KR920001772B1 - 포유류 중의 HIV-억제 항체 유도성 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) env-암호화된 펩타이드 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

포유류 중의 HIV-억제 항체 유도성 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) env-암호화된 펩타이드

제1도는 중첩성 합성 펩타이드에 의해 포함된 HIV-1 env-암호화 서열 지도이다.

제2도는 다양한 종류의 MAb와 펩타이드 1-69(면역화 펩타이드), 1-178, 1-177, 5, 1-68, 및 1-70의 면역 반응을 고체상 ELISA 시험한 결과도이다

본 발명은 HIV 감염 및 질환에 대한 예방제 또는 백신으로 유용한 사람 면역 겹핍 바이러스(HIV) env-암호화된 단백질 단편에 상응하는 화학적으로 합성된 펩타이드, 및 (HIV) env-암호화된 단편에 대한 모노 클로날 항체에 관한 것이다.

후천성 면역 결핍증(AIDS)의 병원체인, 사람 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1)에 대하여 특이적인 항체가 HIV-감염 개체의 혈청중에서 발견되었다[참조문헌 : Sarngadharan et al. (1984)Science 224, 506-508; Schupbach et al. (1984) Science 224, 503-505; Chang et al. (1985) Biotechnology 3, 905-911; Kenealy et al. (1987) AIDS, Research and Human Retroviruses 3, 95-105] HIV -1의 증식을 차단하는 항체(HIV-중화 항체) 또는 세포 배양액중의 HIV-감염 세포 및 비감염 세포의 융합을 차단하는 항체(융합-차단 항체)의 혈청내 농도는 바이러스에 대한 모든 체액성 반응에 대한 농도(즉, HIV-특히 항체의 총 농도)에 비해 상대적으로 낮다[참조 문헌 : Weiss et al. (1985) Nature 316, 69-74 ; Robert-Guroff et al. (1985) Nature 316, 72-74; Weiss et al. (1986) Nature 324, 572-575]. HIV-1 감염의 발병 과정에 있어서 HIV-중화 및 융합-차단 항체의 역할 및 이러한 생물학적 활성에 관여하는 에피토프(epitope)의 구조는 규명되어야 할 과제로 남아 있다. HIV-1의 외부 외피 당 단백질(gp120)은 사람의 중화 항체에 결합하는 것으로 알려졌으며 동물 내의 HIV 중화 항체 유도성 면역원으로서 사용되어 왔다.[참조 문헌 : Lasky et al (1986) Science 233, 209-212 ; Matthews et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9709-9713; Robey et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84. 7023-7927]. 주목할만한 것은, 이들 중화 항체는 유형-특이적인 것으로 보고되었다. 즉, 항체는 면역원이 유도된 HIV-1 아형 또는 분리체의 증식만을 차단한다.

동물체내의 중화 항체를 유도하는 많은 HIV-1 펩타이드 및 단백질이 동정되었다. 이러한 것에는 gag-암호화된 단백질로부터의 서열에 상응하는 합성 펩타이드, env-암호화된 수송막 단백질(gp41), 및 env-암호화된 gp120 단백질의 보존된 영역에 상응하는 몇몇 펩타이드가 포함된다[참조문헌 : Putney et al. (1986) Science 234, 1392-1395; Sarin et al. (1986) Science 232, 1135-1137; Kennedy et al. (1987) J. Biol. Chem. 262. 5769-5774; Taylor et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2951-2955; Chanh et al. (1986) EMBO J. 5, 3065-3071; Ho et al. (1987) j. of Virol . 61. 2024-2028). 특히 고농도의 중화 및 융합-차단 항체는 두개의 재조합 단백질에 의해 동물내에 유도되는 것으로 나타났다. 이들중 하나는 gp160으로 명명된, 곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 생성된 당화된 완전한 길이의 env-암호화된 단백질 [참조 문헌 : Rusche et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6924-6928]이며 다른 하나는 PB1으로 명명된 gp120의 영역(HIV-1 III B의 아미노산 288서부터 472까지)을 나타내는, 비당화된 이. 콜라이 생성된 단백질[참조문헌 : Putney et al. (1986) Science 234, 1392-1395]이다. 면역원으로서 이들 단백질을 사용한 강력한 항체 반응에도 불구하고, 중화 활성은 면역원이 유도된 HIV-1 아형 또는 분리체 즉, III B에 국한되고 이에 대하여 특이적이다.

(env-암호화된 gp120의 아미노 말단에 상응하는) 재조합 단백질 PE 3 및 (gp120의 카복실-말단 및 gp41의 대부분에 상응하는) ENV9는 측정할만한 수준의 중화 활성을 유도하지 않지만[참조 문헌 : Putney et al. (1986) Science 234, 1392-1395], 반면 PB1은 재조합 gp160을 사용하여 유도된 수준에 필적할만하거나 또는 그 이상의 수준으로 중화 및 융합-차단 항체를 유도할 수 있다[참조문헌 : Rusche et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6924-6928]

이. 콜라이-발현된 HIV-1 env-유도된 단백질 PB1을 면역원으로 사용하는 경우, 동물에서 중화 및 융합-차단 항체를 고농도로 유도하는 것으로 알려졌다[참조문헌 : Putney et al. (1986) Science 234, 1392-1395]. 동물에서 이와 같은 면역 반응이 나타남은 HIV env의 이 영역이 HIV 감염 및 질환의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다는 것을 암시한다. 중화 및 융합-차단 활성에 관여될 수도 있는 gp120의 PB1 영역내의 단편을 더 상세히 규명하기 위한 체계 분석에 착수하였다. 완전한 PB1 영역 (HIV-1 III B env-암호화된 단백질 gp120의 아미노산 288번째부터 472번째까지)을 나타내는 화학적으로 합성된 펩타이드를 시리즈로 중첩하여 체계 분석하는 방법이 사용되었다. 펩타이드의 길이는 15 내지 16개 아미노산이고 5개의 아미노산으로 상호간에 중첩시킨다. 이러한 합성 펩타이드를 사용하여 피검 동물(기니아 피그)을 면역시키고 피검 동물에서 생성된 항-펩타이드 항체를 HIV 중화 활성 및 세포 융합-차단 활성을 포함한 생물학적 활성에 대하여 분석한다.

분석된 HIV-1 env-암호화된 PB1 영역을 연결하는 합성 펩타이드를 표 1에 수록하였다. 시험된 18개의 펩타이드중 1-69로 명명된, 하나의 펩타이드만이, 면역원으로서 사용되는 경우, 세포 배양액중의 HIV 증식 및 세포 배양액중의 HIV-감염 세포 및 비감염 세포간의 융합 모두를 차단하는 항체를 유도하였다. 이러한 관찰 결과는 펩타이드 1-69 또는 펩타이드 1-69 서열의 대부분을 함유하는 거의 동일한 길이(10 내지 30개의 아미노산 또는, 더욱 바람직하게는 15 내지 25개의 아미노산)의 펩타이드가 HIV 감염에 대한 예방제 또는 백신으로서, 또는 이들의 성분으로 유용할 수 있다는 것을 나타낸다. 펩타이드 1-69 서열의 일부를 함유하는 5 내지 10개의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드로 포유 동물에서 HIV-억제 항체를 유도하는 데에 유용할 것으로 예상된다. 유용한 펩타이드에는 QRGPGRA, RIQRGPGRA, GPGRAFVTIG, GPGRAFV 및 GPGRA 가 포함된다. HIV-1 III env-암호화된 cys 296 내지 cys 331로부터 연장되고(표 4) 펩타이드 1-69를 함유하는, 약 36개 아미노산 길이의 다소 큰 펩타이드도 동물에서 HIV-억제 항체를 유도할 것으로 예상된다.

HIV 증식을 억제하고 HIV-매개된 세포 융합을 차단하는 항체는 HIV 감염에 대한 저항성을 증가시키는 것으로 추측된다. 본 명세서에서 사용된 ＂HIV-억제 항체＂에는 중화 항체 및 융합-차단 항체 모두 포함된다. 환자 내의 이러한 HIV 억제 항체 존재 유무의 탐지능은 중요한 예후적인 가치를 지닌다. 이러한 항체를 함유하는 약학제제는 HIV에 노출된 개체의 수동 면역화에 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 항체는 HIV-감염 개체중의 AIDS에 대한 질환의 진행 속도를 감소시키며 AIDS 환자에 있어서 잠정적인 치료적 가지를 지닌다. 본 발명의 모노클로날 HIV-억제 항체가 특히 유용할 것으로 예상된다.

항-펩타이드 1-69 항체의 HIV-중화 및 융합-차단 활성은, HIV-1 III B는 억제되지만 HIV-1 RF는 억제되지 않으므로 펩타이드 서열이 유도된 HIV 분리체에 주로 한정된다. 그러나, HIV의 다른 분리체로부터의 HIV-1 III B 펩타이드 1-69와 상동인 env-암호화된 영역은 아미노산 서열을 비교(표 4)함으로써 쉽게 동정될 수 있으며, 상응하는 펩타이드는 펩타이드 1-69에 대해 기술한 방법을 사용하여 면역원으로서 사용될 수 있다. 더욱이, gp120의 아미노산 제296 내지 331번의 영역내에 존재하는 밀접히 관련된 서열을 갖는 HIV-1 아형 또는 분리체로 억제될 것으로 예상된다. 사실, MAb 제5025,29.1.1.1호(ATCC HB10041)는 III B 및 MN과 같은 다수의 HIV-1 분리체에 대하여 융합 차단 활성을 나타낸다.

아미노산(aa) 서열에 대하여 본 명세서에서 사용된 ＂상응하는＂이란 예를 들어 IntelliGenetics, Ine., (Mountain View, CA) 또는 Genetics Computer Group(University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison. WI.)로부터 입수할 수 있는 표준 컴퓨터 프로그램을 사용하여 상동성에 대하여 두개 이상의 서열을 비교하여 정렬한 경우 상호간에 정렬되는 aa간의 관계를 의미한다.

HIV-1 III B 펩타이드 1-69에 대한 상동 영역에 상응하는, 상이한 HIV-1 및 HIV-2 분리체에 대한 env-암호화된 펩타이드의 서열을 표 4에 수록하였다. HIV-1 III B 펩타이드 1-69에 상응하는 env-암호화된 영역은 표 4에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 동정할 수 있다. 상이한 HIV 분리체로부터의 외피 단백질이 아미노산 서열에 있어서 상당히 다양한 영역을 지니지만, 단백질의 전체적인 구조는 예를 들어, Cys 잔기의 상대적인 위치(표 4 참조)를 포함하여, 잘 보존되므로, 상이한 HIV 분리체로부터의 env 단백질의 전체 구조 및 작용성(예를 들어 CD4 결합)이 잘 보존되므로, 다른 HIV-1 및 HIV-2 분리체로부터의 펩타이드 1-69에 상응하는 env-암호화된 영역도 펩타이드로 면역시킨 동물에서 HIV-중화 및 세포 융합-차단 항체를 유사하게 유도할 것으로 예상된다. HIV 감염에 대한 효과적인 백신 또는 예방제는 HIV-1 III B 펩타이드 1-69에 상응하는 영역을 함유하는 펩타이드의 혼합물 또는 ＂칵테일＂을 함유할 수 있다. 이와 같은 혼합물에는 바람직하게는 다양한 종류의 HIV-1 분리체로부터의 펩타이드 1-69에 상응하는 펩타이드, 또는 다소 크거나 작은 동가 펩타이드가 포함된다. 이러한 혼합물 또는 ＂칵테일＂은 HIV의 다수의 독특한 분리체에 잠정적으로 광범위한 내성을 부여할 것이다.

본 발명은 또한 HIV-1 외피-유도된 펩타이드 1-69에 대한 HIV-억제 모노클로날 항체에 관한 것이다. 특히, 쥐의 모노클로날 항체 시리즈를 1-69로 명명된 합성 HIV 외피-유도된 펩타이드 수준으로 높인다. 이러한 쥐의 모노클로날 항체중 하나인 이의 하이브리도마 클론 제5023, 24. 4. 1. 1호(ATCC #HB 10043)는 III B 분리체에 대하여 특히 강력한 HIV-1 바이러스 중화 활성을 가지며 HIV-1 III B 감염 세포와 비감염 표적 세포와의 융합을 차단하는 것으로 나타났다. 이들 MAb의 다른 하나인, 제5025, 24. 1. 1. 1호(ATCC #HB 10041)은 다수의 HIV-1 분리체에 대한 융합 차단 활성을 갖는 것으로 나타났다.

HIV-1 III B env-암호화된 아미노산 제288 내지 472번을 함유하는 이. 콜라이-생성된 단백질 PB1은 면역된 동물에서 HIV-중화 및 융합-차단 활성을 갖는 항체를 유동하는 것으로 나타났다[참조문헌 : Putney et al. (1986) Science 234, 1392-1395]. HIV-1 중화 및 세포 융합-차단 활성을 갖는 항체를 유도할 수 있는 에피토프를 규명하기 위한 시도로 완전한 PB1 영역을 완전히 연결하는 18개의 중첩성 합성 펩타이드(표 1) 세트의 항원성 및 면역원성을 체계적으로 분석하였다.

펩타이드는 이들의 사람 HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료로부터의 항체에 의해 인지되었는지의 여부를 측정하기 위한 항원으로서 분석하였다(표 1). 이러한 분석 결과 두개의 펩타이드, 1-69 및 1-73은 미세역가 평판에 대한 항체의 비특이적 결합에 비해 많은 HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료와 반응성인 것으로 밝혀졌다. HIV-1 혈청 양성 혈청 시료중에서 몇몇 env-암호화된 펩타이드의 사람 항체와의 반응성을 추가로 분석하여 대조용 HIV-1 혈청 음성인 혈청 시료의 반응성과 비교하였다(표 2). 펩타이드 1-69는 시험된 HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료 37개중 12개와 고수준의 반응성을 나타낸 반면, 시험된 47개의 대조용 HIV-1 혈청 음성 혈청 시료는 어느 것도 임계치 0.2이상의 ELISA 흡수도를 나타내지 않는다. HIV-혈청 양성인 혈청 시료와 펩타이드 1-80 및 1-73과의 반응성의 빈도 및 수준은 펩타이트 1-69와 한 경우보다 낮았다. 대조용 혈청과 펩타이트 1-73과는 다소 반응성이다(시험된 혈청 시료 47개중 3개). 혈청 시료 반응성과 펩타이드 1-69와 1-80, 및 HIV-1 혈청 양성간에는 명확한 관계가 있다. 즉, 펩타이드 1-69 또는 펩타이드 1-80을 사용하여 ELISA한 결과 HIV-특이적 항체에 대하여 특이성을 나타냈다. 펩타이드 1-69 및 1-80, 및 다른 HIV 분리체로부터의 상응하는 펩타이드는 진단 또는 예후 목적을 위하여 사람 혈청시료내 HIV-특이적 항체의 탐지에 유용하다. 펩타이트 1-83은 HIV-1 Ⅲ B env-암호화된 단백질의 제418 내지 432번을 함유한다. 펩타이드 1-69는 HIV-1 Ⅲ Benv-암호화된 단백질의 aa 제308 내지 322번을 함유한다. 표 2에 사용된 조건하에, 펩타이드 1-68, 1-74, 1-77, 1-81 및 1-84는 극소량의 HIV-1 혈청 양성인 시료(시험된 37 샘플당 1이하)로 탐지되었다. 표 1 및 2에 나타낸 펩타이드(예를 들어, 펩타이드 1-81, 1-84, 1-73)에 대한 양성 반응성 혈청 시료의 ELISA 흡수도 및 빈도차는 표 1 및 2에 사용된 조건에서의 차이를 반영하는 것으로 추측된다.

펩타이드의 면역원성을 연구한 결과 표 3, 5개의 펩타이드(1-67, 1-75, 1-77, 1-80, 및 1-83)가 기니아 피그에서 항-펩타이드 항체 고 역가를 유도할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 상당 수준의 항-펩타이드 항체를 함유한 기니아 피그 혈청 샘플중에서, 펩타이드 1-69를 유도하는 혈청만이 1) 면역 블롯(immunoblot)상에서 env-암호화된 gp120과 반응성이고표 3, 2) gp120을 면역 침전시킬 수 있고(데이타에 나타내지 않았음). 3) 세포 배양액중의 HIV-1 III B 증식을 중화시킬 수 있으며(표 3), 4) 세포 배양액중의 HIV-1 III B 감염 세포 및 비감염 세포 융합을 차단할 수 있는 것과 같은 탐지 가능한 활성을 나타냈다.

바이러스 중화 시험을 한 결과, 항-펩타이드 1-69 혈청은 1:300 희석비에서 50% 억제율을 나타냈다. 이러한 수준의 중화 활성은 HIV-감염 세포 또는 재조합 env-유도된 단백질 또는 화학적으로 합성된 HIV-유도된 펩타이드로부터 정제된 gp120에 대한 항체에 대하여 이전에 보고된 수준 이상이다[참조 문헌 : Lasky et al. (1989) Science 233, 209-212; Matthews et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9709-9713; Taylor et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2951-2955; Chanh et al. (1986) EMBO J. 5, 3065-3071; Ho et al. (1987) j. of Virol . 61. 2024-2028). gp120과 같은 고당화 복합 단백질로부터의 화학적으로 합성된 작은 펩타이드 서열은 명백하게 천연 단백질보다 더 강한 중화 반응할 유도할 수 있다. 부적절한 면역학적 반응은 보호 반응을 선점할 수 있다. env의 다른 영역, 펩타이드 1-69 영역 외부에 특이적인 항체는 env의 펩타이드 1-69 영역에 대하여 특이적인 중화 항체의 결합을 방해한다. 또한 펩타이드 1-69 영역 외부의, 다른 env-암호화된 에피토프도 env의 펩타이드 1-69 영역애 대하여 특이적인 강한 면역 반응을 방해할 수 있다. 유리 바이러스에 결합된 항체가 대시 세포에 더 잘 결합할 수 있으므로, 대식 세포가 감염될 가능성이 증가한다. 이러한 점을 고려해볼때 펩타이드 1-69가 env 단백질 대단편보다 더 좋은 면역원이 이유를 동물의 HIV-억제 항체 유도능으로 설명할 수 있다. 그러므로, 적절한 펩타이드 면역원을 사용하여 어떠한 보호 작용도 갖지 않는 동물 내의 HIV-특이적 항체의 유도를 피할 수 있다.

더욱이, 항-펩타이드 1-69 혈청은 세포 융합을 차단할 수 있으며, 이러한 특성은 HIV-감염 세포로부터 정제된 gp120에 특이적인 염소 항체에 의해서는 나타나지 않는다[참조 문헌 : Matthews et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9709-9713], 항-펩타이드 1-69 혈청내 융합-차단 항체의 농도는 HIV-1 혈청 양성인 혈청중에서 발견되는 최고 농도에 필적한다[참조 문헌 : Matthews et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 424-5428].

항-펩타이드 1-69 혈청은 단지 HIV-1 III B를 중화시키고 HIV-1 III B 감염 세포의 융합을 차단하였으며 HIV-1 RF에는 어떠한 영향도 미치지 않았다. 한(Hahn)등[참조 문헌 : Hahn et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4813-4817; Starcich et al. (Cell 45, 637-648; Hahn et al. (1986) Science 323, 1548-1553]은 gp120 단백질 내의 예측된 아미노산 가변 영역을 동적하였고, 항바이러스성 항체의 유형 또는 분리체 특이성이 이들 과가변 영역의 인지에 기인하는 것으로 예측하였다. 예측된 과가변 영역중 하나에 존재하는 15개의 아미노산을 함유하는 강력한 중화 및 융합-차단 영역이 동정되었으며 이러한 결과는 유형 또는 분리체 제한된 중화에 있어서의 아미노산 변화의 역할을 지지한다. HIV-1 양성 혈청과 이 동일한 펩타이드와의 반응성은 이 단백질 영역이 HIV-1 감염 동안 인지되어 항체를 유도한다는 것을 나타낸다.

gp120에 대한 항원성 영역의 컴퓨터 추론된 예측이 모드로우 등에 의해 보고되었다[참고 문헌 : Modrow et al. (1987) J. of virol. 61, 570-578]. 펩타이드 1-63에 의해 포함되는 영역은 HIV-1 III B 분리체에 대하여 항원성인 것으로 예측된 영역중의 하나에 존재한다. 펩타이드 1-73의 일부도 항원성인 것으로 예측되나, HIV-1 양성 혈청과 반응성인 다른 펩타이드인, 1-80은 항원성이 아니었다. 펩타이드 1-80은 gp120의 보존된 영역으로부터 유도되므로 이 펩타이드에 대한 반응성은 추가의 연구가 요구된다. 즉, 펩타이드 1-80은 env-암호화된 단백질이 보존된 영역 내에 존재하지 않는 영역중의 서열에 있어서 상이할 수 있는, 다수의 독특한 HIV 분리체에 반응하여 유도된 사람 항체의 탐지에 유용하여야 한다.

비록 항-펩타이드 1-69 혈청의 HIV-억제 활성이 III B 분리체에 대하여 특이적인 것으로 나타나지만, 중화를 조정하고 세포 융합을 차단하는 항체가 단일의 짧은 (15개 아미노산) 펩타이드 서열에 반응하여 생성된다는 사실은 흥미롭다. 이러한 결과는 env의 동일한 15aa 영역이 바이러스 중화 및 세포 융합 억제 모두에 중요한 것으로 나타나므로, 두 과정에 대한 공통 기작이 존재할 수 있다는 것을 암시한다. 전술한 바와 같이 HIV 외피 단백질은 바이러스성 감염 및 감염 세포의 융합 모두에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으며, env-유도된 단백질에 특이적인 특정인 및 동물 항체는 바이러스 감염 및 융합 모두 차단한다.[참조 문헌 : Science 234, 1392-1395 : Rusche et al. (1987)) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6924-6928]. 연구 결과 상기의 두가지 활성 모두에 관하여는 항체는 gp120의 단일 15 아미노산 영역 내에 결합될 수 있다는 것 되었다. 놀랍게도, 본 발명의 모노클로날 항체는 HIV-중화 및 융합 차단 활성 모두 발휘하는 것 다. 비록 항-펩타이드 1-69에 의한 HIV-억제의 다른 가능한 기작이 가능하지만, 이 영역 펩타이드 1-69 항체의 결합은 gp120과 gp41과의 상호 작용도 방해할 수 있다.

바이러스를 감염 세포와 비감염 세포의 융합을 차단하는 모노클로날 항체는 부적절하고 잠정적으로 유해한 면역학적 반응을 피하면서 HIV-1 감염에 대한 증가된 내성을 제공할 수 있다.

펩타이드 1-69 또는 다른 HIV-1 분리체로부터의 외피 단백질의 상응하는 단편에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 항-인자형 항체를 유도하기 위한 연구시제(들)로서, AIDS 바이러스에 노출되거나 감염된 환자에 수동면역 또는 치료적인 잇점을 제공할 수 있다. 항-인자형 항체는 원래의 항체 Ab1을 증가시키는 항원에 대한 면역을 유도하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. HIV 감염의 경우, 항-인자형 항체를 사용한 면역화는 완전한 바이러스 또는 바이러스성 성분을 사용한 면역화에 비해 안전성을 제공한다.

합성 펩타이드 1-69에 대한 일련의 쥐의 모노클로날 항체가 개발되었다. 이들 모노클로날 항체중 하나는 이의 하이브리도마 클론 제5023, 24.4.1. 1호(ATCC # HB 10043)로 공지되었으며 특히 III B 분리체에 대한 강력한 HIV-1 바이러스 중화 활성을 가지며 HIV-1 III B 감염 세포의 비감염 표적 세포와의 융합을 차단하는 것으로 나타났다. 이와 같이 HIV-1 III B 분리체에 노출된 환자에 수동 면역을 제공하거나, 또는 바이러스 감염 환자의 질환의 진행을 늦추기 위한 치료제로서 유용하다. MAb 제5023, 24. 4.1호는 또한 env gp120에 대한 강력한 웨스턴 블롯 활성을 나타냈으며, 이러한 사실은 이것이 진단용으로 잠정적으로 사용될 수 있음을 암시한다. 이들 모노클로날 항체는 백신 생산을 위한 항-인자형 항체를 개발하는데 사용하기 위한 시발제도될 수 있다. 이러한 동일한 펩타이드에 대하여 상승된 다른 MAb는 낮은 수준의 중화 활성을 가지며 하기에 기술될 것이다.

문헌[참조 : Lehninger, Biochemistry. 2nd Edition, p. 72, Worth Publishers. Inc. (1975)]에 기술된 바와 같이, aa 잔기를 나타내기 위한 단일 문자 부호를 사용하여 펩타이드의 아미노산 서열을 표 1 및 4에 수록하였다. 따라서, 펩타이드 1-65의 aa 서열은 RIQRGPGRAFVTIGK 또는 Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-GIy-Lys으로서 동정될 수 있다.

다양한 종류의 약학 제제 및 용량 형에 관한 귀중한 정보원은 문헌[참조 : Remington's Pharmaceutical Sciences 17th Edition(1985), Mack Publishing Company Easton, PA 18042]이다.

제1도는 중첩성 합성 펩타이드에 의해 포함된 HIV-1 env-암호화 서열 지도이다. 밝은 영역은 보존된 단백질 영역을 나타내며 어두운 영역은 과가변 영역이다. [참조 문헌 : Pvtney et al. (1986) Science 234, 1392-1395 ; Sarin et al. (1986) Science 232, 1135-1137].

제2도는 다양한 종류의 MAb와 펩타이드 1-69(면역화 펩타이드), 1-178, 1-177, 5, 1-68, 및 1-70와의 면역 반응성을 고체상 ELISA 시험한 결과도이다. 이들 펩타이드의 서열은 표 6에 나타냈다.

[재료 및 방법]

[펩타이드의 합성 및 특정화]

Rapid Multiple Peptide Synthesis System(RaMPS, E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE)를 사용하여 중첩성 펩타이드를 제조한다. 이 시스템은 수동형으로 고체상 FMOC 화학을 사용한다. 고체 지지체는 p-알콕시벤질 알콜 수지(Bachem Inc, Torrance, CA)이다. 수지상의 아민 치환도의 범위는 약 0.25 내지 0.65mmol/g이다. 1차 활성화 목적을 위하여 보호된 아미노산(Hilligen Bedford, MA)의 펜타플루오로페닐 에스테르를 다른 사용 목적으로 준비된 하이드록시벤조트리아졸 보조되거나 예비 형성된 대칭성 무수물과 함께 사용한다. 커플링 효율은 프롤린에 가한 잔기에 대한 닌히드린(Kaiser test) 또는 이사틴에 의해 정량적으로 모니터링된다. 두 시험 다비반응 아민 그룹이 검출되었다.

음성 Kaiser 또는 이사틴 시험이 달성될 때까지 각각 커플링 반응시킴으로써, 99% 이상의 커플링 효율이 수득될 수 있다. 산 가수분해로 펩티닐 잔기를 절단하여 C-말단에 유리 카복실 그룹을 갖는 펩타이드를 수득한다. 이들 펩타이드를 20 내지 80% 아세토니트릴 : 물 구배를 사용하여 Pharmacia FPLC PepRPcNR 5/5 컬럼 상에서 역상 크로마토그래피에 의해 뱃치 견지성에 대하여 먼저 특정화한다. 모든 펩타이드를 고속 원자 충격량(bombardment-mass)분광 분석법을 이용하여 추가로 분석한다. 산정된 M+H의 주이온이 분명한 경우 주어진 펩타이드의 목적 서열이 존재하는 것으로 추론한다. FPLC로 구별할만한 주요피크 또는 질량 M+H의 분자성 이온을 나타내지 않는 펩타이드는 버리고 재합성한다.

펩타이드에 대한 항체 결합의 효소-연결된 면역 흡수 분석(ELISA)검정

합성 펩타이드는 글루타르알데하이드를 사용하여 Immulon^ⓡ-II 미세 역가 평판 상에 직접 부동화시킨다. 평판을 실온에서 2시간 동안 2% 글루타르알데하이드로 또는 30분간 0.1% 글루타르알데하이드로 활성화시키고 탈이온수로 세정한다. 글루타르알데하이드의 처리는 일상적으로 2가지 조건을 사용한다 : 2% 글루타르알데하이드를 사용하여 평판에 대한 펩타이드의 적합한 결합을 보장하고 0.1% 글루타르알데하이드를 사용하여 결합 부위의 변화를 피한다. 하나의 웰당 60mM 중탄산염 완충액(pH 9.6)중의 10㎍/ml를 함유하는 100μl의 펩타이드 용액을 가하고 4℃에서 밤새 배양한다. 평판을 37℃에서 1시간 동안 PBST(인산염 완충된 생리 식염수 +0.05% Tween^ⓡ10)로 37℃에서 1시간 동안 세척 및 차단시키고 4℃에서 저장 건조한다.

글루타르알데하이드 방법을 사용하여 미세 역가평판 웰에 직접 커플링시키는 경우 HIV 혈청 양성인 혈청과 반응하지 않은 펩타이드도 하기에 기술된 바와 같이 사람혈청 알부민(HSA)에 결합되었다. 이러한 방법을 사용하여 미세 역가 평판에 대한 펩타이드의 부동화를 보장한다. 글루타르알데하이드를 반응에 사용하지 않는 것을 제외하고는 펩타이드-HSA 결합물을 상기 방법을 사용하여 미세역가 평판 웰 상에 부동화시킨다.

사용 직전에, 지시된 경우, 평판을 37℃에서 30 내지 60분간 100μl 희석액(PBST+5% 소 혈청 알부민+ 20% 열 불활성화된 염소 정상 혈청+0.1% 나트륨 아자이드+0.05% 티메로살)으로 다시 차단시킨다. 희석액(100μl)으로 1 : 20비로 희석시킨 사람 혈청 시료를 각각의 웰에 가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 알칼리성 포스파타제-결합된 염소 안티-휴먼 IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories, Avondale, PA)를 실온에서 1시간 동안 배양하고 기질로서 o-니트로페놀 포스페이트를 사용하여 실온에서 1시간 동안 발색시킨다. 미세 역가 평판 판독기를 사용하여 반응물의 흡광도를 측정한다.

[펩타이드와 단백질 담체와 결합]

펩타이드를 면역화시키기에 앞서서 오브알부민 또는 키호울 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌에 접합시킨다. ELISA 연구를 위하여, 사람 혈청 알부민(HSA)을 담체 단백질로 사용한다. 담체 단백질(2mg/ml)을 실온에서 30 내지 60분간 0.5% 글루타르알데하이드로 활성화시킨 후, 이어서 동용적의 펩타이드 용액(디메틸설폭사이드 중 2mg/ml)을 가한다. 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 사람 혈청 알부민의 경우, 반응 혼합물을 탈이온수 또는 0.1M 글리신, pH 7.0에 대하여 밤새 투석한다.

[면역화 방법]

기니아 피그와 토끼를 표준 면역화 방법에 따라 면역시킨다. 기니아 피그 및 토끼를 완전한 프로인트(Freund) 보조제중의 펩타이드-담체 단백질 접합물 100 내지 200㎍으로 초기 면역시키고, 이어서 2주마다 불완전 프로인트 보조제중의 펩타이드-담체 단백질 결합물 1/2 양을 사용하여 보강접종한다. 매회 보강 접종할때 마다 혈청 시료를 수득한다.

[HIV 중화 및 세포 융합 분석]

25μl중의 약 500TCID₅₀감염 단위의 HIV-1 III B 또는 HIV-1 RF를 혼합하고 37℃에서 30분간 혈청 희석액(25μl)과 배양한다. Molt4 세포(4×10⁴)를 100μl 용적 중에 가하고 37℃에서 6일간 연속 배양한다. 혈청 시료의 최종 희석도는 1 내지 20이다. 매일 신선한 배지(RPMI+20% 태 송아지 혈청)를 가하여 각 배양액의 총 용적이 2배가 되게 한다. 6일째 되는 날, 상등액으로부터 100μl의 시료를 취하고 항원 포착 분석기(Du Pont, Wilmington, DE)를 사용하여 바이러스 gag-암호화된 p24 항원의 농도를 시험한다.

세포 융합 분석법이 문헌[참조 : Matthews et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84. 424-5428]에 기술되어 있다. 간단히, HIV-1 III B 또는 HIV-1 RF 만성 감염된 5000CEM 세포를 평판의 1/2중의 96웰중의 100μl 용적 중의 75,000 Molt 4 세포와 혼합한다. 분석에 사용된 혈청의 최종 희석도는 1 내지 20이다. 24시간 경과후 40X 배율에서 육안으로 거대 세포의 수를 센다.

[방사 면역 침전법]

각각 메티오닌(35S, 600μci/mmol) 및 시스테인(35S, 600μci/mmol) 500μci로 4시간 동안 표지시킨 8×10⁶세포로부터의 배양 배지(3ml)를 분석에 사용한다. 배양 배지를 정상인 혈청 및 단백질 A-세파로스로 예비 흡착한다. 사람 HIV-1 양성 혈청 또는 기니아 피그 혈청 시료 및 단백질 A-세파로스를 사용하여 단백질을 면역 침전시킨다. NaDodSO₄-PAGE(10%)로 단백질을 분리하고 겔을 자기 방사선을 촬영한다.

[실시예 1]

HIV-1 III B env에 상응하는 화학적으로 합성된 펩타이드에 대한 사람 항체의 결합

재료 및 방법에 기술된 바와 같이 펩타이드를 합성한다. 이 방법에 따라 사람 항체 반응성 및 동물의 면역화 선별 충분량의 펩타이드를 합성한다. 펩타이드에 의해 포함되는 영역을 제1도에 도시하였으며 PB1 재조합 단백질의 서열[참조 문헌 : Putney et al. (1986) Science 234, 1392-1395]이 포함되었다. 펩타이드는 5개의 아미노산이 중첩되도록 고안되었으므로 6개의 연속적인 아미노산 서열이 나타날 것이다.

표 1에 나타낸 모든 펩타이드와 12사람 HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료와의 반응성, 즉, 사람 HIV-특이항체에 의한 펩타이드의 인지 정도를 분석한다. 펩타이드를 함유하지 않는 글루타르알데하이드 처리된 빈웰을 사용한 혈청 시료를 사용하여 수득된 자연 흡수도보다 5배 이상의 평균 ELISA 흡수도를 갖는 펩타이드에 대한 혈청 시료의 수를 표 1에 나타냈다. 커플링 반응에 2% 글루타르알데하이드를 사용하여 수득한 데이타를 표 1에 나타냈다.

ELISA 흡수도는 펩타이드1-69 및 1-73에 대하여 최고이며 이들 펩타이드는 이들과 반응하는 혈청 시료의 %도 최고이다. 하기의 펩타이드를 펩타이드를 함유하지 않는 대조용 웰로 수득한 자연 흡수도보다 10배 이상인 ELISA 임계 흡수도를 사용하여 반응성으로 평가한다(펩타이드 명칭/양성 혈청의 수) : 1-69/5, 1-72/1, 1-73/3, 1-74/2, 1-77/1, 1-78/1, 1-81/2, 1-83/1, 및 1-84/1.

펩타이드 결합 반응에 0.1% 글루타르알데하이드를 사용한 경우 ELISA 자연 흡수도는 더 낮다. 이 분석에서, 흡수도가 자연 흡수도보다 5배 이상인 유일한 펩타이드는 펩타이드1-69이다. 12개의 혈청 시료중 9개가 평균 흡수도 1.06±0.47인 펩타이드 1-69와 반응성이다. 자연 흡수도보다 10배 이상의 ELISA 임계 흡수도가 사용되는 경우, 펩타이드 결합 반응에 0.1% 글루타르 알데하이드를 사용하여, 12개의 혈청 시료중 6개가 펩타이드 1-69와 양성인 것으로 평가한다.

추가로, 표 1의 실험에서 사람 항체에 결합하지 않는 것으로 나타난 펩타이드 1-67, 1-70, 1-71, 1-75, 1-76, 및 1-79는 미세 역가 평판 상의 펩타이드 부동화 3차 기술을 사용하여 시험한다. 이들 펩타이드는 먼저 사람 혈청 알부민(HSA)에 접합시킨 후 펩타이드-HSA 결합물을 미세 역가 평판 상에 부동화 시키고 HIV-1 양성인 사람 혈청 시료와의 반응성에 대하여 ELISA 시험한다. 이들 펩타이드 결합물은 여전히 대조용 혈청 이상의 유의할 만한 ELISA 흡수도를 나타내지 않는다.

선별된 펩타이드 ELISA를 사용하여 37개의 HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료 및 49개의 정상 HIV-1 혈청 음성인 혈청 시료를 분석하였고 결과를 표 2에 나타냈다. 3개의 정상 혈청 시료가 펩타이드 1-73을 사용하여 임계 흡수도 이상의 ELISA 흡수도를 나타냈다. 정상 HIV-1 혈청 음성인 혈청 시료의 어느 것도 ELISA에서 펩타이드 1-69 또는 1-80을 사용한 경우 양성이 아니었다. 시험된 37개의 HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료 중에서, 12개가 ELISA에서 펩타이드 1-69을 사용하여 양성이었고, 16개가 펩타이드 1-73을 사용하여 양성이었으며, 14개가 펩타이드 1-80을 사용하여 양성이었다. HIV-1 양성혈청 시료는 평균 ELISA 흡수도를 기준으로 하여, 펩타이드 1-73 및 1-80에 비하여 펩타이드 1-69와 더 반응성이었다. 펩타이드 1-73에 대한 높은 표준 편차 및 낮은 평균치는 다수의 HIV-1 양성 혈청 시료가 일부 정상 혈청 시료와 마찬가지로 이 펩타이드와 반응성이 아니며, 한편, 1-69 및 1-80에 대한 표준 편차는 혈청에 따라 반응성에 있어서 광범위함을 나타낸다.

펩타이드 1-69는 env-암호화된 gp 120 단백질 [참조 문헌 : Modrow et al. (1987) J. of Virol. 61, 570-578](표 4)의 과가변 영역중 하나로부터 유도되는 반면, 펩타이드 1-73 및 1-80은 바이러스의 상이한 분리체의 서열을 일부 보존하는 덜 가변성인 영역[참조 문헌 : Modrow et al. (1987) J. of Virol. 61, 570-578]으로부터 유도되었다. 펩타이드 1-69가 과가변 영역으로부터 유도된 경우, 놀랍게도 상대적으로 높은 %의 HIV-1 혈청 양성 혈청 시료가 펩타이드 1-69 ELISA를 사용하여 양성인 것으로 시험되었다. 다량의 면역 반응성이 펩타이드 1-69내의 고도로 보존된 Gly-Pro-Gly 서열에 대하여 특이적임이 가능하다. 펩타이드 1-69를 사용하여 HIV-1 양성 혈청으로 수득된 ELISA 흡수도는 평균적으로 1-73 및 1-80보다 크지만, 이들 펩타이드로 한 분석은 최적화되지 않았다. 표 1과 비교하여 표 2에 나타낸 바와 같이 펩타이드 1-73과 반응한 혈청 시료에 대한 낮은 ELISA 흡수도는 혈청 노출전평판을 희석제와 배양한 결과이다.

[실시예 2]

면역원으로서 HIV-1 III B에 상응하는 합성 펩타이드

표 1에 기재된 펩타이드 모두를 담체 단백질(키호울 림펫 헤모시아닌 또는 오브 알부민)에 결합시키고 각 펩타이드 담체 결합물을 사용하여 두마리의 기니아 피그를 면역시킨다. 기니아 피그는 편리한 시험 동물 체계로서 선택된다. 생성된 기니아 피그 항 혈청 시료를 ELISA 방법을 사용하여 항-펩타이드 활성에 대해 모니터링한다. 펩타이드 1-76을 초기에 기니아 피그에 주사하나 기니아 피그는 초기 주사 후에 곧 죽는다. 이어서 항-펩타이드 항체가 역효과를 나타내지 않는한 펩타이드를 토끼에 주사한다. 6개월 후에 기니아 피그 항 혈청의 항 바이러스 특성(예 : HIV중화 및 세포 융합-차단성)을 시험하기 위해 선발한다.

표 3의 데이타는 대부분의 펩타이드가 제1면역 6개월 후 펩타이드 특이성 항체의 생산을 유도하는 것을 나타낸다. 비록 다른 수준의 항체가 형성되지만, 두마리중 단지 하나의 동물만이 항체를 생성되는 경우는 없다. 펩타이드 1-67, 1-75, 1-77, 1-80 및 1-83은 결합 및 면역화에 사용되는 조건하에서 매우 낮은 수준의 항-펩타이드 항체를 유도한다. 주목할만한 수준의 항-펩타이드 항체를 생성한 동물은 대개 3개월 후에 반응성을 나타내고 그 수준은 2 내지 3개월 동안 증가된다.

면역 블럿 스트립상의 gp120에 결합된 항-펩타이드 혈청 시료만이 항-펩타이드 1-69이고; 이들은 HIV-1 III B의 120/160 밴드(데이타에는 기재되어 있지 않음)와만 명백한 반응성을 나타낸다. 항-펩타이드 1-69 혈청 시료는 또한 스트레인 HIV-1 III B (데이타에는 기재되어 있지 않음)로부터의 gp 120을 방사 면역 침전시킬 수 있는 실험 물질로부터의 유일한 혈청 시료이다. 펩타이드가 유도되는 gp 영역을 함유하는 재조합 이 콜라이-생성된 단백질 1EnV-14(ENV-14는 HIV-1 III B의 아미노산 40-517을 함유한다)을 사용하여 면역 블롯에 의해 분석하는 경우, 펩타이드 1-68, 1-69, 1-76 및 1-82에 대하여 특이적인 항 혈청과만 반응성이 탐지되었다. 1-69를 제외한 이들 펩타이드 모두는 잠정적인 당화 부위를 함유한다. 포유 동물 세포의 gp 120의 당화는 (비당화된) 펩타이드 1-68, 1-76, 및 1-82에 대한 특이성 항체의 결합을 방해한다.

기니아 피그 혈청 시료를 HIV 증식 억제능, 즉 세포 배양시, HIV 중화능 및 HIV 감염된 세포와 비감염된 세포간의 세포 융합 차단능에 대해서도 시험한다(표 3). HIV-1 III B를 중화시키고 융합을 차단할 수 있는 혈청 시료만이 펩타이드 1-69에 대하여 상승되었다. HIV-1 III B는 항 펩타이드 1-69 항체에 의해 중화되나, HIV-1 RF는 중화되지 않으므로, 중화 및 융합 차단 활성 둘다는 유형 특이성이다. 세포 융합 차단에 대해서도 HIV-1 III B는 항 펩타이드 1-69 항체에 의해 세포 융합이 차단되나, HIV-1 RF는 세포 융합이 차단되지 않는다.

표 5에서 나타낸 바와 같이, 펩타이드 1-69로 면역화된 동물에서 검출 가능한 HIV 세포 융합-차단 항체의 출현이 면역 개시 5개월까지는 발생하지 않고; 본 활성에 대한 항체 역가는 면역 개시 6개월째에 수득된다.

[표 1]

HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료와 HIV-1 III B env-암호화된 아미노산 서열에 상응하는 펩타이드와의 ELISA 반응성

평판에 부착시키기 위하여 2% 글루타르알데하이드 방법을 사용하여 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 ELISA를 수행한다. 혈청은 이들이 펩타이드 분석시 펩타이드를 함유하지 않는 글루타르 알데하이드 처리된 대조용 웰보다 5배 이상인 ELISA 흡수도를 나타내는 경우 양성으로서 판정한다. 평균 흡수도 및 표준 편차는 반응성 혈청(각 혈청에 대한 이중 웰)에 대한 모든 측정치를 이용하여 산정한다. 12개의 HIV-1 혈청 양성인 혈청 시료가 시험되었다.

[표 2]

선별된 펩타이드 ELISA 상의 사람 HIV-1 혈청 양성 및 혈청 음성인 혈청 시료의 반응성 비교

사용전 미세 역가 웰을 1시간 동안 희석제로 차단시키는 것을 제외하고는 표 1에 기술된 바에 따라 ELISA를 수행한다. 혈청 시료는 37개의 HIV-1 양성 혈청 시료 및 47개의 정상 혈청 시료를 시험하여 0.2 이상의 ELISA 흡수도를 나타내는 경우 양성으로 판정한다.

[표 3]

펩타이드에 의해 유도된 항체의 항바이러스성 활성의 특정화 및 평가

표 3에 대한 각주

* 토끼에 주사된 76을 제외한 모든 펩타이드에 대하여 기니아 피그를 사용한다. 이들은 초기 주사 2 내지 5개월 후에 출혈하고, 모든 다른 것들은 6개월 후에 출혈한다.

+제한 희석도는 수득된 흡수도가 0.1인 희석도로서 희석 곡선으로부터 산정한다.

* * 융합 분석 수는 1 : 10 혈청 희석도에서 형성된 거대 세포의 수이다. 가해진 대조용 혈청은 50, 65 거대 세포를 갖는다. ND=갖지 않음

# 중화 활성은 방법에 기술된 바와 같이 수행하며 상등액중에 존재하는 p 24의 양(ng/ml)을 나타낸다.

[표 4]

HIV-1 Ⅲ B 펩타이드 1-69에 대한 상동 영역에 상응하는, 상이한 NIV-1 및 HIV-2 분리체에 대한 env-암호화된 펩타이드의 서열

표 4에 대한 각주

HIV env aa서열은 Los Alamos National Laboraory로부터 입수하며 문헌[참조 : Human Retroviruses and AIDS 1987. Los Alamos National Laboraory, Los Alamos NM]에 상세히 기술되어 있다. HIV env-암호화된 아미노산 서열은 예를 들어, Intell; Geneics, Inc. (Mountain view, CA), 또는 Genetics Computer Group(University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison. WI)로부터 구입할 수 있는 표준 컴퓨터 프로그램을 사용하여 상동성에 대하여 정렬시킨다.

대쉬(-)는 그 위치에서의 aa가 상응하는 aa 즉, BH/O 서열 중의 일직선인 aa와 동일함을 나타낸다. 점(·)은 틈(gap)이 존재하여 그 위치에 aa가 존재하지 않음을 나타낸다. 틈을 서열의 정렬을 촉진하도록 유도된다.

HIV-1 III B-유도된 env-암호화된 펩타이드 1-69의 서열은 aa번호 제308번 내지 322번이다(Human Retroviruses and AIDS 1987에 따른 번호 매김, Los Alamos National Laboratory ). 다른 HIV 분리체중의 HIV III B(BH 10, HXB 2, BH 8, HXB 3, PV 22) 펩타이드 1-69에 상응하는 영역은 HIV-1 III B 분리체 중의 aa번호 제296번 및 331번에 상응하는 두개의 고도로 보존된 Cys 잔기(원형) 사이의 거의 중간에 위치한 15 내지 25aa 서열 내에서 발견되었다. Gly-Pro-Gly(원형)의 서열은 상이한 HIV 분리체로부터 펩타이드 1-69에 상응하는 env-암호화된 영역이 대부분에서 발견된다. HIV-1 III B 펩타이드 1-69에 상응하는 HIV 분리체내 env-암호화된 영역은 상기 기술된 컴퓨터 프로그램을 사용한 결과, HIV-1 III B의 약 aa 제304 내지 326번과 일직선인 aa위치에 포함된다.

[표 5]

펩타이드 1-69에 의해 유도된 융합 차단 항체의 농도

[실시예 3]

펩타이드 1-69에 대한 모노클로날 항체의 제조

재료 및 방법

펩타이드 및 펩타이드 결합물

아미노산 서열이 RIQRGPGRAFVTIGK인 펩타이드 1-69는 74% 순물질로서, 벨몬트 캘리포니아 94002에 소재하는 페닌슐라 래보러토리즈로부터 입수한다. 이것은 글루타르알데하이드를 사용하여 난백 오브알부민과 결합시킨다[참조 문헌 : Reichlin, M., Meth. in Enzymol 70 : 159-169(1980)]. 본 펩타이드 결합물을 약어로 Oval-glut-69라 한다(다른 펩타이드-단백질 결합물을 이와 유사한 방법으로 명명한다). 펩타이드 1-69는 또한 수용성 카보디아미드, 1에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(ECDI)를 사용하여 소 티로글로불린에 결합시킨다[참조 문헌 : Goodfriend et al, Science 144 : 1344-1346(1964)]. 커플링시킨 후, 결합물을 인산염 완충된 생리 식염수(PBS)에 대해 투석하여 특정의 유리 펩타이드 및 과량의 커플링제를 제거한다.

펩타이드 1-69외에, 아미노산 제475 내지 486번으로 이루어진 아미노산 서열이 MRDNWRSELYKY인 HIV-1 외피-유도된 합성 펩타이드(펩타이드 #5로 표기됨)를 대조용 펩타이드로서 포함된다. HIV-1 gp 120과도 반응하는 펩타이드 #5에 대한 MAb는 문헌[참조 : Durda et al., AIDS Research and Human Retroviruses 4 : 331-341(1988)]에 상술되어 있다.

[면역화 및 항체 생성]

Balb/oxc 57 B 1/6 F1 마우스(생후 8주), #5020-5029를 문헌[참조 : French et al., Immunology Today 7 : 344-346(1986)]에 기술된 방법에 의해 면역화한다. 요약해서, 완전환 프로인트 보조제와 1 : 1 혼합된 Oval-glut-69 결합 물질 100㎍을 1회 복막내 접종한다. 4주 후에, 마우스는 출혈하고 펩타이드-특이성 항체 반응을 측정한다. Ab 역가가 떨어질때까지 마우스를 휴식시키고, 이 시점에서 불완전한 프로인트 보조제 중의 Oval-glut-69-결합물 100㎍으로 보강접종한다. 유사한 방법으로, 동물 #5040-5049를 면역시키고 BTG ECDI-69로 보강접종한다. 보강접종량의 결합물을 투여한지 4일 후, 마우스를 치사시키고 이의 비장 세포를 SP 2/0-Ag 14 골수종 세포(ATCC #CRL 1581)와 전형적인 하이드브리도마 융합 방법[참조 문헌 : Galfre et al., Nature 277 : 131-133(1979)]으로 융합시킨다. 다른 적합한 융합 파트너에는 P 3/NS 1/1-Ag 4-1(ATCC # TIB 18) : P 3×63 Ag 8 U.1 (ATCC # CRL 1597); 및 P 3×63 Ag 8.653 (ATCC # CRL 1580)이 포함된다.

고체상 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의하여 목적하는 하이브리드를 선별한 후, 하이브리도마를 지정된 농도(1세포/3웰)로 희석시킴으로 2회 클로닝시킨다. 벌크 항체가 Balb/cxc 57 B 1/6 F1 마우스중의 복수로서 제조된다. 복수액을 황산 암모늄 침전 및 단백질 A 친화성 크로마토그라피에 의해 정제한다[참조문헌 : EY et al., Immuno Chemistry 15 : 429-436 (1978)]. MAb #5025, 29, 1. 1. 1 및 #5023, 24.5가 IgG 2b인 것을 제외하고, 면역 글로블린은 IgG 1형이다.

고체상 효소 결합된 면역 흡수 검정(ELISA)

상기 기술된, 예를 들어 BTG-ECDI-69와 같은 단백질 펩타이드 결합물(100ng/웰)을 4℃에서 18시간동안 0.1M NaCO₃완충액(pH 9.6)중의 Immulon

미세 역가 평판(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, Va, 22021)에 흡착시킨다[참조문헌 : Voller et al., Mannal of Clin. Immun. 69 : 506-510 (1976)]. 이어서 평판을 PBS(인산염 완충된 생리식염수)주의 0.05% Tween

로 세척한다. 하이브리도마를 본원에서 참조문헌으로 인용된 문헌[참조문헌 : Durda et al., AIDS Research and Human Retroviruses 4 : 331-342(1988)]에서 기술된 바와 같이 펩타이드 결합물 평판에 결합된 항체의 생산에 대해서 시험한다.

[전기 영동 및 웨스턴 면역 블롯팅]

HTLV-1 III B(1% 트리톤

X-100중의 동결 건조제 로서)를 윌밍턴 델라웨어에 소재하는 이.아이.듀풍드 네모아 사로부터 단백질 1ml당 800㎍의 농도로 구입한다. 동결 건조체를 100℃에서 5분 동안 5% 2-머캅토에탄올을 함유하는 시료 완충액으로 파괴시키고[참조문헌 : Laemmli, Nature 277 : 680-685 (1970)], 5 내지 15% 아크릴아미드 구배겔(10cm×12cm×0.15cm)상에서 전기 영동시킨다.¹²⁵I 표지된 단백질 분자량 마커(Du pont/NEN Research Product)를 시료 중에 포함시킨다. 바이러스 단백질을 니트로 셀룰로우즈에 전기-트랜스 블롯팅시키고 웨스턴 블롯을 문헌[참조문헌 : Tsang et al., Meth, in Enzymol. 92 : 377-391 (1983)]에 기술된 바와 같이 필수적으로 수행한다. 면역 블롯팅을 위한 희석제 완충액으로서 PBS중의 4% 염소 정상 혈청을 함유하는 5% 무지방 무수분유를 사용한다.

[웨스턴 블롯팅 활성의 억제]

상술한 펩타이드 1-69 및 #5을 정제된 MAb에서와 같이 웨스턴 블롯 희석제 중에서 10㎍/ml가 되게 희석시킨다. 항체 및 펩타이드를 1 : 1로 혼합하고 22℃에서 1시간동안 배양한다. 이어서 이들을 상술한 웨스턴 블롯형으로 분석한다.

[면역 형광 검정]

매사추세츠 제네랄 호스피탈의 감염성 질환 래보러토리의 로이 빙톤에서 제공된 HTLV-III B 감염된 및 비감염된 H9 세포 22℃에서 1시간동안 1% 소 혈청알부민을 함유하는 PBS(PBS BSA)중에서 재수화시킨다. 이어서 슬라이드를 희석된 복수 또는 하이브리도마 상등액에서서 제1항체와 함께 22℃에서 2시간 동안 배양시킨다. 철저하게 세척한 후, 형광화된 GAM F(ab')2 (Du pont/NEN Research Products)를 사용하여 마우스 항체의 존재유무를 검출한다. 실온에서 1시간 경과 후, 형광화된 Ab를 제거한다. 이어서 세포를 세척하고 50% 글리세롤 : PBS(v/v)중에 고정시킨다. 슬라이드를 형광 현미경을 사용하여 조사한다.

[중화 검정]

항체를 시험관 내에서 HIV-1 감염성을 중화하는 능력에 대해 본원에서 참고문헌으로 인용된 문헌[참조 : D.HO et al. J. Virol. 61 : 2024-2028 (1987)]의 방법에 따라 필수적으로 검정한다. 하이브리도마 세포 상등액(35㎍/ml IgGl)을 2% 태 송아지 혈청(2배 연속 희석물)을 함유하는 RPMI-1640 배지 중에서 예비 희석시킨다. 희석된 항체 100μl을 50 TCID-50 단위에 필적하는 동용적의 정제된 바이러스에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하고 난 다음, 1.5 내지 2.0×10⁶H9 세포에 가한다. 배양물을 37℃에서 7일 동안 배양하고, 재공급한 다음, 추가로 7일 동안 배양시킨다. 이때, 합포체 형성으로 나타나는 세포병변 효과를 조사하고 배양액에 존재하는 p 24 HIV gag 항원의 양을 대조 배양액과 비교한다. 중화 활성에 대해 양성으로 사려되는 항체에 대해 p24 양의 90% 이상의 감소가 요구된다.

[세포 융합의 억제]

세포 융합 검정은 본원에서 참조문헌으로 인용된, 문헌[참조문헌 : T. Matthews et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 5424-5428 (1987)]에 기술되어 있다. 요약하여, 30μl중의 4000개의 감염된 세포(CEM 세포중의 HIV-1 III B 및 H9 세포의 HIV-1 HAT 3)를 미세 역가 웰 내에 시딩한다. 희석된 항제(상술한 바와 같음)30μl을 가한다. 37℃에서 30분 경과후에, RPMI 배지 중의 56,000SupT-1세포를 함유하는 30μl을 웰에 가한다. 평판을 37℃에서 밤새 배양하고 아침에 합포체 형성(세포 융합)을 평가한다. 항체를 함유하지 않은 웰은 웰당 50 내지 70개의 합포체를 갖는다.

[결과]

[MAb 미세 특이성]

펩타이드 1-69(HIV-1 III B외피 아미노산 제308 내지 322번)에 대한 MAb을 면역화 펩타이드 1-69, 뿐만 아니라 아미노산 298 내지 332 영역의 기타의 중첩성 펩타이드 및 308 내지 322영역내의 여러가지 작은 펩타이드에 대한 면역 활성에 대해 시험한다. 사용된 펩타이드의 서열 및 이의 상대적인 위치는 표 6에 기재되어 있다. 제2도에서 알 수 있는 바와 같이, MAb는 면역화 펩타이드에 대해 특이적이다. 제2도에서 #5023,24,5를 제외하고는 기재된 어떠한 MAb는 펩타이드도 HIV-1 외피 아미노산 475-486을 으로 나타내는 대조 펩타이드, 펩타이드 #5와 반응하지 않으며, 이들은 각각 아미노 및 카복실 말단상의 펩타이드 1-69를 중첩하는 펩타이드 #1-68 및 1-70과 반응하지 않는다. 반응성의 변화 정도는 펩타이드 1-69보다 env aa 308 내지 322이 더 작은 부분을 점유하는 펩타이드 1-77 및 1-178로 관찰된다. 실험에 사용된 고체상 ELISA는 ELISA 미세 역가 평판 상에 피복된 유리 펩타이드를 사용한다. 제2도 및 표 7의 MAb는 축소된 클론 명칭으로 언급된다. 생략되지 않은 클론 번호는 하기와 같다: 5021, 22.2=5021, 22.2.1.1; 5023, 24.4=5023, 24.4.1.1 ; 5025, 29.1=5025, 29.1.1.1 ; 5025, 29.2=5025, 29.2.1.1; 및 5042, 43.3=5042, 43.3.2.1. 후자는 ATCC 기탁용으로 사용된다.

MAb의 특이성은 또한 용액상을 억제함으로써 검사한다. 이들 실험에서 MAb는 ELISA 중에서 펩타이드 1-69 피복된 평판을 사용하여 적정하기 전에 유리 펩타이드와 함께 예비 배양한다. 이들 실험의 결과의 요약은 표 7에 기재되어 있다.

[표 6]

[표 7]

억제에 사용된 펩타이드

플러스(+)는 억제 수준을 나타내고; +/-는 유리, 가용성 펩타이드 1MG/ML에서 20% 이상의 억제를 나타내며, +는 100㎍/ml에서 90% 이상의 억제를 나타내고, ++는 10㎍/ml에서 90% 이상의 억제를 나타내며, +++는 1㎍/ml에서 90% 이상의 억제를 나타낸다.

항체 농도는 100㎍/ml의 농도상에서 변한다.

항체는 예비 혼합시켜 PBS : BSA(1 : 1)중의 펩타이드의 농도를 변화시키면서 예비 혼합한다. 23℃에서 약 1시간 후에 혼합물 100μl을 PBS : BSA로 차단된 25/50μl/웰로 1-68 또는 1-69로 피복된 Immulon Ⅱ 평판에 가한다. 평판상에 23℃에서 약 60분 동안 MAb로 배양시킨다.

모든 MAb은 1-176 및 1-70과 비반응성이다. 펩타이드 1-68에 대해 MAb 4407.2를 제조한다.

MAb와 바이러스 성분과의 반응성을 측정하기 위하여, 여러가지 조건하에 웨스턴 블롯을 수행한다. 바이러스 동결건조체(겔당 단백질 200㎍)을 2-머캅토 에탄올의 존재 또는 부재하에 파괴시키고 SDS-PAGE로 분리한다. 제2도에 기재된 MAb와 환원된 바이러스 성분 및 모조(mock) 바이러스 동결 건조체(바이러스와 같이 프로쎄싱된 비감염 H9 세포)의 성분과의 웨스턴 블롯 반응성을 Durda 등에 의해 기술된 바와 같이 측정한다. #5020.1; 5023.24.5; 5042.43.1; 및 5042.43.2를 제외한 모든 MAb은 환원 및 비환원 조건하에 약 120KD의 HIV-1 바이러스 성분과 반응하는 것으로 밝혀졌다. MAb은 어떠한 HIV-1 바이러스 성분과도 반응하지 않는다.

이들 MAb중 가장 강력한 것인 MAb 5023, 24, 4.1.1에 의해 발생된 웨스턴 블롯 시그널이 아미노산 서열, RIQRGPGRAFVTIGK에 기인한다는 것을 확인하기 위하여, 1-69의 존재 또는 부재하에 MAb을 시험한다. 블롯팅 시그널의 억제는 인지 펩타이드, 1-69로는 알 수 있으나, 대조 펩타이드 #5로는 알 수 없다.

슬라이드에 고정된 세포를 사용한 형광 면역에서, MAb 5023, 24, 4.1.1 뿐만 아니라 MAb 5021, 22.2.1.1, 5025, 29.1.1.1 및 5042, 43.3.2.1은 HIV-1의 Ⅲ B 분리체로 감염된 H9 세포상에서 양성반응을 나타낸다. 이어서 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 생 HIV-1 Ⅲ B 감염된 CEM/NKR 세포상에서 MAb을 시험한다. MAb 5023, 24.4.1.1은 HIV-1 Ⅲ B 감염된 세포 47%와 반응하였고; HIV-1 MN 분리체로 감염된 세포의 5%만이 5023, 24.4.1.1에 의해 염색되는 것으로 나타난다. HIV-1 RF 분리체로 감염된 세포 또는 비감염된 CEM/NKR 세포와의 반응성은 관측되지 않는다. MAb 5025, 29, 1.1.1은 유사한 반응 패턴을 보이지만 HIV-1 Ⅲ B 감염된 세포와는 낮은 염색율(27%), HIV-1 MN 세포와는 높은 염색율(16%)을 나타낸다. 한편, 대조 부류와 맷칭된 항체(골수종 단백질)는 감염되거나 비감염된 생세로에 결합하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Ⅲ B 이외의 HIV 스트레인과 가교 반응이 어느 정도 일어났으나 비감염된 세포와는 그다지 반응성이 아님을 암시한다.

바이러스 중화

중화 활성을 시험하고 기타 MAb 및 항 혈청과 비교하는 경우 표 8에 기재된 결과가 수득된다. MAb 5023, 24.4.1.1.1은 가장 강한 HIV-1중화 활성을 나타내고, 본 특정의 검정 형태에서 대부분의 사람 중화 혈청을 사용하여 나타난 중화 활성만큼 강하다. MAb 5021, 22.2.1.1 또한, 표 8에 기재된 바와 같이 HIV-1 3B 중화 활성이 입증되었다.

[표 8]

펩타이드 1-69에 대한 MAb의 HTLV-3B의 중화

혈청 시료는 잘 정의된 사람 혈청이고 적정 형태로 시험하는 경우 양성 혈청의 중화 역가는 1/32 내지 1/64이다. CPE는 복제되는 HIV-1에 의해 숙주 세포에 유도된 세포 병변 효과(즉, 합포체 형성 및 세포 사멸)를 의미한다. 활성 HIV-1에 기인한 가장 심각한 세포 붕괴는 가시적으로 3-4+로 표기된다.

세포 융합 차단

MAb 5021, 22.2.1.1, 5023, 24.4.1.1, 5025, 29.1.1.1 및 5042, 43.3.2.1에 의한 HIV-1 감염 세포와 표적 세포, Sup T-1(D. Bolognesi, Duke University로부터 입수됨)와의 융합 억제를 입증하는 데이타는 표 9에 기술되어 있다.

Sup T-1은 T 세포상의 HIV-1의 수용체인 CD4 항원의 강한 발현자이다. HIV-1 Ⅲ B 및 HIV-1 MN 감염된 세포에 대한 활성을 평가한다. MAb 5025, 29.1.1.1은 항원이 유도되는 분리된 HIV-1 Ⅲ B에 대해서 뿐만 아니라 HIV-1 MN 분리체에 대해서도 융합-억제-활성을 나타낸다. 상술된 보고결과는 이러한 HIV-억제 항체가 유형 또는 분리체 특이성임을 암시한다.

[표 9]

MAb에 의한 펩타이드 1-69에 대한 합포체 형성(융합)의 억제

모든 MAb는 복수이고 1/50 희석비에서 시험한다. MAb 4407.2는 펩타이드 1-68에 대해 제조되었고 : MAb 351-56은 항 Hras MAb이며; MAb 2085.1은 HIV-3(3B) 외피 단백질의 아미노산 740-750에 대하여 제조되었다. MAb 2085.1은 외피 단백질 또는 어떠한 바이러스 성분과도 반응성이 없는 것으로 입증되었다. 다른 IgG1 및 IgG2b 대조군도 필적한 만한 결과가 수득될 수 있는 것으로 예상된다.

MAb 5021, 22.2.1.1이 펩타이드 1-178(제2도)와 반응하고 펩타이드 1-175(표 7)에 의해 차단된다는 사실은 펩타이드 1-178과 1-175 둘다에서 공유된 서열 QRGPGRA 내에 5021. 22.2.1.1에 의해 인지된 에피토프를 함유한다는 것을 나타낸다.

MAb 5025, 29.1.1.1이 펩타이드 1-177 및 1-178(제2도 및 표 7)와 반응한다는 사실은 펩타이드 둘다에 공유된 서열 GPGRAFV 내에 5025. 29.1.1.1에 의해 인지된 에피토프를 함유한다는 것을 나타낸다.

MAb 5042, 43.3.2.1이 펩타이드 1-175(표 7)에 의해 차단된다는 사실은 MAb 5042, 43.3.2.1에 의해 인지된 에피토프가 서열 RIQRGPGRA 내에 함유한다는 것을 나타낸다.

MAb 5023, 24.4.1.1이 펩타이드 1-177(표 7)에 의해 차단된다는 사실은 본 MAb이 서열 GPGRAFTIG에 의해 형성된 에피토프를 인지한다는 것을 나타낸다.

함께 수득된 결과는 바이러스 억제 활성을 갖는 항체에 의해 인지된 중요한 에피토프는 잔기 GPGRA에 의해 형성된다는 것을 나타낸다.

흥미롭게도, MAb 5025, 29.1.1.1은 HIV-1 3B 뿐만 아니라 HIV-1 MN(표 9)를 억제한다. 따라서 5025, 29.1.1.1은 상술된 바와 같이 서열 GPGRAFV 뿐만 아니라 HIV-1 MN으로부터의 상응하는 서열인 GPGRAFY(표 4)에 의해 형성된 에피토프도 인거한다. 펩타이드 1-69 영역내의 서열에 근거하여, MAb 5025, 29.1.1.1은 HIV-1 스트레인 SF2 및 NMJ2(표 4)도 억제할 것으로 기대된다.

에피토프 QRGPGRA , RIQRGPGRA , GPGRAFVTIG , GPGRAFV 및 GPGRA를 함유하는 5 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드는 면역학적으로 허용되는 담체와 결함시키는 경우 포유동물의 HIV-억제 항체의 생성을 유도하기 위한 유용한 면역원이다. 이와 유사하게, 기타 HIV 분리체로부터의 상응하는 펩타이드도 포유 동물의 HIV-억제 항체의 생성을 유도하기 위한 유용한 면역원으로 기대된다.

펩타이드 1-69에 대한 단일 MAb가 강한 HIV-1 중화 및 융합-차단 활성을 나타낼 수 있다는 것의 관찰은 흥미롭고 기대하지 않은 것이다. 이러한 MAb는 중요한 치료 용도를 갖는다.

# 5021, 22.2.1.1, 5023, 24.4.1.1, 5025, 29.1.1.1, MAb 5025, 29.2.1, 1, 및 5042, 43.3.21로 표기된 하이브리도마 세포주 MPEP 608. 01(P)(C)(1)(2) 및 (3)의 항 및 부다페스트 조약에 따라 아메리칸 타입 컬쳐컬렉션(ATCC), (Rockville, MD)에 1989년 3월 1일자로 기탁되었다. 이들 하이브리도마 세포주에 대한 ATCC 기탁 번호는 각각 HB10040, HB10043, HB10041, HB10042 및 HB1004이다. 배양군은 37 CFR 1.14 및 35 USC 122하에 여기에 권리를 부여한 장관에 의해 결정된 사람에게 특허원의 계류동안 입수가능하다. 특허가 양도된 경우 균주를 제3자가 용이 입수시의 모든 제한은 변경할 수 없이 제거된다.

본원에서 사용된 바와 같이 ＂필수적으로 조성된＂이란 용어는 통상적인 의미를 갖으며 즉, 모든 명시된 물질 및 상태는 본 발명의 수행시 매우 중요하나 기타의 치료제 또는 성분을 포함하는 추가의 명시되지 않은 물질 및 조건도 본 발명의 이익을 방해하지 않은 한 배제되지 않는다.

Claims (29)

1. HIV-1 III B의 아미노산 제308번 내지 322번에 상응하는 아미노산 서열, 및 HIV-1 III B 외피 단백질의 아미노산 제296번 내지 307번과 아미노산 323번 내지 331번에 상응하는 아미노산 서열로부터 선택된 추가의 아미노산을 함유함을 특징으로 하는, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 외피 단백질의 아미노산 15 내지 36개로 이루어진 화학적으로 합성된 펩타이드.
2. 제1항에 있어서, HIV-1 III B 외피 단백질의 아미노산 제308번 내지 322번을 함유하는 펩타이드.
3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 RIQRGPGRAFVTIGK를 함유하는 펩타이드.
4. 제1항에 있어서, 길이가 15 내지 25개의 아미노산인 펩타이드.
5. 아미노산 서열 KLREQFGNNKTIIFK를 함유함을 특징으로 하는, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV)외피 단백질의 아미노산 15 내지 30개로 이루어진 화학적으로 합성된 펩타이드.
6. 아미노산 서열 CRIKQIINMWQEVGK를 함유함을 특징으로 하는, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV)외피 단백질의 아미노산 15 내지 30개로 이루어진 화학적으로 합성된 펩타이드.
7. 면역학적으로 허용되는 담체와 결합된 보호 유효량의 제1항의 펩타이드를 함유함을 특징으로 하는, HIV에 대한 보호 백신.
8. 면역학적으로 허용되는 담체와 결합된 보호 유효량의 제2항의 펩타이드를 함유함을 특징으로 하는, HIV에 대한 보호 백신.
9. 각각 상이한 HIV 분리체로부터의 서열에 상응하고, 면역학적으로 허용되는 담체와 결합된 보호 유효량의 제1항에 따른 상이한 펩타이드 적어도 두개를 함유함을 특징으로 하는, HIV에 대한 보호 백신.
10. HIV-1 III B의 아미노산 제308번 내지 322번에 상응하는 아미노산 서열, 및 HIV-1 III B 외피 단백질의 아미노산 제296번 내지 307번과 아미노산 323번 내지 331번에 상응하는 아미노산 서열로부터 선택된 추가의 아미노산을 함유하는 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 외피 단백질의 아미노산 15 내지 36개로 이루어진 펩타이드에 대한 HIV-억제 모노클로날 항체.
11. 제10항에 있어서, 펩타이드가 HIV-1 III B 외피 단백질의 아미노산 제308번 내지 322번을 함유하는 HIV-억제 모노클로날 항체.
12. 제10항에 있어서, 펩타이드가 아미노산 서열 RIQRGPGRAFVTIGK를 함유하는 HIV-억제 모노클로날 항체.
13. 제12항에 있어서, 펩타이드이 길이가 15 내지 25개의 아미노산인 HIV-억제 모노클로날 항체.
14. 제13항에 있어서, 펩타이드가 아미노산 서열 RIQRGPGRAFVTIGK를 함유하는 HIV-억제 모노클로날 항체.
15. 제14항에 있어서. MAb 5021, 22.2.1.1(ATCC # HB 10040), 5023, 24.4.1.1(ATCC # HB 10043), 5025, 29.1.1.1(ATCC # HB 10041), 5025, 29.2.1.1(ATCC # HB 10042), 및 5042, 43.3.2.1(ATCC # HB 10044)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 클론에 의해 동정된 주의 모노클로날 항체.
16. 제15항에 있어서, 클론 번호 MAb 5023, 24.4.1.1호(ATCC # HB 10043)에 의해 동정된 쥐의 모노클로날 항체.
17. 제15항에 있어서, 클론 번호 MAb 5025, 29.1.1.1(ATCC # HB 10041)에 의해 동정된 쥐의 모노클로날 항체.
18. 필수적으로 치료량의 제10항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.
19. 필수적으로 치료량의 제11항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.
20. 필수적으로 치료량의 제12항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.
21. 필수적으로 치료량의 제13항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.
22. 필수적으로 치료량의 제14항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.
23. 필수적으로 치료량의 제15항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.
24. QRGPGRA , RIQRGPGRA , GPGRAFVTIG , GPGRAFV, 및 GPGRA로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 5 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 화학적으로 합성된 펩타이드.
25. 제24항의 펩타이드와 면역 반응성인 HIV-억제 모노클로날 항체.
26. 제1항의 펩타이드와 면역 반응성인 HIV-억제 모노클로날 항체.
27. 제2항의 펩타이드와 면역 반응성인 HIV-억제 모노클로날 항체.
28. 필수적으로 치료량의 제25항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.
29. 필수적으로 치료량의 제26항의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어진 약학 조성물.

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