KR900005903B1

KR900005903B1 - 알파-msh의 동족체의 국소적용으로 메라노싸이트를 자극시키는 방법 및 이에 사용될 수 있는 조성물

Info

Publication number: KR900005903B1
Application number: KR1019870700899A
Authority: KR
Inventors: 쥬니어 허비 빅터; 이.하드레이 멕; 도르 로버트; 레빈 노르만
Original assignee: 유니버시티 페이턴츠 아이엔씨; 죠오지 엠.야학
Priority date: 1986-02-03
Filing date: 1987-01-23
Publication date: 1990-08-16
Also published as: IE870236L; CA1282324C; US4866038A; WO1987004623A1; AU597630B2; IE60883B1; DK518187A; DK518187D0; ATE84420T1; EP0259440B1; NZ233248A; KR880700670A; US4918055A; AU7082887A; EP0259440A4; EP0259440A1; DE3783541T2; DE3783541D1

Abstract

내용 없음.

Description

알파-MSH의 동족체의 국소적용으로 메라노싸이트를 자극시키는 방법 및 이에 사용될 수 있는 조성물

본 발명은 알파-MSH 동족체의 국소적용으로 척추동물의 외피성 메라노싸이트를 자극시키는 방법 및 이에 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.

척추동물에 있어서, 피부의 색깔, 나아가 (모)털의 색깔은 어느 색소관련 세포, 예를 들면 메라노싸이트의 수와 분포, 유전적인 조절하에 있는 메라노싸이트의 수와 분포에 의하여 결정된다.

포유동물중의 메라노 싸이트는 진피와 외피 사이의 접합부에서, 머리모낭내에서, 외피의 기초층에 존재하고 있다.

이들 메라노싸이트내에 색소(메라닌)의 합성은 내부세포 유기질내에 존재하는 푸리메라노좀(premelanosome)인 효소, 티로시나제의 역활(역가)에 의하여 조절된다.

티로시나제의 활력에 따라, 오리메라닌(eumelanin)(갈색-검은색)또는 파에오메라닌(phaeomelanin)(황색-적색) 색소는 유기질내에 나타나게 되고 완전한 메라닌화가 이루어진 후에는 푸리메라노좀은 메라노좀으로 알려져 있으며, 나아가 특히(오이메라노좀 또는 파에오메라노좀) 색소에 의존경향이 있다. [참조, 핏츠팻트릭, 티.비,. 와이. 호리, 케이. 토다, 엠.세이지, Jap.J.Derm 79 : 278(1969)].

메라노좀은 피부의 둘러싸여져 있는 케라티노싸이트(Keratinocytes) 또는 싸이토크린분비로서 알려진 공정에 의하여 성장중인 모근의 지주내에 있는 세포에서 유도된다. 비록 메라닌 합성경로와 네발짐승의 모피형태가 유전적으로 명백하다할지라도, 포유동물의 모낭 메라노게네시스와 모피색소변화는 호르몬에 따라 알파-메라노트로핀(알파-메라노싸이트 자극호르몬, 즉 알파-MSH)에 의해 조절되며, 이는 하나의 트리데카펩타이드(tridecapeptide) 구조를 갖는다.

Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂

이 호르몬은 뇌하수체 중엽에서 분비되며 아데닐레이트 싸이클라제활성, 티로시나제 활성을 자극하여 결국 메라닌을 생성한다[참조 하들리, 엠.이,. C.B.Howard, V.J.Hruby, T.K.Sawyer, 및 Y.C.S. Young, Pigment Cell 6 : 323(1980)].

인간에 있어서 알파-MSH는 태아의 뇌하수체 중에서만이 확실히 발견되며 성인에서는 없다. 성인에서는 메라닌 생성의 일정수치가 유전적으로 확인되며 구성조직적으로 존재하였다. 이런 기초적인 수치를 지나거나 상회하는 여러 가지 메라닌 합성방법은 UV 자극 즉 태양광선에 의존하였는데, 태양의 높은 수치로 메라닌의 생성을 증가시키기 위하여, 피부의 어두움을 공존케하여 노출시키는 것이었다.

이와같은 조치는 UV의 경시변화나 돌연변이 성질에 대하여 사람을 보호하기 위하여 진보된 적응이 된다. 피부외피의 메라닌 합성의 낮은 수치로 UV의 낮은 수치에 노출시키고, 피부색소를 투여하여, 방사선의 많은량이 흡수되는 것을 피부에 적용시킴에 감소된 억제효과를 보이게 하는 것이다. 비록 성인에서는 뇌하수체에서 알파-MSH가 합성되지 않지만, 인간의 메라노싸이트는 이 호르몬( 및 그들의 라세미화된 제제)에 영향을 받은 것이다.

인간의 피부의 저색소 형성은 메라노싸이트내에 메라닌 생성중 국소결손으로부터 일어나지만, 그러나, 많은 이와같은 저색소형성 색소형성 장해에 대한 원인론은 아직 미확인 상태이다. 세계인구의 대락 1%가 저색소형성 기능장해의 여러형태로 괴로움을 당하고 있다. 비록 알파-MSH 및 알파-MSH 동족체가 피하로 투여될 때 양서류중에 검은 색소를 일으킬 수 잇는 것으로 알려져 있으나 알파-MSH는 부신절제수술을 받은 인간에게 근육투여시에는 피부에 검은색소와 연관되어 있음도 알았다(Lener, A.B., 및 J.C McGuire, N.E.J Med.270 : 539-546(1984)]. 그리고 이와 같은 투여경로는 바람직한 효과를 나타내거나 유지하기 위한 반복적인 적용 필요성이 있을때에는 적당하지 못하였다.

본 발명 이전에는 이와같은 저색소형성 장해에 대한 알맞은 방법이 없었음을 밝히고 있다. 현재까지 알파-MSH 및 알파-MSH의 동족체는 경피에 투여로 효과가 있음이 발견되었으며, 이와같은 화합물은 메라닌의 생성을 자극시킬 수 있는 활성형으로 메라노싸이트로 될 것이다. 그래서, 본 발명에 따르면 후염증성 저색소 형성증, 백색 비강진을 포함하여, 티니아 잡색증, 백반, 개인특유의 반점; 및 신경성 저색소형성증과 같은 저색소형성 장해에 대한 정상화를 시키기 위하여 알파-MSH 동족체로 구성된 국소용 조성물을 적용시키는데 편리하고 가능토록 한 것이다. 나아가 알파-MSH 동족체의 국소적용으로 경시적으로 회색머리를 검게 할 수 있도록 한 것이다.

이와같은 동족체의 국소적용으로 검은색을 희게 하므로서 상업적으로 동물의 모피의 가치를 높이는 것이 또한 가능하다. 부가적으로 태양이나 UV 광선방사가 전혀 없는 상태에서도 피부를 검게할 수 있는 것이 가능하다.

본 발명의 목적은, 그러므로, 태양이나 UV 광선 방사의 전혀없는 상태에서 성인중에 메라노싸이트 생성을 자극하기 위한 방법이라고 설명될 수 있으며, 높은 수치의 UV에 의한 경시변화 및 돌연변이 효과로 노출을 위한 필요성을 피하고 탄닝(tanning)의 안전한 방법을 제공하고자 하는 것이다.

햇빛에 탄빛깔을 얻기 위하여 필요하였던 전에 UV에 의한 손해효과를 피하는 것뿐만 아니라, UV 방사에 노출결과에 대한 피부의 보호를 도울 수 있는 햇빛에 탄빛깔을 얻을 수 있는 것이다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 적당한 화합물로는 미국특허 제 4,457864호 및 제 4,485,039호에 알려진 물질을 포함하며, 여기에서 알파-MSH, 즉 다음 구조식을 갖는 화합물로 연관되어 있다 ; R₁-W-X-Y-Z-R₂

여기서, R₁은 Ac-Gly-, Ac-Met-Glu, Ac-Nle-Glu-, 및 Ac-Tyr-Glu-로 구성된 군중에서 선택되며; W는 -His- 및 -D-His-로 구성된 군중에서 선택되고 ; X는 -Phe-, -D-Phe-, -Tyr-, -D-Tyr-, -(P NO₂)D-Phe⁷-로 구성된 군중에서 선택되며 ; Y는 -Arg- 및 -D-Arg-로 구성된 군중에서 선택되고 ; Z는 -Trp- 및 -D-Trp- 로 구성된 군중에서 선택되며 ; 그리고 R₂는 -NH₂; -Gly-NH₂; 및 -Gly-Lys-NH₂로 구성된 군중에서 선택한다.

상기 및 하기에서 사용된 용어로서, Ala=alanine(알라닌), Arg=arginine(알기닌), Glu=glumatic acid(구루타민산), Gly=glycine(글라이신), His=histidine(히스티딘), Lys=Lysine(라이신), Met=meth-ionine(메티오닌), Nle=norleucine(노르루이신), Phe=phenylalanine(페닐알라닌), (pNO₂)Phe=par-anitro-phenylalanine(파라니트로페닐알라닌), Plg=phenylglycin(페닐글라이신), Pro=proline(푸로린), Ser=serine(세린), Trp=tryptophan(트리푸토판), TrpFor=N¹-formyl-tryptophan(N¹-포밀-트리푸토판), Tyr=tyrosine(티로신), val=valine(발린)을 의미한다.

모든 펩타이드는 왼쪽에 아실-터미날 말단으로 그리고 오른쪽으로 아미노터미날 말단으로 기재되어 있다 ; 접두사인 아미노산 앞에 "D"는 D-이성체 구조형태를 뜻하는 것이며, 기타 특별히 기재되어 있지 않은, 모든 아미노산은 L-이성체 구조형태이다.

본 발명에서 사용될 수 있는 화합물로는 다음과 같은 화합물이 포함된다 ;

이와 같은 화합물은 미국특허 제4,457,864호 및 제4,485,039호에 기재된 공정에 따라서 또는 합성 알파-MSH의 제법에 사용된 잘 알려진 공정에 따라 합성될 수 있다.

이들 화합물은 알파-MSH보다 다음과 같은 하나 또는 2이상의 특징점을 갖는다 : 개구리와/또는 도마뱀을 이용한 체외 및 체내 실험에서 측정된 바와같은 강력효과; 이를 실험에서 생체내 효과의 지속; 및/ 또는 혈청요소에 의한 퇴화에 대한 저항성.

본 발명에서 유용한 화합물은 경피적으로(transdermally)투여되며, 그리고 해당분야에서 숙련된자에게 잘 알려져 있는 방법 및 공정에 따라서 투여에 대한 기도방법에 의해서 결정된 적당한 조성물로 제형화된다.

예를 본 발명에서 사용된 적당한 화합물은 제형화 또는 여러 편리한 기제로서 제제화한 조합물을 만들 수 있는데, 각기 피부에 성분효과를 나타나게 할 수 있는 바람직한 형으로 크림, 연고, 겔, 로숀 또는 스프레이와 같은 제제로서 조화시킬 수 있다.

이들 제제의 제조에 있어서, 조성물은 농후제, 연화제, 계면활성제, 색소, 향료, 보존제, 보충제 및 유화제를 혼합할 수 있으며 피부용 제제의 제형으로 사용될 수 있으며 잘 알려진 모든 제형으로 할 수 있다.

전형적으로 이들 불활성의 성분들은 최종제형에 많은 량으로 조합된다. 바람직하다면, 조성물은 서방출성 또는 지속성 방출 제형으로 만드는 것이다. 본 발명의 이해를 돕기 위하여 다음과 같은 실시예를 들은 것이며 제한을 가하는 것이 아니다. 모든 온도와 온도범위는 섭씨이며, 환경 또는 실온은 약 20℃이며 퍼센트 또는 (%)는 중량 퍼센트이며 몰 또는 수몰은 그람몰수이다.

[화합물의 제조]

실시예 1-3에 언급된 모든 화합물들은 고체상 합성(Solid-Phase Synthesis)으로 합성하여 Sawyer등의 P.N.A.S. 77 : 5754-5758(1980), Sawyer 등의 P.N.A.S. U.S.A. 79 : 1751-1755(1982) 또는 Sawyer 등의 J.Med.Chem.25 : 1022-1027(1982)에 기재된 방법으로 정제된 것이다.

간단히 요약하면, 각 화합물들은 P-메틸벤즈하이드릴아민수지에 목적하는 아미노산들을 연속적으로 결합시켜 그것의 N^α-Boc 유도체들로 합성 되는 것이다. 삼관능성 아미노산 각각의 반응성 가지중의 측면기들은 적당한 보호기와 결합되므로써 보호된다. 결국, 아미노산 잔류물들은 수지에 결합되므로써 펩타이트-수지중의 아미노 말단은 아세틸화된다. 아세틸화의 결과로, 보호된 펩타이드는 수지로부터 분해되므로 모든 보호기들은 제거되게 된다. 시클릭 디설파이드 화합물에 있어서는, 설프하이드릴형이 페리시아나이드 산화반응에 의해 시클릭 디설파이드 화합물로 산화된다. 조화합물들은 실리카겔상에서 적당한 용매를 사용, 이온교환 크로마토그라피하므로써 정제한다. 광회전 값은 퍼킨-엘마 241MC 편광계를 사용, 머큐리-그린선(546nm)에서 측정하였다.

실시예 1-3에서 비교의 목적으로 사용된 알파-MSH는 Yang등의 Int.J.Pept. Protein Res.15 : 130-138(1980)에 기재된 방법으로 제조하였다. 비교분석에 사용되는 [Nle⁴]-알파-MSH는 페닌슬라 라보라토리스(산 카를로스, CA) 제품을 구입하여 사용하거나, Hruby 등의 J.Med.Chem. 23 : 1432-1437(1980)에 기재된 방법으로 제조하여 사용하였다.

[실시예 2]

메라노좀분산이 생체내와 생체외에 미치는 생물학적 효과는 개구리(Rana Pipiens)와 도마뱀(Anolis Caroliziensis)을 사용하여 실험하였다. [Hadley 등, Science 213 :1025-1027(1981) 참조] 생체외에서 메라노즘(Stimulate Melansome)분산에 대하여 자극시키는데 영향을 미치는 지속기간을 측정키 위해 Shimume 의 Endrochrinology, 54 : 553-560(1954)에 기재된 스킨바이오에세이(Skin Bioassay)를 사용하여 유사한 실험을 행하였다.

[표 1]

I= 비교적 효능있는 개구리

II= 비교적 효능있는 도마뱀

III=지속성 개구리

IV=지속성 도마뱀

본 발명에 의한 화합물들의 혈청단백질 분해 효소분해에 대한 저항성은 본 발명에 의한 화합물들을 10% 말혈청과 2% 우태아혈청을 포함하는 Ham's F-10배지가 들어있는 코닝 플라스크내에서 무균조건으로 37℃의 온도조건하에서 배양하여 입증할 수 있었다.

이 실험을 행함에 있어서, 펩타이드(10nM)를 함유하는 배지의 시료들은 0, 24, 48, 72시간 간격으로 채취하였고 채취된 시료는 즉시 냉동하고, 생물학적 활성의 분석시에는 생체외에서 개구리 피부 생물학적 검정방법(frog skin bioassay)으로 행하였다. 이와같은 프로토콜을 사용하므로써 혈청단백질 분해효소분해에 대한 저항성이 분명히 밝혀질 수 있었다.

또한 본 발명에 의한 화합물들의 현저한 특성들은 존재하는 진단용, 치료용 및 기본연구시약(schemes)중에서 알파-MSH와 [Nle⁴]-알파-MSH에 대한 치환체를 유용하게 제공하기도 한다. 진단용시약 제조분야에 있어서, 본 발명에 의한 화합물 특히, 방사선으로 요오드화되거나 또는 감마방사선방출제와 결합된 본 발명에 의한 화합물들은 예외적으로 세포내에서 메라노트로핀 수용체와의 결합을 기초로하여 있거나 또는 특이적 특성을 갖는 메라노마세포로 사용하는데 매우 적합한 것이다.

본 발명에 의한 화합물의 혈청안정성은 가장 우수한 특성으로 제안된 선택적 약물 투여경로로 투여할시 표적조직의 농도가 높아지고 본 발명의 화합물이 관여하는 색상변화 관련 현상에 대한 효과가 지속적으로 나타나기 때문에 종래 알려진바와 같은 자연적으로 발생하는 메라노사이트 자극 호르몬과 이들의 합성동족체에 대한 여러 가지 생물학적 효과에 비추어 두배이상의 효과가 기대된다.

실시예 3과 4는 쥐의 낭성의 메라노게네시스에 대한 국소 또는 피하용 알파-MSH, [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH, [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH^4-10및 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH^4-11의 대조효과를 구체적으로 설명하는 것이다.

[실시예 3]

[피하주사]

알파-MSH와 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH를 합성하였다. 잭슨 라보라토리스(Bar Harbor, ME)로부터 구입한 쥐(C57BL/6JA^y)를 실험실에서 사료와 물을 계속 공급하면서 사육하였다. 알파-MSH는 C57BL/6JA^y황색쥐의 생체외 및 생체내에서 낭성 메라노게네시스를 자극하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 발명자등은 메라노게네시스를 자극하기 위해 쥐에 주사할 경우에는 동족체 즉, [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH와 비교하여 알파-MSH가 1만배 정도의 높은 농도를 요구함을 발견하였다. 동족체(10^-6M)를 1회 주사(0.05ml)한 결과, 24시간이 경과후 모근내에서 파에오메라닌(phaeomelanin)생성이 오이메라닌(eumelanin)합성으로 바뀌는 결과가 나타났고 오이메라노게네시스는 1회 주사후 96시간 동안 지속되었다. 쥐들의 모근색깔은 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH를 매일 1회씩 14회 주사한 결과 완전히 변화됨을 발견하였다. 메라노트로핀은 단지 머리털이 성장하는 동안에만 메라노게네시스를 감소시켰으며, 메라노즘들은 계속적으로 성장하는(증식기) 오랫동안 털의 세포내에 결합되어 색의 변화를 초래하였다. 다만 성장하는 털중의 오이메라닌 합성은 호르몬을 주사하여 보여지는 상태와 같은 결과를 나타내었다.

[실시예 4]

[국소적용]

알파-MSH와 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH를 각각 폴리에틸렌글리콜(26% PEG 400과 74% PEG 3350의 혼합물)로 구성된 비클(Verhicle)에 용해하여 표피에 국소적으로 적용하였다. 48일동안 자란 쥐의등 2-3㎠ 부위에 있는 털을 뽑으면, 이 부위에 있는 모낭은 털의 성장주기에 있어서 휴지기 상태가 된다. 모낭으로부터 털을 뽑으므로해서 새로운 털의 성장이 자극을 받기 때문에 7일후에는 표피층을 통해 털의 발진이 초래된다. 연고가 연고를 바르지 않은 부위로 번지지 않토록하여 관찰할 수 있도록 쥐를 카듭드칼라로 고정시키고 우리내에 각각 집어 넣었다. [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH(0.5ml, 10^-6M)을 함유한 연고를 매일 털을 뽑은 부위에 새로운 털이 나올때까지 발라주었다. 새로 나오는 털을 뽑은 다음, 메라노트로 핀을 바르고 매 25시간 간격으로 일주일간 발라주었다.

현미경조사로 동족체의 투여후 24시간에 모근내에 오리메라닌이 나타났다. 동족체의 계속적으로 매일 적용으로 계속적인 오이메라닌 합성이 일어나고 머리털 성장이 진행중에 있는 동물의 약물 미처리된 면적이 줄어들었음을 모근의 현미경적으로 관찰되었지만 약물처리된 모근으로 움직여 세포에서 메라노좀의 이동이 일어났다. 오이메라닌은 조절군 쥐에서 감소된 머리털내에서는 볼 수 없었고 전자현미경 조사로 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH로 처리된 쥐의 모낭 메라노싸이트내에 오이메라노틱메라노좀의 존재를 확인하였다.

다만 파에오메라노좀이 메라노트로핀이 함유되어있지 않은 대조연고로 처리된 쥐에서 존재하였다. 동족체(10^-8또는 그 이하)와 동일 농도인 알파-MSH는 14일 동안의 긴 기간 주의 피부에 적용할지라도 오이메라노게네시스를 유발시키는데 실패하였으나 높은농도(10^-5내지 10^-7)로 알파-MSH를 적용시에는 국소 및 조직성 모낭 메라노게네시스를 모두 유발시킴을 알았다.

이와같은 실시예는 자연적인 호르몬인 알파-MSH와 그 동족체 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH 모두의 경피전달로 나타났다. 동족체의 효과는 펩타이드가 여러 생물학적 정량법으로 측정된 바와 같이 알파-MSH보다 약 10 내지 1,000배의 강한 활성을 갖는다는 사실에 관련된다. 부가적으로 동족체는 효소 불활성에 저항성이 있으며, 어울리지 않게 알파-MSH는 빨리 불활성화한다. 암컷 및 수컷쥐는 모두 메라노트로핀과 유사한 반응을 보인다.

동족체의 경피전달은 피부를 면도한 부분에 적용할때나 털의 뿌리에 적용할때 모두 잘 일어났다. 이런 결과는 메라노트로핀의 수송이 피부의 본래대로의 부분을 통하여 진행되었음을 나타낸다. 비록 모낭의 메라노게네시스가 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH의 적용후 24시간에 나타난다 할지라도, 메라노싸이트에 있어서 펩타이드의 경피전달은 아마도 대단히 빠른 것인데 그것은 티로신아제 역가에 대한 활성이 게놈성이 있는 경우로서 (genomic event) 메라노트로핀과 접촉후 다만 많은 시간후에 일어난다고 알려져 있는 전서와 번역을 모두 포함하고 있기 때문이다.

[실시예 5]

푸로필렌 글리콜과 1-도데실아자싸이클로헵탄-2-온(다른 화합물의 경피침투를 증강시키는 것으로 이미 알려진 합성 극성 계면활성제임)중에 알파-MSH 또는 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH로 구성된 조성물로 실시예 4를 반복하였다. [예로서, stoughten, R.B., Arch.Dermatol.118 : 479(1982); stoughten, R.B. 및 W.O.McClure, Drug Devel. Indust. Pharm, 9(4) : 725(1983) ; (azone)참조]

비록 비클(vehicle)이 실온에서 고체라 할지라도 쥐의 면도된 피부에 적용시 쉽게 도포된다. 본 실험에서 아존농도는 1.8%(w/v PEG 비율은 PEG 400까지이다 ; 중량으로 PEG 4,000) 이고 MSH의 최종농도는 0.001%(1mg/100g 크림기제) 또는 0.003%이다.

[실시예 6]

[쥐]

피부에 약간의 색소를 지닌 쥐들을 실시예 5와 동일한 크림으로 처리하였다. 처리된 부위는 변화하지 않았으나 꼬리는 현저히 검어졌다.

처리된 쥐의 꼬리는 직접 국고적으로 처리하지 않았음에도 불구하고 검어졌다. 조직학적 실험은 비-여포성 메라노사이트의 부위에서 색소가 증가됨을 보인다. 이러한 결과는 (1) [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH는 국소적용을 한후에도 전신에 효과를 나타내며 (2) 비-여포성 메라노사이트는 이들 메라노트로핀의 메라노겐 효과에 민감하기 때문인 것으로 판단된다.

[실시예 7]

Ames 미생물학적 검정(Ames microbacterial assay)을 마이크로 좀 효소/NADPH 발생계통의 존재유무에 관계없이 행하여진 실험에 사용하였다.

간단하게 설명하자면, 본 실험은 살모낼라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 특별한 히스티딘 요구주에서 발생하는 역변성(reverse mutation)의 수를 측정하는 것이다.

양성(변성)은 변성유발물질에 노출된 후 히스티딘이 결핍된 성장배지내에서 콜로니를 형성할 수 있는 환원성 세포(revertant cell)의 수로 기록한 것이다.

이러한 특정실험은 알파-MSH, [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH와 [Ac-[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-10-NH₂등 3가지의 메라노트로핀을 포함한다. 모든 기질은 농도가 10^-2, 10^-3및 10^-4몰농도가 되도록 무균 0.9% 식염수(방부제가 없는)에 용해하였다. S.티피무리움의 TA-98 스트레인을 사용하여 S-9쥐의 간장 마이크로좀 효소 및 NADPH 발생계통에 노출시키거나 또는 노출시킴이 없이 행하였다. 이와같은 효소혼합물은 변성유발인자에 대한 몇몇 화합물에 신진대사적으로 활성을 줄 수 있다. 메라노트로핀이외에 독소리비신(아드리아마이신

) 또한 동시에 실험하였다.

독소리비신은 실험결과, 상당한 변성유발성이 있는 DNA가 포함된 항생물질임을 알았다. 따라서 양성대조구로서 행동할 수 있을 것이다. 다음의 표는 이러한 결과를 보여주는 것이며 특정실험을 위한 화합물들을 브라인드 시켰다.

[표]

* 실험적인 계수는 플레이트당 자발적인 환원성 리버탄트(revertants)의 감산으로 정상적으로 조절하였다(56회). 이러한 예비실험 결과들은 천연 또는 합성 메라노트로핀이 생체외에서는 변성 유발인자가 아님을 보여주는 것이다. 아드리아마이신은 상당히 변성유발성이 있는 물질이며 따라서 미생물학적검정 및 신진대사활성계통은 매우 활동을 잘하는 것으로 보여지며 메라노트로핀을 지닌 변성유발인자를 갖는 물질의 결핍은 인공품에서는 나타나지 않는다.

[실시예 8]

[독물실험]

6마리의 쥐에 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH(10^-4M 펩타이트용액 : 0.2ml ; 매일 0.02mg 씩 5일간 계속)를 주사하였다.

4마리의 암쥐 및 2마리의 숫쥐를 처리기간중 건강이 악화되지 않도록 하였다. 처리를 하는 마지막날에 쥐들을 희생시켜서 혈청시료를 채취하였다. 혈액 글루코오즈 분석결과에 의해 대조구와 처리구 사이에 글루코오즈의 수준은 상이하지 않음을 알았다. 만약 메라노트로핀이 아드레날을 자극하였다면 혈액중의 글루코오즈 수준은 달라졌을 것이다(인간의 쿠싱 질병과 같이).

고농도의 호르몬을 비정상적으로 메라노트로핀과 동시에 쥐에 주사한 결과, 쥐들에게는 분명히 영향을 미치지 않았다. 관찰하는 동안 이들의 행동변화는 없었다. 추가로 숫쥐 CD-2의 복막내에 20^-3M의 [Nle⁴, D-Phe⁷]MSH 0.25ml를 주사하였다.

코아의 온도는 디지틀 온도의 변환기에 연결된 직장탐칭에 의해 모니터하였다. 코아의 온도는 평균 35.2℃의 주사후 24시간 동안 변화가 없었다. 활성도 또한 정상적이었다. 24시간후 위치를 바꾸로 혈액을 간장과 신장의 화학분석을 위해 채취하고 혈액에 표시를 하였다. 실험결과 간장이나 신장의 기능에는 변화가 없었다. 전해질의 혈청수준도 정상이었고 혈청코티졸의 수준 또한 정상이었다.

혈액을 전체적으로 분석한 결과, 혈액학상 독성으로 발견할 수 없었으며 백혈구 세포의 수준, 적혈구 세포의 수준 및 혈소판의 수준도 정상적이었다. 적혈구 세포의 특성(크기, 헤모글로빈 수준)도 정상이었고, 단기간의 연구중 처리구에서도 현저한 체중의 변화를 발견할 수 없었다.

[실시예 9]

[인간사체 및 절개피부에 대한 메라노트로핀의 경피성 전달 실험]

인간의 사체 및 유방, 안면등으로부터 절개한 피부를 알파-MSH 동족체[Nle⁴4H, D-phe Y7H]-알파-MSH의 생체외 침투력을 측정하기 위해 사용하였다. 이러한 유형의 피부에 대한 생체의 경피성 전달 실험은 생체외에서의 상황을 정확히 예측할 수 있음을 보여준다. 피부시료들로부터 피하조직을 제거하고 특별히 고안된 침투세포[LGA]에 고정하여 38℃에서 24시간동안 유지시켰다. PEG중의 알파-MSH 동족체를 상피층에 적용시켰다. 시료를 셀라인(saline)에 담구었다. 알파-MSH 동족체의 양이 피부를 통해 셀라인으로 이동하는 것을 개구리 피부 바이오 에세이(Frog skin bioassay)에 의해 정량분석하였다. 이러한 실험결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1) 쥐의 피부는 생체내 연구와 관련하여 동족체에 의해 침투성이 우수하였으며 ;

2) 두터운 인간의 복부 및 흉부의 피부(표피+진피)는 전혀 침투되지 않았다. 이것이 국소 적용에 대한 중요한 발견이다. (예를 들면, 약제가 피부에 국소적으로 남아있을 경우).

3) 인간의 두피는 많은 모낭의 존재로 침투성을 갖는다.

4) 인간의 표피로부터 얻은 절개된 시료의 피부(0.5mm 와 0.7mm)는 동족체에 대하여 막층에 주관문이 없으므로 동족체의 침투가 가능하며 이것이 피층내에 메라노사이트가 도달하도록 하는 것이다.

상술한 바와같이 본 발명에 구체적으로 기재하였다 하더라도, 본 발명은 변경될 수 있는 것으로 이해될 수 있으므로 이에 제한을 두는 것은 아니다.

Claims

다음과 같은 그룹의 화합물을 메라노싸이트의 자극을 일으키기에 충분한 량으로 척추동물에게 국소적용시킴을 특징으로 하는 척추동물의 메라닌 산생을 자극시키는 방법.

(1) 다음과 같은 아미노산 구조를 갖는 알파-MSH : Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂; (2) 다음과 같은 구조를 갖는 알파-MSH 동족체 ; Ac-Ser-Tyr-Ser-M-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂여기서 M은 Met, Nle 및 Cys로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; (3) 다음과 같은 구조를 갖는 알파-MSH 동족체 R₁-W-X-Y-Z-R₂여기서 R₁은 Ac-Gly, Ac-Met-Glu, Ac-Nle-Glu 및 Ac-Tyr-Glu로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 여기서 W는 His, 및 D-His로 구성된 그룹으로부터 선택된다. ; 여기서 X는 Phe, D-Phe, Tyr, D-Tyr, 및 (pNO₂)D-Phe 로 구성된 그룹으로부터 선택된다. ; 여기서 Y는 Arg 및 D-Arg로 구성된 그룹으로부터 선택된다. ; 여기서 Z는 Trp 및 D-Trp로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 그리고 여기서 R₂는 NH₂, Gly-NH₂및 Gly-Lys-NH₂로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 그리고 (4) 알파-MSH 동족체는 다음 구조를 갖는 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-10

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-11

[Nle⁴, D-Phe⁷, D-Tr⁹]-알파-MSH_4-11

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-9
제1항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-10인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-11인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷, D-Trp⁹]-알파-MSH_4-11인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-9인 방법.
제1항에 있어서, 화합물 Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 Ac-Ser-Tyr-Ser-Cys-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 X가 D-Phe인 알파-MSH 동족체인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 R₁이 Ac-Nle-Glu 인 알파-MSH 동족체인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 R₁이 Ac-Nle-Glu 이고 X가 D-Phe 인 알파-MSH 동족체인 방법.
다음과 같은 그룹의 화합물을, 자극을 일으키기에 충분한 량으로 척추동물의 외피조직에 국소적용시킴을 특징으로 하는 척추동물이 피질메라노게이트를 자극 시키는 방법. (1) 다음과 같은 아미노산 구조를 갖는 알파-MSH : Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂; (2) 다음과 같은 구조를 갖는 알파-MSH 동족체 ; Ac-Ser-Tyr-Ser-M-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂; 여기서 M은 Met, Nle 및 Cys로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; (3) 다음과 같은 구조를 갖는 알파-MSH 동족체 R₁-W-X-Y-Z-R₂여기서 R₁은 Ac-Gly, Ac-Met-Glu, Ac-Nle-Glu 및 Ac-Tyr-Glu 로 구성된 그룹으로부터 선택된다 : 여기서 W는 His, 및 D-His로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 여기서 X는 Phe, D-Phe-Tyr, D-Tyr 및 (pNO₂)D-Phe로 구성된 구룹으로부터 선택된다; 여기서 Y는 Arg 및 D-Arg로 구성된 그룹으로부터의 선택된다 ; 여기서 Z는 Trp 및 D-Trp로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 그리고 여기서 R₂는 NH₂, Gly-NH₂및 Gly-Lys-NH₂로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 그리고 (4) 알파-MSH 동족체는 다음 구조를 갖는 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-10

[Nle⁴, D-Phe⁹]-알파-MSH_4-11

[Nle⁴, D-Phe⁷, D-Trp⁹]-알파-MSH_4-11

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-9
제12항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-10인 방법.
제12항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-11인 방법.
제12항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷, D-Trp⁹]-알파-MSH_4-11인 방법.
제1항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-9인 방법.
제12항에 있어서, 화합물 Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂인 방법.
제12항에 있어서, 화합물이 Ac-Ser-Tyr-Ser-Cys-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂인 방법.
제12항에 있어서, 화합물이 X가 D-Phe인 알파-MSH 동족체인 방법.
제12항에 있어서, 화합물이 R₁이 Ac-Nle-Glu 인 알파-MSH 동족체인 방법.
제12항에 있어서, 화합물이 R₁이 Ac-Nle-Glu 이고 X가 D-Phe 인 알파-MSH 동족체인 방법.
척추동물에 있어서 메라닌산생을 일으키기에 충분한 량의 다음 그룹의 화합물과 약제학적으로 국소적용할 수 있는 가능한 기제로 이루어진 척추동물에 있어서 메라닌산생을 자극시키기위한 화합물의 국소적용을 위한 약제학적 조성물의 제조방법. (1) 다음과 같은 아미노산 구조를 갖는 알파-MSH : Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂; (2) 다음과 같은 구조를 갖는 알파-MSH 동족체 ; Ac-Ser-Tyr-Ser-M-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂; 여기서 M은 Met, Nle 및 Cys로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; (3) 다음과 같은 구조를 갖는 알파-MSH 동족체 R₁-W-X-Y-Z-R₂여기서 R₁은 Ac-Gly, Ac-Met-Glu, Ac-Nle-Glu 및 Ac-Tyr-Glu 로 구성된 그룹으로부터 선택된다 : 여기서 W는 His, 및 D-His로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 여기서 X는 Phe, D-Phe-Tyr, D-Tyr 및 (pNO₂)D-Phe로 구성된 그룹으로부터 선택된다. ; 여기서 Y는 Arg 및 D-Arg 로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 여기서 Z는 Trp 및 D-Trp로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 그러기 여기서 R₂는 NH₂, Gly-NH₂및 Gly-Lys-NH₂로 구성된 그룹으로부터 선택된다 ; 그리고 (4) 알파-MSH 동족체는 다음 구조를 갖는 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-10

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-11

[Nle⁴, D-Phe⁷, D-Trp⁷]-알파-MSH_4-11

[Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-9
제22항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-10인 조성물의 제조방법.
제22항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-11인 조성물의 제조방법.
제22항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-11인 조성물의 제조방법.
제22항에 있어서, 화합물이 [Nle⁴, D-Phe⁷]-알파-MSH_4-9인 조성물의 제조방법.
제22항에 있어서, 화합물이 Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂인 조성물의 제조방법.
제22항에 있어서, 화합물이 Ac-Ser-Tyr-Ser-Cys-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂인 조성물의 제조방법.
제22항에 있어서, 화합물이 X가 D-Phe인 알파-MSH 동족체인 조성물의 제조방법.
제23항에 있어서, 화합물이 R이 Ac-Nle-Glu 인 알파-MSH 동족체인 조성물의 제조방법.
제24항에 있어서, 화합물이 R이 Ac-Nle-Glu 이고 X가 D-Phe 인 알파-MSH 동족체인 조성물의 제조방법.