KR840001441B1 - 고등생물의 특정 단백질에 대한 뉴클레오티드 배열을 함유하는 dna전달 매개체의 제조방법 - Google Patents

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Description

고등생물의 특정 단백질에 대한 뉴클레오티드 배열을 함유하는 DNA전달 매개체의 제조방법

제1도는 본 발명의 과정을 도식화한 그림이다.

본 발명은 고등생물로 부터 특정한 뉴클레오티드 배열 또는 유전자를 분리 및 정제시키고 그 유전자를 미생물에 전달하므로서,유전암호에 따라 단백질을 합성하는 유전적 능력을 미생물에게 부여하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 인슐린이나 성장호르몬 같은 플리펩티드 호르몬의 유전자를 분리, 정제하여 미생물에 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명은 고등생물의 특정한 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 포함하고 있는 DNA전달 매개체(transfer vector)를 제조하는 방법을 제공하는 것으로, 이는 다음 단계들로 이루어진다.

(1) 특정한 단백질을 생산할 수 있는 고등생물로 부터, 이 특정한 단백질을 운전암호화하는 mRNA를 함유하고 있는 세포들을 분리하고,

(2) 리보뉴클레아제(ribonuclease; 리보핵산 가수분해효소) 억제제의 존재하에서 이 분리된 세포들로 부터 mRNA를 추출하여, mRNA의 리보뉴클레아제에 의한 분해를 방지하고,

(3) 단백질, DNA및 기타 RNA가 얹는 mRNA를 분리해내고,

(4) 둘중 한 가닥이 mRNA의 뉴클레오티드 배열에 상보적인 뉴클레오티드 배열을 갖는 이중 가닥의 cDNA를 합성하므로써, 특정한 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 갖고 있는 cDNA를 생산하고,

(5) 이중가닥의 cDNA와 결합할 수 있는 반응물 잔기(reactant end)들을 갖는 DNA전달 매개체를 첨가하고,

(6) 특정한 단백질을 유전암호화 하는 뉴클레오티드 배열을 갖고 있는 이중가닥의 cDNA와 DNA전달 매개체를 결합시키므로써 특정한 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 갖고 있는 DNA전달 매개체를 생성한다.

본 발명은 특정한 단백질을 유전암호화하는 유전정보를 함유하고 있는 특정한 뉴클레오티드 배열을 분리하고, 이 특정한 뉴클레오티드 배열을 갖고 있는 DNA를 합성하여, 지 DNA를 DNA가 복제될 수 있는 미생물 숙주에 전달하는 방법에 관한 것이다. 더욱 자세히 설명하자면, 본 발명은 인슐린 유전자및 성장호르몬 유전자의 분리, 정제, 미생물숙주에 전달과 미생물숙주에서의 복제및 그후 이들의 특성에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 새로운 생성물이 산출된다. 새조운 생성물에는 고등생물로 부터 유래된 특정한 뉴클레오티드 배열을 함유하고 있는 제결합성 플라스미드및 유전인자 구조의 일부로서 고등생물로 부터 유래된 특정한 뉴클레오티드 배열을 함유하고 있는 새로운 미생물이 포함된다.

본 명세서에서 사용되고 있는 기호및 약어들을 설명하면 다음과 같다.

DNA-데옥시리보핵산

RNA-리보핵산

cDNA-상보적인 DNA(mRNA배열로 부터 효소적으로 합성된것임)

mRNA-메신저 RNA

tRNA-트랜스퍼 RNA

dATP-데옥시아데노신 트리포스페이트

dGTP-데옥시구아노신 트리포스페이트

dCTP-데옥시시티딘 트리포스페이트

A-아데닌

T-티민

G -구아닌

C-시토신

Tris-2-아미노-2-히드록시에틸-1,3-프로판디올

EDTA-에틸렌디아민 테트라아세트산

ATP-아데노신 트리포스페이트

TTP-티미딘 트리포스페이트

DNA의 염기 배열은 운전정보를 함유라고 있는 것으로써 생물학적으로 중요하다. DNA에 있어서 염기의 배열은, 세포에 의해 만들어지는 모든 단백질의 아미노산 배열을 특수화하는 암호로 사용된다고 알려져 있다. 또한 염기배열의 일부는 각각의 단백질이 만들어지는 시간및 양을 조절하는 목적으로 사용된다.

이러한 조절요소의 성질에 대해서는 극소 부분만이 알려져 있다. 마지막으로, 각 가닥의 염기 배열은 세포분열을 수반하는 DNA의 복제시 주형(template)으로 사용된다.

단백질의 아미노산 배열을 결정하는데 DNA의 염기 배열에 대한 정보를 사용하는 방법은 일반적인 것으로, 모든 생물에 적용된다. 단백질에서 흔히 볼수 있는 각각의 아미노산은 하나, 혹은 그 이상의 트리뉴클 레오티드나 3연염기(連監基)배열에 의해 결정된다고 알려져있다. 그러므로 각각의 단백질은 단백질의 아미노산 배열에 대응하는 일련의 3연염기를 함유하고 있는 DNA의 대응체절을 갖고 잇다. 유전암호에 대해서는 다음에 수반된 표에서 설명하고 있다.

뉴클레오티드 배열에 관한 정보를 아미노산 배열 구조로 전환시키는 생물학적 방법에 있어서, 첫단계에서는 소위 전사(轉寫 ; transcription)가 행해진다. 이 단계에서는 만들어질 단백질을 특정화하는 배열을 갖고 있는 DNA의 부분적인 체절이 먼저 RNA로 복사된다. RNA는 데옥시리보오스 대신 리보오스, 티민 대신 우라실을 함유하고 있다는 점외에는 DNA와 유사한 폴리 뉴클레오티드이다. RNA의 염기들은 DNA와 관계를 이루는 동종의 염기쌍을 형성할 수 있다. 결과적으로, DNA뉴클레오티드 배열의 RNA전사는 복사된 배열애 상보적이다. 이러한 RNA를 메신저 RNA(mRNA)라고 부르는데, 이는 세포의 유전자계(genetic app-aratus)와 단백질 합성계 사이에 매개체로서의 위치 때문이다. 세포내에서, mRNA는 세포내의 각양각색의 효소와 기관들을 포함하는 복잡한 과정에서 주형으로 사용되어, 특정한 아미노산 배열을 합성한다. 이 과정을 mRNA의 번역(translation)이라고 부른다. 때때로 가공이라고 불리는 부가 단계가 있어서, 번역과정에의해 합성된 아미노산 배열을 기능 단백질로 전환시키는 공정이 실시되기도 한다. 인슐린의 경우를 예로 제시한다.

유전암호

페닐알라닌(Phe) TTK 히스티딘(His) CAK

로이신(Leu) XTY 글루타민(Gln) CAJ

이소로이신(Ile) ATM 아스파라긴(Asn) AAK

메티오닌(Met) ATG 리신(Lys)AAJ

발린(Val) GTL 아스파르트산(Asp) GAK

세린(Ser) ORS 글루타민산(Glu) CAJ

프롤린(Pro) CCL 시스테인(Cys) TGK

트레오닌(Thr) ACL 트립토판(Try) TGG

알라닌(Ala) GCL 아르기닌(Arg) WGZ

티로신 (Tyr) TAK 글리신(Gly) GGL

종지부호 TAJ

종지부호 TGA

요점 : 각각의 세글자 3연염기 왼쪽에 5'말단및 오른쪽에 3'말단을 갖는 DNA의 트리뉴클레오티드를 나타낸다. 문자들은 뉴클레오티드 배열을 형성하는 푸틴 또는 피리미딘 얻기를 나타낸다.

A=아데닌

G=구아닌

C=시토신

T=티민

X=T또는 C(Y가 A또는 G일때)

X=C(Y가 C또는 T일때)

Y=A,G,C 또는 T(X가 C일때)

Y=A또는 G(X가 T일때)

W=C또는 A(Z는 A또는 G일때)

W=C(Z가 C또는 T일때)

Z=A,G,C 또는 T(W가 C일때)

Z=A또는 G(W가 A일때)

QR=TC(S가 A,G,C또는 T일때)

QR=AG(S가 T또는 C일때)

S=A,C,C또는 T(QR이 TC일때)

S=T또는 C(OR이 AG일때)

J=A또는 G

K=T또는 C

L=A,T,C또는 G

M=A,C또는 T

인슐린의 직접적인 전구체는 프로인슐린이라는 단일 플리펩티드인데, 이는 다른 펩티드 C에 의해 연결된 2개의 인슐린사슬 A와 B를 함유하고 있다 [Steiner, D. F., Cunningham, D., Spigelman, L. 및 Aten, B., Science 157,697(1967) 참조].

최근에 인슐린 mRNA의 최초 번역 생성물은 프로인슐린 그 자체가 아니고, 프로인슐린의 아미노 말단에 20개 이상의 부가적 아미노산을 함유하고 있는 프리프르인슐린이라는 것이 보고되었다[Cahn,S.J.,Keim, P. 및 Steiner, D.F., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 73, 1964(1976)과 Lomedico, P.T 및 Saunders, G,F., Nucl. Acids Res. 3,381(1976) 참조].

프리프로인슐린 분자의 구조는 NH₂-(프리-펩티드)-사슬-(C펩티드)-A 사슬-COOH로 표시할 수 있다.

의학용 또는 연구용으로 가치가 있는 많은 단백질들이 척추동물과 같은 고등생물의 세포속에서 발견되거나 또는 그 세포에 의하여 만들어진다. 예를들면 호르몬인슐린, 성장호르몬 같은 기타 펩티드 호르몬, 혈압 조절용 단백질및 산업용, 의학용, 또는 연구용으로 가치가 있는 여러가지 효소들이 여기에 포함된다. 이러한 단백질들을 생물로 부터 추출하여 충분양을 얻는다는 것은 상당히 어려우며, 이 문제는 인간의 단백질 경우에 특히 심하다. 그러므로 그 생물체외에서 세포에 의하여 그러한 단백질들을 층분양 만들수 있는 기술이 필요하다. 어떤 경우에는, 조직 배양법에 의하여 보육될 수 있는 적당한 세포 계통들을 얻을 수 있다.

그러나 조직 배양시에 세포의 성장은 느리고, 배지는 비싸며 배얀조건은 정확히 조절되어야할 뿐만 아니라 수득량도 낮다. 더구나 원하는 특징을 갖는 배양 세포계통을 기른다는 것은 어려운 일이다.

반면에 박테리아 같은 미생물은 화학적으로 한정된 배지에서 성장하기가 비교적 쉽다. 발효기술은 매우 발달하여 조절이 용이하다. 생물은 빨리 성장하며, 높든 수득량도 가능하다. 또한 어떤 미생물들은 유전학적으로 완전히 묘사되어 있으며, 사실상 가장 잘 묘사되고 이해된 생물체에 속한다.

정상적으로 단백질을 만드는 생물체로 부터 의학적으르 중요한 단백질을 유전암호화하는 유전자를 분리하여, 적당한 생물체에 전달하는 것은 매우 바람직하다. 이런 방식으로, 조절된 성장 조건하에서, 미생물에의해 단백질이 만들어질 수 있으며, 원하는 양만큼 얻을 수 있다. 또한 이러한 공정에 의해 원하는 단백질은 생산하는데 드는 총 비용은 실제적으로 상당히 감소할 수 있다. 또, 특정한 단백질의 생산을 결정하는 유전자 배열을 분리하여, 명복한 유전학적 배경을 갖고 있는 미생물에 전달하는 능력은, 이러한 단백질의 합성은 어떻게 조절되며 합성후 이 단백질은 어떠한 과정을 밟는지에 대한 연구에 대해 상당한 가치가 있는 연구방법을 제공한다. 더구나 분리된 유전암호 배열은 치료학상 또는 기능적 성질이 변형된 여러가지 단백질을 유전암호화하기 위해 바뀌어질 수 있다.

본 발명은 상기 언급한 목적을 달성하기 위한 방법을 제공한다. 효소-촉매 반응을 포함하여 일련의 복잡한 단계들로 이루어진 방법이 발표되었다. 이러한 효소반응의 성질에 관해서는 종래의 기술에 알려진 바대로 여기에 기술되어 있다.

역 전사효소(transcriptase)는 RNA주형, 올리도-데옥시뉴클레오티드 프라이머(primer) 및 4개일 데옥신뉴클레오시드 트리포스페이트, 즉 NATP, dGTP, dCTP, 및 TTP의 존재하에서 RNA주형가닥에 상보적인 DNA를 합성하는데 촉매작용을 한다. 이 반응은 올리도-데옥신뉴클레오티드 프라이머를 mRNA의 3'말단에 비공유결합시킴으로써 시작되고, 그 다음에 mRNA뉴클레오티드 배열과 염기쌍을 이루는 관계에 의해 결정되는 적당한 데옥시뉴클레오티드를 성장한 사슬의 3'말단에 계란식으로 첨가한다. 생성물 분자는 단일 가닥의 DNA루우프(loop)에 의해 연결되어 있는 DNA의 상보적인 가닥과 원래의 RNA를 함께 함유하고있는 머리핀 구조로 설명된다.

역 전사효소는 또한 단일 가닥의 DNA주형을 사용하여 유사한 반응을 촉매할 수 있는데, 이러한 경우에 생성된 생성물을 한쌍의 말단들을 연결하는 단일가닥 DNA의 루우프를 가지고 있는 이중가닥 DNA의 머리핀 구조이다[Aviv, H. and Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,1408(1972)과 Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.F. 및 Maniatis, T., Cell 7,279(1976) 참조].

제한 엔도뉴클레아제는 이중가닥의 DNA에 있는 포스프디에스테르 결합을 가수분해하므로써, DNA가닥의 연결을 분해하는 효소이다.

만일 DNA가 닫힌 루우프의 형태라면, 이 루우프는 선형구조로 전환된단. 이러한 형태의 호소의 중요한 특징은 이들의 가수분해 작용이 특정한 뉴클레오티드배열이 있는 곳에서만 일어날 수 있다는 것이다. 이러한 배열을 제한 엔도뉴클레아제의 인지 부위라고 부른다. 여러가지 원천으로부터 얻은 제한 엔도 뉴클레아제를 분리하여 이들의 인지 부위인 뉴클레오티드 배열에 의하여 분명히 식별된다. 어떤 제한 엔도뉴클레아제는 같은 위치에서 양쪽 가닥상의 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 둔단(blurnt end)들을 생성한다.

다른 효소들은 몇몇 뉴클레오티드에 의해서 따로따로 분리된 결합의 가수분해를 촉매하여, 분열된 분자의 각말단에 유리된 단일가닥 부위를 생성한다.

이러한 단일 가닥의 말단들은 자기상보적이고(self·complementary)결합력이 있으므로 가수분해된 DNA를 재결합하기도 한다. 이러한 효소에 의해 분열되기 쉬운 DNA는 동일한 인지 부위를 함유한고 있기 때문에, 동일한 결합성 말단들이 생성되어, 제한 엔도뉴클레아제로 처리된 DNA의 이종성 배열을 비슷한 방법으로 처리된 다른 배열과 결합시키는 것이 가능하다[Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem. 4,123(1976) 참조].

제한 부위는 비교적 드물지만, 제한 엔도뉴클레아제의 일반적인 용도는 제한 부위 배열을 갖고 있는 이중가닥의 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하므로써 매우 확대되었다. 그러므로 사실상 DNA의 체절은 적당한 제한 올리고뉴클레오티드를 분자말단에 첨가하므로써 어떤 다른 체절과 단단히 결합할 수 있고, 이생성물을 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 가수분해하므로써, 필요한 결합성 말단을 생성한다[Heyneuker, H. L., Shine, J., Goodman, H.M., Boyer, H.W., Rosenberg, J., Dickerson, R.E., Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. and Riggs, A.D. Nature.263,748(1976) and Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. and Itakurn, K., Science 196,177(1977) 참조].

S1 엔도뉴클레아제는 단일 가닥의 DNA나 또는 이중가닥 DNA내의 단일 가닥의 간격들 또는 루우프에 있는 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있는 일반적 특이성을 가진 효소이다[vogt, V.M., Eur. J. Bi-ochem. 33, 192 (1973) 참조].

DNA리가아제는 결합성 말단에 의하여 함께 있는 두개의 DNA단편으로부터 형성될 수 있는 5'인산과 3'히드록실을 각각 갖고 있는 두개의 DNA체절 사이에 포스포디에스테르 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소이다. 이 효소의 일반적인 기능은 다른 이중 가닥 DNA분자내에 있는 단일 가닥 새김눈(nicks)을 결합시키는 것으로 생각된다. 그러나 적당한 조건하에서, DNA리가아제는 둔단을 갖고 있는 두개의 분자를 공유결합으로 연결하는 둔단결합(blunt end ligation)을 할수 있다[Sgaramella, V., Van de Sande, J.H., and Khorana, H.G., Proc. Nat]. Acad. Sci. USA 67. 1468(1970) 참조].

알칼리성 포스포타아제는 DNA상에 5'말단 인산을 포함하고 있는 인산 에스테르를 가수분해시킬 수 있는 일반적 특이성을 가진 효소이다.

전 과정에서 설명되어 있는 또 한가지 단계는 특정한 DNA단편을 플라스미드 같은 DNA매개체에 삽입하는 것이다. 플라스미드는 숙주세포 자체의 게놈과는 다른, 미생물 세포에서 발견될 수 있는 자기 복제 DNA단위로 사용되는 용어이다. 플라스미드는 숙주세포의 염색체와 유전학적으로 결합하지 않는다. 플라스미드 DNA는 어떤 것은 10⁸이상의 분자량을 가진 것도 있지만, 일반적으로 몇백만 분자량을 가진 이중가닥 고리분자형태로 존재하며, 이들은 보통 세포에 있는 총 DNA의 아주 작은 비율을 차지하고 있다. 플라스미드 DNA는 보통 숙주세포 DNA로 부터 분리할 수 있는데 이는 둘 사이의 크기에 상당한 차이가 있기 때문이다. 플라스미드는 숙주 세포분열 속도와 상관없이 복제할 수 있으며, 어떤 경우에는 성장조건에 따라 연구자가 이들의 복제속도를 조절할 수 있다. 플라스미드가 닫힌 고리상태로 존재하더라도, 인위적 방법에 의하여 DNA체절을 플라스미드에 삽입하여서, 분자크기가 커진 재결합성 플라스미드를 형성할 수 있으며, 이경우 옮겨질 유전인자가 무엇이든간에 복제 또는 표현능력에 실질적인 영향을 미치지 않는다. 그러므로 플라스미드는 DNA체결을 새로운 숙주 세포에 전달하는데 유용한 매개치 역할을 한다. DNA재결합 기술에 유용한 플라스미드는 전형적으로 약제 저항성 유전자와 같이 선택적인 목적에 적당한 유전자들을 함유하고 있다.

본 발명의 실시를 예시하기 위하여, 쥐의 인슐린 유전자의 분리및 전이에 대해 자세히 설명하겠다. 인슐린은 임상의학및 기초연구의 견지에서 매우 중요하기 때문에 여기에서 선택하였다. 발표된 방법은 이 분야에서 통상의 기술을 가진 사람들이 인간을 포함한 다른 생물로 부터 인슐린 유전자를 분리 해내는데 사용할 수 있는 것이다.

인슐린은 1922년에 처음 분리되었다. 현재 이 호르몬을 당뇨병 치료에 사용하고 있다는 것은 잘 알려진 사실이다. 도살장에서 인슐린 원료로 소와 돼지의 췌장을 얻을 수 있지만, 당뇨병 환자의 수가 세계적으로 증자함에 따라서 호르몬의 부족현상을 일으키고 있다. 더구나 어떤 당뇨병 환자들은 유독한 결과와 더불어 소와 돼지 인슐린에 대해 알레르기 반응을 일으킨다. 그러므로 세계의 요구를 만족시킬 수 있는 충분한 양의 사람 인슐린을 생산하는 것이 매우 바람직하게 되었다. 박테리아에서 사람 인슐린을 제조하는 것은 이러한 바람직한 목적을 달성할 수 있는 한가지 방법이다. 그러나 본 발명 이전에는, 인슐린 유전자를 박테리아에 삽입시키는 기술이 발달하지 못했기 때문에 이런 바람직한 목적을 달성하기 위한·공정을 실시하지 못했다. 본 발명은 이러한 기술을 제공한다.

특정한 단백질을 유전 암호화 할수 있는 특정한 배열을 갖는 DNA를 얻어서 화학적 또는 생물학적 방법으로 뉴클레오티드 배열을 변형시킬 수 있으며 마침내 생성된 특정한 단백질 또한 변형시킬 수 있다. 이것은 예를들어 특정한 의학 용도에 적합하게 만들어진 변형된 인슐린의 생산을 가능하게 하였다. 그러므로 인슐린의 중요한 기능적 성질을 갖고 있는 어떤 아미노산 배열을 생산하는 유전 능력을 미생물에 부여할 수 있다. 성장호르몬의 경우에도 비슷한 생각이 적용되고 있다.

특정한 고등 생물의 정상적인 대사에 필요한 특정한 단백질에 대한 유전암호를 박테리아와 같은 미생물에 전달할 수 있다는 것은, 이러한 단백질의 배양 생산을 가능하게 하는 중요한 것이다.

또한 이러한 단백질의 생산시에 정상적인 기능을 하는 고등 생물의 능력이 손상되었을 경우, 이러한 단백질의 산출량을 증가시키거나 또는 본 발명에 따라서 변형된 미생물에 의해 생성된 단백질로 치환할 수 있는 중요한 가능성을 부여한다. 예를들면 본 발명에 의해 생성된 미생물과 만성 또는 급성 결필증이 있는 사람사이에 공생관계를 수립하므로써, 여기에 설명한 바와같이 유전적으로 변형된 미생물들을 사람에 이식하거나 또는 사람과 관련을 시켜, 대사에 있어서 병적 결핍증을 치료해준다.

유전정보를 함유하고 있는 특정한 뉴클레오티드 배열을 분리하고, 이 특정한 뉴클래오티드 배열을 갖는 DNA를 합성한후, 이 DNA를 숙주 미생물에 전달하는 방법이 발표되었다.

본 발명은 쥐의 프리프로인슐린의 구조 유전자, 쥐의 성장 호르몬의 유전자 및 사람의 성장 호르몬 유전자를 포함하여 박테리아에 전달된 특정한 DNA배열을 예로 들고 있다. 그런므로 이 방법은 척추동물과 같은 고등생물로 부터 얻은 바람직한 DNA배열을 어떤 미생물에 전달하는데 아주 적당한 것으로 생각된다. 여기서 고등생물이란 곤충류, 연체류, 식물 및 소, 돼지, 영장류, 사람등의 포유퐁물이 속해있는 척추동물을 포함하여 분화된 조직을 갖고 있는 진핵 생물로서 정의된다. 당해업계에 알려진 것으로서 미생물이라함은 원생생물에 속하는 미시적 생물체로써 원핵 생물이나 진핵 생물로서 예를들면 박테리아, 원생동물, 조류 및 효모가 속해 있는 공팡이류를 포함하고 있다. 본 방법에 있어서 먼저 개선된 방법으로 선택된 세포개체군을 분리한다.

새로운 방법에 의해 이 세포들로 부터 완전한 mRNA를 추출하는데 있어서, 실제로 모든 리보뉴클레아제의 활성은 억제된다. 이러한 추출물로부터 칼럼 크로마토그래피 방법으로 완전한 메신저 RNA를 정제한 다음, 상보적인(cDNA)가닥을 합성하는데 필요할 4개의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에 작용하는 역전사효소를 mRNA에 작용시킨다. 역 전사효소를 사용한 이 첫번째 반응의 생성물에서는 선택적으로 리보뉴클레오티드 배열을 제거한다. 남아있는 데옥시뉴클레오티드 배열은 원래의 mRNA와 상보적인 것으로 4개의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 역 전사효소나 DNA폴리머라아제와 두번째 반응을 일으킬때 배양된다. 생성된 물질은 한쪽끝에서 단일 가닥의 루우프에 의해 함께 결합된 상보적인 가닥을 갖고 있는 듀플렉스(duplex) cDNA구조이다. 그런다음에 이 생성물을 단일 가닥루우프를 쪼갤 수 있는 단일 가닥 특정 뉴클레아제로 처리한다. 이렇게하여 생성된 이중 가닥 cDNA는 제한 효소 인지 부위 배열을 함유하고 있는 특정한 DNA를 양쪽 말단에 첨가하므로써 길이를 늘린다. 이러한 첨가시에는 DNA리가아제 효소가 촉매작용을 한다. 그후에 늘어난 cDNA를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여, 듀플렉스의 각 가닥의 5'말단에서 자기 상보적인 단일 가닥의 말단을 생성한다.

동일한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위를 갖고 있는 플라스미드 DNA를, 그 효소로 처리하여, 폴리뉴클레오티드 가닥을 분해하고, 5'말단에 자기 상보적인 단일 가닥 뉴클레오티드 배열을 생성한다. 단일가닥 말단에 있는 5'말단 인산기를 제거하므로써 플라스미드가 숙주세포를 변형시킬 수 있는 고리 구조를 형성하는 것을 방지한다. 미리 준비된 cDNA와 플라스미드 DNA를 DNA리가아제의 존재하에 함께 배양시킨다. 기술된 반응조건하에서 cDNA의 체절을 포함하고 있을때에만 플라스미드 DNA의 생존할 수 있는 닫힌 고리를 형성할 수 있다. 그 다음에 cDNA배열을 함유하고 있는 플라스미드를 적당한 숙주세포에 삽입한다. 생존할 수 있는 플라스미드를 받은 세포들은 플라스미드로 부터 얻은 유전적 특성, 예를들어 약물내성 같은 것을 갖고 있는 콜로니가 나타나는 것에 의해 검출할 수 있다. 합체된 cDNA배열을 갖고 있는 재결합성 플라스미드를 함유하는 순수한 박테리아 균주들이 자라면, 재결합성 플라스미드를 다시 분리할 수 있다.

이러한 방법으로 많은 양의 재결합성 플라스미드 DNA를 제조할수 있고, 적당한 제한 효소로 엔도뉴클레올리틱 분해(endoaucleolytic cleavage)를 시켜서 특정한 cDNA배열을 재분리할 수 있다.

본 발명의 기본 공정은 사람을 포함한 고등생들로 부터 얻어진 바람직한 뉴클레오티드 배열을 분리하고, 이를 숙주 미생물에 전달하는 것이다. 이 방법은 의학적 또는 공업적 가치가 있는 특정한 단백질을 유전암호화하는 유전자의 전달및 이러한 단백질의 미생물학적 합성에 유용할 것이다. 본 발명을 설명하자면, 인슐린을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 쥐로 부터 분리하여, 박테리아에 전달한후 그 속에서 복재하는 것이다. 비슷한 것으로 쥐의 성장 호르몬을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 분리하여, 박테리아에 전이시킨 다음 그 속에서 복제시킨다.

이 방법은 사람의 인슐린, 성장호르몬 뿐만 아니라 기타 폴리펩티드 호르몬등 사람으로부터 분리한 뉴클레오티드 배열의 전달에도 적용시킬 수 있다.

본 발명은 특정한 뉴클레오티드 배열의 DNA분자를 분리하고, 이것을 미생물에 전달하는 방법을 포함하고 있는데, 여기에서 DNA의 원래 뉴클레오티드 배열은 전달 생물체에서 복제가 일어난 후에 발견된다. 본 발명의 과정을 포함하는 일련의 단계들은 일반적으로 네가지로 분류할 수 있다.

1. 고등생물로부터 원하는 새포 개체군의 분리

특정한 단백질을 유전암호화하는 유전배열에는 두가지 가능한 원천이 있다 : 원천 생물 자체의 DNA와 이 DNA의 RNA전사가 그것이다. 현재 미국국립 보건원의 안전 규정에는 어떤 종류의 사람 유전자는, 특수한 위험성이 큰(P4)용기내에서 아주 조심스럽게 유전자를 정제한 후에만, 재결합성 DNA에 삽입시키고 곧이어서 박테리아에 삽입시킬 수 있다고 되어있다[Federal Register, Vol. 41, No. 131, July 7, 1967, pp. 27902-27943 참조].

그러므로 본 방법에서 사람 단백질의 생산에 이용할 수 있는 어떤 과정에 있어서 바람직한 접근 방식은, 원하는 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 갖고 있는 특정한 mRNA를 분리하는 것이다. 이리한 방법을 채택하면 세포로부터 DNA를 추출하는 것보다 훨씬 쉽게 mRNA를 정제할 수 있다는 장점이 있다. 특히 척추동물같이 고도로 분화된 생물체에 있어서, 우선적으로 문제의 단백질을 생산하는데 기여하는 생물체내에 특정한 위치를 갖는 세포의 특정 개체군을 확인할 수 있다는 사실을 이용할 수 있다. 선택적으로 이러한 개체군은 생물체의 과도적 발전 단계시에 존재한다. 이러한 세포 개체군에 있어서, 세포로부터 분린된 대부분의 mRNA는 원하는 바의 뉴클레오티드 배열을 간지고 있다. 그러므로 분리시킬 세포 개체군의 선택및 여기에 사용되는 분리 방법은 이로 부터 분리되는 mRNA의 최초의 순도의 견지에서 실질적으로 유익하다.

대부분의 조직, 샘(gland)및 기관에식 세포들은 일반적으로 결합조직의 섬유망에 의해 결합되어 있고, 원칙적으로는 콜라겐으로 이루어져 있으나 조직에 따라서는 기타구조단백질, 다당류및 무기성분등을 포함하기도 한다. 선택된 조직으로부터 세포를 분리하려면 결합조직 매트릭스(matrix)로 부터 세포를 유리시키는 기술이 절대적으로 필요한다 그러므로 특정한 분화된 세포형태를 분리및 정제하는 방법에는 두가지 중요한 단계가 있다 : 즉 결합조직 매트릭스로부터 세포를 분리하는 것과, 조직에서 볼수 있는 기타 모든 세포형태로 부터 원하는 형태의 세포를 분리하는 것이다. 본 발명에 기술되어 있는 작용원리는 여러가지의 조직원천으로부터 여러가지 세포형태를 분리하는데 적용할 수 있다. 예를들어, 인슐린을 유전암호화하는 mRNA의 분리에 적합한 췌장으로부터 랑게르한스섬을 분리시키는 방법을 설명하겠다.

인슐린을 생성하는 세포는 태아 송아지 췌장또는 배양된 랑게르한스섬 종양세포같은 다른 원천으로부터 얻을 수 있다. 이러한 경우, 특히 순수한 세포배양을 하는 경우에는, 순수한 랑게르한스섬 세포를 분리하기가 훨씬 간단할 것이다 위에서 설정한 랑게르한스섬 세포분리 방법이 이러한 경우에는 필요치 않을 것이나 일반적으로 적용시킬 수 있기 때문에 유리하다.

주위 자극에 대한 세포의 반응을 이용하여 원하는 mRNA의 비율을 증자시킬 수 있음이 빈번히 발견되고 있다. 예를들어, 호르몬으로 처리하면 원하는 mRNA의 생산을 증가시킬 수 있다. 다른 방법으로서는, 특정한 온도에서 성장시키는 것과 특정한 영양소 또는 기타 화학 물질에 노출시키는 것등이 있다. 쥐의 성장 호르몬의 mRNA를 분리시킬때, 배양된 쥐의 뇌하수체 세포들을 갑상선 호르몬및 글루코코르티코이드를 함께 작용시켜 처리하였더니 성장 호르몬의 mRNA비율이 현저한 양 증가되었다.

2. mRNA의 추출

본 발명의 중요한 특징은 세포 추출물 내의 리보뉴클레아제 활성을 완전히 제거한다는 점이다. 추출될 mRNA는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드이며, 어떤 상보적 가닥과도 쌍을 이루고 있지 않다. 그러므로 배열중에 있는 단일 포스포디에스테르 결합을 가수분해시키는 것은, 완전한 유전자 배열을 미생물에 전달하기 위하여 전체 분자가 무용지물화하기 때문일 것이다. 위에서 언급한 바와같이 효소 리보뉴클레아제는 널리 분포되어있고 활성이 있지만 예외적으로 안정하단. 이 효소는 피부상에서 발견되고 평범한 유리제품 세척기술에 남아 있으며, 가끔 유기 화학약품의 원료들을 오염시키기도 한다.

췌장 세포의 추출물 취급시에는 특히 어려운 점이 있는데, 왜냐하면 췌장은 소화효소의 원천이고 따라서 리로뉴클레아제가 풍부하기 때문이다. 그러나 리보뉴클레아제 오염의 문제는 모든 조직에 존재하며, 여기에 발표되어 있는 리보뉴클레아제 활성의 제거방법은 모든 조직에 적용시킬 수 있다. 본 발명에 있어서 이 방법의 특별한 효과는 췌장에서 분리된 랑게르한스섬 세포로부터 완전한 mRNA를 성공적으로 분리해낸 것으로 설명할 수 있다.

본 발명에서는 세포분열 및 단백질로 부터 RNA를 분리해내는데 필요한 모든 작동을 하는 동안에 카오트로프(chaotropic)음이온, 카오트로프 양이온, 그리고 딘설파이드 결합분해제를 흔합한여 사용한다. 상기 물질들을 화합하여 사용한 효과는 분리된 뒤 췌장의 랑게르한스섬으로 부터 손상되지 않은 mRNA를 고수득율로 분리하는데 사용하므로써 밝혀졌다.

적당한 카오트로프 이온들을 선택할때는 수용성 배지에서의 용해도및 유용성을 염두에 두어야 한다. 적당한 카오트로프양이온으르는 구아니디늄, 카르바모일구아니디늄, 구아닐구아니디늄, 리튬등이 이에 속한다.

적당한 카오트로프 음이온으로는 요오드, 과염소산염, 티오시안산, 디요오도살리실산 등이 이에 속한다. 이러한 양이온과 음이온을 화합하여 형성된 염의 상대적 효과도는 이 염들의 용해도에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 예를들자면 디요오도살리실산 리튬은 티오시안산 구아니디늄보다 훨씬 강력한 변성제이지만, 용해도간 겨우 약 0.1M정도이며 또한 비교적 가격이 비싸다. 티오시안산 구아니디늄은 바람직한 양이온-음이온 결합을 제공하는데, 이는 쉽게 얻을 수 있고 수용성 배지에서 약 5M정도까지 용해될 수 있으므로 바람직하다.

β메르캅토에탄올같은 티올 화합물 티올 디설파이드 상호 교환반응에 의하여 단백질의 분자내에 있는 디설파이드 결합을 파괴한다고 알려져 있다. β-메르캅토에탄올 외에 디티오트레이틀(dithiothreitol), 시스테인, 프로판올 디메르캅탄 등을 포함하여 여러가지 적당한 티올 화합물들이 효과적인 것으로 알려져있다.

상호 교환반응을 필구적으로 완료하기 위해서는 티올 화합물이 분자내 디설파이드상에 과량으로 존재하여야 하므로 수용성인 것이 필요한데, β-메르캅토에탄올은 적당한 가격으로 쉽게 구입할 수 있어서 적당하다.

조직이나 세포로부터 RNA를 추출하는 동안 리보뉴클레아제를 억제하기 위해서 주어진 카오트로프 염의 효과는 그 농도에 직접 관련된다. 그러므흐 바람직한 농도는 실제로 사용할 수 있는 최고의 농도이다. 추출하는 동안 mRNA를 완전하게 보조하고자 하는 본 발명의 성공은 티보뉴클레아제가 신속하게 변성되는 것과, 변성의 범위에 달려있다고 생각된다. 예를들어 하이드로클로라이드는 변성제로써 단지 약간 덜 강력한데도 불구하고 하이드로클로라이드보다 티오시안산 구아니디늄이 훨씬 우세한 것은 이 때문이다. 변성제의 효과는 단백질을 완전히 변성시키는데 필요한 최저한계농도조써 정의된다. 반면에 여러가지 단백질의 변성 속도는 변성제의 최저 한계농도에 비례하여 변성제 농도에 따라 5승지서 10승까지 증간한다[Tanford, C.A., Adv. Prot, Chem. 23, 121 (1968) 참조].

정성적인 이러한 관계는 구아니디늄 하이드로클로라이드보다 단지 약간 더 강력한 변성제가 같은 농도에서 수배 더 빨리 단백질을 변성시킬 수 있음을 암시한다. 리보뉴클레아제 변성 반응 속도와, 세포로 부터 mRNA를 추출할때 이를 보전하는 과정 사이의 관계에 대해서는 본 발명 이전에 알려지거나 이용된 바가없는 것으로 생각된다. 위의 분석내용이 옳다면, 바람직한 변성제는 높은 수용성 용해도와 결부된 낮은 최저한계변성농도를 갖고 있는 것으로 생각된다. 이러한 이유 때문에 디요오도살리실산 리튬이 보다 강력한 변성제인데도 불구하고 디요오도살리실산 리튬보다 티오시안산 구아니디늄이 더욱 바람직하며, 티오시안산 구아니디늄의 용해도가 훨씬 크므로 주어진 농도에서 리보뉴클레아제를 더 빨리 불활성화하는데 사용할 수 있다. 상기 분석에 의하면 또한 티오시안산 구아니디늄이 거의 동등한 용해도를 갖는 하이드로클로라이드염보다 더 바람직한 이유를 설명하고 있는데 이는 티오시안산 구아니디늄이 약간 더 강력한 변성 제이기 때문이다.

변성제와 함께 디설파이드 결합분해제를 사용하면 리보뉴클레아제 분자를 완전히 펼치게 하므로써 변성제의 효과를 강력하게 한다. 티올화합물은 분자내 디설파이드 결합이 그대로 남아있을때 일어날 수 있는 신속한 원형재현을 방지하므로써 변성과정의 속도를 증진시키는 것으로 생각된다. 더우기 mRNA제조시에 남아있는 어떤 오염된 리보뉴클레아제는 변성제와 티올이 없더라도 거의 불활성 상태로 존재한다. 일반적으로 말해서 분자내 디설파이드 결합에 대해서 상당히 초과하는 티올기들이 분자내 디설파이드를 분해하는 방향으로 상호 교환반응을 유도하기에 바람직하지만, 티올기를 갖고 있는 디설파이드 결합분해제는 어떤 농도에서나 어느정도 효과적이다. 한편, 대부분의 티올 화합물들은 고약한 냄새가 나고 고농도에서는 다루기 힘들기 때문에 실제적인 농도의 상한이 존재한다.

β-메르캅토에탄올을 사용하여 0.05M에서 1.OM의 범위내에 있는 농도가 효과적이라는 것이 밝혀졌으며, 쥐의 췌장으로부터 퇴화되지 않은 RNA를 분리시킬 경우에는 0.2M이 최적농도라고 생각된다.

세포로부터 mRNA를 추출하는 동안 배지의 pH범위는 pH5.0-8.0사이에 속하면 된다.

세포를 분열시킨 다음, 세포 단백질및 DNA로부터 RNA를 분리한다. 이러한 목적으로 다양한 과정들을 발전시켰는데, 이중 몇몇은 적합한 것으로 그들 모두가 이 분야에서는 잘 알려져 있다. 종래 기술에서 통상적인 방법은 RNA를 선택적으로 침전시키는 에탄올 침전 과정을 사용하는 것이다. 본 발명의 바람직한 방법은 침전 단계를 거치지 않고, 인심분리관내의 5.7M염화세슘 용액에 이 균질액을 직접부어 층을 만든다음 그 원심분리관을 Glisin,V., Crkvenjakov, R., and Byus, C., Biochemistry 13, 2633(1974)에서 설명한 대로 원심분리시킨다. 이 방법은 리보뉴클레아제에 나쁜 환경을 계속적으로 유지시켜, RNA가 DNA 및 단백질 없이 고수득율로 회수되도록 하므로 바람직하다.

상술한 과정에 의한 세포 균질액으로부터 전체 RNA를 정제할 수 있다. 그러나 이러한 방법으로 회수된 RNA중 극히 일부만이 원하는 mRNA이다. 원하는 mRNA를 더욱 정제하기 위해서는, 고등생물의 세포내에 있는, mRNA가 전사된 후에 세포내에서 폴리아데닐린산과 부착하므로써 더욱 정제된다는 사실을 이용한다. 부착된 폴리 A배열들을 함유하고 있는 이러한 mRNA는 상기 Aviv, H. 및 Leder, p.가 설명한 바와같이 올리고-티미딜레이트가 부착되어 있는 셀룰로오스의 칼럼상에서 칼럼 크로마토그래피에 의하여 선택적으로 분리할 수 있다. 앞에서 말한 과정들에 의하여 리호뉴플레아제가 풍부한 원천으로 부터 순수하고 완전하며 번역이 가능한 mRNA를 충분히 얻을 수 있다. mRNA의 정제및 이후 계속되는 시험관내 과정들은 원료 생물의 종류에 관계없이 어떤 mRNA에나 똑같은 방법으로 수행될 수 있다.

어떤 환경에서는, 예를들어 조직 배양세포를 mRNA원료로 사용할 경우, 리보뉴클레아제 오염이 극히 적어 방금 설명한 리보뉴클레아제 억제 방법이 필요치 않다. 이러한 경우에는 리보뉴클레아제 활성을 감소시키는 종래의 기술만으로 충분하다.

3. cDNA의 형성

본 공정의 나머지 단계들은 제1도에 도식화하여 설명하였다. 이 공정의 첫번째 단계는 정제된 mRNA에 상보적인 DNA배열을 형성하는 것이다. 원칙적으로는 mRNA를 주형으로 사용하여 상보적인 가닥을 형성할 수 있는 어떤 효소든지 사용하여도 무방하지만, 이 반응에 선택된 효소는 역전사효소이다. 이 반응은 종래 기술에서 설명한 조건하에서 설치할 수 있으며, 주형으로 mRNA를 사용하고 DNA가닥에 대한 전구체로서 4개의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 혼합물을 사용한다. 이 반응의 과정을 추적하기 위해 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 중의 하나를 α위치에 32_p로 라벨을 하고 크로마토그래피 및 전기영등같은 분리과정후 생성물을 회수하기 위해서, 또 이 회수한 것을 정량 평가하기 위해서, 꼬리표를 붙이는 것이 편리하다.

[상기 Efstratiadis, A.씨 등의 저서 참조].

제1도에서 보는 바와같이 역전사효소 반응의 생성물은, RNA가닥과 DNA가닥 사이에 비공유결합을 가진 이중가닥의 머리핀 구조이다.

역전사 효소반응의 생성물은 당해 업계에 알려져 있는 통상적인 방법에 의하여 반응 혼합물로 부터 제거된다. 이때 폐놀추출, 세파덱스(상품명, Pharmacia Inc., Uppsala, Sweden) G-100을 이용한 크로마토그래피 및 에탄올 침전법 등을 혼합하여 사용하는 것이 좋다. 일단 cDNA가 효소적으로 합성되었으면, RNA주형을 제거할 수 있다. DNA존재하에서 RNA를 선택적으로 분해시키는 여러가지 방법들이 종래 기술에 알려져 있다. 바람직한 방법의 하나로 알칼리성 가수분해가 있는데, 이 방법은 선택성이 높으며 pH조정에 의해 쉽게 조절할 수 있다.

알칼리 가수분해 반응을 일으킨 후 곧 중화시키고 필요하다면 에탄올 침전번에 의해 32_p로 라벨된 cDNA를 농축시킨다.

DNA폴리머라제나 역전사효소와 같은 적당한 효소를 사용하여 이중가닥으로된 머리핀 모양의 cDNA를 합성한다. 반응조건들은 상술한 바와 유사한 것으르 α-32_p라벨된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용한다.

역전사효소는 여러가지 원료로 부터 얻을 수 있는데 적당한 원료는 닭 골수성 백혈병(avain myeloblastosis)비루스이다. 이 비루스는 Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida에 있는 D.J. Beard박사로부터 얻을 수 있는데, 이 박사는 국립보건원과의 계약하에서 이 비루스를 생산하고 있다.

머리핀 모양의 cDNA를 형성한 후에 반응 혼합물로부터 DNA를 정제하는 것이 편리하다. 상술한 바와같이, 페놀 추출법, 세파덱스 G-100을 이용한 크로마토그래피및 에탄올 침전법의 단계들을 사용하여 오염 단백질이 없는 DNA생성물을 정제하는 것이 편리한 것으로 밝혀졌다. 상보적인 가닥의 말단을 연결하는 단일가닥으로된 루우프를 제거하여서 머리핀 구조를 종래의 이중 가닥 DNA구조로 전환시킬 수 있다. 이러한 목적으로 DNA의 단일 가닥 영역을 특이하게 가수분해할 수 있는 여러가지 효소를 사용할 수 있다. 이 목적에 적당한 효소는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)로 부터 분리된 Sl뉴클레아제이다. 이 효소는 Miles Research Products, Elkhart, Indiana로부터 구입할 수 있다. 머리핀 모양의 구조로된 DNA를 Sl뉴클레아제로 처리하면 염기쌍 말단을 가진 cDNA분자를 고수득률로 산출할 수 있다. 추출하고 크프마토그래피한 다음 상술한 바와 마찬가지로 에탄올 침전을 일으킨다. mRNA의 이중가닥 cDNA전사체를 합성할때 역전사효소와 Sl뉴클레아제를 사용하는 것은 Efstratiadis씨 등에 의해 위에서 설명되었다.

경우에 따라서는, 4개의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에 대장균 DNA폴리머라제 I로 처리하므로써 둔다(blunt ond)을 갖고 있는 cDNA분자의 비율을 최대로 할 수 있다. 이 효소의 엑소뉴클레아제 및 폴리머라제로써의 활성은 어떤 3'돌출말단을 제거하고 어떤 5'돌춘말단을 채우도록 작용한다. 이렇게하여 후속되는 결합반응에서는 cDNA분자의 비율을 최대로 할 수 있다.

본 공정의 다음 단계는 cDNA생성물의 말단을 처리하여 각 말단에 제한 엔도뉴를레아제 인지부위를 함유하고 있는 적당한 배열을 만드는 것이다. 말단에 첨가될 DNA단편의 선택은 취급하기 편리한 것으로 한다.

말단에 첨가될 배열은 선택된 특정한 제한 엔도뉴클레아제 효소를 기준으로 하여 선택하는데, 이 선택은 cDNA와 재결합하는 DNA매개체의 선택에 달려 있다. 선택된 플라스미드는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 민감한 부위를 적어도 하나 가지고 있어야 한다. 예를들어 플라스미드 pMB9는 효소 힌드 Ⅲ에 대한 제한부위를 하나 함유하고 있다. 힌드 Ⅲ는 Hemophilus influenzae로 부터 분리되며 Smith, H.0., 및 Wilcox, K.W., J. Mol. Biol. 51, 379(1970)의 방법으로 정제된다. Hemophilus aegyptious로 부터 분리된 효소, HaeⅢ는 Middleton, J.H., Edgell, M.H., and Hutchison Ⅲ, C.A., J. Virol. 10, 42(1972)의 방법에 의해 정제된다. Hemophilus suis로 부터 분리된 효소, HsuI은 힌드 Ⅲ와 동일한 일지부위에서 동위특정 가수분해를 촉매한다. 그러므로 이 두가지 효소들은 기능적으로 상호 교환할 수 있는 것으로 생각된다.

cDNA듀플렉스(duplex)말단에 부착시키기 위해서는, 힌드 Ⅲ에 대한 인지 배열을 함유하고 있으며 화학적으로 합성된 이중가닥의 데카뉴클레오티드를 사용하는 것이 좋다. 이중가닥의 데카뉴클레오티드는 제1도 에서 보여주는 배열을 가지고 있다. [상기 Heyneker, H.L., et al., and Scheller, R.H., et al. 참조].

이러한 합성 제한부위 배열은 다양하기 때문에 이 분야의 기술자에게 유용하게 사용되며, 따라서 매우 다양한 어떤 제한 엔도뉴클레아제의 작용에 민감하도록 듀플렉스 DNA의 말단을 제공할 수 있다.

제한부위 배열을 cDNA의 말단에 부착하는 것은 이 분야의 기술자에게 알려져 있는 어떤 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 선택된 방법은 둔갑결함(blunt end ligation)이라 불리워지는 반응으로서, Panet, A., et al., Biochemistry 12, 5045 (1973)의 방법으로 정제된 DNA리가아제에 의해 촉매작용을 발는다. 둔단 결할반응에 대해서는 상기 Sgaramella, V씨등에 의해 설명되었다. 둔단을 갖고 있는 cDNA와 힌드 Ⅲ엔도 뉴클레아제 제한 부위를 함유하고 있는 과잉몰의 이중가닥 데카뉴클레오티드 사이에 일어나는 둔단결합 반응의 생성물은 각 말단에 힌드 Ⅲ제한부위 배열들을 갖는 cDNA이다. 이 반응 생성물을 힌드 Ⅲ[엔도뉴클레아제르 처리하면 제한 부위에서 분해가 일어나고 도면1에서 보는 바와같이 단일 가닥의 5'자기-상보적 말단들을 형성한다.

4. 재결합성 DNA전달매개체의 형성

원칙적으로, 여러가지의 비루스성 DNA및 플라스미드 DNA가 상술한 방법으로 제조된 cDNA와 재결합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 중요한 조건으로 DNA 전달 매개체가 숙주세포로 들어갈 수 있어야하고, 숙주세포내에서 복제가 일어날수 있어야하며, 또한 유전결정인자를 가지고 있어 매개체를 받은 숙주세포들을 선택할수 있어야 한다. 그러나 공공 안전을 위해서, 선택의 범위는 상술한 NIH기준선에 따라, 실시할 실험의 형태에 적합한 전달매개체의 종류에 의해 제한된다. 공인된 DNA전달매개체의 목록은 새로운 매개체들이 개발되어 NIH재결합성 DNA안전 위원회에 의해 승인됨에 따라 계속해서 증가되고 있으며 본 발명에서는 나중에 NIH승인을 받을 것들을 포함하여 상술한 능력을 가진 모든 비루스성 DNA및 플라스미드 DNA의 사용을 심사숙고하여 나타내었다. 현재 승인된 전달 매개체로서 사용하기 적당한것은 박테리오파아지 람다의 여러가지 유도체[Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E., Denniston Thompson, K., Faber, H. E., Furlong, L.A., Grunwald, D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schumm, J.W., Sheldon, E.L., and Smithies, O., Science 196, 161 (1977) 참조] 및 플라스미드 콜 El의 유도체[Rodriguez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer. H.W., and Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on Mo1ecular Mechan-isms In The Control of Gene Expression, D.P. Nierlioh, W.J. Rutter, C.F. Pox, Eds, (Academic Press, NY, 1976), pp.471-477 참조]이다.

콜 El로부터 유래된 플라스미드는 비교적 작고, 몇백만 정도의 분자량을 가지고 있으며, 숙주세포당 플라스미드 DNA의 복제수가 보통 상태에서는 20-40인데 이 숙주세포를 클로람페니콜로 처리 하므로서 1000또는 그 이상으로 증가시킬수 있는 특징이 있다. 숙주세포내에서 유전인자용량을 증가시킬수 있다면 적당한 환경하에서 연구자의 조절에 따라 숙주세포는 플라스미드상에 옮겨진 유전자에 의해 유전암호화 되는 단백질을 먼저 생산할 수 있게 한다. 그러므로 이러한 콜 EI의 유도체들은 본 발명의 방법에 바람직한 전달 매개체이다. 콜 EI의 유도체로서 적당한 것으로 테트라사이클린 내성이 있는 유전자를 운반하는 플라스미드 pMB-9을 포함하여, 테트라사이클린 내성 유전자 외에 앰플리실린내성 유전자를 함유하는 pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 및 pBR-322를 들 수 있다. 약물 내성 유전자가 존재하면 플라스미드에 의해 성공적으로 감염된 세포들을 가려내는데 편리한데, 왜냐하면 이러한 세포의 클로니는 약물의 존재하에서도 성장하는 반면, 플라스미드를 받지못한 세포들은 성장하거나 클로니를 형성하지 않기 때문이다. 본 발명의 특정한 실시 예로서 본 명세서에 설명되어 있는 실험에서는, 콜 EI로부터 유래된 플라스미드가 전단적으로 사용되고 있으며 이는 상술한 약물내성 표지인자 외에도 힌드 Ⅲ부위를 하나 가지고 있다.

플라스미드의 선택과 함께 적당한 숙주의 선택에 있어서도 대체로 매우 광범위하나 공중안전을 위해 좁게 제한받고 있다. 본 명세서에 기술된 형태의 공정을 위해 P2격납설비를 사용하여 X-1776으로 명명된 대장균균주를 개발하여 NIH의 승인을 받았다[Curtiss, Ⅲ, R., Ann. Rev. Microbiol., 30, 507(1976)참조]

대장균 RR-1은 P3격납 설비를 사용할 경우에 적합하다. 플라스미드의 경우에서와 같인, 본 발명에서는 NIH기준선하에서 숙주세포 균주들의 사용이 승인되기만 하면 박테리아외의 원생생물, 예를들어 효모를 포함하여 선택된 매개체의 전달물로 작용할 수 있는 어떤 숙주세포 균주든 사용할수 있는것으로 이해된다.

재결합성 플라스미드는 제한 엔도뉴클레아제로 처리된 플라스미드 DNA와 비슷한 방법으로 처리된 잔기를 함유하고 있는 cDNA를 혼합하므로써 형성된다. cDNA체절들이 서로 결합할 기회를 최소로하기 위하여, 플라스미드 DNA를 cDNA보다 과잉 몰 첨가한다. 종전 기술에서 이러한 방법들은 대부분의 플라스미드가 cDNA단편에 삽입되지 않고 환상화(circulariBing)하는 결과를 초래했다. 그후에 변형된 세포들은 주로 플라스미드를 함유하지 cDNA재결합성 플라스미드를 함유하지 않는다. 결과적으로 이러한 선택공정은 매우 지주하며 시간소모적이다. 이러한 문제에 대한 종래 기술의 해결책으로서 적당한 표지 유전자의 중간에 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 DNA매개체를 고안하여, 재결합체를 삽입하면 유전자간 분리되어 유전자에의해 유전암호화 되는 기능을 손실하도록 하는 것이었다.

바람직한 것으로, 재결합성 플라스미드로 선택될 클로니의 수를 감소시키는 방법이 사용된다. 이 방법은 제한 엔도뉴클니아제로 절단된 플라스미드 DNA를 알카리성 포스파타아제로 처리하는 것이 포함되는데, 이 효소는 New Jersey의 Freehold에 있는 Worthington Biochemical Corporation같은 몇몇 출처로부터 상업적으로 얻을수 있다. 알칼리성 포스파타아제로 처리하면, 엔도뉴클레아제가 생성한 플라스미드의 말단으로부터 5'-말단 인산이 제거되고, 플라스미드 DNA의 자가 결합이 방지된다. 결과적으로 원을 형성하며 그에 따른 변형은 5'一인산화된 말단을 함유하고 있는 DNA단편을 삽입하는것에 달려있다. 기술된 방법은 재결합이 일어나지 않은 상황하에서 변형의 상대적 빈도를 1내지 10⁺⁴이하로 감소시킨다.

본 발명은 DNA리가아제 촉매반응이 5' -인산 DNA잔기와 3'∼히드록실 DNA잔기 사이에서 일어난다는 사실에 기초를 두고 있다. 만일 말단에 있는 5'-인산이 제거되면 결합반응은 일어나지 않는다. 이중가닥 DNA가 연결될수 있는데에서 일어날수 있는 세가지 상황을 하기 표1에 나타냈다.

표 1에서 이중가닥 DNA는 곧은 평행선들로 표시되어 있으며, 이들 각각의 5'및 3'잔기에는 히드록실(OH)이나 인산(OPO₃H₂)이 있다. I경우에, 5'인산은 두개의 반응물 말단에 모두 있으므로 결과적으로 두개의 가닥은 모두 공유결합하게 된다. Ⅱ경우에는 결합할 가닥들중 하나만이 말단에 5'인산을 가지고 있어, 결과적으로 다른 가닥(5'인산을 말단에 가지고 있지 않은 가닥)은 불연속적인 단일 가닥으로 남겨두고 하나만 공유단일 가닥 결합을 일으킨다. 공유결합되지 않은 각닥은 당해업계에 널리 알려져있는 바와같이 반대쪽 가닥에 있는 상보적인 염긴쌍들과 수소결합 사이의 상호작용힘에 의하여 공유결합을 한 분자와 결합된다. Ⅲ경우에는 반응물 말단중 어느것도 5'-인산을 가지고 있지 않으므로, 어떤 결합반응도 일어날 수 없다.

그러므로 결합반응을 원하지 않을때는 결합을 방지하고자 하는 반응물의 적당한 말단을 처리하여 이로부터 5'-인산기들을 제거하면 된다. DNA구조를 손상시키지 않고 5'-인산기만 제거하는 적당한 방법을 사용한다. 알칼리성 포스파타아제 효소가 촉매작용을 하는 가수분해가 적당하다.

상술한 공정은 선형 DNA분자를 전형적으로 제한 엔도뉴클레아제 호소를 사용하여 두개의 세분된 단편(subfragment)으로 분해시킨 다음 원래의 배열대로 다시 구성하고자 하는 경우에도 또한 유용하다. 이 세분된 단편들을 따로따로 정제한후, 이 단편들을 재결합 하므로써 바람직한 배열을 재구성할수 있다. 이러한 목적으조 DNA단편의 말단과 말단을 연결하는 반응을 촉매하는 효소 DNA리가아제를 사용한다[Sgarame-lla, V., Van de Sande, J.H., and Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sci USA 67, 1468 (1970)참조].

연결될 배열들이 둔단을 가지고 있지 않은 경우에는, 대장균으로부터 얻은 리가아제를사용한다[Modrich, P., and Lehman, I.R., J. Biol. Chem. 245,3626 (1970)참조].

제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 세분 단편들로부터 원래의 배열을 재구성하는 효율은 부적당한 배열의 재구성을 방지하는 방법을 사용하므로써 매우 증가된다. 이러한 바람직하지 못한 결과를 방지하기 위해서는 배열을 가진 균등한 길이의 cDNA단편을, 동종의 cDNA를 제한 엔도뉴클레아제로 파괴시키기 전에 cDNA의 5'-말단 인산기를 제거할수 있는 시약으로 처리하면 된다. 효소로는 알칼리성 포스파타아제가 바람직하다. 5'-말단 인산기들은 분열된 세분 단편들을 재구성하는데 사용되는 DNA리가아제의 후속적인 연결작용을 위한 구조적 필요조건이다. 그러므로 5'-말단 인산이 없는 잔기는 공유결합될 수 없다. DNA세분 단편들은 분리된 DNA단편에서 행해지는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의하여 생성된 5'-인산을 함유하고 있는 말단에서만 결합될 수 있다.

상술한 공정의 가장 중요한 것으로 원하지 않은 연결반응의 형성, 즉 전-후 대신에 후-전의 반대 배열을 가진 두개의 단편들을 연결시키는 것을 방지한다. 기타 가능한 부반응들, 예를들어 이합체형성및 고리화 반응은 상기 표 1, 경우 Ⅱ의 반응에 의해 일어나는 것이므로 방지할 수 없다. 이러한 부반응들은 물리적으로 분리할 수 있고, 분별할수 있는 생성물을 만들며, 반대 방향으로의 재조합은 일어나지 않으므로 거의 말성이 없다. 상기한 공정을 설명하기 위하여, 쥐 인슐린을 유전 암호화하는 cDNA를 분리하여 플라스미드와 재결합시켰다. 이 DNA분자들은 대장균 X-1776을 변형시키는데 사용하였다. 변형체를 테트라사이클린을 함유하고 있는 배지상에서 성장한 것으로 선택하였다. 변형된 세포로부터 얻어진 재결합성 플라스미드 DNA 하나가 약 410뉴클레오리드 정도의 길이를 가진 삽입된 DNA단편을 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 유사한 공정으로 분리된 다른 재결합체들도 획득하여 분석하였다. 삽입된 단편들은 힌드 Ⅲ나 HUS I엔도뉴클레아제 소화에 의하여 플라스미드로부터, 방출되었고 Maxam, A.M. 및 Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci USA 74, 560(1977)의 방법으로 DNA배열을 분석하였다. 삽입된 단편들의 뉴클레오티드 배열은 중첩(overlapping)되어있고, 프리펩티드 배열의 23아미노산증 13개뿐만 아니라 쥐 프로인슐린에 I에 대해서 전체적으로 유전 암호화하는 영역을 함유하고 있음이 밝혀졌다. 이 영역에 있는 뉴클레오티드 배열을 가진 합성물은 하기한 바와같이 형성된다.

비슷한 방법으로, 쥐의 성장 호르몬을 유전암호화하는 cDNA를 분리하여, 플라스미드와 재결합시킨 다음 대장균에 전달하였다. 대장균내에서 상당한 복제가 일어난후 길이가 약 800뉴클레오티드인 뉴클레오티드 배열이 재분리 되었고, 전구체 펩티드부분과 번역되지 않은 5'부분 뿐만 아니라 RGH에 대해 완전히 유전암호하는 배열을 포함하고 있음이 밝혀졌다.

방금 상술한 공정은 사람을 포함한 고등생물로부터 유전자를 분리및 정제하고, 이러한 유전자를 미생물에 전달하거나 미생물내에서 복제하는데 일반적으로 사용된다. 분리된 유전자의 전부 또는 일부를 함유하고 있는 새로운 재결합성 플라스미드에 대해 설명하였고, 지금까지 전혀 알려져 있지 않고 고등생물로부터 얻은 유전자를 이들의 유전적 구성부로 가지고 있는 새로운 미생물들을 설명하였다. 쥐의 인슐린 유전자를 분리, 정제하여 대장균에 전달하는 본 공정의 각 단계를 상세히 설명한 실시예가, 본 발명의 특징과 효용을 보다 명확히 하기 위해 다음에 기재되어 있다. 실시예들은 쥐의 인슐린 유전자, 쥐의 성장호르몬 유전자, 사람인슐린 유전자및 사람 성장호르몬의 유전자들을 함유하고 있는 재결합성 플라스미드및 상기 유전자들을 함유하고 있는 새로운 미생물의 특징을 설명하고 있다.

[실시예 1]

설명할 과정들은 쥐의 인슐린 mRNA의 추출및 분리. mRAN에 상보적인 DNA의 합성및 이 상보적인 DNA의 특성을 기술하고 있다. 정제된 쥐의 랑게르한스섬 세포를 얻기 위하여 마취된 쥐의 췌장을 행크 염용액으로 가득 채우는데 이는 췌장관에 역행 주일하므로써 가능하다.

행크 염용액은 이 분야에서 공지된 표준 염용액 혼합물이며, Grand Island Biological Supply Company, Grand Island, New York같은 다수의 상업적 원천으로부터 구입할 수 있다. 그 다음에 췌장을 잘라내어 섭씨 0도의 행크 용액내에서 잘게 자른다음 클라게나제및 콩 트립신 억제제로 소화시켰다. 모든 공정들은 특별히 언급되지 않는한 섭씨 0도-4도에서 실시했다. 소화과정의 조건은 극히 중요하여, 행크용액내에 있는 총부피 8ml의 잘게자른 쥐 췌장 2개를 30ml의 유리시험관에 넣었다. 모든 유리시험관은 실리콘으로 미리 처리하였다. (실리콘 : 실리클라드, 상품명, clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany. NeW Jersey) 배양혼합물은 12mg의 클라게나체 즉 Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NewJersey로부터 얻은 CLS Ⅳ형태의 Clostridium histolyticum를 사용하여 Mandl, I., Mackennan, J.D. and Howes, E.L., J. Clin.Invest. 32, 1323 (1943A)의 방법으로 제조한 효소및 미주리주 세인트 루이스에 있는 Signa chemical Company로부터 얻은 콩 트립신 억제제 1mg을 함유하고 있다. 배양은 섭씨 37°에서 1분에 90번의 속도로 25분 동안 교반하였다. 콜라게나제 소화가 최적의 정도까지 진행되는 것을알기 위하여 계속적으로 관찰해야 한다. 배양이 너무 짧으면 랑게르한스섬 세포들은 불완전하게 유리되고, 배양이 너무 길면 랑게르한스섬 세포가 용해하기 시작한다. 배양후 그 시험관을 200×G에서 1분 동안 원심분리 하였다. 상청액을 따라 버리고 펠릿을 행크 용액으로 세척하는 과정을 5회 반복하였다. 마지막 원심분리 후에 펠릿을 1.O85의 밀도를 갖는 피콜(상품명, Pharmacia chelmical Company, Uppsala, Sweden) 15ml에 현탁시켰다. 밀도가 1.080인 피콜 8ml를 첨가하고 또 밀도 1.060인 피콜 5ml를 첨가하여 층을 이룬 다음, 이 시험관 500×G에서 5분동한 날개 회전자에서 원심분리한후, 다시 2,000×G에서 5분동안 원심분리 하였다.

상기 공정결과, 아시날(acinar)세포들은 유리관 바닥에 남아있고, 랑게르한스섬 세포들은 경사를 이루어 두개의 상층 사이에 층을 형성하였다. 랑게르한스섬 띠는 오염시키는 가글리온(gaglion)세포, 림프절및 결합조직을 함유하고 있다. 커다란 오염 물질들은 띠에 있는 물질들조 부터 제거하였다. 나머지 부분들을 해부용 현미경 아래놓고, 오염물질이 보이면 마이크로 피펫을 사용하여 제거하였다. 이 세포 표본을 행크 용액으로 희석한후 원심분리하였다. 상청액을 따라 버리고 이 세포 펠릿을 액체 질소에서 냉동 보관 하였다.

200마리의 쥐로부터 모여진 랑게르한스섬 세포들을 pH 5.0으조 완충된 섭씨 4도의 1M β-메트캅토에탄올을 함유하고 있는 4M티오시안산 구아니디늄(Tridom, 상품명, Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, 스위스)에서 균질화 하였다. 이 균질액에 100mM EDTA를 함유하고 있는 5.7M CsCl 1.2ml를 부은 다음, 섭씨 15도에서 벡크만 초원심 분리기의 SW 50.1희전기 내에서 37,000rpm으로 18시간동안 원심분리 하였다.

(Beckman Instrument Company, Fullerton, California) RNA는 시험관 바닥으로 이동 하였다.

총 RNA표본을 상기한 Aviv, H., 및 Leder, P.의 방법에 따라 올리고 (dT)-셀룰로오스 상에서 크로마토그래피 하므로써 폴리아데닐산염화 RNA를 분리하였다. D.J. Beard, Life Science Inc., St. Petersburg, Florida에 의해 제공된 닭의 골수성 백혈병비루스 역전사효소는 쥐의 랑게르한스섬으로 부터 분리된 총 폴리아데닐산염화 RNA를 cDNA에 전사하는데 사용하였다. 이 반응들은 50mM의 트리스-HCl, pH8.3, 9mM MgCl₂, 30mM NaCl, 20mM베타-메르캅토에탄올, 세가지의 비방사능 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 각 1mM씩, 고유활성도가 몰당 50-200퀴리인 알파-32_p로 라벨된 4번째 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 250μM, Collaborative Research, Waltham, Massachusetts로부터 얻은 올리고-dT 12-18 20ug/ml, 100ug/ml의 폴리아데닐산염화 RNA 및 역전사효소 200단위/ml중에서 살시되었다. 이 혼합물을 섭씨 45도에서 15분간 배양시켰다. EDTA-NA₂를 25mM까지 첨가한후에, 이 용액을 같은 부피의 물로 포화된 페놀로 추출하였고, 그 다음에 10mM트리스-HCl, pH9.0, 100mM NaCl, 2mM EDTA를 함유하는 직경 0.3cm 높이 10cm인 세파덱스 G-100 100칼럼 상에서 액체상을 크로마토그래피 하였다. 공극 부분에서 용출된 핵산은 pH6.0의 초산 암모늄을 0.25M첨가한 후에 에탄올로 침전시켰다. 침전물을 원심분리에의해 모은 다음, 펠릿을 새로 만든 0.1M NaOH 50μl에 용해시키고, RNA를 가수분해 하기 위해 섭씨 70도에서 20분 동안 배양하였다. 이 혼합물에 pH4.5의 초산나트륨 1M을 첨가하며 중화시키고,³²P-cDNA생성물을 에탄올로 침전시킨 다음 물에 다시 용해시켰다. 단일가닥 cDNA의 분취량을 Dingman, C.W., and Peacock, A.C., Biochemistry 7,659(1968)의 방법으로 천연의 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다.

상기 겔을 건조시키고 Kodak No-Screen NS-2T필름(상품명, Eastman Kodak Corporation, Rochester, New York)을 사용한 방사성 자동사진에 의해³²P DNA를 검출하였다. 전기영동 양식에 의해 판단된 바와 같이 이 cDNA는 여러종류가 분산되어 있었으며, 공지된 표준과 비교해본 결과 길이가 약 450뉴클레오티드인 중요한 cDNA적어도 한 종류는 함유하고 있었다.

[실시예 2]

쥐 인슐린의 배열을 함유하고 있는 이중가닥 cDNA의 합성및 특성을 설명하고자 한다. 실시예 1의 단일가닥 cDNA생성물을 역전사효소로 처리하여 상보적 가닥을 합성했다. 반응혼합물에는 50mM트리스-HCl, pH 8.3, 9mM MgCl₂, 10mM디티오트레이톨, 세가지의 라벨이 안된 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 각각 50mM씩, 고유 활성도가 밀리몰당 1-10퀴리인 알파³²P로 라벨된 뉴클레오시드 트리포스페이트 1mM, 50μg/ml cDNA및 220단위/ml의 역전사효소가 포함되었다. 이 반응 혼합물을 섭씨 45도에서 120분동안 배양하였다. EDTA-Na₂를 25mM첨가하여 반응을 중단시킨 다음 페놀로 추출하여 세파덱스 G-100상에서 크로마로그래피한 후 에탄올 침전을 실시했다. 500cpm에서 1000cpm을 갖는 반응 생성물의 분취량을 실시예 1에서 설명한 바와같이 겔 전기영동에 의하여 분석하였다. 표준 시료와 비교해본 결과 길이가 약 450뉴클레오리드인 중심을 갖는 이종분산액띠가 관찰되었다. 실시예 1및 실시예 2의 DNA반응상성물 분취량들을 과량의 제한 엔도뉴클레아제 Hae Ⅲ로 소화시킴으로써 각각 처리하여 유사한 방법으로 겔 전기영등에 의해 분석하였다. 이 생성물들을 둘다 엔도뉴클레아제로 분해하여 두개의 방사능띠를 겔 전기영동 상에서 관찰하였다. 이중가닥 cDNA를 분해하므로써 생겨난 띠들은 단일 가닥 cDNA를 분해하므로써 생긴 띠와 똑같은 길이의 분해 생성물들을 나타낸다.

[실시예 3]

Hind Ⅲ데카뉴클레오리트 결합체와 실시예 2의 쥐 랑게르한스섬 이중가닥 cDNA의 둔단 결합에 대해 설명하고자 한다. 농도간 2-5μg/ml인 실시예 2의 이중가닥 반응생성물을 인디아나주 엘크하르트에 있는 마일즈 실험실로부터 얻은 1200/단위ml의 활성을 가진 Sl뉴클레아제 30단위로 처리하고, 섭씨 22도에서 0.03M초산나트륨, pH4.6, 0.3M염화나트륨, 4.5mM ZnCl₂중에서 30분간 배양한 다음 섭시 10도에서 다시 섭시분간 더 배양하였다. 최종농도가 0.1M될때까지 트리스 염기를 첨가하고 또 EDTA를 25mM첨가하고 von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, S.P. Colowick and N.O. Kaplan, Eds., Vol. 12A, p588 (1967)의 방법에 의하여 제조된 대장균 tRNA를 40μg/ml 첨가하여 소화를 중단시켰다. 이 반응혼합물들 페놀로 추출하고, 세파덱스 G-100으로 크로마토그래피한후, 공극부분에 용출된³²P-cDNA를 에탄올로 침전시켰다. 이렇게하여 화학적으로 합성된 데카뉴클레오리드와 둔단 결합하는데 필요한 염기쌍 말단을 가진 cDNA분자를 고수득율로 얻을수 있다. Hind Ⅲ데카머는 Scheller, R.H., Dickerson. R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. and Itakura, K., Science 196, 177(1977)의 방법에 의하여 제조 되었다. Hind Ⅲ데카머와 cDNA와의 결합은 섭씨 14도에거 66mM트리스-HCl, pH 7.6, 6.6mM MgCl₂, 1mM ATP,10mM디티오트레이톨, 10⁵cpm/pmol을 갖는 3mM Hind Ⅲ데카머및 약 500단위/ml의 T⁴DNA리가아제중에서 1시간동안 배양시키면 된다. 그런다음 이반응 혼합물을 섭씨 65도로 5분간 가열하여 리가아제를 불활성화시켰다. KCl을 최종농도 50mM까지, 베타-메르갑토에탄올을 최종농도 1mM까지, 그리고 EDTA를 최종농도 0.1mM까진 첨가한 다음 150단위/ml의 HSU I이나 Hind Ⅲ엔도뉴클레아제로 섭씨 37도에서 2시간 동안 소화시켰다.

Hind Ⅲ및 Hae Ⅲ엔도뉴클레아제는 메사추세츠주, 비벌리에 있는 뉴잉글랜드 생물학 연구소로부터 상업적으로 구입할수 있다. 이 반응 생성물을 실시예 1에서와 마찬가지로 겔 전기 영동에 의해 분석하였고, 분해된 Hind Ⅲ데카머의 단편과 함께 약 450뉴클레오티드 배열에 해당하는 피이크(Peak)가 관찰되었다.

[실시예 4]

재결합성 플라스미드의 형성및 복제후의 특징에 대하여 설명한다. Rodriguez, R.L. Boliver, F., Goodm-an, H.M., Boyer, H.W., and Betlach, M., in ICN-UCLA Symoposium on Molecular and Cellular Bio-logy, D.P. Wierlich, W.J. Rutter, and C.F. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976) pp.471-477에 설명되어 있는대로 플라스미드 pMB-9 DNA를 제조하였다. 이 플라스미드 pMB-9 DNA를 Hsu I엔도뉴클레아제를 사용하여 Hind Ⅲ제한부위에서 분해하고, 그 다음에 알칼리성 포스파타제, BAPF형으로 처리하였다. 이 알칼리성 포스파타제는 Worthington Biochemical Corporation. Freehold, New Jersey에서 구입한 것이다. 이 효소는 반응 혼합물에서 0.1단위/μg DNA정도로 존재한다. 이 반응 흔합물을 25mM 트리스-HCl중에서 섭씨 65도,. pH8을 유지하며 30분간 배양시킨후 페놀 추출하여 포스파타제를 제거 하였다. 에탄올 침전을 한후 포스파타제로 처리된 플라스미드 DNA를 플라스미드 3몰 대 cDNA 1몰의 몰비로 Hind Ⅲ결합성 말단을 함유하는 cDNA에 첨가하였다. 이 혼합물을 섭씨 14도에서 50단위/ml의 T4 DNA리가아제 존재하에 66mM트리스, pH 7.6, 6.6mM MgCl₂, 10mM디티오트레이톨, 및 1mM APT중에서 1시간동안 배양하였다.

결합 혼합물을, 하기와 같이 전형(轉形, transformation)시키기 위해 제조한 대장균 X-1776세포들의 현탄액에 직접 첨가하였다. 세포들을 트립톤 10g/1, 효모 추출물 5g/1, NaCl 10g/1, NaOH 2mM, 디아미노 피멜산 100ug/ml및 티민 40μg/ml를 함유하고 있는 배지 50ml내에서 약2×10⁸세포/ml의 세포밀도로 성장 될때까지 섭씨 37도로 배양하였다. 이 세포들을 섭씨 5도에서 5,000×G의 속도로 5분간 원심분리하여 수집한 다음, 차게한 10mM NaCl 20ml에 재현탁시키고, 전과 같이 원심분리하여75mM CaCl2, 140mM NaCl 및 10mM트리스 pH7.5를 함유하는 전형 완충액 20ml에 재현탁시킨후 얼음 속에 5분간 방치 하였다. 그런 다음 세포들을 원심분리하고 0.5ml전형 완충액에 재현탁 시켰다. 전형은 100μl의 세포현탁액을 50μl의 재결합성 DNA(1μg/ml)와 혼합하므로써 실시되었다. 이 혼합물을 섭씨 0도에서 15분동안 배양시킨다음 섭씨 25도에서 4분간, 그 다음에 섭씨 0도에서 30분간 배양 하였다. 그런다음 세포들을 선택된 조건하에서 성장 시키기 위해 한천 평판 배지에 이식 하였다.

Hind Ⅲ부위로 전형시키기 위해서 5μg/ml의 테트라사이클린으로 재결합성 플라스미드를 가려내었다.

PAU-1이라고 명명된 가려낸 재결합체를 분리하였다. PAU-1으로부터 분리된 2μg-5μg DNA의 조플라느미드 표본들을 과량의 Hsu I엔도뉴클레아제로 소화시켰다. EDTA-Na₂10mM및 설탕 10%w/v(즉, 부피에 대한 무게비) 최종농도를 첨가하고, 그 다음 이 혼합물을 8%폴리아크릴아미드 겔 상에서 용해시켰다.

DNA는 약 410염기쌍의 길이에 해당하는 위치에서 발견되었다. 비슷한 실험에서, 전달 매개체로 플라스미드 PBR-322를 사용하였다. 모든 조건은 상기한 바와 같으나 단지 재결합성 균주의 최종 선택을 20μg/ml의 암퍼실린을 함유하는 평판배지에서 실시한다는 점이 다르다.

[실시예 5]

실시예 4에서 설명한 바와같이 PAU-1으로부터 분리된 DNA를 6%폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동을 하여 더욱 정제하였다. 겔로부터 용출한 다음, DAN를 상기한 Maxam 및 Gilbert가 설명한 조건하에서 감마-32P-ATP 및 효소폴리뉴클레오티드 키나아제로 배양시킴으로써 라벨하였다. 상기 효소는 방사능이 있는 포스페이트기를 감마-³²P-ATP로부터 DNA의 5'-말단으로 전달하는데 촉매작용을 한다. 이 효소는 Panet, A., et al., Biochemistry 12, 5045(1973)의 방법에 의해 대장군으로부터 얻은 것이다. 이렇게하여 라벨된 DNA는 실시예 2에서 설명한 바와같이 Hae Ⅲ엔도뉴클레아제에 의하여 분해되며, 두개의 라벨된 단편, 즉 각각 약 265및 135염기쌍들을 실시예 1에 기술한 조건하의 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 이 분리된 단편들을 상기 Maxam및 Gilbert의 방법에 따라서 특정한 분해 반응을 일으킨후 배열을 분석하였다. 표1의 배열은 이러한 일련의 실험으로부터 발견한것과 pMB-9및 pBR-322와 같은 콜 El로부터유래된 플라스미드 매개체를 사용하여 유사한 일련의 CDNA를 발견한 것의 합성물을 기초로한 것이다.

배열의 5'말단에서 50-120뉴클레오티드 길이 사이에 있는 배열은 분명치 않으며 3'-말단에 있는 폴리 dA체절의 길이는 다양하다. 이 배열은 현재 이용할수 있는 가장 좋은 정보를 나타내는 것으로, 계속 연구가 진행됨에 따라 보다 자세히 알수 있으며 또한 어떤 면에서는 약간의 수정을 필요로하는 것으로 이해된다.

쥐의 프로인슐린 I의 대응하는 아미노산 배열은 1로 표시한 3연염기 위치에서 시작하여 86이라고 표시한 3연염기 위치에서 끝난다 점선으로 밑줄그은 배열에 관해서는 다소 불명확한 채로 남아있다.

[표 1]

[실시예 6]

실시예 1-4에서 설명한 바와같이 사람의 인슐린을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 분리하고 정제한 다음 플라스미드에 삽입하는 것은 기부된 췌장이나 깨끗한 시체, 또는 사람의 인슐리노마와 같은 적당한 원천으로부터 사람의 췌장조직을 분리함으로써 시작된다. 실시예 4에서 설명한 바와같이 사람 인슐린 A사슬 및 B사슬을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 미생물을 생산한다.

사람 인슐린의 A사슬에 대해 공지된 아미노산 배열은 다음과 같다 :

사람 인슐린의 B사슬에 대해 공지된 아미노산 배열은 다음과 같다.

아미노산 배열은 유리 아미노기를 갖는 말단에서부터 번호를 붙인다[Smith, L.F., diabetes 21 (suppl. 2) 458 (1972) 참조].

[실시예 7]

RGH에 대한 완전한 구조유전자 배열을 갖는 DNA의 분리및 정제에 관하여, RGH에 대한 완전한 구조유전자를 함유하는 전달 매개체의 합성및 유전자구조의 일부로 RGH에 대한 유전자를 함유하는 미생물 균주의 형성을 함께 설명한다.

사람의 유전자가 아닌것을 포함하고 있는 경우에, U.S. Federal안전규정에는 사람의 cDNA에서 요구한것처럼 고순도로 cDNA를 분리할것을 요구하지 않는다. 그러므로 RGH의 공지된 아미노산 길이로부터 결정된 바와같이 약 800염기쌍 길이로 전기영동으로 분리된 DNA를 분리하므로써, 완전한 RGH 구조 유전자를 함유하는 cDNA를 분리할수 있다. 배양된 쥐의 뇌하수체 세포, American Type Culture Collection으로부터 구입한 GH-1세포계통의 아군주들 RGH mRNA의 원료로서 사용된다[Tashjan, A.H., et al., End-ochrinology82, 342 (1968) 참조].

이러한 세포들의 경우 정상 조건하에서 자라면, 성장호르몬 mRNA는 RNA를 함유하고 있는 총 폴리-A의 단지 1-3%에 불과하다. 그러나 갑상선 호르몬과 글루코코르티코이드를 함께 작용시키므로써 다른 세포의 mRNA종류 이상으로 성장 호르몬의 mRNA수준을 상승시켰다. 현탁액 배양으로 5×10⁸로 성장한 세포로부터 RNA를 수득하고, 세포를 수집하기전에 4일 동안 배지에 1mM덱사메타손 및 10mML-트리요오드티로닌을 포함시켜 성장 호르몬의 생성을 유발하였다. 다른데서 설명한 바와같이 배양된 세포의 세포질막부분으로부터 폴리아데닐산염화 RNA를 분리하였다[Martial, J.A., Baxter, J.D., Goodman, H.M. aud See·burg, P.H., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 1816 (1977), and Bancroft, F.C., Wu, G, and Zubay, G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 3646 (1973) 참조].

상기 실시예 1,2및 3에서 기술한 바와같이 mRNA를 더욱 정제하여 이중가닥 cDNA에 전사하였다. 겔 전기영동으로 분류한 다음 약 800염기쌍 길이를 가진 DNA에 대응하는 확실한 띠가 희미하게나마 관찰되었다.

배양된 뇌하수체 세포의 mRNA로부터 전사된 완전한 cDNA를 Hha Ⅰ엔도뉴클레아제로 처리하여 전기영등 분리를 한 결과 약 320뉴클레오티드(단편 A) 및 240뉴클레오티드(단편 B)에 대응하는 두개의 중요한 DNA단편을 수득했다. 실시예 5에서 설명한 바와같이 단편 A및 단편 B의 뉴클레오티드배열을 분석한결과 이러한 단편들은 다른 공지된 성장흐르몬 배열과 비교하여, 그리고 공포된 RGH아미노산 배열 데이타를 근거로하여 RGH에 대한 코우딩 영역의 부분임이 증명되었다[Wallis, M. and Davies, R.V.N. Growth Hor-mone And Related Peptides (Eds., Copecile, A. and Muller, E.E.), pp.1-14 (Elsevier, New York, 1976), and Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, suppl. 2, pp.120-121 (Na-tional Biomedical Research Foundation, Washinton, D.C., 1976) 참조].

상술한 바와같이 전기영동에 의하여 분리된 800염기쌍의 이중가닥 cDNA를 Hha I엔도뉴클레아제로 처리하면 A단편및 B단편에 대응하는 길이를 가진 두개의 단편들이 중요한 분해 생성물들 사이에서 발견되었다.

약 800염기쌍으로된 RGH-cDNA는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 정제되지 않으므로, 쌍을 이루지않은 단일가닥 잔기들을 제거하기 위하여 DNA를 처리해야한다. 실제로 이러한 잔기들을 제거하기 위하여, 전기영동법으로 분리하기 전에 pH7.5의 60mM트리스-HCl, 8mM MgCl₂, 10mM β-메르캅토에탄올, 1mM ATP및 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 각각 200μM씩을 포함한 25μl액에서 처리하였다. 이 혼합물을 섭씨 10도에서 1단위의 대장균 DNA폴리더라제 I으로 10분간 배양시켜 엑소핵산분해적으로 3'돌출말단을 제거하고 5'돌출말단을 채웠다. DNA폴리머라제 I은 Boehringer-MannheimBiochemicals, Indianapolis, Indi-ana로부터 상업적으로 구입할 수 있다.

실시예 3에서 설명한 바와같이 약 800염기쌍으로된 RGH-cDNA를 화학적으로 합성된 Hind Ⅲ결합체로 처리하였다. 암피실린 내성 유전자및 테트라사이클린 내성 유전자내에 존재하는 단일 Hind Ⅲ부위를 갖고있는 플라스미드 pBR-322를 실시예 4에서 설명한 바와같이 Hind Ⅲ엔도뉴클레아제및 알칼리성 포스파타제로 미리 처리하였다. 처리된 플라스미드는 실시예 3에서 설명한 바와같이 DNA리가아제 반응혼합물에서 800개의 염기쌍으로된 RGH-cDNA와 결합하였다. 리가아제 반응혼합물은 실시예 3에서 상술한 바와같이 처리된 대장균 X-1776세포의 현탁액을 전형시키는데 사용되었다. 재결합성 클로니들은 암피실린을 함유하고 있는 영양 평판배지 상에서 성장하고, 20μg/ml테트라사이클린에서는 성장할수 없으므로 구별할수 있다.

10개의 이러한 클로니를 얻었는데 이들은 모두 Hind Ⅲ분해에 의하여 유리된 약 800개의 염기쌍 가운데 하나의 삽입체와 함께 플라스미드를 운반했다.

800개의 염기쌍으로된 RGH-DNA는 재결합성균주 pRGH-1으로부터 충분양 분리되었고, 이의 뉴클레오티드배열은 실시예 5에서 설명한 바와같이 결정되었다. 이러한 경우에 뉴클레오티드 배열은 분비되기전의 성장 호르몬의 전구 단백질에서 볼수 있는 26아미노산 배열뿐만 아니라 RGH의 5'가 번역되지 않은 영역의 부분들을 포함하였다. 유전자 배열로부터 추론된 mRNA배열의 메신저는 표2에 나타나있다. 상기 Wallis및Davies가 설명한 바와같이, 예견했던 아미노산 배열은 잔기 1-43, 65-69, 108-113, 133-143및 150-l9O을 함유하는 쥐성장 호르몬의 부분적인 아미노산 배열과 1과 8위치를 제외하고는 일치한다.

[표 2]

RGH를 유전암호화하는 완전한 배열을 함유하는 단일가닥의 DNA뉴클레오티드 배열. 대응하는 아미노산들을 아미노 말단에 대한 위치번호와 함께 표시했다. 음수로 번호가 표시되어 있는 아미노산은 프리-성장호르몬 배열을 나타낸다. 대응하는 mRNA배열은 동일하되 단지 mRNA에서는 T가 U로 대치된다.

[실시예 8]

HGH를 유전암호화하는 완전한 유전자 배열의 분리 및 정제에 대하여, 그리고 HGH에 대한 완전한 구조유전자를 함유하는 재결합성 플라스미드의 합성및 유전자구조의 일부로 HGH에 대한 완전한 구조유전자를 갖는 미생물의 생성에 대해 설명한다.

HGH mRNA의 분리는 생물학적 원료물질이 사람의 뇌하수체 종양조직이라는 점을 제외하고는 실시예 7에서 설명한 것과 동일하게 실시된다. 양호한 다섯 사람의 뇌하수체 종양을 외과 수술로 제거한후 액체 질소속에서 재빨리 냉동시킨 다음 각각 0.4g에서 1.5g씩 잘라 녹여서 pH5.0으로 완충된 1M메르갑토에탄올을 함유하는 섭씨 4도의 4M티오시안산 구아니디늄에서 균질화 하였다. 이 균질액을 100mM EDTA, 함유하고 있는 5.7M CsCl 1.2ml에 붓고, 섭씨 15도에서 벡크만초원심분리기(Beckman Instrument Company, Fullerton, California)의 SW 50.1회전기 내에서 37,000rpm의 속도로 18시간 동안 원심분리 하였다. RNA는 시험관의 바닥에 모였다. 더욱 정제하기 위해서는 실시예 1,2및 3에서 미리 설명한 바와같이 올리고-dT칼럼및 설탕 기울기 침강법을 사용하였다. 이렇게 하여 분리된 RNA의 약 10%는 성장 호르몬을 유전암호화하는데 사용되며 이 사실은 밀 배아로부터 유도된 무세포 번역 체제에서 항성장 호르몬 침전물에 방사성 아미노산 전구체를 혼합하므로써 밝혀졌다[Roberts, B.E. and Patterson, B.M., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 2330 (1973) 참조].

HGH-cDNA는 실시예 7에서 설명한 바와같이 실시하므로써 제조된다. HGH-cDNA는 겔 전기영동에의해 분류되며 약 800개의 뉴클레오티드 길이에 대응하는 위치로 움직이는 물질을 균주화하기 위핵 선택한다. 선택된 부분을 실시에 6에서 설명한 바와같이 DNA폴리머라제 I으로 처리한다음 Himd Ⅲ결합체를 잔기에 첨가하였다. 그런다음 DNA리가아제를 사용하여 cDNA를 알칼리성 포스파타제로 처리된 플라스미드 pBR-322와 재결합시켰다. 대장균 X-1766을 재결합성 DNA로 전형시키고 HGH DNA를 함유하고 있는 균주를 선택한다. HGH-DNA를 함유하고 있는 균주를 준비된 양만큼 성장시키고, 이들로부터 HGH-DNA를 분리하여 이들의 뉴클레오티드 배열을 결정하였다. 균주화된 HGH-DNA는 HGH의 완전한 아미노산 배열을 유전암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 있음이 밝혀졌다. HGH의 처음 23개 아미노산들은

이 배열의 나머지 부분은 표 3에 나타나있다.

[표 3]

HGH-DNA단일가닥의 뉴클레오티드 배열. 번호는 아미노말단에서 시작하는 HGH의 아미노산 배열번호이다. 표에 나타난 DNA배열은 HGH에 대한 mRNA배열에 대응하나 단지 mRNA에서는 T가 U로 대치된다.

본 발명의 방법은 처음으로 척추동물과 같은 고등생물로부터 특정한 조절 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 분지하여 이 배열에 포함되어 있는 유전정보를 이것이 무한히 복제될 수 있는 미생물에 전달할 수 있게 하였다. 설명한 방법은 사람 인슐린 유전자의 분리및 정제와 이것을 미생물에 이식하는데 적용된다. 유사한 방법으르 사람의 성장 호르몬 유전자및 기타 단백질 유전자들을 분리하고, 미생물에 전달하여, 거기서 복제할 수 있다. 몇가지 새로운 재결합성 플라스미드가 밝혀졌는데, 이들은 각각 이들의 눈클레오티드 배열내에 고등생물 유전자의 구조를 갖는 배열을 함유하고 있으며 고등생물의 유전자로부터 전사된다. 몇가지 새로운 미생물이 알려졌는데 이들은 각각 고등생물 유전자의 구조를 갖는 뉴클레오티드 배열을 함유하도록 수정되어 고등생물의 유전자로부터 전사된다. 본 발명의 실시는 쥐의 프로인슐린 I 유전자를 대장균 균주에 이식하고, 또 쥐의 성장 호르몬 유전자를 대장균 균주에 이식하므로써 증명되었다. 이식된 유전자의 주요 부분의 배열은 각각의 경우에 결정되었으며 이 배열은 모든 형태의 생물체에 일반적으로 공지된 유전암호를 참고로 하여 결정된 바와같이 쥐의 프로인슐린 또는 쥐의 성장 호르몬 각각의 완전한 아미노산배열을 유전암호화하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 특정한 구체적인 실시예를 들어 설명하기는 하였으나, 여러가지로 변형하여 이용할수 있다. 본 발명의 출원은 대체적으로 본 발명의 원리를 추구하는 본 발명의 어떠한 변형, 응용 또는 적응도 모두 본 발명의 범주내에 들어가는 것으로 간주하며, 본 명세서에는 기술되지 않았으나 본 발명에 관련된 기술분야에 알려져 있거나 또는 통상적으로 실시되는 것들을 포함하고 있는데, 이는 상기 분야에서 숙련된 전문가에게는 명백한 것이다. 본 발명은 청구범위에 의해 요구된 범위에 국한되지 않는다.

Claims (1)

1. 도시하고 본문에 상술한 바와같이, 쥐및 인간의 특정한 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 함유하고 있는 DNA전달 매개체를 제조라는 방법에 있어서, 특정한 단백질을 생산할수 있는 쥐및 인간으로부터 특정한 단백질을 유전암호화하는 mRNA를 함유하는 세포들을 분리하고, mRNA의 리보뉴클레아제 분해를 방지하기 위하여 리보뉴클레아제 억제 조성물의 존재하에서 이 분리된 세포로 부터 mRNA를 추출하고, 단백질, DNA및 기타 RNA가 거의없는 mRNA만을 분리한 다음, 한가닥이 mRNA의 배열에 상보적인 뉴클레오티드 배열을 갖는 이중가닥 cDNA를 합성하므로써, 특정한 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 cDNA를 생성하고, 이중가닥 cDNA와 결합할수 있는 반응물 말단을 가진 DNA전달 매개체를 가하여, 특정한 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 이중가닥 cDNA와 이 DNA전달 매개체를 결합하므로써 특정한 단백질을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA전달 매개체를 생성함을 특징으로 하는 DNA전달 매개체 제조방법.

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