KR900005606B1 - 복합 다당류 s-657의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
본 발명은 미생물의 다당류의 분야에 관한 것이다. 이 분야에서 특정 미생물의 공통된 특성은 세포의 복합 다당류(heteropolysaccharides)의 생산이다. 복합 다당류는 중합화되는 반복 단위를 형성하는 2종류 또는 그 이상의 단당류를 함유하는 고분자량의 통상 선형 탄수화물 중합체이다.
대부분 복합 다당류의 유용성은 수용액의 점도 및 유동성을 변화시키는 그들의 능력에 근거한다. 게다가 복합 다당류는 유화, 현탁, 안정화, 응결 등과 같은 2차 기능과 관련되어 있다. 예를들면 미합중국 특허 제4,326,052호 및 제 4,401,760호를 참조하라.
복합 다당류는 식량, 정(井 ; well) 천공, 농업 및 광범위한 기타 산업 적용시 널리 사용되고 있다. 이들 수용성 검(gums)의 상업적 수요는 최근 수십년에 걸쳐 크게 증가했다. 또한 새로운 산업 기술이 새로운 물리적 특성을 갖는 복합 다당류의 필요성을 창출하고 있다. 결국 상업적 수요와 결부된 상이한 기능성 범위를 갖는 복합 다당류에 대한 필요성은 새롭고 상이한 물리적 특성을 갖는 신규와 복합 다당류의 개발에 대한 필요성을 명백히 가르킨다.
그러므로 미생물 키산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)의 신규한 균주에 의해 생산되는, 신규한 복합 다당류를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 이 신규한 복합 다당류를 만드는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 부가적인 목적이다. 신규한 화합물을 만드는 미생물을 제공하는 것이 또다른 목적이다. 그밖의 목적은 신규한 복합 다당류를 함유하는 제형의 제공이다. 본 발명의 이런 목적 및 기타 목적이 확실한 설명에 의해 명백해질 것이다.
기본적으로 글루쿠론산 약 19중량% 및 중성의 당 람노스와 글루코스를 약 2:1의 몰비로 함유하는 탄수화물, 약 12%의 단백질 및 약 7%(O-아세틸로 계산)의 아실 그룹으로 신규한 복합 다당류가 선별된 탄소원상에서 키산토모나스 캄페스트리스의 신규한 균주의 활동에 의해 생산됨이 현재 발견되었다. 이 신규의 화합물은 키산토모나스 캄페스트리스의 신규한 균주를 적당한 수성 영양 배지에서 호기성 발효시시킴으로써 생산된다. 부다페스트 조약하에 이 유기체의 생물학적 순수 배양체의 기탁이 부여 번호 ATCC53159[기탁번호 : KFCC-10269, 기탁일 : 1986.9.16, 기탁기관 : 한국종균협회]로 아메리칸 타이프 컬춰 컬렉션(American Type culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A)에 1985년 6월 19일 이루어졌다. 여기에서 복합 다당류 S-657에 해당하는 이 복합 다당류는 수성계에서 바람직한 특성을 갖고 있으며 특히 유정(油井 : oil well)처리 유체 제형시 유용하다.
본 발명의 신규한 유기체는 캘리포니아의 유레카(Eurreka) 부근의 습지에서 취한 해조 샘플로부터 분리하였다. 본 유기체는 30℃에서 배양 4일후 YM 한천 평판으로부터 점착성의 콜로니로서 채취된다. 이어서 분리물을 영양 한천상에서 순수 배양한다.
플라스크 종자는 분리물의 영양 한천 배양물로 부터 개시한다. 이 종자를 사용하여 탄소원으로서 가수분해된 전분은 갖는 영양 배지가 있는 다른 플라스크에 접종한다.
배양후 점성의 비어(beer)를 함유하는지 및 이소프로필 알코올을 가함에 따라 섬유성 물질이 침전하는지 확인한다. 다른 플라스크 종자를 개시하고 이를 사용하여 검 생산성 여러 가지 영양 배지의 효과 측정 및 이 미생물의 가장 양호한 생육 배지 및 발효 조건을 측정한다.
복합 다당류 S-657은 유기체 ATCC 53159[기탁번호 : KFCC-10269, 기탁일 : 1986.9.16, 기탁기관 : 한국종균협회] 배양체의 접종을 통해 통제 조건하에 적당한 수성 영양 배지의 호기성 발효도중 생산된다. 배지는 동화성 탄소, 질소, 및 무기염의 자원을 함유한다.
통상 탄수화물(예: 글루코스, 프룩토스, 말토스, 수크로스, 키실로스, 락토스 등)은 영양 배지에서 동화성 탄소원의 자원으로서 단독 또는 공동으로 사용할 수 있다. 배지에 사용하는 탄수화물원 또는 원들의 정확한 양은 배지의 다른 성분에 따라 부분적으로 달라지나, 통상 탄수화물의 양은 배지의 약 2 내지 5중량%이다. 이들 탄소원은 배지에 독립적으로 사용하거나 또는 혼합할 수 있다.
일반적으로 많은 단백질성의 물질이 발효 공정을 위한 질소원으로 사용될 수 있다. 적당한 질소원은, 예를들면 효모 가수분해물, 1차 효모(primary yeast), 콩 곡분, 목화씨 분말, 카제인의 가수분해물, 옥수수 침출액, 알코올 박즙 또는 토마토 페이스트 등이다. 질소원은 단독 또는 공동으로 바람직하게는 수성 배지의 약 0.05 내지 0.2중량% 범위의 양을 사용한다.
배양 배지에 사용할 수 있는 영양 무기염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 인산염, 황산염, 염산염, 탄산염 등의 이온을 생성시킬 수 있는 통상의 염이다. 또한, 코발트, 망간, 철 및 마그네슘과 같은 미량 금속을 포함한다.
여기에서 기술되는 영양 배지는 사용할 수 있는 광역적인 배지를 단순히 설명하고 있으며 제한되는 것이 아님을 주지해야 한다.
다른 배지로서, S-657은 낮은 칼슘 이온 조건하에, 즉 탈이온수 또는 칼슘 이온이 거의 없는 약간의 다른 수성계[즉, 최종 발효조 브로뜨(broth)에서 검 1%당 Ca++약 4ppm이하]에서 생산될 수 있다.
발효는 약 25℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 수행한다; 그러나 최적 결과를 위해서 약 28℃ 내지 32℃의 온도에서 발효를 수행하는 것이 바람직하다. ATCC 53159 배양체의 생육 및 복합 다당류 S-657의 생산을 위한 영양 배지의 pH는 약 6 내지 8로 한다. 비록 S-657이 표면 및 수중 배양물에 의해 생산되나, 수중 상태에서 발효시키는 것이 바람직하다. 소규모의 발효는 통상 적당한 영양 배지에 배양체를 접종하고, 생산 배지에 전이한 다음, 진탕기 상에서 약 30℃의 항온으로 수일동안 발효를 진행시켜 수행한다.
발효는 1 또는 그 이상의 종자, 발전 단계를 거쳐 멸균 플라스크의 배지에서 개시한다. 종자 단계의 영양 배지는 탄소 및 질소원의 어느 적당한 배합일 수 있다. 종자 플라스크는 약 30℃의 항온실에서 1-2일 동안, 또는 생육이 만족스러울 때까지 진탕하고, 생성된 생육물의 일부를 사용하여 제 2 단계 종자 또는 생산 배지에 접종한다. 중간 단계 종자 플라스크를 사용할 경우 기본적으로 동일한 방법에 의해 전개시킨다; 즉 최종 종자 단계의 플라스크 내용물의 일부를 사용하여 생산 배지를 접종한다. 접종한 플라스크는 수일동안 항온에서 진탕하고, 배양기간의 말기에 플라스크의 내용물을 이소프로판올과 같은 적당한 알코올로 침전시켜 회수한다.
대규모 작업시 교반기 및 발효 배지의 통기 수단을 갖춘 적당한 탱크에서 발효시키는 것이 바람직하다. 이 방법에 따라 영양 배지는 탱크에서 만들고 온도를 약 121℃까지 가열하여 멸균시킨다. 냉각후 멸균된 배지를 미리 생육한 생산 배양체의 종자로 접종하고, 영양 배지를 교반 및/또는 통기와 온도를 약 30℃로 유지하면서 일정시간, 예를들면 2 내지 4일 동안 발효를 진행시킨다. S-657의 이 생산 방법은 대량 생산시 특히 적합하다.
ATCC 53159[기탁번호 : KFCC-10269, 기탁일 : 1986.9.16, 기탁기관 : 한국종균협회]에 의해 생상되는 복합 다당류는 기본적으로 탄수화물, 약 12%의 단백질 및 약 7중량%(O-아세틸로계산)의 아실 그룹으로 구성되어 있으며, 피루베이트가 거의 없다. S-657의 탄수화물 부분은 약 19%의 글루쿠론산(검의 중량 기준) 및 중성의 당 람노스 및 글루코스를 약 2:1 몰비로 함유한다.
약 7%의 아세틸 함량은 2가지 분리 기술로 측정한다. S-657검의 0.2% 수용액을 알칼리성 하이드록실아민 시약으로 처리하고 산성 염화제 2 철 시약으로 처리하며, 비색정량적 분석을 한다[참조:S.Hestrin(1949)J.Biol.Chem. 180, 249-261]. O-아실그룹은 O-아세틸로서 인지되며 액체 크로마토그래피로 측정한다.
S-657의 중성 당은 또한 여러가지 기술로 측정한다. 한가지 방법이 S-657 50mg을 1M H2SO41ml중에서 100℃로 4시간동안 가수분해하는 것이다. 냉각후 3mg/ml 키실로스 0.5ml를 내부 표준물질로서 가한다. 포화 Ba(OH)23ml를 가하고, 콩고적(Congo Red) 2방울을 가하며, 색이 적색으로 변할때까지 Ba(OH)2를 가하여 샘플을 중화시킨다. 원시분리(3000RPM에서 20분)후 모든 샘플의 상청액을 증발시킨다. 건조 샘플을 하이드록실아민 하이드로클로라이드 (건조 피리딘중 40mg/ml)0.1ml에 용해하고, 90℃로 45분동안 가열한다. 냉각후 무수 아세트산 0.1ml를 가하고 다시 샘플을 90°로 45분동안 가열한다. 그들의 알도노니트릴 아세테이스 유도체의 가스-액체 크로마토그래피로 당을 분리하고, 동정하며, 확실한 표준물질과 비교하여 정량한다. [J.K.Baird, M.J.Holroyde, and D.C.Ellwoood (1973) Carbohydr.Res.27, 461-467].
이 다당류의 다양한 중성 당은 또한 S-657 약 2mg을 0.5M 트리플루로아세트산(2ml)에 용해하는 2차 방법에 의해 특성을 알아낸다. 샘플을 밤새 100℃로 유지하고 농축 건조하며 물(2ml)에 용해한다. 나트륨 보로하이드라이드(25mg)를 가하고, 2시간후 용액을 도웩스(Dowex) 50(H+)로 처리하면 pH가 3.5로 떨어진다. 여과후 용액을 농축하고 메탄올(3×5ml)과 공동 증류시킨다. 잔사를 무수 아세트산(1ml) 및 피리딘(1ml)의 혼합물에 용해시키고, 1시간동안 100℃로 유지하며 농축한다. 톨루엔(3×5ml)과 공동 증류후, 잔사를 메틸렌 클로라이드에 용해하고 가스-액체 크로마토그래피로 분석한다.
[표 1]
다당류의 글루쿠론산 함량은 17% 염산으로 탈가복실화하고, 표준 수산화나트륨에서 이탈된 이산화탄소를 포집하며, 역적정(back tritration)해서 측정한다[B.L.Browning(1967)Methods of wood chemistry 2, 632-633]. 탈카복실화 방법은 S-657의 3가지 다른 샘플에 대해 17.6% 내지 19.6%의 값을 산출한다.
종이 전기영동을 상술한 중화된 산 가수분해물에 존재하는 우론산의 분리 및 분류시 사용한다. 이것의 분취량과 공지된 우론산 표준물질을 전기영동 종이에 적용하고, pH 2.7 완충액중에서 2시간동안 전기영동을 수행한다. 크로마토그램을 공기 건조하고, 질산온으로 염색하여 분리된 우론산의 위치를 확인한다. 단지 확인된 우론산 반점만이 글루쿠론산임이 밝혀졌다.
피루베이트의 부재는 S-657의 2mg/ml 용액 1ml를 배양관에 가하고, 0.2N HCL 1ml를 가하며, 100℃로 4시간동안 가열하여 측정한다. 가수분해물의 샘플 0.5ml를 환원된 디포스포피리딘 누클레오티드(NADH) 0.2ml 및 트리에탄올아민 2.4ml용액에 가한다. 흡광기에서 흡광도를 검출하고 피루베이트를 측정한다[Duckworth and Yaphe Chem. & Ind.(1970) p.747]. 특기할 만한 피루베이트는 검출하지 않았다.
질소 분석은 킬탈(Kjeldahl) 분해에 의해 수행하여 질소 약 1.5중량%를 측정하였다(3샘플에 대해 약 1.3% 내지 1.9). 고체 및 회분 분석은 S-657이 고체 약 94중량%(91.8-95.8%) 및 회분 약 9중량%(7.8-10.3%)를 함유하는 것으로 나타났다. 단백질 함량은 로우리 등의 방법[Lowry et al., J.Biol.Chem.,(1951),193,p,256]에 의해 표준물질로서 소의 혈청 알부민을 사용하여 약 12%(7.5%-14.5%)임이 밝혀졌다.
메틸화 분석은 투석 및 동결건조후 부분적으로 정제된 S-657의 샘플에 대해 수행한다. 샘플은 샌드포드 및 콘라드가 정리한 방법[Sandford & Conrad, (1966) Biochem.5 1508-1507]에 따라 메틸화한다. 그들의 아디톨(aditol)아세테이트와 같이 당의 o-메틸 에테르 유도체는 가스 크로마토그래피에 의해 분리하고, 컴퓨터로 확실한 표준물질과 비교해서 동정한다. 동정된 주요 메틸화 당이 하기 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
비록 여기에 기술한 복합 다당류의 분석 방법이 상술한 조성에 접근하는데 사용된 실제의 방법이라 해도, 그밖의 분석 방법이 당분야 숙련가에게 가능함이 이해되어야 한다. 기타 분석 방법의 활용은 복합 다당류의 동일한 특성화를 유출하여야 하나, 약간 상이한 양적 결과가 기록 될 수 있다.
복합 다당류 S-657은 수용액에서, 특히 매우 낮은 농도로 매우 높은 점도, 양호한 온도 안정성 및 양호한 기포 안정성면에서 유별난 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이로 인해 그것은 비대, 현탁, 유화, 안정, 윤활, 필름-성형, 또는 결합제로서 유용하다. S-657은 높은 점도와 탁월한 열역학적 및 기포 안정성이 바람직한 여러 가지 산업적, 석유 및 식량 적용시 효용성이 있다. 특히 그것은 하기 적용 및 제품에 용도를 갖는다:접착제, 벽 결합 시멘트, 보수성 그라우트 및 모르타르, 스파클링 화합물(Spackling compounds), 캔 밀봉제, 보일러 화합물, 라텍스 크리밍, 용접용 플럭스(welding-rod fluxes), 브레이싱 페이스트(braising pastes), 자기 유약 및 압출제, 세정제 및 연마제, 완구, 유제(라텍스, 아스팔트, 실리콘), 은의 쇠수, 종자 피복, 살충제 또는 제초제의 분무 방제, 유화 농축제 및 분산성 살충제와 제초제, 담배 결합제, 수기제 잉크, 석판 기초 용액, 가죽 가공, 수피복(hydroseeding), 섬유 인쇄 및 가공, 웨트-엔드 페이퍼(wet-end paper) 첨가물, 웨트-엔드 페이퍼 보존 및 성형 보조제, 미끄럼 방지 화합물, 주형-이탈제, 액체 수지, 슬러리 및 포장 화약, 석유 및 수정(井) 천공 진흙, 석유 워크오버(workover) 및 완성 유체, 석유 촉진 유체, 화장품, 약제학적 현탁제 및 유제.
이 검은 또한 젤리 및 기타 고도의 당계(sugar sysrems), 시트르산 기본 음료를 포함하는 청량음료, 아이스크림 및 요구르트를 포함하는 낙농제품, 샐러드 드레싱, 드라이 믹스, 글레이즈(glazes), 시럽, 푸딩, 녹말질식품, 캔 및 레토르트 식물 및 제과용 필링(fillings)과 같은 식품계에 효용성이 있다.
특히 가치있는 효용성은 석유 및 수정(水井) 처리 유체 및 진흙 분야에 있다. 복합 다당류 S-657은 정 처리 유체로서 사용하도록 특별히 제형된 수성 매질에 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.
정 처리 유체는 가스 또는 유정과 같이 정을 천공 및 사용하는 여러 단계에서 조작을 용이하게 하기 위해 사용하는 광범위한 스펙트럼의 매질에 해당한다. 예를들면 용어 " 정 처리 유체"는 순환성 천공 유체, 워크오버 및 완성 유체, 중심 윷체, 및 촉진 유체(수력 파손 및 산성화) 및 보강된 오일 회수 유체, 황산바륨, 무정형 실리카, 탄산칼슘, 벤토나이트, 애터펄자이트, 나트륨 메타설보네이트, 케브라코, 칼슘 리그노설포네이트, 석회, 황산칼슘, 토올유 스프, 조 및 디이젤유, 전분, 바이오사이드(biocides) 및 CM, 폴리아크릴 아마이드, 및 폴리아크릴레이트와 같은 중합체 등이다. 이 모든 화합물이 어느 특정 유체에 존재하지 않고, 오히려 화합물들이 훌륭한 조작자에 의해 수행할 특정 업무에 필요한 양으로 선택되는 것은 고마워할 일이다. 정이 천공되는 동안 및 이후 겪게 되는 지하의 상이한 저건 때문에, 정 처리 유체의 조정 및 한 유체를 다른 것으로 대치하는 것이 예상된다.
S-657은 증진된 현탁액을 이한 고도의 점성, 열 및 염 안정성, 전단 안정성 및 가열 냉각후 양호한 점도 회복성과 같은 특성을 나타내 정처리 유체에서 유동학적 개질제러서 바람직하다.
대표적인 정 처리 유체의 제형이 실시예4 및 5에 제공되고 있다. 이들 제형은 제한하고자 시도되는 것이 아니고, S-657로 제조할 수 있는 정 처리 유체의 가능 범위를 제안하고 있다. 복합 다당류 S-657은 그와 같은 제형에서 0.01 내지 1.0중량% 범위가 유용하다.
낮은 농도에서 S-657의 높은 점도는 복합 다당류가 보강된 오일 회수시 점성제로서 특히 유용하게 하고 있다. S-657은 그와같은 조작에서 0.01 내지 0.2중량% 범위, 바람직하게는 0.02% 내지 0.1%범위로 사용한다.
복합 다당류 S-657은 이 다당류의 현저한 특성이 있고 이것을 그밖의 복합 다당류보다 능가하도록 하는 용액 특성의 특정 측면을 갖고 있다. S-657은 하기 내용의 특성을 갖는다:
복합 다당류 S-657은 적당한 영양 배지를 키산토모나스 캄페스트리스의 새로운 균주인 신규의 미생물로 발효시켜 제조할 수 있다. 이 복합 다당류 제조시 사용하는 미생물의 생물학적으로 순수한 배양체가 부다페스트 조약하에 부여 번호 ATCC 53159[기탁번호:KFCC-10269, 기탁일:1986.9.16, 기탁기관:한국종균협회]로 아메리칸 타이프 컬춰 컬렉션(Rockville, Maryland, U.S.A.)에 1985년 6월 19일 기탁되었다.
문헌을 고찰한 후, 아직까지도 전형적인 것으로 사료되는 키산토모나스의 극편모운동의 형태학적 특성이 비정상적[즉, 측(lateral) 편모운동의 경우이므로 크게 축소된 분류학적 특성을 갖는다고 결정을 내렸다. 따라서 본 유기체는 적합한 특성을 갖고 있는 키산토모나스 캄페스트리스로 동정하였다.
전형적으로 키산토모나스 캄페스트리스는 순수한 발효 공정에 의해 산탄 검을 생산한다. 산탄 검의 탄수 화물부는 글루쿠론산 및 중성당 글루코스와 만노스를 함유한다. 산탄 검으로 고려할 수 없는 복합 다당류 S-657은 글루코스 람노스를 함유하나 만노스는 함유하지 않는다. 따라서 복합 다당류 S-657를 생산하는 키산토모나스 캄페스트리스의 신규 균주가 ATCC 53159 [기탁번호 : KFCC-10269, 기탁일 : 1986.9.16, 기탁기관 : 한국종균협회]로 인정을 받았다.
[A. 콜로니 형태의 특성]
영양 한천상에서 콜로니는 30℃에서 2일 후 약 0.5-1.0mm의 직경으로 나타난다. 콜로니는 둥글고, 흠이 없으며, 매끈하며, 색소가 밝은 황색이다. 영양 한천에 1% 글루코스를 가하면 콜로니는 점액성의 돔형으로 빛이 난다.
[B. 세포 형태의 특성]
세포 크기는 영양 한천상에서 약 0.8-1.0×2.0-3.0㎛이며, 쌍 및 장쇄 형태로 단독발생한다. 세포는 끝이 점점 가늘어지는 운동성의 그람-음성 간균이다. 편모는 주변성(peritrichous)이다.
[C. 생리학적 및 생화학적 특성]
하기의 표 3은 이 미생물의 동정시 사용한 많은 생화학적 및 생리학적 시험의 결과이다.
[표 3a]
[표 3b]
ATCC는 또한 세균 분리물 S-657의 분류학적 동정을 수행하였다. ATCC에 의해 이미 특정지워진 키산노모나스 캄페스트리스 균주에 대한 내부 ATCC 자료를 참고하였으며, 뿐만 아니라 출판[문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 1984, Vol. 1, Krug & Holt eds., Williams & Wilkins; D.W. Dye, N.Zealand J.Med., 5, P. 393-416(1962), 및 M.P.Starr, The Genus yanthomonas in the Prokaryotes, (1981)]에 있는 여러 가지 동정을 참고하였다.
이 키산토모나스 미생물에 대한 주변(peritrichous) 편모가 확인되는 경우, 최근 문헌[Palleroni, N.in Clarke, P.H. and M.H. Richmond(1975). Genetics and Biochemistry of Pseudomonas pg. 5-6, Willey & Sone; Palleroni, N. in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(1984), pg. 142, Volume a; Hugh, R. and G.Gilardi in Lennette, Balows Hausler and Truant, (1980), Manual of Clinical Microbiology, pg. 290, American Society for microbiology; Palleroni, N., M.Doudoroff, R.Y.Stanier, R.E.Solanes and M.Mendel(1970), Hournal of General Microbiology, Vol.60:215-231; Ulitzwr, S.(1975), Arch.microbiology, Vol 104:285-288; and Shinoda, S, and Okamoto, K.(1977), Journal of Bacteriology, Vol.129:1266-1271]를 참고하였다.
본 발명의 기타 태양은 이 명세서의 고려를 당분야 숙련가에게 분명히 할 것이다. 그러므로 본 명세서 및 실시예는 실례로서 취급되며, 본 발명의 진정한 영역 및 취지는 뒤에 나오는 청구범위에 의해서 시사되도록 되어있다.
[실시예 1]
YM 플라스크 종자를 30℃로 선회 진탕기상에 놓은 48-시간 영양 한천 배양체로부터 개시한다. 약 24시간 뒤 이 종자를 상용하여 탄소원으로서 3% 가수분해된 전분의 E1배지를 함유하는 플라스크에 접종한다. 이 배지를 또한 30℃의 선회 진탕기상에 위치시킨다. 약 72시간 뒤 이 플라스크가 점성 비어(beer)를 갖고, 99% 이소프로필 알코올 2용적을 가함에 따라 섬유성 침전물이 검출되는지 확인한다.
E1배지는 인산 이나트륨 5ｇ, 황산 마그네슘 0.1ｇ, 질산 암모늄 0.9ｇ, 프로모소이 100(Promosoy 100 ; Central Soya Chemurgy Division이 판매하는 콩 곡류의 효소적 분해물) 0.5ｇ, 덱스트로스 30ｇ 및 저장수 11를 함유한다. E1배지의 pH는 약 7.6-7.8이다.
그밖의 YM 종자 플라스크를 상기 방법으로 준비하여 24시간에 여러 가지 배지를 함유하는 5개의 플라스크에 접종하고, 이들 플라스크를 약 72시간 동안 선회 진탕기상에서 30℃로 배양하며, 이때 pH, 점도, 검수율 및 생성물 점도를 측정한다. 결과가 하기 표 4에 있다.
[표 4]
상기 결과로부터 알수 있는 바와 같이 가장 양호한 성장 배지는 3% 가수분해된 전분 및 홀 솔트(HoLe salt)를 갖는 E1이다.
[실시예 2]
복합 다당류 S-657의 대량 생산시 발효 방법이 제공되고 있다.
YM 브로뜨(YM broth ; Difco) 100ml를 함유하는 500ml 에를렌마이어 플라스크를 48시간-시간 영양 한천 평판으로부터 1루프량의 S-657 세포를 접종한다. 플라스크를 400rpm으로 맞춘 선회 진탕기에서 30℃로 24신간동안 배양한다. 1% 접종물을 종자 배지 각각 100ml를 함유하는 2개의 500ml 에를렌마이어 플라스크에 접종한다. 종자 배지는 다음을 함유한다.
배지를 저장수로 제조한다. 홀 솔트는 탈이온수 또는 증류수 1ℓ에 하기 성분을 가하여 제조한다:
이들 플라스크를 400rpm의 선회 진탕기 상에서 로 24시간 동안 배양하고, 글들을 사용하여 동일 배지 3000ml(최종 용적)를 함유하는 5l 발효조 용기를 접종한다. 발효를 30℃ 및 1l/분의 통기율로 통제한다. 교반은 400rpm에서 개시하고 이후 증가시켜 혼합을 양호하게 한다. 24시간에 이 종자 약 2.5l를 사용하여 하기 배지 50l(최종 용적)를 함유하는 70ℓ 발효조를 접종한다.
온도는 30℃로 유지하고, 25시간까지는 10ℓ/분의 통기율로 하며 발효시 20ℓ/분의 조정한다. 발효가 지속되는 동안은 그 비율을 유지한다. pH는 자동 pH 조절 시스템을 사용하며 필요할 경우 40% KOH를 가하여 6.0 이상으로 조절한다. 교반은 초기에 300rpm으로 정하였으나, 25시간에는 550rpm, 48신간에는 750rpm 및 72시간에는 800rpm으로 증가시킨다. 발효가 지속되는 동안 800rpm으로 유지한다. 이 발효의 결과가 하기 표 5에 있다.
[표 5]
40% KOH 총 150ml를 사용하여 발효도중 pH를 조절한다. 발효액을 약 75℃로 15분 동안 가열하고 이어서 약 30℃로 냉각한다. 발효액을 99% 이소프로판올 3용적에 가한다. 섬유성 물질로 침전된 다당류는 체를 사용하여 용이하게 회수한다. 섬유를 통풍 트레이(tray) 건조기에서 140℉로 2.5시간 동안 건조하고 분말로 제분한다.
[실시예 3]
분리물 S-657의 특정 생리학적 및 생화학적 특성을 버게이의 1984년 편람(Bergey's 1984 Manual) 및 ATCC에 의해 이미 특성화된 28균주의 결과에서 동정된 키산토모나스 캄페스트리스의 전형적인 특성과 비교하여 분류 동정을 수행한다. 결과가 하기 표 6에 나와 있다.
[표 6]
[실시예 4]
해수 진흙 조성
복합 다당류 S-657은 유정 천공시 진흙에 사용한다. 폐수 진흙에 대한 조성 및 자료는 하기와 같다.
S-657 1파운드
해수 1배럴(42갤론)
[실시예 5]
담수 벤토나이트 진흙
복합 다당류 S-657이 기능성인 기타 천공제형은 다음과 같다:
S-657 1파운드
벤토나이드 7파운드
담수 1배럴
[실시예 6]
염을 함유하는 시스템에서의 용해성
복합 다당류는 여러 가지 염을 함유하는 시스템에 용해성이다. S-657 1파운드를 하기 수성 성분 1배럴(42갤론)과 혼합하고 Fann 35점도를 하기와 같이 측정한다.
Claims (7)
- 미생물 키산토모나스 캄페스트리(Xanthomonas Campestris) AiCC 53159[기탁번호 : KFCC-10269, 기탁일 : 1986.9.16, 기탁기관 : 한국종균협회]를 수성 영양 배지에서 동화성 탄소원의 호기 발효에 의해 생육시키고, 주로 탄수화물, 약12%의 단백질 및 약 7%(O-아세틸로 계산)의 아실 그룹을 함유하며, 탄수화물 부분은 약 19%의 글루쿠론산, 및 중성당 람노스 및 글루코스를 약 2:1의 몰비로 함유하는 복합 다당류(heteropolysacchariodle S-657)를 회수함을 특징으로하여 복합 다당류 S-657을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 동화성 탄소원이 탄수화물인 방법.
- 제2항에 있어서, 탄수화물이 가수분해된 전분인 방법.
- 제1항에 있어서, 영양 배지에 칼슘 이온이 실질적으로 없는 방법.
- 주로 탄수화물, 약 12%의 단백질 및 약 7%(O-아세틸로 계산)의 아실 그룹을 함유하고, 탄수화물 부분은 약 19%의 글루쿠론산, 및 중성당 람노스 및 글루코스를 약 2:1의 몰비로 함유함을 특징으로 하는 복합 다당류 S-657.
- 제5항에 있어서, 제1항의 방법에 의해 제조된 생성물.
- 복합 다당류 S-657 약 0.01 내지 약 1.0중량% 및 물로 이루어진 웰(well) 처리유체.
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