KR920003663B1 - 합성유전자에 의한 효모세포로부터 돼지 성장 호르몬의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제 1 도는 전체 돼지 성장 호르몬 유전자에 해당하는 28종류의 합성 올리고 뉴클리오티드의 염기 순서를 5' 말단에서 3'말단순서로 나타낸 것이며,
제 2 도는 제 1 도의 올리고 뉴클리오티드의 접합 전략을 도시한 것이며,
제 3 도는 합성 올리고 뉴클리오티드를 대장균 운반체 pUC18에로의 클로닝 과정을 도시한 것이며,
제 4 도는 확인된 돼지 성장 호르몬의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이며,
제 5 도는 효모내에서 돼지 성장 호르몬의 대량 생산을 위하여 대장균 운반체 pPGAP및 효모 발현 운반체 pC1/1에의 클로닝 과정을 도시한 것이며,
제 6 도는 효모 세포내에서 합성된 돼지 성장 호르몬을 SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동법에 의해 확인한 결과이다.
본 발명은 합성유전자에 의해 효모세포내에서 돼지 성장 호르몬을 제조하는 방법에 관한 것으로, 이는 돼지 성장 및 사료효율을 증진시키기 위한 것이다. 현재까지 양돈업에서는 주로 고단백의 사료나 스테로이드 계통 합성화학 제품을 이용하여 성장촉진 및 사료효율을 높이고 있는데 스테로이드 제품은 체내에 장기간 잔류하여 인체에 미치는 악영향으로 인해 선진 각국에서는 사용을 금지시켜 가고 있다.
본 발명자들은 이러한 사실을 감안하여 돼지 자체의 성장 호르몬을 유전공학 기술을 응용하여 값싸게 대량으로 효모에서 제조함으로써 양돈업에 응용시킴을 목적으로 하고 있다.
따라서, 본 발명자들은 이제까지 알려진 타 제조방법(Seeburg 등 DNA2(1983),3
7)과는 상이하게 효모세포를 이용한 결과 아미노 말단이 알라닌으로부터 시작되는 자연상태의 성숙형 돼지 성장 호르몬을 대량생산할 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 방법은 다음과 같다.
본 발명은 돼지 성장 호르몬의 cDNA유전자 염기 배열 순서에 따라 SacI, Xbai 및 Sal I의 인지부위가 존재하는 올리고 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 접합전략에 따라 접합시킨 합성 올리고 뉴클리오티드의 카복시쪽 Xba I/Sal I 절편을 Xba I/Sal I 으로 처리한 대장균 운반체(pUC18)에 클로닝한 다음 이를 Sac I/Xba I 으로 처리하여 합성 올리고 뉴클리오티드의 아미노쪽 Sac I/Xba I절편을 클로닝시켜 아미노 말단의 일부가 없는 돼지 성장 호르몬 유전자를 제조한 다음 이 유전자를 아미노 말단 합성 유전자와 함께 프로모터와 터미네이터가 있는 대장균 운반체에 클로닝하여 프로모터-아미노말단 합성유전자가 포함된 돼지 성장 호르몬 유전자-터미네이터의 카세트를 제조한 다음 이를 효모발현 운반체에 재클로닝시켜 최종 효모 발현 운반체를 만들어 이를 효모 세포내에서 발현시킴을 특징으로 하는 돼지 성장 호르몬 제조방법으로서 상기 합성 올리고 뉴클리오티드에는 제한 효소 Sac I, Xba I, Sal I 의 부위가 존재하며, 상기 아미노말단 합성 유전자는 Nco I 인지부위 및 Sac I 인지부위가 존재하는 다음과 같은 염기서열로 합성하였고
상기 최종 효모발현 운반체는 효모 발현 운반체를 효소 BamHI 으로 처리한 후 프로모터-합성아미노 말단이 포함된 돼지 성장 호르몬 유전자=터미네이터의 카세트를 클로닝시킨 운반체(PCl/1-PGH)임을 특징으로 하는 돼지 성장 호르몬의 제조방법이다.
본 발명의 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
시브르등(DNA 2(1983)37)에 의해 보고된 돼지 성장 호르몬의 아미노산 배열 순서에 의거하여 본 발명자들은 효모 세포에서 선택적으로 사용되는 아미노산 코오돈으로 돼지 성장 호르몬 염기서열을 바꾸면서 동시에 자연상태에서 존재하는 성숙형 성장 호르몬중 아미노말단이 알라닌이 되도록(LI, C. H. etal J. Biol. chem 203. 419-424)전체 유전자를 유전자 합성기(Applied Biosystem Model 380B, USA)로 포스포 라미티드 방법에 의하여 화학합성하였고, 제 2b 도에서 나타냈듯이 이들 합성 올리고 뉴클리오티드를 접합시키고 대장균 운반체인 pUC18[Norrander 등 gene 36(1936)101-106]에 클로닝하여 전체 돼지 성장 호르몬 유전자 579 염기쌍중 일부 아미노 말단 부위가 없는 돼지 성장 유전자 절편 Sac I/ Sal I 제한효소 절편 552염기쌍을 포함하는 운반체 pPGH(552) 를 제조하였다. 전체 돼지 성장 호르몬을 가지고 있는 유전자 클론을 제조하고 또한 효모내 발현을 위하여 효모 프로모터의 터미네이터 유전자를 가지고 있는 운반체 pPGAP[Clontech Lab, Palo Alto, CA 94303, U.S.A. Holland, J.P ＆ Holland, M.J.J. of Biological Chemistry 255, 2596-2605(1980) Bitter, G.A ＆ Egan, K.M Gene 32, 263-274(1984) 20B-12. Zhu, X -L.et al. Mol. Gen. Gunet 194,31-41(1984)ATCC 34025]의 Nco I과 Sal I위치에 제한효소 인지부위와 시작 코오돈 그리고 아미노 말단 부위에 해당하는 몇개의 아미노산 코돈을 화학 합성하여 pPGAP-PGH(579)을 얻었다. (실시예 3참조)
이 pPGAP-PGH(579)으로부터 BamHI 을 처리하여 프로모터와 돼지 성장 호르몬 유전자 및 터미네이터를 포함하는 BamHI 절편(약 1970염기쌍)을 분리하여 대장균과 효모에서 자발적으로 복제할 수 있는 효모용 발현 운반체 pC1/1[ATCC 37115 Brake 등 Proc. Natl. Acad. Sci USA 81(1984), 4642]의 BamHI 부위에 삽입시켜 pC1/1-PGH 를 제조하였다.(제 5 도)
이 발현운반체를 힌넨(Hinnen)등의 방법에 의해 효모균주 2130-2,3[Yeast Genetic Stock Center, Broach, J.R. ＆ Hicks, J.B. Cell 21, 501(1980)]에 프로토 플라스트 형질전환시킨 후 형질전환된 효모세포를 실시예 5에서와 같이 2%포도당이 함유된 와이피디(YEPD)배지에서 24시간 배양하여 돼지 성장 호르몬이 세포의 성장과 함께 생성되도록 하여 리터 배양당 200㎎의 돼지 성장 호르몬을 얻을 수 있었다.
본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
[합성 돼지 성장 호르몬 올리고 뉴클리오티드의 접합(Ligation)및 운반체 pUC18 으로의 클로닝]
합성 올리고머들로부터 돼지 성장 호르몬 전체 유전자를 얻기 위해 제 1 도에서 도시한 전략으로 제한 효소 Sac I, Sal I 및 Xba I 등이 유일하게 존재하는 운반체 pUC18을 사용하였다.
즉, 전체 합성 올리고 뉴클리오티드중 카복시쪽의 Xba I 과 Sal I 절편에 속하는 올리고 뉴클리오티드 (U7-U14/L8-L14)를 각각 260㎚에서 흡광도가 0.05되도록 취한 뒤 각각을 건조시키고 전체부피, 30㎕에 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM ATP, 1mM DTT, 10mM MgCl2의 완충액 조건하에 T4폴리뉴클레오티드키나제(Polynucleotide Kinase) 4unit 를 가하여 37℃에서 30분간 반응시켜 올리고 뉴클리오티드의 5'- 말단을 인산화시킨 후에 이들을 전부 모아 같은 부피의 페놀과 클로로포름을 처리한 후 에탄올로 침전시킨 다음 완충액(60mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM DTT, 10mM MgCl2) 53㎕에 녹이고 95℃수조에 놓은 후 이를 온도가 서서히 내려가도록 상온에서 6시간 동안 방치하여 각각의 올리고 뉴클리오티드들이 서로 상보적인 가닥들로 염기쌍을 형성하도록 한뒤 여기에 20unit 의 T4DNA리가제와 10mM ATP 5㎕를 가하여 상온에서 10분 동안 올리고머의 5' 말단과 3'말단들을 연결시킨 후 다시 페놀과 클로로포름을 처리 및 에탄올로 침전시켰다.
침전시킨 핵산을 60mMTris(pH 7.6), 10mM MgCl4, 100mM NaCl이 있는 완충액 조건하에 우선 제한 효소 Xba I 과 Sal I을 각기 10units씩 가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그리고, 이들 반응액을 7% 폴리아크릴 아마이드겔 전기영동을 시킨 후 겔에서 200-300염기쌍에 해당하는 부분을 절단시켜 전기용출(Electro elution)한 후 에탄올 침전시켜서 다시 20㎕의 증류수에 녹였다.
이 핵산 3㎕와 제한효소 Xba I과 Sal I로 절단된 운반체 pUC18(10mg) 을 접합반응조건 (60mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM DTT, 10mM Mgcl2, 1mM ATP, 10units T4DNA ligase)하에서 14℃에서 16시간 접합반응시켰다. 이어서 접합 반응액에 E.coli JM103[BRL, U.S.A. Messing, J. (1983)101, 99, 20-78 Methods in Enzymology]컴피턴트 세포를 가하여 하나한(Hanahan)방법(J.Mol. Biol 116, 557(1983))에 따라 형질전환시킨 후 37℃에서 하룻밤 숙성시킨 다음 하얀 콜로니를 바른 보임과 돌리방법(Nucleic Acid Res 7,1513(1970))으로 재조합된 운반체 p3'-PGH 을 지닌 콜론을 선별하였다.
한편 전체 돼지 성장 호르몬중 5'말단 부위의 Sac I -Xba I 제한효소 절편에 해당되는 올리고 뉴클리오티드들도 상기 언급한 동일 방식으로 접합시켜 제한효소 Sac I, Xba I으로 절단된 p3'-PGH 에 클로닝시켜 제 3 도에서와 같이 pPGH(552)를 제조하였다.
이어서 이들을 생거의 다이디옥시 시퀴엔싱(dideoxy segueucing)방법으로 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5473-5477)염기배열 순서를 확인하였다. (제 4 도)
[실시예 2]
[합성 돼지 성장 호르몬 유전자의 효모세포내 발현을 위한 유전자 조작]
pPGH(552)는 돼지 성장 호르몬 전체 유전자중 5' 부문 9개의 아미노산이 없는 상태이므로 전체 유전자를 클로닝하기 위하여 그리고, 효모세포내에서 발현시키기 위하여 5'말단 결여 부분을 유전자 합성기를 통하여 합성하였다. 합성은 제한효소 Nco I 의 인지부위를 포함하여 시작코돈 및 8개의 아미노산에 해당하는 코돈을 효모세포에서 주로 사용되는 코돈으로 합성하였으며, 최종적으로 Sac I 인지부위를 만들어 넣었다. (제 5 도 참조)
이들의 클로닝 과정은 다음과 같다.
pPGH(552)로부터 Sac I과 Sal I을 처리하여 552염기쌍에 해당하는 제한효소 절편을 아가로스 전기영동을 통하여 분리해내고 이를 효모의 프로모터와 터미네이터를 포함하는 운반체 pPGAP의 Nco I와 Sal I사이에 상기 설명한 합성 연결체와 함께 삽입하였다. 곧, 합성 연결체 각각을 실시예 1에서와 같이 T4폴리 뉴클레오티드키나제로 5'말단을 인산화시켰으며, 인산화 반응액 각각 1㎕와 분리된 돼지 성장 호르몬의 SacI/Sal II 절편 3㎕(30ng)와 Nco I 및 Sal I으로 절단된 운반체 pPGAP 1㎕(7ng)을 가하여 65℃에서 15분동안 방치하고 상온에서 서서히 냉각함으로써 단일 가닥의 상보적인 합성 연결체들이 서로 이중 나선구조를 형성토록 한뒤에 다시 10mM ATP 2㎕, 10배 농축된 접합반응 완충액 2㎕ , 리가제 1㎕ 및 증류수 8㎕ 를 가해 14℃에서 16시간 반응시켰다.
그후 실시예 1에서와 같은 방법을 대장균 세포 HB101[ATCC 37017]에 형질전환시켜 효모내 발현을 위한 프로모터와 돼지 성장 호르몬 전체 유전자 및 터미네이터를 포함하는 pPGAP-PGH를 제조하였다.
효모내 발현을 위한 pPGAP 운반체는 세포의 성장과 함께 발현되는 구성(Constitutive)프로모터인 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 프로모터와 터미네이터를 가지고 있는 운반체이다. pPGAP-PGH로부터 BamHI을 처리하여 글리세르알데히드-3'-인산 디하이드로 게나제의 프로모터와 돼지 성장 호르몬 유전자 및 글리세르 알데히드3'-인산 디하이드로 게나제의 터미네이터가 포함된 1970 염기쌍 정도의 절편을 분리하고 이를 효모 세포내에서 복제할 수 있는 발현용 운반체 PC1/1 의 BamHI 부위에 삽입시켜 Pcl/1-PGH 를 제조하였다.(제 5 도).
이 PC1/1-PGH 유전자 10μg을 힌넨[Proc Nacl. Acad, Sci, USA 75(1978), 1929]의 방법에 따라 효모균주 2130-2,3에 프로토클라스트(Protoplast)형질전환시키고 루이신 결핍 아가 플레이트(리터당 6.7g Yeast Nitrogen Base without amino acid,(182G sorbitol.2% glutose, 0.25g Leu-deficient supplements, 20g Bactoagar)에 플레이팅하여 30℃에서 5일간 배양후 자라난 콜로니를 이용 돼지 성장 호르몬의 생성을 실시예 3에서와 같이 점검하였다.
[실시예 3]
[돼지 성장 호르몬 생산을 위한 효모 배양 및 동정]
운반체 PC1/1-PGH로 형질전환된 효모균주들을 각각 3ml루이신 결팝 배양액(ℓ배양액당 6.7g Yeast Nitrogen Base without amino acid, 0.25g Leu-deficients supplements, 6% glucose)에서 24시간 30℃에서 배양시킨 후 이를 100ml YEPD 배양액 (2% Pepton, 1% Yeast extract, 2% glucose)에 접종한 후 30℃에서 24시간 배양하였다.
이때 최종 흡광도는 650nm에서 40정도였으며, 여기서 ml당 10O.D를 취하여 원심분리시키고 400㎕ 완충액 10mM Tris-Hcl, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 8M UREA에 용존시키고 같은 부피의 직경 0.45㎜의 유리구슬을 가하여 강하게 진탕시켜 세포벽을 파괴하여 완충액을 돼지성장 호르몬이 용출되도록 한 뒤 4㎕의 용출액을 12.5% SDS폴리아크릴 아마이드겔 전기영동시켰다. 그 를 제 6 도에 나타냈으며, 여기서 레인 8은 표준단백질이고, 레인 1.5는 돼지 성장 호르몬 유전자가 없는 효모세포( PCI/I자체로 형질전환된)에서의 전체 단백질이며, 레인 2-4는 돼지 성장 호르몬을 생산하는 PC1/1-PGH로 형질전환된 효모세포의 전체 단백질을 전기영동한 사진이다.
제 6 도 레인 2-4에서 알 수 있듯이 22,000달톤 정도되는 부분에서 돼지 성장 호르몬이 전체 단백질의 10% 정도에 해당되는 양으로 생성됨을 젤 스캐닝 결과 알 수 있었다.
그리고 돼지 성장 호르몬을 순수 분리한 뒤 아미노산 배열을 동정한 결과 메타이오닌이 아미노 페티다아제에 의해 잘려 나간 알라닌으로부터 시작되는 성숙형 돼지 성장 호르몬이었다.
Claims (2)
- 돼지 성장 호르몬의 아미노산 배열 순서에 따라 효모에서 선택적으로 사용되는 코돈 및 Sac I, Xba I 및 Sal I의 인지부위가 존재하는 올리고 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 접합전략에 따라 접합시켜 합성올리고 뉴클리오티드의 카복시쪽 Xba I/Sal I 절편을 Xba I/Sac I으로 처리한 대장균 운반체(pUC18)에 클로닝한 다음 이를 Sac I/Xba I으로 처리하여 합성 올리고 뉴클리오티드의 아미노쪽 Sac I/Xba I 절편을 클로닝시켜 아미노 말단의 일부가 없는 돼지 성장 호르몬 유전자를 제조한 다음 이 유전자를 아미노말단 합성유전자와 함께 프로모터와 터미네이터가 있는 대장균 운반체에 클로닝하여 프로모터-전체 돼지 성장 호르몬 유전자-터미네이터의 카세트를 제조한 다음 이를 효모발현 운반체에 재클로닝시켜 최종 효모발현 운반체를 만들어 이를 효모내에서 발현시킴을 특징으로 하는 돼지 성장 호르몬의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 아미노 말단 합성 유전자는 Nco I 인지부위 및 Sal I 인지부위가 존재하는
임을 특징으로 하는 돼지 성장 호르몬의 제조방법.
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