KR910002958B1 - 췌장의 알파-아밀라제를 정량하는 방법 및 시약 - Google Patents
췌장의 알파-아밀라제를 정량하는 방법 및 시약 Download PDFInfo
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Abstract
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Description
제1도는 MAK 최종 농도에 대한 아밀라제의 잔여 활성을 도시한 것이다.
본 발명은 타액의 알파-아밀라제(h-SA) 존재하에 췌장의 알파-아밀라제(h-PA)를 특이적으로 정량하는 방법 및 시약에 관한 것이다.
알파-아밀라제(E.C.3.2.1.1)는 1,4-알파-클루코시드 결합의 불규칙적인 가수분해에 의해 1,4-d-글루코시드 결합된 올리고- 및 다당류를 절단하여 맥아당 및 맥아-올리고 당류로 분해한다. 본 효소는 발효산업뿐만 아니라 임상 분석 및 진단영역에 상당히 중요하다. 그러므로 다수의 질병의 경우에, 혈청, 소변 또는 십이지장 분비물 같은 체액 내의 알파-아밀라제 함량은 상당히 변화한다. 그러나, 체내에, 대체적으로 두가지의 알파-아밀라제, 즉 췌장의 효소 및 타액의 효소가 존재한다. 췌장의 효소만이 진단에 중요하기 때문에 드물게 소량으로 존재하는 이소효소중에서 두 알파-아밀라제를 분석적으로 분리하는 문제가 생긴다. 이때 어려운 점은 두 복합 형태가 구조적으로 유사하고 면역학적으로 동일하다는 것이다(K.Lorentz, Laboratoriumsblatter,32, 118/1982). 타액 효소의 활성을 제거하기 위해, 음이온 교환 수지 상의 흡착, 소맥 단백질 또는 전기영동 또는 등전집속법에 의한 저지를 사용하는 것이 공지되어 있다. 그러나 이 방법들은 분리효과가 불충분하거나 또는 정상적인 진단이 곤란하다. 상기된 방법중에서, Clin. Chem.2817, 1525-l527/1982에 기재된 맥아에서 얻은 저지제로 타액의 효소를 저지하는 방법만이 정상적인 진단에 허용가능한 시간이 들지만 선택성은 만족스럽지 못하다 부가적으로, 최적 저지 농도의 경우에, 타액효소 활성도의 약 13%가 유지되며 반면에 췌장의 요소 활성도는 약 81%까지 감소한다.
유럽 특허 출원 제84 114 l72.4호에는 타액의 알파-아밀라제와 반응하여 췌장의 알파-아밀라제와의 혼합 반응성이 5% 또는 그 이하인, 단일 크론 항체(monoclonal antibody) 존재하에 작업하여, 타액의 알파-아밀라제의 존재하에 췌장의 알파-아밀라제를 정량하는 방법이 이미 제안되어 있다. 이 단일 크론 항체군과 함께 침전제를 부가하는 경우에, 타액의 알파-아밀라제와 불용성 착물을 형성케하고 이를 용액으로부터 분리시켜 췌장의 효소만이 남아있도록 한후 이를 정량하는 것이 가능하다. 또한 고정된 형태의 단일크론 항체를 사용하여 타액의 아밀라제를 분리하는 것이 가능하다. 그러나 두 경우에, 불용성 상을 형성하여 용해성 상으로부터 분리하는 것이 필요하다.
또한 DE A-1 35 00526.2에 상기된 유럽 특허 출원의 결합 단일 크론 항체 대신에, 타액의 이소효소를 특이적으로 저지하는 단일 크론 항체가 사용된다. 상 분리 작업없이 알파-아밀라제 이소효소의 정량이 개량되었지만, 타액 효소에 의한 최대 저지는 97% 이하여서, 바람직스럽지 못하게 정량의 부정확함이 있다.
그러므로 이러한 단점을 극복하고 체액내에서 알파-아밀라제 존재하에 췌장의 알파-아밀라제의 빠르고 단순하며 더 정확한 정량을 가능하게 하는 방법 및 시약을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명에 따라, 저지제로서 10% 이하로 효소를 저지하는 제2의 항-타액 알파-아밀라제 단일 크론 항체와 조합하여, 타액 효소를 97% 이하로 특이적으로 저지하는 제1의 단일 크론 항체를 사용하여, 타액의 알파-아밀라제를 저지하는 단일 크론 항체의 존재하에 알파-아밀라제를 검출하기 위한 시스템과 반응시킴에 의해, 특히 혈청, 혈장, 십이지장액 또는 소변 같은 체액내의 타액 알파-아밀라제 존재하에 췌장의 알파-아밀라제를 정량하는 방법이 제공된다.
저지 ＜93%의 저지하는 항체는 제1의 단일 크론 항체로서 그리고 타액 효소의 저지 ＜5%의 결합하는항체는 제2의 단일 크론 항체로서 본 발명에 바람직하다. 본 발명에 따르는 조합에서 97% 이상의 저지를 얻기 위해 저지의 하한선은 약 70%, 바람직하게 80%로서 간주될 것이다.
타액의 효소를 만족할 정도로 완전하게 저지하지 못하는 단일 크론 항체의 저지 작용이 단지 결합하지만 실제적이 아니거나 또는 완전 불충분하게 저지하는 항체에 의해 상승작용이 강화되고, 타액 효소의 정량적인 저지가 췌장 효소 활성의 100%가 유지되는 경우에 얻어진다는 눌라운 발견에 본 발명의 방법이 기초한다. 또한, 배양 시간이 실제적으로 감소된다.
제1의 단일 크론 항체로서 NCACC에(99D12) 84122003호 및 (89E2) 84122004호(National Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, GB)로 기탁된 세로 배양물로부터 얻은 항체가 본 발명의 방법에 바람직하게 사용된다. 제2의 단일 크론 항체로서, NACC에 84111301호 및 84111302호로 기탁된 세로배양물의 (EU-Al 84 114 l72.4에 기재) 결합하는 항체가 바람직하게 사용되는데, NCACC 84111301호가 특히 바람직하다.
일정 항체 제제에 특히 필요한 제1의 항체 및 제2의 항체의 양은 예비 실험에 의해 용이하게 알아낼 수있다. 최소한 5㎍/㎖ 및 바람직하게 최소한 20㎍/㎖ 제1의 단일 크론 항체 및 최소한 1㎍/㎖ 및 바람직하게 최소한 5㎍/㎖ 제2의 단일 크론 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 사용 가능한 단일 크론 항체는 실험 동물을 천연의 또는 변성된 타액의 알파-아밀라제로 면역하고, 면역된 동물에서 얻은 B-임파구를 변형제(transfonning agents)와 융합하고, 단일 크론 항체를 생성하는 혼합 세포를 클로닝(cloning) 및 배양하고 이로부터 분리함에 의해 얻어질 수 있다. 타액의 알파-아밀라제 항제 제조에 특히 바람직한 동물은 쥐 및 새앙쥐이다. 사람의 천연 타액의 알파-아밀라제 또는 변성된 타액의 아밀라제로 면역한다. 이 목적에 천연 효소를 사용한다면, 전기영동으로 균질하게 제조한 시판 조제를 이용할 수 있다. 화학적으로 변성된 타액의 알파-아밀라제는 DE-AS 제 25 43 994호에 기술된 바와 같이, 공지의 효소 변성 방법에 따라 얻을 수 있다. 바람직한 변성법은 예를 들면, N-브로모숙신이미드(NBS)에 의한 단백질상의 트립토판균의 산화(BBA, 143, 462-472/1967), 히스티딘에 주로 작용하는 요오도아세테이트(IAA)에 의한 카복시메틸화 또는 테트라니트로메탄(TNM)에 의한 질화(J BiolChem., 238, 3307/1963), 뿐만 아니라, 디아조화된 설프아닐린산에 의한 디아조화(Meth. Enzymol., 25, 515-531/1972)를 포함한다. Balb/c 새앙쥐를 사용하는 경우에 TNM으로 변성된 효소를, 또는 AJ를 새앙쥐를 사용하는 경우에는 천연 효소를 사용하는 것이 적당함이 증명되었다.
천연 또는 변성된 효소, 바람직하게는 보조제와 혼합하여 투여함에 의해 면역하였다. 보조제로서, 보다텔라 퍼투씨스(Bordatella pertussis)와 함께, 수산화 알루미늄을 사용하는 것이 바람직하다. 면역시, AJ 새앙쥐의 천연 타액의 알파-아밀라제, 또는 Balb/c 새앙쥐의 TNM-변성된 타액의 알파-아밀라제가 사용된다면, 최저 7의 면역(복강내 주사)으로 최소한 9개월 동안 면역화가 바람직하게 수행된다.
면역후에, 면역된 동물의 B-임파구를 공지 방법으로 변형제와 융합한다. 본 발명에 사용 가능한 변형제의 예에는 골수종 세포, 변형 비루스, 예를 들어 엡스타인-바(Epstein-Barr) 비루스, 또는 공개된 독일연방공화국 특허 제 32 45 665호에 기재된 시약이 있다. 융합은 Koehler 및 Milstein(Nature, 256 (1975) 495-497)의 공지방법에 따라 수행한다. 결과적으로 형성된 혼성 세포는 예를 들면 시판용 세포 분별제를 사용하는 일반적인 방법으로 크론되고(cloned), 소기의 단일 크론 항체를 형성하는 크론 배양한다. 혼성세포의 암성 증식에 기초하여, 이들은 불특정 시간 동안 배양이 가능하고, 원하는 양의 소기 단일 크론 항체를 얻을 수 있다.
본 발명에 따르는 정량 방법에서, 단일 크론 항체는 그것 자체 또는 동일 면역성을 보이는 그것의 단편(Fab 단편)으로서 사용가능하다 .따라서 "단일 크론 항체"는 단편을 의미함을 이해하여야 할 것이다. 완전한 항체뿐만 아니라 그것의 단편도 부동화된 형태로 사용 가능하다.
그와 같은 알파-아밀라제의 정량은 공지 방법에 따라 수행되어진다. 본 발명에 따르는 단일 크론 항체의 조합은 타액 형태의 알파-아밀라제를 선택적으로 저지하고, 췌장의 효소를 손상함이 없이 효소 활성 측정으로부터 제거되기 때문에, 단일 크론 항체외 존재하에 알파-아밀라제를 정량하는 경우에 얻은 값은 췌장효소에 기인한 활성에 상당한다.
본 발명에 따르는 방법은 분자내에 4 내지 7의 포도당 잔사를 가지는 말토폴리오스(maltopolyose), 맥아당 가인산 분해효소, β-포스포클루코뮤타제, 포도당-6-인산염 탈수소 효소 및 NAD를 포함하는, 알파-아밀라제를 검출하는 시스템(system)으로 바람직하게 행한다.
알파-아밀라제를 검출하기 위하여 본 발명에 사용된 더욱 바람직한 시스템은 분자내에 4 내지 7의 포도당 잔사를 가지는 니토로페닐 말토폴리오스 및 알파-글루코시다제로 구성된다.
더욱 바람직한 알파-아밀라제 검출 시스템은 정량가능한 그룹으로 변성된 전분으로 구성된다 "변성 전분은" 예를 들면 Sweden, Phannazia 제품, "Phadebas" 뿐만 아니라 DE-OS 제28 12 154호에 기재된 생성물 같은 정량 가능한 그룹으로 변성된 전분, 카복시메틸전분 및 한계 덱스트린 같은 분해 특성이 변성된 전분을 포함한다. 이 모든 시스템은 공지되었으므로, 더 상세히 설명할 필요가 없다.
본 발명의 방법을 수행함에 있어, 시험액은 본 발명의 항체와 함께 배양하고 그 후에 재래식 아밀라제 테스트에 직접 사용하거나 또는 기질없는 아밀라제 검출 시약과 항체의 혼합물을 얻고, 배양후에, 기질에 부가하기 시작한다. 배양 시간은 사용된 항체의 활성도에 의존하는데 바람직하게 0.5 내지 10분 특히 바람직하게는 약 5분이다.
타액의 알파-아밀라제의 분리를 원한다면, 단일 크론 항체는 완전한 형태뿐만 아니라 단편 형태로 존재하며 면역 수착지 또는 합성 수지 테스트 튜브 또는 관의 표면과 같은 고체 담체에 고정된 형태로 존재 가능하다. 이러한 방법으로 타액 형의 알파-아밀라제가 고체상 같은 담체에 결합된다
다음의 실험은 본 발명에 의해 얻은 효과를 증명한다.
최대 93%까지 특이적으로 h-SA를 저지히는 단일 크론 항체(MAB)는 재래식 황산 암모늄 침전법 및 DEAE 크로마토그리피에 의해 정제된다. h-SA와 특이적으로 결합하는 MAB도 또한 정제된다. 용액내의 단일 크론 항체 또는 항체는 먼저 인간의 아밀라제와 혼합되고 이 혼합물을 주변 온도에서 5분간 배양한다. 그후에 혼합물을 아밀라제 시약에 부가하고 아밀라제 활성을 측정한다. 대조로서, MAB 없이 완충액과 먼저 혼합된 아밀라제가 사용된다. 또한, 단일 크론 항체 또는 항체를 아밀라제 시약의 일부-알파-글루코시다제 용액에 장입한다. 그후에, 아밀라제 용액을 거기에 부가하고, 5분간 배양한다. 반응은 기질-G7PNP(
-니트로페닐말토헵타오시드)로 시작한다. 대조 용액으로 MAB 없는 글루코시다제 용액이 사용된다. 부속된 도면의 제1도는 기질 개시 방법으로 입증된 저지 MAB의 최종 농도의 함수로서 결합하는 MAB가 있고 그리고 없는 h-SA 또는 h-PA의 % 잔여 활성을 나타낸다. 다음 표 1은 혈청 개시 방법(MAB(s)및 아밀라제가 먼저 혼합)의 결과를 나타낸다.
[저지 MAB NCACC 84122003(MAB 1) 또는 84122004(MAB 2) 및/또는 결합 MAB NCACC84111301(MAB 3)에 의한 인간의 타액 및 췌상의 알파-아밀라제의 저지, 혈청 개시 방법, 기질로서 G7PNP,TA=전체 활성, A=MAB(s)로의 활성, Ra=잔여 활성%]
[표 1]
도면 및 표에 의거하여, 특이 h-SA-결합하는 MAB 뿐만 아니라, 저지하는 특히 MAB의 조합으로 저지의 상승작용적 증가가 초래된다는 것을 알 수 있다. 이 효과는 기질과 무관하다. G5PNP(
-니트로페닐말토펜타오시드)같은 단쇄 기질뿐만 아닐, 고분자량 기질(착색된 전분)의 경우에 위와 같은 결과가 발견된다. 또한 기질 eth-G7PNP의 경우에도 효과가 관찰된다. 인간 혈청내의 타액 알파-아밀라제는 또는 두개의 MAB에 의해 상승적으로 저지된다.
본 발명은 또한 알파-아밀라제를 검출하는 시스템 및 타액의 알파-아밀라제에 대한 단일 크론 항체를 포함하고, 혈청, 십이지장액, 혈장 또는 소변등과 같은 체액내의 타액 알파-아밀라제의 존재하에 췌장의알파-아밀라제를 정량하는 시약을 또한 제공하는데, 효소를 10%이하 저지하는 제2의 항-타액의 알파-아밀라제 단일 크론 항체와 조합된 타액 효소를 97%이하 특이적으로 저지하는 제1의 단일 크론 항체를 포함한다.
알파-아밀라제를 검출하는 본 발명의 시약에 포함된 시스템 및 기타 조건에 관련하여 상기 방법이 동등하게 사용된다.
본 발명으로 체액내의 타액 형태(h-SA)의 알파-아밀라제 존재하에 췌장의 알파-아밀라제(h-PA)를 단순하며 빠르고 정확하게 정량하는 것이 가능해서, 임상적 진단의 가능성이 개선된다.
다음의 실시예는 본 발명을 상술하는 것이다 :
[실시예 1]
제1의 MAB(NCACC 84122004) 단독으로 그리고 제2의 MAB(NCACC 8411130l)와 조합하여 인간의 췌장 및 타액의 알파-아밀라제를 저지 : 혈청 개시 방법 :
시약 : 완충액 : 100㎃ PO4 -3, 150㎃ 염화 나토륨, 6% 소의 혈정 알부민(pH 7.1)
아밀라제 시약 : G7PNP(뵈링거 만하임, Cat. No.568589 37℃)
MAB-1 : 완충액내의 제1의 MAB 0.63Ing/㎖
MAB-2 : 완층액내의 제1의 MAB 0.63㎎/㎖ 및 제2의 MAB 0.105㎎/㎖
MAB-3 : 완충액내의 제2의 MAB 0.105㎎/㎖
h-SA : 완충액내의 약 3000u/l(G7PNP)
h-PA : 완충액내의 약 3000u/l(G7/PNP)
실험 : 각 경우에 100㎕ h-SA 또는 h-PA를 100㎕ 완충액 또는 여러 MAB 용액과 혼합하고, 주변 온도에서 5분간 배양한다. 그후에 25㎕ 혼합물을 37℃의 1000㎖ 아밀라제 시약에 부가하고, 지시에 따라 아밀라제의 활성을 결정한다. 잔여 활성은 다음 식으로 계산된다 :
결과 : h-SA의 상응하는 잔여 활성은 제1의 MAB로 8.6%, 제2의 MAB로 96.9% 및 두 MAB로 2.7%이다. h-PA 상웅하는 잔여 활성은 100.1%, 99.6% 및 99.7%이다.
[실시예 2]
제1의 MAB(NCACC 84122003) 및/또는 제 2 의 MAB(NCACC 84111301)로 아밀라제를 저지·혈청 개시법의 변형
시약 : MAB-1 및 MAB-2를 변화시키는 것은 제외하고 실시예 1과 같음.
MAB-1' : 완충액내의 제1의 MAB 0.525㎎/㎖
MAB-2' : 완충액내의 제1의 MAB 0.525㎎/㎖ 및 제2의 MAB 0.105㎎/㎖
실험 : 실시예 1과 같고, 잔여 활성도%로 계산
결과 : h-SA의 잔여 활성은 제1의 MAB로 9.1%, 제2의 MAB로 96.9% 및 두 MAB로 2.5%이다.
h-PA의 상용하는 잔여 활성은 99.9%, 99.6% 및 99.7%이다.
[실시예 3]
제2의 MAB(NCACC84111301)없이 제1의 MAB(NCACC84122004)로 인간의 타액 및 췌장의 알파-아밀라제를 억제 : 기질 개시 방법
시약 : 완출액(실시예 1과 같음)
h-SA(실시예 1과 같음)
h-PA(실시예 1과 같음)
MAB-1" : 완층액대내 제1의 MAB, 여러 농도
MAB-2" : 완층액내의 제2의 MAB, 0.513㎍/㎖
알파-글루코시 다제 : 알파-아밀라제 시약(뵈링거 만하임, Cat. No.568589) 으로부터
기절 : 일파-아밀라제 시약으로부터 G7PNP
실험 : 880㎕ 알파-글루코시다제에 10㎕ MA MAB-1" 용액뿐만 아니라,10㎕ MAB-2" 용액 또는 l0㎕ 완충액을 부가하고, 25㎕ h-PA를 또는 h-SA를 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 5분간 배양한다. 그후에, 100㎕ 기질 용액의 부가를 시작하고 개시 후에 아밀라제 활성을 측정한다. 대조로서, 알파-글루코시다제와 20㎕ 완충액의 혼합물뿐만 아니라 상응하는 알파-아밀라제의 혼합물이 사용된다. MAB(s)있는 활성을 MAB(s)없는 활성으로 나눈 값이 %잔여 활성이다.
결과 : 부속된 도면의 제1도는 제2의 MAB가 있고 및 없는 h-SA의 경우 및 제 2 의 MAB만 있는 h-PA의 경우에 제1의 MAB의 최종농도의 함수로서 잔여 활성을 나타낸다.
Claims (14)
- 저지제로서, 타액의 효소를 특이적으로 97%이하 저지하는 제1의 단일 크론 항체 및 이 효소를 10%이하 저지하는 제2의 항-타액 알파-아밀라제 단일 크론 항체를 사용하여, 타액의 알파-아밀라제를 저지하는 단일 크론 항체의 존재하에 알파-아밀라제를 검출하는 시스템과 반응시킴에 의해, 특히 헐청, 혈장, 십이지장액 또는 소변같은 체액내의 타액 알파-아밀라제 존재하에 췌장의 알파-아밀라제를 정량하는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1의 항체는 93%이하로, 제2의 항체는 5%이하로 타액 효소를 저지하는 방법.
- 제2항에 있어서, AJ 새앙쥐를 천연 또는 변성된 타액의 알파-아밀라제로 면역하고, 면역된 동물의 B-임파구를 변형제(transfonning agent)와 융합하고, 형성된 혼성 세포를 클로닝(cloning) 및 배양하고 단일 크론 항체를 분리하여 얻은, 단일 크론 항체를 사용하는 방법.
- 제3항에 있어서, 사용된 제1의 단일 크론 항체가 NCACC 84122003호 또는 NCACC 84122004호인 방법.
- 제4항에 있어서, 사용된 제2의 단일 크본 항체가 NCACC 84111301호 또는 84111302호인 방법.
- 제5항에 있어서, 최소한 5㎍/㎖ 제1의 단일 크본 항체 및 최소한 1㎍/㎖ 제2의 단일 크론 항체가 사용되는 방법.
- 제6항에 있어서, 최소한 20㎍/㎖ 제1의 단일 크론 항체 및 최소한 5㎍/㎖ 제2 의 단일 크론 항체가 사용되는 방법.
- 제7항에 있어서, 췌장의 알파-아밀라제를 검출하는 시스템으로서, 4 내지 7의 포도당 잔사를 가지는 말토폴리오스, 맥아당 가인산분해효소, β-포스포글루코뮤타제, 포도당-6-인산염 탈수소 효소 및NAD가 사용되는 방법.
- 제1항에서 제7항까지의 어느 한 항에 있어서, 췌장의 알파-아밀라제를 검출하는 시스템으로서, 알파-글루코시다제와 함께, 분자내에 4 내지 7의 포도당 잔사를 가지는 니토로페닐말토폴리오스가 사용되는 방법.
- 제1항에서 제7항까지의 어느 한 항에 있어서, 알파-아밀라제를 검출하는 시스템으로서, 정량가능한 그룹으로 변성된 전분이 사용되는 방법.
- 타액의 호소를 특이적으로 97%이하 저지하는 제1의 단일 크론 항체 최소한 5㎍/㎖ 및 이 효소를10%이하 저지하는 제2의 항-타액 알파-아밀라제 단일 크론 항체 최소한 1㎍/㎖을 포함하고, 알파-아밀라제 및 타액의 알파-아밀라제에 대한 단일 크론 항체를 검출하는 시스템을 포함하고, 특히 헐청, 십이지장액, 혈장 또는 소변같은 체액내의 타액 알파-아밀라제의 존재하에 췌장의 알파-아밀라제를 정량하는시약.
- 제11항에 있어서, 췌장의 알파-아밀라제를 검출하는 시스템으로서, 4 내지 7의 포도당 잔사를 가지는 말토폴리오스, 맥아당 가연산분해효소, β-포스포글루코뮤타제, 포도당-6-임산염 탈수소효소 및NAD를 포함하는 시약.
- 제11항에 있어서, 췌장의 알파-아밀라제를 검출하는 시스템으로서, 4 내지 7의 포도당 단위를 가지는 니트로페닐말토폴리오스 및 발파-글루코시다제를 포함하는 시약.
- 제11항에 있어서, 췌장의 알파-아밀라제를 검출하는 시스템으로서, 정량가능한 그룹으로 변성된 전분을 포함하는 시약.
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