KR860000274B1

KR860000274B1 - 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR860000274B1
Application number: KR8203485A
Authority: KR
Inventors: 델라 발레 프란세스코; 로메오 아우렐리오
Original assignee: 델라 발레 프란세스코; 피디아 에스. 피. 에이.
Priority date: 1981-08-04
Filing date: 1982-08-03
Publication date: 1986-03-26
Also published as: PT75369B; IT1217327B; AU8672782A; YU168882A; FR2511005B1; ES514684A0; PT75369A; GR77228B; FR2511005A1; KR840000905A; BE894024A; CH663617A5; EP0072722A2; EP0072722B1; DK151967B; FI822673L; PL237770A1; DE3271547D1; ATE20238T1; ES8403925A1

Abstract

내용 없음.

Description

갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 제조방법

본 발명은 신경계통질환의 치료에 사용되는 갱그리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유도체는 특히 의약조성물로서 사용되어지는 바 이러한 본 발명의 유도체가 함유된 의약조성물은 신경발육을 자극하여 신경재생을 촉진시키는데 효험이 있어서 사고에 의한 신경계통의 질환이나 손상된 신경조직의 질환을 치료하는데 사용된다.

갱글리오사이드는 세라미드(Ceramide)와 시알산(Sialic Acid)부위가 탄수화물 부위와 결합되어 있는 구조로된 글리코스핀고리피드의 일종으로서, 이중 탄수화물 부위는 한개 이상의 갈락토오스나 글루코오스와 한개이상의 N-아세틸글루코사민이나 N-아세틸 갈락토사민을 함유하고 있다.

이러한 갱글리오사이드의 일반적 구조는 다음과 같이 표시될 수 있는바,

이때, 각 부위는 모두 글루코시드 결합으로 연결되어 있다.

보통 다수의 갱글리오사이드는 신경조직, 특히 뇌조직에 풍부하다는 것이 확인되었으며, 갱글리오사이드에서 발견되는 시알산중 가장 중요한 것으로는 N-아세틸-뉴라민산(NANA)과 비록 작은 양이지만, N-글리콜릴뉴라민산이 있다는 것이 연구결과 나타났다.

이와같이 확인된 다수의 갱글리오사이드중에서 다음과 같이 국제심볼로 표시된 갱글리오사이드류는 소의 뇌조직에서 추출된 갱글리오사이드 혼합물중에 다량으로 존재함이 발견되었다.

이때, Glc는 글루코오스를 나타내고, GalNAC는 N-아세틸갈락토사민을 나타내며, Gal은 갈락토오스를 나타내고, NANA는 N-아세틸-뉴라민산을 나타내며, ( )의 %는 소의 뇌조직으로부터 추출한 갱글리오사이드 혼합물 중에서 각 갱글리오사이드들이 차지하는 비율을 나타낸 것이다.

갱글리오사이드류가 신경계통에서 중요한 역할을 하고 있다는 것에 대해서는 이미 잘 알려져 있으며, 최근에는 갱글리오사이드가 말초신경계통 질환과 중추신경계통 병리의 치료에 유효함이 입증되었다.

[Acta psychiat. Scand, 55, 102 (1977) ; Eur. Med. Phys. , 13, 1, (1977) ; Ric. Sci. Educ. Perm. 9, 115, (1978) ; Adv. Exp. Biol. 71, 275, (1976) ; Electromygr. Clin Neurophysiol. , 19, 353, (1979) ; Minerva, 69, 3277, (1978) ; Minerva Stomat, 27, 177 (1978) ; Med. del Lavoro, 68, 296 (1977) ; Brain Res. 197, 236 (1980)].

갱글리오사이드의 치료작용은 주로 신경조직에서 발육현상을 자극하고 (Na⁺, K⁺) ATPase(Brain Res. , 197, 236, (1980) ; Leon et al, J. of Neurochem, 37, 350, (1981)와 같은 신경자극의 유도에 관계되는 막(膜)요소를 활성화 시키는 것으로 되어있으며, 이와같은 갱글리오사이드에 의해 자극받은 신경발육은 손상된 신경조직을 재생시키고 치유하게 되는 것이다.

따라서 본 발명자는 신경계통질환을 치료하는데 갱글리오사이드보다 더욱 효과가 있을지 모르는 화합물을 발견하고자 연구를 계속한 결과 본 발명에 따른 어떤 갱글리오사이드 유도체가 신경 발육을 자극하며(Na⁺, K⁺) ATPase와 같은 신경자극의 유도에 관계되는 막효소를 활성화시키는데 갱글리오사이드 자체보다 더 활성적이라는 것을 밝혀냈다.

그중 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체가 신경계통질환의 치료에 특히 활성적이고 갱글리오사이드 기본 물질보다 더 활성적이라는 것이 발견되었으며, 시험관내 및 생체내 실험결과, 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 신경발육의 자극과 신경유도에 관계되는 (Na⁺, K⁺) ATPase 막효소의 활성화에 있어서 갱글리오사이드 기본물질보다 더 우수한 것으로 밝혀졌다.

갱글리오사이드의 가능한 분자내 에스테르 유도체중 오직 일부만이 현재까지 분리되었으며, 이들은 뇌조직내에 극히 소량으로만 존재한다. 갱글리오사이드의 분자내 에스테르는 시알산부위의 카르복실기와 동일한 갱글리오사이드 분자내의 다른 인접한 시알산이나 하나의 탄수화물 부위의 수산기와의 반응에 의해서 형성된다. (J. of Neurochemistry, 34, 1351, (1980), Bull. of Molecular Biology and Medicine, 3, 170, (1978))

예를 들어 갱글리오사이드의 가능한 분자내 에스테르 유도체중 하나는 다음 구조식(I)로 나타낼수 있다.

상기 식 (I)에서 시알산부위중 R은 H 또는 OH이고, 세라미드기중 R₁은 올레인산, 스테아린산 또는 리놀레인산과 같은 지방산이다.

상기갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체 (I)는 시알산의 카르복실기가 탄수화물 부위중 하나, 특히 갈락토오스의 수산기에 에스테르 결합된 유도체의 일 예로서, 시알산과 탄수화물 부위사이의 정상적인 글루코시드결합에 따른 분자내 에스테르 결합의 형성은 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체 구조의 특징인 전형적인 5또는 6원환으로 된 락톤환을 형성하게 한다.

상기구조식(I)은 예로서 나타낸 것으로서, 5이상의 환구조를 갖는 다른 락톤환은 시알산의 카르복실시가 탄수화물 부위의 수산기와 에스테르 결합할때 형성될 수 있음을 유의해야 한다.

이상에서 지적했던 대로 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 시알산의 카르복실기가 기본이 되는 초기의 갱글리오사이드에 글리코시드 결합하고 있는 인접 시알산에 에스테르 결합할때 역시 형성될 수 있는데 그 구조는 다음식(Ⅱ)로 나타낼 수 있다.

상기식에서 R₂는 시알산부위와 글루코시드 결합하고 있는 탄수화물 부위를 나타낸다.

가능한 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체중 또다른 것은 식(Ⅲ)으로 나타낼 수 있다.

상기식에서 R₃는 인접하고 있는 시알산이 에스테르 결합된 탄수화물 부위를 나타낸다.

구조식(Ⅲ)에서는 시알산이 인접한 시알산과 에스테르 결합을 하며 동시에 이 인접한 시알산 자체가 탄수화물 부위와에스테르 결합을 하고 있는 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체를 나타낸다.

그러므로 상술한 유도체의 많은 변형체가 형성될 수 있으며, 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 한개이상의 세라미드와 한개이상의 시알산부위와 탄수화물부위로 형성되는 것이 일반적이고, 이 경우 하나 이상의 시알산이 탄수화물 부위에 결합되고 하나 이상의 시알산이 인접한 시알산과 에스테르 결합한다.

따라서 다수의 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체가 가능하다.

[제조 방법]

종래 알려진 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 제조방법은 다음과 같다.

1. 초산 또는 트리클로르초산 중에서 갱글리오사이드를 단순히 방치함으로써 분자내 에스테르를 형성.

(Sphingolipids, Sphinglipidoses and Allied Disorders, Adv. Exp. Med. Biol. 19, 95 (1972) ; J. Neu-rochem. 28, 1133, (1977))

이 방법에 따르면 갱글리오사이드에 대한 초산의 비율은 아주 높게 조작할 필요가 있으며, 갱글리오사이드의 완전한 성분치환이 달성되지 않는다. 이 때문에 최종적으로 정제공정이 필요하게 되는데 이는 세파덱스(Sephadex)와 같은 이온교환수지에 의해 이루어진다.

2. 수성매체중에서 갱글리오사이드와 수용성 카르보디이미디와의 반응(Carbohydr. Res. 41, 344, (1975)).

이 방법에 의하면 반응이 수성매체중에서 행하여지기 때문에 역시 갱글리오사이드의 완전한 성분치환이 달성되지 않는다. 또한 이 방법은 수율이 아주 낮으며 분자내 에스테르 생성물을 최종적으로 정제시킬 필요가 있게 된다.

따라서 본 발명에 따른 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 개선된 제조방법으로는 높은 수율의 유도체를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법은 무수(無水)상테에서 비수성유기 용매안에서 락톤화 시약과 함게 갱글리오사이드를 반응시키는 것인바, 본 발명에 사용되는 적합한 유기용매로는 디메틸설폭사이드(DMSO)와 디멜틸포름아미드(DMF), 설포란, 테트라하이드로퓨란, 디메톡시에탄과 피리딘 또는 이들의 혼합물들이 있으며, 락톤화시약으로는 디싸이클로헥실 카르보디이미드와 벤질이소프로필카르보디이미드 및 벤질에틸카르보디이미드와 같은 유기용매에 녹는 카르보디이미드와 2-클로로-1-메틸-피리디니움 염. 에톡시아세틸렌과 우드워드시약(N-에틸-5-페닐이속사줄리움-3'-설포네이트)이 적당하다.

수성매체에서 카르보디이미드와 함께 갱글리오사이드를 반응시키는 종래의 방법에서는 분자내 에스테르 유도체가 매우 낮은수율로 얻어지는 반면, 비수성매체에서 갱글리오사이드를 반응시키는 본 발명의 방법은 매우 높은 수율 즉, 종래의 방법에서 가능했던 것보다도 훨씬 많은 양의 원하는 분자내 에스테르 유도체의 수율을 얻게 된다.

본 발명의 방법에서 사용되는 초기 갱글리오사이드 화합물은 포유동물의 뇌조직(그중에서도 소의 뇌조직이 가장 적합함)으로 부터 추출된다.

다음의 실시예들은 본 발명의 방법에 따라 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체를 제조하는 방법을 나타낸 것이다.

[실시예 1]

소의 뇌 혼합물 5g을 DMSO에 용해시킨후 여기에 무수스티렌형수지(술폰산)(50-100메쉬, H⁺항) 4g을 첨가하고, 실온에서 30분간 교반시켯다.

상기 용액을 이온교환수지로 처리하면 갱글리오사이드의 카르복실레이트기가 모두-COOH(카르복실)기로 전환되는데, 카르복실레이트기의 완전전환은 원자흡수와 같은 적당한 물리적 분석법에 의해 확인되어진다.

다음에 수지는 흡인여과시키고, 이때의 여액을 1.5g의 디싸이클로헥실카르보디이미드로 처리하여 1시간동안 방치시키는데 이때 침전된 디싸이클로헥실우레아는 여과하여 제거시키고 남은 용액은 아세톤 100㎖로 처리하여 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체를 침전시켜 얻게되는데 이때의 수득율은 4.6g으로서 이론치의 약 90-95%이다. 분자내 에스테르 유도체의 존재여부는 적외선 분광기(IR분광기) 및 얇은 막크로마토그래피에 의해 확인되어진다.

IR분광기 : KBr필렛상에서 실시하게 되는데, 에스테르락톤 결합은 1750㎝^-1에서 밴드를 나타냄.

얇은막 크로마토그래피 : 실리카겔상에서 실시하게 되는데, 용매계는 CHCl₃/MeOH/0.3% CaCl₂(55 : 45 : 10V/V/V)이며 분자내 에스테르 혼합물의 Rf치는 0.7-0.85범위로써, 최종생성물의 Rf치는 초기물질들의 혼합물의 Rf치보다 크게 되는데 크로마토그래피결과를 볼때 초기물질이 존재하고 있지 않음을 알 수 있다.

1시간동안 60℃에서 0.1N 탄산나트륨 용액으로 처리하면 에스테르 결합이 끊어지고 갱글리오사이드의 본래의 초기물질 혼합물이 얻어질 수 있다.

[실시예 2]

갱글리오사이드 혼합물(나트륨염) 9g을 증류수 80㎖에 용해시킨 다음, Dowex 50W×8(100-200 메쉬트리에틸 암모니움형) 20g으로 채워진 칼럼을 통과시켰다. 고 진공에서 무수화시킨 상기 생성물을 트리에틸아민 8㎖을 함유하고 있는 무수 테트라하이드로퓨란 200㎖에 초음파기 욕조를 이용하여 용해시키고, 이 용액을 45℃의 항온으로 유지하면서 계속 교반시키면서 2-클로로-1-피리디니움염 40mM(음이온은 예컨대 요오드화물, 톨루엔-4-설포네이트, 트리플루오로에탄 설포네이트 등임)은 함유하고 있는 무수 테트라하이드로퓨란 600㎖에 서서히 첨가시킨다.

상기 반응을 45℃의 온도에서 18시간동안 실시한다.

과잉시약은 여과시켜 제거하고 혼합물을 질소기류하에 농축시킨후 잔사를 클로로포름/메탄올(1 : 1) 90㎖에 다시 용해시켜 450㎖의 아세톤 중에서 침전시켜, 얻어진 생성물은 최종적으로 고 진공하에서 건조시키는데 이때의 수득율은 7.9g으로서 이론치의 약 89,7%이었다.

얇은막 크로마토그래피 : 실리카겔프레이트상에서 실시하게 되는데, 용매계는 클로로포름/메탄올/염화칼슘0.3% (55 : 45 : 10)이며 분자내 에스테르혼합물의 Rf치는 0.7-0.85범위로써 최초생성물의 Rf치는 초기물질들의 혼합물의 Rf보다 크게되는데 크로마토그래피 결과로 볼때 초기물질이 존해하고 있지 않음을 알수있다.

60℃에서 1시간동안 0.1N의 탄산나트륨 용액으로 처리하면 에스테르 결합이 끊어지고 갱글리오사이드의 본래의 초기 물질혼합물이 얻어질 수 있다.

KBr펠렛상에서 실시된 갱글리오사이드 혼합물의 분자내 에스테르의 IR스팩트럼은 1750㎝^-1의 파장에서 전형적인 에스테르 흡수밴드를 보여준다.

[실시예 3]

CM₁(나트륨염) 8g을 증류수 80㎖에 용해시키고 Dowex 50wx 8(100-200메쉬 트리에틸 암모니움형) 10g으로 채워진 컬럼을 통과시켰다. 고 진공하에서 무수화된 상기 생성물을 트리에닐아민 4㎖을 함유하고 있는 무수테트라하이드로퓨란 200㎖에 초음파기욕조를 이용하여 용해시키고, 이용액을 45℃의 항온에서 계속 교반시키면서 200mM의 2-클로로-1-메틸-피리디니움 염(음이온은 예컨대 요오드화물, 톨루엔-4-설포네이트, 트리플루오로메탄 설포네이트 등임)을 함유하고 있는 무수 테트라하이드로퓨란 600㎖에 4시간동안 서서히 첨가시킨다.

상기 반응을 45℃의 온도에서 18시간동안 실시한다. 과잉의 시약은 여과시켜 제거하고 혼합물을 질소기류하에 농축시킨후 잔사를 클로로포롬 메탄올(1 : 1) 80㎖에 용해시키며, 400㎖의 아세톤 중에서 침전시켜 얻어진 생성물은 최종적으로 고진공하에서 건조시키는데, 이때의 수득율은 7.0g으로서 이론치의 약 88.4%이었다.

얇은막 크로마토그래피 : 실리카겔 플레이트상에서 실시하게 되는데, 메탄올/염화칼슘 0.3%(55 : 45 : 10)이며, 최종생성물의 Rf치는 0.70으로써 초기물질들의 혼합물의 Rf(0.65)보다 크게 되는데, 크로마토그래피 결과를 볼때 초기물질이 존재하고 있지 않음을 알수 있다.

60℃에서 1시간동안 0.1N의 탄산나트륨 용액으로 처리하면 에스테르결합이 끊어지고 갱글리오사이드의 본래의 초기 물질혼합물이 얻어질 수 있다.

KBr펠렛상에 실시된 CM₁의 분자내 에스테르의 IR스팩트럼은 1750㎝^-1의 파장에서 전형적인 에스테르흡수밴드를 보여준다.

[실시예 4]

갱글리오사이드혼합물(나트륨염) 9g을 증류수 80㎖에 용해시켜 Dowex 50W×8 (100-200메쉬 피리디니움 염형) 20g으로 채워진 칼럼에 통과시켰다. 고진공에서 무수화시킨 생성물은 4.2g(60mM)의 에톡시아세틸렌이 함유되어 있는 무수 테트라하이드로퓨란 800㎖에 용해시키고, 이 혼합물을 3시간동안 환류시키는데, 환류기는 -10℃의 온도로 냉각시키고 무수화밸부를 설치한다.

용매와 과잉의 에톡시아세틸렌을 제거시킨다음 잔사를 클로로포름/메탄올(1 : 1) 80㎖에 용해시키며 400㎖의 아세톤 중에서 침전시키는데 이때의 수들율은 8.1g으로서 이론치의 약 92.0%이었다.

얇은막 크로마토그래피 : 실리카겔플레이트상에서 실시하게 되는데, 용매계는 클로로포름/메탄올/염화칼슘 0.3%(55 : 45 : 10)이며, 분자내 에스테르 혼합물의 Rf치는 0.7-0.85범위로써 최종생성물의 Rf치는 초기 물질들의 혼합물의 Rf치보다 크게되는데 크로마토그래피 결과로 볼때 초기 물질이 존재하고 있지 않음을 알수 있다.

60℃에서 1시간동안 0.1N의 탄산나트륨 용액으로 처리하면, 에스테르 결합이 끊어지고 갱글리오사이드 본래의 초기물질 혼합물이 얻어질 수 있다.

KBr펠렛상에서 실시된 갱글리오사이드의 분자내 에스테르의 IR스팩트럼은 1750㎝^-1의 파장에서 전형적인 에스테르 흡수밴드를 보여준다.

[실시예 5]

C_M1(나트륨염) 8g을 증류수 80㎖에 용해시킨 다음 Dowex 50Wx8(100-200메쉬 피리디니움형) 10g으로 채워진 컬럼을 통과시켰다. 고진공에서 무수화시킨 생성물을 2.1g (30mM)의 에톡시아세틸렌을 함유하고 있는 무수테트라하이드로퓨란 800㎖에 용해시키고, 이 혼합물을 3시간동안 환류시키는데, 환류기는 -10℃의 온도로 냉각시키고 무수화밸브를 설치한다.

용매와 과잉의 에톡시아세틸렌을 제거시킨 다음 잔사를 클로로포롬/메탄올(1 : 1) 80㎖에 용해시키며 400㎖의 아세톤 중에서 침전시키는데, 이때의 수득율은 7.2g으로서 이론치의 약 91.0%이었다.

얇은막 크로마토그래피 : 실리카겔플레이트 상에서 실시하게 되는데 용매계는 클로로포롬/메탄올/염화칼슘 0.3%(55 : 45 : 10)이며, 최종 생성물의 Rf치(0.70)는 초기화합물의 Rf치(0.65)보다 크게되며 크로마토그래피 결과로 볼때 초기물질이 존재하고 있지 않음을 알수 있다.

60℃에서 1시간동안 0.1N의 탄산나트륨 용액으로 처리하면 에스테르 결합이 끊어지고 갱글리오사이드 본래의 초기 물질혼합물이 얻어질수 있다.

KBr펠렛상에서 실시된 G_M1의 분자내 에스테르의 IR스팩트럼은 1750㎝^-1의 파장에서 전형적인 에스테르 흡수밴드를 보여준다.

[실시예 6]

갱글리오사이드 혼합물(나트륨염) 9g을 증류수 80㎖에 용해시킨 다음, Dowex 50wx 8 (100-200메쉬 피리디니움형) 20g으로 채워진 컴럼을 통과시켰다. 고진공에서 무수화 시키고 200㎖의 무수피리딘에 용해시킨 생성물을 5.52g (10mM)의 양성이온 우드워드 시약(N-에틸-5-페닐이속사줄리움-3'-설포네이트, Woodward et al. , J . Am. Chem Soc. 83 , 1010-1012, 1961)현탁액이 함유되어 있는 200㎖의 무수피리딘에 첨가시키며 이반응 혼합물을 실온에서 10일간 교반시킨다.

과잉의 시약을 여과시키고 용매를 완전히 제거시킨 다음, 잔사를 클로로포롬/메탄올(1 : 1) 90㎖에 용해시키며 450㎖의 아세톤 중에서 침전시키는데 이때의 수득율은 7.2g으로서, 이론치의 약 81.8%이었다.

얇은막 크로마토그래피 : 실리카겔 플레이트상에서 실시하게 되는데 용매계는 클로로포롬/메탄올/염화칼슘 0.3%(55 : 45 : 10)이며 분자내 에스테르 혼합물의 Rf치는 0.7-0.85로써 최종생성물의 Rf치는 초기물질의 Rf치보다 크게되는데 크로마토그래피 결과로 볼때 초기물질이 존재하고 있지 않음을 알수 있다.

60℃에서 1시간동안 0.1N의 탄산나트륨 용액으로 처리하면 에스테르 결합이 끊어지고 갱글리오사이드 본래의 초기물질 혼합물이 얻어질 수 있다.

[실시예 7]

G_M1(나트륨염) 8g을 증류수 80㎖에 용해시킨다음 Dowex 50wx 8 (100-200메쉬 피리디니움형) 10g으로 채워진 컬럼을 통과시켰다. 그진공에서 무수화시켜 200㎖의 무수피리딘에 용해시킨 생성물을 1.26g(5mM)의 양성이온 우드워드시약(N-에틸-5-페닐이속사줄리움-3'-설포네이트) 현탁액이 함유되어 있는200㎖의 무수피리딘에 첨가시키며 이 반응 혼합물을 실온에서 10일동안 교반시킨다.

과잉의 시약을 여과시켜 제거하고 용매를 완전히 제거시킨 다음 잔사를 클로로포롬/메탄올(1 : 1) 80㎖에 용해시키며 400㎖의 아세톤 중에서 침전시키는데, 이때의 수득율은 6.3g으로서 이론치의 약 79.5%이었다.

얇은막 크로마토그래피 : 실리카겔 플레이트상에서 실시하게 되는데 용매계는 클로로포롬/메탄올/염화칼슘 0.3%(55 : 45 : 10)이며 최종 생성물의 Rf치(0.70)는 초기물질의 Rf(0.65)보다 크게되는데 크로마토그라피 결과로 볼때 초기물질이 존재하고 있지 않음을 알수 있다.

60℃에서 1시간동안 0.1N의 탄산나트륨 용액으로 처리하면 에스테르 결합이 끓어지고 갱글리오사이드 본래의 초기물질 혼합물이 얻어질 수 있다.

KBr펠렛상에서 실시된 G_M1의 분자내에스테르의 IR스팩트럼은 1750㎝^-1파장에서 전형적인 에스테르밴드를 보여준다.

[약리학적 성질]

갱글리오사이드류의 일부 분자내 에스테르 유도체와 이들 유도체의 제법은 종래방법에 기술되어 있는 반면, 분자내 에스테르 유도체의 생리학적 작용 또는 가능한 약리학적 용도에 대한 발표는 종래에 없었다. 그러나 본 발명에 의하여 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체는 신경계통 질환의 치료에 대단히 유효한 작용이 있음이 밝혀졌으며 사실상 갱글리오사이드 자체의 효과보다 훨씬 우수하다. 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 질병이나 사고로 인한 말초 및 중추신경계통의 질환을 포함한 각종의 신경질환의 치료에 사용될수 있으며, 약제조성물은 치질수술과 같은 신경에 영향을 미치는 수술에 있어서 수술후 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 주제인 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 우수한 약리학적 성질은 다음 실험을 통해 갱글리오사이드류와 비교하여 평가될 수 있다.

1……페오크로모시토마세포선(PC₁₂)에서 신경발육

2……뉴론막(Na⁺, k⁺)ATPase작용

3……혼미를 수반하는 망막전도의 회복

1. PC₁₂의 신영발육엑 대한 갱글리오사이드의 분자내에스테르 유도체의 효과(치료 및 방법)

신경발육 정도는 국소화된 뉴론변이로서 측정되는바 상기효과를 나타내는 갱글리오사이드 분자의 생화학적 메카니즘은 시험관내에서 세포배양물 모델로써 연구평가 될수 있다.

(Dr. P. Calissano에 의해 제공된 1A Subclone으로부터 발생된 PC₁₂세포선(C. N. R.-Laboratorio di Biologia Cellulare-Roma, Italy)) ("Gangliosides in Neurological and Neuromuscular Function, Develo-pment and Repair", Ed. by M.M. Rapport and A. Gorio, Raven Press, New York (1981)).

이 모델에서 갱글리오사이드 또는 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체는 신경성장인자(NGF), 즉 신경발육을 자극하는 PC₁₂변이의 특수유도인자와 함께 PC₁₂배양물에 첨가된다. 갱글리오사이드에 의해 자극되는 신경발육은 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체에 의해 자극되는 것과 비교될 수 있다.

특히 세포(100,000/플레이트)는 헤라에우스 배양기내에서 37℃의 온도로 유지되었고 (5% CO₂및 95%가 습공기) 다음과 같은 배양매체하에서 콜라겐-피막조직배양물, 60㎜ 인테그리드 활콘플레이트에서 배양하였다.

배양매체 : 85% RPM 1640(Gibco), 10% 가열-불활성화시킨 말의 혈청(Gibco), 5% 송아지의 혈청(Gibco), 50U/㎖페니실린 및 25㎖/㎖ 스트렙토마이신

상기 배양매체는 48시간마다 바꾸어 주었다.

이러한 조건에서 세포분열은일어나지만 뉴라이트를 형성하지 않는다. NGF(50ng/㎖)를 첨가하면 세포가 증식하는 것은 중단되고, 뉴라이트가 형성되며 5-10일내에 분화되게 된다. 이 효과는 5일부터 시작해서 격일로 뉴라이트와 세포수를 계산하여 평가하였다.

갱글리오사이드와 이들의 유도체(1mM)는 NGF와 함께 동시에 배양매체에 첨가되었으며, 그들 효과는 뉴라이트를 함유한 세포수의 산출에 의해 7일 및 9일째 평가되었다.

[결과]

신경발육에 대한 비교연구의 결과는 다음 표 1에 요약된 바와 같다.

[표 1]

PC₁₂세포중에서 신경발육에 대한 갱글리오사이드 유도체의 효과

상기 결과로부터 본 발명에 따른 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 신경발육을 자극하는 능력을 가지고 있으며, 7일 및 9일째에서 양물질이 나타내는 효과를 보면 갱글리오사이드보다 훨씬 효과가 좋음이 입증된다.

2. 뉴론막(Na⁺, K⁺) ATPase작용에 대한 갱글리오사이드 유도체의 효과

막효소(Na⁺, K⁺) ATPase를 활성화시키는 갱글리오사이드 또는 갱글리오사이드 분자내 에스테르 유도체의 능력은 뉴론막제제(J.of Neurochem)를 시험관내에서 실험함으로써 알수 있다.

[재료 및 방법]

가. 쥐뇌의 조(組)미토콘드리어분획물(P₂분회물)의 제조

P₂분회물의 제조는 Morgan et al, Bionhem. Biophys. Acta 241, 737 (1971)의 방법을 이용하였다. (모든 조작은 0-4℃의 온도에서 행해졌으며 Xg치는 평균원심력이다.) 체중 150-170g의 스프라그 다우레이 숫놈쥐(챨스 리버로부터)의 머리를 잘라 뇌를 신속하게 제거해서 얼음으로 냉장된 등장액으로 세척시켰다. 쥐뇌의 절제후 4배용량의 균질화용액(인산칼슘완충액 1mM 및 비소디움EDTA 0.1nM을 함유한 0.32M슈크로스, pH 7.27)을 사용하여 모터작동 테프론-그래스 균질기(클리어런스직경, 0.25㎜ : 800r. p. m.)의 12상하 행정에 의해 균질화 되었다.

균질화물은 균질화용액중에서 10% (W/V)로 희석히켜 네겹의 치즈포를 통해서 여과후 15분간 100×g으로 원심분리 하였다. 얻어진 펠렛은 균질화 용액의 동일한 출발용액으로 세척하여 위와 같이 원심분리 시켰다.

합친 상층액은 25분간 17,500×g으로 원심분리 하였고(이 중력상태는 분획물에서 신경목적물의 최대함유를 도모하기 위해 사용되었음) 펠렛은 1회에 9배 용량의 균질화 용액으로 4회 세척하여 25분간 17,500×g으로 원심분리시켰다. 최종펠렛(P₂분획물)은 주성분으로서 파열되지 않은 미토콘드리어와 신경목적물을 함유한다. 최종펠렛은 상술한 테프론-그래스 호모지나이저에 의해 적당한 용량의 균질화용액으로 균질하게 재현탁시켜서 즉시 효력검정용으로 사용되었다. 저장에 관련된 부조화를 피하기 위해 신선한 P₂분획물은 항상 사용하기 전에 조제되었다. P₂분획물조제는 NeuAc/㎎ 단백질을 결합한 33.9±2.8(S.D.) nM의 갱글리오사이드 내용물을 함유하였다.

나. ATPase 효력검정

ATPase작용은 Wallick et al (J. Pharm. Exptl, Therap. 189, 434, (1974)에 따라 분광분석으로 측정되었다. 반응혼합물은 따로 설명하지 않는한 최종용량 3㎖ 및 최종 pH 7.2중에 슈크로스 50mM, 비소디움EDTA 0.2mM (pH 7.4로 조정). NaCl 100mM, MgCl₂5mM, KCI 10mM, 포스포(에놀)피루베이트 모노포타슘염(PEP) 2mM(pH 7.4로 조정), ATP 3mM, TRIS-HCI 50mM (pH 7.4), NADH 0.33mM, 피루베이트-키나제(PK) (30㎍/㎖) 및 락테이트-디하이드로게나제(LDH) (10㎍/㎖)로 구성되어 있다.

반응은 P₂분획물을 50-75㎍(단백질로서) 첨가시킴으로써 개시되었다. (Na⁺, K⁺) ATPase작용은 3×10^-5M 오우아바인의 존재하에 측정된 총 ATPase와 Mg²⁺-의존 ATPase사이의 차이에 의해 얻어졌다. 개별적인 효력검정에 필요한 시간은 3-5분 이었다.

ATPase 작용은 국제단위(IU)로서 표시되었다. (가수분해된 ATPμM/단백질 ㎎/분).

갱글리오사이드 유도체(50nM)의 작용은 2시간동안 37℃ 에서 뉴론막으로 배양후 검정되었다.

[결과]

ATPase작용에 대한 비교연구의 결과는 다음 표 2에 요약된 바와 같다.

[표 2]

뉴론막(Na⁺, K⁺) ATPase에 대한 갱글리오사이드의 효과

상기 결과로부터 본 발명에 따른 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 뉴론막효소(Na⁺, K⁺) ATPase를 활성화시키는 능력을 가지고 있으며 몰농도의 동일한 조건하에서 갱글리오사이드보다 훨씬 유효함이 입증되었음을 나타낸다.

3. 혼미로 손상된 망막전도의 회복된 갱글리오사이드 유도체의 효과

망막전도작용의 회복을 촉진하는 갱글리오사이드 또는 갱글리오사이드의 분자내 유도체의 능력은 토끼에서 물리적 손상(혼미)을 입힌후 평가될 수 있다. 이 모델에서 갱글리오사이드 또는 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체는 비경구적으로 (정맥내) 투여되었다.

("Int. Symposium on the Neurochemistry of the Retina", Athens, August 28-September 1 (1979) (Communication)("Satellite Meeting on Biochemical and Pharmacolofical Implications of Gangliosodes Functions", Cortona, August 28-31 (1975)(Communications)).

[방법 및 재료]

체중 1.9-2㎏ 사이의 뉴질낸드산 토끼 숫놈이 사용되었다. ("Int. Symp. on the Neurochemistry of the Retina, Athens, August 28-September 1 (1979)) 각막마취는 0.4%노베신의 국소적용에 의해 유도되었다. 망막전도는 온화한 흡입으로 고정된 (Henkes에 따라) 각막전극의 적용에 의해 기록되었다. 참고용 전극은 전면에 피하내로 삽입된 니들로 구성되었다.

사용된 장치는 다음과 같다.

AC프리암플리화이어 5A 22N테크트로닉(10H_ZDC휠터) : 뉴로에버리지 11720TE 바이오메디카분석기 : XY플로터 L800린세이스 기록기 : 1273 OIE바이오메디카 광자극기, 광자극은 10초간 0.2왓트/초 및 주파수 0.5H_Z의 푸렛쉬 5기로 실시되었다.

기록을 위한 기본 시간은 10msec (pre-set=5)이었다.

동물은 일정한 공기, 온도 , 소음의 조건에서 암흑에 적용할 수 있도록 30분간 암실에서 보관되었다.

측정은 다음과 같이 실시하였다.

1. 3개의 기본대조용은 15분마다 모든 동물에서 평가되었다.

파장 a+b(피크 대 피크)의 평균차가 산출되었다.

2. 다음에 동물은 각막전극으로 부터 10m거리에 위치한 스코드메인즈 KL 150B램프를 사용하여 20분간 혼미되게 하였다.

이 기간후 망막전도(ERG)회복은 홈미기간에 따른 20,40 및 60분에서 ERG의 진폭을 측정하여 결정되었다. 이것은 동물의 기본조건의 평가를 가능케 하였다.

이어서 동물들은 화합물로 처리되였으며 30분후 다시 혼미시켰으며 ERG의 기록은 상기와 같은 조건에서 일어났다.

화합물은 정맥주사에 의해 33nM/㎏투여되었다.

[결과]

망박전도회복에 대한 비교연구의 결과는 다음 표 3에 요약된 바와 같다.

[표 3]

망막전도 회복에 대한 갱글리오사이드 유도체의 효과

이와 같이 얻어진 결과를 보면 본 발명에 따른 분자내 에스테르 유도체는 망막전도 회복을 증가시키고 모든 시험에서 갱글리오사이드보다 작용이 있음을 나타낸다.

[치료적 응용]

본발명에 의한 갱글리오사이드 분자내 에스테르 유도체는 신경계통, 특히 말초신경질환과 중추신경계통의 병인을 치료하는데 상이한 치료를 위한 약제로서 사용될수 있다. 좀더 자세히, 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 외상(外傷), 혈관압박, 퇴행성(退行性)질환, 또는 유독성전염으로 인해 생기는 신경재생의 자극과 신경근육작용의 회복이 필요한 말초신경계통 질환의 치료에 사용될 수 있고, 외상, 무산소증 퇴행성질환 또는 유독성전염으로 인해 생기는, 신경분출의 자극이 기능회복을 위해 필요한 중추신경계통질환의 치료에도 사용될 수 있다.

종래에 이들 질환은 갱글리오사이드의 사용에 의해 치료되었다. 그러나 상술한 실험결과는 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체가 갱글리오사이드 자체보다 훨씬 우수한 작용을 가지고 있음을 나타낸다.

본 발명에 의한 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체는 인체 또는 동물에 근육내, 피하, 정맥내 주사 또는 주입으로 투여되는 약리학적 조제물에서 약제로서 사용될 수 있다.

약제조제물은 하나 또는 그 이상의 약제학상 혀용되는 담체또는 희석제의 배합과 적당한 PH에서 완출매체에 함유되어 생리적 액체와 등장성인 화합물의 용액 또는 화합물의 냉동건조 분말일수 있다. 투여되는 용량은 원하는 효과와 원하는 투여경로에 따라 다르다. 예컨대, 용량은 1일 체중 ㎏ 당 유효화합물의 0.05-5㎎이고 단일용량은 체중 ㎏당 0.05-2㎎일 수 있다.

본 발명의 치료조성물은 보통 갱글리오사이드의 상이한 분자내 에스테르 유도체의 혼합물로 조제되지만 유효한 단일 유도체로서만 함유시켜 조제될 수 있다. 예컨대, 다음 표 4는 신경계통 질환의 치료를 위한 용액의 형태로 조제될 수 있는 가능한 약제조성물의 일부를 나타낸다.

[표 4]

주사용 약제조성물용액의 예

조제 1-2ml앰플당 조성물

-유효 성분 5㎎

-염화나트륨 16㎎

-파이로젠유리증류수중 구연산 적당량

염 완충액(pH6) 2㎖

조제 2-2㎎앰플당 조성물

-유효 성분 100㎎

-염화나트륨 16㎎

-파이로젠유리 증류수중 구연산 적당량

염 완충액(pH6) 2㎖

조제 3-4ml바이알당 조성물

-유효 성분 100㎎

-염화나트륨 32㎎

-파이로젠유리증류수중 구연산 적당량

염 완충액(pH6) 4㎖

표 4에 표시된 조제물은 상술한 투여 경로에 의해 인체 또는 동물에 직접 투여될 수 있다. 부거적으로 조성물은 유효성분의 중량으로서 약 2%-50%를 함유할 수 있다.

또 한예로서 표 5는 신경계통질환의 치료용으로 조제될 수 있는 가능한 약제조성물의 일부를 나타낸다.

제1 유효성분 바이알은 글리신 및 만니톨과 같은 약제학상 허용되는 부형제와 함께 유효성분의 냉동건조된 분말의 중량으로 약 10%-90%를 함유하도록 조제된다. 제2 용매 바이알은 염화나트륨 및 구연산염 완충액과 같은 용매의 원하는 양을 함유하도록 조제된다. 두 바이알의 내용물은 투여하기 바로 직전에 혼합되고 냉동건조된 유효성분 분말은 신속히 용해되어 주사용액을 형성한다. 유효성분의 냉동건조된 분말을 함유한 제1 바이알을 표함하는 약제조성물 제형은 종전의 약제조성물 용액에 비할때 유효성분인 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체가 더욱 안정하므로 본 발명의 적합한 약제 조성물이다.

[표 5]

약제 조성물 제형의 예

제형 1-가. 2㎖냉동건조물 앰플당 조성물.

-유효성분 5㎎

-글리신 30㎎

나. 2㎖용매 앰플당 조성물.

-염화나트륨 16㎎

-파이로젠 유리증류수중 구연산염 완추액 2㎎

제형 2-가. 3㎖냉동건조물 앰플당 조성물.

-유효성분 5㎎

-만니톨 40㎎

나. 2㎖용매 앰플당 조성물.

-염화나트륨 16㎎

-파이로젠유리증류수중 구연산염 완추액 적당량

2㎖

제형 3-가. 3㎖냉동건조물 앰플당 조성물.

-유효성분 50㎎

-글리신 25㎎

나. 3㎖용매 앰플당 조성물

-염화나트륨 24㎎

-파이로젠유리증류수중 구연산염 완충액 적당량

3㎖

제형 4-가. 3㎖냉동건조물 앰플당 조성물

-유효성분 50㎎

-만니톨 20㎎

나. 3㎖용매 앰플당 조성물

-염화나트륨 24㎎

-파이로젠유리증류수중 구연산염 완추액 적당량

3㎖

제형 5-가. 5㎖냉동건조물 바이알당 조성물

-유효성분 100㎎

-글리신 50㎎

나. 4㎖용매 앰플당 조성물

-염화나트륨 32㎎

-파이로젠유리증류수중 적당량

구연산염 완충액(pH 6) 4㎖

제형 6-가. 5㎖냉동건조물 바이알당 조성물

-유효성분 100㎎

-만리톨 40㎎

나. 4㎖용매앰플당 조성물

-염화나트륨 32㎎

-파이로젠유리증류수중 적당량

구연산염완충액(pH 6)

4㎖

Claims

하나의 갱글리오사이드나 여러개의 갱글리오사이드들의 혼합물로부터 갱글리오사이드 분자내 에스테르유도체를 제조하는데 있어서, 비수성유기용매안에 들어있는 하나의 갱글리오사이드나 여러개의 갱글리오사이드들의 혼합물 또는 이 갱글리오사이드의 염이나 이 갱글리오사이드 혼합물의 염을 락톤화 시약과 반응시켜서 그 구조가, (가) 하나의 탄수화물 부위와 하나이상의 세라미드 및 하나이상의 산부위로 이루어져 있으며, (나) 특히 상기 탄수화물 부위는 한개이상의 N-아세틸 갈락토사민이나 N-아세틸글루코사민 부위와 한개이상의 글루코오스나 갈라토오스부위를 함유하고 있고, (다) 상기 산부위는 한개이상의 N-아세틸-뉴타민산이나 N-글리콜릴뉴라민산을 함유하고 있으며, (라) 한개이상의 상기 산부위에서 그의 카르복실기가 상기의 여러개의 탄수화물들 중 하나에 있는 또는 상기의 여러개의 산부위중 어느 하나에 존재하는 수산기와 에스테르결합을 하여 락톤환을 형성하고 있는 구조로 된 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체내에 적어도 하나 잇아의 락톤결합이 형성되어지도록 하여서 됨을 특징으로 하는 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유기용매는 디메틸설폭사이드와 디메틸포름아미더, 설포란, 테트라하이드로퓨란, 디메톡시에탄 및 피리딘중에서 선택되어지는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 락톤화 시약은 유기용매에 가용성인 카르보디이미류와 2-클로로-1-메틸 피리디니움염류, 에톡시아세틸렌 및 N-에틸-5-페닐이속사줄리움-3'-설포네이트중에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 카르보디이미드는 디싸이클로헥실 카르보디이미드나 벤질이 소프로필 카르보디이미드 또는 벤질 에틸카르보디이미드임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 아세톤으로 처리시켜 침전되어진 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 구조중 탄수화물부위는, (Gal) (GalNAC) (Glc) (세라미드)인 것으로서, 이때 Gal은 갈락토오스부위이고 GalNAC는 N-아세틸갈락토사민부위이며 Glc는 글루코오스부위인 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 하나이상의 갈락토오스(Gal)부위에 결합된 하나이상의 N-아세틸-뉴라민산을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체의 구조는, 적어도 하나가

인 구조를 갖는 것으로서, 이때 Gal은 갈락토오스부위이고 GalNAC는 N-아세틸갈락토사민부위, Glc는 글루코오스부위이며 NANA는 N-아세틸-뉴라민산부위이며, 상기 NANA와 상기 Gal은 에스테르 결합으로 결합되어 있음을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 산부위에는 N-아세틸-뉴라민산이 함유되어 있음을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 탄수화물 부위는 각락토오스와 글루코오스 및 N-아세틸갈락토사민부위가 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 다음 구조와 같은 것들의 혼합물로 되어 있으며,

이때 Gal은 갈락토오스부위이고, GalNAC는 N-아세틸갈락토사민 부위, Glc는 글루코오스부위이며 NANA는 N-아세틸-뉴라민산부위이며, 한개이상의 상기 NANA부위가 갈락토오스부위나 인접한NANA부위의 수산기와 에스테르 결합하여 락톤환을 형성시킨 구조로 된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 산부위는 거기에 존재하는 모든 카르복실기가 하나의 탄수화물 부위나 상기 산부위들중 하나의 수산기와 에스테르 결합하여 락톤결합을 형성시켜서 되어짐을 특징으로 하는 방법.
하나의 갱글리오사이드나 여러개의 갱글리오사이드들의 혼합물로부터 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체를 제조함에 있어서, (가) 포유동물로 부터 추출된 하나의 갱글리오사이드나 여러개의 갱글리오사이드들의 혼합물을 비수성 비양성자성 유기용매에 용해시킨 다음, (나) 상기 갱글리오사이드나 갱글리오사이드들의 혼합물을 이온교환수지를 이용해서 그 갱글리오사이드내의 카르복실레이트기가 카르복실기로 전환되도록 하고, (다) 이렇게 전환된 상기 갱글리오사이드나 갱글리오사이드들의 혼합물을 락톤화 시약과 반응시켜서 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체내에 한개 이상의 락톤결합이 형성되어지도록 함을 특징으로 하는 갱글리오사이드의 분자내 에스테르유도체를 제조하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 유기용매는 디메틸 설폭사이드와 디메틸포름아미드, 설포란, 테트라하이드로퓨란, 디메톡시에탄 및 피리딘 중에서 선택되어지는 것임을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 락톤화 시약은 유기용매에 가용성인 카르보디이미드류와 2-클로로-1-메틸-피리디니움 염류, 에톡시아세틸렌 및 N-에틸-5-페닐이속사줄리움-3'-설포네이트 중에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 카르보디이미드는 디싸이클로헥실 카르보디이미드나 벤질이소프로필카르보디이미드 또는 벤질에틸카르보디이미드임을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 아세톤으로 처리시켜 침전되어진 것임을 특징으로 하는 방법
제13항 또는 제17항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그의 탄수화물 부위의 구조가, (Gal) (GalNAC) (Gal) (Glc) (세라미드)인 것으로서, 이대 Gal은 갈락토오스 부위이고, GalNAC는 N-아세틸갈락토사민부위이며, Glc는 글루코오스부위인 것임을 특징으로 하는 방법.
제13항 도는 제17항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 한개이상의 상기 Gal부위에 결합된 한개이상의 N-아세틸-뉴라민산을 함유하고 있음을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제17항중 어느하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그 구조가 적어도 하나는

인 구조를 갖는 것으로서, 이때 Gal은 갈락토오스 부위이고 GalNAC는 N-아세틸-갈락토사민부위, Glc는 글루코오스부위이며, NANA는 N-아세틸-뉴라민산 부위이며, 상기 NANA와 Gal은 에스테르 결합으로 결합되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제17항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그의 산부위에 N-아세틸-뉴라민산을 함유하고 있음을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제17항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그의 탄수화물 부위에 갈락토오스와 글루코오스 및 N-아세틸갈락토사민 부위가 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 13항 또는 제17항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 다음 구조와 같은 것들의 혼합물로 되어 있으며,

이때 Gal은 갈락토오스부위이고, GalNAC는 N-아세틸 갈락토사민 부위, Glc는 글루코오스부위이며, NANA는 N-아세틸-뉴라민산부위이고, 한개이상의 상기 NANA부위가 갈락토오스부위나 인접한 NANA부위의 수산기와 에스테르 결합을 하여 락톤환을 형성시킨 구조로 된 것임을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 산부위는 거기에 존재하는 모든 카르복실기가 하나의 탄수화물 부위나 상기 산부위들중 하나의 수산기와 에스테르 결합을 하여 락톤환을 형성시켜서 되어진 것임을 특징으로 하는 방법.
하나의 갱글리오사이드나 여러개의 갱글리오사이드들의 혼합물로부터 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체를 제조하는데 있어서, (가) 하나의 갱글리오사이드나 여러개의 갱글리오사이드들의 혼합물을 이온교환수지를 이용해서 그 갱글리오사이드내의 카르복실레이트기를 그의 염 형태로 전환시킨 다음, (나) 이렇게 전환된 상기 갱글리오사이드나 갱글리오사이드들의 혼합물의 염을 비수성 용기용매에 용해시키고, (다) 상기 갱글리오사이드나 갱글리오사이드들의 혼합물의 염을 락톤화 시약과 반응시켜서 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체내에 하나이상의 락톤결합이 형성되어지도록 함을 특징으로 하는 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체를 제조하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 유기용매는 디메틸 설폭사이드와 디메틸포름아미드, 설포란, 테트라하이드로퓨란, 디메톡시에탄 및 피리딘중에서 선택되어지는 것임을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 락톤화 시약은 유기용매에 가용성인 카르보디이미드류와 2-클로로-1-메틸-피리디니움염류, 에톡시아세틸렌 및 N-에틸-5-페닐이속사줄리움-3'-설포네이트 중에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서, 카르보디이미드는 디싸이클로헥실 카르보디이미드나 벤질이소프로필카르보디이미드 또는 벤질 에틸카르보디이미드임을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 하나의 갱글리오사이드염이나 여러개의 갱글리오사이드들의 혼합물의 염은 이온교환수지를 이용해서 상기 갱글리오사이드의 카르복실레이트기를 그의 3가 염으로 전환시켜서 형성되어진 3가 질소염인 것임을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 3가 질소염은 트리에틸암모늄이거나 피리디니움인 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 아세톤으로 처리시켜 침전되어진 것임을 특징으로 하는 방법.
제25항 또는 제31항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그의 탄수화물 부위가 (Gal) (GalNAC) (Gal) (Glc) (세라미드)의 구조를 갖는 것으로서, 이때 Gal은 갈락토오스부위이고 GalNAC는 N-아세틸갈락토사민부위이며 Glc는 글루코오스부위인 것임을 특징으로 하는 방법.
제25항 또는 제31항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 하나이상의 상기 Gal부위에 결합된 하나이상의 N-아세틸-뉴라민산이 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
재25항 또는 제31항중 어느 하나의 항에 있어서, 한개 이상의 하기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그 구조가

인 것으로서, 이때 Gal은 갈락토오스부위이고, GalNAC는 N-아세틸 갈락토사민부위, Glc는 글루코오스부위이며, NANA는 N-아세틸-뉴라민산 부위이고, 상기 NANA와 Gal은 에스테르 결합으로 결합되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 25항 또는 제31항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그의 산부위에 N-아세틸-뉴라민산이 함유되어 있음을 특징으로 하는 방법.
제25항 또는 제31항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 그의 탄수화물 부위에 갈락토오스와 글루코오스 및 N-아세틸 갈락토사민부위가 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제25항 또는 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 갱글리오사이드의 분자내 에스테르 유도체는 다음 구조와 같은 것들의 혼합물로 되어 있으며, 그 구조는

인 것으로서, 이때 Gal은 갈락토오스부위이고, GalNAC는 N-아세틸갈락토사민 부위, Glc는 글루코오스부위이며, NANA는 N-아세틸-뉴라민산부위이고, 한개이상의 상기 NANA부위는 갈락토오스부위나 인접한 NANA부위의 수산기와 에스테르 결합을 하여 락톤환을 형성시킨 구조로 된 것임을 특징으로 하는 방법.
제35항에 있어서, 산부위는 거기에 존재하는 모든 카르복실기가 하나의 탄수화물 부위나 상기 산부위들 중 하나의 수산기와 에스테르 결합을 하여 락톤결합을 형성시켜서 되어진 것임을 특징으로 하는 방법.