KR920002315B1 - 뉴클레오티드 암호서열 또는 아미노산 서열중 적어도 일부분이 알려진 단백질 또는 펩티드에 대한 상보성 폴리펩티드 및 이것의 디자인방법 - Google Patents
뉴클레오티드 암호서열 또는 아미노산 서열중 적어도 일부분이 알려진 단백질 또는 펩티드에 대한 상보성 폴리펩티드 및 이것의 디자인방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 암호정보를 갖고 있는 뉴클레오티드 가닥과 이것과 역평행으로 염기쌍이 형성된 상보성 뉴클레오티드 가닥 또는 비암호 뉴클레오티드 가닥에 의해 정의된 아미노산들의 수치적 스코어(hydropathic scores)의 관계를 그래프로 도시한 도.
제2도는 암호 뉴클레오티드 가닥과 이것에 대해 역평행으로 염기쌍을 형성하는 비암호 뉴클레오티드 가닥에 의해 암호된 아미노산들의 수치적 스코어 관계를 그래프로 도시한 도.
제3도는 HTCA(ACTH에 대한 상보성 펩티드) 또는 인슐린이 피복된 마이크로타이터(microtiter) 웰에 대한 유리 상태의 ACTH의 결합을 그래프로 도시한 도.
제4도는 HTCA(3.7nmol/웰)로 각각 피복된 마이크로타이터 웰에 대한 ACTH의 결합정도를 그래프로 나타낸 도.
제5도는 HTCA에 대한 항체(안티-HTCA)가 고정된 마우스의 부신(Y-1)세포에 대해 결합하는 정도와 이 결합을 억제하는 ACTH에 의한 억제정도를 그래프로 도시한 도.
제6도는 사전에 안티-HTCA에 결합된 마우스 부신(Y-1) 세포 성분들을 겔 크로마토그래피하여 얻어진 용출물을 그래프로 도시한 도.
제7도는 소의 감마 엔도프핀에 대해 상보적인 뉴클레오티드 가닥에 의해 암호된 펩티드(감마-odne), 400㎍/웰 : 인슐린, 20유니트/웰 : 또는 소의 혈청 알부민(BSA), 200㎍/웰로 피복된 마이크로 타이터 웰에 가해진 여러 가지 용량의 감마(γ)-엔도르핀의 결합도를 그래프로 도시한 도.
제8도는 상피세포 생장인자(EGF), EGF 수용체의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 도시하고 있다. EGF 수용체의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열과 이 상보성 뉴클레오티드 서열을 3'-5' 방향으로 해독할 때 이 서열에 의해 암호된 아미노산 서열을 나타낸 도.
제9a와 9b도는 펩티드 호르몬[EGF, 인터로이킨-2(IL-2) 및 트랜스페린(TF)] : 펩티드 호르몬 수용체[EGF 수용체, IL-2 수용체 및 TF 수용체] : 상기 수용체들에 대한 상보적인 메세지의 뉴클레오티드서열 및 아미노산 서열을 도시한 도.
본 발명은 구조적으로 특이하며 생물학적 활성과 생물학적 친화력을 갖는 폴리펩티드의 구조를 결정하는 방법에 관한 것이다.
현재 약제를 제조하기 위한 체계적 방법은 의학분야의 약물학자들이 화학적 차원에서 특정 약물제제의 구조 및 작용 활성에 대한 지식을 근거로 해당 약물제제의 활성을 추론하는 것으로부터 개시된다. 이와 같은 지식은 구조적으로 모체 화합물에 관련되어 있으나, 신규의 약학적 특성 또는 작용을 나타내는 신규의 약제를 디자인하는데 특히 유용하다.
예를 들면, 스테로이드 생화학 및 디자인 분야에 있어서, 여러 가지 스테로이드의 구조가 향상된 또는 특이화된 작용을 제공하도록 여러 가지 방법에 의해 변형되어왔다. 체계적인 약물 디자인에 관한 다른 예는 합성 페니실린의 의학화학분야에서 찾을수 있다 : 현재 비합성 페니실린이 갖고있지 않은 수많은 작용에 나타내는 합성페니실린이 디자인되었다. 합성페니실린에 의해 페니실리나제를 생산하는 박테리아에 대한 활성, 광범위 활성도, 구강내 활성등이 개선되었다.
그러나, 단백질과 같은 거대분자구조물의 구조/작용활성에 관하여 알려진 바는 거의 없다. 예를 들면, 항체가 항원에 결합한다는 사실은 알려져 있지만, 그 근본적인 상호 인력 작용은 완전히 이해되지 않고 있다.
더군다나 항원에 결합할수 있는 항체형태의 단백질을 생산하는 항원공격에 대한 반응의 근본 메카니즘에 관해서는 알려진 것이 거의 없다.
또한, 펩타이드 호르몬과 이들 호르몬 수용체와의 상호작용도 완전히 이해되고 있지 않다. 펩타이드 호르몬과 그의 수용체간에 결합친화도가 있으며, 상기 수용체를 ＂자극＂하는 상기 결합된 호르몬의 고유활성에 의해 해당 호르몬의 활성이 나타난다는 것은 공지된 것이다. 비단백질성 호르몬의 공지된 구조/작용관계로부터, 결합친화도와 고유자극활성이 별개의 구조적 관계를 지니고 있음을 알수 있다. 예를 들어 호르몬과 같은 리간드를 그 수용체에 결합시키기 위해 특정 화학적 구조가 존재한다. 그러나 일단 호르몬이 그 수용체에 결합한 후에는 그 수용체를 ＂자극＂시키기 위해 또 다른 화학적 구조가 존재한다.
결합활성은 지니고 있으나, 고유의 자극활성은 지니고 있지 않은 반응제는 원래의 호르몬의 작용을 차단한다는 점에서 ＂차단제＂ 또는 길항제(antagonists)로 명명된다. 이러한 차단제의 예로는 이소프로테레놀이 있는데, 이것은 널리 알려진 카테콜라민 베타-차단제로서 카테콜라민과 이들 수용체간의 구조/기능 관계를 근거로 하여 디자인된 것이다. 또한 호르몬 수용체에 결합하여, 그것을 활성화시키는 효능제(agonists) 생산되었다. 폴리펩티드 호르몬에서 상기와 같은 구조/작용 관계가 완전히 알려진 것은 아니다. 따라서 현재 특정 단백질 호르몬 수용체 또는 특정 폴리펩타이드 호르몬과 특이하게 상호반응할수 있는 폴리펩타이드의 체계적인 디자인을 가능케하는 방법은 없다.
완전한 면역시스템을 갖고 있는 유기체는 면역글로불린으로 알려진 특이화된 단백질 부류를 생산할 수 있는 생물학적 능력을 소유하고 있다. 면역글로불린은 유기체에 대해 이질성이 있는 외래 분자의 존재에 대한 반응으로 면역경쟁 유기체의 특이화된 세포에 의해 생산된다. 이러한 외래 분자를 일반적으로 항원이라한다. 항원은 해당 유기체내에서 상보적인 항체 형성을 유발할수 있는 분자로 정의된다. 이렇게 형성된 특이항체는 당해 항체형성을 자극하는 항원에 결합할수 있다. 특이항체의 생물학적 기능은 외래 항원을 결합하여, 그 항원을 불활성화시키는 것이다.
과학자들은 치료 및 진단의학에 유용한 것으로 입증된 다양한 항체를 제공하기 위해 여러가지 유기체의 면역시스템을 조작하는데 성공했다. 이들은 최근에 하이브리도마 기술의 비약적인 발전으로 인해 항원 결정기(determinant)라 명명된 선택된 분자구조에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 개가를 올렸다. 이러한 특이항체의 이용도는 광범위하다. 즉, 암을 정복하는데 중요한 역할을 하는 임상적 실험으로부터 혈액검사를 통한 수많은 질병상태의 검진에까지 사용된다.
항체기술에 있어서 다분히, 이론적 적용분야이기는 하나, 흥미로운 분야는 항-이디오타입(antiidiotype) 항체 분야이다. 항-이디오타입 항체는 일차항체의 이디오타입 부위 또는 결합부위에 대해 결합능을 갖는 이차항체이다. 이러한 항-이디오타입항체는 일차항체가 결합하는 항원과 공통된 특성을 나타낸다. 예를 들면, 인슐린에 대한 항체를 생성하고, 그후 항-인슐린 항체에 대해 지시된 항-이디오타입 항체를 생성한다면, 상기 항-이디오타입 항체 일부(이디오타입)는 인슐린과 비슷한 특성을 나타낼 것이다. 이와 같은 발견은 항체의 3차원적 네가티브-이미지이며, 따라서 1차 항체에 대한 항-이디오타입 항체는 원래의 항원의 포지티브 이미지라는 이론을 기정화한 것이다. 상기 사실로부터 만일 상기와 같은 상호작용성구조물이 디자인되어 생성된다면, 생물학적 활성물질, 예를 들면 신규하고 유용한 활성을 나타내는 폴리펩티드 호르몬 또는 그의 수용체가 개발될 수 있음을 알수 있다.
항체기술이 급속히 발달하고 있긴 하지만 적어도 기본적인 기술적 한계는 남아있다. 예를 들면 과학과 의학은 여전히 항체를 생산하기 위해 항체-생산성 세포에 의존하고 있다. 그러므로 과학자는 과도한 항체 생산을 직접 조절할 수가 없다. 직접 조절을 할 경우 상당한 잇점이 있다. 상기와 같은 항체기술의 발달로 단순히 선택된 분자뿐 아니라 그 분자의 사전선택된 부위와 특이적으로 상호작용 또는 그 부위에 특이하게 결합할수 있는 인조 ＂항체＂생산이 가능해졌다. 항체와 상호인력 작용에 관한 기본적인 이론은 아직 완전히 밝혀지지 않고 있다.
전술된 설명으로부터 항체-생산성 세포는 항원의 화학구조를 인지하여, 항체형태의 상보적은 화학구조를 제공하는 메카니즘을 지니고 있다는 것이 명백해졌다. 상기와 같은 상보성(complementarity)은 항원성 구조에 결합하는 능력을 나타낸다. 본 발명의 기술이 출현하기 이전에는, 다른 단백질 구조물에 대해 상보적인 특성을 지니고 있어 그 단백질 구조물과 결합할 수 있는 단백질 구조물을 디자인하거나, 작제하기 위해서는 결합현상을 설명하는 화학적 상호작용에 대해 지식이 반드시 필수적인 것이었다.
모든 단백질 또는 펩티드는 일차적으로 단량체 아미노산 유니트의 중합체들이다. 일반적으로 20개의 이종아미노산이 있으며, 이들은 각각 상이한 구조를 지니기 때문에 물리화학적 특성이 서로 다르다. 예를 들면, 어떤 아미노산은 소수성인데 비하여, 다른 아미노산은 친수성이다. 또한, 어떤 아미노산은 특정 아미노산을 끌어당기는 경향이 있는데 비해, 또 다른 아미노산은 배척한다. 그러므로, 해당 단백질 내에는 그 단백질을 구성하고 있는 각각의 아미노산에 의해 나타난 다양한 인력과 척력이 존재한다. 주어진 단백질의 아미노산들 사이에 존재하는 상기의 상호적힘외에도 상기 아미노산과 이것을 둘러싸고 있는 환경사이에도 상호적인 힘들이 존재한다. 후자의 힘은 단백질 잔기들이 수성 또는 친수환경, 또는 비수성 또는 소수성 환경에 있는지의 여부에 의존한다.
주어진 단백질의 아미노산에 의해 나타난 상호적인 힘은 단백질의 3차 구조 또는 ＂원＂구조를 결정하는데 중요한 인자이다. 그러므로, 단백질내의 어떤 부위는 동일한 단백질의 다른 부위와 결합하는 반면 또는 어떤 부위는 단백질내의 어떤 부위를 배척한다. 이와 같은 힘에 의해 각각의 단백질은 특징적인 형상을 갖게 되고, 따라서 그 작용활성이 부여되게 된다.
최근에, 상대친수성과 소수성을 반영하는 수치법(水治法) (hydropathy)이라는 용어로 아미노산의 특성을 규명하는 수단이 개발되었다.(Kyte et al. (1982) J.Molec, Biol. Vol. 157, pp 105-132). 수치법 스케일은 20개의 아미노산 측쇄 각각의 친수성 및 소수성특성을 고려하여 얻어졌다. 컴퓨터 프로그램을 사용하여 소정의 길이를 갖는 폴리펩타이드 서열내의 평균 수치법을 연속적으로 결정하였다. 이 연구결과 단백질은 뚜렷히 구분되는 소수성 부위와 친수성 부위를 가지고 있음을 밝혀냈으며, 또한 그 분자내의 상기 부위들의 상호작용뿐 아니라 내부 디설파이드 결합에 의해 해당 단백질 분자의 3차원 구조를 설명할수 있음이 입증되었다.
최근 연구결과 친수성 및 소수성 아미노산과 이들 부위를 포함하는 양쪽성 단백질 구조물이 단백질 호르몬 및 이들 수용체의 활성을 유지시켜주는 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다(Kaiser et al (1984) Science Vol. 233 pp 249-255). 또한 이 연구는 호르몬 수용체내의 양쪽성 구조부는 호르몬 그 자체내의 양쪽성 구조부의 거울상으로서 상보성이 있음을 제안하고 있다. 그러므로 호르몬과 이들 수용체사이의 상호작용은 호르몬의 양쪽성 구조부와 그 수용체의 상보적 양쪽성 구조물부 사이의 특이한 상호작용에 의해 매개될수 있다. 이러한 개념이 도입될수 있는 한가지 방법은 자물쇠와 열쇠의 모델개념을 생각하는 것이다. 즉, 자물쇠 배열은 수용체의 양쪽성 구조부를 나타내며, 열쇠 배열은 호르몬제의 상보적인 양쪽성 구조부를 나타낸다.
따라서, 공지된 펩티드, 단백질 또는 단백질성 수용체와 상호작용을 일으키거나, 또는 이들과 결합할수 있는 폴리펩티드를 체계적으로 디자인하는 방법은 매우 이용가치가 높다. 예를 들면, 단백질성 호르몬의 수용체-상호 작용성 구조물의 디자인에 관한 실제적인 지식으로부터 특이활성도가 매우 큰 합성 호르몬의 신규 부류를 개발할 수 있다. 역으로, 공지된 단백질성 호르몬에 상보적이며, 상기 호르몬에 결합할수 있는 폴리펩티드를 디자인하고 생산할수 있다. 이렇게 디자인된 폴리펩티드는 상보적인 호르몬을 불활성시키는데 이용된다.
단백질 또는 펩티드 디자인에 대한 상기 지식은 과학연구분야에 있어 매우 중요함이 입증되었다. 예를 들면, 단백질 호르몬에 대해 상보적인 합성폴리펩티드가 구조적으로 상기 호르몬에 대한 생물학적 수용체와 유사하다면, 상보적인 단백질에 대해 지시된 항체 또한 원래의 호르몬 수용체에 결합해야 한다. 이러한 항체는 특이 호르몬 수용체 또는 이것의 일부를 분리 연구하는데 유용하며, 이것은 호르몬과 수용체간의 상호 작용을 보다 많이 이해하는데 도움을 준다. 또한 특정 단백질에 상보적인 합성 단백질 또는 펩티드는 X-레이크리스탈로 그래피를 통한 단백질 구조를 증명하기 위해 상기 단백질을 결정화시키는데 유용하다. 또한, 천연 상태에 발견되어 때로 섭취되는 독성 펩티드에 특이적으로 단단히 결합하는 해독성 폴리펩티드를 디자인할 수 있을 것이다.
상기에 예시한 것은 합성 단백질 또는 펩티드 디자인 개발이 가능한 수많은 가능성 범위중 몇예에 불과하다. 공지된 단백질에 결합하거나 또는 이들과 상호작용하는 폴리펩티드를 체계적으로 디자인 할수 있다면(이 디자인과정은 공지된 단백질의 구조적인 면을 기초로 가능하다) 이는 펩티드 및/또는 화학, 의학 분야에 있어 비약적인 발전이라 하겠다.
본 발명의 이해를 돕기 위해서 하기의 용어가 정의된다.
핵산 쌍(짝)과 관련하여, ＂역평행(antiparallel)이라는 용어는 짝지어진 핵산에 대한 방향성을 의미한다. 원형(original) 핵산은 5'-3' 방향으로 존재하며, 여기서 5'와 3'는 뉴클레오티드 커플링에 포함된 당(sugar) 부분상의 위치를 뜻한다. 상기 원형 핵산가닥에 상보적인 또는 그것과 염기 쌍이 형성된 이차 핵산 가닥(=스트랜드)은 3'-5' 방향(5'-3' 방향성을 갖고 있는 상기 원형과 함께 선형으로 배열된 경우)으로 위치하고 있다.
암호 핵산은 5'-3' 방향으로 해독(解讀)될 때 아미노산의 서열을 규정짓는 뉴클레오티드 트리플렛(코돈)의 서열을 포함한다. 비암호(상보성) 핵산(또는 핵산가닥)은 상기 암호 핵산(또는 핵산가닥)에 대해 상보적이며, 상기 가닥들은 역평행방향으로 놓여있거나 또는 역평행방향으로 염기가 짝지워져 있다.
아미노산의 수치적 스코어(소수성과 친수성의 상대적 측정치)와 관련하여, 수치적 상보성이란 높은 수치성에 낮은 수치성이 상응함을 의미하며, 이 역도 성립한다.
아미노산을 함유하는 구조물에 있어서, 이들은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질(이 순서는 디펩티드, 올리고펩티드, 그리고 수백의 아미노산을 함유하는 단백질간의 크기 증가에 의한 것임)로 명명된다.
본 명세서에서 사용되는 상보성 또는 보체(complement)란 문맥상의 용법에 따라 여러의미를 지닌다. 예를 들면, 상보적 염기 또는 뉴클레오티드는 수소결합을 특징적으로 형성하는 것(G-C,A-T 또는 A-U)들이며, 상보성 코돈 핵산 또는 이것의 가닥은 이중핵산 가닥을 구성하고 있는 이중나선형의 수소 결합된 폴리뉴클레오티드 성분들로서, 예를 들면 수치적 상보성을 갖는 상보적인 아미노산들을 1쌍의 상보성 코돈들에 의해 암호된다.
상보성 펩티드 또는 폴리펩티드와 이들의 관련된 원형 펩티드 또는 단백질은 상보성 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 의해 암호된 한쌍의 펩티드이며, 상기 1쌍의 멤버들간에는 특징적인 결합 친화도를 지니고 있다. 펩티드 또는 단백질의 적어도 일부에 대해 상보적인 폴리펩티드는 상기 펩티드 또는 단백질 일부에 대하여 결합 친화도를 지니고 있다. 펩티드 결합 친화도가 완전히 이해되고 있지 않지만, 이 친화도는 Kaiser et al(Science(1984) Vol. 223 pp. 249-255)에 의해 기술된 양쪽성 이차 구조 개념에 의해 부분적으로 설명할수 있다.
원형 펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 대해 상보적인 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법은 종래에는 개시된 바 없다. 이 방법은 다음을 포함한다 : (a) 상기 원형 펩티드 또는 단백질의 적어도 일부를 생합성할수 있도록 코오딩된 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열을 규명하고, (b) 상기 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열과 염기쌍을 형성하는 제2뉴클레오티드 서열을 결정하고(이때 상기 제1 및 제2핵산은 역평행 방향으로 짝지워진다) : (c) 상기 제1뉴클레오티드 서열과 동일한 리딩 프레임(reading frane)으로 해독시 상기 제2뉴클레오티드 서열에 의해 생성되서 상보성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정한다.
이렇게 결정된 아미노산 서열을 갖는 상기 상보성 폴리펩티드는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 화학합성, 상기 아미노산 서열을 함유한 단백질 또는 더 큰 폴리펩티드로부터 유도하는 방법, 또는 상기 제2핵산이 DNA인 경우, 상기 제2 뉴클레오티드 서열을 플라스미드내에 삽입시켜 재조합 DNA 플라스미드 벡터를 만들고, 단세포 유기체를 상기 벡터로 형질전환시켜, 상기 상보성 폴리펩티드를 생합성하는 형질전환체인 단세포 유기체를 제조하는 방법등이다.
본 발명은 공지된 아미노산 서열을 갖고 있는 선택된 펩티드 구조물과 특이적으로 상호작용할수 있는 폴리펩티드의 디자인 방법 및 제조방법에 관한 것이다.
제1도는 암호정보를 갖고 있는 뉴클레오티드 가닥과 이것과 역평행으로 염기쌍이 형성된 상보성 뉴클레오티드 가닥 또는 비암호 뉴클레오티드 가닥에 의해 정의된 아미노산들의 수치적 스코어(hydropathic scores)의 관계를 그래프로 도시한 것이다. 각 가닥의 트리플렛 뉴클레오티드 코드는 5'-3' 방향으로 해독된다. 암호된 아미노산들의 수치적 스코어를 상보적으로 암호된 아미노산의 평균 수치적 스코어에 대해 도면화하였다.
제2도는 암호 뉴클레오티드 가닥과 이것에 대해 역평행으로 염기쌍을 형성하는 비암호 뉴클레오티드 가닥에 의해 암호된 아미노산들의 수치적 스코어 관계를 그래프로 도시한 것이다. 암호 가닥의 트리플렛 뉴클레오티드 코드는 5'-3' 방향으로 해독되는 반면, 비암호가닥 코드는 3'-5'으로 해독되었다. 암호된 아미노산들의 수치적 스코어를 상보적으로 암호된 아미노산들의 수치적 스코어에 대하여 도면화했다.
제3도는 HTCA(ACTH에 대한 상보성 펩티드) 또는 인슐린이 피복된 마이크로타이터(microtiter) 웰에 대한 유리 상태의 ACTH의 결합을 그래프로 도시한 것이다. 결합된 ACTH는 효소-결합된 면역흡착분석법에 의해 측정되었다.
제4도는 HTCA(3.7nmol/웰)로 각각 피복된 마이크로타이터 웰에 대한 ACTH의 결합정도를 그래프로 나타낸 것이다. 각각의 ACTH 첨가물은 3.7mmol의 용해성 ACTH를 포함하며, 횡좌표상에 표시된 일정량의 용해성 HTCA와 사전 혼합되었다. 결합된 ACTH는 효소-결합된 면역흡착 분석법에 의해 측정되었으며, 유리상태의 ACTH는 전체 ACTH 및 결합된 ACTH 사이의 차감값으로 계산되었다.
제5도는 HTCA에 대한 항체(안티-HTCA)가 고정된 마우스의 부신(Y-1)세포에 대해 결합하는 정도와 이 결합을 억제하는 ACTH에 의한 억제정도를 그래프로 도시한 것이다.
제6도는 사전에 안티-HTCA에 결합된 마우스 부신(Y-1) 세포 성분들을 겔 크로마토그래피하여 얻어진 용출물을 그래프로 도시한 것이다.
제7도는 소의 감마 엔도프핀에 대해 상보적인 뉴클레오티드 가닥에 의해 암호된 펩티드(감마-odne), 400㎍/웰 : 인슐린, 20유니트/웰 : 또는 소의 혈청 알부민(BSA), 200㎍/웰로 피복된 마이크로 타이터 웰에 가해진 여러 가지 용량의 감마(γ)-엔도르핀의 결합도를 그래프로 도시한 것이다.
제8도는 상피세포 생장인자(EGF), EGF 수용체의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 도시하고 있다. EGF 수용체의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열과 이 상보성 뉴클레오티드 서열을 3'-5' 방향으로 해독할 때 이 서열에 의해 암호된 아미노산 서열을 나타내었다. EGF 및 EGF 수용체의 서열에 있어서, 적은 번호로 표시된 위치가 5' 뉴클레오티드 방향인 동시에 아미노-말단 아미노산 방향이다. EGF 수용체에 대한 상보성 정보를 지닌 서열에 있어서, 적은 번호로 표시된 위치는 3' 뉴클레오티드 방향이며, 아미노 말단아미노산 방향이다. 상동성 서열은 박스로 나타내었다.
제9a와 9b도는 펩티드 호르몬[EGF, 인터로이킨-2(IL-2) 및 트랜스페린(TF)] : 펩티드 호르몬 수용체[EGF 수용체, IL-2 수용체 및 TF 수용체] : 상기 수용체들에 대한 상보적인 메세지의 뉴클레오티드서열 및 아미노산 서열을 도시하고 있다. 펩티드 호르몬과 수용체 서열에 있어서, 적은 번호로 표시한 위치는 5' 뉴클레오티드 방향과 아미노-말단 아미노산 방향을 나타낸다. 상보적인 메시지의 서열에 있어서, 적은 번호로 표시된 위치는 3' 뉴클레오티드 방향과 아미노-말단 아미노산 방향을 나타낸다. 상보성 뉴클레오티드는 3'-5' 방향으로 해독되어 그에 상응하는 아미노산 서열을 제조했다.
생물학적으로 중요한 분자들간의 상호작용은 세포사이 및 조직사이의 교신(communication)을 기본으로 한 것이다. 생물학적으로 특히 중요한 교신용 분자가 펩티드 호르몬 및 이것을 위한 펩티드-함유 세포 수용체인 경우, 그들의 교신에 관한 상호작용을 논리적으로 설명하고, 그 이론을 체계화하려는 노력이 행해져 왔다.
상술된 것처럼 핵산으로 구성된 역평행성 염기-쌍 가닥들 사이에 잘 알려지지 않은 기본적인 관계가 있음이 밝혀졌다. 한가지점에서, 이러한 관계에 의해 펩티드의 쌍들이 생성되며 여기에서 특정쌍의 한 멤버는 다른 멤버에 대해 친화성을 가지고 있다. 기본적인 관계는 표 1 설명된 바와 같으며, 여기에 다양한 코돈과 이들의 상보성(즉 염기 쌍을 형성하는) 코돈이 나타나 있다. 암호 가닥(즉, 아미노산 서열을 나타내는 암호정보를 갖는 가닥)의 코돈은 왼쪽에서 오른쪽으로 해독된다(5'-3' 방향).
역평행로 염기가 쌍을 형성하는 상보성(비암호) 가닥의 코돈 또한 5'-3' 방향으로 해독된다. 비암호 및 암호핵산 가닥들은 역평행 방향(암호가닥은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'-3'이며 : 비암호 가닥은 왼쪽에서 오른쪽으로 3'-5' 방향이다)으로 놓여 있을 때 결합쌍을 만들기 때문에 짝지워진 코돈들은 5'-3' 방향으로 해독하면 반대쪽 방향(왼쪽-오른쪽 대 오른쪽-왼쪽)으로 놓여있는 것과 같이 보인다.
표 1에 나타난 코돈들은 Kyte 등에 의해 정의된 바와 같은 수지법에 의해 일정그룹으로 나뉜다. 표 1에 서 알수 있는 바와 같이, 소수성(높은 값의 수치) 아미노산에 대한 코돈과 짝을 이루는 상보성 코돈은 친수성(낮은 값의 수치) 아미노산을 암호하는 경향이 있다. 친수성 아미노산의 코돈 경우에도 유사한 경향이 나타난다. 약한 친수성 아미노산(약간 네가티브 값인수치)의 경우, 비슷한 아미노산들이 상보성 코돈에 의해 암호된다. 그 결과는 제1도에 그래프로 도시되어 있다. 이러한 관계는 후술되는 것처럼 중요한 생물학적 의미를 가지고 있다.
[표 1]
표 1의 짝을 이룬 코돈(뉴클레오티드 트리플렛)들은 가상적인 암호핵산 가닥(이경우에 RNA)과 비암호 핵산 가닥(역평행 방향으로 짝지워진 RAN)을 비교한 것이다. 상기 가닥들은 동일한 리딩 프레임내에서 5'-3' 방향으로 해독되어 원형 코돈과 그의 상보성(염기 쌍이 형성되는)코돈을 얻는다.
소수성 아미노산-암호코돈에 대한 가능한 20개의 상보성 코돈중에서, 오직 두 개(GCA 및 UGC)만이 소수성 아미노산을 암호했다. 친수성 아미노산-암호 코돈에 대한 18개의 상보성 코돈중에서, 13개가 소수성 아미노산들을 암호하고, 5개가 약친수성 아미노산을 암호했다.
약 친수성 아미노산 암호 코돈에 대한 20개의 상보성 코돈들중에서 10개가 약 소수성 아미노산을 암호하고, 5개가 강친수성 아미노산을 암호하며, 5개가 강소수성 아미노산을 암호했는데, 이러한 결과는 그 수치적 특성에서 크게 벗어나지 않은 것이다.
표 2는 표 1의 암호된 아미노산 및 그들 각각의 상보적으로 암호된 아미노산을 나타낸 것으로, 그들의 수치적 스코어(Kyte et al, 1982)도 포함하고 있다.
[표 2]
표 2와 제1도를 통해 알수 있는 바와 같이, 아미노산의 세트로 예시된 바와 같은 일반적인 관계가 나타난다. 예를 들면, 제1아미노산 세트는 제1그룹 코돈에 의해 암호되며(지시되며), 제2아미노산 세트(상보적으로 암호된 것)는 상기 제1그룹의 토큰에 대해 상보적인 제2그룹 코돈에 의해 암호된다. 제1세트 아미노산과 제2세트 아미노산간의 관계는 수치적으로 상반되는 것을 특징으로 한다. 한가지 경우에 있어서, 상보적으로 암호된 친수성(낮은 값의 수치) 아미노산은 소수성(높은 값의 수치) 아미노산을 암호하는 코돈에 상보적인 코돈에 의해 암호된다. 이러한 관계는 수치적 상보성(hydropathic complementarity)으로 명명한다.
제1도는 상보적인 비암호가닥 코돈에 의해 상보적으로 암호된 아미노산의 평균 수치 스코어에 대한 암호 핵산가닥의 코돈에 의해 암호된 아미노산의 수치 스코어를 나타낸 표 2의 자료를 도시한 플롯이다. 이 데이터를 선형 희귀 분석한 결과 -0.77의 상관계수가 얻어졌다. 트립토판, 티로신, 글루타민, 및 아스파라긴에 대해 다소 상이한 값(데이터는 나타나 있지 않음, Hopp 등, Proc. Natl. Acad. Sci.(1981) Vol. 78 pp.3824-3828)을 나타내는 다른 수치적 스코어 시스템으로 계산할 때도 비슷한 패턴이 관찰된다. 그러므로 비암호 가닥에 의해 암호된 아미노산의 수치적 스코어는 암호 가닥 아미노산의 수치적 스코어와 상반되는 관계를 나타내는 경향이 있으며, 이러한 관계는 불규칙적인 것이 아니며, 단독으로 또는 아미노산의 기타 물리적 특성과 함께 소수성 및 친수성 경향을 나타내는 아미노산 특성을 반영한 스코어 시스템으로도 알수 있는 것이다.
상보적인 코돈을 3'-5' 방향으로 해독할 경우에도 비슷한 관계가 얻어진다. 3'-5' 방향으로 해독된 상보성 코돈의 암호관계는 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
표 3에 나타난 것처럼, 3'-5' 방향으로 해독될 때 소수성 아미노산에 대한 코돈에 상보적인 20개의 코돈중에서 어느것도 소수성 아미노산을 암호하는 것은 없었으며, 16개가 친수성 아미노산을 암호하고, 4개(UAU, ACA, AGC 및 UAC)가 약친수성 아미노산을 암호하였다.
3'-5' 방향으로 해독할 때 강친수성 아미노산의 코돈에 상보적인 18개의 코돈중에서, 어느것도 강친수성 아미노산을 암호하는 것은 없으며 16개가 소수성 아미노산을 암호하고, 2개 (UCU 및 UCC)가 약친수성 아미노산을 암호했다.
표 4 표 3에 기재된 아미노산 및 이들의 보체(즉, 각각 상보성 코돈에 의해 암호된 아미노산, 또는 상보적으로 암호된 아미노산)를 수록하고 있다.
[표 4]
3'-5' 방향으로 해독할 때 약친수성 아미노산을 암호하는 코돈에 대한 상보성 코돈중에서, 14개가 약친수성 아미노산을 암호하며, 2개(ACA 및 ACG)가 강친수성 아미노산을 암호하고, 4개(UCG, UGU, AUA, AUG)가 소수성 아미노산을 암호한다. 여기에서 비암호가닥 아미노산의 평균 수치 특성은 별 변화가 없다.
제2도는 암호가닥 아미노산의 수치스코어대 비암호 가닥 아미노산의 수치 스코어를 비교한 플롯이다. 이 데이터를 선형 희귀 분석한 결과 상관계수가 -0.77이 있다. 그러므로 5'-3' 방향에서처럼 3'-5' 방향에 있어서, 비암호가닥 아미노산 수치스코어는 암호가닥의 수치스코어와 상반관계를 갖으며, 이 관계는 불규칙한 것이 아니다.
유전 암호내에 포함된 정보관계를 아미노산의 수치적 상보성을 입증한다. 5'-3' 방향으로 해독할 때, 일반적으로 친수성 및 소수성 아미노산의 코돈은 각각 소수성 및 친수성 아미노산의 코돈으로 보체화된다. ＂약친수성＂(비하전)아미노산 코돈은 ＂비하전＂아미노산의 코돈에 의해 보체화된다.
상기 관찰에서 알수 있듯이, 상보적인 뉴클레오티드 코돈은 5'-3' 방향보다는 3'-5' 방향으로 해독될 때 상기와 거의 동일한 결과가 나타난다. 왜냐하면 해독방향과는 관계없이 상보성 코돈의 트리플렛 코돈을 구성하고 있는 3개의 뉴클레오티드중 제2뉴클레오티드(두번째에 위치한 뉴클레오티드)는 변하지 않기 때문에, 트리플렛 코돈의 제2뉴클레오티드(second nucleotide)가 상보적인 코돈에 의해 규정된 아미노산의 수치적 상보성에 대한 중요한 결정기(determinant)인 것으로 사료된다. 이것은 친수성 아미노산의 경우(7개중에서 6개) 그의 두 번째 뉴클레오티드 코돈으로 아데닌을 가지고 있는 반면, 그의 상보성 뉴클레오티드 유리딘은 대부분(7개중에서 5개) 소수성 아미노산의 트리플렛 코돈중 두 번째 뉴클레오티드로 존재한다. 소수성 그룹(알라닌)에서 상기 사실에 대한 2가지 예외중 하나는 그것이 두 번째 염기인 시토신을 가지고 있기 때문에 상기 일반 원칙을 심각하게 손상시키지 않는 반면, 친수성 그룹(아르기닌)에서 한가지 예외로는 두 번째 염기가 구아닌을 갖는 경우이다. 그러므로 상보적인 코돈의 5'-3'으로 해독되는 것인지 또는 3'-5'방향으로 해독되는 것인지 간에 소수성 및 친수성 아미노산이 완전히 상호 교환된다. 6개의 약친수성 아미노산중 티로신을 제외한 나머지 아미노산에 대한 각 코돈의 제2염기는 G 또는 C이다. 그러므로 이 그룹의 코돈들은 상보적인 코돈이 해독되는 방향과 무관하게 비슷한 타잎의 아미노산을 제공한다.
표 5는 특정 제2(중간) 염기를 포함하는 코돈을 갖는 아미노산을 수록하고 있다.
[표 5]
유리딘 제2염기에 의해 암호된 아미노산 그룹(U그룹)은 아데닌 제2염기에 의해 암호된 아미노산(A그룹)의 상보적으로 암호된 그룹이며, 이 반대도 가능하다. 시토신 및 구아닌에 의해 암호된 그룹(C그룹 및 G그룹)도 각각 동일한 관계를 가지고 있다.
표 6은 특정 제2염기를 갖는 코돈에 의해 암호된 아미노산의 수치적 스코어를 기술한 것이며, 상보적으로 암호된 아미노산(보체)의 상응하는 스코어도 함께 나타내었다. 즉 수치적으로 상보적인 관계를 나타낸 것이다.
[표 6]
표 2,4,6에서 알수 있듯이, 펩티드와 그의 보체들은 그 서열이 생성방식에 따라 역평행방식 또는 평행방식으로 배열될 때 아미노산 상의 수치적 특성이 상반관계를 갖는 특징이 있다. 표 1과 표 3에 나타난 특이 코돈 관계를 이용하여 입증된 바와 같이 본 발명의 바람직한 구체화는 상보적인 펩티드를 제조하기 위한 방법중 특별한 방법이다.
핵산 서열이 알려져 있지 않은 경우, 제2염기 상보성 또는 수치적 상반관계를 기본으로 하는 일반적인 방법이 특히 바람직한 상보적인 펩티드의 동족체를 생성하는데 이용될수 있다. 예를 들면, 단백질 또는 펩티드 전부 또는 일부에 대해 특정 코돈이 아닌 아미노산 서열이 알려져 있는 경우, 상보적인 펩티드는 표 6에 기술된 일반적인 관계를 근거로 하여 디자인될 수 있다. 제2코돈 염기로 유리딘을 갖고 있는 원형 단백질 또는 펩티드 서열내의 아미노산에 대해, A그룹의 아미노산을 치환할수 있으며, 이 반대도 가능하다. 단백질 또는 펩티드서열내의 아미노산의 제2코돈 염기가 시토신(C그룹)인 경우, 구아닌 군의 아미노산(G그룹)으로 치환할 수 있으며, 이 반대도 가능하다. 이러한 치환후 얻어진 아미노산 서열은 원형 펩티드 또는 단백질의 각각 부위에 대해 상보적인 것이 된다.
핵산 서열이 알려져 있지 않은 경우, 표 1,3 및 6이 일반적인 방법으로 사용될수 있다. 이런 경우에 있어서, 원형 펩티드 또는 단백질 서열내의 아미노산은 상응하는 비암호가닥 아미노산의 셋트로부터 치환된다. 이러한 치환이 일어난후, 이렇게 얻어진 아미노산 서열은 원형 펩티드 또는 단백질의 각 부위에 대해 상보적이다.
본 발명의 원리를 확장시켜 보면 상보적인 아미노산 서열의 특정 방향성은 그다지 중요하지 않다. 본 명세서내의 상세한 설명을 참고하면 본 기술 분야의 숙련자에게 명백한 바와 같이 상보적인 폴리펩티드를 작제하는데 있어서 아미노산의 병렬 위치는 방향면에서 두가지 방식들로 배향될수 있다. 특별한 수치적 특성을 지닌 아미노산의 위치를 암호하는 아미노산 서열에 대해, 아미노 말단과 카르복시 말단 방향은 상호 교환될수 있으며, 이 두가지 구조 모두 상보적인 폴리펩티드를 생산한다. 한가지 예로서, 표 6에 기술한 일반 방법에 의하면, 특정 아미노산 서열의 아미노 말단 부분이 발린(제2코돈 염기=U)을 포함한다면, 그때 상보적인 아미노산의 서열은 아미노 말단부분 또는 카르복시 말단부분에서 제2코돈 염기 A를 갖는 아미노산(LYS, ASN, ASP, GLN, GLU, HIS, 또는 TYR)을 포함할수 있다.
유전 암호는 진화 과정중에 안티코돈 염기 및 그의 각각의 아미노산의 화학적 유사성이 결과로 나타날 수 있다. 상기 유사성은 본 명세서에서 관찰된 패턴을 나타낸다. 이 현상의 기능적 진화론적 잇점은 사실상 수치적으로 비슷한 아미노산들에 대한 코돈의 제2염기가 동일하다는 사실에 있다. 핵산 해독의 방향성이 출현하기 이전에 동일한 수치성 군에서 얻어진 아미노산이 존재하고, 그로부터 얻어진 펩티드 또는 단백질은 핵산이 5'-3' 또는 3'-5'로 해독되는지에 관계없이 배열면에서 거의 유사할 것이다.
본 발명은 공지된 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 암호서열을 지닌 원형 펩티드 또는 단백질 일부(예를 들면 4-5개의 아미노산)에 상보적이며, 상기 원형 펩티드 또는 단백질에 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드를 디자인하여 제조하기 위한 것이다. 만일 원형 펩티드 또는 단백질의 최소한 일부(예를 들면 4내지 5개의 아미노산) 아미노산 서열이 알려져 있다면, 상보적인 폴리펩티드를 다지인하기 위해서 상기 서열정보가 다양한 방법으로 사용될 수 있다.
상보적인 폴리펩티드를 디자인하는 바람직한 방법은 표 3에 기재된 아미노산 관계를 이용하는 것이다. 따라서, 원형 펩티드 또는 단백질 전체 또는 일부의 아미노산 서열에 있어 이소로이신의 위치에 대해 티로신을 치환할 수 있다. 다른 예로서 발린은 글루타민 또는 히스티딘을 치환할수 있다. 또한 나머지 18개 아미노산들은 표 3에 예시된 관계에 따라 치환될수 있다. 실시예 2A,2B,2C에서 후술되는 것처럼 펩티드 호르몬-수용체 부위 아미노산 서열이 원형 펩티드 또는 단백질로서 사용될 때 수용체 부위에 결합하며 그곳에 상보적인 펩티드 호르몬 부분에 대해 통계적으로 중요한 독특한 코돈이 제공된다. 실시예 2A,2B,2C와 제8도, 9a도, 9b도에서 나타난 것처럼 공지된 뉴클레오티드 서열을 기본적으로 특정 아미노산에 대해 더 바람직한 치환이 일어날 수 있다. 예를 들면 세린은 아르기닌 대신 치환되며, 세린 또는 시스테인은 쓰레오닌 대신 치환된다.
상보적인 폴리펩티드를 디자인하는 다른 바람직한 방법은 표 1에 기재된 아미노산 관계를 사용하는 것이다. 하지만 원형 펩티드, 단백질 또는 그의 바람직한 일부의 아미노산 서열은 카르복시 말단 방향으로부터 해독된다. 이 카르복시 말단 방향은 상보적인 폴리펩티드의 아미노산 말단 방향과 상응한다(즉, 아미노산 설치 방향을 정함). 이 순서의 역이 정해지면 표 1에 나타낸 아미노산 관계에 따라 치환이 실시된다. 예를 들면 이소로이신 대신에 티로신, 아스파라긴 또는 아스파르트산이 치환된다. 다른 19개의 아미노산에 대한 치환이 표 1의 아미노산 관계에 따라 시행될수 있다.
후술되는 실시예 1A-1H에서 입증되는 바와 같이, 감마 엔도르핀 및 ACTH에 대해 상보적인 폴리펩티드가 후자방법의 바람직한 변형에 따라 디자인되어 제조될 때, 공지된 뉴클레오티드 서열을 기본으로 하는 특정 아미노산 치환이 실시된다. 예를 들면, 발린은 아스파르트산 또는 히스티딘으로 : 로이신은 리신 또는 글루타민산으로 : 페닐알라닌은 글루타민산으로 : 아르기닌은 알라닌 또는 프롤린으로 : 리신을 로이신으로 : 히스티딘은 발린으로 : 글리신은 프롤린 또는 알라닌으로 : 쓰레오닌은 글리신 또는 아르기닌으로 : 세린은 글리신, 아르기닌 또는 알라닌으로 : 티로신은 발린으로 : 프롤린은 글리신 또는 아르기닌으로 치환된다.
일반적인 제2염기 그룹으로부터 상보적인 아미노산의 특정세트를 선택하기 위한 바람직한 방법은 다음에 기술한다. 각 아미노산에 있어서, 선택된 아미노산에 대해 3'-5' 및 5'-3'으로 해독되는 모든 가능한 코돈으로부터 생성될수 있는 모든 가능한 상보적인 아미노산의 리스트를 기록한다. 이 리스트로부터 가장 빈번히 발생하는 아미노산을 선택한다. 예를 들면, 발린에 있어서, 발린에 가능한 보체 세트를 만들기 위해 두가지 방향으로 해독될수 있는 4개의 코돈은 다음과 같다.
상기 리스트로부터 HIS는 VAL에 대한 보체로서 선택되었다. 이와 같이 선택된 것을 본 명세서에서 콘센서스 보체(consensus complements)로 명명한다. 하기표는 각각의 아미노산에 대해 선택된 것을 나타내었다.
[표 6a]
펩티드 제조 및 취급에 숙련자들은 펩티드서열내에 시스테인 잔기가 존재하면 어떤 상황에서 산화와 다이머화 문제를 일으킨다는 사실을 알수 있을 것이다. 이런 이유 때문에 연구자들은 상보적 펩티드서열내의 시스테인 잔기를 세린같은 수치적으로 중성인 다른 아미노산으로 대체할수 있기를 열망했으며, 이러한 치환방법이 본 발명에 의해 숙고되었다.
일반적으로 제2염기 그룹으로부터 상보적인 아미노산의 특정 세트를 선택하기 위한 다른 바람직한 방법은 각 아미노산에 대해 가장 자주 사용되는(종특이성) 코돈을 결정하고, 그 상보적인 코돈을 5'-3' 또는 3'-5'(＂출현 빈도수를 기초로 하는 보체＂)중 한 방향으로 번역하는 방법이다. 그러므로, 각 아미노산( 및 각종=species)에 대해 빈도수를 기초로 하는 2개의 보체 아미노산이 유도될수 있으며, 이들이 상보적인 펩티드서열을 생산하는데 사용할수 있다. 만일 정지코돈(세포내에서 번역 정지를 알리는 시그날)이 상기 방법에서 나타나는 경우, 해당 아미노산에 대해 두번째로 가장 빈번히 사용되는 코돈을 사용할수 있다. 하기표(6B)에는 Grantham et. al. (Nucl. Acids, Res., 9, p. r43-r75, 1981)에 의해 결정된 인체 코돈 빈도수를 사용하여, 각 아미노산에 대해 빈도수를 기초로 한 보체를 수록했다.
[표 6b]
일반적으로 제2염기 그룹으로부터 상보적인 아미노산으 특정세트를 선택하기 위한 또다른 바람직한 방법은 각 제2염기 그룹에 대해 가장 일반적으로 사용되는 코돈을 결정하는 것이다. 코돈 사용 빈도수는 각각의 종마다 다양하기 때문에 상이한 종에 대해서는 다른 선택 방법이 필요하다. Grantham et al.(Nuc. Acid. Res., 9, p. r43-r75, 1981)에 의해 제창된 인체 코돈 사용빈도수를 이용하여, 선택된 단순화 보체아미노산을 하기표에 수록하였다(상기의 상보적인 아미노산은 본 명세서에서 ＂단순화된 보체＂(simplified complements)로 명명된다) :
[표 6c]
어떤 경우에 있어서, 펩티드는 그 서열의 특이한 특징으로 인해 자가-상보성(self-complementary)을 갖는다. 서열이 제2염기서열에서 전환점을 지닐때 그 서열을 자가-상보적이 된다.
예를 들면 :
N-말단 Glu-Leu-Glu-Leu 펩티드 서열
5'말단 A-U-A-U
3'말단 U-A-U-A 보체서열
C-말단 Leu-Glu-Leu-Glu
분명히 상기의 테트라펩티드는 역평행 방향으로 그 자체가 보체이다. 이 펩티드는 여전히 동일한 제2염기 서열을 갖고 있는 상이한 서열의 아미노산을 갖는 수많은 다른 역평행 보체를 갖고 있다. 역평행 보체 모두가 제2염기 동족체(analogs)로 간주될수 있다.
자가 상보적인 펩티드가 다른 역평행 보체와 함께 존재할 때 이러한 서열의 특성으로 인해 실험결과 분석이 복잡하게 된다. 다른 역평행 보체는 통상의 동족체(동근효과 또는 길항효과) 특성을 지녔거나 또는 보체와 연관된 특성(통상적 동근 및 길항제인 비통상적인 길항체 및 항체)을 지닐수 있다. 이러한 특별한 경우에서 보체의 상세한 작용모드와는 관계 없이, 상보적 펩티드 원리가 바람직한 생물학적 활성 특성을 지닌 신규의 분자를 제조하는데 사용될수 있다.
원형 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 코돈 서열을 기본으로 하는 상기 방법에 의해 정해진 서열을 갖는 상보적 펩티드는 상기에서 정해진 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 부터의 생물학적 합성 또는 유도체화(예. 절단에 의해)하거나, 화학합성법에 의해 얻어질 수 있다.
본원에 기술된 상보적 아미노산 관계로부터 바람직한 아미노산 서열에 대한 상보적인 아미노산 서열을 함유하는 많은 폴리펩티드 구조물을 디자인, 작제 및 사용할수 있도록 해준다. 상보적 아미노산 서열은 본 명세서에서 HTCA 및 감마 oden에 나타낸 것처럼 전체 펩티드 또는 폴리펩티드일수 있다. 이것들은 표적 펩티드 ACTH(1-24) 또는 감마-엔도르핀의 총서열에 대해 상보적이다.
특정 응용용도에서 상보적인 펩티드는 좀더 큰 폴리펩티드 구조물에 화학적 가교-결합되거나, 상기 구조물내에 병합되는 방법과 같은 기술에 의해 더 큰 분자에 결합될수 있다. 상보적인 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피같은 용도를 위해 고체 매트릭스에 부착될수 있다.
본 발명의 실행에 있어서, 표적 펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다면 이것은 보체의 아미노산 서열을 파악하는데 사용될수 있다. 이러한 상황에서 이소로이신(AUU, AUC), 로이신(UUA,CUA), 트레오닌(ACU) 또는 세린(UCA)에 대한 특정 코돈은 5'-3' 또는 3'-5' 방향으로 해독될 때 단백질 합성의 정지를 암호하는 정지 코돈인 상보적인 코돈을 생성할수 있다. 이러한 상황하에서 상기 정지 코돈의 제2염기는 수치적 상보성을 가진 적절한 아미노산을 (표 5와 6에 나타나 있는 그룹으로부터) 선택하는데 사용될 수 있다. 특정 그룹으로부터 선택은 수치적 상보성을 최적화시킴으로써 바람직하게는 좁혀질수 있다. 예를 들면, ILE(+4.5 수치적 스코어) 코돈(AUU 또는 UUA)를 사용하여, 상보성 제2염기 A-그룹 으로부터 LYS(-3.9 수치적 스코어)가 선택된다 : 세린(-0.9 수치적 스코어) 코돈(UCA) 또는 트레오닌(-0.9 수치적 스코어) 코돈(ACU)을 사용하면, 제2염기 G-그룹으로부터 트리프로판(-0.9) 또는 세린(-0.9)이 선택될수 있다.
본 발명의 범위는 또한 특정 구체화를 적용하여 예시될 수 있다. 예를 들면, 황체 호르몬 방출 호르몬(LH-RH)은 그의 암호 뉴클레오티드 서열이 공지되지는 않았지만 표 7의 상단에 나타난 아미노산 서열을 갖는 데카펩티드이다.
[표 7]
본 명세서에서 기술된 지식 및 원리에 입각하여, 표 7에 관련된 방법으로 제조한 보체 대부분이 LH-RH에 대해 친화성을 나타냄을 예상할수 있으며, 이 호르몬의 효과를 변화시키는데 유용함이 입증되었다.
어떠한 경우에 있어서, 가장 바람직한 생물학적 또는 생화학적 특성 또는 효과를 갖는 본 발명에 의한 특이한 상보적인 펩티드 또는 펩티드를 선택하는 방법은 상기 상보적 펩티드가 사용되는 생물학적 시스템의 특성을 비롯한 여러 가지 요인에 의존한다. 즉 진단 또는 치료용도가 바람직한지 아닌지, 표적 생물학적 시스템에서 상보적인 펩티드가 일으키는 작용모드 및 생물학적 효과 형태등의 요인에 의존한다. 바람직한 효과에 따라, 상보적인 펩티드 중 일부가 다른 것들에 비해 더 바람직할 수 있다. 하기의 접근방법은 다수의 가능한 디자인 방법(scheme) 중의 하나로서, 이 방법은 10-4몰 농도 또는 그 이하의 상보적 펩티드 농도하에서 생리학적, 진단적, 또는 물리적 분석에서 반응하는 상보적 펩티드 서열을 제조하는데 사용될수 있다. 상기 10-4몰 또는 그 이하의 상보적 펩티드 농도(여기서는 ＂최소의 상보적 펩티드 결합 활성도＂로 명명함)는 본 발명의 적합한 상보적인 펩티드를 선택하는데 있어서 유용한 변수이다. 왜냐하면 실용적인 관점에서 볼 때 최소의 상보적 펩티드 결합 활성도로 확정된 농도 이상에서는 비실용적인 치료용량을 포함하여 이 결합력이 치료 또는 진단시에 유용할 정도로 충분히 특이적인 것이 아닌 펩티드를 생산하기 때문이다.
후술되는 선택방법은 종래 기술에 숙련된 사람들이 최소의 상보적 펩티드 결합 활성도를 특징으로 하는 상보적 펩티드를 쉽게 얻을 수 있도록 해준다. 구체적으로 만일 핵산 서열이 알려져 있다면, 상기 서술된 방법에 4개의 상보적 펩티드가 바로 직접 디자인될수 있다(상보적 핵산 서열을 5'-3' 또는 3'-5'으로 번역하고, 아미노산의 연속 서열은 아미노-말단을 카르복시-말단으로 하거나, 또는 카르복시-말단을 아미노-말단으로 배향시킨다). 이들 상보적 펩티드중에서 어떠한 것도 바람직한 레벨의 활성도를 가지고 있지 않다거나, 또는 표적 핵산 서열이 알려져 있지 않다면, 그때는 콘센서스 보체 방법(표 6A)을 이용하여 아미노산으로부터 표적 서열을 디자인 하여 2개의 보체펩티드를 얻을 수 있는데, 이때 상기 보체펩티드는 상기 보체 아미노산 서열의 아미노 말단을 카르복시 말단으로 하거나, 또는 카르복시 또는 아미노-말단으로 배향함으로써 제조된다. 바람직한 레벨의 활성도를 지니지 못했다면 목표 서열내의 아미노산에 대해 종특이적으로 가장 빈도가 높게 사용되는 코돈을 5'-3' 보체에서 또는 3'-5' 보체로 번역한 뒤, 그 보체 아미노산 서열을 아미노-말단은 카르복시-말단으로 또는 카르복시-말단은 아미노-말단으로 배향시킴으로서 코돈 사용 빈도가 높은 보체 제조법을 사용(표6B)하여 4개의 상보적인 펩티드를 더 제조할수 있다. 각각의 제2염기 그룹에 대해 가장 빈번히 사용되는 종특이성 아미노산을 분류한 뒤, 목표 서열내의 각 아미노산의 제2염기 그룹을 근거로 하여 상보적 아미노산 서열을 제조하고, 그 보체 아미노산 서열을 아미노-말단은 카르복시-말단으로 또는 카르복시말단은 아미노-말단으로 배향시킴으로서 단순화된 보체 제조법(예, 표6C)를 사용하여 두 개의 보체를 더 디자인 할 수 있다.
특정 시스템에 있어서, 한 방향의 펩티드 결합에 의해 제조된 상보적 펩티드가 다른 한 방향의 펩티드 결합에 의해 얻어진 펩티드, 즉 최소의 상보적인 펩티드 결합 활성도를 지닌 펩티드 또는 최소의 상보적인 펩티드 결합 활성도 이상의 활성도를 지닌 펩티드보다 더 바람직한 상보적 펩티드이다. 이러한 경우에 있어서, 연구자들은 추가 실험을 간소화하기 위해 더 바람직한 배향도로 제한하여 그들의 연구를 집약시키기를 바란다. 또한, 만일 상기의 디자인 방법이 특히 바람직한 상보적 펩티드를 생산한다면, 연구자들은 제2염기 그룹내의 다른 아미노산으로 보체 아미노산 서열내의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 선택적으로 교환 함으로서 더 바람직한 상보적 펩티드를 찾으려고 할 것이다.
활성적인 또는 바람직한 상보적 펩티드 디자인은 상보적 펩티드의 혼합물을 제조함으로서 용이하게 실시할수 있다. 예를 들면 이것은 하나 또는 그 이상의 커플링 반응에서 여러개의 아미노산 반응제를 1단계로 가한후 고체 지지체에 부착된 표적 펩티드를 함유하는 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 상기 혼합물을 구배 용출시키는 고체-상 펩티드 합성법으로 제조할수 있다. 가장 간단하게 결합된 상보적 펩티드는 마지막에 용출될 것이다. 여러 가지 용출분취물내의 펩티드의 구조는 분획물을 수거한 뒤 통상적인 방법으로 서열결정(sequencing) 결정함으로써 결정될수 있다. 이러한 방법으로 수많은 펩티드를 최소노력으로 평가할 수 있으며, 최소의 상보적 활성도를 갖는 펩티드를 쉽게 얻을 수 있다.
바람직한 상보적 펩티드 서열을 결정하기 위한 다른 방법은 표적 펩티드에 대한 단일 클론 항체 세트를 생성한 뒤, 면역글로불린을 암호하는 유전자의 가변성 부위를 서열결정하는 방법이다. 서열을 조사함으로써 확인된 상보성 영역들은 적당히 어셈블리되면 상보적 펩티드 서열을 나타내게 될 것이다.
상보적 폴리펩티드를 디자인하는데 있어서, 천연 아미노산은 비슷한 구조 및 또는 수치성을 갖는 동족체에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 대체될 수 있다. 예를 들면, 알라닌 알파 아미노 이소부티르산으로, 아르기닌은 카나바빈으로, 아스파르테이트는 베타-히드록시 아스파르테이트로, 로이신은 노르로이신 또는 감마-클로로로이신으로, 페닐알라닌은 베타 페닐세린 또는 D-페닐 알라닌으로 대체될수 있다. 이들은 일례만을 예시한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 상보적인 폴리펩티드를 작제하기 위한 상기 대체방법도 본 발명의 범위내에 포함된다.
천연 호르몬 전체 또는 일부에 대해 상보적인 펩티드를 사용하여 해당 호르몬 수용체를 인식 결합하는 항체를 생산한다. 이 항체는 호르몬에 대해 항-이디오타입 항체 특성을 지니므로 수용체를 정제하거나, 호르몬과 일반적으로 관련된 생물학적 반응을 자극시키거나, 또는 천연 호르몬의 효과를 길항시키는데 사용될수 있다. 호르몬에 대해 상보적인 펩티드의 항체로 인한 생물학적 반응은 부분적으로 특정항체 생산 세포가 항원(상보적 펩티드)과 함께 존재하는 방식에 의해 조절된다. 이러한 방식은 목적 반응의 타잎에 따라 바람직하다.
일반적으로, 항체를 생산하기 위해 펩티드를 사용하는 경우, 이 펩티드는 캐리어기질, 즉 커다란 단백질에 커플화된다. 커플링 기술은 본 기술분야에 공지된 것이다. 사용된 커플링 타잎에 따라 상보적 펩티드 항원의 존재에 영향을 줄수 있다.
생체내에서 또는 실험관내에서 면역화 유형에 따라, 각종 첨가제(보조제)가 항원 그자체와 혼합되어 면역반응을 조절할수 있다. 그러한 보조제 또한 상보적인 펩티드 항원의 존재에 영향을 준다.
동물 혈청에서 얻은 항체는 다클론성이다. 이것은 수많은 세트의 세포에 의해 생산된 항체 혼합물이라는 것을 뜻한다. 동물이 상보적 펩티드로 면역될 때 모든 항체의 서브세트는 상보적 펩티드와, 이 상보적 펩티드가 유래된 분자의 수용체에 결합된다. 수많은 항체 타잎으로 구성된 상기 서브세트는 통상적인 친화성 크로마토그래피법에 의해 기타 항체로부터 분리될수 있다. 이렇게 정제된 항체의 서브세트를 통상 모노-특이성이라 칭한다. 상보적 펩티드에 대한 모노-특이성 항체는 수용체를 정제하거나, 수용체를 진단 분석하거나 또는 생물학적 반응을 조절하는데 사용될수 있다.
모노-특이성 항체는 다양한 형태의 항원의 존재로 인해 얻어진 항체의 세트로 간주될수 있다. 펩티드 항원은 어느정도 유연성을 지니고 있기 때문에, 이 항원들은 많은 상이한 배열 또는 여러 가지 3차원적 구조로 추정될수 있다. 각가의 배열마다 약간 다른 항체를 생성하게 되지만 이 모든 것이 모노-특이성 세트 멤버이다.
본 기술분야에 공지된 단일클론 기술을 사용하여 상기 모노-특이성 세트의 특정 항체를 다량 생산할수 있다. 이러한 단일클론 항체들은 상보적 펩티드 또는 수용체에 강하게 결합하거나, 해당 상보적 펩티드가 유도된 분자와 비슷한 생물학적 반응을 생성하거나, 또는 그 생물학적 반응을 억제하는 그들의 능력을 이용해 스크린될수 있다. 그러므로, 바람직한 반응 타잎에 따라 선택할수 있다.
상보적인 펩티드는 보조제와 함께 사용되어 백신을 생성할수 있다. 이러한 방법으로 유기체의 면역시스템을 사용하여 그의 호르몬 시스템의 생물학적 반응을 조절할수 있다. 항원은 바람직한 생물학적 반응을 제공하는 항체를 다량 확보하기 위해 특별히 변형될 필요가 있다. 특이 생활성 펩티드에 상보적인 다른 펩티드는 심차원구조의 차이로 인해 예방접종시 다른 생물학적 반응을 보인다.
본 발명의 상보적 펩티드는 적은 펩티드 또는 단백질 일부에 상보적일수 있다. 이러한 상보적 펩티드는 종종 항체를 이용할때와 같이 이용될수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 디자인된 폴리펩티드는 특정 신생물(종양)를 특징짓는 독특한 세포표면 단백질성 항원의 특정부위에 상보적인 상태로 제조될수 있다. 이러한 상보적 폴리펩티드는 화학적으로 다음과 같은 물질에 커플화될수 있다 : 예를 들면 리신 A사슬(ricin A chain)또는 시스-플래티늄 화합물 : 중금속 같은 방사-불투명 물질 : 방사성 동위원소 : 또는 형광성 화합물등과 같은 생물 또는 화학적 톡신이다. 폴리펩티드-물질 접합체(conjugate)는 신생물에 특이적으로 결합하여 거기에 독소 또는 라벨을 운반한다. 리포솜, 분해성 중합체 또는 다른 엑스캡슐화(excapsalating)물질과 같은 바람직한 약제 운반 시스템은 특정 부위로 특이 상보적 폴리펩티드가 운반되도록 한다.
펩티드 호르몬, 효소의 촉매적 부위, 또는 펩티드성 독소에 결합함으로서 특정물질의 활성도를 중화시키기 위해 상보적 폴리펩티드가 사용될수 있다. 호르몬 수용체의 단백질성 단편에 상보적인 폴리펩티드를 투여함으로서 상기 수용체가 불활성(길항체에 의해)화 되거나 또는 활성화(동근에 의해)될수 있다.
특정 효소의 활성 부위에 상보적인 폴리펩티드가 약리학적으로 효과가 있음이 입증되었다. 예를 들면, 인슐린-불활성화 효소 글루타치오닌-인슐린 스트랜 하이드로 게나제 및/또는 인슐린나제로 명명된 프로테아제의 촉매부위에 대해 상보적인 폴리펩티드를 투여함으로서 당뇨병을 치료하는데 유익하다.
안지오테시노겐, 안지오텐신 I 및 /또는 안지오텐신 II의 최소한 일부에 상보적인 펩티드를 디자인하고 생산하는 본 발명의 방법을 사용하여 안지오텐신 시스템을 방해함으로써 고혈압 환자의 치료에 도움을 줄수 있다.
내분비학 분야에 있어서, 최소한 호르몬 일부에 상보적인 폴리펩티드가 해당 호르몬의 생물학 작용을 감소 또는 제거시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, Graves병(안구 돌출성 갑상선종)에는 갑상선 기능항진이 나타난다. 티로토로핀 분비 호르몬(TRH)이나 또는 갑상선 자극 호르몬의 베타-서브유니트(TSH 또는 티로트로핀)에 상보적인 폴리펩티드는 상기 호르몬들에 결합하여 갑상선을 불활성화시킨다.
본 발명은 혈액군 식별을 용이하게 한다. 100개 이상의 서로 다른 혈액군 항원이 적혈구 표면에 존재하여 14개의 유전적으로 독립적인 인체 혈액군계로 나뉜다. 이러한 항원 그룹은 특이 항원에 대한 항체와의 적혈구 응집 반응에 의해 식별된다. 특이 혈액군 항원에 대해 상보적인 폴리펩티드는 혈액을 유형별로 나누기 위해 항체대신에 사용될수 있다. 특정 혈액군 항원에 포함된 아미노산 서열에 대해 상보적인 폴리펩티드는 글루타르알데히드같은 반응제와 가교 반응에 의해 최소한 2가로 변형되거나 또는 형광염료 또는 방사성동위원소체에 커플화될수 있다. 전자의 변형에 의한 상보적 폴리펩티드 표적이 되는 혈액군 항원을 지닌 적혈구를 응집시킨다. 형광 또는 방사성 동위 원소체에 의해 변형된 상보성 폴리펩티드는 표적이 된 혈액군 항원을 함유하는 적혈구에 결합하여, 그 적혈구를 라벨시킨다.
체액의 가임성 특이 성분인 융모 성고나도 트로핀의 베타사슬에 상보적인 펩티드는 형광염효 방사성 동위 원소 같은 라벨 또는 담색성 생성물을 제공하는 효소 같은 라벨을 부착하여 임신 반응 시험을 실시하는데 사용될수 있다.
면역 시스템의 가장 중요한 열쇠는 T 세포수용체에 결합하는 항원에 의한 T세포 활성화 원리를 하는데 있다. 1984년 T세포수용체 단백질 및 이 두 단백질을 암호하는 유전자를 클론화시켜 분리한후 규명하였다(Science V25 p859, Science V25 p 1065). 본 발명에 의해 기술된 방법을 적용함으로써 T-세포 수용체의 다른 분체에 상보적인 펩티드가 제조될수 있으며, T세포활성화 기작을 체계적으로 연구할수 있다. 알러지 반응이 면역글로불린 E(IgE) 매개단계를 포함한다는 것은 잘 알려진 것이다. IgE에 대해 상보적인 펩티드 서열을 함유하는 단백질 또는 IgE의 분절에 대해 상보적인 펩티드는 IgE 매개성 알러지 증세를 경감시키는데 효과가 있다.
염증생성시의 인체의 주요 구조적 단백질인 콜라겐파괴 현상은 질환상태의 숙주의 병리상태에 중요하다. 가수분해성 리소좀 메탈로 효소인 활성화된 콜라게나제는 병상태의 개시단계에서 단백질 가수분해에 의해 콜라겐을 공격한다. 콜라게나제의 촉매적 부위에 대해 상보적인 폴리펩티드는 콜라게나제 불활성화 시약일 수 있다. 포유동물의 콜라게나제가 폴리펩티드 각 사슬대의 어떤 특정 부위 한곳에서 천연타잎 I콜라겐을 가수분해한다는 사실때문에, 천연타잎 I 콜라겐의 상기 동일부위에 대해 상보적인 폴리펩티드를 콜라게나제에 의한 분해로부터 콜라겐을 보호하는데 사용할수 있다.
독성 펩티드 또는 단백질에 대해 상보적인 폴리펩티드를 생체내 또는 실험관내에서 적당히 투여하면, 상기 독성 물질과 결합하여 이들의 독소력을 감소시키거나 또는 없앤다.
본 발명의 상보적인 펩티드 또는 그의 항체를 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법은 단백질 성분이 과생산되거나 또는 적게 생산되어 일으키는 병의 치료 및 단백질성 물질로 인한 생물학적 반응의 감소 또는 증가를 나타내는 치료법에 유용하다. 특히, 이러한 치료용 조성물은 약학적 허용담체와 함께 유효량의 상보적 펩티드 또는 그의 항체를 포함하고 있다. 특히 활성성분으로 본 발명의 상보적 폴리펩티드 또는 그의 항체를 함유하는 약학적 조성물은 사용되는 투여모드에 따라 적합한 고체 또는 액체 담체와 함께 제형화될수 있다. 예를 들면, 비경구용 제제는 주사액이며, 이것은 부형제로서 생리적 식염수, 평형염 용액, 또는 이와 비슷한 약학적 및 약리학적 허용액을 사용하고 있다. 경구용 제제는 정제 또는 캡슐같은 고체, 또는 물약 또는 현탁제등일수 있다.
본 발명의 치료방법에 있어서, 상보적인 폴리펩티드 또는 그의 항체은 경구적으로, 정맥내로, 근육내로, 복강내로, 콧속으로, 피내로, 피하내로 등의 여러 방식으로 인간 또는 기타 표적 유기체에 투여될수 있다. 투여의 특이 모드와 용량은 환자의 특이성, 치료를 요하는 상태 및/또는 병의 종류와 병상태를 고려하여 선택될 것이다. 예를 들면, 외래 단백질성 독소에 의한 감염 또는 그에 노출된 것은 몇일 내지 몇주간 하루에 1회 또는 2회로 처리하고 : 암 또는 종양 치료같은 증식성 질환의 치료는 몇 달 또는 몇 년을 두고 일일용법 또는 하루에 여러번 투여하는 방법을 사용한다. 본 발명의 상보적 펩티드 또는 이것에 대한 항체용법은 다른 치료방법과 함께 병행해서 사용되거나 또는 화학예방제 또는 화학치료제와 함께 병용하여 사용될수 있다.
본 발명을 인간에게 적용하여 얻을수 있는 잇점은 무한하며 이것은 진단학, 약제의 운반, 단백질 및 세포교차결합 능력, 식물, 박테리아 또는 곤충에서의 독소 중화력, 어떤 종양이 자라는데 필수적인 펩티드 성장인자의 중화를 비롯한 수많은 기작에 의한 종양성장의 억제등을 포함한다. 본 발명의 이용도는 여기에 서술된 실시예의 범주를 능가한다.
핵산의 뉴클레오티드 트리플렛 코돈 서열의 짝관계는 특정 폴리펩티드들의 작용활성 및 상호 관계를 연구함으로써 그 중요성이 밝혀졌다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체화를 예시한 것이며, 특허청구범위에 의해 특별히 지적하지 않은 한 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
아드레노코르티코트로핀 호르몬(ACTH, 아미노산 1-24를 함유하는 분체)과 이것의 상보적인 폴리 펩티드(HTCA, 1-24)를 디자인, 제조하는 방법.
합성 ACTH 분체 1-24개를 Organon(West Orange, NJ)에서 구입하였다. ACTH(1-24)을 암호하는 m-RNA(메센저 RNA)의 일차구조는 Nakanishi et al(Nature(1979) Vol. 278, pp. 423-427)에 의해 알수 있었으며, 이것은 표 8에 나타나 있다. m-RNA 서열위에 상응하는 ACTH(1-24)의 아미노산 서열이 나타나있다. m-RNA가 역평행 방향으로 염기쌍을 형성하라 때, 표 8에 나타낸 상보적인 뉴클레오티드 서열(C-RNA)이 산출되었다. C-RNA 서열 아래에는 아미노산 HTCA 서열을 나타내었다. 상기 HTCA는 c-RNA 서열을 5'-3' 방향으로 해독하여 얻어진 ACTH(1-24)에 대해 상보적인 폴리펩티드이다.
[표 8]
상기에 나타낸 HTCA의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 페닌실라연구소(San Carlos CA)의 발명자에 의해 합성되었다.
[실시예 1B]
ACTH(1-24)와 그의 상보적 폴리펩티드 HTCA(1-24)의 결합
ACTH(1-24)와 그의 상보적 폴리펩티드 HTCA(1-24)간의 결합친화력을 증명하기 위해 Johnson et al(J. Immunol(1982) Vol. 129, pp. 2357-2359)에 의해 교시된 일반적인 방법을 사용하였다. 카보네이트-바이카보네이트 코팅 버퍼중의 HTCA 또는 인슐린을 웰 하나당 1-25마이크로그램(㎍)씩 둥근 밑바닥을 지닌 96웰 마이크로티터 플레이트에 가한 뒤 4℃에서 8사간 동안 항온배양하였다. 상기 플레이트를 인산염완충식염수(PBS)-Tween20(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo)버퍼로 세척하였다.
인슐린이 코팅된 웰 및 HTCA가 코팅된 웰에 PBS-Tween 버퍼중의 합성 ACTH(1-24) 10㎍을 가했다. 대조용 웰(HTCA 단독)은 PBS-Tween만을 포함하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온배양한 뒤 PBS-Tween 버퍼로 3회 세척하였다. 합성 ACTH 1-13(Accurate Biochemicals, Westbury N.Y)의 아미드에 대하여 암호된 도끼 항혈청을 각 웰에 가한 뒤 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온배양하였다. PBS-Tween 버퍼로 3회 세척한 뒤 PBS-Tween 버퍼 중의 알카리성 포스페이트가 접합된 염소의 항토끼 IgG(Miles Laboratories, Elkharbt, IN)(1 : 300희석)을 가하였다. 실온에서 1시간동안 항온 배양한후, 플레이트를 PBS-Tween 버퍼로 3회 세척하고 각웰을 카보네이트-바이카보네이트 버퍼중의 p-니트로페릴 포스페이트 200마이크로리너(μL)(1mg/ml)로 1시간 30분동안 실온에서 처리하였다. 3N NaOH(50μl)을 각웰에 첨가함으로써 효소반응을 중지시키고, 알카리성 포스파타제 생성물과 p-니트로페놀의 광학적 흡수도를 405nm에서 측정하였다. 코팅된 마이로티터웰에 결합된 ACTH는 효소 결합 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 측정되었다.
본 실시예 결과가 제3도에 나타나 있다. 합성 ACTH(1-24)는 인슐린 코팅 마이크로티터 웰에 결합된 것이 아니라, HTCA 코팅 마이크로리터 웰에 결합되었다. ACTH(1-13 아미드)에 특이한 항체는 HTCA 코팅웰에 결합하지 않았을뿐더러, 인슐린 코팅웰에도 결합하지 않았다. 결합된 ACTH의 몰양은 HTCA 코팅 농도에 정비례하며, 이로부터 두개의 펩티드가 1 : 1로 결합됨을 알수 있다(데이터 분석은 나타내지 않음).
마이크로티터 플레이터를 만들고, 상술된 것처럼 처리하되, 단 3.7nmol/웰 HTCA로 코팅시켰다. 코팅된 웰 각각에 제4도의 횡좌표상에 명시된 HTCA량과 3.7nmol ACTH를 합한 용액을 가한다. ACTH 결합은 ELISA로 평가했으며, 90%의 ACTH-HTCA 결합이 특이적인 것으로 나타났다. 제4도의 데이터를 Scatchard 분석(나타내지 않음)한 결과 항체- 항원 복합체에 의해 나타난 친화도와 비교해볼 때 1.9마이크로몰랄의 Kd를 갖는 하나의 균일한 결합부위를 나타내었다.
[실시예 1C]
3'-5' HTCA 에 대한 I125ACTH 의 결합.
실시예 1A 표 8에 나타난 상보적인 RNA(cRNA) 서열을 이용하되, 3'-5' 방향으로 cRNA로 해독하여 하기의 아미노산 서열을 얻고, 각 펩티드(3'-5' HTCA)를 화학적으로 합성하였다 :
137P 염기서열
실시예 1B의 설명된 방법을 사용하여 폴리비닐 마이크로티터 웰을 3'-5' HTCA 1mM용액 또는 BSA로 코팅시켰다.
BSA와 3'-5' HTCA로 코팅된 웰을 세척한 뒤, 서로 다른 농도를 갖는 I125ACTH(1-39)(New England Nuclear Boston, MA)의 3개 용액중 하나로 처리하였다. 45분 동안 항온 배앙한후, 용액을 제거하고 마이크로티터 웰을 세척하였다. 마이크로티터 웰을 분리한 뒤 Beckman Gamma 5500감마 카운터로 요오드125의 함량을 분석하였다. 이같은 시험결과는 표 9에 나타내었다. 결합된125I-ACTH는 과량의 라벨되지 않은 ACTH가 존재 또는 부재하는 상태에서 3가지 농도로 2회 측정되었다.
[표 9]
표 9의 자료에서 나타난 것처럼125I-ACTH는 광범위한 결합 작용을 갖는 것으로 잘 알려진 단백질인 코팅된 BSA에는 결합하지 않지만 코팅된 3'-5'HTCA에는 결합한다. 3'-5'HTCA 코팅된 마이크로티터웰에 대한125I-ACTH의 결합력은 과량의 유리 ACTH 존재하에서 억제된다. 이 결과는 원형 펩티드에 대해 상보적인 펩티드가 친화력이 있으며, 또한 이러한 상보적인 폴리펩티드는 3'-5' 방향으로 상보적 핵산 코돈 서열을 해독함으로써, 그에 의해 암호된 펩티드를 화학적으로 합성하여 디자인 및 제조할수 있다는 사실을 입증한 것이다.
[실시예 1D]
HTCA의 성분 펩티드 서열에 대한125I-ACTH의 결합도.
실시예 1A의 표 8에 나타낸 cRNA 서열과 HTCA 서열을 이용하여, HTCA 아미노산의 카르복시-말단부위를 갖는 일련의 펩티드를 합성하였다. 5랑체(5-mer)는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함하였다 : H2N-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. 10량체(10-mer)는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함하였다 : H2N-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. 20개의 멤버로 구성된펩티드(20-mer)는 다음의 아미노산 서열을 포함한다 : H2N-His-Arg-Ara-Leu-Leu-Ala-His-Arg-Lew-Ala-Pro-Ara-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-CooH. 이러한 펩티드 각각을 사용하여 마이크로티터웰을 코팅하고, 코팅된 웰은 실시예 1C에 기술된 바와 같이125I-ACTH 결합 능력을 시험하였다. 이결과는 표(10)에 나타나 있다.
[표 10]
표 (10)의 데이터에서 알수 있는 것처럼, HTCA 서열의 펩티드 모두는125I-ACTH의 능력을 나타낸다.
[실시예 1E]
역방향성을 갖고 있는 HTCA 및 그에 대한125I-ACTH(1-39)의 결합력 아미노산 서열 역방향성(아미노-말단 및 카르복시말단이 상호 역으로 된것)를 갖는 24-mer HTCA 변형체(R-HTCA)를 합성하였으며, 이것은 다음의 서열을 지니고 있었다 : H2N-Arg-Val-Gly-His-Phe-Val-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-His-Lew-His-Val-Gly-CooH. 실시예 1-C에 기술된 방법에 따라 웰코팅과125I-ACTH 결합과정을 수행하였으며, 그 결과는 표 11에 나타내었다.
[표 11]
표 11에서 입증된 바와 같이, ACTH에 대해 상보적인 R-HTCA 폴리펩티드는 ACTH에 상당한 친화도를 가지고 있다. 이것은 본 발명의 범주를 나타낸다. 여기서 특별히 테스트된 역방향성은 폴리펩티드를 다지인하는데 있어서 생물리화학적 효과에 의한 특이상황하에서 하나의 변형을 나타낸 것이다. HTCA가 ACTH 서열에 대해 역평행인 아미노산을 갖는다면 R-HTCA 서열은 ACTH 아미노산 서열에 대해 평행하다. 그러므로 원형 또는 표적 아미노산 서열에 대해 상보적인 상기와 같은 평행 및 역평행 펩티드 또는 폴리펩티드 둘 모두가 친화도를 지닌다. 원형 펩티드 또는 단백질에 대해 상보적인 폴리펩티드의 상보성 또는 친화도는 상기 상보적 폴리펩티드의 아미노-말단 및 카복시 말단 방향상과 관계없이 유지된다.
[실시예 1F]
HTCA에 대한 항체의 제조 및 특성
Avrameas et al(Immunochemistry(1969) Vol. 6, pp. 53-66)의 방법에 따라 200㎍ HTCA를 6.7mM 글루타르 알데하이드를 사용해 200㎍의 키홀림페트 헤모시아닌(KLH)에 커플링시킴으로서 항원형태의 HTCA를 제조할수 있다. Bio-Rad P-10칼럼(Bio-Rad, Richmond, CA)를 통과시켜 HTCA-KLH 접합체에서 과량의 글루타르알데히드를 제거하였다.
0.5ml의 완전 Freund 보강액중의 25㎍ HTCA-KLH를 함유하는 3가지 주사를 2주간의 간격으로 두고 토끼에 주사하였다. 염소의 항-토끼 면역글로불린에 커플화된 세파로즈 4B(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 칼럼상에서 면역친화 크로마토그래피에 의해 상기에서 얻어진 토끼의 항혈청으로부터 면역글루불린 모두를 분리하였다. 항-HTCA 항체를 정제하기 위해, KLH에 커플화된 세파로즈 4B 컬럼속을 통과시킴으로서 총 면역글루불린으로부터 KLH를 제거하였다. 정제된 항체 제제(항-HTCA)제제의 1 : 300 회석물을 간접 ELISA 분석한 결과 HTCA 적어도 100ng이 검출되었다.
ACTH 및 항-HTCA에 의한 글루코코르티코이드 호르몬 생산의 유도현상은 배양된 포유류 세포에서 밝혀졌다. 마이크로티터 플레이트중의 마우스 아드레날 종양(Y-1) 세포의 배양물을 배양배지, ACTH(10마이크로유니트/웰) 또는 항-HTCA 희석물로 처리하였다. 이 실험결과가 표 12에 나타나 있다.
[표 12]
a는 마이크로티터 플레이트중의 마우스 아드레날(Y-1) 세포의 배양물들을 배양배지, ACTH(10마이크로유니트/웰) 또는 상기 표기된 HTCA에 대한 항체의 희석물로 처리한 것이다. 37℃로 4% CO₂분위기 하에서 18시간동안 항온배양한후, 복제 배양물을 혼주화시킨 뒤 코르티코스테론을 사용 방사선면역분석(RIA)함으로서(Smith et al, Science(1982), Vol. 218, pp. 1311-1312) 글루코코르티코이드 호르몬 생산을 분석하였다. b는 실험 샘플과 코르티코스테론 표준물에 대한 평행 용량 반응은 10배 이상의 범위에서 얻어졌다. 분석치 내의 편차는 8.8%였다. c는 측정되지 않았다.
항-HTCA에 의해 마우스 아드레날 종양 세포 ACTH 수용체가 활성화된 것으로 보아 항체 및 ACTH는 배열이 상호 유사한 동족체임을 나타내준다. 정상 토끼 혈청 또는 KLH에 대한 항체 그 어느것도 스테로이도게닉 반응을 일으키지 않았다(자료는 나타내지 않음). 인슐린 또는 베타 부신 반응제의 수용체가 항-이디오타입 항체에 의해 활성화(Sege et al, Proc. Nat'l. Aca. Sci.(1978)와 베타-부신, Schreiber et al, Proc. Nat'l Acad. Sci, (1980), Vol. 77, pp. 7385-7389)되며, 이같은 활성화는 인슐린 또는 베타 부신 반응제에 대한 항체에 의해서도 발생되었다. 그러므로, 항-이디오타입 항체와 상보적인 펩티드리간드 사이에 동족체관계가 존재한다.
[실시예 1G]
마우스 아드레날 종양(Y-1) 세포의 대한 항-HTCA의 결합도.
글루타르알데히드로 마이크로티터 플레이트의 둥근 밑바닥을 지닌 웰 중에 마우스 아드레날 종양(Y-1)세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 여러 가지 농도의 ATCH 존재하에 또는 토끼의 항-KLH 또는 토끼의 항-HTCA 만으로 처리하였다. 세척후, 마이크로티터 웰을 토끼의 면역글로불린에 대한 염소의 항체로 처리하였다. 상기 염소의 항체는 효소인 알카리성 포스파타제에 커플화되어 있다. 세척하여 결합되지 않은 항체-포스파타제 복합체를 제거한후, p-니트로 페닐 포스페이트를 가한 뒤 405nM에서 효소-의존성 흡광도를 측정하였다. 제5도에 나타난 것처럼, ACTH는 항-HTCA의 결합력을 용량-의존성 방식으로 차단하였다. ACTH와 항-HTCA는 마우스 아드레날 종양(Y-1) 세포상의 동일 결합부위에 대해 경쟁적인 것으로 사료된다. 토끼의 KLH는 효과가 없었다(음영부위).
[실시예 1H]
ACTH 수용체에 대한 정제작용.
정제된 항-HTCA를 시아노겐 브로마이드로 활성화된 세파로즈 4B에 공유결합시켰다. 마우스의 아드레날 종양(Y-1) 세포 약 108개를 2nM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 존재하에 40KHZ(Branson E Module Bath Sonicator)하에서 5분간 초음파 처리하였다. 원심분리로 세포파편을 제거한후, 상청액을 항 HTCA에 커플화된 세파로즈 4B를 함유하는 크로마토그래프 컬럼속에 통과시켰다. 세척후 0.1M의 글리신(pH 2.0)을 사용하여 잔여의 결합물질을 컬럼으로부터 용출시켰다. 용출된 물질은 무수 폴리에틸렌 글리콜에 대하여 투석시킴으로서 중화농축하였다. 농축된 물질은 세파아크릴 S-200(Pharmacia, Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 컬럼상에 겔 크로마토그래피시켰다. 방사선 수용체 방법을 사용하여 겔 크로마토그래피 분획물의 ACTH 수용체 활성도를 분석하였다. 이 방법은 96-웰 폴리비닐 플레이트중에서 상기 분류물을 18시간동안 항온 배양한 뒤, 비결합물질은 세척제거하는 것을 포함한다. 방사선 요오드화한 ACTH(125I-ACTH, 70마이크로큐리/㎍, New England Nuclear, Boston, MA)를 비라벨된 ACTH 과량(10㎍/웰)존재하에 또는 이것없이 상기 웰중에 가하였다. 플레이트를 세척한 뒤 플레이트에서 웰을 분리하여 Beckman Gamman 5500gamma 카운터로125I-ACTH를 측정하였다. 크로마토그래피 분류물을 280nM에서 측정하여 흡광도를 기록하였다. 본 실시예 결과가 제6도에 나타나 있다.
라벨되지 않은 ACTH 부재하에 결합된 방사능 활성치로부터 과량의 라벨되지 않은 ACTH(일반적으로 10% 이하)존재하에 결합된 방사능 활성치를 차감시킴으로써 특이하게 결합된125I-ACTH를 알수 있다. 158 킬로달톤(K), 67(K), 45(K) 및 14.4(K) 분자량 표준물의 용출 지점은 화살표로 나타냈다.
ACTH 수용체 활성도는 약 80-100K 분자량을 지니고 있다. 이것은 광친화 라벨링 기술(Ramachan-dran et al, Proc, Nat'l Acad. Sci. (1980), Vol. 77, pp. 3697-3970)에 의해 확인된 ACTH 수용체에 대한 것과 비슷한 것으로 나타났다.
본 실시예에 기재된 방법은 임의의 펩티드 또는 단백질 리간드 수용체 부위의 성분을 얻기 위한 본 발명의 일반적인 방법이다. 먼저 펩티드 또는 단백질의 최소한 일부에 대해 상보적인 폴리펩티드가 제공된다. 그후 상기의 상보적 폴리펩티드에 대한 항체를 만든다. 항체는 화학적 수단 또는 흡착 수단에 의해 고체 매트릭스에 커플화된다. 수용체-함유 샘플을 상기 항체가 커플화된 매트릭스로 처리하여 수용체부위의 성분을 특이하게 결합시킨다. 최종적으로 결합된 성분을 용출한다.
[실시예 1I]
감마 엔도르핀, 그의 상보적인 폴리펩티드를 디자인 및 제조하는 방법.
본 발명의 일반적인 응용분야와 그 중요성을 예시하기 위해서 상호작용하는 상보적 폴리펩티드의 두 번째 쌍을 연구하였다. 소의 감마 엔도르핀 전구체의 아미노산 서열 중 104 위치 내지 120 위치의 서열과 이를 암호하는 nRNA 서열이 Nakanishi et al(Nature(1979), Vol. 278, pp. 423-427)에 의해 얻어졌다. 표 13은 감마 엔도르핀 아미노산 서열(엔도(=endo)로 명명)과 그에 상응하는 m-RNA 서열을 나타낸 것이다. 감마-엔도에 대한 m-RAN와 역평행으로 염기쌍을 형성하는 RNA의 상보적 스트랜드(c-RNA)가 m-RNA 아래쪽에 나타나 있으며, 상기 cRNA는 m-RNA와 평행하게 표 5에 나타나 있다. 5'-3'방향으로 cRNA를 해독하여 암호된 서열을 갖는 폴리펩티드(감마-done)는 c-RNA의 아래쪽에 나타나 있다(감마-odne)라 명명).
[표 13]
감마-odne의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 페닌실라 연구소(San Carlos, CA)의 발명자에 의해 합성되었다.
[실시예 1J]
감마-엔도르핀(γ-엔도)에 상보적인 폴리펩티드인 감마(γ)-odne의 특성.
소의 합성 감마-엔도르핀은 Boehringer Manheim(Indianapolis, IN)에서 구입하였으며 합성 감마-엔도에 대한 토끼 항체는 Accurate Biochemicals(Westbury, NY)에서 구입하였다.
밑바닥이 둥근 96-웰 마이크로티터 플레이트의 웰을 감마-odne(40㎍/웰) 인슐린(20μ/웰) 또는 소혈청알부민(BAS, 200㎍/웰)로 코팅시켰다(실시예 1B에 기재된 방법에 의하여). 여러 가지 농도의 감마-엔도르핀을(제7도의 횡좌표상에 나타냄)1시간동안 코팅된 웰중에서 항온 배양한 뒤, 플레이트를 PBS-Tween버퍼로 3회 세척하였다. 웰을 감마-엔도르핀에 대한 토끼의 항체로 처리한 뒤, 세척하고 다시 토끼의 면역 글로불린에 대한 염소의 항체로 처리하였다. 이때 상기 염소의 항체는 알카리성 포스파타제에 접합되어 있다. 비결합된 염소의 항체 접합체를 세척제거 한 뒤, 결합된 알카리성 포스파타제 활성도를 상술된 p-니트로페닐포스페이트로측정하였다. 이 결과는 제7도에 나타나 있다. 405nM에서 흡광도는 감마-odne, 인슐린 또는 BSA로 코팅된 웰에 결합한 감마- 엔도르핀 결합의 정도를 반영한 것이다. 고정된 인슐린 또는 BSA에 대한 감마- 엔도르핀의 결합도에 비해 고정된 감마-odne 대한 감마-엔도르핀의 결합도가 더 우수했다. 음영부분은 과량의 용해성 감마-odne 존재하의 감마-엔도르핀 결합 정도를 나타낸 것이다. 그러므로 상보적 펩티드의 두번째 쌍은 친화도와 뚜렷한 일치성을 나타낸다는 점에서 상호작용한다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 1K]
실시예 (1A-1J)는 뉴클레오티드 암호 서열의 적어도 일부가 공지된 단백질 또는 펩티드에 대해 상보적인 폴리펩티드를 디자인하고 제조하기 위해 일반적인 방법을 적용한 예를 예시하였다. 예를 들면, 5'-3'방향으로 해독될 때 제1단백질 또는 펩티드의 최소한 일부의 대해 상보적인 폴리펩티드를 암호하는 상보적 뉴클레오티드 서열은 DNA 일수도 있다. 이 DNA를 플라스미드내로 삽입하면 재조합 DNA전이 벡터를 형성한다. 단세포 유기체인 박테리아, 이스트 또는 포유류 세포는 상기 재조합 DNA벡터로 형질전환되어 상기 상보적 폴리펩티드를 생합성하는 형질전환성 단세포 유기체가 된다. 이러한 삽입 및 형질 전환 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
아미노산으로부터 폴리펩티드를 화학적으로 합성하는 기술뿐아니라, 목적하는 상보적인 아미노산 서열을 함유한 단백질로부터 단백질 가수분해에 의해 폴리펩티드를 얻는 방법은 공지되어 있다. 그러므로, 펩티드 또는 단백질에 대해 상보적인 폴리펩티드를 얻는 많은 방법들이 유용하다.
[실시예 1L]
아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH)에 대해 상보적인 펩티드에 의한 마우스의 스트레스 반응의 억제.
여러가지 자극(스트레스)에 대한 응답 반응에서 동물은 ACTH를 생산한다. 이것은 아드레날 세포(부신세포)상에서 작용하여 코르티코스테론의 혈청 레벨을 증가시킨다. 상보적 펩티드인 HTCA(실시예 1A 참조)에 의한 생체내의 ACTH의 작용 억제 효과를 테스트하기 위해서 하기의 실험이 수행되었다. 마우스(Balb/c)에 상보적인 펩티드 HTCA를 주사한 뒤 일정시간이 지난후에 자극을 주고, 치사시켰다. 통상적인 면역분석법에 의해 혈청 코르키코스테론 레벨이 결정되었다.
첫 번째 실험으로서, PBS(인산염 완충식염수)중에 용해된 1mg HTCA(포스페이트 완충 식염수)를 3마리 Balb/c 마우스로 구성된 8개의 군에 각각 주사하였다. 3Balb/c 마우스로 구성된 2개의 군은 PBS만 주사하였다. 각각의 마우스의 군에 대한 평균 코르티코스테론 레벨은 몇일 경과한 뒤 자극을 주어 결정되었다. 표 14에 결과가 나타나 있다. 여기서 자극은 냉수에 30초간 침수시키는 방법이다.
[표 14]
*1M-근육내주사
IP-복강내주사
1mg의 HTCA를 근육내 주사한지 2시간후에 자극을 주었을 때 발생된 혈청 코르티코스테론의 레벨은 최대 50%가 감소되었다. 두번째 실험에서는 3마리의 Balb/c 마우스로 구성된 여러개의 군에 각가 HTCA 양을 달리하여 근육내 주사하였다. 2시간 경과후에 마우스를 냉수에 침수시켜서 자극을 주었다.
표 15는 상기 마우스 군들에 있어서 평균 혈청 코르티코스테론 레벨을 나타낸 것이다.
[표 15]
상기 실험결과는 ACTH에 대해 상보적인 펩티드가 마우스의 코르티코스테론 자극 응답을 저하시키는 능력이 있음을 나타낸 것이다.
[실시예 1M]
감마- 엔도르핀에 상보적인 펩티드에 의한 NG108-15 세포에 대한125I-베타-엔도르핀 결합의 억제.
NG108-15 세포는 마취제 수용체라 불리는 베타-엔도르핀에 대한 수용체를 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. 베타-엔도르핀 외에도, 베타-엔도르핀의 동족체 및 감마-엔도르핀이 상술된 마취제 수용체에 결합한다. 실시예 1I에 기재된 감마-엔도르핀에 상보적인 펩티드인 감마-ODNE을125I-베타-엔도르핀이 NG108-15 세포상의 마취제 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력이 있는지 시험하였다. 감마-엔도르핀은 좀더 큰 펩티드인 베타-엔도르핀의 단편이다.
다른 실험으로 마이크로티터 웰에 평판된 NG108-15 세포에 대한125I-베타-엔도르핀의 특이 결합도를 라벨되지 않은 베타-엔도르핀과의 경쟁에 의해 측정하였다. 총 결합의 70%가 특이적이었다.
이 실험에 있어, 마이크로티터 웰내의 NG108-15 세포와 30분간 항온 배양(37℃)하기 전에,125I-베타 엔도르핀을 각기 다른양의 상보적 펩티드인 감마-ODNE과 함께 30분간 사전항온 배양하였다. 배양후 세포를 3회 세척하고, 세포 결합 방사선 활성은 Packard Multi-Prias감마 카운터로 결정하였다. 표 16은 감마-ODNE가 NG108-15 세포에125I-베타-엔도르핀(10-11M,2000Cl/mmol)이 결합하는 것을 억제함을 나타내준다.
[표 16]
[실시예 1N]
감마-엔도르핀에 대해 상보적인 펩티드에 대한 항체를 이용하여 마우스에 긴장병을 유도하는 방법.
다량의 마취성 물질이 동물에 있어 긴장상태를 유도하며, 이것은 마취제 길항제인 날옥손(naloxone) 처리에 의해 억제된다는 것은 이미 잘 알려져 있다. 상기 실시예와 비슷한 방식으로, 마취성 펩티드인 감마-엔도르핀에 상보적인 펩티드(감마-ODNE)가 마취특성을 지닌 항체를 유도하는지를 시험하였다.
감마-ODNE(실시예 1I)는 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)에 접합시키고, Freund 보조제와 함께 통상적인 방법으로 토끼의 항체를 제조하는데 사용되었다(실시예 1F 참조). 정상적인 토끼의 혈청과 유도된 토끼의 혈청을 대뇌관내로 암컷 ICR 마우스에 주사하였다. 50μl 정상토끼 혈청(1 : 00으로 희석) 주사액은 마취성 간장병을 유도하지 않았다. 상보적 펩티드(감마-ODNE)로 유도된 토끼혈청 50μl(1 : 00으로 희석)를 주사한 경우 긴장병을 유도하였는데 이것은 마취성 길항제인 날옥손 0.2mg을 피하내로 주입하였을 때 전환되었다.
이 결과는 마취제의 상보적 펩티드에 대한 항체가 마취 작용을 나타낼수 있음을 입증한 것이다.
[실시예 10]
아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH)에 대해 상보적인 두 개 펩티드 사이의 항원적 관계
실시예 1B와 1C에서 HTCA와 3'-5'로 각각 기술된 ACTH에 상보하는 두 개 펩티드를 글루타르알데히드로써 Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)에 각각 커플시켜서(실온에서 30분간 1mg 펩티드, 1mg KLH, 30mM 글루타르알데히드 그후 투석) 토끼 면역을 위한 항원을 제조한다. 두 마리 토끼를 4주 동안 250㎍의 펩티드-KLH 항원으로 매주 각각 주사한다. 각 토끼를 최종 주사 후 삼주동안 1주 2회 채혈한다. 각 토끼의 혈청으로부터 총 면역글로불린에 해당하는 항체들은 혈청을 50% 포화 암모늄 설페이트로 4℃에서 침전시킨후, DEAE 컬럼상에서 표준 이온교환 크로마토그래피시켜 정제한다.
각 펩티드에 대한 면역글로불린의 결합을 시험하기 위해, 효소-결합된 면역흡착 분석법을 실시하였다. 이분석에서, 상보적 펩티드 중 하나를 pH 9.0의 카르보네이트 코팅 완충제에서 하룻밤동안 폴리카르보네이트 플레이트상에 피복시킨다. 결합되지 않은 펨티드는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)-TWEEN 20으로 3회 세척하여 제거한다. 각기 다른 양의 면역글로불린을 PBS-TWEEN 20용액내의 펩티드-피복된 웰에 가하고 1시간 동안 항온 배양한다. 결합되지 않은 면역글로불린을 PBS-TWEEN 20으로 세척하여 제거한다. 각 웰에 알카린 포스파타제 효소에 커플된 염소 항-토끼 IgG의 1 : 300희석물을 가한다. 1시간후, 각 웰을 PBS-TWEEN 20으로 세척하여 결합되지 않은 이차 항체를 제거한다. 남은 이차 항체의 양을 측정하기 위해, p-니트로페닐 포스페이트와 남은 알카리 포스파타제 효소를 15분간 반응시키고, 그 반응을 3M NaOH를 가해 정지시킨 후 490nm에서 생성된 니트로페놀을 분광학적으로 측정한다.
표 17은 그 분석 결과를 나타낸다.
0.01 이하의 흡광도를 나타내는 세가지 대조용(ACTH 플레이트+면역된 토끼 면역글로불린, HTCA 플레이트+정상 토끼 면역글로불린, 3'-5' HTCA 플레이트+정상토끼 면역글로불린)는 나타내지 않았다.
[표 17]
이 결과는 하나의 상보적 펩티드에 대한 항체가 다른 상보적 펩티드를 인식하고 결합함을 입증해준다. 따라서, 두 개의 상보적 펩티드는 그들의 서열이 똑같은 아미노산을 갖는 동일한 절대적 위치가 단지 한곳임에도 불구하고 항원적으로 관련이 있음을 알 수 있다.
[실시예 1P]
아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH)에 대한 항체와 ACTH의 상보성 펩티드에 대한 항체 사이의 아이오도타입 : 항-아이오도타입 관계
ACTH에 대한 표준 방사선 면역 분석법(RIA)을 사용하여(Immuno Nuclear Corporation, CAT. #2400), ACTH의 상보성 펩티드(HTCA)에 대한 항체가 ACTH에 대한 항체와 결합하는 능력이 있는지를 시험한다. ACTH에 대한 표준 RIA에서 , 기지양의 비라벨된 ACTH를 방사선 라벨된 ACTH와 ACTH에 대한 항체의 용액에 가하면 방사선 라벨된 ACTH가 그의 항체에 대한 결합을 경쟁적으로 제거한다. 방사선 라벨 결합의 양은 그 항체를 면역침전시키고, 그 침전물의 방사선 활성을 카운팅 함으로써 측정한다.
이 실험에서, 비라벨된 ACTH, 상보적인 펩티드 HTCA로 면역된 토끼로부터 얻은 면역글로불린과 정상 토끼로부터 얻은 면역글로불린을 사용하여 RIA에서 방사선 라벨된 ACTH와 경쟁하게 한다.
면역글로불린(35mg/ml)용액은 인산염 완충 식염수 중에서 제조하고, ACTH와125I-ACTH를 RIA 키트에서 상술한 바와 같이 제조한다. 표 18은 경쟁 분석법의 결과를 나타낸 것이다.
[표 18]
이 결과는 ACTH의 상보성 펩티드에 대한 항체가 ACTH에 대한 항체를 인식하고 그에 결합함을 나타내며, 그 결과 상기 항체들간에 이디오타입 : 항- 이디오타입 관계가 있음을 확인했다.
[실시예 1Q]
동물 예방접종(vaccination)에 의해 발생된 아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH)의 상보성 펩티드에 대한 항체의 생체내 활성
ACTH에 대한 상보성 펩티드(HTCA 실시예 1A 참조)를 실시예 10의 방법에 의해 Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)에 접합시킨다. 시간당 세 마리의 BALB/c 마우스를 면역시킨다(0일째 100㎍ 접합체/0.2ml 완전 프로인드 보조제를 복강내 및 피하주사, 1,2,3,4주째에 100㎍ 접합체/0.2ml 완전 프로인드 보조제를 복강내 및 피하주사).
네 마리의 토끼를 면역시킨다(300㎍ 접합체/0.1ml 완전 프로인드 보조제를 0일째 주사, 200㎍ 접합체/1.0ml 불완전 프로인드 보조제를 10,20,30,40과 60일째 주사).
마우스 실험에서 각 시간당 세 마리를 치사시키고, 채혈하여 응혈지게하고, 그것의 항체 역가를 후술하는 고체상 방사선 면역 분석법(RIA)에 의해 측정했다. HTCA를 용액(0.25mg/ml)으로부터 폴리비닐 마이크로타이터 플레이트의 웰내에 피복시킨다. 웰을 TWEEN 20이 함유된 인산염 완충식염수(PBS)로 세척하고, 1 : 5의 일련의 혈청 희석물을 가한다.
1시간 후,125I 토끼 항-마우스 면역글로불린을 가하고 웰을 PBS-TWEEN 20으로 세척하여 비결합된 방사선 라벨을 제거한다. 웰을 편취하여 카운팅함으로써 역가를 측정한다. 마우스의 실험에 있어서 역가는 분당 100 카운트를 나타내는 혈청희석배수로 정의된다. 또한 각 시간점에서 혈청은 시판 RIA법으로 코르티코스테론레벨을 분석한다.
토끼실험에 있어서 매시간 2ml의 혈액을 채혈하여 응고시키고 분석시까지 냉동시켰다. 항체역가는 다음과 같이 효소-결합된 면역흡착분석법(ELISA)으로 측정했다. HTCA는 폴리카르보네이트 플레이트의 웰상에 0.25mg/ml 용액으로 밤새 피복했다. 그후 웰을 세척하고 혈청을 일련의 1 : 5 희석물 중에 가했다. 1시간 경과후 알카리성 포스파타제와 접합시킨 염소 항-토끼 면역글로불린(1 : 300희석물)을 가했다. 1시간내에 웰을 PBS-TWEEN 20으로 세척했다. p-니트로페놀 포스페이트기질을 가하고 급냉(quenching)전에 15분간 3M NaOH와 반응시켰다. 역가는 분광학적으로 490nm에서의 흡광도로 측정했다. 토끼 연구에 있어서, 역가는 0.05 흡광도(백그라운드 0.01)를 나타내는 혈청희석배수로 정의한다. 또한 매시간 시판 RIA방법으로 혈청을 분석하여 코르티코스테론 농도를 측정했다.
표 19와 20은 이 실험의 결과를 항체에 대한 HTCA 역가 및 혈청 코르티코스테론 레벨을 대조용(KHL 만으로 면역하고 HTCA를 받은 것과 똑같은 과정으로 채혈함)의 %로 나타낸 것이다.
[표 19]
[표 20]
마우스 실험에서, 대조용 코르티코스테론 함량은 약 세배로 상승되는 마지막 시점을 제외하고는 거의 정상이다. 대조용 토끼에서 코르티코스테론 함량은 정상 이하로 0 내지 30일 사이에 떨어지며 60일까지 정상레벨로 회복된다.
두개 실험 모두에서, 호르몬유사(ACTH)응답 반응이 일어난후, 응답반응의 일반적인 억제가 뒤따른다. 이 실험들은 상보적인 펩티드 항원이 수용체 결합활성으로 항체 생산을 촉진시킴으로써 생체내에서 호르몬 반응을 완화시킴을 입증한 것이다.
다른 상황에서 바람직할 수도 있는 동근 또는 길항성 항체의 생산을 위해 항원 공급을 변화시키기 위한 노력은 전혀 하지 않았다.
[실시예 1R]
상보성 펩티드 결합에 준한 아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH)에 대한 잠재적 진단 분석
혈청 중의 ACTH 레벨을 측정하는데에 있어서, ACTH에 대한 상보성 펩티드, 특히 실시예 1A의 HTCA를 사용하기 위한 가능성을 고체상 방사선 결합 분석법을 이용해 조사했다. 상보성 펩티드(HTCA)를 1mg/ml로 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시키고, 200μl 표본 샘플을 96개 웰 폴리비닐 분석 플레이트(Micortest III, Falcon cat. #3911)의 웰내에 방치한다. HTCA로 4℃에서 하룻밤 동안 그 웰을 피복시킨다. 코팅 용액을 제거하고 웰을 PBS로 3회 세척한다. 방사선 라벨된 ACTH(125I-ACTH, New England Nuclear NEX-65)를 0.0005% TWEEN-20이 함유된 PBS 중에 희석시켜, 20μl부피내에 50pg(또는 약 30,000cpm)이 운반되도록 한다.
혈청을 PBS/TWEEN 20에 일련적으로 희석하여 최종 부피가 180μl/웰이 되도록 하여 96개 웰 조직 배양 플레이트에서 혈청 샘플을 제조한다. 그 혈청 샘플을 HTCA 피복분석 플레이트에 옮기고 항온 배양한다. 최종적으로 20μl의125I-ACTH 용액을 가하여 항온 배양시키고 200μl의 총샘플을 제거한다. PBS로 3회세척한 후, 그 웰을 플레이트로부터 절단하여 감마 계수기로 계측한다.
분석 플레이트에 샘플들을 옮기기전에 일부 샘플에 비라벨된 ACTH 5㎍을 가하여 비특이성 결합을 측정한다.
이 연구에 사용된 혈청 샘플은 태아송아지 혈청(FCS)에 가해진 50pg/ml 또는 500pg/ml의 ACTH를 함유한다.
표 21의 자료들은 두 개 샘플에 대한 혈청 희석액의 작용에 의한 특이125I-ACTH 결합의 억제 %를 나타낸 것이다.
[표 21]
이 분석에서 총 특이결합은 1분당 1000카운트로 측정되고, 특이활성을 기준으로 50% 특이결합은 혈청 회석액내에 0.85pg ACTH가 존재하는 것을 의미한다.
50pg/ml 혈청 샘플에 있어서, 상업 시판의 방사선 면역분석 기술에 의해 측정되는 바에 의하면 50% 억제가-1.1의 Log10희석에서 나타났다(그래프 내삽법에 의해 측정됨). 따라서, 이 분석에 의해 54pg/ml으로 혈청 샘플이 측정되었고 이는 표준 방법에 의한 것과 양호하게 일치하는 것이다. 그래픽 내삽법에 의해, 500pg/ml 혈청 샘플에 대한 50% 억제가 예상한 바와 같이 -2.0의 Log10희석배수에서 일어난다.
이 결과는 상보성 펩티드 결합에 의거한 발전된 진단 분석의 실시가능성을 입증해준다.
[실시예 1S]
125I-아드레노코르티코트로픽 호르몬과 5'-3'과 3'-5' 상보성 펩티드의 결합비교
고체상 결합 분석법을 사용하여 5'-3'과 3'-5' 상보성 RNA-가닥 펩티드(실시예 1A와 1C참조)가125I-ACTH에 결합하는 능력을 검사한다. 상기 펩티드를 인산염-완충 식염수(140mM-NaCl/3mM-KCl/0.1% NaN3/20mM-인산염 완충제, pH 7.4)에 2mg/ml로 희석하고, 웰당 0.2ml씩 폴리(비닐 클로라이드)마이크로-타이터 플레이트(Becton and Dickinson, Oxnard, CA, U.S.A)에 위치시킨다. 4℃에서 18시간후, 비결합 펩티드를 제거하기 위해 0.1% 소혈청 알부민(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.)이 함유된 인산염-완충식염수로 3회 세척한다.
125I-ACTH를 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염- 완충 식염수로써 여러 농도로 희석하고, 60분간 4℃에서 펩티드-피복 웰에 항온 배양시킨다. 몇개 웰에,125I-ACTH외에도 여러 농도의 용해성 펩티드를 가하여 결합의 특이성을 입증한다. 항온 배양후, 비 결합된 방사선 라벨은 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염-완충 식염수로 세척제거하고, 각 웰의 방사선 활성을 감마-방사선 계수법으로 측정한다. 특이적으로 결합된 방사선 활성의 양은125I-ACTH 결합을 비라벨된 ACTH로 차단시킴으로써 측정한다. 대조용들은125I-ACTH를 가하기전의 인슐린 또는 소 혈청 알부민(2mg/ml)이 피복된 웰을 포함한다.
이 실험에서,125I-ACTH의 1/2-최대 결합이 두 개 상보 펩티드에 있어서 0.3mM ACTH에서 발생된다. 84% 이상의 결합이 특이적인 것으로 나타났으며, 인슐린 또는 송아지 혈청 알부민 플레이트에 대하여 상보성 펩티드 플레이트가 5% 이하로 결합되었음이 관찰되었다. 두 개 상보성 펩티드가 용액 중에 존재할 때, 이들은 똑같은 정도로 경쟁하여 서로 상대방에 대한125I-ACTH 결합을 차단한다.
이 자료들은 ACTH 시스템에서, 5'-3'과 3'-5'상보 펩티드가 ACTH를 결합하는데 있어서 똑같이 유효하다는 것을 입증해준다.
[실시예 2A]
펩티드 호르몬의 수용체 단백질을 암호하는 핵산에 대해 상보적인 핵산을 역해독함으로써 암호되는 폴리펩티드와 상기 펩티드 호르몬 사이의 상동성.
핵산의 상보성 가닥들에 의해 암호적으로 정의된 펩티드를 사이에는 미묘하지만 중요한 기능적이고 구조적인 관계가 존재한다. 이 관계를 정상적인 전사방향인 5'에서 3' 방향으로 상보성 핵산을 해독함으로써 고찰해보았다(참고예, 표 1, 제1도 및 실시예 1A-1H).
상보성 핵산이 역으로 또는 3' 또는 5'방향으로 해독될 때, 얻어진 암호된 아미노산 서열의 독특한 관계가 실시예에서 나타나는 바와 같이 명백하다.
[실시예 2B]
상피세포 생장인자(EGF), EGF 수용체 및 그 EGF 수용체에 대한 상보성 메시지
EGF의 아미노산 서열과 이것의 암호 뉴클레오티드(mRNA) 서열을 Gray(Nature (Londo, 1983), Vol. 303, p.722)와 Scott(Science (1983), Vol. 221, p.236)으로부터 유도된 바대로 제8도에 나타내었다. 또한 제8도에는 Ulrich 의 Nature London, 1984, Vol. 309, p.418로부터 유도된 바와 같은 EGF 수용체의 부분적 아미노산 서열과 부분적 암호 뉴클레오티드 서열(c-DNA)를 나타내었다.
제8도의 마지막 칼럼에는 EGF 수용체를 암호하는 RNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드(RNA) 서열을 나타내었다. EGF 수용체 뉴클레오티드 서열과 이것의 상보적 뉴클레오티드 서열은 역평행 염기-짝짓기 배열을 할것으로 추정된다. 상보적 뉴클레오티드 서열은 그 암호 서열과 똑같은 해독 플레임내에서 해독되었지만 3'에서 5'방향으로 해독되었다. 상기 상보성 뉴클레오티드 서열위에 나타낸 것과 같이 암호된 아미노산 서열이 얻어졌다. XXX 코돈은 종료를 의미한다. 제8도에 나타낸 아미노산 서열의 아미노 말단 방향이 적은 번호로 표시된 방향일 때, EGF 수용체-상보성 폴리펩티드와 EGF내에서 두 개의 상동성 부분(박스로 나타냄)이 나타난다. 단지 이 두 개의 상보성 아미노산 부분을 얻기 위하여 전체 EGF 수용체 상보성 서열(나타내지 않았음)을 분석했다. EGF아미노산 서열 11-16과 24-29는 EGF수용체의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 의해 각각 암호되는 아미노산 서열 111-116과 149-154에 대해 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다.
제8도에 나타낸 바와 같이, 6개의 아미노산으로 구성된 EGF내의 두 개의 상동성 부분에 있어서, 각 서열에서 5개의 아미노산이 동일하다(83% 상동성). 또한, 뉴클레오티드 서열에 있어서, 두 개 부분사이에서 각각 67과 78% 뉴클레오티드 상동성이 존재하며, 상이한 대부분의 뉴클레오티드들은 그 암호된 아미노산(즉 제3염기변화)에는 영향을 미치지 않는 것들이었다. 두 개의 상동성 아미노산 부위는 총 EGF 아미노산 서열의 약 23%에 해당하며(53잔기 중 12), 그 상동성은 너무나 현저하므로 이것이 무작위한 결과에 의한 것으로 보이지는 않는다. 이 아미노산 상동성에 관한 비-무작위 원리는 서열 ASP-GLY-TYR-X-LEU-ASN와 GLU-SER-LEU-X-SER-TYR(이때 X는 임의 아미노산)을 National Biomedical Research Foundation(NBRF)에 보관된 3060개 단백질에 대하여 스크리닝할 때, EGF만이 이 서열을 함유한다는 결과로부터 강력하게 지지된다. National Biomedical Research Foundation에서 탐색된 단백질 서열 데이터 베이스는 SIAO : [Blomquist] NEW. PRO : 80file이다. 전체적으로, 3,060 단백질 서열이 조사되었는데, 6 아미노산 길이의 616,748 테스트 분체 또는 5 아미노산 길이의 619,803 테스트 분체가 포함된다. 리간드와 수용체 보체 서열사이의 상이한 위치에서 상동성 서열에 대한 조사의 정확성을 위하여, 어떠한 임의 아미노산(X)를 배우체(match)로 허용한다. 따라서 상동성 서열에 대한 조사는 제2도에 나타낸 특이 리간드 또는 수용체 보체 서열에 국한되지 않으며, 상이한 위치에서 임의의 아미노산의 치환을 인정한다.
상동성에 대해 시험된 6 아미노산 길이의 616,748분체들 중에서, EGF만이 이 서열들 중 하나를 함유한다. 그러므로, 이 특정 아미노산 서열 사이의 관계는 EGF와 이것의 수용체간에 매우 중요한 관계가 있음을 의미한다.
[실시예 2C]
펩티드 호르몬과 그 펩티드 호르몬 수용체의 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상보성 뉴클레오티드 서열에 의해 암호된 폴리-펩티드 사이의 아미노산 및 뉴클레오티드 상동성의 통계학적인 의미.
임의의 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성이 갖는 통계적인 의미는 특성 상동성이 우연히 일어날 확률인 Pa값을 계산함으로써 결정된다. 사용된 식은 프와송(Poisson)분포의 합계이다.
이때 N은 상동성 서열내의 뉴클레오티드 길이이며 i는 그 서열에 대한 배우체(match)의 수이며 p는 소정의 뉴클레오티드가 짝짓게될 확률이다.
전형적인 무작위 표본에 있어서, 어떠한 위치에서 어떠한 뉴클레오티드에 대한 선호도가 없을때 p=0.25이다. 무작위 표본으로부터 어떠한 현저가 편차가 있는지를 조사하기 위하여, p값을 세 개의 수용체에 대하여 실험적으로 측정한다. 실제로, p값은 항상 0.25내지 0.27 사이이므로, Pa값을 계산하기 위해 간단히 p=0.25로 가정한다. 이상적인 무작위 표본에 있어서 서열내의 N=18과 N=15인 경우, 뉴클레오티드 배우체의 수 (i)는 각각 4.5와 3.75에 해당한다. N=18과 N=15인 각 수용체 서열의 무작위 표본으로부터 편차를 구하기 위해, i값을 각 수용체에 대하여 실험적으로 측정하였는데, 각각 4.75(1.41)과 3.88(1.45)로 나타났다. 통계학적인 의미를 고찰하기 위하여 i값은 평균값으로부터 얻어진 두 개 표준 편차 이상이어야 한다(즉 N=18에 대해서 i=7.57이며 N=15에 대해서 6.78). 따라서, N=18에 대한 Pa값 4.63×10-2또는 N=15에 대한 4.87×10-2는 통계학적으로 중요한 것으로 인정된다. 18뉴클레오티드에 대한 4.63×10-2이하, 그리고 15뉴클레오티드에 대한 4.87×10-2이하의 Pa값이 통계학적으로 중요함이 실험적으로 결정되었다. 제9a도는 EGF와 그 두 개 EGF 수용체 보체사이의 뉴클레오티드 서열 상동성이 1.60×10-3과 1.78×10-4의 Pa값을 각각 갖는 것으로 계산되었음을 나타낸다. 따라서, 이 서열들 사이의 상동성은 대단히 중요한 것으로 염기 배우체의 수가 이상적인 무작의 표본에 평균치로부터 5표준 편차 이상이면 중요하다.
실시예 2B의 과정에 따라 일반적으로 실시되는 다른 분석에서, 다른 펩티드 호르몬과 그들의 수용체 그리고 수용체 상보성 폴리펩티드의 관계가 밝혀졌다.
제9b도에 나타낸 아미노산과 뉴클레오티드 서열은 하기 제공처로부터 수득되었다 :
Taniguchi 등의(Nature London, 1984), Vol. 302, p.305)와 Devos 등의(Nucl, Acid Res. (1983) Vol, VII, p.4307)로 부터의 인터로이킨-2(IL-2).
Nikaido 등의(Nuture (London, 1984), Vol. 311, p,631)로 부터의 인터로이킨-2 수용체(IL-2 수용체).
Yang 등의(Proc. Nat'l. Acad. Sci. (1984) Vol. 81, p.2752)로 부터의 트랜스페린(TF).
Schneider 등의(Nature (London, 1984) Vol. 311, p. 675)로 부터의 트랜스페린 수용체(TF 수용체)
제9a도와 9b도에 나타낸 바와 같이 EGF 시스템을 사용하여 밝혀진 것과 유사한 결과가 IL-2 및 TF에 대해 그들의 상응 수용체 보체와의 상동성을 조사했을 때 발견되었다. IL-2에 있어서, 6개 및 5개 아미노산으로 구성된 두 개 상동성 부분이 각각 83과 80% 아미노산 상동성(제9도)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 두 개 서열간의 뉴클레오티드 상동성(각각 61과 67%)은 대단히 현저하다(각각 Pa=4.26×10-3과 3.56×10-3). 두 개의 아미노산 서열 (LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU와 TYR-ARG-MET-X-LEU 이때 X는 임의의 아미노산)은 NBRF 서열 뱅크내의 3060 단백질과 상동성에 대하여 스크리닝되었다.
6개 아미노산 길이의 616,748시험 분체에 대해서 IL-2를 비롯한 단지 7개 단백질만이 LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU와 상동성을 가짐이 밝혀졌다. 서열 LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU(X는 임의의 아미노산)가 6 아미노산 길이의 616,748 시험 분체에 대한 상동성에 대하여 스크리닝될 때, 7개 단백질이 상동성 서열을 함유하였다. 이들은 인체 IL-2, 인체 및 마우스의 1g 알파중 사슬, E.coli와 S.typhimurium으로부터의 아라비노즈 오페론 조절 단백질, Aspergillus amstelodami 미토콘 드라이로부터의 OX-174의 유전자 k 단백질과 단백질 4를 포함한다. 그러나, 단지 하나의 단백질(IL-2)만이 IL-2와의 완전 상동성을 함유하며(이때 X=HIS), 하나의 단백질(Aspergillus amstelodami 미토콘드리아로부터의 단백질 4)만이 X=THR인 IL-2수용체 보체와 완전 상동성을 갖는다. TYR-ARG-MET-X-LEU 서열이 5개 아미노산 길이의 619, 803 분체에 대해 스크리닝 될 때, IL-2와 사우스 아프리칸 두꺼비의 헤모글로빈 알파 사슬만이 상동성 서열을 함유하고 있다. 그 두개 상동성 서열이 고유하게 IL-2와 관련되는 것으로 밝혀졌다. TF와 이것의 수용체 보체에 있어서, 많은 부분에 상당한 서열 상동성이 존재하지만, 이것은 지면 제한 관계로 모든 상동성 부위를 나타내지 않았음을 알리는 바이다. 제9b도에 나타낸 대표적인 서열은 적어도 53% 뉴클레오티드 상동성을 가지며 통계적으로 중요한 것으로 간주된 Pa값 이하의 Pa값을 가진다. 아미노산 서열 ILE-PRO-X-GLY-LEU-LEU와 GLU-PHE-X-LEU-PHE-SER(여기에서 X는 임의의 아미노산)을 NBRF서열 뱅크에서 3,060 단백질에 대해 상동성을 스크리닝할 때, TF만이 상기 두 개 서열 모두를 함유하였다. 후자의 서열은 트랜스페린(transferrin) 내에서만 발견되었으며, ILE-PRO-X-GLY-LEU-LEU는 트랜스페린, 락토트랜스페린과 단지 세 개의 비관련 단백질(박테리아성 트립토판 합성 효소, E.coli 콜리신 El 면역 단백질과 인플루엔자 C헤마글루티닌 전구체)에서 발견되었다.
[실시예 2D]
실시예 2C에서 얻어진 결과로부터, 리간드와 수용체에 대한 뉴클레오티드 서열이 대단히 중요한 상보성 부위들을 함유한다는 것은 거의 의심할 수 없다. 지금까지 이들은 완전한 아미노산과 뉴클레오티드 서열이 밝혀진 리간드-수용체 쌍(pair)뿐이었다. 즉, 입수 가능한 모든 서열 자료는 수용체와 리간드 결합부위가 핵산의 상보성 가닥들로부터 진화되었다는 가설을 지지해 준다. 본 명세서내에 나타낸 상보성 부위들이 실제로 수용체 결합 부위의 아미노산 서열을 암호한다는 개념을 지지하는 몇가지 관찰 결과가 있다.
첫째, 상보성 뉴클레오티드 서열은 항상 원형질막 외부의 수용체 부분에서 확인되었다. 예컨대, EGF 수용체 보체에서 검출된 두 개의 상동성 서열은 100,000달톤의 외부영역(수용체내의 EGF가 결합하는 영역)에 존재하는데, 반면에 60,000달톤의 원형질 영역(단백질 키나제 활성영역)에서는 전혀 상동성 서열이 발견되지 않는다. 이것은 또한 IL-2 와 TF 수용체 서열에서도 마찬가지로 일치되는데, 모든 경우에서 상동성 서열은 리간드 결합에 기여하는 외부 부분에 존재하기 때문이다. 둘째로, 리간드에 있어서, 그 크기 (5-6 아미노산)는 Nisonoff등(The Antibody Molecule(Acacemic Press. N.Y. (1984) pp.29-38))에 의해 입증된 바와 같이 항체 결합 부위를 사용할 때 완전히 수용체 부위를 충진시킬수 있을 것으로 기대된다. 이 서열은 결합부위들을 나타내며, 이들 중 하나는 수용체와 리간드 사이의 각 접촉지점일 것으로 예상된다. 셋째로, 가장 중요하게 , 전술된 바와 같이 호르몬 ACTH와 감마-엔드로핀은 각 호르몬 mRNA에서 상보하는 RNA에 의해 암호된 합성 펩티드에 높은 친화력으로 결합하는 것이 입증되었다. 이같은 사실은 펩티드에 상보하는 아미노산 서열이 실제로 그 펩티드에 결합하고, 그러므로 그 펩티드에 상보하는 서열은 수용체-유사 결합 부위를 포함하고 있음을 나타낸다. 또한, ACTH에 대한 ＂합성＂결합 부위는 항원적으로 ACTH 아드레날 세포 수용체와 관련이있다. 전체적으로, 이것은 펩티드-수용체 결합 부위가 궁극적으로는 핵산의 상보성 가닥으로부터 유도될 수 있음을 의미하는 것이다.
핵산의 상보성 가닥으로부터 얻어진 단백질-단백질 결합 상호작용이 생물학에서 일반적인 현상으로 입증 된다면, 이 개념을 많은 분야에 응용할 수 있다. 예컨대, 리간드 서열에 대한 자료는 전술한 바와 유사한 방법을 사용하여 수용체를 정제하고 특성을 규명하는데 용이하게 사용될 것이다. 결합 부위 환경내에서 리간드 배열에 대한 가치있는 정보는 잘 정의된 리간드-＂결합부위＂쌍을 작제 함으로써 얻을 수 있다. 궁극적으로, 수용체-리간드 쌍의 결합부위 서열에 대한 지식은 생물학적 반응을 조작하는데 유용한 잘 규명된 작은 수용체 아고니스트(동근자)의 작제 및 또는 안타고니스트(길항자)의 작제를 가능케한다. 이 발견은 또한 분화와 발생을 연구하고 이해하는데에 있어서 매우 중요한 것이다. 예컨데, 하나의 세포에 의한 DNA서열의 단순전사 및 다른 세포에 의한 그의 보체의 전사에 의해 얻어진 상호작용하는 펩티드 또는 단백질을 통해 세포성 인식과 전달이 가능하게 된다. 본 명세서에 설명된 개념은 예컨대 면역 시스템에서 내부 영상화(internal imaging)와 중추 신경 계통에서 순환 생성에 대한 유전적이고 분자적인 원리를 제공한다. 본원 명세서, 특히 실시예 2A-2C에 설명된 발견은 특정 펩티드 호르몬의 세포성 수용체 부위에 대한 친화성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 설명한 것이다. 상기 방법은 일련의 단계를 포함한다. 첫째로, 펩티드 호르몬 수용체 부위의 단백질성 성분의 적어도 일부분을 암호하는 제1뉴클레오티드 스트랜드와 염기쌍을 이루는 제2뉴클레오티드 스트랜드의 제2뉴클레오티드 서열을 규명한다.
상기 펩티드 호르몬과 상기 제2뉴클레오티드 서열에 의해 암호된 아미노산 서열의 사이의 상동성 아미노산 서열을 3'-5' 방향으로 해독함으로써 결정한다.
펩티드 호르몬과 그것의 수용체 부위간의 결합 특성을 제공하는 상동성 아미노산 서열이 밝혀졌으므로, 상기 상동성 서열 중 적어도 한 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩티드를 예컨데, 일상적인 화학적 또는 생물학적 합성밥법으로 제조할 수 있다.
상동성 및 펩티드 호르몬 또는 리간드와의 수용체 결합 친화성에 관여하는 주요(key)부분을 포함하는 폴리펩티드들은 펩티드 호르몬 또는 리간드에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트처럼 통상 이용되는 방법으로 스크리닝될 수 있다.
[실시예 3A]
안지오텐신 II와 핵산 서열에 의한 상보성 펩티드의 디자인 제조방법 안지오텐신 시스템은 하기와 같다 :
반응 1은 효소레닌에 의한 효소 분해이며, 반응 2는 안지오텐신 전환 효소(ACE)에 의한 효소 분해이다. 안지오텐시노겐은 453 아미노산 잔기를 포함하며, 안지오텐신 I은 안지오텐시노겐의 10개 N-말단 잔기들로 이루어지며, 안지오텐신 II는 안지오텐신 I의 8개 말단 잔기들을 포함한다. 안지오텐신 II는 혈압조절을 통제하는 활성분자이다.
래트의 안지오텐신 II에 대한 핵산 서열이 Ohkubo 등의(Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 80, p.2197- 2200, 193)으로부터, 안지오텐시노겐에 대한 전체 mRNA를 번역하고 안지오텐신 II로 공지된 아미노산 서열(염기 134-157)을 관찰함으로써 얻어졌다. 이 서열, 이것의 번역, 이것의 보체 및 3'와 5' 해독으로 결정된 상보성 아미노산을 하기표에 나타내었다.
안지오텐신 II ASP ARG VAL TYR ILE HIS PRO PHE 카르복시말단
mRNA GAC CGC GUA UAC AUC CAC CCC UUU 3'말단
cRNA CUG GCG CAU AUG UAG GUG GGG AAA 5'말단
3'해독 LEU ALA HIS MET END VAL GLY LYS
5'해독 VAL ALA TYR VAL ASP VAL GLY LYS
3' 해독 결과 정지시그날(UAG/END)를 제공하기 때문에, ASP로 END를 치환했다. 하기와 같은 상보성 펩티드들이 Triton Biosciences Inc.(Alameda, CA)로 부터의 통상의 고체-상 합성법에 의해 얻어졌다. 이들 중 두 개 펩티드는 평행 펩티드 결합방향을 가지며 나머지 두 개는 역평행 방향을 가짐을 주의한다.
[실시예 3B]
안지오텐신 II와 아미노산 서열을 기초로한 상보성 펩티드(콘센서스 보체)의 디자인과 제조방법.
인체 안지오텐신 II의 아미노산 서열을 Tewsbury 등(BRRC, 99, p.1311-1315, 1981)에 의해 결정된 인체 안지오텐시노겐 분체의 서열로부터 얻는다.
표 6a에 주어진 치환 방법을 사용하여 안지오텐신 II의 콘센서스 보체 두 개를 디자인하되, 하나는 평행 펩티드 결합 방법으로 또하나는 역평행 방향으로 하기와 같이 디자인한다.
CCA-AII LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU
CCP-AII LEU-ALA-HIS-ILE-TYR-VAL-GLY-LYS
이들 상보성 펩티드들은 Triton Biosciences Inc.(Alameda, CA)로부터의 통상 고체상 합성에 의해 얻어졌다.
[실시예 3C]
안지오텐신 II와 아미노산 서열을 기초로한 상보성 펩티드의 디자인과 제조방법(단순화된 보체)
전기 실시예로부터의 안지오텐신 II에 대한 아미노산 서열과 표 6C에 제공된 치환방법을 사용하여 안지오텐신 II(인체)에 대한 하기(역-평행)의 단순화된 상보성 펩티드를 디자인했다.
SCA-AII GLU-GLY-LEU-GLU-LEU-GLU-ALA-LEU
이 상보성 펩티드 Triton Biosciences Inc.(Alameda, CA)로부터의 통상 고체상 합성에 의해 얻어졌다.
[실시예 3D]
안지오텐신과 관련 상보성 펩티드의 디자인 및 제조방법
안지오텐신 시스템의 공지된 반응계에 의거, 많은 유익한 작용을 나타낼수 있는 상보성 펩티드를 제조했다.
상보성 펩티드 결합 관찰결과에 의거하여, 안지오텐신 시스템 분자 중 하나 이상과 특이적으로 상호 작용할 수 있는 분자를 디자인한다. 그와 같은 상호작용의 결과, 안지오텐신 분자는 효소반응을 거치지 않을 것이다. 따라서, 예컨데 안지오텐신 I을 안지오텐신 II로 전환시키는 반응은 ACE 또는 그의 다른 기능을 실질적으로 억제하지 않고 감소시킬 수 있다. 실시예 3B에 대한 인체 안지오텐시노겐 분체 서열을 기초로, 콘센서스 보체 방법을 사용하여 하기 두 개의 펩티드를 고안한다.
CCA-AI GLU-VAL-LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU
CCA-AI(1-13)VAL-TYR-HIS-GLU-VAL-LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU
이들 상보성 펩티드들은 Triton Biosciences Inc.(Alameda, CA)로부터 제공된 고체상 합성법에 의해 얻어졌다.
분자 CCA-A(1-13)은 상기에 나타낸 안지오텐신족의 세개의 모든 분자들에 결합할 것으로 예상되며, 그로써 반응 1과 2를 억제하고, 안지오오텐신 II가 이것의 수용체를 활성화시키는 것을 억제하게 된다.
[실시예 3E]
안지오텐신 II와 대사적으로 안정한 상보성 펩티드의 디자인과 제조방법
안지오텐신 II의 상보성 펩티드 중 하나(CCA-AII, 실시예 3B)의 구조를 근거로, 각종 펩티다제에 대해 대사적으로 안정한 몇 개 유도체를 디자인했다. 아미노- 및 카르복시-펩티다제는 모두 많은 유기체에 존재하는 것으로 알려졌다. 펩티드 구조를 변형시킴으로써 상기 효소들의 작용으로부터 그 펩티드를 보호할수 있음은 알려진 것이다. 말단 아미노기의 아실화(Ac)와 말단 카르복시기의 아미드화(Am)는 그 펩티드를 각각 아미노- 및 카르복시-펩티다제로부터 보호하는 통상의 방법이다.
하기 분자들은 이들 원리와 활성 상보성 펩티드 CCA-AII의 구조를 근거로 디자인되었다.
이 분자들은 Triton Biosciences Inc.(Alameda, CA)로부터 통상의 고체상 화학법에 의해 얻어졌다. 아미드 수지가 아미드화 펩티드를 얻기 위한 고체-상 합성법에 사용되었다. 상기 고체상 합성법의 수지상에 위치하고 있는 충분히 보호된 펩티드를 아세트 안히드라이드와 반응시킴으로써 아실화를 실시하였다.
효소 공격으로 펩티드를 보호하는 다른 방법으로는 천연 발생 L-아미노산에 대해 D-아미노산을 치환하는 방법이 있다. 이 이유로서 모든 D상보성 펩티드가 CCA-AII(실시예 3B)의 서열을 기초로 고안되었다.
CCA-AII(모든 D) LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU
이분자는 Triton Biosciences Inc.로부터 통상 고체상 합성법에 의해 얻어졌다.
[실시예 3F]
방사선 라벨된 안지오텐신 II와 그의 수용체에 대한 결합에 있어 안지오텐신 II에 상보적인 펩티드가 미치는 작용효과
상보성 펩티드에 의한 안지오텐신 II와 그의 수용체간의 결합작용 억제효과는 방사선 활성 안지오텐신 II를 사용하여 시험했다. 토끼간을 균일 마쇄시키고, 1,000과 100,000×g 사이에서 침전하는 입자를 분리하기위해 원심분리한다. 결합 활성을 1% 디기토닌으로 용해시키고 49내지 65% 포화 암모늄 설페이트로 분획화한 후, 0.0 내지 0.3 M KCl의 선상구배를 사용하여 pH 7.5에서 DEAE-셀롤로오즈 크로마토그래피한다. 부분적으로 정제되고 가용화된 수용체 제조물은 Scatchard 분석에 의해 분석될때 단백질 1ng당 안지오텐신 II 17몰을 결합했으며, 이로써 약 0.1% 순도를 갖음을 알수 있다.
안지오텐신 II와 그의 수용체에 대한 결합을 하기와 같이 표준 분석하였다 : 완전한 시스템(150μl)는 30mM 트리스-염산, pH 7.5, 2.5mM K2EDTA, 0.2mM PCMS, 0.25nM[125I] 안지오텐신 II(약 100,000cpm), 100㎍ BSA, 0.25%(V/V) Brij 99와 30㎍의 부분 정제된 수용체를 포함한다. 이 반응은 상기 수용체를 부가함으로써 개시되고, 그 샘플은 60분간 20℃에서 항온 배양했다. 100mM 트리스-염산, pH 7.5중의 찬 0.5% 목탄/ 0.05% 덱스트란 1ml로 그 반응을 종결시킨다. 튜브를 와동시키도 10분간 4℃에서 정치시킨 후, 원심 분리하고, 단백질-결합된 안지오텐신 II 가 함유된 그 상청액을 카운트한다.
이 조건하에서 상기 완전한 시스템은 보통 결합된 방사선 활성이 약 10,000cpm이었다. 수용체가 없는 대조군은 이 데이터로부터 차감된 50-200cpm의 값을 나타낸다. 50-2000cpm의 값은 120μM 의 찬 안지오텐신 II가 반응 혼합물에 존재할 때 얻어지는데, 이는 실질적으로 모든 결합이 특이함을 나타낸다. 20μM 의 찬 안지오텐신 II가 포함된 샘플을 또한 런(run)시킨다. 이 대조용에서 나머지 방사선 결합활성은 35-45%이다. 안지오텐신 II에 대한 상보성 펩티드를 물에 용해시키는데, 단, CCA-A(1-13)은 3% DMSO, 0.04M 초산과 0.05M HCl중에 용해시킨다. 이 분석 결과를 표 22에 수록한다. ID50은 방사선 라벨된 안지오텐신 II의 결합을 50%까지 억제하는 펩티드의 농도이다.
[표 22]
[실시예 4A]
황체 호르몬 방출 호르몬(LHRH)와 상보성 펩티드의 디자인 및 제조방법
황체 호르몬 방출 호르몬은 광범위한 생물학적 작용효과를 가지며 이것에 대한 수용체는 많은 세포 유형상에서 발생하는 것 같다(Miller 등의 nature, 313, p.231-233, 1985). LHRH의 전구체 형태의 핵산 서열이 보고되어 있고(Seebury와 Adelman, Nature, 311, p.666-668, 1984) 이는 하기와 같은 상보성 펩티드의고안에 사용되었다. LHRH에 대한 서열, 이것의 번역, 이것의 보체 및 이 보체의 5'-3' 번역체가 하기에 수록되었다.
LHRH GLN-HID-TRP-SER-TYR-GLY-LEU-ARG-PRO-GLY C말단
mRNA CAG-CAC-TGG-TCC-TAT-GGA-CTG-CGC-CCT-GGA 3'말단
cRNA GTC-GTG-ACC-AGG-ATA-CCT-GAC-GCG-GGA-CCT 5'말단
5CA-LHRH LEU-VAL-PRO-GLY-ILE-SER-GLN-ALA-ARG-SER N말단
상보성펩티드 5CA-LHRH는 Triton Biosciences Inc.(Alameda, CA)로부터 고체-상 합성법에 의해 얻어졌다.
[실시예 4B]
LHRH에 의해 자극된 뇌하수체 세포로부터의 LH분비 현상에 LHRH의 상보성 펩티드(5CA-LHRH)가 미치는 작용효과
역 용혈성 플라크 분석법(Smith 등의 Method in Enzymology, 124, p.443)을 사용하여, LHRH에 의해 자극된 뇌하수체 세포로부터의 LH분비 현상에 LHRH의 상보성 펩티드(5CA-LHRH)가 미치는 효과를 조사했다. 상기 분석법은 종래와 같이 실시하는데, 단 (Pre)로써 표시된 실험에서는 상기 상보성 펩티드 LHRH를 분산된 뇌하수체 세포에 가하기 전에 1시간 동안 사전 배양했다.
125x-500x 현미경 확대비율로 영상분석(Bioguant or Image Teehnology Corp. Medel 300)함으로써 플라크 면적을 측정하여 플라크들을 분석한다. 그 결과는 대조분석(5×10-10M LHRH에 의해 자극될 때 형성된 플라크)에 대한 특정 분석의 반응 퍼센테이지로 나타낸다.
상보성 펩티드(5CA-LHRH)의 작용효과는 표 23에 나타내었다.
[표 23]
이 결과들은 이 분석에서 상보성 펩티드 5CA-LHRH에 의해 LHRH의 활성이 분명히 억제됨을 나타내고 있다.
[실시예 4C]
뇌하수체 세포에 의한 LHRH-자극된 LH분비에 있어서, 5CA-LHRH에 대한 항체(A5CA LHRH)의 작용효과
프로에스트러스 래트(proestrous rats)의 분산된 뇌하수체 세포에 의한 LH분비에 대해 실시예 4B에서와 같이 역 용혈성 플라스크 분석을 실시하는데, 단, 그 뇌하수체 세포를 두 시간 동안 A5CA LHRH 또는 정상의 토끼혈청(NRS)과 함께 사전 배양시킨다. 세척후, 역 용혈성 플라크 형성은 LHRH와 항-LH 항혈청을 부가함으로써 개시시킨다. 2시간 후, 보체를 30분간 가한다. 같은 농도의 A5CA LHRH를 또한 역용혈성 플라크 형성 중에 가한다. A5CA LHRHB1 은 Keyhole Limpet Hemocyanin에 커플된 5CA-LHRH로 수컷 토끼를 면역시킨 후 40일째에 처음 채혈한 것으로부터 얻어진 항 혈청의 IgG 분획분이다(완전 포르인드 보조제 1ml 중의 300㎍ 항원, 0일에 최초주사, 1ml 불완전 프로인드 보조제 중의 200㎍ 항원, 10,20,30,40,50과 60일에 주사) A5CA LHRHB3은 60일째에 토끼로부터 삼차 채혈한 것으로부터 얻어진 것이다. A5CA LHRHB1의 F(ab)₂분체들은 통상 방법(Methods In Immunolgy, 3rd ed : p.256, 1977)에 의해 제조되었다. 결과는 표 24에 수록되었다.
[표 24]
*뇌하수체 세포는 항체 분자의 FC부분에 대한 수용체를 갖고 있는 것으로 보고되었다(Pouglane 등의 Nature 261, 142(1976), Buffer 등의 Histochem 63 15(1979)). 뇌하수체 세포의 LHRL 자극반응은 비특이성 FC 수용체와 A5CA LHRH의 상호적용에 의해 어떠한 영향도 받지 않음을 증명하기 위해 A5CA LHRH의 F(Ab)₂분체를 제조하였다.
이 결과는 LHRH에 상보적인 펩티드로 면역된 토끼의 면역 혈청내에 안타고니스틱 및 아고니스틱 항체가 존재함을 나타내는 것이다.
[실시예 4D]
LHRH에 상보적인 펩티드에 대한 항체에 기초한 LHRH 세포 표면 수용체에 대한 면역세포 화합분석
다양한 세포들은 그 표면상에 LHRH에 대한 수용체를 갖고 있다. 뇌하수체 세포는 LH를 방출함으로써 LHRH에 대해 반응하기 때문에 상기 세포 중 5%가 그 수용체를 갖고 있다는 것은 널리 알려져 있다. LHRH에 상보적인 펩티드에 대한 항체가 LHRH 수용체를 함유하는 뇌하수체 세포들을 특이적으로 라벨하는 능력이 있는지를 입증하기 위해 하기 실험들이 실시되었다.
표준 플라크 분석이 실시된 후(실시예 4B에서와 같이), 그 챔버에 소듐 아세테이트를 주입시켜 결합항체등을 용출시키고 B5 고착성, 에탄올, Lugol의 요오드와 소듐 티오설페이트 중에서 연속적으로 고정시킨다(Smith 등의 Methods in Enzymology, 124, p.443에서 설명됨). 그 슬라이드를 과산화 수소와 정상의 염소 혈청으로 처리한 뒤 항체의 적합한 희석액을 적용시킨다. 면역 세포화학분석은 기질로서 디아니노벤지딘을 사용하여 ABC방법(Vertor Labs, Burlimgam, CA)으로 실시한다.
LH가 함유된 세포들은 LH에 대한 항체로써 선택적으로 염색(staining)된다. 일반적으로 전기 실시예의 분석에서 형성된 플라크들은 각각의 환상플라크의 중앙 근처에 하나의 LH-함유세포를 함유한다. LHRH수용체를 제공하는 세포들을 LHRH에 상보적인 펩티드로 면역된 토끼로부터의 면역 혈청에서 얻어진 IgG분획분(실시예 4C 참조)을 사용하여 염색한다. 다시, 환상 플라크당 하나의 세포를 염색했는데, 이들은 LH가 함유된 똑같은 세포들이었다. 대조용 실험은 LHRH의 상보체에 대한 항체에 의한 수용체 염색 반응은 LHRH(수용체에 결합함으로써) 및 LHRH에 대한 보체(상기 항체에 결합함으로써)에 의해 차단될 수 있음을 입증했다.
이 실험들은 LHRH수용체가 있는 뇌하수체 세포는 LHRH의 보체에 대한 항체에 의해 선택적으로 염색됨을 증명해준다.
[실시예 5A]
리보뉴클레아제 A(RNase) S-펩티드와 상보성 펩티드의 디자인 및 제조방법
124 아미노산 단백질인 소의 리보뉴클레아제 A(RNase)을 단백질 분해 효소인 서브티리신으로 처리하면 RNase가 1-20 아미노산 잔기를 갖는 S-펩티드와 21-124의 아미노산 잔기를 갖는 S 단백질로 구성된 두 개의 분체로 절단된다. 래트 RNase에 대한 m-RNA 서열이 Mac Donald(J. Biol. Chem. 257, p.14582-14585, 1982)로부터 입수되었는데, 이것은 소의 RNase와 거의 상동적인 서열을 나타낸다. 잔기 4-23은 소의 S-펩티드 중 S-펩티드와 상동성을 갖는다. 소의 RNase에 대한 추정 m-RNA 구조는 래트 m-RNA 서열에서 염기를 최소로 변화시켜 유도하였고, 그 결과는 표에 나타내었다 :
레트의 RNase 아미노산 잔기
4-23 ARG GLU SER SER ALA ASP LYS PHE LYS ARG GLN HIS MET ASP THR GLU GLY PRO SER LYS
5'에서 3'로 해독한 래트의 RNase 잔기
4-23에 대한 래트 m-RNA 서열 AGG GAA UCA UCG GCG GAU AAG UUU AAG AGG CAG CAC AUG GAC ACA GAG GGU CCC UCC AGG
5'에서 3'로 해독한 소의 S-펩티드에 대한 추정
m-RNA AAG GAA ACA GCG GCG GCU AAG UUU GAG AGG GAG CAC AUG GAC UCA UCG ACU UCC GCC GCG
소의 S-펩티드의 아미노산 서열
LYS GLU THR ALA ALA ALA LYS PHE GLU ARG GLU HIS MET ASP SER SER THR SER ALA ALA
소의 S-펩티드에 대한 상보성 펩티드의 아미노산은 하기 표에서 나타낸 바와 같이 5'에서 3' 해독 프레임으로 상보성 스트랜드를 해독함으로써 당해 핵산구조로부터 결정되었다 :
소의 S펩티드에 대한 상보성 핵산구조
CGC GGC GGA AGU CGA UGA GUC CAU GUG CUC CCU CUC AAA CUU AGC CGC CGC UGU UUC CUU
소의 S-펩티드에 대한 평행 상보성 아미노산 서열
LEU PHE SER ARG ARG SER LEU LYS LEU PRO LEU VAL HIS VAL SER ARG SER GLY GLY ARG
6번째 코돈이 정지시그널(UGA/END)를 제공하기 때문에, SER을 END대신 치환하였다. 코돈 18(UGU/CYS)에 대해서는, SER를 CYS대신에 치환하였다. 이같은 아미노산 치환은 송아지 S-펩티드와 제2염기 상보성을 유지한다. 이 상보성 펩티드는 Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA)로부터 통상의 고체-상합성법에 의해 얻어졌다.
[실시예 5B]
리보뉴클레아제 A S-펩티드와 상보성 펩티드의 결합 및 정제방법
S-펩티드와 S-펩티드 상보성 펩티드의 상호 작용은 통상적인 화학방법을 사용하여 N-하이드록시숙신이미드 활성화된 실리카겔 결합상에 공유 결합된 S-펩티드를 사용해 조사했다.
통상적인 화학방법을 사용하여 상보성 펩티드를 염화수소 처리하여 얻은 펩티드 혼합물을 직접 S-펩티드 크로마토그래피 컬럼(3mm×44mm)에 1ml/min의 유츌속도로 적응시키는데, 상기 컬럼은 사전에 0.10M 트리스-아세테이트, pH 7.0, 또는 0.10M 트리스-아세테이트 : pH 5 : 1로 평형화시켰다. 컬럼 유출물을 226nm에서 흡광도를 측정해 모니터 했다. 이 조건하에, 펩티드 및 비-펩티드 물질로 이루어진 큰 피이크가 용매앞에서 얻어졌다. 컬럼을 45ml의 완충제로 세척 후 30ml 물로 세척하고 0.10M 초산을 226nm 흡수물질을 용출시킨 컬럼에 가한다. 1ml/min의 유출속도와 10% 용액 A로부터 40% 용액 B에 대한 구배용출(용액 A, 0,1% 트리플루오로아세트산/물 : 용액 B, 0.1% 트리플루오로아세트산/100% 아세토니트릴)을 35분간 사용하여 워터스 역상 C-18컬럼(Waters reversed phase C-18 column)상에서 상기 용출된 물질을 크로마토그래피하면 약 26분의 체류시간대에서 단일 피크가 얻어진다. 가스상 서열결정기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 이 물질을 시컨싱하면, 그 구조가 합성된 상보성 펩티드와 동일함이 확인된다. 대조용 펩티드는 S-펩티드 친화성 컬럼에 결합하지 않는다. 이 결과는 S-펩티드와 이 것의 상보체 중 하나 사이의 특이적 결합을 입증한 것이며, 또한 S-펩티드 친화성 컬럼이 펩티드의 조제물을 정제하기 위해 사용될 수 있음을 입증한 것이다.
하기 청구범위에서 정의된 바와 같은 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않고서 이에 설명된 각종 아미노산, 원소, 단계 및 방법의 구성, 조작과 배열을 변화시킬 수 있다.
Claims (83)
- 원형(original)펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법으로서, (a) 상기 원형(original)펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 암호하는 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 : (b) 상기 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열과 역평행 방향으로 염기쌍을 형성하는 제2핵산의 제2뉴클레오티드 서열을 규명하는 단계 : (c) 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 동일한 해독 플레임 내에서 상기 제2뉴클레오티드 서열을 5'-3' 방향으로 해독함으로써 아미노산 서열을 결정하는 단계를 포함하는 상기 원형(original)펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법.
- 원형(original)펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법으로서, (a) 상기 원형(original)펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 암호하는 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 : (b) 상기 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열과 역평행 방향으로 염기쌍을 형성하는 제2핵산의 제2뉴클레오티드 서열을 규명하는 단계 : (c) 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 동일한 해독 플레임 내에서 상기 제2뉴클레오티드 서열을 3'-5' 방향으로 해독함으로써 아미노산 서열을 결정하는 단계를 포함하는 상기 원형(original)펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(a)가 상기 원형펩티드의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 암호하는 뉴클레오티드 트리플렛 코돈의 서열을 결정하는 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1핵산이 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1핵산이 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1뉴클레오티드 서열과 제2뉴클레오티드 서열이 또한 트리플렛 뉴클레오티드들로 구성된 것을 특징으로 하는 방법
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, (a) 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 암호하는 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열을 결정하며 : (b) 상기 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열과 역평행 방향으로 염기쌍을 형성하는 제2핵산의 제2뉴클레오티드 서열을 규명하며 : (c) 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 동일한 해독 플레임 내에서 상기 제2뉴클레오티드 서열을 5'-3' 방향으로 해독하여 아미노산 서열을 얻음으로써 상보성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하며 : (d) 단계(c)에서 결정된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제조함을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, (a) 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 암호하는 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열을 결정하며 : (b) 상기 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열과 역평행 방향으로 염기쌍을 형성하는 제2핵산의 제2뉴클레오티드 서열을 규명하며 : (c) 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 동일한 해독 플레임 내에서 상기 제2뉴클레오티드 서열을 3'-5' 방향으로 해독하여 아미노산 서열을 얻음으로써 상보성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하며 : (d) 단계(c)에서 결정된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제조함을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 제1핵산이 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 제1핵산이 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 제1뉴클레오티드 서열과 제2뉴클레오티드 서열이 또한 트리플렛 뉴클레오티드들로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 감마 엔도르핀에 대해 상보적이며 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 : H2N-Gln-Arg-Asp-Lys-Gly-Arg-Leu-Ala-Leu-Leu-Gly-Gly-His-Glu-Pro-Val-COOH.
- 코르티코트로핀에 대해 상보적이며 하기 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 : H2N-Gly-Val-His-Leu-His-Arg-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Leu-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH.
- 펩티드 리간드가 결합하여 그의 호르몬성 작용효과를 전달하는 수용체 부위에 대해 친화성을 가지며, 상기 펩티드 리간드의 적어도 일부분에 대해 상보적인 폴리펩티드에 대한 항체.
- 제14항에 있어서, 상기 펩티드 리간드가 코르티코트로핀이며, 상기 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 : H2N-Gly-Val-His-Leu-His-Arg-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 이소로이신을 티로신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 발린을 글루타민 또는 히스티딘으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 로이신을 아스파라긴, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 페닐알라닌을 리신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 시스테인을 트레오닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 메티오닌을 티로신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 알라닌을 아르기닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아르기닌을 알라닌 또는 세린으로 치환시키며; 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 리신을 페닐알라닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파라긴을 로이신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파르트산을 로이신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루타민을 발린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루탐산을 로이신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 히스티딘을 발린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글리신을 프롤린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 트레오닌을 트립토판 또는 시스테인으로 치환치키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 트립토판을 트레오닌으로 치환치키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 세린을 아르기닌 또는 세린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 티로신을 이소로이신 또는 메티오닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 프롤린을 글리신으로 치환시킴을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 이소로이신을 티로신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 발린을 글루타민 또는 히스티딘으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 로이신을 아스파라긴, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 페닐알라닌을 리신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 시스테인을 트레오닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 메티오닌을 티로신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 알라닌을 아르기닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아르기닌을 알라닌 또는 세린으로 치환되며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 리신을 페닐알라닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파라긴을 로이신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파르트산을 로이신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루타민을 발린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루탐산을 로이신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 히스티딘을 발린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글리신을 프롤린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 트레오닌을 트립토판 또는 시스테인으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 트립토판을 트레오닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 세린을 아르기닌 또는 세린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 티로신을 이소로이신 또는 메티오닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 프롤린을 글리신을 치환시키며 : 상기와 같은 치환에 의해 결정된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 원형 단백질 또는 펩티드의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법에 있어서, 상기 원형 단백질 또는 펩티드의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하고 : 상기 규명된 아미노산 서열의 카르복시-말단 방향을 그의 상보성 폴리펩티드의 N-말단으로 택하고, 그의 N-말단은 상기 상보성 폴리펩티드의 C-말단이 되도록 상기 규명된 아미노산 서열을 역순으로 배열하고 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 이소로이신을 티로신, 아스파라긴 또는 아스파르트산으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 발린을 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘 또는 티로신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 로이신을 리신, 글루타민 또는 글루탐산으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 페닐알라닌을 리신 또는 글루탐산으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 시스테인을 트레오닌 또는 알라닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중 각 메티오닌을 히스티딘으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 알라닌을 아르기닌, 세린, 글리신, 또는 시스테인으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아르기닌을 알라닌, 세린 트레오닌 또는 프롤린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 리신을 로이신 또는 페닐알라닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파라긴을 이소로이신 또는 발린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파르트산을 이소로이신 또는 발린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루타민을 로이신으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루탐산을 로이신 또는 페닐알라닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 히스티딘을 발린 또는 메티오닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글리신을 프롤린, 세린, 트레오닌 또는 알라닌으로 치환시키며 : 상기규명된 아미노산 서열 중의 각 트레오닌을 글리신, 세린, 아르기닌 또는 시스테인으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 트립토판을 프롤린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 세린을 글리신, 트레오닌, 알라닌 또는 아르기닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 티로신을 이소로이신 또는 발린으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 프롤린을 글리신, 아르기닌 또는 트립토판으로 치환시킴을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 원형 단백직 또는 펩티드의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하며 : 상기 규명된 아미노산 서열의 카르복시-말단 방향을 그의 상보성 폴리펩티드의 N-말단으로 택하고, 그의 N-말단은 상기 상보성 폴리펩티드의 C-말단이 되도록, 상기 규명된 아미노산 서열을 역순으로 배열하고, 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 이소로이신을 티로신, 아스파라긴 또는 아스파르트산으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 발린을 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘 또는 티로신으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 로이신을 리신, 글루타민 또는 글루탐산으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 페닐알라닌을 리신 또는 글루탐산으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 시스테인을 트레오닌 또는 알라닌으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 메티오닌을 히스티딘으로 치환시키며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 알라닌을 아르기닌, 세린, 글리신, 또는 시스테인으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아르기닌을 알라닌, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 리신을 로이신 또는 페닐알라닌으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파라긴을 이소로이신 또는 발린으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 아스파르트산을 이소로이신 또는 발린으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루타민을 로이신으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글루탐산을 로이신 또는 페닐알라닌으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 히스티딘을 발린 또는 메티오닌으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 글리신을 프롤린, 세린, 트레오닌 또는 알라닌으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 트레오닌을 글리신, 세린, 아르기닌 또는 시스테인으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 트립토판을 프롤린으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 세린을 글리신, 트레오닌, 알라닌 또는 아르기닌으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 티로신을 이소로이신 또는 발린으로 치환하며 : 상기 규명된 아미노산 서열 중의 각 프롤린을 글리신, 아르기닌 또는 트립토판으로 치환하며 : 상기 치환에 의해 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함하는 방법.
- 특정한 펩티드 리간드에 대한 세포성 수용체 부위에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 펩티드 리간드의 수용체 부위를 구성하는 단백질성 성분의 적어도 일부분을 암호하는 제1뉴클레오티드 스트랜드와 염기-쌍을 형성하는 제2뉴클레오티드 스트랜드의 뉴클레오티드 서열을 규명하는 단계 : 상기 제2뉴클레오티드 서열을 3'에서 5'방향으로 해독할 때, 이 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열과 상기 펩티드 리간드내의 아미노산 서열 중에 상동성이 있는 부분들의 펩티드 리간드내 아미노산 서열을 결정하는 단계 : 상기 상동성 아미노산 서열의 부분중 적어도 하나의 일부분을 함유하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 혼합물로부터 펩티드 리간드 수용체 부위의 성분을 얻는 방법에 있어서, 상기 펩티드 리간드의 적어도 일부분에 대해 상보적인 폴리펩티드를 제공하며 : 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 제조하고 : 고체 매트릭스에 상기 항체를 커플링하고 : 상기 혼합물을 항체-커플된 매트릭스로 처리하여 상기 수용체 부위의 성분을 특이적으로 규명시키고 : 상기 규명된 성분을 용출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 결정하고, 이들 아미노산들을 그들의 코돈의 제2염기에 따라, U그룹, A그룹, C그룹 또는 G그룹으로 분류하고, 이때 U그룹은 상기 코돈의 제2염기가 우라실, A그룹은 상기 제2염기가 아데닌, C그룹은 상기 제2염기가 시토신, 그리고 G그룹은 상기 제2염기가 구아닌인 아미노산을 의미하며 : 각 A그룹 아미노산은 U그룹의 아미노산으로 치환하며 : 각 U그룹 아미노산 A그룹의 아미노산으로 치환하며 : 각 C그룹 아미노산은 G그룹의 아미노산으로 치환하며 : 각 G그룹 아미노산은 C그룹의 아미노산으로 치환하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 결정하고, 이들 아미노산들을 그들의 코돈의 제2염기에 따라, U그룹, A그룹, C그룹 또는 G그룹으로 분류하고, 이때 U그룹은 상기 코돈의 제2염기가 우라실, A그룹은 상기 제2염기가 아데닌, C그룹은 상기 제2염기가 시토신, 그리고 G그룹은 상기 제2염기가 구아닌인 아미노산을 의미하며 : 각 A그룹 아미노산은 U그룹의 아미노산으로 치환하며 : 각 U그룹 아미노산 A그룹의 아미노산으로 치환하며 : 각 C그룹 아미노산은 G그룹의 아미노산으로 치환하며 : 각 G그룹 아미노산은 C그룹의 아미노산으로 치환하고 : 상기 치환에 의해 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 상보성 폴리펩티드가 그의 아미노 말단과 카르복시-말단 방향성과 상관없이 원형펩티드 또는 단백질에 대해 상보성 또는 결합 친화성을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 세포 표면 성분이며, 상기 상보성 폴리펩티드가 형광 라벨과 같은 진단제 또는 독소에 접합되어 있고, 이 접합체는 상기 세포 표면 성분에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 효소이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 상기 효소의 촉매적 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 독소작용을 갖으며, 상기 상보성 폴리펩티드가 생체내 또는 실험관내로 투여되었을 때 상기 독소작용을 감소시키거나 또는 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 호르몬의 적어도 일부분이며, 상기 상보성 폴리펩티드가 상기 호르몬에 결합함으로써 그 호르몬의 생물학적 활성을 감소 또는 제거시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 혈액군 항원이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 적어도 이가이거나, 상기 혈액군 항원의 동정을 용이하게 하는 라벨이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 생물학적 유체의 임신-특이성 성분이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 임신 테스트를 용이하게 하는 발색적으로 측정가능한 생산물을 제공하는 형광 염료, 방사선동위원소 또는 효소에 커플되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항의 방법에 의해 제조된 폴리펩티드.
- 펩티드나 또는 단백질을 함유한 샘플에서 목적 펩티드 또는 단백질을 검출하고 정량하는 방법에 있어서, (a) 제17항의 방법을 사용하여 목적 펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드를 얻고, (b) 상기 상보성 폴리펩티드 라벨에 화학적으로 커플링하여 상기 폴리펩티드의 라벨된 접합체를 형성하고, (c) 상기 펩티드 또는 단백질이 함유된 샘플을 상기 상보성 폴리펩티드의 라벨된 접합체와 접촉시킴으로써, 목적 펩티드 또는 단백질에 상기 상보성 폴리펩티드의 라벨된 접합체가 결합된 화학적 복합체 또는 커플을 만들며 : (d) 상기 라벨된 접합체에 결합된 펩티드 또는 단백질을 분석함으로써 상기 목적 펩티드 또는 단백질을 검출 및 정량하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 라벨이 효소, 중금속, 방사동위원소 및 형광성 화합물로 구성된 군으로 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하며 : 인체내에서 상기 서열내의 각 아미노산에 대해 가장 빈번히 사용되는 코돈을 규명하되, 그의 상보성 코돈을 5'에서 3'으로 해독할 때 정지 코돈을 나타내지 않도록 규명하며 : 가장 빈번히 사용되는 것으로 규명된 코돈의 보체를 5'에서 3'으로 번역함으로써 얻어진 아미노산으로 상기 규명된 서열내의 각 아미노산을 치환시킴을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하며 : 인체내에서 상기 서열내의 각 아미노산에 대해 가장 빈번히 사용되는 코돈을 규명하되, 그의 상보성 코돈을 5'에서 3'으로 해독할 때 정지 코돈을 나타내지 않도록 규명하며 : 상기 빈번히 사용되는 코돈의 보체를 5'에서 3'으로 번역하여 얻어진 아미노산으로 상기 규명된 아미노산 서열내의 각 아미노산을 치환시키며 : 상기 치환에 의해 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하며 : 인체내에서 상기 서열내의 각 아미노산에 대해 가장 빈번히 사용되는 코돈을 규명하되, 그의 상보성 코돈을 3'에서 -5'으로 해독할 때 정지 코돈이 나타나지 않도록 규명하며 : 가장 빈번히 사용되는 코돈의 보체를 -3'에서 5' 번역함으로써 얻어진 아미노산으로 상기 규명된 아미노산 서열내의 각 아미노산을 치환시킴을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 규명하며 : 인체내에서 상기 서열내의 각 아미노산에 대해 가장 빈번히 사용되는 코돈을 규명하되, 그의 상보성 코돈을 3'에서 5'으로 해독할 때 정지 코돈을 나타내지 않도록 규명하며 : 가장 빈번히 사용되는 코돈의 보체를 3'에서 5'으로 번역함으로써 얻어진 아미노산으로 상기 규명된 아미노산 서열내의 각 아미노산을 치환시키며 : 상기 치환에 의해 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 결정하며 : 코돈의 제2염기가 구아닌(G), 시토신(C), 아데닌(A), 및 우라실(U)/티민(T)인 아미노산들을 각각 G,C,A 및 U/T 그룹으로 나누고, 각 그룹에 대해 인체내에서 가장 빈번히 사용되는 코돈에 상응하는 아미노산을 규명하고 : 상기 원형 아미노산 서열내의 아미노산은 그에 대해 상기 인체내에서 가장 빈번히 사용되는 코돈의 제2염기에 상보적인 제2염기를 갖는 아미노산 그룹내의 아미노산으로 치환함을 특징으로 하는 방법.
- 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 결정하며 : 코돈의 제2염기가 구아닌(G), 시토신(C), 아데닌(A), 및 우라실(U)/티민(T)인 아미노산들을 각각 G,C,A 및 U/T 그룹으로 나누고, 각 그룹에 대해 인체내에서 가장 빈번히 사용되는 코돈에 상응하는 아미노산을 규명하고 : 상기 원형 아미노산 서열내의 아미노산은 그에 대해 상기 인체내에서 가장 빈번히 사용되는 코돈의 제2염기에 상보적인 제2염기를 갖는 아미노산 그룹내의 아미노산으로 치환하며 : 상기 치환에 의해 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 제16항의 방법에 의해 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하고 : (b) 단계(a)에서 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 의해 제조된 원형펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드.
- 제17항에 있어서, 상기 상보성 폴리펩티드가 그의 아미노말단 및 카르복시- 말단 방향성과 무관하게 상기 원형펩티드 또는 단백질에 대해 상보성 또는 결합친화성을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제41항의 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제14항에 있어서, 상기 항체가 제40항의 상보성 펩티드의 전체 또는 일부를 함유하는 항원에 대해 발생된 것을 특징으로 하는 항체.
- 제43항에 있어서, 상기 항체가 또한 제40항의 상보성 펩티드 전체 또는 일부를 포함하는 항원에 대해 생산된 모노크로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
- 유기체의 세포 표면 또는 유체상의 단백질성 물질에 대한 수용체를 검출하는 방법에 있어서, (a) 상기 단백질성 물질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드에 결합하는 제43항의 항체를 제조하고 : (b) 그항체를 유기체의 세포표면 또는 유체에 투입시키며 : (c) 상기 단백질성 물질의 수용체에 결합된 상기 항체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 펩티드 또는 단백질성 물질을 정제하는 방법에 있어서, (a) 상기 펩티드 또는 단백질성 물질의 적어도 일부분에 상보적인 제40항에 정의된 폴리펩티드를 제조하고 : (b) 그 폴리펩티드를 적합한 고체 또는 중합체 지지체 물질에 고착시키고 : (c) 결합된 폴리펩티드를 갖고 있는 상기 지지체 물질을 목적 펩티드 또는 단백질성 물질이 함유된 용액과 접촉시킴으로써, 상기 결합된 폴리펩티드에 상기 목적 펩티드 또는 단백질 물질을 선택적으로 결합시키며 : (d) 비 결합된 물질을 제거하기 위하여 상기 목적 펩티드 또는 단백질성 물질이 결합되어 있는 상기 지지체 물질을 용매로써 세척 또는 용출시키며 : (e) 상기 목적 펩티드 또는 단백질성 물질이 결합되어 있는 지지체 물질을 이차 용매로써 세척 또는 용출시킴으로써 상기 목적 펩티드 또는 단백질성 물질을 정제형태로 용액 중에 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 펩티드 리간드가 감마-엔도르핀이며, 상기 펩티드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것임을 특징으로 하는 항체 : H2N-Gln-Arg-Asp-Lys-Gly-Arg-Leu-Ala-Leu-Leu-Gly-Gly-His-Glu-Pro-Val-COOH.
- 황체 호르몬 분비호르몬(LHRH)에 상보적이며, 서열H₂N-Ser-Arg-Ala-Gln-Ser-Ile-Gly-Pro-Val-Leu-COOH를 포함하는 폴리펩티드.
- 제14항에 있어서, 상기 펩티드 리간드가 황체 호르몬 분비 호르몬이며, 상기 폴리펩티드가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 : H₂N-Ser-Arg-Ala-Gln-Ser-Ile-Gly-Pro-Val-Leu-COOH.
- 하기군으로부터 선택된 아드레노코르티코드로픽 호르몬(ACTH)에 상보적인 폴리펩티드 : (a) NH2-Arg-Met-Arg-Tyr-Leu-Val-Lys-Ala-Thr-Pro-Phe-Fly-His-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Gly-His-Phe-His-Met-Gly-COOH(b) NH2-Arg-Val-Gly-His-Phe-Val-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Arg-His-Leu-His-Val-Gly-COOH(c) NH2-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH(d) NH2-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH(e) NH2-His-Arg-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH.
- 제20항의 방법에의해 제조된 폴리펩티드.
- 제51항의 폴리펩티드에 대한 항체.
- 폴리펩티드 리간드의 세포성 수용체 부위를 기초로 상기 리간드에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 펩티드 리간드 수용체 부위의 단백질성 성분의 적어도 일부분을 암호하는 제1뉴클레오티드 스트랜드와 염기-쌍을 형성하는 제2뉴클레오티드 스트랜드의 제2뉴클레오티드 서열을 규명하며 : 상기 제2뉴클레오티드 서열이 3'에서 5'방향으로 또 5'에서3'방향으로 해독될 때 상기 제2뉴클레오티드 서열에 의해 암호된 아미노산 서열과 상기 펩티드 리간드내의 아미노산 서열간의 상동성 아미노산 서열의 부분들을 결정하며 : 상기 상동성 부분에 해당하는 폴리펩티드 리간드에 대한 단백질성 수용체의 아미노산 서열을 결정하며 : 상기 단백질 수용체의 상기 아미노산 서열 중 하나의 적어도 일부분을 함유하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53항의 방법에 의해 제조된 폴리펩티드.
- 제54항의 폴리펩티드에 대한 항체.
- 제19항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 세포 표면 성분이며, 상기 상보성 폴리펩티드가 형광 라벨과 같은 진단제 또는 독소에 접합되어 있고, 이 접합체는 상기 세포 표면 성분에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 세포 표면 성분이며, 상기 상보성 폴리펩티드가 형광라벨과 같은 진단제 또는 독소에 접합되어 있고, 이 접합체는 상기 세포 표면 성분에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 효소이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 상기 효소의 촉매적 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 효소이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 상기 효소의 촉매적 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 독소작용을 갖으며, 상기 그 상보성 폴리펩티드가 생체내 또는 실험관내로 투여되었을 때 상기 독소작용을 감소시키거나 또는 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 독소작용을 갖으며, 상기 그 상보성 폴리펩티드가 생체내 또는 실험관내로 투여되었을 때 상기 독소작용을 감소시키거나 또는 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 호르몬의 적어도 일부분이며, 상기 상보성 폴리펩티드가 상기 호르몬에 결합함으로써 그 호르몬의 생물학적 활성을 감소 또는 제거시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 호르몬의 적어도 일부분이며, 상기 상보성 폴리펩티드가 상기 호르몬에 결합함으로써 그 호르몬의 생물학적 활성을 감소 또는 제거시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 혈액군 항원이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 적어도 이가이거나, 상기 혈액군 항원의 동정을 용이하게 하는 라벨이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 혈액군 항원이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 적어도 이가이거나, 상기 혈액군 항원의 동정을 용이하게 하는 라벨이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 원형펩티드 또는 단백질이 생물학적 유체의 임신-특이성 성분이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 임신 테스트를 용이하게 하는 발색적으로 측정가능한 생성물을 제공하는 형광 염료, 방사선동위원소 또는 효소에 커플되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서,상기 원형펩티드 또는 단백질이 생물학적 유체의 임신-특이성 성분이며, 상기 상보성 폴리펩티드는 임신 테스트를 용이하게 하는 발색적으로 측정가능한 생성물을 제공하는 형광 염료, 방사선동위원소 또는 효소에 커플되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항의 방법에 의해 얻어진 펩티드.
- 펩티드나 또는 단백질을 함유한 샘플에서 목적 펩티드 또는 단백질을 검출하고 정량하는 방법에 있어서, (a) 제19항의 방법을 사용하여 목적 펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드를 얻고, (b)상기 상보성 폴리펩티드를 라벨에 화학적으로 커플링하여 상기 폴리펩티드의 라벨된 접합체를 형성하고, (c) 상기 펩티드 또는 단백질이 함유된 샘플을 상기 상보성 폴리펩티드의 라벨된 접합체와 접촉시킴으로써, 목적 펩티드 또는 단백질에 상기 상보성 폴리펩티드의 라벨된 접합체가 결합된 화학적 복합체 또는 커플을 만들며 : (d) 상기 라벨된 접합체에 결합된 펩티드 또는 단백질을 분석함으로써 상기 목적 펩티드 또는 단백질을 검출 및 정량하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 펩티드나 또는 단백질을 함유한 샘플에서 목적 펩티드 또는 단백질을 검출하고 정량하는 방법에 있어서, (a) 제23항의 방법을 사용하여 상기 펩티드 또는 단백질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드를 얻고, (b)상기 상보성 폴리펩티드를 라벨에 화학적으로 커플링하여 상기 폴리펩티드의 라벨된 접합체를 형성하고, (c) 상기 펩티드 또는 단백질이 함유된 샘플을 상기 상보성 폴리펩티드의 라벨된 접합체와 접촉시킴으로써, 목적 펩티드 또는 단백질에 상기 상보성 폴리펩티드의 라벨된 접합체가 결합된 화학적 복합체 또는 커플을 만들며 : (d) 상기 라벨된 접합체에 결합된 펩티드 또는 단백질을 분석함으로써 상기 목적 펩티드 또는 단백질을 검출 및 정량하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 라벨이 효소, 중금속, 방사선동위원소 및 형광성 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제70항에 있어서,상기 라벨이 효소, 중금속, 방사선동위원소 및 형광성 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 항체가 제42항의 상보성 펩티드의 전체를 또는 일부를 함유하는 항원에 대해 발생된 것을 특징으로 하는 항체.
- 제43항에 있어서, 상기 항체가 제42항의 상보성 펩티드의 전체를 또는 일부를 포함하는 항원에 대해 생산된 모노크로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
- 유기체의 세포 표면 또는 유체상의 단백질성 물질에 대한 수용체를 검출하는 방법에 있어서, (a) 상기 단백질성 물질의 적어도 일부분에 상보적인 폴리펩티드에 결합하는 제44항의 항체를 제조하고 : (b) 그 항체를 유기체의 세포표면 또는 유체에 투입시키며 : (c) 상기 단백질성 물질의 수용체에 결합된 상기 항체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 펩티드 또는 단백질성 물질을 정제하는 방법에 있어서, (a) 상기 펩티드 또는 단백질성 물질의 적어도 일부분에 상보적인 제42항에 정의된 폴리펩티드를 제조하고 : (b) 그 폴리펩티드를 적합한 고체 또는 중합체 지지체 물질에 고착시키고 : (c) 결합된 폴리펩티드를 갖고 있는 상기 지지체 물질을 목적 펩티드 또는 단백질성 물질이 함유된 용액과 접촉시킴으로써, 상기 결합된 폴리펩티드에 상기 목적 펩티드 또는 단백질 물질을 선택적으로 결합시키며 : (d) 비 결합된 물질을 제거하기 위하여 상기 목적 펩티드 또는 단백질성 물질이 결합되어 있는 상기 지지체 물질을 용매로써 세척 또는 용출시키며 : (e) 상기 목적 펩티드 또는 단백질성 물질이 결합되어 있는 지지체 물질을 이차 용매로써 세척 또는 용출시킴으로써 상기 목적 펩티드 또는 단백질성 물질을 정제 형태로 용액 중에 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 (a)가 상기 원형펩티드의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 암호하는 뉴클레오티드 트리플렛 코돈의 서열을 결정하는 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 제1핵산이 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 제1핵산이 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 제1뉴클레오티드 서열과 제2뉴클레오티드 서열이 또한 트리플렛 뉴클레오티드들로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 제1핵산이 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 제1핵산이 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 제1뉴클레오티드 서열과 제2뉴클레오티드 서열이 또한 트리플렛 뉴클레오티드들로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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Legal Events
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 19910529 Patent event code: PE09021S01D |
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