에 초음파를 사용 현탁시킨다. 수득 현탁액에, 시험하고저 하는 시료를 포함하는 용액 10㎕를 첨가한다. 이 수득 현탁액에(카베이지 배추로부터 유도한) 시판되고 있는 포스포리파제 D용액 100㎕를 첨가하고 또 37℃에서 20분간 반응시켰다. 이 반응을 클로로포름, 메탄올 및 농염산(2 : 1 : 0.02%)의 혼합물을 첨가해서 갑자기 중단시켰다. 이어 이 혼합물에 0.1M 염화칼륨을 포함하는 50% 메탄올 1㎖를 첨가하고 또 이 혼합물을 교반하였다. 2개 층을 원심분리로서 분리하고, 효소에 의해 상부층으로부터 방출되는 콜린의 방사능(a)을 측정하였다. 또한 시료로부터 유리한 완충액의 방사능(b)을 공시험용으로 측정하였다. 포스포리파제 활성의 % 억제율을 다음 식에 따라 계산하였다:

[(b-a)/b]×100

IC50 치는 50% 억제율을 갖는 시료농도에 상응하였다.

배양육즙 여과액으로부터의 생성물 분리와 정제는 미생물 배양육즙 여과액으로부터 미생물 대사산물을 분리해내는데 사용되는 선행방법중 어느 방법으로든지 진행시킬수 있다.

프리파스타틴은 물, 메탄올, 에탄올 및 n-프로판올에는 가용성이지만, 아세톤과 같은 통상의 유기용매중에는 불용성 또는 극미량이 용해된다. 따라서 프리파스타틴은 수가용성 산성물질을 정제하는데 사용되는 모든 방법을 사용해서 정제할수 있다. 예를 들어, 활성탄 분말 또는 기공성수지 상에 흡착 및 이로부터의 탈착과 실리카겔, 실리화 실리카겔

또는 세파덱스

LH-20을 이용한 칼람 크로마토그래피를 단독 또는 복합해서 사용할수 있다.

실시태양의 한 예로서, 바실러스 세레우스 BMG302-fF67 배양육즙의 여과액을 Amberlier

XAD-7으로 처리해서 목적하는 물질을 흡착시킨다. 물로 세척한 후, 수지를 80% 메탄올로 용리시켜서 목적하는 물질을 포함하는 조(租) 갈색 분말을 수득하였다. 여기에는 본 발명 프리파스타틴의 A군 및 B군의 4개 화합물이 함유되어 있다.

각개 화합물의 분리는 다음과 같이 행한다 : 이같이 수득한 조분말을 n-프로판올에 용해한 용액을 n-프로판올로 평형화시킨 실리카겔 칼람을 통해주고, 이어 단계적으로 물의 함량을 증가시킨 n-프로판올 수용액으로 용리시켜서 프리파스타틴의 A군 화합물(A₁및 A₂)을 이후 정의되는 B 군 화합물(B₁및 B₂)로부터 분리한다. 이같이 수득한 프리파스타틴 A군 화합물을 미리 1% 칼륨아세테이트 ±3% 아세트산의 수용액과 메탄올(4 : 6)의 혼합물로서 평형화시킨 실리화 실리카겔

상에서 크로마토그래피 분리를 행하고 이어 동일한 용매 혼합물로 용리시켜서 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 수거하였다. 이어 분획을 세파덱스

LH-20 으로 탈염시키고 농축한 후 동결 건조시켰다. 이같이 수득된 분말을 이어 미리 2% 칼륨아세테이트 +6% 아세트산의 수용액 1부와 아세토니트릴 1부의 혼합물로서 평형화한 칼람상에서 고압 액체 크로마토그래피 분리(HPLC)를 행하였다. HPLC로서 수득한 목적하는 생성물을 함유하는 각개 분획을 세파덱스

LH-20으로 처리해서 그 안에 함유된 칼륨 아세테이트를 제거하고 또 이어 각개 분획을 농축, 동결 건조시켜서 프리파스타틴 A₁또는 A₂의 칼륨염을 백색 분말로 수득하였다.

또한, 칼람 크로마토그래피에 의해 실리카겔 상에 수득된 프리파스타틴 B군 화합물(B₁및 B₂화합물 포함)을 미리 40% 메탄올 용액으로 평형화시킨 실리화 실리카겔

상에서 크로마토그래피 분리를 행하고, 이어 동일한 메탄올 용액으로 용리해서 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 수거하고 또 이어 Sephadex

LH-20 으로 탈염시킨후 농축하고 또 동결 건조시킨다. 수득분말을 A군 화합물 분리에 사용한 것과 동일한 HPLC 분리를 행해줌으로서 프리파스타틴 B₁을 프리파스타틴 B₂로부터 분리시킨다. 프리파스타틴 B₁또는 B₂를 함유하는 분획을 세파덱스

LH-20으로 처리해서 농축한 후 동결 건조시켜서 프리파스타틴 B1 또는 B2를 칼륨염을 백색 분말로 수득하였다.

이같이 해서 수득된 본 발명 화합물 각각을 알카리로 점화시키고 또 질량 스팩트럼 분석을 행해준다. 스팩트럼 상에 나타나는 분자이온의 단편들은 각개 화합물이 N-말단으로부터 다음의 아미노산 배열순서를 갖고 있음을 나타내었다 : Glu, Orn, Tyr, Thr, Glu, Ala (또는 Val), Pro, Gln, Tyr 및 Ila 또한 IR 스팩트럼상에 나타나는 락톤고리의 존재는 Orn과 연결된 Tyr이 C-말단 아미노산인 Ile와 결합하고 있음을 나타내었으며, 또 이는 효소가수분해와 NMR 스팩트럼으로 입증되었다. 이들 데이터를 기준으로 본 발명자 등은 전술한 본 발명 화합물들의 구조를 확인하였다.

본 발명 화합물들의 물리화학적 특성을 다음 표 1에 요약하였다. (별도로 명시하지 않은 경우, 모든 측정은 화합물의 칼륨염을 사용해서 진행하였다).

[표 1]

[프리파스타틴의 물리화학적 특성 ]

주 :^*실리카겔 박층(Kieselgel 60F 0.24㎜, Merck)을 사용함 : 전개용매 : (a) n-부탄올/아세트산/물(4 : 1 : 1, v/v), (b) 80% n-프로판올.

^**산가수분해물 : 6N HCl, 105℃, 밀봉관 내에서 18시간.

[급성독성]

본 발명 화합물은 비교적 낮은 독성을 갖는다. 예를 들어, 생쥐 급성독성 시험에서 프리파스타틴 B₁의 LD₅₀치는 250내지 500㎎/㎏(i.p.) 범위인 것으로 나타났다.

이는 본 발명 프리파스타틴은 이를 단독으로 사용하는 경우에도 면역반응을 억제할수 있다는 사실을 지지하고 있다. 따라서, 본 발명 화합물들은 면역억제 약제로서 유용된다.

본 발명 화합물들은 통상 알카리금속염 또는 기타 비독성염 형태의 면역억제 약제로 사용된다. 본 발명 화합물들은 선행방법에 따라 제조 및 투여할수 있다. 이들 화합물은 예를 들어 주사제, 분말제, 입제, 정제 및 좌제로 제조할수 있다. 이들 화합물의 투여경로의 예로는 비경구, 경구 및 직장을 들 수 있다.

제조방법에서는 본 발명 화합물들에 영향을 미치지 않는 안정제, 보존제 및 진통제등의 약제학적 허용담체와 기타 첨가제는 어느 것이든지 사용할수 있다. 본 발명의 화합물과 만티톨을 증류수에 용해한 용액을 바이알이나 앰푸울에 충전하여 주사제로 하거나 그대로 동결건조시킨다. 동결건조분말은 사용직전에 생기식염수나 증류수를 가하여 복원시켜 주사제로 한다. 제제내에 존재하는 활성성분의 양은 제제형태에 따라 달라지지만, 일반적으로 0.01%-100%(W/W, 이하 동일함), 바람직하게는 0.1-70%이다. 본 발명의 화합물의 투여량은 질환의 정도등 여러 가지 인자에 따라 달라지지만 일반적으로 성인의 경우 1일 0.01내지 2000㎎, 바람직하게는 0.1 내지 1000㎎ 범위이다. 전형적인 제제예를 다음에 기술하였다.

[주사제]

30중량부의 프리파스타틴 B₁칼륨염을 970중량부 순수에 용해하고 또 수득용액을 GS-형 밀리포어(milipore)여과기를 통과시켜 살균하였다. 이 여과액 2㎖를 10㎖ 바이알에 장입한후 동결 건조시켜서 주사제용 동결 건조 분말을 수득하였다.

[입제]

50중량부의 프리파스타틴 A₁칼륨염, 600부의 락토오스, 330부의 결정 셀루로스 및 20부 히드록시프로필 셀룰로스를 잘 혼합하고 또 수득혼합물을 Roller compactor

를 사용 압축하고, 연마 및 시별을 행해서 16 내지 60메쉬 범위 입도를 갖는 입제를 수거하였다.

[활성도]

본 발명의 신규한 생기적 활성물질인 프리파스타틴의 생리적 활성을 다음에 설명하였다.

(1) 포스포리파제의 억제

포스포리파제의 억제 측정을 앞에서 설정한 오꾸야마 등의 방법으로 진행하였다. 수득 결과를 다음 표 2에 요약하였다.

[표 2]

[포스포리파제의 억제]

(2)면역억제 활성

본 발명 프리파스타틴의 약리적 효과를 조사한 결과로서, 이 물질은 세포 중재면역에 대해 억제효과를 갖는다는 사실을 발견하였다. 본 발명의 프리파스타틴 A₁및 프리파스타틴 B₂모두의 세포 중재면역에 대한 억제효과를 다음 실험으로 설명하였다.

[실험(1)]

본 실험은 정상적인 생쥐의 세포 중재면역에 대한 효과를 설명하고 있다. 세포 중재면역에서의 프리파스타틴 A₁및 B₁의 활성을 생쥐의 한쪽 발바닥에 항원성 양(洋) 적혈세포(SRBC)를 접종해서 야기되는 지연형 감각과민(DTH) 형태로 조사하였다.(참고 : J. Exp. Med., 139, 1529 내지 1539, 1974).

CDF₁생쥐(암컷, 8주령)을 생리식염수 중에 5×10⁵개 SRBC를 가해준 현탁액으로 정맥내 접종시켰다. 이와 동시에 5㎎/㎏ 또는 0.5㎎/㎏의 프리파스타틴 A₁또는 B₁의 수용액을 단일 투여량으로 이들 생쥐에 복강내 투여하였다. 주사 4일후에 이들 생쥐의 다른쪽 발바닥에 피하주사로 생리식염수 중에 10⁸SRBC를 가해준 현탁액을 투입하였다. 24시간 경과후, 발바닥 팽창(발바닥 두께의 증가) 정도를 캘리퍼스로 측정하였다. 처리동물에서의 발바닥 팽창 정도를 시험화합물 대신에 생리적 식염수에 SRBC를 첨가한 용액으로 이들 생쥐에 피하주사한 대조동물인 미처리 동물에서의 발바닥 팽창 정도(100%)와 비교해서 시험화합물들의 세포 중재면역 억제효과를 측정하였다. 수득한 결과는 다음 표에 요약하였다.

[표 3]

[실험(2)]

본 실험은 임파구 배자(胚子) 발색반응에서의 프라파스타틴의 억제효과를 설명하고 있다.

임파구 배자 발생반응은 콘카나발린 A(이후 "Con A"로 칭함)로 자극시킨 T-세포 및 B-세포 양쪽에 의한 DNA 합성에서의 [³H]-타미딘과 E. 콜리 055 : B₅의 지방다당류를 결합시킨 형태로 평가될수 있다. (참고 : "Meneki Jikken Sosaho" 또는 "Immunological Experiments Manual" 2267 내지 2276페이지 ; The Japanese Society for Immunology).

T-임파구 배자 발생반응에서, T-세포는 BALB/C 생쥐(19주령)의 비장세포들을 나일론 칼람을 통과시켜서 흡착성 세포를 제거하고 또 이어 수득 비장세포들을 플라스틱 페트리 접시에서 1시간 동안 배양시켜서 잔유하는 흡착성 세포들을 제거함으로서 수득하였다. 이 T-세포의 배양은 20%의 태아송아지혈청, 25㎖의 헤페스, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100U/㎖의 페니실린 G를 함유하는 RPMI 1640 배지를 사용하는 팔콘(Falcon) 마이크로테스트 판상 배지의 웰(wells)에서 진행하였다. T-임파구세포(1×10⁵개), 5㎍/㎖의 Con A 및 프리파스타틴 A₁또는 B₁을 순서에 따라 웰에 첨가하고 또 이 웰에 전술한 배지를 첨가해서 전체 부피가 0.2㎖가 되게 한다. 수득혼합물을 72시간 동안 배양시킨다. 이 혼합물을 배양종료 8시간 전에 [³H]-티미딘으로 박동표지(pulse-labeled)하였다. 비장세포 대신에 T-세포를 사용하고 또 Con A 대신에 100㎍/㎖의 LPS를 사용한 것 이외에는 앞에서 설명한 것과 동일한 조건에 따라 B-임파구 배자 발생반응을 진행시켰다.

100㎍/㎖농도에서 프리파스타틴 A₁은 Con A-자극 T-임파구 및 LPS-자극 B-임파구 중에서 [³H]-티미딘의 소비를 각각 52% 및 15% 억제하였다. 또한 프리파스타틴 B₁은 T-임파구 배자 발생의 Con A-자극반응과 B-임파구 배자발생의 LPS-자극반응을 각각 54% 및 20% 차단하였다. 이들 데이터는 프리파스타틴의 정상적인 동물내에서 세포-중재면역을 억제할수 있는 물질임을 입증하고 있다.

(3) PCA 반응의 억제 :

프리파스타틴의 약리학적 효과에 대한 연구는 이 화합물이 수동 피부과민증(이후, PCA로 칭함) 반응에서 억제효과를 나타내는 것으로 입증되었다. 다음 실험은 PCA 반응에서 본 발명 프리파스타틴 A₁의 억제 효과를 입증하게 된다.

[실험(1)]

본 실험은 PCA 반응에서 프리파스타틴 A₁의 억제효과를 입증하고 있다. 다음에 기술한 실험은 선행방법(참고 : J. Immunology, 106, 1002 내지 1011, 1971)에 따라 완성되었다. 쥐들을 달걀 일부민 항원으로 감작시켜서 항혈청을 수득하였다. S-D속의 쥐(숫놈, 8주령)들 잔등에 이같이 해서 수득한 항-달걀 알부민 혈청 50㎕를 피내주사해서 이들 쥐를 수동적으로 감작시켰다. 48시간 후, 이들 쥐 각각에 달걀 알부민(2.5㎎)+에반스 부루(2.5㎎ : Evans blus)를 함유하는 생리식염수로서 정맥내 주사하였다. 주사 60분후 감작된 부위에서의 에반스 부루 출현에 의한 청색반점의 전개를 체크하였다. 생리식염수 주사 5분전에 시험화합물(150㎕)을 감작부위에서 피내주사하였다. DSCG(2 나트륨 크로모글리세이트)를 대조용으로 사용하였다.

시험결과는 다음 표 4에 요약하였다.

[표 4]

^*5마리 동물군에서 반점을 갖는 동물의 수

^**p : 위험인자

^***N. S. : 위험하지 않음.

표 4에서 수록된 바와같이, 590㎛ 프리파스타틴 A1의 파내주사는 DSCG에서와 필적할수 있는 RCA 반응에 대한 억제효과를 나타낸다. 이들 데이터는 본 발명 화합물이 천식, 화분증 및 과민성 피부염과 같은 타입 Ⅰ 알레르기성 질병에 억제효과를 나타낸다는 사실을 입증하고 있다.

전술한 각종 실험들로부터 명백한 바와같이, 본 발명의 프리파스타틴은 세포-중재면역에 억제효과를 갖고 있음은 물론 상대 독성이 낮기 때문에 선행 면역억제제와는 다른 작용기구를 갖는 면역억제제로서 유용될 수 있다. 이밖에 프리파스타틴은 PCA 반응에 대해 억제효과를 나타내기 때문에 이는 또한 항 알레르기성 약제로서 유용될수 있다.

본 발명은 다른 실시예로서 보다 상세히 설명될수 있다. 그러나 본 발명 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니며, 본 발명 기술분야에 숙련된 자들은 본 발명 범주를 벗어나지 않는 밤위내에서 각종 변화와 수정을 행할수 있음을 밝혀둔다.

[실시예 Ⅰ]

2.5% 글리세린, 0.5%의 육추출액(Kyokuto K.K의 제품), 0.5% 폴리펩톤, 1.0%의 이스트추출액(Oriental K.K.의 제품), 0.2%의 NaCl, 0.05%의 MgSO₄7H₂O, 0.05%의 K₂HPO₄, 0.32%의 CaCO₃, 소포제로서 실리콘 KM-70(Shin-etsu Kagaku K.K)와 콩기름(JP)의 1 : 1 혼합물 0.05%를 함유하는 배지(pH7.4)를 120℃ 오오토크래브 내에서 20분간 살균시켰다.

500㎖ 에렌마이어 플라스크에 프리파스타틴-생산 균주(FERM BP-934)의 고리를 접종시킨 살균배지 120㎖를 장입하였다. 이 접종배지를 회전식 진탕기(180rpm)상에서 27℃로 1일간 배양하였다. 이같이 해서 수득한 씨배지 1㎖를 이 살균배지 120㎖를 포함하고 있는 500㎖ 에렌마이어 플라스크로 옮기고 또 전술한 바와 동일한 조건하에서 1일간 진탕배양하였다. 배양육즙을 pH7.4에서 여과해서 이들 세포를 제거하고 또 18ℓ의 여과액을 수득하였다. 포스포리파제 D 억제용 여과액의 IC₅₀값은 32㎍/㎖ 이었다. 여과액을 암버라이트 XAD-7(2ℓ)로서 충진한 칼람을 통과시켜서 효소억제물질을 흡착시켰다. 이어 이 칼람을 물(8ℓ)로서 세척하고, 또 80% 메칸올(4ℓ)로 용리시켜서 활성물질을 함유하는 분획을 수거하였다. 혼합분획물을 감압하에서 농축 건고시켜서 IC₅₀값 18㎍/㎖를 갖는 갈색의 조(粗)분말 24.6g을 수득하였다.

이같이 수득한 조(粗)분말을 n-프로판올에 용해시킨 용액을 미리 n-프로판올로 충진한 실리카겔(1ℓ)칼람을 통해주고, 이어 n-프로판올(800㎖), 90% n-프로판올 용액(2ℓ) 및 80% n-프로판올 용액(2.5ℓ)으로 연속적으로 용리시켜서 활성물질을 포함하는 분획을 수거하였으며, 이들 분획을 감압하에서 농축 건고시켰다. 프리파스타틴 B₁및 B₂를 함유하는 갈색분말(2.15g)(IC₅₀=15㎍/㎖)을 90% n-프로판올 용리분획으로부터 수득하고 또 80% n-프로판올 용리분획으로부터 프리파스타틴 A₁및 A₂(IC₅₀=9.5㎍/㎖)를 함유하는 황갈색분말 2.0g을 수득하였다.

이같이 수득된 A 군의 황갈색분말을 미리 메탄올 및 아세테이트 완충액(1% 칼륨아세테이트±3% 아세트산, pH5)의 6 : 4 혼합물로 충진시킨 실란화 실리카겔(400㎖) 칼람에 통해주고, 또 이어 동일한 혼합물로서 용리시켜서 활성물질을 함유하는 분획을 수거하였다. 이어 혼합 분획물을 감압하에서 농축 건고시켰다. 수득고형물을 소량의 80% 메탄올 중에 용해시키고 또 이용액을 80% 메탄올로 용리되는 세파덱스 LH-20 칼람하여 상에서 과잉량의 칼륨아세테이트 제거를 위한 탈염을 행하였다. 활성물질을 함유하는 이들 분획을 수거 감압하에서 농축 건고시켜서 994㎎의 담황색분말(IC₅₀=9.5㎍/㎖)을 수득하였다. 이같이 수득된 분말을 미리 아세토니트릴과 아세테이트 완충액(2% 칼륨아세테이트 +6% 아세트산, pH4)의 1 : 1 혼합물로 평형화시킨 고압액체 크로마토그래피(HPLC)용 칼람(Sensku Kagaku K. K. 제품 ; Nucleosil 5 C₁₈20ψ×300m/m; 유속 : 8㎖/분)을 통해주고, 이어 이 평형유체로 용리시켜서 프리파스타틴 A₁및 A₂의 각각을 함유하는 분획을 수거하였다. 이어 각각의 분획을 농축건고시키고 또 수득된 고형물을 실란화 실리카겔 칼람으로부터의 용출액을 탈염시키기 위해 사용한 방법과 동일한 방법으로 탈염시킴으로서 542㎎의 프리파스타틴 A₁(IC₅₀=2.1㎍/㎖)을 무색 분말로서, 또 152㎎의 프리파스타틴 A₂(IC₅₀=3.8㎍/㎖)을 또한 부색분말로서 수득하였다.

90% n-프로판올 용리분획으로부터 수득한 본 발명의 B군( B₁및 B₂) 물질을 함유하는 황갈색 분말을 또한 사전에 40%에 메탄올 충진시킨 실란화 실리카겔(200㎖) 칼람을 통해주고 이어 40% 메탄올(1.5ℓ)과 60% 메탄올(1.5ℓ)로서 연속해서 용리시켜서 활성물질을 함유하는 분획을 수거하였다. 이 혼합분획을 이어 농축 건고시켰다. 이 잔유물을 소량의 80% 메탄올에 용해시키고 또 이 수득용액을 세파덱스 LH-20 칼람에 통해주고, 이어 80% 메탄올로 용리시켜서 활성물질을 함유하는 분획을 수거하였으며, 이어 이를 농축 건고시켜서 545㎎의 담황색 분말(IC₅₀=8㎍/㎖)을 수득하였다. 이같이 수득한 분말을 이어 사전에 아세토니트릴과 아세테이트 완충액(2% 칼륨아세테이트 +6% 아세트산, pH4)의 65 : 35 혼합물로서 평형화시킨 HPLC 칼람(Nucleosil 5 C₁₈20ψ×300m/m; 유속 : 8m/분)을 통해주고, 이어 동일한 평행한 유체로 용리시켜서 프리파스타틴 B₁및 B₂각각을 함유하는 분획을 수거하였다. 이들 각개 분획을 농축 건고시켰다.

수득 잔우물들을 80% 메탄올로서 세파덱스 내-20 칼람으로부터 용리 탈염시키므로서 151㎎의 프리파스 타틴 B₁(IC₅₀=2.8㎍/㎖)을 무색분말로서 또 89㎎의 프리파스타틴 B₂(IC₅₀=3.3㎍/㎖)를 또한 무색분말로서 수득하였다.

[참고실시예 1]

본 발명 물질을 구성하는 지방산의 구조를 결정하기 위해서 다음의 화학실험과 기기분석을 행하였다.

본 발명의 프리파스타틴 A₁또는 B₁을 50℃의 30% HCl/메탄올 중에서 2일간 가메탄올 분해시키고 또 이어 농축 건고하였다. 수득잔유물을 디에틸에테르로서 추출하였다. 추출액을 실리카겔 상에서 박층 크로파토그래피 분리(이후 TLC 분리로 칭한다)를 행해서 (전개용액 : 클로로포름/메탄올(50 : 1)) 가메탄올 분해생성물을 분리하였다. NMR 및 MS를 사용한 이들 생성물의 기기분석결과는 본 발명의 프리파스타틴 A₁및 B₁를 구성하는 지방산은 β-히드록시 헥사데칸산(β-히드록시 팔미트산)임을 입증하였다.

전술한 것과 동일한 방법으로, 본 발명의 프리파스타틴 A₂및 B₂를 구성하는 지방산은 β-히드록시 안테이소헥사데칸산(β-히드록시 안테이소팔미트산)인 것으로 나타났다.

[참고실시예 2]

본 발명의 락톤 고리를 형성하는 티로신과 C-말단 이소로이신을 결정하기 위해서 다음 효소분석 및 화학분석을 행하였다. 본 발명 억제제는 다음 2개 방법을 따라 카르복시펩티다제 Y와 소화시켰으며 또 이 소화로 방출된 아미노산을 검사하였다. 카르복시펩티다제 Y는 억제제로부터 배열순서에 따라 아미노산을 연속적으로 분활시켜서 C-말단 아미노산을 방출시키는 능력을 갖고 있다.

(ⅰ) 아무 전처리를 행함이 없이 효소에 의한 직접소화

(ⅱ) 억제제의 락톤 고리를 알카리로 개환시킨후 효소호화

전술한 2개 방법에 따라 효소소화를 행한후에 다음 2개 결과를 얻었다.

(ⅰ)유리아미노산이 전혀 검출되지 않거나; 또는

(ⅱ) Ile, Tyr 및 Gln이 순서에 따라 방출되었다.

이들 데이터를 근거로, 본 발명자들은 C-말단 아미노산이 Ile 이고, 또 락톤이 C-말단에서 형성된다는 사실을 확인하였다.

C-말단 Ile와 락톤 고리를 형성할수 있는 기능기는 지방산, 2개의 Tyr와 Thr의 히드록시기들이다. 본 발명 억제제를 피리딘 용액 중에서 아세트산 무수물로서 아세틸화시킬 경우에, 수득된 아세틸 유도체의 NMR의 MS 스펙트라로서 확인한 바와 같이 Ile 에 결합된 지방산 Thr 및 Tyr의 히드록시기가 아세틸화되었다. 이들 결과는 C-말단 Ile가 오르니틴과 연결된 티로신의 페닐히드록시기와 락톤을 형성한다는 사실을 입증하고 있다.

Claims

바실러스 속에 속하는 프리파스타틴-생산균주를 배양해서 배양육즙 내에 프리파스타틴을 생산 축적하고 또 이어 이 배양육즙으로부터 프리파스타틴을 분리시킴을 특징으로 하는 다음 일반식(Ⅰ)의 프리파스타틴 또는 그 염의 제조방법.

상기식에서, R₁은 -C₁₃H₂₇또는 -C₁₄H₂₉, R₂는 Ala 또는 Val이다.
제1항에 있어서, 균주가 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)인 프리파스타틴 또는 그 염의 제조방법.
제2항에 있어서, 균주가 바실러스 세레우스 BMG 302-fF67(FERM BP-934)인 프리파스타틴 또는 그 염의 제조방법.
제1항에 있어서, 배양을 10내지 37℃ 및 pH 5.0 내지 9.0에서 호기성으로 진행시키는 프리파스타틴 또는 그 염의 제조방법.