KR900008250B1 - 시스테인으로부터 시스틴을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

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Description

시스테인으로부터 시스틴을 제조하는 방법

본 발명은 효소법 또는 발효법으로 제조된 시스테인을 산화하여 시스틴을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-시스테인 및 L-시스틴은 의약품, 의약품의 원료, 식품첨가제 및 화장품 첨가제로서 유용성이 입증된 단원소 S(황)-함유 아미노산류이다. 특히 최근에는, 차가운 퍼어머넌트 웨이브액의 원료로서 이들 화합물의 수요가 꾸준이 증가하고 있다.

발효법, 효소법, 합성법 또는 기타 다른 방법에 의해 제조되는 시스테인함유 반응용액으로부터 시스테인을 분리해 내는데 있어서(이하 "반응용액"은 효소법, 발효법 또는 합성법의 반응종료후 존재하는 용액을 의미한다.), 반응용액의 구성성분이 복잡하고 물속의 시스테인용해도가 매우 높기때문에, 먼저 시스테인을 염산 또는 p-톨루엔술폰산등의 강산과 반응시킴으로서 당해 염을 형성하여 시스테인의 분리 및 정제를 실행하는 다양한 방법이 보급되어 있었다.

이러한 방법은 일반적으로 공정 과정이 복잡하고 시스테인의 수율이 매우 낮다. 발효법으로 얻어진 복잡한 성분의 반응용액으로부터 고순도형태로 시스테인을 추출해내기란 곤란하며, 특히 반응용액이 미생물에서 발생되는 불순물을 함유하기 때문에, 발효법 또는 효소법에 의해 얻어지는 반응용액으로부터의 시스테인의 분리 및 정제는 많은 손실을 수반한다.

시스테인은 비교적 산화되기 쉬우므로, 반응용액에서 시스테인을 시스틴으로 강제 산화시키고, 다시 시스틴을 정제된 형태로 분리한 다음에, 분리된 시스틴을 전해환원시켜 순수한 시스테인을 얻어내는 방법이 안출되어왔다.

시스테인 발효액에서 시스테인의 산화를 실행하는 방법 몇가지가 발표되어있다. 일본국 특허공보 소57(1982)-7,634에 발표된 방법을 보면, 공기 또는 H₂O₂등의 과산화물을 사용하여, 반응혼합물의 pH를 5내지 10으로 유지시키면서 상기 산화를 달성한다.

본 발명자가 상기 방법에 의해 실험한 결과, H₂O₂또는 공기를 사용한 산화법에 따른 방법에 있어서, 반응은 라디칼 산화방식으로 진행하여 반응상태의 조절이 어렵다는 결점을 수반하고 분해발생율이 상당히 크다는 것이 전제된다.

상술한 방법의 경우에서와 같이, 반응용액이 시스테인 반응계에 라디칼반응을 촉진시키는 Fe⁺⁺또는 Mn⁺⁺등의 금속이온을 함유하는 발효액일때, 시스틴의 수율은 비교적 높다.

그러나, 반응용액이 실질적으로 금속이온을 함유하지 않을 경우 수율은 저조하다. 만일 Fe⁺⁺혹은 Mn⁺⁺등의 첨가금속이온이 분리된 시스틴에 혼합된다면, 그것은 시스틴의 전해 환원에 역효과를 초래할 가능성이있다.

발효법 또는 효소법에 의해 얻어진 시스테인 반응용액으로부터 사용된 효소 또는 사용된 미생물을 제거하기 위해서, HCl 또는 H₂SO₄를 첨가하여 반응용액의 pH를 4 이하로 조절하고, 거기에 활성탄을 첨가하고, 결과 용액을 가열처리하여, 그에 따라 사용된 효소 또는 사용된 미생물 세포를 응집 및 활성탄에 흡착되도록 하고, 얻어진 혼합물을 고액분리하는 방법이 가장 효율적이라고 공지되어왔으나, 이런 경우에 있어서, 공기나 H₂O₂를 사용한 산화방법은 상술한 명세서에서 특별히 지적한 바와 같이 반응용액의 pH를 5 이상으로 유지할 것이 요망되므로 반응용액처리후의 산성상태에 있는 시스테인의 산화는 적합하지 않다.

특히 본 발명자의 확인실험에 의하면, pH 1 근방의 강한 산성상태하의 공기에 의한 산화는 실제로 시스틴을 전혀 생성할 수 없음이 확인되었다.

현재까지 공지된 종래의 시스테인 산화방법중에는 메틸 크산티드를 사용한 산화방법(미국특허공보 제4,039,586호)과 α-선 방사에 의한 방법(케미칼 커뮤니케이션 1968판,826-827)을 들 수 있다. 그러나 이들방법은 상업상 실행할만한 가치가 없다.

본 발명자는 상기 문제점의 해결 방안을 모색하기 위하여 꾸준히 연구하였다.

특별히, 본 발명은 디메틸 술폭시드(이것은 산화제로 작용한다.)의 존재하에 발효법 또는 효소법으로 생성된 시스테인 함유 수용액에서 시스테인의 산화를 야기시키고 그에 따라 시스테인을 시스틴으로 변화시키고 얻어진 시스틴을 분리해내는 공정과정을 특징으로 하는 시스틴 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 기도되는 산화를 전제로 하는 반응용액은 그것이 발효법 및 효소법으로 생성된 시스테인함유 반응용액이어야 한다는 요구조건에만 합치되면 된다. 예를 들면, 상기 일본국 특허공보 소57(1982)-7,634에서 발표된 것과 같이 2-아미노-티아졸린-4-카르복실산(ATC)을 사용한 슈우도모나스(Pseudomonas)류 등의 L-시스테인 제조용 미생물을 배양시켜 제조된 반응용액이 사용될 수 있다. 바람직하게 본 발명은 시스테인 제조과정에서 발생하는 무기염 함유량이 비교적 높은 반응용액에 적용된다.

본 발명자는 출발물질로서 L-세린을 사용하고, 트립토판 신타아제의 존재하에 술포히드릴기 도입제의 기능으로 소용될 Na₂S, NaHS 또는 H₂S등의 황 함유 화합물을 사용하여 효소반응을 실행하여 L-시스테인을 제조하는 방법을 전에 개발하여 특허 출원 하였으며, 이런 효소반응에 의해 제조된 반응용액은 NaCl 및 (NH₄)₂SO₄등의 무기염을 함유한다.

본 발명의 방법이 효소 및 발효 반응용액에 적용될때, 디메틸 술폭시드(이하 간략히 "DMSO"라 칭한다.)의 존재하에서 산화는 이온반응에 의존하기 때문에 산화시 반응속도는 예컨대 산화 반응계에 존재하는 염의 촉매작용에 의해 빨라지는 경향이 있다.

본 발명은 효소법(이하 발효법까지 포함하여 "효소법"이라 칭한다.)으로 생성된 반응용액에 함유된 시스테인을 시스틴으로 산화시키는 방법에 관한 것이며, 반응이 약한 상태하에 진행되므로 반응용액의 조성에 영향을 받지 않는다.

따라서, 반응용액은 시스테인 생성과정 도중에 형성된 극미량의 시스틴을 함유할 수도 있고 또한 사용된 효소 또는 사용된 배양 미생물도 함유할 수 있다. 예를 들면, 효소반응으로부터 새롭게 얻어지고, 사용된 효소 또는 사용된 미생물 세포들은 여전히 함유하는 반응용액에 함유되어 있는 시스테인은 용액에 DMSO를 첨가함으로써 시스틴으로 산화되며, 사용된 효소 또는 미생물 세포를 용액에서 제거함으로써 생성된 시스틴을 분리한다.

그러나, 이미 상술한 것처럼, 본 발명에 있어서 반응용액으로부터 사용된 미생물 세포의 제거는, pH 4를넘지 않는 산성상태하에서, 바람직하게는 흡착제의 존재하에 pH 1 근방으로 유지하여 반응용액을 가열처리함으로써 사용된 미생물 세포를 응집시키고, 그 응집체를 활성탄에 흡착되도록하여 피흡착질을 용리시키는과정으로 이루어지는 방법에 의해 가장 효율적으로 실행된다. 상술한 바와 같이 반응용액에서 사용된 미생물세포를 제거함으로써 얻어지는 시스테인을 함유한 산성수용액에 대하여, 산화제로서 DMSO를 첨가하여 시스테인을 시스틴으로 전환시킨다. 본 발명에 의해 기도되는 시스테인의 시스틴으로의 산화를 위한 반응에 있어서, 반응속도는 용액의 pH 값과 반비례하며 시스틴의 수율은 용액의 산성도에 비례하여 증가한다.

DMSO의 사용양은 반응용액에 함유된 시스테인 1몰당 약 0.2 내지 2.0몰, 바람직하게는 0.5 내지 1.0몰이면 충분하다.

본 발명의 반응이 실시되는 통상의 온도는 엄격히 제한되지 않으나 5℃에서 100℃ 사이이면 바람직하다. 본 발명은 반응계에 강제적인 산소공급을 요구하지 않으며, 편리하게 밀폐가능한 어떠한 반응용기에서도 실시 가능하며, N₂가스분위기 하에서도 가능하다.

따라서 산화는 DMSO의 사용으로 초래되며, 본 발명은 다음과 같은 잇점을 지닌다. (1) 공기를 이용한 산화 또는 H₂O₂를 이용한 산화에 있어서는, 촉매로서 Fe⁺⁺, Mn⁺⁺또는 Cu⁺⁺등의 금속을 반응계에 첨가하지 않으면 알맞은 반응속도를 취할 수 없다. 본 발명의 방법은 절대 촉매를 사용하지 않는다.

공기를 이용한 산화 또는 H₂O₂를 이용한 산화는 라디칼반응이므로, 그것은 시스틴 발생으로 끝나지 않고 시스테인산과 같은 분해산물의 발생으로 진행된다. 그 결과, 시스틴의 회수는 필연적으로 대량 손실을 수반하며, 산화 반응은 용이하게 조절될 수 없다. 본 발명에서 기도되는 DMSO의 존재하에 실시되는 산화에 있어서, 산화는 이온반응이므로 알맞게 진행하여 시스테인으로부터 실질량의 시스틴을 생성한다. 전해 무기염의 존재하에서 반응이 실시될때, 산화반응속도는 빨라진다. 이러한 전해 무기염의 존재효과는, 기질로서 L-세린을 사용하고 트립토판 신타아제의 존재하에 황 함유 화합물의 효소반응을 실행하여 얻어진 L-시스테인 반응용액에 본 발명의 방법을 적용할때 특히 현저하다. (2) 본 발명의 산화방법으로 산화되는 시스테인 수용액은 가능한한 낮은 pH 값을 갖는 것이 바람직하다. 산성상태(pH 4 이하)하에 활성탄을 사용하여 사용미생물세포를 제거하여 얻어진 시스테인 수용액을 산화반응을 할때에 수용액은 pH 조절처리가 필요없이 산화반응에 사용되도록 직접 투입될 수 있다.

공기를 이용한 산화 또는 H₂O₂를 이용한 산화에 의한 종래의 방법과 비교하여, DMSO를 사용한 산화에 의존한 본 발명의 방법은 특히 강한 산성상태하에서 시스테인의 시스테인산으로의 분해율 저하와 같은 현저한 효과를 발생하여, 이 사실을 입증하는 자료를 다음표에서 볼 수 있다.

산화시험에 있어서, 10% L-시스테인 수용액을 표본 용액으로 사용한다. DMSO와 H₂O₂를 각각 L-시스테인 1몰당 0.75몰씩 사용한다. 공기를 사용하여 산화시키는 경우에 있어서, 공기를 1분당 용액 체적의 3배의 비율로 용액을 통과시키며, 모든 시험에 있어서, 산화를 실온에서 8시간 동안 실시한다. 표에서, 분자는 시스테인의 전환율(산화율)을, 분모는 시스틴 생성율(시스틴에 대한 선택도)을 나타낸다.

주의) 공기와 H₂O₂를 사용한 시험에 있어서, 반응계에 이온이 존재하도록 미량의 FeCl₂를 가한다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예에 있어서, 시스테인과 시스틴은 다음과 같이 분석한다. 시스테인의 분석은 공지된 가이톤드 방법(Gaitonde method)으로 실시한다.

주어진 용액의 약 0.5g을 시료로 취하여 정확하게 무게를 달고, 2N-HCl을 사용하여 본래 체적의 10 내지 20배로 희석한다. 희석용액을 대략 100배로 더욱 희석하고, 최종적으로 본래 체적의 1000 내지 2000배로 희석된 용액을 산성 닌히드린 시약으로 착색하고 흡광계를 사용하여 560nm에서의 흡광도를 시험한다. 따로, 농도를 알고있는 표준시료를 미리 준비하여 560nm에서의 흡광도 곡선을 얻는다. 다음, 주어진 용액의 시스테인 농도를 눈금선으로부터 계산한다.

시스틴 농도에 관하여, 상술한 바와 같이 본래 체적의 1000 내지 2000배로 희석된 주어진 용액을 5-μM 1.4-디티오트레이톨(환원제)과 거의 같은 부피로 혼합하고, 2N-NaOH를 가하여 pH를 8.0 내지 8.5로 조절하고, 상술한 방법으로 시스테인 농도를 계산할 수 있도록 시스틴의 시스테인으로의 완전 환원을 위해 실온에서 한시간 동안 방치한다. 시스틴의 농도는 산출농도에서 환원전의 시스테인농도를 감하여 알 수 있다.

실시예 1

내부 체적이 300ml이고 교반기가 장치된 분리형 플라스크에, L-세린 22.0중량%(L-세린으로 0.19몰)을 함유하는 L-세린수용액 91g, 황화나트륨이수화물(NaSH·2H₂O)(0.38mol) 28.1g과 대장균(Esckerichia coli)MT-10242(FERMBP-20)(한국 기탁 수리번호 KFCC-10206, 별첨 미생물보관 수탁신청서 수리중 참조)에 의해 발생되며 사용된 세포(건조함량 2.2g)를 계속 함유하는 트립토판 신타아제의 배양 발효액 10g을 넣고, 5% 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 7.5로 맞추고, 전체 부피가 200ml가 되도록 물로 희석한다. 얻어진 혼합물을 35℃의 항온조에 두고 24시간 동안 반응하도록 방치한다.

반응 종료후, 반응 혼합물에 염산을 가해 pH를 1.0으로 조절하고, 다음에 활성탄(다케다 화학공업사에서 제조되고 "도큐세이시라사기"의 지정등록 상표로 시판된다.) 5g을 섞고, 80℃에서 30분간 가열한다. 가열처리종료후, 80℃로 유지된 반응 혼합물을 흡인여과기를 통해 고온 여과하여 사용된 미생물 세포를 제거하고 처리된 형태로 반응여과액 188g을 얻는다. 이 반응 여과액을 분석하면 L-시스테인 20.1g(0.166몰)과 L-시스테인으로서 환원된 L-시스틴 2.0g(0.008몰)을 함유한 것을 알 수 있다.

L-세린의 L-시스테인 및 L-시스틴으로의 전환율은 95.8%로 계산된다.

가열처리하여 얻어진 반응용액을 교반기가 장치된 300ml들이 분리형 플라스크 안으로 옮겨 담고, DMSO 9.7g을 가하여 실온에서 8시간 동안 교반시켜(용액의 pH는 계속 1이다.) L-시스틴 결정이 침전된 용액 196.2g을 얻는다. 이 용액에 있어서, L-시스테인 0.2g이 남는다.

산화하여 얻어진 용액에 5% 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 대략 5정도로 중화하여 결정을 침전시킨다. 결정을 여과분리하고 건조하여 백색 분말상 결정 19.8g(100%로 0.165몰)을 얻는다. 이 결정은 굴절율,

Fe 함량 10ppm 이하 및 순도 98.5% 이상을 갖는 것으로 확인되었다. 회수율에 관하여는, 반응용액에 존재하는 L-시스테인과 L-시스틴 모두 95.0%가 회수되며, 분해율은 2%이하이다.

비교예

실시예 1의 과정을 따라 얻어진 동일한 반응용액을 가열 처리하고 5% 수산화나트륨 수용액으로 pH 5정도로 중화시킨다. 가열처리하여 얻어진 반응용액을 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 300ml들이 분리형 플라스크에 넣고, FeCl₂0.2g을 혼합하고, 200ml/min의 유출 속도로 유입된 공기를 실온에서, 불어넣어, L-시스틴 결정이 침전된 용액 200.8g을 제조한다. 용액에 4.2g의 L-시스테인이 잔재한다.

석출된 결정을 여과 및 건조시켜 반응용액으로부터 분리하여, 백색분말상 결정 14.8g을 얻는다. 이 결정은 굴절율

Fe 함량 30ppm 및 순도 98.5% 이상을 갖는다. 회수율에 있어서, 반응용액에 존재하는 L-시스테인 및 L-시스틴 모두 70.3%가 회수된다. 분해율은 9.9%이다.

실시예 2

교반기가 장착된 300ml들이 분리형 플라스크에 22.0중량%의 L-세린(L-세린의 0.19몰)을 함유한 L-세린 수용액 91g과 황화나트륨이수화물(NaSH·2H₂O) 28.1g(0.38몰) 및 대장균(Esckerichia coli) MT-10242(FERM·BP-20)(한국 기탁 수리번호 KFCC-10206, 별첨 미생물 보관 수탁신청서 수리중 참조)로부터 발생되고 사용된 세포(건조함량 2.2g)를 계속 함유하는 트립토판 신타아제의 배양발효액 10g을 혼합하여 넣고, 5% 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 7.5로 조절하고, 다음에 전체 부피가 200ml가 되도록 물로 희석한다. 희석액을 35℃의 항온조에 두어 24시간 동안 반응하도록 방치한다.

반응 종료후 생성된 반응용액을 분석하면 L-시스테인 18.5g(0.153몰)과 L-시스테인으로써 환원된 L-시스틴 3.2g(0.013몰)을 함유한 것을 알 수 있다. L-세린의 L-시스테인 및 L-시스틴으로의 전환율은 94.2%로 계산된다.

결과적으로 생성된 반응용액을 진한 염산 30ml정도를 가하여 pH 0.5로 조절하고 DMSO 0.97g을 섞어 35℃에서 8시간 동안 교반하여 산화시킨다. 본 공정에서, 산화된 용액을 L-시스테인 0.7g(0 .006몰) 및 L-시스틴 20.7g(0.086몰)을 함유했다. L-세린의 L-시스틴으로의 전환율은 90.6%로 계산되었다.

산화용액과 거기에 첨가된 활성탄(다케다 화학공업사 제품) 5g을 80℃에서 30분간 가열한다. 80℃로 유지된 반응 혼합물을 흡인여과기를 통해 고온여과하여 사용미생물 세포를 제거하여 균일한 여과액(pH는 계속 0.5이다)2.30g을 처리된 형태로 얻는다. 이 여과액을 분석하면 L-시스테인 0.3g(0.002몰) 및 L-시스틴 20.8g(0.087몰)을 함유하고 있음을 알 수 있다. L-세린의 L-시스틴으로의 전환율은 91.3%로 확인된다.

사용미생물 세포를 분리하여 얻어진 용액에 30% NaOH 용액 5ml가량을 적하시켜 pH 2로 중화하여 L-시스틴 결정을 침전시킨다. 결정을 흡인여과기로 진공 여과시켜 분리하고 물 50ml로 완전히 세척하고 건조하면 백색분말상 결정 20.2g(100%로 0.084몰)이 산출된다. 이들 결정은 굴절율

=-218.6(C=2,2NHCl), 10ppm 이하의 Fe 함량, 98.5% 이상의 순도를 갖는다. 회수율에 있어서, 반응용액에 존재하는 L-시스테인 및 L-시스틴 모두 100% 가까이 회수된다.

Claims (2)

1. 효소법 또는 발효법으로 제조되는 pH 4 이하의 시스테인 함유 수용액에서 산화제로서 사용하는 디메틸술폭시드의 존재하에 시스테인을 산화시킴으로써 상기 시스테인을 시스틴으로 전환시키는 것으로 이루어진 시스테인으로부터 시스틴을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 시스테인 함유 수용액이 트립토판 신타아제의 존재하에 L-세린과 술포히드릴기-함유 화합물을 반응시켜 생성된 L-시스테인 수용액인 것을 특징으로 하는 시스테인으로부터 시스틴을 제조하는 방법.