KR910008640B1 - 배양제어방법 및 배양제어장치 - Google Patents

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Description

배양제어방법 및 배양제어장치

제1도는 복합 플라스미드 pTREZ1의 구조를 나타낸 도면.

제2도는 trp 프로모터의 하류부위의 기본서열을 나타낸 도면.

제3도는 복합 플라스미드 pTREZ1의 구조를 나타낸 플로우 다이아그램.

제4도는 RQ, 세포증식과 β-gal생산과의관계를 나타낸 그래프.

제5도는 본 발명의 배양제어장치의 실시태양을 나타낸 개략도.

제6도 및 제7도는 각기 50ℓ들이 자동제어 배양 조에서의 SM발효 시험 결과를 나타낸 그래프.

제8도 및 제9도는 본 발명에 따른 실시 예에 있어서의 배양제어의 실시결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 배양제어방법 및 배양제어장치에관한 것으로, 특히 미생물 또는 동식물 세포 등으로 항생물질, 아미노산, 효소 및 생리학적 활성을 가진 물질 등과 같은 대사물을 효율적으로 생산하기 위한 배양제어방법 및 배양제어장치에관한 것이다.

미생물 또는 동식물 세포 등으로 상기한 바와 같은 대사물을 생산하는 것은 종래로부터 행하여져 왔으나, 이러한 대부분의 종래 방법은 배양 탱크내에서 배지에 종료를 단순히 배양하는 배치식 배양으로 수행하는 것이며, 생산성이 낮다. 본 발명자들은 생산성을 높이기 위한 방안으로서 배양 도중에 기질 및 유도물질을 첨가하는 배양법으로 검토하게 되었다. 배양단계에서 기질 및 유도물질을 첨가하는 공업적 규모의 연구에 대한 것을 보고된 바 없다.

예를 들면, 일본국 공개특허공보 제141796/1983호에는 대사물(예, 펩타이드)의 생산을 위한 배양법이 기재되어 있다. 그러나, 이 방법으로는 연속(예, 온-라인)적으로 균체증식을 시키는 것은 불가능하며, 따라서 기질 및/또는 유사물질을 첨가하는 적합한 시점은 언급되어 있지 않다. 일본국 공개 특허공보 제125686/1977호에는 대사물을 생산하기 위한 것은 아니나, 효모의 배양방법이 기재되어 있는데, 이 방법은 소위 호흡율을 일정 범위 내로 유지시키면서 총산소 소비 속도에 따라 배양액을 첨가하는 것이며, 호흡율의 변화를 검색하여 기질 및/또는 유사물질을 첨가하는 과정을 채용한 것은 아니다.

본 발명의 목적은 대사물 생산용 세포배양을 공업적 규모로 효율적으로 수행하는 방법 및 장치를 제공하는 데 있다.

세포를 호기적으로 배양하여 대사물을 생산케 하는 본 발명의 방법은 세포배양에 의해 발생되는 이산화탄소의 양에 의거한 제1의 파라메터와 세포배양에 의해 소비되는 산소의 양에 의거한 제2의 파라메터와의 비율의 변화를 지표로 하여 배양액에 기질 및/또는 유도물질을 첨가하거나, 균체 증식 및/또는 대사물 생산의 종점을 판정하거나 또는 배양을 종료하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 사용하는 세포는 미생물 세포 또는 동식물세포 어느 것이나 상관없다. 본 발명을 특히 유전자 재조합 균세포 배양에 적용하면 현저한 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 대사물의 생산은 세포배양 후에 또는 세포배양과 동시에 수행할 수 있으나, 후자의 공정이 공업적 견지에서 바람직하다.

각 파라메터의 검출과 이들 파라메터에 의거한 배양제어(온/오프제어포함)는 온-라인으로 수행하는 것이 바람직하다.

이러한 파라메터에 의거한 대표적인 비율은 호흡율(이후 RQ로서 칭함)이다. RQ는 이산화탄소량 대 산소량의 비율을 의미하며 다음 식으로 표시한다. 즉, RQ는 다음 식으로 측정할 수 있다.

RQ= △CO₂/ △O₂(1)

RQ=Q· △CO₂/Q· △O₂(2)

RQ=(△CO₂/Cell)/(△O₂Cell) (3)

상기 식에서 △O₂는 공급 가스중의 산소량과 배기가스중의 산소량과의 차이이고, △CO₂는 공급 가스중의 이산화탄소량과 배기가스중의 이산화탄소량과의 차이이고, Q는 총 가스의 양이고, Cell은 세포의 양이다.

각 식중 △O₂및 △CO₂는 상기한 데이터에 의거한 파라메터이다. 공급 가스 중 각 성분의 농도를 미리 알게되면, 이 값으로 배기가스 중의 각 성분의 농도를 측정할 수 있다. 이 비율은 RQ로 한정되지 않으며 다음과 같이 변경할 수 있다. 예를 들면 RQ^-1, RQ XA(A는 상수임), RQ÷B(B는 상수임), △CO₂/(△CO₂+ △O₂), △O₂/( △O₂+ △CO₂), (△CO₂SB)/(△O₂XB) 및 (△CO₂+ A)/(△O₂+ B)를 본 발명에 적용할 수 있다.

기질 및/또는 유도물질은 RQ의 상승 개시에서부터 RQ의 상승 종료직후까지의 사이에 첨가하는 것이 바람직하다. RQ의 두 번째의 피크는 통상적으로 대사물 생산의 종료 판정의 기준이 될 수 있으며, 이 시점에서 배양을 종료하는 것이 바람직하다.

본 발명의 장치는 배양탱크, 배양탱크에 개구된 가스 공급관, 가스 배출관, 기질 공급관 ,가스 공급관을 통과하는 가스의 양을 측정하는 제1의 가스량을 측정하는, 제1의 가스량 측정기, 제1의 산소분석기, 배양탱크 상부로부터 가스 배출관에 이르기까지 통과하는 가스의 양을 측정하는 제2의 가스량 측정기, 제2의 산소분석기, 이산화탄소 분석기와 각 측정기 및 분석기로부터 검출신호를 입력하고 기질 공급관으로부터 배양탱크 까지에 이르는관로의 개폐제어 및/또는 공급제어 신호를 출력하는 컴퓨터로 구성되어 있다.

상기한 기구 이외에 본 발명의 장치에는 가스공급관상에 제1의 산소 분석기와 함께 이산화탄소 분석기를 설치하거나 또는 기질 첨가 탱크 외에 유도물질 첨가탱크를 설치하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다. 이 경우, 이산화탄소 분석기의 출력신호는 다른 측정기 및 분석기의 출력신호와 함께 컴퓨터로 송신해야 한다.

이와 달리 공급가스의 조성, 예를 들면 산소 및 이산화탄소의 농도가 미리 판명된 경우(예를 들면 산소가스통을 사용한 경우)공급 가스의 가스 분석기는 불필요하며, 따라서 이들 분석기로부터의 검출신호를 컴퓨터에 입력하는 것도 필요하지 않게 된다. 이와 같은 경우도 본 발명의 범위에 포함된다. 온-라인 공정의 견지에서 상술한 바와 같이 컴퓨터의 출력에 의거하여 기질 및 유도물질을 첨가하는것이 바람직하다. 이 경우 각 탱크 또는 각 탱크로부터 배양탱크에 이르는관로 상에 설치한 펌프 및/또는 밸브를 통해 이들 물질을 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제1의 실시태양으로서, 유전자 재조합 균으로 β-갈락토시다제(β-＞gal)를 생산하는 배양방법을 이하에 기술하였다.

최근에 이르러 숙주 미생물의 백터 플라스미드로 유효 물질을 생산하는 유전 정보를 가진 유전자를 집어넣은 복합 플라스미드를 보유하는 숙주 미생물을 이용하여 유효물질을 대량으로 생산시키는 유전자 재조합 기술이 발전되고 있다. 이들 기술에 의해 이미 인터페론, 인슈린 및 유사물질이 생산되고 있으며, 숙주 미생물로서는 대장균이 사용되고 있다.

그러나, 목적하는 유전자를 가진 유전자 재조합 균을 사용하여 목적하는 생산물을 공업적 규모로 대량 생산하는 방법은 아직 개발되어 있지 않기 때문에 유전자 재조합균을 효율적으로 배양하는 방법을 개발하는 것이 시급히 요청되고 있다.

본 실시태양에서는 목적하는 유전자, 벡터 및 프로모터로 이루어진 복합 플라스미드를 세포 내에 보유하고, 상기 유전자 발현을 유도할 수 있는 미생물을 배양하여 목적하는 유전자를 발현시켜 생산물을 대량으로 수집하는데 있어서 배양 중 RQ가 급상승하는 시점에서 기질과 유도 물질을 동시에 첨가한다.

목적하는 유전자의 발현을 위한 프로모터로서는 trp(트립토판)프로모터, lac 프로모터(Nature 281, p. 544-148, 1979), tac 프로모터(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, P,21-25, 1983) 등을 사용할 수 있다.

trp 프로모터 및 β-갈락토시다제유전자의 결찰에 의해 수득되는 복합 플라스미드로서는 제1도에 표시한 바와 같은 구조를 가진 복합 플라스미드 pTREZ1을 사용할 수 있다. 복합 플라스미드 pTREZ1은 플라스미드 pTRE1 및 pMC1403으로부터 수득할 수 있다.

trp 프로모터를 함유하는 복합 플라스미드 pTRE1은 대장균의 trp오페론의 프로모터, trpL(리더 펩타이드) 및 TrpE(안트라닐레이트 합성효소)의 말단의 일부를 함유하는 약 500bp(base pairs)의 DNA 단편을 플라스미드 pBR322(Gene, 29, p41-49, 1984)의 EcoRI 부위에 삽입함으로써 얻어진다. trp 프로모터의 방향은 pBR322의 Tcr(테트라사이클린 내성유전자)의 방향이다. trp 프로모터의 상류측 상의 EcoRI 부위는 DNA 폴리머라제I으로 채워서 불활성화하여 프로모터의 하류의 EcoRI 부위만이 작용하도록 한다. 제2도는 trp 프로모터 하류 부위의 기본 서열을 나타낸 것이다. trpE 폴리펩타이드 유전자내의 EcoRI 부위에 이 유전자(foreign gene)를 연결함으로써 trpE 폴리펩타이드의 N-말단 부위의 8아미노산과 융합된 형태로 이 유전자를 발현시킬 수 있다.

한편, β-갈락토시다제유전자로서, 플라스미드 pMC403(J.Bacteriol, 143, p971-980, 1980)을 사용할 수 있다. 플라스미드 pMC1403은 6.2kb(kilobase pairs)의 β-갈락토시다제유전자(lac'Z +lacY)를 EcoRI 부위와 pBR322의 sall 부위사이에 삽입함으로써 얻어진다.

제3도는 플라스미드 pTREZ1을 형성시키는 방법을 나타낸 도면이며, 여기에서는 β-갈락토시다제유전자를 trp 프로모터의 하류에서 연결시킨다. 10.21kb의 복합 플라스미드 pTREZ1은 플라스미드 pTRE1에서 절단된 TRP 프로모터와 플라스미드 pMC1403에서 절단된 6.2kb의 β-갈락토시다제유전자를 함유하는 4.21kb의 DNA단편을 T₄DNA 리가제로 결찰시킴으로써 형성시킬 수 있다.

목적하는 유전자, 백터 및 프로모터로 이루어진 하이브리드 플라스미드를 세포 내에 함유하고 목적한 유전자의 발현능을 가진 미생물로서 각종의 대장균(예, M182, HB101, C600, X1776, DH1등)을 사용할 수 있다. 이들 중, 염색체상의 β-갈락토시다제유전자 결손균주인 대장균 M182주(1984년 5월 30일자로 FERMP-7650으로서 FRI에 기탁되고, 한국종균협회에 1986년 9월 17일 기탁번호 KFCC-10272)로 기탁되었음)로 상기한 구조를 가진 복합 플라스미드 pTERZ1을 도입하여 얻는 β-갈락토시다제를 생산하는 유전자 재조합균과 복합 플라스미드 pTREZ1을 대장균 HB101주(1985년 3월 9일자로 FERM p8136으로서 FRI.에 기탁하였고 한국종균협회에 1986년 9월 17일 기탁번호 KFCC-10271로 재기탁하였음)로 도입하여 얻는 β-갈락토시다제를 생산하는 유전자 재조합균은 trp 프로모터의 제어 하에 이루어지며, 프로모터의 기능을 효율적으로 이용함으로써 공지된 방법에서 보다 매우 대량으로 β-갈락토시다제를 생산할 수 있다.

적합한 프로모터를 사용하고 목적하는 유전자를 프로모터에 도입하는 경우에는 숙주 미생물로서 효모, 바실루스 서브틸리스(Bacillus Sabtilis)등과 같은 대장균이 아닌 다른 미생물을 사용할 수도 있다.

본 실시예에 따라, 목적하는 유전자를 발현시키기 위해 목적하는 유전자, 벡터로 이루어진 복합 플라스미드를 함유하며 목적하는 유전자를 발현하는 미생물, 예를 들면 β갈락토시다제를 생산하는 미생물을 사용함으로써 β-갈락토시다제와 같은 생산물을 매우 효율적으로 생산할 수 있다. 유전자 재조합균의 배양을 제어하기 위해서는 재조합균을 배양용 배지에 도입하고 기질 및/또는 유도물질을 배지에 첨가한다.

유도물질로서는 trp 프로모터용으로 3-β-인돌일아크릴산(IA) 및 lac 프로모터 및 tac 프로모터용으로 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)등을 사용할 수 있다.

기질로서는 아미노산의 혼합물인 카스아미노산, 글루코스, 트립토판을 제외한 아미노산, 효모 추출물 및 이들 혼합물을 사용할 수 있으며, 이들 중 카스아미노산을 사용하는 것이 바람직하다.

trp 프로모터를 가진 복합 플라스미드는 배양 중에 IA를 첨가함으로써 유전자가 발현되는 것으로 알려져 있다(Nature, 291, p.503-506, 1983), 이것은 유전자의 전사를 억제하는 억제체가 IA에 의해 불활성화 되어 RNA 폴리머라제에 의한 mPNA의 합성이 개시되는데 기인한다.

본 발명자들은 β-gal을 생산하는 유전자 재조합균을 사용하여 β-gal을 효율적으로 생산시키기 위한 배양 제어방법을 여러 가지로 검토하여 β-gal을 대량으로 생산하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

유도물질 IA를 첨가하면 trp 프로모터가 작용하기 시작하는데, 유도물질의 첨가 시기를 결정하는 것은 목적하는 유전자 생산물의 생산에 있어서 대단히 중요하다. IA를 첨가하는 시기로서 배양개시 1시간째에 첨가하는 방법(Nature, Vol 291, p.503-506, 1981참조)과 미생물 농도를 지표로서 사용하는 방법(일본국 공개 특허공보 제141796/83호 참조)이 있다. 그러나, 이들 방법은 모두 공업적인 배양에는 부적합하다.

본 발명자들은 이들 방법에 있어서 균체의 생리학적 상태에 적합한 IA의 첨가에 대해 검토한 결과, 배양중의 RQ의 변화가 균체증식과 β-gal의 생산에 밀접하게관련되어 있음을 발견하였다. 여기에서 사용된 RQ는 균체에 의해 생성된 CO₂양을 소비된 O₂양으로 나눈 값을 말한다. 제4도에서 보는 바와 같이, RQ는 균체가 증식하는 동안 대략 1몰/몰로 일정하게 유지된다. 균체 농도가 최고치에 달하는 배양 개시 후 6.5시간째에는 RQ가 급격히 상승하며 대략 1.25몰/몰이된다. 이 시점에서 기질인 글루코스가 소비된다. 배양개시 후 8.5시간째에 유도물질인 IA 15μg/ml와 β-gal 생산에서 기질로 사용하는 카스아미노산 2.5mg/ml를 동시에 첨가한 결과, 생산된 β-gal의 양은 4.5U/ml에서 배양개시후 18시간째에는 12.3U/ml까지 상승하였다. IA 및 카스아미노산을 첨가하면, RQ는 다시 대략 1몰/몰로 되는데 이것은 균체의 증식이 거의 없음을 나타내는 것이며, 이러한 결과로서 β-gal이 생산되어 균체 내에 축적되어 있음을 알 수 있다. RQ의 급격한 상승은 배양개시후 16.5시간째에 나타났다. 균체에 의한 β-gal의 생산은 이 시점에서 종결되는 것으로 본다.

따라서, RQ는 균체의 증식동안 1몰/몰로 일정하게 유지되고 균체의 증식이 종결되면 1몰/몰 이상으로 급격히 상승하며, 이 시점에서 유도 물질과 기질을 첨가하면 균체는 대사물인 β-gal을 생산하며 이때의 RQ는 1몰/몰로 되고 β-gal의 생산이 종료된 후에는 다시 급격하게 상승한다는 것이 밝혀졌다. 그러므로 RQ를 지표로서 배양을 제어함으로써 대사물의 효율적인 대량생산을 이룩할 수 있다.

이에 비해, 일본 국 공개 특허공보 제125685/1977호에 기술된 바와 같은 RQ를 지표로서 배양을 제어하는 선행기술은 공급배양에 있어서 기질의 공급이 과잉이 되면 부산물로서 에탄올이 형성되어 균체의 증식에 바람직하지 못한 영향을 줌으로써 균체의 수율이 감소되는 등의 단점을 지니고 있다. 이 경우, RQ치가 1몰/몰보다 높아지기 때문에 이것에 의해 에탄올의 형성을 검지하여 기질의 공급을 감소하거나 중지시켜야 한다. 이 경우, RQ의 변화가 본 발명에서와는 달리 에탄올의 형성에관련을 갖는다. 그러나, 본 실시태양에서의 RQ의 변화는 균체의 증식과 대사물의 생산에관련이 되며, 빵 효모를 배양하는 경우와는 반대로 RQ의 증가시에 기질을 공급한다. 본 실시태양에서는 균체에 의해 대사물을 생산하기 위해 배양하는 동안의 RQ의 변화가 빵 효모의 배양동안의 RQ의 변화와 전혀 다르다는 새로운 사실을 발견한 것에 근거하여 미생물 또는 유사균체에 의해 대사물을 효율적으로 생산시킨다.

본 실시태양에 있어서, 글루코스 및 카스아미노산을 RQ의 증가에 의해 균체의 증식이 정지된 시점에서 첨가함으로써 다시 균체의 증식을 유도하고 높은 균체 농도에서 배양을 계속한 후 유도물질과 기질을 첨가할 수 있다. 또 유도물질과 기질을 첨가한 후 RQ의 상승 시에 재차 유도물질과 카스아미노산과 같은 기질을 첨가함으로써 균체 내에 다량의 대사물을 생산시킬 수도 있다.

유전자 재조합균이 trp 프로모터, 예를 들면 lac(lactose) 프로모터가 아닌 발현 벡터의 프로모터를 보유하는 경우, 유도물질로서 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 사용한다. 유전자 재조합균 이외의 미생물 또는 동식물 세포에 의한 대사물의 생산은 다른 기질과 유도물질을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제어할 수 있다.

제5도는 본 실시예에서 필요한 장치의 일례를 나타낸 것이다. 배양탱크(1)내에 배지 및 종균을 넣고 도관(7)을 통해 배양탱크(1)내에 공기를 주입하고 교반기(2)로 배양액을 교반하면서 유전자 재조합균을 배양시킨다. 이 기간동안 입구가스의 산소량은 도관(7)에 각기 장치된 가스측정기(5)와 산소분석기(6)로부터 얻어진 데이터에 근거하여, 컴퓨터(4)로 측정하는 반면, 출구가스의 산소 및 이산화탄소의 양은 도관(13)에 각기 장치된 가스측정기(10), 산소분석기(11) 및 이산화탄소 분석기(12)로부터 얻어진 데이터에 근거하여 컴퓨터(4)로 유사하게 측정하여 이들 값으로부터 RQ를 구한다. RQ가 급격히 상승하면 제어 컴퓨터(4)로부터의 신호가 기질공급 펌프(8)를 작동시켜서, IA 및 카스아미노산을 도관(9)을 통해 기질 탱크(3)로부터 배양탱크(1)로 공급한다. RQ가 재차 급상승하면 배양을 종료시키고 배양액으로부터 균체를 회수하여 분쇄하고 균체 내에 축적된 β-gal을 분쇄하고 정제한다.

공급가스가 공기가 아니고 순수한 산소인 경우, 산소분석기(6)는 필요하지 않으나, 이산화탄소를 함유한 가스인 경우에는 이산화 분석기를 사용하는 것이 바람직하다.

산소분석기로서 격막식 산소센서 및 덤벨형 자기분석기를, 이산화탄소 분석기로서 적외선 흡수 분석기를, 유출측정기로서 열 질량 유출측정기를 각기 사용할 수 있다.

바람직한 기질의 예를 들면 글루코스, 카스아미노산 및 이의 혼합물이다.

기질(영양물질)과 유도물질을 병용할 경우에는 이들 물질을 동시에 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제2의 실시태양은 스트랩토마이신(는) 발효와 유사한 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에 의한 대사물로서 항생물질을 생산하는 방법에관한 것이다. SM 발효동안에 첨가하는 기질에 대해 검토한 결과, 글루코스가 유효함이 판명되었다. 이어서 배양 플라스크를 사용하여 글루코스를 공급하는 적합한 시기에 대해서도 검토하였다. 그 결과는 다음 표 1과 같다.

[표 1]

배양 1일째, 2일째, 5일째에 글루코스가 10g/ℓ 증가하도록 첨가하였으나, 각 경우 그다지 큰 효과는 나타나지 않았다.

SM 생산량이 최대에 도달한 후, 글루코스를 첨가하는 것이 효과적일 수 있다는 추정 하에 배양 2.5일째에 글루코스가 5, 10 및 20g/ℓ증가하도록 첨가하였다. 이 결과를 표 2와 같다.

[표 2]

표 2에서 보는 바와 같이, 배양 2.5일째에 글루코스가 10g/ℓ증가하도록 첨가하는 경우 SM 생산량은 1.5배로 증가함을 알 수 있다.

제6도(a) 내지(c) 및 제7도(a) 내지 (d)는 글루코스의 첨가시기를 검토하기 위해 50ℓ 배양탱크를 가진 자동제어 배양장치를 사용하여 SM 발효를 수행한 결과를 나타낸 것이다. SM 생산량이 피크에 달한 배양 2일째에 산소 소비속도와 이산화탄소 발효속도의 급격한 저하가 나타났다.

이 시점에서의 글루코스 농도는 10g/ℓ이며, 초기의 글루코스 양이 약 50%가 잔류한 것을 알 수 있다. 그럼에도 불구하고 이와같은 현상이 일어나는 것은 SM-생산균의 물질대사가 SM 생산으로부터 다른 방향으로 변화되기 때문인 것으로 생각된다. 산소 소비속도와 이산화탄소 생성속도가 이와 같이 급격하게 변화되는 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀진 것이다. 이러한 변화를 지표로 하여 글루코스를 공급함으로써 SM 생산량의 증대를 가져오게 되었다.

산소 소비속도는 공급 가스중의 산소량(몰/시간)에서 배출가스중의 산소량(몰/시간)을 뺀 값으로 구하여, 이산화탄소 생성속도는 배기가스중의 이산화탄소량(몰/시간)에서 공급가스중의 이산화탄소량(몰/시간)을 뺀 값으로 구한다. 공급가스의 양이 일정한 경우는 배출가스중의 산소 및 이산화탄소의 농도 변화를 지표로서 이용할 수 있다. 글루코스에 유사한 기질로서 프럭토스와 같은 당 및 아미노산을 사용할 수 있다.

본 실시예를 수행하는데 있어서, 사용할 기질과 배양시킬 균주 또는 세포를 미리 정하여 예비 배양 실험을 하여 특정한 조합 조건하에 산소 소비속도 및/또는 이산화탄소 생성속도가 급격히 변화하는 시점을 구하고 이 예비 실험 결과에 기초하여 실제의 첨가시점을 결정할 수 있다.

상기 실시태양에 상응하는 구체적 실시예를 이하에 기술한다.

[실시예 1]

균주 : 복합 플라스미드 pTERZ1을 보유한 E Ciol HB101 주. 이 균주는 대장균 K-12주에서 유래된 것으로 유전자 재조합에 있어서 전형적인 숙주로서 공지되어 있다. 유전자형은 F^-(F인자 무), hsd S20(r^- _B, m^- _B), rec A 13 ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(Sm^r), xyl-5, mtl-1, supE44 및 λ^-(λ파지무)이다.

배지 : M9-카스아미노산 배지(pH7.0)이며, 조성은 NH₄CL 1g, Na₂HPO₄6g, KH₂PO₄3g, NaCl 5g, MgSO₄·7H₂O 0.1g, CaCl₂·2H₂O 15mg, 글루코스 5g, 카스아미노산 2.5g, 티아민 0.1g, 프롤린 0.1g 및 증류수 1ℓ이다. 복합 플라스미드를 보유하는 대장균만을 증식시키기 위해 암피실린(AP) 50㎍/ml를 이 배지에 추가한다.

배양조건 : 복합 플라스미드를 보유하는 대장균[E.Coli HB 101(pTREZl),FERM p-8136, (KFCC-10271)]을 500ml의 M9-카스아미노산 배지를 넣은 8개의 500ml들이 진탕 플라스크에 접종하고 진탕기로 진폭 7cm, 진탕회수 115회/분으로 진탕시키면서 37℃에서 하룻밤 배양시킨다. 배양세포를 종균으로서 100ml를 취하여 M9-카스아미노산 배지 2ℓ를 넣은 4개의 5ℓ들이 발효 병에 접종하고 배양시키는데, 소포제로서 레오콘 1750 W(The Lion Co., Ltd 제품) 2적을 첨가한다. 배양은 온도 37℃, pH7.0, 교반기 회전수 600rpm, 통기속도 2ℓ/분에서 하룻밤 수행된다. 이 배양액 8ℓ를 50ℓ들이 자동제어 배양장치에 접종하고 총 용적이 30ℓ가 되도록 M-9카스아미노산 배지를 가한다. 상기한 바와 같은 소포 제를 가하고 온도 37℃ , pH7.0, 통기속도 6ℓ/분, 용존산소농도 3mg/ℓ, 교반기 회전수 150 내지 400rpm에서 배양시킨다.

결과 : 제6도에서 보는 바와 같이, RQ는 배양 개시 후 대략 4시간째에 급격히 상승하였기 때문에 IA는 15㎍/ml을, 카스아미노산은 2.5mg/ml을 첨가하였다. RQ가 상승되면 균체 농도는 2.66g/ℓ이고 β-gal의 양은 4.3U/ml이었다. 배양개시후 13시간째에 RQ가 다시 상승하였으며, 이 시점에서의 균체농도는 2.66g/ℓ이고 β-gal의 양을 8.3U/ml이었다. 따라서, 균체 농도는 거의 증가되지 않은데 비해 β-gal은 거의 두배로 증가하였다.

이상의 결과에서 RQ를 지표로 하여 IA 및 카스아미노산을 첨가함으로써 β-gal의 수율을 크게 향상시킬 수 있다는 것이 명백히 드러났다. 배양의 종료는 RQ가 제2의 피크에 달한 후 종결하는 것이 좋다. 복합 플라스미드 pTREZ1을 보유하는 균주로서 E.Coli M182를 사용할 수도 있다. 이 균주도 대장균 K-12주에서 유래되며 염색체상의 β-gal 유전자가 없다. 이 유전자형은 △(lac IPOZY) X 74, galk, galU, Str A로 표시되고, 또한 사용할 수 있다. 이 경우, 상기한 대장균 대신에 복합 플라스미드를 보유하는 대장균[E.Coli M182(pTREZ1), 1984년 5월 30일자로 FERM p-7650으로서 FRI에 기탁되고, 1986년 9월 17일 한국종균협회에 기탁번호 KFCC-10272호로 재기탁되었음]을 사용하는 것 이외는 배지 및 배양조건은 상기에서와 동일하다.

[실시예 2]

균주 : 스트렙토마이세스 그리세우스 HUT 2247(Streptomyces griseus HUT 2247)

배지조성 : 글로코스 25g, (NH₄)₂SO₄2g, KH₂PO₄0.4g, Nacl 1g, K₂SO₄6g, MgSO₄·7H₂O 0.2g, FeSo₄·7H₂O 0.01g, ZnSO₄·7H₂O 0.05g, L-아스파라긴 7g, CaCO₃2g 및 증류수 1ℓ(pH7.0).

배양조건 : 50ℓ들이 배양탱크에 배치 30ℓ를 넣고 미리 48시간 동안 진탕 배양시킨 종균 600ml를 첨가한다. 배양은 온도 28℃, pH 6.7, 입구 가스량 8ℓ/분으로 일정하게 유지시키면서 수행하는데, 교반기 회전수를 140내지 245rpm을 변화시켜 용존 산소농도를 약 4.5mg/ℓ이상으로 제어한다.

결과 : 제7도에서 보는 바와 같이, RQ는 배양 초기에는 0.5몰/몰이었으나, 1일째 후반에서부터 상승하기 시작하여 2.2일째에는 최대치에 달하였기 때문에 기질로서 글루코스(300g/ℓ)를 1ℓ첨가하였다. 이 시점에서 균체 농도는 최대치에 달하였으나, 글루코스는 11.5g/ℓ이 잔류하였다. 이때 스트렙토마이신의 생산량은 155mg/ℓ이었으나, 그 글루코스를 첨가한 후 4일간의 배양에서 265mg/ℓ(예, 전자에서보다 1.7배 높다)이었다. 배양 4일째 후에는 RQ가 용균으로 인해 저하되는데, 이것은 배지중의 글루코스가 소비된 시기와 거의 일치한다.

이와 같이, 스트렙토마이신 발효에 있어서도 RQ를 지표로 하여 효율적으로 제어할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 세포배양에 의해 대사물을 공업적으로 효율적인 생산을 하는데 효과가 있다.

Claims (16)

1. 세포를 호기 적으로 배양하여 대사물을 생산하는 배양제어 방법에 있어서, 세포배양에 의해 배출되는 이산화탄소의 양에 의거한 제1의 파라메터를 검출하는 단계, 세포배양에 의해 소비되는 산소의 양에 의거한 제2의 파라메터를 검출하는 단계, 상기 제1 파라메터와 제2의 파라메터의 비율을 구하는 단계 및 상기 비율의 변화를 지표로 하여 배양을 제어하는 단계로 이루어지고, 배양을 제어하는 단계는 배양액에 기질을 첨가하는 공정, 균체 증식의 종점을 판정하는 공정, 배양을 종료하는 공정, 대사물 생산의 종료를 판정하는 공정과 기질의 첨가와 배양의 종료를 제어하는 공정중 하나 이상의 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
2. 제1항에 있어서, 비율이 호흡상(균체에 의해 생성된 CO₂량/균체에 의해 소비된 O₂량)인 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
3. 제1항에 있어서, 세포가 미생물 세포인 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
4. 제2항에 있어서, 기질을 첨가하는 공정에서, 유도물질을 기질과 함께 Q배양액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
5. 제2항에 있어서, 기질을 첨가하는 공정에서, 기질을 호흡상의 상승 개시로부터 저하될 때까지의 기간에 첨가하는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
6. 제4항에 있어서, 기질 및 유도물질을 호흡상의 상승개시로부터 저하될때까지의 기간에 첨가하는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
7. 제1항에 있어서, 배양제어단계가 배양액에 유도물질을 기질과 함께 첨가하는 공정과 균체 증식의 종점을 특징으로 하는 배양제어방법.
8. 제2항에 있어서, 배양제어단계가 배양액에 기질과 유도물질을 호흡상의 상승 개시로부터 저하직후까지의 기간에 첨가하는 공정과 균체증식의 종점을 판정하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
9. 제2항에 있어서, 배양제어단계가 배양액에 유도물질을 기질과 함께 첨가하는 공정과 배양의 종료를 제어하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
10. 제2항에 있어서, 배양제어단계가 기질 및 유도 물질 중 일종 이상을 첨가하는 공정가 배양의 종료를 제어하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
11. 제3항에 있어서, 미생물 세포가 유전자 재조합균 세포인 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
12. 제9항에 있어서, 제1의 파라메터 검출단계 및 제2의 파라메터 검출단계와 기질의 첨가 및 배야의 종료를 제어하는 단계를 온-라인으로 수행하는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
13. 세포를 호기적으로 배양하여 대사물을 생산하는 배양제어방법에 있어서, 세포배양에 의해 배출되는 이산화탄소의 양을 검출하고, 세포배양에 의해 소비되는 산소의 양을 검출하여 검출된 이산화탄소 및 산소의 양으로부터 호흡상을 구하고, 호흡상의 제1의 급상승에서부터 제1의 급상승 종료 직후까지의 기간에 적어도 기질 및 유도물질을 공급하는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
14. 제13항에 있어서, 호흡상의 제1의 급상승 기간 후에 발생되는 제2의 급상승을 검출하고 이에 의거하여 배양을 종료하는 것을 특징으로 하는 배양제어방법.
15. 제13항에 있어서, 이산화탄소를 검출하는 단계와 산소를 검출하는 단계에 있어서 세포배양을 수행하는 배양탱크로 도입된 가스중 이산화탄소 및 산소농도와 유출속도를 검출하는 단계와 배양탱크로부터 배출되는 가스 중 산소 및 이산화탄소의 농도 및 유출속도를 검출하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 배양 제어방법.
16. 배양탱크(1), 배양탱크(1)에 개구된 가스 공급관(7), 가스 배출관(13), 기질탱크(3), 기질공급펌프(8), 기질 공급관(9), 가스 공급관(7)을 통과하는 가스를 검출하는 제1의 가스량 측정기(5) 및 제1의 산소 분석기(6), 배양탱크(1) 상부의 가스 영역 내지 가스 배출관(13)을 통과하는 가스를 검출하는 제2의 가스량 측정기(10), 제2의 산소분석기 (11) 및 제2의 이산화탄소분석기(12), 각 측정기 및 분석기로부터의 검출신호를 입력하여 기질 공급관(9)으로부터 배양탱크(1)에로의관로의 개폐 및/또는 공급제어를 하는 제어신호를 출력하는 컴퓨터(4)를 구비한 것을 특징으로 하는 배양제어장치.

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