KR20250035055A - Pcsk9의 표적화를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9) 유전자를 억제하는 데 유용한 유전자 억제자 시스템으로서, 융합 단백질, 예컨대 TALE과 같은 DNA 결합 도메인, 징크 핑거 또는 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질, 및 가이드 핵산(gRNA)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 유전자 억제 시스템이 본원에 제공된다. 이러한 시스템을 사용해 PCSK9의 전사를 억제하는 방법도 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2022년 6월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/349,981호, 2023년 3월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/492,923호, 및 2023년 6월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/505,823호에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
전자 서열 목록에 대한 참조
전자 서열 목록(SCRB_055_01WO_SeqList_ST26.xml; 크기: 4,317,702 바이트; 및 생성일: 2023년 6월 2일)의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
포유류에서, 콜레스테롤은 유화에 의해 지단백질 내에서 수송된다. 지단백질 입자는 이들의 밀도에 기초하여 다음과 같이 분류된다: 저밀도 지단백질(LDL), 초저밀도 지단백질(VLDL), 고밀도 지단백질(HDL), 및 유미미립(chylomicrons). 표면 LDL 수용체는 콜레스테롤를 흡수하는 동안 내재화된다. 콜레스테롤이 풍부한 세포는 LDL 수용체 합성을 차단하여 LDL 입자 중의 새로운 콜레스테롤이 흡수되지 않게 한다. 역으로, LDL 수용체 합성은 세포에 콜레스테롤이 결핍될 때 촉진된다. 프로세스가 조절되지 않는 경우, 과량의 LDL 입자는 LDL 수용체에 의해 흡수되지 않고 혈액 내에서 이동하게 된다. 혈액 내의 LDL 입자는 산화되어 대식세포에 의해 흡수된 다음, 포식되어 거품 세포(foam cell)를 형성한다. 이들 거품 세포는 혈관 벽에 포획되어, 심장 마비, 뇌졸중, 및 다른 심각한 의학적 문제의 주요 원인 중 하나인 죽상경화성 플라크 형성에 기여할 수 있다.
간 단백질 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9)은, LDL 입자의 세포내 섭취(endocytosis) 동안 저밀도 지단백질 수용체(LDL-R)에 결합하여 LDL-R이 세포 표면으로 재순환되는 것을 방지하고 LDL-콜레스테롤 제거를 감소시키는, 분비된 구형의 자가 활성화 세린 프로테아제이다. PCSK9는 (EGF-A 도메인을 통해) LDL-R에 결합하여 수용체-리간드 복합체의 형태 변화를 방지하고, 대신에 LDL-R을 리소좀으로 재유도한다. 저밀도 지단백질 입자(LDL)에 대한 수용체는 일반적으로 세포외액(extracellular fluid) 내에서 입자 당 수천 개의 지방 분자(콜레스테롤 포함)를 수송하므로, LDL 콜레스테롤의 PCSK9의 기능을 차단하거나 억제하여 LDL-R 매개 제거를 증가시키면 LDL 입자 농도를 낮출 수 있다. PCSK9는 주로 간, 장, 신장, 및 중추신경계에서 발현되지만, 내피, 평활근 세포, 및 대식세포와 같은 동맥 벽에서도 고도로 발현되는데, 이 경우 혈관 항상성 및 죽상경화증을 조절할 수 있는 국소 효과가 있다.
PCSK9는 전구단백질 전환효소(PC) 계열의 구성원이며, 이의 유전자는 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)을 가진 개체의 약 2% 내지 3%에서 돌연변이된다(Sepideh Mikaeeli, S. 등의 문헌[Functional analysis of natural PCSK9 mutants in modern and archaic humans. FEBS J. 2019 Aug 6. doi: 10.1111/febs.15036]). 연구자들은 유전된 형태의 고콜레스테롤(고콜레스테롤혈증)을 유발하는 여러 PCSK9 돌연변이를 식별하였다. 이들 돌연변이는 PCSK9 단백질에서 단일 아미노산을 변화시킨다. 연구자들은 고콜레스테롤혈증의 원인이 되는 돌연변이를 "기능 획득(gain-of-function)"으로서 기술하는데, 이는 이들 돌연변이가 PCSK9 단백질의 활성을 향상시키거나 단백질에 새로운 비정형 기능을 제공하는 것으로 보이기 때문이다(Blesa, S. 등의 문헌[A New PCSK9 Gene Promoter Variant Affects Gene Expression and Causes Autosomal Dominant Hypercholesterolemia. J. Clin. Endocrinol. & Metab. 93:3577(2008)]). 과활성 PCSK9 단백질은 간 세포의 표면에서 저밀도 지단백질 수용체의 수를 실질적으로 감소시킨다. PCSK9 유전자에서 기능 획득 돌연변이가 있는 사람들은 혈액으로부터 저밀도 지단백질을 제거하는 수용체가 더 적으므로, 혈중 콜레스테롤 수치가 매우 높다. 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH)은 저밀도 지단백질(LDL)-콜레스테롤 수준의 증가를 특징으로 하는 유전적 장애로서, 조기 심혈관 질환의 높은 위험을 초래한다. PCSK9에서 약 10개의 돌연변이가 상이한 모집단에서 질환의 원인으로서 식별되었다. 고콜레스테롤혈증을 유발하는 PCSK9에서의 모든 알려진 돌연변이는 이러한 프로테아제의 효소 활성을 증가시킨다(Bleasa, S., 2008). 또한, PCSK9에서의 돌연변이는 상염색체 우성 가족성 저베타지질단백질혈증을 초래할 수 있는데, 이는 간 지방증, 간경변증, 및 다른 장애로 이어질 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템의 출현과 이들 최소 시스템의 프로그래밍 가능한 성질은 게놈 조작(manipulation 및 engineering)을 위한 다목적 기술로서 이들의 사용을 용이하게 하였다. 그러나, 생체 내에서 PCSK9 보호 변이체 및 기능 상실 돌연변이를 생성하는 현재의 방법은 콜레스테롤 수준을 조절하기 위해 변형해야 할 세포의 수가 너무 많은 탓에 효과적이지 않았다. 다른 우려에는 게놈 편집에 의해 야기될 수 있는 표적 외 효과, 게놈 불안정성, 또는 종양원성 변형뿐만 아니라 유전자-발현 시스템을 위한 안전한 전달 방식의 결여도 포함된다. 또한, 특정 질환 적응증에서는, 유전자 침묵화 또는 억제가 유전자 편집보다 바람직하다. Cas9 및 CasX와 같은 CRISPR 뉴클레아제를 촉매적으로 비활성으로 만드는 능력이 입증되었는데(WO2020247882A1 및 US20200087641A1, 본원에 참조로서 통합됨), 이러한 능력은 이들 시스템을 유전자를 침묵화시킬 수 있는 억제자 도메인을 갖는 융합 단백질을 생성하기 위한 매력적인 플랫폼으로 만든다. 특정 억제자 시스템이 기술되어 왔지만, 다양한 치료, 진단, 및 연구 응용에서 활용하도록 최적화된 및/또는 Cas9 기반 시스템과 같은 이전 세대 유전자 억제 시스템에 비해 개선을 제공하는 추가의 유전자 억제자 시스템이 여전히 필요하다. 따라서, PCSK9를 조절하기 위한 개선된 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.
본 개시는 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9) 유전자 표적 핵산 서열의 억제 및/또는 후성적 변형에 사용되는 DNA 결합 및 연결된 억제자 도메인을 포함하는 억제자 융합 단백질을 포함하거나 이를 암호화하는 시스템을 제공한다. 일부 경우에, 억제자 융합 단백질은 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 상보적인 징크 핑거(ZF) 또는 전사-활성화제-유사 효과기(TALE) 단백질 및 하나 이상의 연결된 억제자 도메인을 포함하는 DNA-결합 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 억제자 융합 단백질은 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질 및 하나 이상의 연결된 억제자 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질; 및 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 가이드 핵산을 포함한다. 단백질 및 가이드 핵산은 표적 세포 내로의 수동적 진입을 위해 변형될 수 있고, PCSK9의 억제를 위한 다양한 방법에 유용하다. 이러한 방법들도 제공된다. 본 개시는 또한, PCSK9 표적 핵산 서열의 전사를 억제하기 위해 시스템을 세포에 전달하기 위한 억제자 융합 단백질 및 가이드 핵산 성분을 암호화하거나 캡슐화하는 벡터 및 지질 나노입자(LNP)를 제공한다.
본 개시는 본원에 기술된 시스템, 핵산, LNP, 및 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 개시는 또한, PCSK9-관련 질환을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 및 방법은 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 저베타지질단백질혈증, 또는 콜레스테롤 수치 상승과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 대사 장애를 가진 대상체에게 유용하다.
또 다른 양태에서, PCRK9 억제자 시스템을 포함하는 시스템, 또는 PCSK9-관련 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이러한 질환을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 사용하기 위한 PCSK9 억제자 시스템을 포함하거나 이를 암호화하는 벡터가 본원에 제공된다.
본 개시는 PCSK9-관련 질환을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질 및 하나 이상의 연결된 억제자 도메인을 포함하는 억제자 융합 단백질, 및 대상체에서 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열의 전사 억제에 사용하기 위한 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 가이드 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 기술된 시스템, 핵산, LNP, 벡터, 및/또는 약학적 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, PCSK9 유전자는 서열번호 1823의 서열에 비해 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 S127R, D129G, F216L, D374H, 및 D374Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시는 세포 집단에서 PCSK9 유전자의 전사를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 시스템, 핵산, LNP, 벡터, 및/또는 약학적 조성물을 집단의 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, PCSK9 억제자 시스템에 사용하기 위한 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질 및 가이드 핵산은 본원에 기술된 바와 같은 촉매적으로 사멸한 CasX 변이체 단백질 및/또는 CasX 변이체 가이드 핵산을 포함한다.
본 개시의 소정의 구현예의 추가 특징 및 장점은 구현예 및 이의 도면에 대한 다음의 설명과 청구범위에서 더욱 완전하게 명백해질 것이다.
본 개시의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 개시의 특징 및 장점은 본 개시의 원리가 사용되는 예시적인 구현예가 제시된 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 첨부 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이며, 도면 중:
도 1은 촉매적으로 사멸한 CasX에 연결된 억제자 분자와 장기 억제자 단백질(LTRP, 본원에서 “억제자 융합 단백질”로도 지칭됨) 융합 단백질의 5가지 구성의 개략도를 도시한다. D3A 및 D3L은 DNA 메틸전이효소 3 알파(DNMT3A) 및 DNMT3A-유사 단백질(DNMT3L)을 각각 나타낸다. L1~L4은 링커이다. NLS는 핵 국소화 신호이다.
도 2는 DNMT3A ADD 도메인이 통합된 LTRP 융합 단백질의 다양한 구성의 개략도를 도시한다. “D3A ADD”, “D3A CD”, 및 “D3L ID”는 DNMT3A의 ADD 도메인, DNMT3A의 촉매 도메인, 및 DNMT3L의 상호작용 도메인을 각각 나타낸다. L1~L3은 링커이다. NLS는 핵 국소화 신호이다.
도 3은 실시예 1에 기술된 바와 같이, LTRP로 일시적으로 형질감염된 인간 간세포에서 분비된 PCSK9 단백질과 PCSK9 mRNA 수준 사이의 상관관계를 보여주는 점 도표 그래프이다. PCSK9 mRNA 수준은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) RPLP0에 대해 정규화하였다. 분비된 PCSK9 단백질 수준은 분비된 인간 혈청 알부민(HSA)에 대해 정규화하였다. 샘플은 비표적화(NT) 대조군에 대해 정규화하였다.
도 4는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 dXR1 또는 LTRP1-ZIM3 mRNA로 치료하고, 6일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 막대 도표이다. 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 6.7은 비표적화 대조군의 역할을 한다.
도 5는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 dXR1 mRNA로 치료하고, 전달 후 6, 13, 및 25일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 6.7은 비표적화 대조군의 역할을 하고, 물을 이용한 치료는 음성 대조군의 역할을 한다.
도 6은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 LTRP1-ZIM3 mRNA로 치료하고, 전달 후 6, 13, 및 25일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 6.7은 비표적화 대조군의 역할을 하고, 물을 이용한 치료는 음성 대조군의 역할을 한다.
도 7은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 IVT-생산한 LTRP1-ZIM3 대 LTRP5-ZIM5 mRNA로 치료하고, 전달 후 표시된 시점에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다.
도 8은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 제3자가 생산한 LTRP1-ZIM3 대 dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L mRNA로 치료하고, 전달 후 표시된 시점에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다.
도 9는 실시예 3에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Huh7 세포에서, 형질감염 후 6, 18, 36, 및 87일차에 분비된 PCSK9 수준의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 10a는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 스페이서 27.88을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA로 치료하고, 전달 후 4, 12, 18, 24, 41, 및 53일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 비표적화(NT) 스페이서를 실험 대조군으로서 사용하였다.
도 10b는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 스페이서 27.94를 갖는 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA로 치료하고, 전달 후 4, 12, 18, 24, 41, 및 53일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 비표적화(NT) 스페이서를 실험 대조군으로서 사용하였다.
도 11a는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 HepG2 세포에서, 형질감염 후 4일차에 분비된 PCSK9의 정규화된 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 11b는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA이 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Huh7 세포에서, 형질감염 후 4일차에 분비된 PCSK9의 정규화된 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 11c는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Hep3B 세포에서, 형질감염 후 4일차에 분비된 PCSK9의 정규화된 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 12는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Huh7 세포에서, 형질감염 후 4, 14, 및 27일차에 분비된 PCSK9 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준의 정량화는 4일차 시점에 미노출, 미치료 세포에서 검출된 분비된 수준과 대비하여 도시되어 있다.
도 13은 실시예 6에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #2 및 표시된 PCSK9-표적화 스페이서를 갖는 gRNA로 형질감염시킨 HepG2 세포에서 분비된 PCSK9 수준의 분포를 보여주는 바이올린 도표이다. 미노출, 미치료 세포, 및 CasX 676 mRNA로만 형질감염시킨 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 14는 실시예 6에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA 및 표시된 PCSK9-표적화 스페이서를 갖는 gRNA로 형질감염시킨 HepG2 세포에서 pro-PCSK9 및 가공된 PCSK9 단백질(상단 웨스턴 블롯)의 수준을 보여주는 한 쌍의 대표적인 웨스턴 블롯이다. 미노출, 미치료 세포, 및 CasX 676 mRNA로만 형질감염시킨 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다. PCSK9 단백질을 발현하지 않는 HEK293T 세포로부터의 용해물, 및 시노몰구스 마카크 재조합 PCSK9 단백질 대조군을 웨스턴 블롯 대조군으로서 사용하였다. 하단 웨스턴 블롯은 총 단백질 로딩 대조군을 보여준다.
도 15는 실시예 6에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA를 HepG2 세포 내로 형질감염시킬 때 평가된 각각의 표시된 스페이서별로 pro-PCSK9, 가공된 PCSK9, 및 총 PCSK9 수준에 대한 웨스턴 블롯 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 미노출, 미치료 세포, 및 CasX 676 mRNA로만 형질감염시킨 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다. PCSK9 수준을 미노출 조건으로부터의 총 PCSK9 수준에 대해 정규화하였다.
도 16a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 235에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 1~3을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다. v2 프로파일의 경우, 3개의 3' 우라실(3'UUU)의 첨가에는 관련 원 내에 “U”로 주석이 달려있다.
도 16b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 235에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 4~6을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 17은 실시예 7에 기술된 바와 같이, 100 ng의 CasX 491 mRNA, 및 스페이서 7.37을 갖는 단부 변형된(v1) 또는 변형되지 않은(v0) B2M-표적화 gRNA의 표시된 투여량으로 공동 형질감염된 HepG2 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 도시한 도표이다. B2M 유전자좌에서의 성공적인 편집으로 인해 HLA 복합체의 표면 제시가 상실된 세포 집단으로서의 편집 수준을 유세포 계측법에 의해 결정하였다.
도 18은 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 7~9를 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 19a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 174(서열번호 1744)의 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다.
도 19b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 235(서열번호 1745)의 개략도이다. 강조된 구조적 모티프는 도 19a에 도시된 것과 동일하다. 변이체 174와 변이체 235 간의 차이는 연장된 줄기 모티프 및 여러 단일 뉴클레오티드 변화(별표로 표시됨)에 있다. 변이체 316은 변이체 174에 비해 더 짧은 연장된 줄기를 유지하지만, 스캐폴드 235에서 발견되는 4개의 치환을 보유한다.
도 19c는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316(서열번호 1746)의 개략도이다. 강조된 구조적 모티프는 도 19a에 도시된 것과 동일하다. 변이체 316은 변이체 174에 비해 더 짧은 연장된 줄기를 유지하지만(도 19a), 스캐폴드 235에서 발견되는 4개의 치환을 보유한다(도 19b).
도 20은 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 491 mRNA 및 표시된 스캐폴드 변이체 및 스페이서 조합을 함유하는 PCSK9-표적화 gRNA를 리포펙션한 HepG2 세포에서, 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 측정했을 때 PCSK9 유전자좌에서의 인델률(편집 분획으로서 도시되어 있음)(x축)과 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 검출된 분비된 PCSK9 수준(ng/mL)(y축) 간의 상관관계를 나타내는 도표이다.
도 21a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 491 mRNA 및 표시된 B2M-표적화 gRNA를 제형화한 LNP의 표시된 투여량으로 치료한 HepG2 세포의 인간 B2M 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 검정의 결과를 도시한 도표이다.
도 21b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 491 mRNA 및 표시된 B2M-표적화 gRNA로 제형화한 LNP의 표시된 투여량으로 치료한 HepG2 세포에서, B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 도시한 도표이다. B2M 유전자좌에서의 성공적인 편집으로 인해 HLA 복합체의 표면 제시가 없는 세포 집단으로서의 편집 수준을 유세포 계측법에 의해 결정하였다.
도 22a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #2, 및 v1 또는 v5 변형 프로파일을 갖는 표시된 ROSA26-표적화 gRNA를 제형화한 LNP의 표시된 투여량으로 치료한 Hepa1-6 세포의 마우스 ROSA26 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 검정의 결과를 도시한 도표이다.
도 22b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #2 및 표시된 화학적으로 변형된 ROSA26-표적화 gRNA를 제형화한 LNP로 치료한 마우스의 ROSA26 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 백분율의 정량화를 도시한 도표이다.
도 23은 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #1 및 표시된 화학적으로 변형된 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화한 LNP로 치료한 마우스의 마우스 PCSK9 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 검정의 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 미치료 마우스는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 24는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 1~3을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 25는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 4~6을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 26은 실시예 8에 기술된 바와 같이, 표시된 조작된 CasX mRNA 및 표적화 스페이서를 형질감염시키고 형질감염 후 20시간차에 수확된 Hepa1-6 세포의 마우스 PCSK9 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 백분율의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다.
도 27a는 실시예 12에 기술된 바와 같이, CpG 모티프가 있는 영역이 표시된, 가이드 RNA 스캐폴드 235(서열번호 1745)의 이차 구조의 다이어그램이다. (1) 유사매듭 줄기, (2) 스캐폴드 줄기, (3) 연장된 줄기 버블, (4) 연장된 단계, 및 (5) 연장된 줄기 루프에서의 CpG 모티프가 해당 구조 상에 표지되어 있다.
도 27b는 실시예 12에 기술된 바와 같이, 가이드 RNA 스캐폴드의 코딩 서열의 5개의 영역 각각에 도입된 CpG-감소 돌연변이의 다이어그램이다. 스캐폴드 174에서의 치환 버블은 AGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCA(서열번호 3442)의 서열을 갖는다.
도 28은 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 4e3의 감염 다중도(MOI)로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”는 형질도입되지 않은 대조군을 나타내고, “NT”는 비-표적화 스페이서를 갖는 대조군을 나타낸다.
도 29는 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 3e3의 MOI로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”은 형질도입되지 않은 대조군을 나타낸다.
도 30은 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 1e3의 MOI로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”은 형질도입되지 않은 대조군을 나타낸다.
도 31은 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 MOI = 3e2의 MOI로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”은 형질도입되지 않은 대조군을 나타낸다.
도 32a는 실시예 13에 기술된 바와 같이, LTRP 단백질 번호 1~3의 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 억제 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 비교하는 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 32b는 도 32a에 도시된 것과 동일한 시간 경과 실험의 결과를 제시하지만, 실시예 13에 기술된 것과 같이, 동일한 실험 대조군에 대해 벤치마킹한, ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP 단백질 번호 1~3의 B2M 억제 활성을 도시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 33a는 실시예 13에 기술된 것과 같이, LTRP 단백질 #1, #4, 및 #5의 B2M 침묵화 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 비교하는 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 33b는 도 33a에 도시된 것과 동일한 시간 경과 실험의 결과를 제시하지만, 실시예 13에 기술된 것과 같이, 동일한 실험 대조군에 대해 벤치마킹한, ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP #1, #4, 및 #5의 B2M 침묵화 활성을 도시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 34는 실시예 13에 기술된 바와 같은 각각의 표시된 실험 조건별로 B2M 유전자좌의 전사 시작 부위 주위에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 35는 실시예 13에 기술된 바와 같이, 촉매적으로 활성인 CasX 491 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/L에 대해 벤치마킹한, LTRP 단백질 #1~3에 대한 상대 활성(21일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 B2M 유전자좌에서 표적 외 CpG 메틸화의 백분율을 정량화한 것)을 보여주는 점 도표이다.
도 36은 실시예 13에 기술된 바와 같은 각각의 표시된 실험 조건별로 VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위의 하류에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 37a는 실시예 13에 기술된 바와 같이 B2M-표적화 스페이서를 갖는 LTRP #1, 4, 및 5를 평가하는 각각의 표시된 실험 조건별로, VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위 주위에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 37b는 실시예 13에 기술된 바와 같이 비-표적화 스페이서를 갖는 LTRP #1, 4, 및 5를 평가하는 각각의 표시된 실험 조건별로, VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위 주위에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 38은 ZNF10 또는 ZIM-KRAB 도메인을 보유한 LTRP 단백질 #1~5에 대한 상대 활성(21일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 VEGFA 유전자좌에서 표적 외 CpG 메틸화의 백분율 중앙값을 정량화한 것)을 보여주는 산포도로서, LTRP 단백질들은 실시예 13에 기술된 바와 같이, 촉매적으로 활성인 CasX 491 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/L에 대해 벤치마킹한 것이다.
도 39는 실시예 14에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 사용했을 때, 표시된 LTRP -ZIM3 및 이의 변이체의 B2M 억제 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 B2M-표적화 gRNA와 비교하는 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. CD = DNMT3A의 촉매 도메인.
도 40은 도 39에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 나타내지만, 실시예 14에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.160을 사용했을 때, 표시된 LTRP-ZIM3 변이체와 B2M-표적화 gRNA의 B2M 억제 활성을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 41은 도 39에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 나타내지만, 실시예 14에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.165를 사용했을 때, 표시된 LTRP-ZIM3 변이체와 B2M-표적화 gRNA의 B2M 억제 활성을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 42는 도 39에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 나타내지만, 실시예 14에 기술된 바와 같이, 표시된 LTRP-ZIM3 변이체와 비표적화 gRNA의 B2M 억제 활성을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 43은 실시예 14에 기술된 바와 같이, 3개의 B2M-표적화 gRNA 및 비표적화 gRNA에 대해 각각의 표시된 LTRP-ZIM3 변이체별로 VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위의 하류에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 44는 실시예 14에 기술된 바와 같이, 표시된 LTRP5-ZIM3 변이체에 대한 상대 활성(21일차에 스페이서 7.160에 대한 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(7일차에 스페이서 7.160에 대해 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화의 백분율)을 보여주는 산포도이다.
도 45는 실시예 14에 기술된 바와 같이, 추가의 DNMT3A 도메인이 통합된 다양한 LTRP #5 구조의 개략도를 도시한 것이다. 추가의 DNMT3A 도메인은 DNMT3A의 ADD 도메인(“D3A ADD”) 및 DNMT3A의 PWWP 도메인(“D3A PWWP”)이었다. “D3A endo”는 DNMT3A PWWP와 ADD 도메인 사이에서 발생하는 내인성 서열을 암호화한다. “D3A CD” 및 “D3A ID”는 DNMT3A의 촉매 도메인 및 DNMT3L의 상호작용 도메인을 각각 나타낸다. “L1~L3”은 링커이다. “NLS”는 핵 국소화 신호이다. 예시적인 서열은 표 12를 참조한다.
도 46은 실시예 15에서 시험된 LTRP 구성 #1, #4, 및 #5에 대한 ADD 도메인을 갖는 LTRP 분자의 일반적인 구조의 개략도를 도시한 것이다. “D3A ADD”, “D3A CD”, 및 “D3L ID”는 실시예 15에 기술된 것과 같은 DNMT3A의 ADD 도메인, DNMT3A의 촉매 도메인, 및 DNMT3L의 상호작용 도메인을 각각 나타낸다. “L1~L4”은 링커이다. “NLS”는 핵 국소화 신호이다. 예시적인 서열은 표 17을 참조한다.
도 47a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 또는 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖고, DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP가 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA와 쌍을 형성했을 때, 상기 LTRP의 B2M 억제 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 비교한 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 47b는 도 47a에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 보여주지만, 실시예 15에 기술된 바와 같이, ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖고, DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP #5가 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA와 쌍을 형성했을 때, 상기 LTRP #5에 대한 B2M 억제 활성을 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 47c는 도 47a에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 보여주지만, 실시예 15에 기술된 바와 같이, DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP5-ZIM3가 표시된 스페이서를 갖는 B2M-표적화 gRNA와 쌍을 형성했을 때, 상기 LTRP5-ZIM3에 대한 B2M 억제 활성을 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 48a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1을 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대한 형질감염 후 27일차의 B2M 억제 활성의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 48b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #4를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대한 형질감염 후 27일차의 B2M 억제 활성의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 48c는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #5를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대한 형질감염 후 27일차의 B2M 억제 활성의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 49a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1을 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대해, 형질감염 후 5일차에 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 메틸화를 결정하는 데 사용된 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 VEGFA 유전자좌 근처에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화의 평균 백분율로서 제시되며; 평균의 표준 오차도 제시된다; N=3. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 49b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #4를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대해, 형질감염 후 5일차에 VEGFA 유전자좌에서의 오프-타깃 메틸화를 결정하는 데 사용된 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 VEGFA 유전자좌 근처에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화의 평균 백분율로서 제시되며; 평균의 표준 오차도 제시된다; N=3. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 49c는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #5를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대해, 형질감염 후 5일차에 VEGFA 유전자좌에서의 오프-타깃 메틸화를 결정하는 데 사용된 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 VEGFA 유전자좌 근처에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화의 평균 백분율로서 제시되며; 평균의 표준 오차도 제시된다; N=3. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 50a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 50b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZNF10-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 51a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.37을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 51b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZNF10-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.37을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 52a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.165를 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 52b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZNF10-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.165를 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 53은 실시예 16에 기술된 바와 같이, 헤파린 결합 EGF-유사 성장 인자(HBEGF)를 암호화하는 유전자를 표적화하는 gRNA를 갖는 촉매적으로 활성인 CasX 편집기, 즉 CasX-34.19 및 CasX-34.21; HBEGF에 대해 표적화된 융합 단백질(dXR 융합 단백질, 즉 dXR1-34.28)로서, 억제자 도메인에 연결된 촉매적으로 사멸한 CasX(dCasX) 단백질; 또는 비표적화 dXR 분자(CasX-NT 또는 dXR-NT)를 형질도입한 세포에 대한 디프테리아 독소 적정의 투여량 반응 결과를 보여준다. 데이터는 2개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 54는 실시예 17에 기술된 바와 같이, HBEGF 유전자좌의 dXR 억제를 뒷받침하는 이들의 능력에 대한 선택하기 전후 서열의 log2(배수 변화)를 보여주는 바이올린 도표를 제공한다. 도표는 전체 라이브러리, 음성 대조군 서열 세트, 알려진 KRAB 억제자의 양성 대조군 세트, log2(배수 변화) > 2 및 p-값 < 0.01로 시험된 상위 1597개의 향상된 도메인, 및 시험된 상위 95개의 향상된 도메인에 대한 결과를 보여준다.
도 55는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 다양한 억제자 도메인을 갖는 dXR 단백질의 B2M 침묵화 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 56은 실시예 17에 기술된 바와 같이, 다양한 억제자 도메인을 갖는 dXR 단백질의 B2M 침묵화 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 57a는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 1의 로고를 제공한다.
도 57b는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 2의 로고를 제공한다.
도 57c는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 3(서열번호 1727)의 로고를 제공한다.
도 57d는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 4(서열번호 1728)의 로고를 제공한다.
도 57e는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 5의 로고를 제공한다.
도 57f는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 6(서열번호 1729)의 로고를 제공한다.
도 57g는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 7(서열번호 1730)의 로고를 제공한다.
도 57h는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 8의 로고를 제공한다.
도 57i는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 9의 로고를 제공한다.
도 58a는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 1(서열번호 2945)의 로고를 제공한다.
도 58b는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 2의 로고를 제공한다.
도 58c는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 3의 로고를 제공한다.
도 58d는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 4의 로고를 제공한다.
도 58e는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 5(서열번호 2946)의 로고를 제공한다.
도 59는 실시예 20에 기술된 바와 같이, 표시된 CasX 또는 LTRP:gRNA 작제물을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 HEK293T 세포를 다양한 농도의 DNMT1 억제제 5-azadC로 치료한 후 6일차에, B2M을 발현한 HEK293T 세포의 백분율을 도시한 도표이다.
도 60은 실시예 20에 기술된 바와 같이, 표시된 CasX 또는 LTRP:gRNA 작제물을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고 58일 동안 배양한 HEK293T 세포에서의 B2M 억제를 정량화한 것과, 형질감염시킨 세포를 5-azadC로 치료한 후 B2M의 재활성화를 정량화한 것을 병치시킨 도표이다.
도 61은 치료 후 4일차에, BJE 로트의 일차 시노몰구스 마카크(CM) 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 62는 치료 후 4일차에, VDU 로트의 일차 CM 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 63은 치료 후 11일차에, BJE 로트의 일차 CM 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 64는 치료 후 11일차에, VDU 로트의 일차 CM 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 65a는 형질감염 후 6일차에, 비표적화(NT) 스페이서와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2 배수 변화(log2FC))을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타낸다.
도 65b는 형질감염 후 26일차에, 비표적화(NT) 스페이서와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 66a는 형질감염 후 6일차에, 스페이서 TG-06-154와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 66b는 형질감염 후 26일차에, 스페이서 TG-06-154와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 67a는 형질감염 후 6일차에, 스페이서 TG-06-133과 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 67b는 형질감염 후 26일차에, 스페이서 TG-06-133과 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 68은 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다. 점선은 약 41%의 형질감염 효율을 나타낸다.
도 69a는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 표시된 gRNA 스캐폴드를 사용하여, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID # 262~274)를 3E4 vg/세포의 MOI로 형질도입한 인간 유도된 뉴런(iN)의 AAVS1 유전자좌에서의 편집 백분율을 보여주는 막대 도표이다.
도 69b는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 표시된 gRNA 스캐폴드를 사용하여, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID # 262~274)를 1E4 vg/세포의 MOI로 형질도입한 인간 iN의 AAVS1 유전자좌에서의 편집 백분율을 보여주는 막대 도표이다.
도 69c는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 표시된 gRNA 스캐폴드를 사용하여, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID # 262~274)를 3E4 vg/세포의 MOI로 형질도입한 인간 iN의 AAVS1 유전자좌에서의 편집 백분율을 보여주는 막대 도표이다.
도 70a는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드(AAV 작제물 ID # 275~289)로 1E4 vg/세포의 MOI로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 도표이다.
도 70b는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드(AAV 작제물 ID # 275~289)로 3E3 vg/세포의 MOI로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 도표이다.
도 70c는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드(AAV 작제물 ID # 275~289)로 1E3 vg/세포의 MOI로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 도표이다.
도 1은 촉매적으로 사멸한 CasX에 연결된 억제자 분자와 장기 억제자 단백질(LTRP, 본원에서 “억제자 융합 단백질”로도 지칭됨) 융합 단백질의 5가지 구성의 개략도를 도시한다. D3A 및 D3L은 DNA 메틸전이효소 3 알파(DNMT3A) 및 DNMT3A-유사 단백질(DNMT3L)을 각각 나타낸다. L1~L4은 링커이다. NLS는 핵 국소화 신호이다.
도 2는 DNMT3A ADD 도메인이 통합된 LTRP 융합 단백질의 다양한 구성의 개략도를 도시한다. “D3A ADD”, “D3A CD”, 및 “D3L ID”는 DNMT3A의 ADD 도메인, DNMT3A의 촉매 도메인, 및 DNMT3L의 상호작용 도메인을 각각 나타낸다. L1~L3은 링커이다. NLS는 핵 국소화 신호이다.
도 3은 실시예 1에 기술된 바와 같이, LTRP로 일시적으로 형질감염된 인간 간세포에서 분비된 PCSK9 단백질과 PCSK9 mRNA 수준 사이의 상관관계를 보여주는 점 도표 그래프이다. PCSK9 mRNA 수준은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) RPLP0에 대해 정규화하였다. 분비된 PCSK9 단백질 수준은 분비된 인간 혈청 알부민(HSA)에 대해 정규화하였다. 샘플은 비표적화(NT) 대조군에 대해 정규화하였다.
도 4는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 dXR1 또는 LTRP1-ZIM3 mRNA로 치료하고, 6일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 막대 도표이다. 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 6.7은 비표적화 대조군의 역할을 한다.
도 5는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 dXR1 mRNA로 치료하고, 전달 후 6, 13, 및 25일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 6.7은 비표적화 대조군의 역할을 하고, 물을 이용한 치료는 음성 대조군의 역할을 한다.
도 6은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 LTRP1-ZIM3 mRNA로 치료하고, 전달 후 6, 13, 및 25일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 6.7은 비표적화 대조군의 역할을 하고, 물을 이용한 치료는 음성 대조군의 역할을 한다.
도 7은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 IVT-생산한 LTRP1-ZIM3 대 LTRP5-ZIM5 mRNA로 치료하고, 전달 후 표시된 시점에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다.
도 8은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표시된 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 제3자가 생산한 LTRP1-ZIM3 대 dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L mRNA로 치료하고, 전달 후 표시된 시점에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다.
도 9는 실시예 3에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Huh7 세포에서, 형질감염 후 6, 18, 36, 및 87일차에 분비된 PCSK9 수준의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 10a는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 스페이서 27.88을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA로 치료하고, 전달 후 4, 12, 18, 24, 41, 및 53일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 비표적화(NT) 스페이서를 실험 대조군으로서 사용하였다.
도 10b는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 스페이서 27.94를 갖는 PCSK9-표적화 gRNA와 쌍을 형성한 LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA로 치료하고, 전달 후 4, 12, 18, 24, 41, 및 53일차에 세포내 PCSK9에 대해 음성으로 염색된 마우스 Hepa1-6 세포의 백분율을 보여주는 시간 경과 도표이다. 비표적화(NT) 스페이서를 실험 대조군으로서 사용하였다.
도 11a는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 HepG2 세포에서, 형질감염 후 4일차에 분비된 PCSK9의 정규화된 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 11b는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA이 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Huh7 세포에서, 형질감염 후 4일차에 분비된 PCSK9의 정규화된 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 11c는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Hep3B 세포에서, 형질감염 후 4일차에 분비된 PCSK9의 정규화된 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 미노출, 미치료 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 12는 실시예 5에 기술된 바와 같이, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA가 표시된 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 mRNA를 리포펙션한 Huh7 세포에서, 형질감염 후 4, 14, 및 27일차에 분비된 PCSK9 수준의 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 분비된 PCSK9 수준의 정량화는 4일차 시점에 미노출, 미치료 세포에서 검출된 분비된 수준과 대비하여 도시되어 있다.
도 13은 실시예 6에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #2 및 표시된 PCSK9-표적화 스페이서를 갖는 gRNA로 형질감염시킨 HepG2 세포에서 분비된 PCSK9 수준의 분포를 보여주는 바이올린 도표이다. 미노출, 미치료 세포, 및 CasX 676 mRNA로만 형질감염시킨 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 14는 실시예 6에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA 및 표시된 PCSK9-표적화 스페이서를 갖는 gRNA로 형질감염시킨 HepG2 세포에서 pro-PCSK9 및 가공된 PCSK9 단백질(상단 웨스턴 블롯)의 수준을 보여주는 한 쌍의 대표적인 웨스턴 블롯이다. 미노출, 미치료 세포, 및 CasX 676 mRNA로만 형질감염시킨 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다. PCSK9 단백질을 발현하지 않는 HEK293T 세포로부터의 용해물, 및 시노몰구스 마카크 재조합 PCSK9 단백질 대조군을 웨스턴 블롯 대조군으로서 사용하였다. 하단 웨스턴 블롯은 총 단백질 로딩 대조군을 보여준다.
도 15는 실시예 6에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA를 HepG2 세포 내로 형질감염시킬 때 평가된 각각의 표시된 스페이서별로 pro-PCSK9, 가공된 PCSK9, 및 총 PCSK9 수준에 대한 웨스턴 블롯 정량화를 보여주는 막대 도표이다. 미노출, 미치료 세포, 및 CasX 676 mRNA로만 형질감염시킨 세포는 실험 대조군의 역할을 하였다. PCSK9 수준을 미노출 조건으로부터의 총 PCSK9 수준에 대해 정규화하였다.
도 16a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 235에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 1~3을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다. v2 프로파일의 경우, 3개의 3' 우라실(3'UUU)의 첨가에는 관련 원 내에 “U”로 주석이 달려있다.
도 16b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 235에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 4~6을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 17은 실시예 7에 기술된 바와 같이, 100 ng의 CasX 491 mRNA, 및 스페이서 7.37을 갖는 단부 변형된(v1) 또는 변형되지 않은(v0) B2M-표적화 gRNA의 표시된 투여량으로 공동 형질감염된 HepG2 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 도시한 도표이다. B2M 유전자좌에서의 성공적인 편집으로 인해 HLA 복합체의 표면 제시가 상실된 세포 집단으로서의 편집 수준을 유세포 계측법에 의해 결정하였다.
도 18은 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 7~9를 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 19a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 174(서열번호 1744)의 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다.
도 19b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 235(서열번호 1745)의 개략도이다. 강조된 구조적 모티프는 도 19a에 도시된 것과 동일하다. 변이체 174와 변이체 235 간의 차이는 연장된 줄기 모티프 및 여러 단일 뉴클레오티드 변화(별표로 표시됨)에 있다. 변이체 316은 변이체 174에 비해 더 짧은 연장된 줄기를 유지하지만, 스캐폴드 235에서 발견되는 4개의 치환을 보유한다.
도 19c는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316(서열번호 1746)의 개략도이다. 강조된 구조적 모티프는 도 19a에 도시된 것과 동일하다. 변이체 316은 변이체 174에 비해 더 짧은 연장된 줄기를 유지하지만(도 19a), 스캐폴드 235에서 발견되는 4개의 치환을 보유한다(도 19b).
도 20은 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 491 mRNA 및 표시된 스캐폴드 변이체 및 스페이서 조합을 함유하는 PCSK9-표적화 gRNA를 리포펙션한 HepG2 세포에서, 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 측정했을 때 PCSK9 유전자좌에서의 인델률(편집 분획으로서 도시되어 있음)(x축)과 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 검출된 분비된 PCSK9 수준(ng/mL)(y축) 간의 상관관계를 나타내는 도표이다.
도 21a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 491 mRNA 및 표시된 B2M-표적화 gRNA를 제형화한 LNP의 표시된 투여량으로 치료한 HepG2 세포의 인간 B2M 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 검정의 결과를 도시한 도표이다.
도 21b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 491 mRNA 및 표시된 B2M-표적화 gRNA로 제형화한 LNP의 표시된 투여량으로 치료한 HepG2 세포에서, B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 도시한 도표이다. B2M 유전자좌에서의 성공적인 편집으로 인해 HLA 복합체의 표면 제시가 없는 세포 집단으로서의 편집 수준을 유세포 계측법에 의해 결정하였다.
도 22a는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #2, 및 v1 또는 v5 변형 프로파일을 갖는 표시된 ROSA26-표적화 gRNA를 제형화한 LNP의 표시된 투여량으로 치료한 Hepa1-6 세포의 마우스 ROSA26 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 검정의 결과를 도시한 도표이다.
도 22b는 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #2 및 표시된 화학적으로 변형된 ROSA26-표적화 gRNA를 제형화한 LNP로 치료한 마우스의 ROSA26 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 백분율의 정량화를 도시한 도표이다.
도 23은 실시예 7에 기술된 바와 같이, CasX 676 mRNA #1 및 표시된 화학적으로 변형된 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화한 LNP로 치료한 마우스의 마우스 PCSK9 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 검정의 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 미치료 마우스는 실험 대조군의 역할을 하였다.
도 24는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 1~3을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 25는 실시예 7에 기술된 바와 같이, gRNA 스캐폴드 변이체 316에 대해 이루어진 화학적 변형의 버전 4~6을 도시한 개략도이다. 구조적 모티프는 강조되어 있다. 표준 리보뉴클레오티드는 개방 원으로 도시되어 있고, 2'OMe-변형된 리보뉴클레오티드는 검은색 원으로 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 결합 아래 또는 옆에 *가 표시되어 있다.
도 26은 실시예 8에 기술된 바와 같이, 표시된 조작된 CasX mRNA 및 표적화 스페이서를 형질감염시키고 형질감염 후 20시간차에 수확된 Hepa1-6 세포의 마우스 PCSK9 유전자좌에서 NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정한 편집 백분율의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다.
도 27a는 실시예 12에 기술된 바와 같이, CpG 모티프가 있는 영역이 표시된, 가이드 RNA 스캐폴드 235(서열번호 1745)의 이차 구조의 다이어그램이다. (1) 유사매듭 줄기, (2) 스캐폴드 줄기, (3) 연장된 줄기 버블, (4) 연장된 단계, 및 (5) 연장된 줄기 루프에서의 CpG 모티프가 해당 구조 상에 표지되어 있다.
도 27b는 실시예 12에 기술된 바와 같이, 가이드 RNA 스캐폴드의 코딩 서열의 5개의 영역 각각에 도입된 CpG-감소 돌연변이의 다이어그램이다. 스캐폴드 174에서의 치환 버블은 AGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCA(서열번호 3442)의 서열을 갖는다.
도 28은 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 4e3의 감염 다중도(MOI)로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”는 형질도입되지 않은 대조군을 나타내고, “NT”는 비-표적화 스페이서를 갖는 대조군을 나타낸다.
도 29는 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 3e3의 MOI로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”은 형질도입되지 않은 대조군을 나타낸다.
도 30은 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 1e3의 MOI로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”은 형질도입되지 않은 대조군을 나타낸다.
도 31은 실시예 12에 기술된 바와 같이, 다양한 CpG-감소된 또는 CpG-고갈된 가이드 RNA 스캐폴드를 갖는 AAV 벡터를 사용하여 유도된 뉴런에서 B2M 유전자좌를 편집하는 편집 실험의 결과를 제공한다. AAV 벡터를 MOI = 3e2의 MOI로 투여하였다. 막대는 샘플 당 2개의 복제물의 평균 ± SD를 나타낸다. “No Tx”은 형질도입되지 않은 대조군을 나타낸다.
도 32a는 실시예 13에 기술된 바와 같이, LTRP 단백질 번호 1~3의 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 억제 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 비교하는 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 32b는 도 32a에 도시된 것과 동일한 시간 경과 실험의 결과를 제시하지만, 실시예 13에 기술된 것과 같이, 동일한 실험 대조군에 대해 벤치마킹한, ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP 단백질 번호 1~3의 B2M 억제 활성을 도시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 33a는 실시예 13에 기술된 것과 같이, LTRP 단백질 #1, #4, 및 #5의 B2M 침묵화 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 비교하는 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 33b는 도 33a에 도시된 것과 동일한 시간 경과 실험의 결과를 제시하지만, 실시예 13에 기술된 것과 같이, 동일한 실험 대조군에 대해 벤치마킹한, ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP #1, #4, 및 #5의 B2M 침묵화 활성을 도시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 34는 실시예 13에 기술된 바와 같은 각각의 표시된 실험 조건별로 B2M 유전자좌의 전사 시작 부위 주위에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 35는 실시예 13에 기술된 바와 같이, 촉매적으로 활성인 CasX 491 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/L에 대해 벤치마킹한, LTRP 단백질 #1~3에 대한 상대 활성(21일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 B2M 유전자좌에서 표적 외 CpG 메틸화의 백분율을 정량화한 것)을 보여주는 점 도표이다.
도 36은 실시예 13에 기술된 바와 같은 각각의 표시된 실험 조건별로 VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위의 하류에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 37a는 실시예 13에 기술된 바와 같이 B2M-표적화 스페이서를 갖는 LTRP #1, 4, 및 5를 평가하는 각각의 표시된 실험 조건별로, VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위 주위에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 37b는 실시예 13에 기술된 바와 같이 비-표적화 스페이서를 갖는 LTRP #1, 4, 및 5를 평가하는 각각의 표시된 실험 조건별로, VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위 주위에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 38은 ZNF10 또는 ZIM-KRAB 도메인을 보유한 LTRP 단백질 #1~5에 대한 상대 활성(21일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 VEGFA 유전자좌에서 표적 외 CpG 메틸화의 백분율 중앙값을 정량화한 것)을 보여주는 산포도로서, LTRP 단백질들은 실시예 13에 기술된 바와 같이, 촉매적으로 활성인 CasX 491 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/L에 대해 벤치마킹한 것이다.
도 39는 실시예 14에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 사용했을 때, 표시된 LTRP -ZIM3 및 이의 변이체의 B2M 억제 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 B2M-표적화 gRNA와 비교하는 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. CD = DNMT3A의 촉매 도메인.
도 40은 도 39에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 나타내지만, 실시예 14에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.160을 사용했을 때, 표시된 LTRP-ZIM3 변이체와 B2M-표적화 gRNA의 B2M 억제 활성을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 41은 도 39에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 나타내지만, 실시예 14에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.165를 사용했을 때, 표시된 LTRP-ZIM3 변이체와 B2M-표적화 gRNA의 B2M 억제 활성을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 42는 도 39에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 나타내지만, 실시예 14에 기술된 바와 같이, 표시된 LTRP-ZIM3 변이체와 비표적화 gRNA의 B2M 억제 활성을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 43은 실시예 14에 기술된 바와 같이, 3개의 B2M-표적화 gRNA 및 비표적화 gRNA에 대해 각각의 표시된 LTRP-ZIM3 변이체별로 VEGFA 유전자좌의 전사 시작 부위의 하류에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화 백분율의 바이올린 도표이다.
도 44는 실시예 14에 기술된 바와 같이, 표시된 LTRP5-ZIM3 변이체에 대한 상대 활성(21일차에 스페이서 7.160에 대한 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(7일차에 스페이서 7.160에 대해 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화의 백분율)을 보여주는 산포도이다.
도 45는 실시예 14에 기술된 바와 같이, 추가의 DNMT3A 도메인이 통합된 다양한 LTRP #5 구조의 개략도를 도시한 것이다. 추가의 DNMT3A 도메인은 DNMT3A의 ADD 도메인(“D3A ADD”) 및 DNMT3A의 PWWP 도메인(“D3A PWWP”)이었다. “D3A endo”는 DNMT3A PWWP와 ADD 도메인 사이에서 발생하는 내인성 서열을 암호화한다. “D3A CD” 및 “D3A ID”는 DNMT3A의 촉매 도메인 및 DNMT3L의 상호작용 도메인을 각각 나타낸다. “L1~L3”은 링커이다. “NLS”는 핵 국소화 신호이다. 예시적인 서열은 표 12를 참조한다.
도 46은 실시예 15에서 시험된 LTRP 구성 #1, #4, 및 #5에 대한 ADD 도메인을 갖는 LTRP 분자의 일반적인 구조의 개략도를 도시한 것이다. “D3A ADD”, “D3A CD”, 및 “D3L ID”는 실시예 15에 기술된 것과 같은 DNMT3A의 ADD 도메인, DNMT3A의 촉매 도메인, 및 DNMT3L의 상호작용 도메인을 각각 나타낸다. “L1~L4”은 링커이다. “NLS”는 핵 국소화 신호이다. 예시적인 서열은 표 17을 참조한다.
도 47a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 또는 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖고, DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP가 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA와 쌍을 형성했을 때, 상기 LTRP의 B2M 억제 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 비교한 시간 경과 실험의 결과를 제시한다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 47b는 도 47a에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 보여주지만, 실시예 15에 기술된 바와 같이, ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖고, DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP #5가 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA와 쌍을 형성했을 때, 상기 LTRP #5에 대한 B2M 억제 활성을 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 47c는 도 47a에 도시된 동일한 시간 경과 실험의 결과를 보여주지만, 실시예 15에 기술된 바와 같이, DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP5-ZIM3가 표시된 스페이서를 갖는 B2M-표적화 gRNA와 쌍을 형성했을 때, 상기 LTRP5-ZIM3에 대한 B2M 억제 활성을 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 48a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1을 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대한 형질감염 후 27일차의 B2M 억제 활성의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 48b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #4를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대한 형질감염 후 27일차의 B2M 억제 활성의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 48c는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #5를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대한 형질감염 후 27일차의 B2M 억제 활성의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 49a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1을 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대해, 형질감염 후 5일차에 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 메틸화를 결정하는 데 사용된 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 VEGFA 유전자좌 근처에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화의 평균 백분율로서 제시되며; 평균의 표준 오차도 제시된다; N=3. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 49b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #4를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대해, 형질감염 후 5일차에 VEGFA 유전자좌에서의 오프-타깃 메틸화를 결정하는 데 사용된 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 VEGFA 유전자좌 근처에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화의 평균 백분율로서 제시되며; 평균의 표준 오차도 제시된다; N=3. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 49c는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #5를 갖는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 중 어느 하나를 갖고, 표시된 gRNA에 대한 DNMT3A ADD 도메인을 갖거나 갖지 않는 LTRP에 대해, 형질감염 후 5일차에 VEGFA 유전자좌에서의 오프-타깃 메틸화를 결정하는 데 사용된 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 도표이다. 데이터는 VEGFA 유전자좌 근처에 있는 CpG 부위에 대한 CpG 메틸화의 평균 백분율로서 제시되며; 평균의 표준 오차도 제시된다; N=3. “NT”는 비표적화 스페이서를 갖는 gRNA이다.
도 50a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 50b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZNF10-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.160을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 51a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.37을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 51b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZNF10-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.37을 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 52a는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZIM3-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.165를 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 52b는 실시예 15에 기술된 바와 같이, 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 ZNF10-KRAB 도메인을 갖는 LTRP 분자별로 스페이서 7.165를 갖는 B2M-표적화 gRNA에 대한 대한 상대 활성(27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율) 대 특이성(5일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율)을 보여주는 점 도표이다.
도 53은 실시예 16에 기술된 바와 같이, 헤파린 결합 EGF-유사 성장 인자(HBEGF)를 암호화하는 유전자를 표적화하는 gRNA를 갖는 촉매적으로 활성인 CasX 편집기, 즉 CasX-34.19 및 CasX-34.21; HBEGF에 대해 표적화된 융합 단백질(dXR 융합 단백질, 즉 dXR1-34.28)로서, 억제자 도메인에 연결된 촉매적으로 사멸한 CasX(dCasX) 단백질; 또는 비표적화 dXR 분자(CasX-NT 또는 dXR-NT)를 형질도입한 세포에 대한 디프테리아 독소 적정의 투여량 반응 결과를 보여준다. 데이터는 2개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 54는 실시예 17에 기술된 바와 같이, HBEGF 유전자좌의 dXR 억제를 뒷받침하는 이들의 능력에 대한 선택하기 전후 서열의 log2(배수 변화)를 보여주는 바이올린 도표를 제공한다. 도표는 전체 라이브러리, 음성 대조군 서열 세트, 알려진 KRAB 억제자의 양성 대조군 세트, log2(배수 변화) > 2 및 p-값 < 0.01로 시험된 상위 1597개의 향상된 도메인, 및 시험된 상위 95개의 향상된 도메인에 대한 결과를 보여준다.
도 55는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 다양한 억제자 도메인을 갖는 dXR 단백질의 B2M 침묵화 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 56은 실시예 17에 기술된 바와 같이, 다양한 억제자 도메인을 갖는 dXR 단백질의 B2M 침묵화 활성(HLA-음성 세포의 백분율로서 표시됨)을 보여준다. 데이터는 평균과 표준 편차(N=3)로서 제시되어 있다.
도 57a는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 1의 로고를 제공한다.
도 57b는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 2의 로고를 제공한다.
도 57c는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 3(서열번호 1727)의 로고를 제공한다.
도 57d는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 4(서열번호 1728)의 로고를 제공한다.
도 57e는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 5의 로고를 제공한다.
도 57f는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 6(서열번호 1729)의 로고를 제공한다.
도 57g는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 7(서열번호 1730)의 로고를 제공한다.
도 57h는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 8의 로고를 제공한다.
도 57i는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 억제자 도메인 모티프 9의 로고를 제공한다.
도 58a는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 1(서열번호 2945)의 로고를 제공한다.
도 58b는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 2의 로고를 제공한다.
도 58c는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 3의 로고를 제공한다.
도 58d는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 4의 로고를 제공한다.
도 58e는 실시예 19에 기술된 바와 같이, 대안적인 억제자 도메인 모티프 5(서열번호 2946)의 로고를 제공한다.
도 59는 실시예 20에 기술된 바와 같이, 표시된 CasX 또는 LTRP:gRNA 작제물을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 HEK293T 세포를 다양한 농도의 DNMT1 억제제 5-azadC로 치료한 후 6일차에, B2M을 발현한 HEK293T 세포의 백분율을 도시한 도표이다.
도 60은 실시예 20에 기술된 바와 같이, 표시된 CasX 또는 LTRP:gRNA 작제물을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고 58일 동안 배양한 HEK293T 세포에서의 B2M 억제를 정량화한 것과, 형질감염시킨 세포를 5-azadC로 치료한 후 B2M의 재활성화를 정량화한 것을 병치시킨 도표이다.
도 61은 치료 후 4일차에, BJE 로트의 일차 시노몰구스 마카크(CM) 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 62는 치료 후 4일차에, VDU 로트의 일차 CM 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 63은 치료 후 11일차에, BJE 로트의 일차 CM 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 64는 치료 후 11일차에, VDU 로트의 일차 CM 간세포에 대한 분비된 PCSK9의 백분율을 베이스라인 PCSK9 분비 수준에 대해 정규화하여 도시한 플롯이다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA, 및 스페이서 6.1을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA를 제형화된 LNP의 표시된 투여량으로 CM 간세포를 치료하였다. 파선은 정량화 하한(LLOQ)을 나타낸다.
도 65a는 형질감염 후 6일차에, 비표적화(NT) 스페이서와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2 배수 변화(log2FC))을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타낸다.
도 65b는 형질감염 후 26일차에, 비표적화(NT) 스페이서와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 66a는 형질감염 후 6일차에, 스페이서 TG-06-154와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 66b는 형질감염 후 26일차에, 스페이서 TG-06-154와 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 67a는 형질감염 후 6일차에, 스페이서 TG-06-133과 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 67b는 형질감염 후 26일차에, 스페이서 TG-06-133과 쌍을 형성한 LTRP5-ADD-ZIM3을 미치료, 미노출 대조군과 비교한 차등 유전자 발현 분석(리드 카운트의 log2FC)을 보여주는 화산 도표이다. 수평 점선은 조정된 p < 0.001을 나타내고, 수직선은 |log2FC| > 2 임계값을 나타낸다. 검은색 점(PCSK9의 경우 제외)은 2개의 유의 임계값을 적용한 후 식별된 차등 조절된 표적 외 유전자이다.
도 68은 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다. 점선은 약 41%의 형질감염 효율을 나타낸다.
도 69a는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 표시된 gRNA 스캐폴드를 사용하여, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID # 262~274)를 3E4 vg/세포의 MOI로 형질도입한 인간 유도된 뉴런(iN)의 AAVS1 유전자좌에서의 편집 백분율을 보여주는 막대 도표이다.
도 69b는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 표시된 gRNA 스캐폴드를 사용하여, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID # 262~274)를 1E4 vg/세포의 MOI로 형질도입한 인간 iN의 AAVS1 유전자좌에서의 편집 백분율을 보여주는 막대 도표이다.
도 69c는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 표시된 gRNA 스캐폴드를 사용하여, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID # 262~274)를 3E4 vg/세포의 MOI로 형질도입한 인간 iN의 AAVS1 유전자좌에서의 편집 백분율을 보여주는 막대 도표이다.
도 70a는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드(AAV 작제물 ID # 275~289)로 1E4 vg/세포의 MOI로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 도표이다.
도 70b는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드(AAV 작제물 ID # 275~289)로 3E3 vg/세포의 MOI로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 도표이다.
도 70c는 실시예 24에 기술된 바와 같이, 스페이서 7.37을 갖는 표시된 gRNA 스캐폴드를 함유하는 CpG-결실된 AAV 플라스미드(AAV 작제물 ID # 275~289)로 1E3 vg/세포의 MOI로 형질감염시킨 HEK293 세포에서 B2M의 녹아웃 백분율의 정량화를 보여주는 막대 도표이다.
예시적인 구현예가 본원에 도시되고 기술되었지만, 이러한 구현예는 단지 예시로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이제 본원에서 청구된 본 발명을 벗어나지 않고도 많은 변이, 변화, 및 치환이 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기술된 구현예에 대한 다양한 대안이 본 개시의 구현예를 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하도록 의도되고, 이들 청구범위 및 이들의 균등물의 범주 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되도록 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질은 아래에 기술된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 특허 명세서가 우선한다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하도록 의도되지 않는다. 이제 본 발명을 벗어나지 않고도 많은 변이, 변화, 및 치환이 당업자에게 발생할 것이다.
정의
"혼성화 가능한" 또는 "상보적인"은, 핵산이 적절한 시험관 내 및/또는 생체 내 온도 및 용액 이온 강도 조건 하에 핵산(예: RNA, DNA)을 또 다른 핵산에 서열 특이적, 역평행 방식으로 비공유 결합시키거나, 즉 또 다른 핵산과 Watson-Crick 염기쌍 및/또는 G/U 염기쌍을 형성하게 하거나, "어닐링"시키거나, "혼성화"시킬 수 있는(즉, 핵산을 상보적 핵산에 특이적으로 결합시킬 수 있는) 뉴클레오티드 서열을 포함한다는 것을 의미하도록 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드의 서열은 특이적으로 혼성화될 이의 표적 핵산과 100% 상보적일 필요는 없고; 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 가질 수 있고 표적 핵산에 여전히 혼성화될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 개재된 분절 또는 인접한 분절이 혼성화 이벤트(예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조, '팽창(bulge)', '버블(bubble)' 등)에 관여하지 않도록 하나 이상의 분절에 걸쳐 혼성화될 수 있다. 따라서, 당업자는 서열 내의 개별 염기가 다른 서열에 상보적이지 않을 수 있지만, 서열 전체가 여전히 상보적인 것으로 간주된다는 것을 이해할 것이다.
본 개시의 목적에 맞는 “유전자”는 유전자 산물(예를 들어 단백질, RNA)을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역도 포함하며, 이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부와 상관없이 포함한다. 따라서, 유전자는 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는 액세서리 요소 서열을 포함할 수 있다: 프로모터 서열, 종결자, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 침묵화인자(silencer), 절연체, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위, 및 유전자좌 조절 영역. 코딩 서열은 전사 후 또는 전사 및 번역 후 유전자 산물을 암호화하며; 본 개시의 코딩 서열은 단편을 포함할 수 있고 전장 개방 해독 프레임을 함유할 필요는 없다. 유전자는 전사된 가닥뿐만 아니라 안티코돈을 함유하는 상보성 가닥 둘 다를 포함할 수 있다.
용어 “하류”는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 하류 뉴클레오티드 서열은 전사 시작점 다음의 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 시작 부위의 하류에 위치한다.
용어 “상류”는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 상류 뉴클레오티드 서열은 코딩 영역 또는 전사 시작점의 5' 측에 위치하는 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사 시작 부위의 상류에 위치한다.
폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대해 “인접한”이란 용어는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 이웃하거나 서로 인접한 서열을 지칭한다. 당업자는 2개의 서열이 서로 인접한 것으로 간주될 수 있고, 제한된 양의 개재 서열, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 여전히 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
용어 “조절 요소”는 용어 “조절 서열”과 상호 교환적으로 본원에서 사용되고, 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 조절 요소를 포함하도록 의도된다. 적절한 조절 요소의 선택은, 발현될 암호화된 성분(예를 들어 단백질 또는 RNA)에 따라 달라지거나, 핵산이 상이한 중합효소를 필요로 하는 다수의 성분 또는 융합 단백질로서 발현되도록 의도되지 않는 다수의 성분을 포함하는지 여부에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다.
용어 “액세서리 요소”는 본원에서 용어 “액세서리 서열”과 상호 교환적으로 사용되고, 특히 폴리아데닐화 신호(폴리(A) 신호), 인핸서 요소, 인트론, 전사 후 조절 요소(PTRE), 핵 국소화 신호(NLS), 탈아미노효소, DNA 글리코실라아제 억제제, 추가 프로모터, (예를 들어 시스 또는 트랜스에서) CRISPR-매개 상동성-유도 복구를 자극하는 인자, 자가 절단 서열, 및 융합 도메인, 예를 들어 CRISPR 단백질에 융합된 융합 도메인을 포함하도록 의도된다. 적절한 액세서리 요소(들)의 선택은, 발현될 암호화된 성분(예를 들어 단백질 또는 RNA)에 따라 달라지거나, 핵산이 상이한 중합효소를 필요로 하는 다수의 성분 또는 융합 단백질로서 발현되도록 의도되지 않는 다수의 성분을 포함하는지 여부에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다.
용어 "프로모터"는 중합효소 결합 및 전사를 용이하게 하기 위한 전사 시작 부위 및 추가 서열을 함유하는 DNA 서열을 지칭한다. 예시적인 진핵생물 프로모터는 TATA 박스 및/또는 B 인식 요소(BRE)와 같은 요소를 포함하고, 연관된 전사 가능한 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 유전자(또는 이식유전자)의 전사 및 발현을 보조하거나 촉진한다. 프로모터는 합성적으로 생산될 수 있거나, 알려진 또는 자연 발생하는 프로모터 서열 또는 또 다른 프로모터 서열로부터 유래될 수 있다. 프로모터는, 특정 특성을 부여하기 위해 2개 이상의 이종 서열의 조합을 포함하는 키메라 프로모터를 포함할 수도 있다. 본 개시의 프로모터는 본원에 제공된 또는 알려져 있는 다른 프로모터 서열(들)과 조성이 유사하지만 동일하지는 않은 프로모터 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 프로모터는, 구성적, 발달적, 조직 특이적, 유도성 프로모터 등과 같은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 연관된 코딩 서열 또는 전사 가능한 서열 또는 유전자의 발현 패턴에 관한 기준에 따라 분류될 수 있다. 프로모터는 그의 강도에 따라 분류될 수도 있다. 프로모터의 맥락에서 사용되는 바와 같이, “강도”는 프로모터에 의해 조절되는 유전자의 전사율을 지칭한다. “강한” 프로모터는 전사율이 높다는 것을 의미하고, “약한” 프로모터는 전사율이 비교적 낮다는 것을 의미한다.
본 개시의 프로모터는 중합효소 II(Pol II) 프로모터일 수 있다. 중합효소 II는 모든 단백질 코딩 유전자와 많은 비-코딩 유전자를 전사한다. 대표적인 Pol II 프로모터는 전사 시작 부위를 둘러싸는 약 100개 염기쌍의 서열인 코어 프로모터를 포함하며, Pol II 중합효소 및 연관된 일반적인 전사 인자를 위한 결합 플랫폼의 역할을 한다. 프로모터는 TATA 박스, BRE, 개시자(INR), 모티프 10 요소(MTE), 하류 코어 프로모터 요소(DPE), 하류 코어 요소(DCE)와 같은 하나 이상의 코어 프로모터 요소를 함유할 수 있지만, 이들 요소가 결여된 코어 프로모터도 당업계에 알려져 있다. 모든 Pol II 프로모터는 본 개시의 범위에 포함되는 것으로서 고려된다.
본 개시의 프로모터는 중합효소 III(Pol III) 프로모터일 수 있다. Pol III은 DNA를 전사하여 5S rRNA, tRNA, 및 다른 작은 RNA와 같은 작은 리보솜 RNA를 합성한다. 대표적인 Pol III 프로모터는 전사를 뒷받침하기 위한 내부 조절 서열(유전자의 전사된 구간 내에 있는 서열)을 사용하지만, TATA 박스와 같은 상류 요소가 사용되기도 한다. 모든 Pol III 프로모터는 본 개시의 범위에 포함되는 것으로서 고려된다.
용어 “인핸서”는, 전사 인자라 불리는 특정 단백질에 결합될 때, 연관된 유전자의 발현을 조절하는 조절 DNA 서열을 지칭한다. 인핸서는 유전자의 인트론에 위치하거나, 유전자의 코딩 서열의 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. 인핸서는 유전자에 근접하거나(즉, 프로모터의 수십 또는 수백 염기쌍(bp) 이내에 있거나), 유전자의 원위에 (즉, 프로모터로부터 수천 bp, 수십만 bp, 또는 심지어 수백만 bp 떨어져서) 위치할 수 있다. 단일 유전자는 둘 이상의 인핸서에 의해 조절될 수 있으며, 이들 모두는 본 개시의 범주 내에 있는 것으로 고려된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 간염 PTRE와 같은 “전사 후 조절 요소(PTRE 또는 TRE)”는, 전사될 때, 전사 후 활성을 나타낼 수 있는 삼차 구조를 생성하여, 작동 가능하게 연결된 연관된 유전자의 발현을 향상시키거나 촉진할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다.
본 개시의 맥락에서 및 유전자와 관련하여, “억제(repress, repression, repressing)”, “유전자 발현의 억제(inhibition of gene expression)”, “하향 조절(downregulation)”, 및 “침묵화(silencing)”는 유전자 또는 이의 일부분의 전사를 억제 또는 차단하는 것을 지칭하도록 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 따라서, 유전자의 억제는 유전자 산물의 생산을 감소시킬 수 있다. 전사를 감소시키는 유전자 억제 프로세스의 예는 전사 개시 복합체의 형성을 억제하는 것들, 전사 개시 속도를 감소시키는 것들, 전사 신장 속도를 감소시키는 것들, 전사의 공정성을 감소시키는 것들, 및 (예를 들어 전사 활성화제의 결합을 차단함으로써) 전사 활성화를 길항하는 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 유전자 억제는, 예를 들어 활성화를 예방하는 것뿐만 아니라 기존 수준 미만으로 발현을 억제하는 것을 구성할 수 있다. 전사 억제는 유전자 전사의 가역적 및 비가역적 불활성화 둘 다를 포함하며; 후자는 유전자의 후성적 변형으로부터 기인할 수 있다.
“억제자” 또는 “억제자 도메인”은 DNA에 대한 조절 요소로서 작용하고, DNA의 전사를 저해, 억제, 또는 차단하여 유전자 발현을 억제하는 폴리펩티드 인자를 지칭하도록 상호교환적으로 사용된다. 본 개시의 맥락에서, 표적 핵산에 결합될 때, 억제자 도메인을 DNA 결합 단백질에 연결하면, 프로모터로부터의 전사를 방지하거나 달리 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 전사 억제자는, 입체 장애에 의해 RNA 중합효소 통과를 물리적으로 차단하는 것, 중합효소의 번역 후 변형 상태를 변경하는 것, 초기 RNA의 후성적 상태를 변형시키는 것, 메틸화를 통해 DNA의 후성적 상태를 변화시키는 것, 히스톤 탈아세틸화를 통해 DNA의 후성유전 상태를 변화시키거나 뉴클레오솜 리모델링을 조절하는 것, 또는 인핸서-프로모터 상호작용을 방지하는 것을 포함하여, 다양한 메커니즘에 의해 기능하여 유전자 침묵화를 유도하거나 유전자 발현 수준을 감소시키는 것으로 여겨진다.
“장기 억제자 단백질” 또는 “LTRP”는 본원에서 “억제자 융합 단백질”과 상호교환적으로 사용되며, 표적 핵산 서열의 전사를 억제할 수 있는 하나 이상의 도메인에 융합된 DNA 결합 단백질(또는 단백질의 DNA 결합 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 임의로, 본 개시의 억제자 융합 단백질은 추가 요소, 예컨대 융합 단백질, 핵 국소화 신호, 핵 내보내기 신호의 도메인들을 비롯하여 억제자 융합 단백질에 추가 활성을 부여하는 추가 단백질 도메인들 중 임의의 것들 사이의 링커를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “억제자 융합 단백질:gRNA 시스템”은 전사 억제를 위한 시스템이며, 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질 및 하나 이상의 연결된 억제자 도메인을 포함하는 억제자 융합 단백질, 및 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질에 결합하는 가이드 핵산(gRNA)을 포함한다. 명확성을 위해, 시스템은 시스템의 억제자 융합 단백질 및 gRNA 성분을 생산하는 데 사용될 수 있는 임의의 암호화 DNA, RNA, 또는 벡터 등도 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, DNA 결합 단백질은 DNA에 결합할 수 있는 단백질, 또는 단백질의 도메인을 지칭한다. 예시적인 DNA 결합 단백질은 징크 핑거(ZF) 단백질, TALE, 및 CRISPR 단백질을 포함한다. 당업자는, DNA에 결합하는 것 및 DNA 절단과 같은 다른 활성을 수행하는 것 모두가 가능한, 예를 들어 CRISPR 단백질과 같은 다기능 단백질에서, DNA 결합 기능을 단백질의 다른 기능으로부터 분리하여 촉매적으로 사멸된 DNA 결합 단백질로 만들 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “촉매적으로 사멸한(catalytically-dead) CRISPR 단백질”은 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 CRISPR 단백질을 지칭한다. 당업자는 CRISPR 단백질이 촉매적으로 사멸할 수 있고, DNA 결합과 같은 추가의 단백질 기능은 여전히 수행할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 유사하게, “촉매적으로 사멸한 CasX”는 엔도뉴클레아제 활성이 결여되어 있지만 DNA 결합과 같은 추가의 단백질 기능은 여전히 수행할 수 있는 CasX 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “재조합”은 특정 핵산(DNA 또는 RNA)이, 자연계에서 발견되는 내인성 핵산과 구별 가능한 구조적 코딩 또는 비코딩 서열을 갖는 작제물을 생성하는 클로닝, 제한, 및/또는 결찰 단계의 다양한 조합의 산물임을 의미한다. 일반적으로, 구조적 코딩 서열을 암호화하는 DNA 서열은 cDNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오티드 링커로부터 조립되거나, 일련의 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립되어, 세포 또는 무세포 전사 및 번역 시스템에 함유된 재조합 전사 단위로부터 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공할 수 있다. 이러한 서열은 진핵생물 유전자에 일반적으로 존재하는 내부 비번역 서열 또는 인트론에 의해 중단되지 않는 개방 해독 프레임의 형태로 제공될 수 있다. 관련 서열을 포함하는 게놈 DNA가 재조합 유전자 또는 전사 단위를 형성하는 데 사용될 수도 있다. 비번역 DNA의 서열은 개방 해독 프레임으로부터 5' 또는 3'에 존재할 수 있는데, 이러한 서열은 코딩 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않으며, 다양한 메커니즘에 의해 원하는 산물의 생산을 조절하도록 실제로 작용할 수 있다(상기 “인핸서” 및 “프로모터” 참조).
용어 "재조합 폴리뉴클레오티드" 또는 "재조합 핵산"은 자연 발생하지 않는 것; 예를 들어 인간의 개입을 통해 달리 분리된 2개의 서열 분절의 인공 조합에 의해 만들어진 것을 지칭한다. 이러한 인공 조합은 종종 화학적 합성 수단에 의해, 또는 핵산의 단리된 분절의 인공 조작에 의해, 예를 들어 유전자 조작 기술에 의해 달성된다. 이는, 일반적으로 서열 인식 부위를 도입하거나 제거하면서, 코돈을 동일하거나 보존적인 아미노산을 암호화하는 중복 코돈으로 치환하기 위해 일반적으로 수행된다. 대안적으로, 이는 원하는 기능의 핵산 분절들을 함께 결합시켜 원하는 기능의 조합을 생성하기 위해 수행된다. 이러한 인공 조합은 종종 화학적 합성 수단에 의해, 또는 핵산의 단리된 분절의 인공 조작에 의해, 예를 들어 유전자 조작 기술에 의해 달성된다.
유사하게, 용어 "재조합 폴리펩티드" 또는 "재조합 단백질"은 자연 발생하지 않는 폴리펩티드 또는 단백질; 예를 들어 인간의 개입을 통해 달리 분리된 2개의 아미노산 서열 분절의 인공 조합에 의해 만들어진 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 이종 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 재조합이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, VLDL, LDL, 및 HDL과 같은 “지단백질(lipoprotein)”은 혈청, 혈장, 및 림프에서 발견되고, 지질 수송에 중요한 단백질 군을 지칭하다. 각각의 지단백질의 화학적 조성은, 예를 들어, HDL이 지질에 비해 단백질 비율이 더 높은 반면, VLDL은 지질에 비해 단백질 비율이 더 낮다는 점에서 상이하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “죽상경화증(atherosclerosis)”은 큰 동맥과 중간 크기의 동맥에 영향을 미치는 동맥의 경화를 의미하며, 지방 침착물이 존재하는 것을 특징으로 한다. 지방 침착물은 주로 콜레스테롤 및 다른 지방, 칼슘, 및 흉터 조직으로 이루어진 “죽종(atheroma)” 또는 “플라크(plaque)”로 불리며, 동맥 내막을 손상시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “관상 심장 질환(CHD)”은 심장에 혈액과 산소를 공급하는 소혈관의 협착을 의미하는데, 이는 종종 죽상경화증으로 인해 초래된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “이상지질혈증(dyslipidemia)”은 지질 및/또는 지단백질 과잉 생산 또는 결핍을 포함하는 지질 및/또는 지단백질 대사의 장애를 지칭한다. 이상지질혈증은 유미지립(chylomicron), 콜레스테롤, 및 중성지방과 같은 지질뿐만 아니라 저밀도 지단백질(LDL) 콜레스테롤과 같은 지단백질의 상승으로 나타날 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “고밀도 지단백질-C” 또는 “HDL-C”는 고밀도 지단백질 입자와 연관된 콜레스테롤을 의미한다. 혈청(또는 혈장) 중 HDL-C의 농도는 일반적으로 mg/dL 또는 nmol/L로 정량화된다. “혈청 HDL-C” 및 “혈장 HDL-C”는 각각 혈청 및 혈장 중 평균 HDL-C이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “저밀도 지단백질-콜레스테롤(LDL-C)”은 저밀도 지단백질 입자에 의해 운반되는 콜레스테롤을 의미한다. 혈청(또는 혈장) 중 LDL-C의 농도는 일반적으로 mg/dL 또는 nmol/L로 정량화된다. “혈청 LDL-C” 및 “혈장 LDL-C”는 각각 혈청 및 혈장 중 평균 LDL-C이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)”은, National Cholesterol Educational Program (NCEP) of Detection, Evaluation of Treatment of high cholesterol in adults(Arch. Int. Med. 148: 36 (1988) 참조)의 전문가 패널 보고서의 가이드라인에 따른 콜레스테롤 또는 순환 (혈장) 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 및 VLDL-콜레스테롤의 상승을 특징으로 하는 병태를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “고지질혈증(hyperlipidemia 또는 hyperlipemia)”은 혈청 지질 또는 순환 (혈장) 지질의 상승을 특징으로 하는 병태이다. 이러한 병태는 비정상적으로 높은 지방 농도를 나타낸다. 순환하는 혈액 중의 지질 분획은 콜레스테롤, 저밀도 지단백질, 초저밀도 지단백질, 유미지립, 및 중성지방이다. 고지혈증의 프레드릭슨 분류는 전기영동 또는 초원심분리에 의해 측정했을 때, TG 및 콜레스테롤이 풍부한 지단백질 입자의 패턴에 기초하며, 고중성지질혈증과 같은 고지혈증의 일차 원인을 특성화하는 데 일반적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “중성지방(triglyceride)” 또는 “TG”는 3개의 지방산 분자와 조합된 글리세롤로 이루어진 지질 또는 중성 지방을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “고중성지질혈증(hypertriglyceridemia)”은 중성지방 수치 상승을 특징으로 하는 병태를 의미한다. 이의 병인은 일차 인자(즉, 유전적 원인) 및 이차 인자(당뇨병, 대사 증후군/인슐린 저항성, 비만, 신체 활동 부족, 흡연, 과도한 알코올, 및 탄수화물이 매우 높은 식단과 같은 다른 기저 원인) 또는 가장 빈번하게는 둘 다의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “진성 당뇨병(diabetes mellitus)” 또는 “당뇨병(diabetes)”은 인슐린의 불충분한 수준 또는 인슐린 민감도 감소로 인한 대사 장애 및 비정상적으로 높은 혈당(고혈당증)을 특징으로 하는 증후군이다. 특징적인 증상은 고혈당 수치로 인한 과도한 소변 생성(다뇨증), 배뇨 증가를 보상하고자 하는 과도한 갈증 및 체액 섭취 증가(다갈증), 눈의 시신경에 고혈당이 미치는 효과로 인한 시야 흐림, 설명되지 않는 체중 감소, 및 무기력증이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “당뇨병성 이상지질혈증(diabetic dyslipidemia)” 또는 “이상지질혈증을 동반한 2형 당뇨병(type 2 diabetes with dyslipidemia)”은 2형 당뇨병, HDL-C 감소, 중성지방(TG) 상승, 및 작고 조밀한 LDL 입자 상승을 특징으로 하는 병태를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “지질 나노입자(lipid nanoparticle)”는 하나 이상의 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 PEG-변형 지질)을 포함하는 나노미터 정도의(예를 들어, 1~1,000 nm의) 적어도 하나의 치수를 갖는 입자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 핵산(예: mRNA)과 같은 활성제 또는 치료제를 관심 표적 부위(예: 세포, 조직, 기관, 종양 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 제형에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 지질 나노입자는 핵산을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 일반적으로 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드, 및 중합체 접합된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산과 같은 활성제 또는 치료제는 지질 나노입자의 지질 부분에 캡슐화되거나 지질 나노입자의 지질 부분의 일부 또는 전부에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화되어, 숙주 유기체 또는 세포의 메커니즘에 의해 유도된 효소 분해 또는 다른 바람직하지 않은 효과, 예를 들어, 유해한 면역 반응으로부터 보호될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “지질 캡슐화된”은 지질 나노입자가 핵산(예: mRNA)과 같은 활성제 또는 치료제에 완전한 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 다를 제공하는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 핵산(예: mRNA)은 지질 나노입자 내에 완전히 캡슐화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “접촉시키는 것”은 둘 이상의 엔티티 사이에 물리적 연결을 확립하는 것을 의미한다. 예를 들어, 표적 핵산을 가이드 핵산과 접촉시키는 것은 표적 핵산과 가이드 핵산이 물리적 연결을 공유하도록 하는 것을 의미하며; 예를 들어 서열이 서열 유사성을 공유하는 경우 표적 핵산 서열과 가이드 핵산이 혼성화될 수 있다.
“해리 상수” 또는 “Kd”는 상호 교환적으로 사용되며, 리간드 “L”과 단백질 “P” 사이의 친화도; 즉 리간드가 특정 단백질에 얼마나 단단히 결합하는지를 의미한다. 이는 식 Kd =[L] [P]/[LP]를 사용하여 계산될 수 있으며, 식 중 [P], [L], 및 [LP]는 단백질, 리간드, 및 복합체의 몰 농도를 각각 나타낸다.
본 개시는 표적 핵산을 변형시키는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “편집(editing)”은 “변형(modifying 및 (modification)”과 상호 교환적으로 사용되며, 절단, 닉킹(nicking), 편집, 결실, 녹인, 녹아웃 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 변형은 또한, 핵산 또는 핵산을 함유하는 염색질에 대한 후성적 변형, 예컨대 DNA 메틸화 및 히스톤 메틸화 및 아세틸화에 있어서의 변화를 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
“절단”은 표적 핵산 분자(예: RNA, DNA)의 공유 백본의 파단(breakage)을 의미한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단 둘 다가 가능하며, 이중 가닥 절단은 2개의 구별되는 단일 가닥 절단 이벤트의 결과로서 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "녹다운(knock-down)"은 유전자 또는 이의 유전자 산물(들)의 발현이 감소되는 것을 지칭한다. 유전자 녹다운의 결과로서, 단백질 활성 또는 기능이 약화되거나, 단백질 수준이 감소되거나 제거될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 특정 백분율의 “서열 유사성” 또는 “서열 동일성”을 갖는데, 이는 정렬했을 때, 해당 백분율의 염기 또는 아미노산이 동일하고, 2개의 서열을 비교했을 때, 동일한 상대 위치에 있음을 의미한다. 서열 유사성(때때로 유사성 백분율, 동일성 백분율, 또는 상동성으로서 지칭됨)은 다수의 상이한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 유사성을 결정하기 위해, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST를 통해 이용할 수 있는 BLAST를 포함하여, 당업계에 알려진 방법 및 컴퓨터 프로그램을 사용해 서열을 정렬할 수 있다. 핵산 내의 핵산 서열의 특정 신장부 사이의 상보성 백분율은 임의의 편리한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예시적인 방법은 BLAST(basic local alignment search tools) 프로그램 및 PowerBLAST 프로그램(Altschul 등의 문헌[J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410]; Zhang 및 Madden의 문헌[Genome Res., 1997, 7, 649-656]), 또는 Smith 및 Waterman의 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)을 사용하는 Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을, 예를 들어 기본 설정으로 사용하는 것을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 임의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하며, 코딩된 아미노산과 코딩되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 융합 단백질을 포함하며, 여기에는 이종 아미노산 서열과의 융합 단백질이 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"는 세포에서 부착된 분절의 복제 또는 발현이 발생하도록 또 다른 DNA 분절, 즉 발현 카세트가 부착될 수 있는 플라스미드, 파지, 바이러스, 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다.
핵산, 폴리펩티드, 세포, 또는 유기체에 적용될 때 본원에서 사용되는 용어 "자연 발생" 또는 "변형되지 않은" 또는 "야생형"은 자연에서 발견되는 핵산, 폴리펩티드, 세포, 또는 유기체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “돌연변이”는 야생형 또는 기준 아미노산 서열과 비교했을 때, 또는 야생형 또는 기준 뉴클레오티드 서열과 비교했을 때 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환, 복제, 또는 반전을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “단리된”은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 세포가 자연 발생하는 것과 상이한 환경에 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 세포를 기술하도록 의미를 갖는다. 단리된 유전적으로 변형된 숙주 세포는 유전적으로 변형된 숙주 세포의 혼합된 집단에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “숙주 세포”는 단세포 엔티티로서 배양된 다세포 유기체(예를 들어 세포주) 유래의 진핵 세포, 원핵 세포, 또는 세포를 지칭하는데, 진핵 세포 또는 원핵 세포가 핵산(예를 들어 AAV 벡터)에 대한 수용자로서 사용되며, 핵산에 의해 유전적으로 변형된 원시 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 보체에 있어서 원시 부모와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. “재조합 숙주 세포”(“유전자 변형된 숙주 세포”로도 지칭됨)는 이종 핵산, 예를 들어 AAV 벡터가 도입된 숙주 세포이다.
용어 “보존적 아미노산 치환”은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 단백질이 상호교환될 수 있음을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신으로 이루어지고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 세린 및 트레오닌으로 이루어지고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 리신, 아르기닌, 및 히스티딘으로 이루어지며; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 시스테인 및 메티오닌으로 이루어진다. 예시적인 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료(treatment 또는 treating)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유익한 결과 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 치료적 이익은 치료 중인 기저 장애 또는 질환의 근절 또는 완화를 의미한다. 치료적 이익은, 대상체가 여전히 기저 장애에 걸릴 수 있음에도 불구하고, 대상체에서 개선이 관찰되도록 하나 이상의 증상을 근절 또는 완화시키거나 기저 질환과 연관된 하나 이상의 임상 파라미터를 개선함으로써 달성될 수도 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량" 및 "치료적 유효 투여량"은 인간 또는 실험 동물과 같은 대상체에게 1회 투여량 또는 반복 투여량으로 투여될 때 질환 상태 또는 병태의 임의의 증상, 양태, 측정된 파라미터 또는 특성에 임의의 검출 가능하고 유익한 효과를 가질 수 있는 약물 또는 생물학적 제제 단독의 양 또는 조성물의 일부로서의 양을 지칭한다. 이러한 효과가 절대적으로 유익한 효과일 필요는 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “투여”는 화합물(예를 들어 본 개시의 조성물) 또는 조성물(예를 들어 약학적 조성물)의 투여량을 대상체에게 전달하는 방법을 의미한다.
“대상체”은 포유동물이다. 포유동물은 가축, 비인간 영장류, 인간, 개, 토끼, 마우스, 랫트 및 다른 설치류를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 “저밀도 지단백질(LDL)”은 최소 밀도(중량-부피 비율이 더 낮은 입자)에서 최대 밀도(중량-부피 비율이 더 큰 입자)까지 다음 5가지 주요 지단백질 군 중 하나를 지칭한다: 유미지립, 초저밀도 지단백질(VLDL), 저밀도 지단백질(LDL), 중간 밀도 지단백질(IDL), 및 고밀도 지단백질(HDL). 지단백질은 전신의 세포외액 내에 지질(지방)을 전달함으로써, 수용체 매개 세포내이입을 통해 전신 세포에 지방 전달을 용이하게 한다. LDL 입자의 직경은 약 220~275 옹스트롬이다.
“저밀도 지단백질(LDL) 수용체”는 콜레스테롤이 풍부한 LDL 입자의 세포내이입을 매개하는 (21개 아미노산 신호 펩티드 제거 후) 839개 아미노산의 수용체 단백질을 지칭한다. 이는, 유미지립 잔존물과 VLDL 잔존물(IDL)에서 발견되는 아포단백질 B100 및 아포단백질 E(apoE) 를 인식하여 LDL-콜레스테롤의 결합 및 세포내이입을 초래하는 세포 표면 수용체이다. 이러한 과정은 모든 유핵 세포에서 발생하지만, 순환으로부터 LDL의 약 70%를 제거하는 간에서 주로 발생한다. 인간 LDLR 유전자는, 참조로서 본원에 통합된 NCBI 데이터베이스(ncbi.nlm.nih.gov)에 기준 서열 NG_009060.1로서 부분적으로 기술되어 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조에 의해 통합되도록 표시된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 본원에 통합된다. CasX 변이체 및 gRNA 변이체, 및 이를 전달하는 방법을 개시하는 2020년 6월 5일에 출원된 WO 2020/247882, 2020년 6월 5일에 출원된 WO 2020/247883, 2020년 9월 9일에 출원된 WO 2021/050593, 2021년 9월 9일에 출원된 WO 2021/050601, 2021년 1월 8일에 출원된 WO 2021/142342, 2020년 12월 4일에 출원된 WO 2021/113763, 2020년 12월 4일에 출원된 WO 2021/113769, 2020년 12월 4일에 출원된 WO 2021/113772, 2020년 12월 4일에 출원된 WO 2021/188729, 2021년 12월 2일에 출원된 WO 2022/120095, 2021년 12월 2일에 출원된 WO 2022/120094, 2021년 12월 9일에 출원된 WO 2022/125843, 2021년 12월 2일에 출원된 WO 2022/120089, 2022년 6월 7일에 출원된 WO 2022/261150, 2022년 9월 21일에 출원된 WO 2023/049742, 2022년 6월 7일에 출원된 WO 2022/261149, 및 2023년 6월 1일에 출원된 PCT/US2023/067791의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
I.
일반 방법
본 발명을 실시하는 데에는, 달리 명시되지 않는 한, 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈, 및 재조합 DNA의 종래 기술이 사용되며, 이들은 다음과 같은 표준 교재에서 확인할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel 등(eds), John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 등(eds), Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits (ed.), Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998) (이들의 개시 내용은 참조로서 본원에 통합됨).
값의 범위가 제공되는 경우, 평가변수가 포함되고, 문맥이 명백히 달리 언급하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이에 있는 각각의 개재된 값과 해당 언급된 범위 내에 있는 임의의 다른 언급된 값 또는 개재된 값이 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고 또한 고려되며, 이는 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 달라질 수 있다. 명시된 범위가 상한과 하한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 상한과 하한 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제한 범위들도 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위한 참조로서 본원에 통합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 그리고 첨부된 청구범위에서, 단수 형태(“a”, “an”, 및 “the”)는 문맥이 명확하게 달리 언급하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 주목해야 한다.
명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 기술된 본 개시의 특정 특징부는 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수도 있음을 이해할 것이다. 다른 경우에, 간결성을 위해, 단일 구현예의 맥락에서 기술된 본 개시의 다양한 특징부가 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수도 있다. 본 개시에 관한 구현예의 모든 조합은 본 개시에 의해 구체적으로 포괄되고, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시되는 것으로 의도된다. 또한, 다양한 구현예의 모든 하위 조합 및 이의 구성요소들은 본 개시에 의해 구체적으로 포괄되고, 마치 각각의 모든 하위 조합이 개별적으로 및 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
II.
PCSK9 유전자의 후성적 변형 및 억제를 위한 시스템
제1 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 융합 단백질(집합적으로, 장기 억제 단백질, 본원에서 "LTRP" 또는 "LTRP 융합 단백질" 또는 "억제자 융합 단백질"로서 지칭됨; 표적화된 유전자에 대해 달성될 수 있는 장기 억제 효과의 반영함)을 포함하거나 이를 암호화하는 시스템을 제공한다: DNA 결합 단백질; 및 전사 억제를 위해 표적화된 PCSK9 유전자의 표적 핵산 서열에 결합하여, 이를 침묵화시키고/시키거나, 후성적으로 변형시킬 수 있는 연결된 억제자 도메인. 본원에서 사용되는 바와 같이, "시스템"은 "조성물"과 상호교환적으로 사용된다. 본 개시는 또한, 본원에 제공된 시스템을 암호화하는 핵산을 제공한다. 또한, 시스템을 만드는 방법뿐만 아니라 시스템을 사용하는 방법도 본원에 제공되며, 여기에는 유전자 억제 및/또는 후성적 변형 방법 및 PCSK9-관련 질환의 치료 방법이 포함된다.
일부 구현예에서, DNA 결합 단백질은, 표적 핵산에 결합하지만 이를 절단하지 않는 DNA 결합 단백질로도 본원에서 지칭되는, 징크 핑거(ZF) 또는 TALE(전사-활성화 인자-유사 효과기) 단백질, 또는 이의 DNA 결합 도메인을 포함한다. TALE의 DNA 결합 도메인은, 이론적으로는 1-반복-결합-1-염기-쌍 인식 코드 다음의 임의의 유전자 서열을 인식하도록 조립될 수 있는, 33~34개 아미노산(aa) 길이의 맞춤화 가능한 단량체의 탠덤 어레이로 이루어진다(Jain, S. 등의 문헌[TALE outperforms Cas9 in editing heterochromatin target sites. Nat. Commun. 12:606 (2021)]). DNA에 결합하기 위한 TALE의 특이성은 반복된 단위의 위치 12 및 13에 위치한 반복 가변 이중잔기(RVD)로 불리는 2개의 다형성 아미노산에 기인한다. 반복을 재배열함으로써, TALE의 DNA 결합 특이성은 임의로 변경될 수 있다. 징크 핑거 단백질은 각각의 핑거가 DNA의 3~4개의 염기를 인식하는 전사 인자이다. 이들 핑거 모듈을 혼합하고 일치시킴으로써, ZF는 표적화될 서열에 맞게 맞춤화될 수 있다. PCSK9 유전자에 결합할 수 있는 예시적인 ZF는 WO2018049009A2에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, DNA 결합 단백질은 촉매적으로 사멸한 클래스 1 또는 클래스 2 CRISPR 단백질이다. 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질은 당업계에서 “촉매적으로 비활성인(catalytically inactive)” CRISPR 단백질로도 지칭된다. 일부 구현예에서, 클래스 2, II형 단백질은 촉매적으로 사멸한 Cas9이다. 다른 구현예에서, 클래스 2 CRISPR 단백질은 II형, V형, 또는 VI형 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 클래스 2 V형 단백질은 Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c(C2c3), Cas12d(CasY), Cas12e(CasX), Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas12k, Cas14, 및/또는 CasΦ로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 경우에 본원에 기술된 바와 같은 특정 돌연변이에 의해 촉매적으로 사멸된다. 일부 구현예에서, CasX는 촉매적으로 사멸한 CasX 변이체(dCasX)이고, 여기서 dCasX는 서열번호 4~29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, dCasX를 포함하는 융합 단백질은 gRNA와 RNP를 형성하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, dCasX는 서열번호 4~29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, dCasX는 서열번호 3281~3441로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하되, 상기 서열은 RuvC 도메인의 절단 활성을 불활성화시켜 CasX 단백질을 촉매적으로 사멸시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 RuvC 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, dCasX는 서열번호 4의 서열을 포함한다.
CRISPR-기반 시스템은 가이드 핵산(gNA), 예를 들어 표적화 서열이 유전자의 표적 서열에 상보적인 가이드 리보핵산(gRNA)을 추가로 포함한다. CRISPR-기반 시스템(CRISPR 단백질 및 연결된 억제자 도메인) 및 gRNA가 표적 서열에 결합한 후, 유전자 전사가 억제된다.
본 개시는 PCSK9 유전자의 전사 억제를 위한 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 시스템은, 촉매적으로 사멸된 CasX 단백질 및 연결된 억제자 도메인을 포함하는 억제자 융합 단백질; 및 억제, 침묵화, 또는 하향 조절을 위해 표적화된 PCSK9 유전자의 표적 핵산 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 가이드 리보핵산(gRNA)을 포함한다(억제자 융합 단백질:gRNA 시스템). 일부 구현예에서, 시스템은 억제자 융합 단백질, 예를 들어 dCasX 및 연결된 억제자 도메인, 및 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 억제자 융합 단백질 및 gRNA를, 리보핵산단백질(RNP) 복합체를 형성하고 진핵 세포에서 PCSK9 표적 핵산에 결합할 수 있는 유전자 억제자 쌍으로서 포함한다. 다른 경우에, 본 개시는 본원에 기술된 특정 입자 제형(예: LNP)에 사용하기 위한, 억제자 융합 단백질을 암호화하는 핵산 및 gRNA로 이루어진 시스템, 또는 gRNA 및 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA로 이루어진 시스템을 제공한다.
또한, 억제자 융합 단백질 및 gRNA를 만드는 방법뿐만 아니라 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템을 사용하는 방법도 본원에 제공되며, 여기에는 유전자 억제 및/또는 후성적 변형 방법 및 치료 방법이 포함된다. 시스템의 DNA 결합 단백질(예: dCasX) 및 연결된 억제자 도메인(들) 및 gRNA 성분, 및 이들의 특징뿐만 아니라 전달 방식, 및 PCSK9 유전자의 억제, 하향 조절, 또는 침묵화를 위해 시스템을 사용하는 방법이 이하에서 더욱 완전하게 기술된다.
본 개시는 PCSK9 유전자의 전사를 억제하거나 침묵화하도록 특별히 설계된 시스템을 제공한다. 일부 경우에, 시스템은 기능 획득 돌연변이를 갖는 진핵 세포에서 PCSK9 유전자의 전사를 억제하도록 설계된다. 일부 경우에, 시스템은 진핵 세포에서 야생형 PCSK9 유전자의 전사를 억제하도록 설계된다. 대안적으로, 시스템은 진핵 세포에서 PCSK9 유전자의 돌연변이체 대립유전자의 전사를 억제하도록 설계된다. 일반적으로, PCSK9 유전자의 임의의 부분은 본원에서 보다 완전하게 기술된, 본원에 제공된 프로그래밍 가능한 시스템 및 방법을 사용하여 표적화될 수 있다.
PCSK9 유전자는, LDL을 세포 내로 수송하기 위해 저밀도 지단백질 입자(LDL)에 대한 수용체에 결합하는 단백질인 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(“PCSK9”)을 암호화한다. PCSK9 유전자는 인간 게놈(GRCh38/hg38)의 chr1:55,039,476~55,064,853에 걸쳐 있는 서열을 포함한다(상기 표기는 염색체 1의 55,039,476 bp에서 시작하여 55,064,853 bp까지 걸쳐 있는 염색체 1(chr1)을 지칭함 (Homo sapiens Updated Annotation Release 109.20190905, GRCh38.p13 참조)(NCBI). 인간 PCSK9 유전자는, 참조로서 본원에 통합된 NCBI 데이터베이스(ncbi.nlm.nih.gov)에 기준 서열 NG_009061.1로서 부분적으로 기술되어 있다. PCSK9 유전자좌는 692개 아미노산의 단백질을 암호화하는 3636 bp의 mRNA를 생산하는 12개의 엑손을 갖는데, 이 단백질은 합성 후 자가촉매적 절단 반응을 거치면서 프로도메인(prodomain)이 절단되고, 그 결과 540개의 아미노산을 갖는 활성화된 단백질이 생성된다. 프로도메인은 촉매 및 레시스틴(resistin)-유사 도메인에 부착된 상태로 남아 있는데, 이는 프로도메인이 샤페론의 역할을 하고 접힘과 분비를 용이하게 하기 때문일 수 있다(Seidah, NG 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 100(3):928 (2003)]). 분비 전구단백질 전환효소 신경 세포자멸사-조절 전환효소 1(NARC-1): 간 재생 및 신경 분화(Seidah NG 등의 문헌 참조). 신경 세포자멸사 조절 전환효소로도 불리는 이 단백질은 서브틸라아제의 프로테아제 K 하위계열에 속하는 세린 프로테아제이다.
인간 PCSK9 유전자(HGNC:20001)는 다음 서열을 갖는 단백질(Q8NBP7)을 암호화한다:
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ (서열번호 1823).
III.
억제자 시스템에 사용하기 위한 촉매적으로 사멸한 단백질
일부 구현예에서, 본 개시의 융합 단백질, 시스템, 및 방법에 사용하기 위한 DNA 결합 단백질은 PCSK9 표적 핵산에 결합할 수 있지만 이를 절단하지는 않는 징크 핑거(ZF) 또는 TALE(전사-활성화 인자-유사 효과기) 단백질이다.
일부 구현예에서, DNA 결합 단백질은 촉매적으로 사멸한 클래스 1 또는 클래스 2 CRISPR 단백질이다. 일 구현예에서, 클래스 2, II형 단백질은 촉매적으로 사멸한 Cas9이다. 또 다른 구현예에서, 클래스 2 CRISPR 단백질은 II형, V형, 또는 VI형 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 클래스 2 CRISPR V형 단백질은 Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c(C2c3), Cas12d(CasY), Cas12e(CasX), Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas12k, Cas14, 및/또는 CasΦ로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 경우에 본원에 기술된 바와 같은 특정 돌연변이에 의해 촉매적으로 사멸된다. 일부 구현예에서, CasX 단백질은 촉매적으로 사멸한 CasX 변이체(dCasX)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “CasX 단백질”은 단백질의 계열을 지칭하고, 모든 자연 발생 CasX 단백질(“기준 CasX”)뿐만 아니라, CasX를 촉매적으로 사멸시키는 변형 외에도 기준 CasX 단백질에 비해 하나 이상의 개선된 특성을 갖는 다수의 서열 변형을 갖는 조작된 CasX 단백질도 포함하며, 이에 대해서는 아래에서 보다 완전하게 기술된다. 본 개시의 CasX 단백질은 다음의 도메인을 포함한다: 비표적 가닥 결합(NTSB) 도메인, 표적 가닥 로딩(TSL) 도메인, 나선형 I 도메인, 나선형 II 도메인, 올리고뉴클레오티드 결합 도메인(OBD), 및 RuvC DNA 절단 도메인. 일부 경우에, 도메인은 표 1에 열거된 바와 같은 하위 도메인으로 추가로 분할될 수 있다.
본 개시의 맥락에서, 억제자 융합 단백질, 시스템, 및 방법에 사용하기 위한 CasX는 촉매적으로 사멸한 것(dCasX)이며; 이는 RuvC 서열의 선택 위치에 도입된, 아래에 기술된 돌연변이에 의해 달성된다.
a.
기준 CasX 단백질
본 개시는 자연 발생 CasX 단백질(본원에서 “기준 CasX 단백질”로서 지칭됨)을 제공하는데, 이는 본 개시의 조작된 dCasX를 생성하도록 후속하여 변형된 것이다. 예를 들어, 기준 CasX 단백질은 델타프로테오박테리아강(Deltaproteobacteria), 부유균문(Planctomycetes), 또는 칸디다투스 성박테리아(Candidatus Sungbacteria) 종과 같은 자연 발생 원핵생물로부터 단리될 수 있다. 기준 CasX 단백질(본원에서 기준 CasX 폴리펩티드로서 상호교환적으로 지칭됨)은 CasX(Cas12e로서 상호교환적으로 지칭됨) 단백질 계열에 속하는 클래스 2, V형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제이며, 가이드 RNA와 상호작용하여 리보핵산단백질(RNP) 복합체를 형성한다.
일부 경우에, 기준 CasX 단백질은 다음의 서열을 갖는 델타프로테오박테리아강으로부터 단리되거나 이로부터 유래된다:
1 MEKRINKIRK KLSADNATKP VSRSGPMKTL LVRVMTDDLK KRLEKRRKKP EVMPQVISNN
61 AANNLRMLLD DYTKMKEAIL QVYWQEFKDD HVGLMCKFAQ PASKKIDQNK LKPEMDEKGN
121 LTTAGFACSQ CGQPLFVYKL EQVSEKGKAY TNYFGRCNVA EHEKLILLAQ LKPEKDSDEA
181 VTYSLGKFGQ RALDFYSIHV TKESTHPVKP LAQIAGNRYA SGPVGKALSD ACMGTIASFL
241 SKYQDIIIEH QKVVKGNQKR LESLRELAGK ENLEYPSVTL PPQPHTKEGV DAYNEVIARV
301 RMWVNLNLWQ KLKLSRDDAK PLLRLKGFPS FPVVERRENE VDWWNTINEV KKLIDAKRDM
361 GRVFWSGVTA EKRNTILEGY NYLPNENDHK KREGSLENPK KPAKRQFGDL LLYLEKKYAG
421 DWGKVFDEAW ERIDKKIAGL TSHIEREEAR NAEDAQSKAV LTDWLRAKAS FVLERLKEMD
481 EKEFYACEIQ LQKWYGDLRG NPFAVEAENR VVDISGFSIG SDGHSIQYRN LLAWKYLENG
541 KREFYLLMNY GKKGRIRFTD GTDIKKSGKW QGLLYGGGKA KVIDLTFDPD DEQLIILPLA
601 FGTRQGREFI WNDLLSLETG LIKLANGRVI EKTIYNKKIG RDEPALFVAL TFERREVVDP
661 SNIKPVNLIG VDRGENIPAV IALTDPEGCP LPEFKDSSGG PTDILRIGEG YKEKQRAIQA
721 AKEVEQRRAG GYSRKFASKS RNLADDMVRN SARDLFYHAV THDAVLVFEN LSRGFGRQGK
781 RTFMTERQYT KMEDWLTAKL AYEGLTSKTY LSKTLAQYTS KTCSNCGFTI TTADYDGMLV
841 RLKKTSDGWA TTLNNKELKA EGQITYYNRY KRQTVEKELS AELDRLSEES GNNDISKWTK
901 GRRDEALFLL KKRFSHRPVQ EQFVCLDCGH EVHADEQAAL NIARSWLFLN SNSTEFKSYK
961 SGKQPFVGAW QAFYKRRLKE VWKPNA (서열번호 1).
일부 경우에, 기준 CasX 단백질은 다음의 서열을 갖는 부유균문으로부터 단리되거나 이로부터 유래된다:
1 MQEIKRINKI RRRLVKDSNT KKAGKTGPMK TLLVRVMTPD LRERLENLRK KPENIPQPIS
61 NTSRANLNKL LTDYTEMKKA ILHVYWEEFQ KDPVGLMSRV AQPAPKNIDQ RKLIPVKDGN
121 ERLTSSGFAC SQCCQPLYVY KLEQVNDKGK PHTNYFGRCN VSEHERLILL SPHKPEANDE
181 LVTYSLGKFG QRALDFYSIH VTRESNHPVK PLEQIGGNSC ASGPVGKALS DACMGAVASF
241 LTKYQDIILE HQKVIKKNEK RLANLKDIAS ANGLAFPKIT LPPQPHTKEG IEAYNNVVAQ
301 IVIWVNLNLW QKLKIGRDEA KPLQRLKGFP SFPLVERQAN EVDWWDMVCN VKKLINEKKE
361 DGKVFWQNLA GYKRQEALLP YLSSEEDRKK GKKFARYQFG DLLLHLEKKH GEDWGKVYDE
421 AWERIDKKVE GLSKHIKLEE ERRSEDAQSK AALTDWLRAK ASFVIEGLKE ADKDEFCRCE
481 LKLQKWYGDL RGKPFAIEAE NSILDISGFS KQYNCAFIWQ KDGVKKLNLY LIINYFKGGK
541 LRFKKIKPEA FEANRFYTVI NKKSGEIVPM EVNFNFDDPN LIILPLAFGK RQGREFIWND
601 LLSLETGSLK LANGRVIEKT LYNRRTRQDE PALFVALTFE RREVLDSSNI KPMNLIGIDR
661 GENIPAVIAL TDPEGCPLSR FKDSLGNPTH ILRIGESYKE KQRTIQAAKE VEQRRAGGYS
721 RKYASKAKNL ADDMVRNTAR DLLYYAVTQD AMLIFENLSR GFGRQGKRTF MAERQYTRME
781 DWLTAKLAYE GLPSKTYLSK TLAQYTSKTC SNCGFTITSA DYDRVLEKLK KTATGWMTTI
841 NGKELKVEGQ ITYYNRYKRQ NVVKDLSVEL DRLSEESVNN DISSWTKGRS GEALSLLKKR
901 FSHRPVQEKF VCLNCGFETH ADEQAALNIA RSWLFLRSQE YKKYQTNKTT GNTDKRAFVE
961 TWQSFYRKKL KEVWKPAV (서열번호 2).
일부 경우에, 기준 CasX 단백질은 다음의 서열을 갖는 칸디다투스 성박테리아로부터 단리되거나 이로부터 유래된다:
1 MDNANKPSTK SLVNTTRISD HFGVTPGQVT RVFSFGIIPT KRQYAIIERW FAAVEAARER
61 LYGMLYAHFQ ENPPAYLKEK FSYETFFKGR PVLNGLRDID PTIMTSAVFT ALRHKAEGAM
121 AAFHTNHRRL FEEARKKMRE YAECLKANEA LLRGAADIDW DKIVNALRTR LNTCLAPEYD
181 AVIADFGALC AFRALIAETN ALKGAYNHAL NQMLPALVKV DEPEEAEESP RLRFFNGRIN
241 DLPKFPVAER ETPPDTETII RQLEDMARVI PDTAEILGYI HRIRHKAARR KPGSAVPLPQ
301 RVALYCAIRM ERNPEEDPST VAGHFLGEID RVCEKRRQGL VRTPFDSQIR ARYMDIISFR
361 ATLAHPDRWT EIQFLRSNAA SRRVRAETIS APFEGFSWTS NRTNPAPQYG MALAKDANAP
421 ADAPELCICL SPSSAAFSVR EKGGDLIYMR PTGGRRGKDN PGKEITWVPG SFDEYPASGV
481 ALKLRLYFGR SQARRMLTNK TWGLLSDNPR VFAANAELVG KKRNPQDRWK LFFHMVISGP
541 PPVEYLDFSS DVRSRARTVI GINRGEVNPL AYAVVSVEDG QVLEEGLLGK KEYIDQLIET
601 RRRISEYQSR EQTPPRDLRQ RVRHLQDTVL GSARAKIHSL IAFWKGILAI ERLDDQFHGR
661 EQKIIPKKTY LANKTGFMNA LSFSGAVRVD KKGNPWGGMI EIYPGGISRT CTQCGTVWLA
721 RRPKNPGHRD AMVVIPDIVD DAAATGFDNV DCDAGTVDYG ELFTLSREWV RLTPRYSRVM
781 RGTLGDLERA IRQGDDRKSR QMLELALEPQ PQWGQFFCHR CGFNGQSDVL AATNLARRAI
841 SLIRRLPDTD TPPTP (서열번호 3).
b.
촉매적으로 사멸한 CasX 변이체 단백질
본 개시의 억제자 융합 단백질 및 이를 포함하는 시스템에서, CasX 단백질은 DNA를 절단할 수 없지만, 가이드 RNA(gRNA)와 복합체를 형성할 때 표적 핵산에 결합하는 능력을 보유한다는 점에서 촉매적으로 사멸한 것(dCasX)이다. 본 개시는 촉매적으로 사멸한 변이체(본원에서 “dCasX 변이체” 또는 “dCasX 변이체 단백질”로서 상호 교환적으로 지칭됨)를 제공하며, 여기서 촉매적으로 사멸한 CasX 변이체는 (전술한) 서열번호 1~3의 서열의 촉매적으로 사멸한 버전에 비해 선택 도메인에서 다수의 변형을 포함한다. 예시적인 촉매적으로 사멸한 CasX 단백질은 CasX 단백질의 RuvC 도메인의 활성 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 사멸한 기준 CasX 단백질은 서열번호 1과 관련하여 잔기 672, 769, 및/또는 935에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 사멸한 기준 CasX 단백질은 서열번호 1과 관련하여 D672A, E769A, 및/또는 D935A의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 촉매적으로 사멸한 기준 CasX 단백질은 서열번호 2와 관련하여 아미노산 659, 756, 및/또는 922에서 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 사멸한 기준 CasX 단백질은 서열번호 2와 관련하여 D659A, E756A, 및/또는 D922A 치환을 포함한다. 본 개시의 dCasX의 예시적인 RuvC 도메인은 상기 RuvC 절단 도메인 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 변형된 서열번호 1의 아미노산 661~824 및 935~986, 또는 서열번호 2의 아미노산 648~812 및 922~978을 포함하며, 여기서 dCasX 변이체는 기준 dCasX에 비해 하나 이상의 개선된 특성을 나타낸다. 추가의 구현예에서, 촉매적으로 사멸한 CasX 변이체 단백질은 기준 CasX 단백질의 RuvC 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함한다. 동일한 전술한 치환 또는 결실이 당업계에 공지된 CasX 변이체에 유사하게 도입되어, dCasX 변이체를 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다(예를 들어, 예시적인 서열에 대해서는 본원에 참조로서 통합된 WO2022120095A1 및 US11,560,555 참조).
일부 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX 변이체는 유사한 방식으로 구성된 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 특성을 나타낸다. 본원에 기술된 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질과 비교하여, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX 변이체 단백질의 하나 이상의 기능 또는 특성을 개선하는 모든 dCasX 변이체는 본 개시의 범주 내에 포함되도록 의도된다. 일부 구현예에서, 변형은 dCasX를 촉매적으로 사멸시키는 변형이 아닌, 기준 dCasX의 하나 이상의 아미노산에서의 돌연변이이다. 예를 들어, dCasX 변이체는 기준 dCasX 단백질 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실, 또는 스와핑된 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 임의의 아미노산은 본원에 기술된 치환에서 임의의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다(예를 들어 염기성 아미노산이 또 다른 염기성 아미노산으로 치환되는 것). 치환은 비-보존적 치환일 수 있다(예를 들어 염기성 아미노산이 산성 아미노산으로 치환되는 것 또는 반대로 치환되는 것). 예를 들어, 기준 dCasX 단백질 내의 프롤린은 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 중 어느 하나로 치환되어 본 개시의 dCasX 변이체 단백질을 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, dCasX 변이체는 기준 dCasX에 비해 개선된 특성을 나타낸다. dCasX 변이체 구현예의 예시적인 개선된 특성은, 변이체의 접힘 개선, gRNA에 대한 결합 친화도 증가, 표적 핵산에 대한 결합 친화도 증가, 표적 핵산을 억제 및/또는 이에 결합함에 있어서 더 큰 범위의 PAM 서열을 이용하는 개선된 능력, 표적 DNA의 풀림 개선, 표적 가닥 로딩의 증가, DNA의 비표적 가닥의 결합 증가, 개선된 단백질 안정성, gRNA와 복합체를 형성하는 능력의 증가, 단백질:gRNA(RNP) 복합체 안정성의 개선, 및 연결된 억제자 도메인의 경우 RNP로서 복합체화될 때의 안정성 개선, 억제자 활성 증가, 표적 핵산에 대한 억제자 특이성 개선, 표적 외 억제의 감소, 효율적으로 억제되고/되거나 후성적으로 변형될 수 있는 진핵 게놈의 백분율 증가를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, dCasX 변이체의 개선된 특성은 기준 dCasX 단백질에 비해 적어도 약 1.1 내지 약 100,000배 개선된다. 일부 구현예에서, dCasX 변이체의 개선된 특성은 기준 dCax 단백질에 비해 적어도 약 1.1 내지 약 10,000배, 적어도 약 1.1 내지 약 1,000배, 적어도 약 1.1 내지 약 500배, 적어도 약 1.1 내지 약 400배, 적어도 약 1.1 내지 약 300배, 적어도 약 1.1 내지 약 200배, 적어도 약 1.1 내지 약 100배, 적어도 약 1.1 내지 약 50배, 적어도 약 1.1 내지 약 40배, 적어도 약 1.1 내지 약 30배, 적어도 약 1.1 내지 약 20배, 적어도 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 4배, 약 1.1 내지 약 3배, 약 1.1 내지 약 2배, 약 1.1 내지 약 1.5배, 약 1.5 내지 약 3배, 약 1.5 내지 약 4배, 약 1.5 내지 약 5배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 5 내지 약 10배, 약 10 내지 약 20배, 약 10 내지 약 30배, 약 10 내지 약 50배, 또는 약 10 내지 약 100배 개선된다. 일부 구현예에서, dCasX 변이체의 개선된 특성은 기준 dCasX 단백질에 비해 적어도 약 10 내지 약 1000배 개선된다. 개선된 특징에 대한 추가 개시는 본원에서 후술된다.
다른 구현예에서, 변형은 기준 dCasX의 하나 이상의 도메인이 상이한 CasX의 하나 이상의 도메인으로 치환되는 것이다. 일부 구현예에서, 삽입은 상이한 CasX 단백질의 도메인의 일부 또는 전부의 삽입을 포함한다. 돌연변이는 dCasX 변이체의 어느 하나 또는 그 이상의 도메인에 위치할 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 도메인의 일부 또는 전부의 결실, 또는 임의의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다. dCasX 단백질의 도메인은 비표적 가닥 결합(NTSB) 도메인, 표적 가닥 로딩(TSL) 도메인, 나선형 I 도메인, 나선형 II 도메인, 올리고뉴클레오티드 결합 도메인(OBD), 및 RuvC DNA 절단 도메인을 포함하고, 후술하는 하위 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 dCasX 변이체 단백질을 생성하기 위한 적절한 돌연변이 유발 방법은, 예를 들어 심층 돌연변이 진화(DME), 심층 돌연변이 스캐닝(DMS), 오류 유발 PCR, 카세트 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발, 시차를 둔 연장 PCR, 유전자 셔플링, 또는 도메인 스와핑을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, dCasX 변이체는, 예를 들어 기준 dCasX에서 하나 이상의 원하는 돌연변이를 선택함으로써 설계된다. 소정의 구현예에서, 기준 dCasX 단백질의 활성은, 하나 이상의 dCasX 변이체의 활성을 비교하여 dCasX 변이체의 기능 개선을 측정하는 벤치마크로서 사용된다.
일부 구현예에서, dCasX 변이체 단백질은 700 내지 1200개의 아미노산, 800 내지 1100개의 아미노산, 또는 900 내지 1000개의 아미노산을 포함한다.
본 개시의 dCasX 및 연결된 억제자 도메인은 TTC, ATC, GTC, 또는 CTC로부터 선택된 PAM 서열을 포함하는 PAM TC 모티프를 사용하고 이에 결합하여 gRNA와 RNP로서 복합체화될 때, 비슷한 검정 시스템에서, 기준 dCasX 단백질 및 기준 gRNA의 RNP와 비교하여 표적 핵산에 효율적으로 결합하는 향상된 능력을 갖는다. 전술한 바와 같이, PAM 서열은 gRNA의 표적화 서열과 동일성을 갖는 프로토스페이서의 비표적 가닥에 대해 5' 방향으로 적어도 1개 뉴클레오티드에 위치한다.
일부 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 본 개시의 dCasX 변이체 단백질 및 gRNA를 20 pM 이하의 농도로 포함하는 RNP는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 효율로 이중 가닥 DNA 표적에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX 변이체 및 gRNA 변이체로 이루어진 RNP는 유사한 검정 시스템에서 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질 및 기준 gRNA를 포함하는 RNP와 비교해 표적 핵산에서 표적 서열의 더 큰 결합을 나타내며, 여기서 표적 핵산의 PAM 서열은 TTC이다. 또 다른 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX 변이체 및 gRNA 변이체로 이루어진 RNP는 유사한 검정 시스템에서 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질 및 기준 gRNA를 포함하는 RNP와 비교해 표적 핵산에서 표적 서열의 더 큰 결합 친화도를 나타내며, 여기서 표적 핵산의 PAM 서열은 ATC이다. 또 다른 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX 변이체 및 gRNA 변이체로 이루어진 RNP는 유사한 검정 시스템에서 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질 및 기준 gRNA를 포함하는 RNP와 비교해 표적 핵산에서 표적 서열의 더 큰 결합 친화도를 나타내며, 여기서 표적 핵산의 PAM 서열은 CTC이다. 또 다른 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX 변이체 및 gRNA 변이체로 이루어진 RNP는 유사한 검정 시스템에서 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질 및 기준 gRNA를 포함하는 RNP와 비교해 표적 핵산에서 표적 서열의 더 큰 결합 친화도를 나타내며, 여기서 표적 핵산의 PAM 서열은 GTC이다. 전술한 구현예에서, 하나 이상의 PAM 서열에 대한 증가된 결합 친화도는 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질(서열번호 1~3으로부터 변형됨) 중 어느 하나 및 PAM 서열에 대한 표 6의 서열번호 1731~1743의 gRNA로 이루어진 RNP의 결합 친화도와 비교해 적어도 1.5배 더 크다.
c.
다중 공급원 단백질로부터의 도메인을 갖는 dCasX 변이체 단백질
키메라 dCasX 단백질도 본 개시의 범위 내에서 고려된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “키메라 dCasX” 단백질은 상이한 공급원으로부터의 적어도 2개의 도메인을 함유하는 dCasX 단백질뿐만 아니라, 그 자체가 키메라인 적어도 하나의 도메인을 함유하는 dCasX 단백질 둘 다를 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 키메라 dCasX 단백질은 상이한 공급원으로부터, 예컨대 2개의 상이한 자연 발생 CasX 단백질로부터 (예를 들어, 2개의 상이한 CasX 기준 단백질로부터), 또는 2개의 상이한 조작된 CasX 단백질로부터 단리되거나 유래된 적어도 2개의 도메인을 포함하는 것이다. 일부 구현예에서, 서열번호 2로부터 유래된 dCasX 변이체의 나선형 I-I 도메인 및 NTSB 도메인은 서열번호 1 유래의 상응하는 나선형 I-I 및 NTSB 서열로 치환되어, 키메라 dCasX 단백질을 생성한다. 전술한 것의 또 다른 예로서, 키메라 RuvC 도메인은 서열번호 1의 아미노산 660 내지 823 및 서열번호 2의 아미노산 921 내지 978을 포함한다. 전술한 것의 대안적인 예로서, 키메라 RuvC 도메인은 서열번호 2의 아미노산 647 내지 810 및 서열번호 1의 아미노산 934 내지 986을 포함한다.
다른 구현예에서, 키메라 dCasX 단백질은 키메라 도메인인 적어도 하나의 도메인을 함유하는 것이고, 예를 들어, 일부 구현예에서, 도메인의 일부는 (기준 CasX 단백질, 또는 다른 조작된 CasX 단백질과) 상이한 CasX 단백질로부터의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 키메라 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 NTSB, TSL, 나선형 I, 나선형 II, OBD, 또는 RuvC 도메인 중 어느 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 2로부터 유래된 dCasX 변이체의 나선형 I-I 도메인 (나선형 I-a로서 지칭될 때도 있음)은 서열번호 1 유래의 상응하는 나선형 I-I로 치환되어, 키메라 dCasX 단백질을 생성한다.
서열번호 1의 NTSB 도메인 및 나선형 I-II 도메인 및 서열번호 2의 나선형 I-I 도메인을 갖는 표 2의 서열은 dCasX 491, 515, 516, 518-520, 522-527, 532, 593, 676(NTSB 도메인에서 L169K 치환을 가짐), 및 812를 포함한다(서열번호에 대해서는 표 2 참조). 서열번호 1 및 서열번호 2의 기준 CasX 단백질에서 CasX 도메인의 좌표는 아래 표 1에 제공되어 있다. 당업자는 아래 표 1에 표시된 도메인 경계가 근사치라는 것과, 경계가 아래 표에 주어진 것과 1, 2, 또는 3개의 아미노산만큼 상이한 단백질 단편이 아래에 기술된 도메인과 동일한 활성을 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 3281~3441, 또는 서열번호 1로부터의 NTSB 도메인 및 나선형 I-II 도메인 및 서열번호 2로부터의 나선형 I-I 도메인을 갖는 서열번호 3444~3446의 CasX 단백질을 제공하되, CasX는 기준 CasX의 도메인에 비해 선택 위치에서 추가의 아미노산 변화(즉, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 불일치)를 가지며, 이들은 RuvC 도메인의 절단 활성을 불활성화시키는 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 촉매적으로 사멸된다.
| 기준 CasX 단백질에서의 도메인 좌표 | ||
| 도메인 명칭 | 서열번호 1에서의 좌표* | 서열번호 2에서의 좌표* |
| OBD-I | 1-55 | 1-57 |
| 나선형 I-I | 56-99 | 58-101 |
| NTSB | 100-190 | 102-191 |
| 나선형 I-II | 191-331 | 192-332 |
| 나선형 II | 332-508 | 333-500 |
| OBD-II | 509-659 | 501-646 |
| RuvC-I | 660-823 | 647-810 |
| TSL | 824-933 | 811-920 |
| RuvC-II | 934-986 | 921-978 |
| * 아미노산 위치 | ||
일부 구현예에서, 본 개시의 융합 단백질에 사용되는 dCasX 변이체 단백질은 표 2에 제시된 것과 같은 서열번호 4~29의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시의 융합 단백질에 사용되는 dCasX 변이체 단백질은 표 2에 제시된 것과 같은 서열 4~29의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 유전자 억제자 시스템의 융합 단백질에 사용되는 dCasX 변이체 단백질은 서열번호 4(dCasX 491)의 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 개시의 유전자 억제자 시스템의 융합 단백질에 사용되는 dCasX 변이체 단백질은 서열번호 6(dCasX 515)의 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 개시의 유전자 억제자 시스템의 융합 단백질에 사용되는 dCasX 변이체 단백질은 서열번호 29(dCasX 812)의 서열을 포함한다.
|
서열
번호 |
dCasX | 아미노산 서열 |
| 4 | dCasX491 |
QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 5 | dCasX514 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTIHTSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 6 | dCasX515 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEAD7KDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 7 | dCasX516 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNHNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 8 | dCasX517 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGAPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 9 | dCasX518 | RQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 10 | dCasX519 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHIQLRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 11 | dCasX520 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTTQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 12 | dCasX522 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKRSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 13 | dCasX523 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTYPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
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| 16 | dCasX526 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAAKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 17 | dCasX527 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 18 | dCasX528 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASYPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 19 | dCasX529 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASNPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 20 | dCasX530 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGWGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 21 | dCasX531 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGYGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 22 | dCasX532 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 23 | dCasX533 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASYPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 24 | dCasX535 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 25 | dCasX593 | QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRWWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 26 | dCasX668 |
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| 27 | dCasX672 |
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| 28 | dCasX676 |
QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLIKLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV |
| 29 | dCasX812 |
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일부 구현예에서, dCasX는 서열번호 4~29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, dCasX는 서열번호 4~29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, dCasX는 서열번호 3281~3441 및 3444~3446으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 상기 서열은 dCasX가 DNA에 결합할 수 있게 하는 하나 이상의 돌연변이를 RuvC 도메인에 추가로 포함하지만, 달리 촉매적으로는 사멸된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 RuvC 도메인에 있고 RuvC를 촉매적으로 불활성화시킨다(즉, DNA를 절단할 수 없음). 일부 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 서열번호 2의 서열에 상응하는 D659A, E756A, 및/또는 D922A 치환을 포함한다. dCasX를 포함하는 억제자 융합 단백질은 gRNA와 RNP를 형성하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, dCasX를 포함하는 억제자 융합 단백질은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 CasX 단백질의 하나 이상의 기능을 보유한다: gRNA에 대한 친화도, 표적 핵산에 대한 결합, 표적 핵산에 대한 특이성, 표적 핵산의 풀림, 표적 가닥 로딩, 또는 이들의 임의의 조합.
d.
gRNA에 대한 친화도
일부 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX는 기준 dCasX 단백질에 비해 gRNA에 대해 개선된 친화도를 가짐으로써, 리보핵산단백질 복합체를 형성한다. gRNA에 대한 억제자 융합 단백질의 친화도가 증가하면, 예를 들어 RNP 복합체의 생성을 위한 Kd가 더 낮아질 수 있으며, 이는 일부 경우에, 보다 안정한 리보핵산단백질 복합체 형성으로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA에 대한 억제자 융합 단백질의 Kd는 기준 dCasX 단백질 및 연결된 억제자 도메인에 비해 적어도 약 1.1, 적어도 약 1.2, 적어도 약 1.3, 적어도 약 1.4, 적어도 약 1.5, 적어도 약 1.6, 적어도 약 1.7, 적어도 약 1.8, 적어도 약 1.9, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 또는 적어도 약 100배만큼 증가한다. 일부 구현예에서, dCasX 변이체는 서열번호 2의 기준 CasX 단백질의 촉매적으로 비활성인 변이체와 비교하여 gRNA에 대해 약 1.1 내지 약 10배 증가된 결합 친화도를 갖는다.
일부 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX의 gRNA에 대한 친화도가 증가하면, 대상체에게 생체 내 전달하는 것을 포함하여 포유류 세포에 전달될 때 리보핵산단백질 복합체의 안정성이 증가한다. 이러한 안정성의 증가는 대상체의 세포에서 복합체의 기능 및 유용성에 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라, 대상체에게 전달될 때 혈액에서 약동학적 특성도 개선할 수 있다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 친화도 증가 및 이로 인한 리보핵산단백질 복합체의 안정성 증가는, 생체 내 또는 시험관 내 유전자 억제 및/또는 후성적 변형과 같은 바람직한 활성을 여전히 가지면서, 더 낮은 투여량의 억제자 융합 단백질을 대상체 또는 세포에 전달되도록 할 수 있다. RNP를 형성하고 이를 안정한 형태로 유지하는 능력의 증가는 당업계에 공지된 시험관 내 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, dCasX 변이체 단백질 및 연결된 억제자 도메인의 gRNA에 대한 친화도가 더 높으면(더 강하게 결합하면), dCasX 변이체 단백질 및 gRNA 둘 다가 RNP 복합체로 남아있을 때, 더 많은 양의 억제 및/또는 후성적 변형 이벤트를 가능하게 한다. 억제 이벤트의 증가는 본원에 기술된 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
gRNA에 대한 억제자 융합 단백질 결합 친화도를 측정하는 방법은 정제된 억제자 융합 단백질 및 gRNA를 사용하는 시험관 내 방법을 포함한다. gRNA 또는 억제자 융합 단백질에 형광단이 태그되는 경우, 억제자 융합 단백질의 결합 친화도는 형광 편광으로 측정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 결합 친화도는 바이오층 간섭계, 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA), 또는 필터 결합에 의해 측정할 수 있다. 기준 gRNA 및 이의 변이체와 같은 특정 gRNA에 대한 본 개시의 기준 dCasX 및 변이체 단백질과 같은 RNA 결합 단백질의 절대 친화도를 정량화하기 위한 추가의 표준 기술은 등온 열량측정(ITC) 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
e.
표적 핵산 서열에 대한 개선된 특이성
일부 구현예에서, 연결된 억제자 도메인을 갖는 dCasX 변이체 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질은 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX 단백질에 비해, gRNA의 표적화 서열에 상보적인 표적 핵산 서열에 대해 개선된 특이성을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “표적 특이성(target specificity)”으로서 지칭되기도 하는 “특이성”은 CRISPR/Cas 시스템 리보핵산단백질 복합체가 표적 핵산 서열과 유사하지만 동일하지는 않은 표적 외 서열에 결합하는 정도를 지칭하며; 예를 들어, 더 높은 정도의 특이성을 갖는 억제자 융합 단백질 RNP는 연결된 억제자 도메인을 갖는 기준 dCasX의 RNP에 비해 서열의 표적 외 메틸화 감소를 나타낼 것이다. 억제자 융합 단백질을 포유류 대상체에서 사용하기 위해 허용 가능한 치료 지수를 달성하기 위해서는 억제자 융합 단백질의 특이성, 및 잠재적으로 유해한 표적 외 효과의 감소가 매우 중요할 수 있다.
이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 표적 핵산 가닥에 대한 억제자 융합 단백질의 특이성을 증가시키는 나선형 I 및 II 도메인에서의 아미노산 변화가 표적 핵산 전체에 대한 억제자 융합 단백질의 특이성을 증가시킬 수 있다는 것이 가능하다. 일부 구현예에서, 표적 핵산에 대한 억제자 융합 단백질의 특이성을 증가시키는 아미노산 변화가 DNA에 대한 억제자 융합 단백질의 친화도를 감소시킬 수도 있지만, 조성물의 전반적인 이점 및 안전성은 향상된다.
f.
추가의 이종 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질
억제자 융합 단백질에 융합된 하나 이상의 이종 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질도 본 개시의 범주 내에서 고려된다. 여기에는 이종 단백질 또는 이의 도메인에 대한 N-말단 또는 C-말단 융합을 포함하는 억제자 융합 단백질이 포함된다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 상이한 관심 활성을 갖는 하나 이상의 단백질 또는 이의 도메인에 융합된다.
일부 경우에, 억제자 융합 단백질과 함께 사용하기 위한 이종 폴리펩티드(융합 파트너)는 세포내 국소화(subcellular localization)를 가능하게 하며, 이종 폴리펩티드는 세포내 국소화 서열(예를 들어, 핵에 대해 표적화하기 위한 핵 국소화 신호(NLS), 융합 단백질을 핵 밖에서 유지하기 위한 서열, 예를 들어, 핵 내보내기 서열(NES), 융합 단백질을 세포질 내에 유지시키는 서열, 미토콘드리아에 대해 표적화하기 위한 미토콘드리아 국소화 신호, 엽록체에 표적화하기 위한 엽록체 국소화 신호, ER 유지 신호, 등)을 함유한다.
일부 경우에, 억제자 융합 단백질은 핵 국소화 신호(NLS)를 포함한다(NLS에 융합된다). 일부 경우에, 억제자 융합 단백질은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상의 NLS에 융합된다. 일부 경우에, 하나 이상의 NLS(2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 NLS)는 억제자 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 또는 그 근처에(예를 들어 이들로부터 50개 아미노산 이내에) 위치한다. 일부 경우에, 하나 이상의 NLS(2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 NLS)는 억제자 융합 단백질의 N-말단에 또는 그 근처에(예를 들어 이로부터 50개 아미노산 이내에) 위치한다. 일부 경우에, 하나 이상의 NLS(2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 NLS)는 억제자 융합 단백질의 C-말단에 또는 그 근처에(예를 들어 이로부터 50개 아미노산 이내에) 위치한다. 일부 경우에, 하나 이상의 NLS(3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 NLS)는 억제자 융합 단백질의 N-말단 및 C-말단 모두에 또는 그 근처에(예를 들어 이들로부터 50개 아미노산 이내에) 위치한다. 일부 경우에, 하나의 NLS는 억제자 융합 단백질의 N-말단에 위치하고 하나의 NLS는 억제자 융합 단백질의 C-말단에 위치한다. 당업자는, 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 또는 그 근처에 위치한 NLS는 N-말단 또는 C-말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산 이내에 있을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, dCasX 또는 억제자 융합 단백질의 N-말단에 연결된 NLS는 C-말단에 연결된 NLS와 동일하다. 다른 구현예에서, dCasX 또는 억제자 융합 단백질의 N-말단에 연결된 NLS는 C-말단에 연결된 NLS와 상이하다. NLS를 갖는 억제인자 융합 단백질의 대표적인 구성은 도 1 및 도 2에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 시스템에서 억제자 융합 단백질과 함께 사용하기에 적합한 NLS는 다음으로부터 유래된 서열과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖거나 동일한 서열을 포함한다: 아미노산 서열 PKKKRKV(서열번호 30)를 갖는 유인원 바이러스 40(SV40) 바이러스 거대 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민의 NLS(예를 들어 서열 KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 31)를 갖는 뉴클레오플라스민 이등분 NLS); PAAKRVKLD(서열번호 32) 또는 RQRRNELKRSP(서열번호 33)의 아미노산 서열을 갖는 c-MYC NLS. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 N-말단에 연결된 NLS는 표 3에 제시된 것과 같은 N-말단 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 C-말단에 연결된 NLS는 표 4에 제시된 것과 같은 C-말단 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 시스템에서 억제자 융합 단백질과 함께 사용하기에 적합한 NLS는 표 3 또는 표 4의 하나 이상의 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖거나 동일한 서열을 포함한다. 당업자는 표 3 및 표 4가 NLS 서열을 예시적인 구현예로서 N-말단 또는 C-말단으로서 제시한다는 것을 이해할 것이다. 표 3 또는 4의 NLS 중 어느 하나는 본원에 기술된 억제자 융합 단백질의 N 또는 C 말단에 융합될 수 있다.
| NLS 아미노산 서열 * | 서열번호 |
| PKKKRKVSR | 34 |
| PKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVSR | 35 |
| PKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVSR | 36 |
| PAAKRVKLDSR | 37 |
| PAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDSR | 38 |
| PAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDSR | 39 |
| PAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDSR | 40 |
| KRPAATKKAGQAKKKKSR | 41 |
| KRPAATKKAGQAKKKKGGSKRPAATKKAGQAKKKKSR | 42 |
| PAAKRVKLDGGSPKKKRKVSR | 43 |
| PAAKKKKLDGGSPKKKRKVSR | 44 |
| PAAKKKKLDSR | 45 |
| PAAKKKKLDGGSPAAKKKKLDGGSPAAKKKKLDSR | 46 |
| PAAKKKKLDGGSPAAKKKKLDGGSPAAKKKKLDGGSPAAKKKKLDSR | 47 |
| PAKRARRGYKCSR | 48 |
| PAKRARRGYKCGSPAKRARRGYKCSR | 49 |
| PRRKREESR | 50 |
| PYRGRKESR | 51 |
| PLRKRPRRSR | 52 |
| PLRKRPRRGSPLRKRPRRSR | 53 |
| PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVGGS | 54 |
| PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVPPPPG | 55 |
| PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVGIHGVPAAPG | 56 |
| PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVGGGSGGGSPG | 57 |
| PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVPGGGSGGGSPG | 58 |
| PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVAEAAAKEAAAKEAAAKAPG | 59 |
| PAAKRVKLDGGSPKKKRKVGGS | 60 |
| PAAKRVKLDPPPPKKKRKVPG | 61 |
| PAAKRVKLDPG | 62 |
| PAAKRVKLDGGGSGGGSGGGS | 63 |
| PAAKRVKLDPPP | 64 |
| PAAKRVKLDGGGSGGGSGGGSPPP | 65 |
| PKKKRKVPPP | 66 |
| PKKKRKVGGS | 67 |
| *굵은 글씨체로 표시된 잔기는 NLS 잔기이고, 굵은 글씨체로 표시되지 않은 잔기는 링커이다. | |
| NLS 아미노산 서열 | 서열번호 |
| GSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKV | 68 |
| GSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKVGGSPKKKRKV | 69 |
| GSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLD | 70 |
| GSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLDGGSPAAKRVKLD | 71 |
| GSKRPAATKKAGQAKKKK | 72 |
| KRPAATKKAGQAKKKKGGSKRPAATKKAGQAKKKK | 73 |
| GSKLGPRKATGRWGS | 74 |
| GSKRKGSPERGERKRHWGS | 75 |
| GSPKKKRKVGSGSKRPAATKKAGQAKKKKLE | 76 |
| GPKRTADSQHSTPPKTKRKVEFEPKKKRKV | 77 |
| GGGSGGGSKRTADSQHSTPPKTKRKVEFEPKKKRKV | 78 |
| AEAAAKEAAAKEAAAKAKRTADSQHSTPPKTKRKVEFEPKKKRKV | 79 |
| GPPKKKRKVGGSKRTADSQHSTPPKTKRKVEFEPKKKRKV | 80 |
| GPAEAAAKEAAAKEAAAKAPAAKRVKLD | 81 |
| GPGGGSGGGSGGGSPAAKRVKLD | 82 |
| GPPAAKRVKLD | 83 |
| VGSKRPAATKKAGQAKKKK | 84 |
| TGGGPGGGAAAGSGSPKKKRKVGSGSKRPAATKKAGQAKKKKLE | 85 |
| TGGGPGGGAAAGSGSPKKKRKVGSGS | 86 |
| PPPPKKKRKVPPP | 87 |
| GGSPKKKRKVPPP | 88 |
| PPPPKKKRKV | 89 |
| GGSPKKKRKV | 90 |
| GGSPKKKRKVGGSGGSGGS | 91 |
| GGSPKKKRKVGGSPKKKRKV | 92 |
| GGSGGSGGSPKKKRKVGGSPKKKRKV | 93 |
| VGGGSGGGSGGGSPAAKRVKLD | 94 |
| VPPPPAAKRVKLD | 95 |
| VPPPGGGSGGGSGGGSPAAKRVKLD | 96 |
| VGSPAAKRVKLD | 97 |
일부 구현예에서, 하나 이상의 NLS는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커 펩티드를 통해 억제자 융합 단백질에 연결되거나 인접한 NLS에 연결된다: SR, GS, GP, VGS, GGS, (G)n (서열번호 98), (GS)n (서열번호 99), (GSGGS)n (서열번호 100), (GGSGGS)n (서열번호 101), (GGGS)n (서열번호 102), GGSG (서열번호 103), GGSGG (서열번호 104), GSGSG (서열번호 105), GSGGG (서열번호 106), GGGSG (서열번호 107), GSSSG (서열번호 108), GPGP (서열번호 109), GGP, PPP, VPPP, PPAPPA (서열번호 110), PPPG (서열번호 111), PPPGPPP (서열번호 112), PPP(GGGS)n (서열번호 113), (GGGS)nPPP (서열번호 114), AEAAAKEAAAKEAAAKA (서열번호 115), VPPPGGGSGGGSGGGS (서열번호 116), TGGGPGGGAAAGSGS (서열번호 117), GGGSGGGSGGGSPPP (서열번호 118), TPPKTKRKVEFE (서열번호 119), GGSGGGS (서열번호 120), GSGSGGG (서열번호 121), SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH (서열번호 122), GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE (서열번호 123), 및 GGSGGG (서열번호 124) (서열 중 n은 1 내지 5임).
일반적으로, NLS(또는 다수의 NLS)는 진핵 세포의 핵에서 LTRP 융합 단백질의 축적을 유도하기에 충분한 강도를 갖는다. 핵에서의 축적을 검출하는 것은 임의의 적절한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포 내의 위치가 시각화될 수 있도록 검출 가능한 마커가 LTRP 융합 단백질에 융합될 수 있다. 세포 핵은 세포로부터 단리될 수도 있고, 그런 다음 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 효소 활성 검정과 같은, 단백질을 검출하기 위한 임의의 적절한 방법에 의해 그 성분을 분석할 수 있다. 핵에서의 축적은 간접적으로 결정될 수도 있다.
IV.
억제자 도메인
일부 구현예에서, 본 개시는 억제자 융합 단백질 및 이를 포함하는 시스템을 제공하며, 여기서 억제자 융합 단백질은 다수의 억제자 도메인에 연결된 DNA 결합 단백질(억제자 융합 단백질)을 포함하고, 시스템은 PCSK9의 표적 핵산에 결합하여, 표적 핵산의 후성적 변형에 의한 것을 포함하여, PCSK9 표적 핵산의 전사를 억제할 수 있다. 억제자 융합 단백질에 사용하기 위한 예시적인 DNA 결합 단백질은 징크 핑거(ZF), TALE(전사-활성화 인자-유사 효과기) 단백질, 및 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질과 같은 DNA 결합 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는, PCSK9의 표적 핵산 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 가이드 리보핵산(gRNA)과 다수의 억제자 도메인이 복합체를 형성할 때 이들 다수의 억제자 도메인에 연결되는, dCasX와 같은 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질을 제공하며, 상기 시스템은 PCSK9의 표적 핵산 서열에 결합하여 PCSK9 표적 핵산의 전사 및/또는 후성적 변형을 억제할 수 있다. 전사를 감소시키는 유전자 억제 과정의 예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 전사 개시 복합체의 형성을 억제하는 것들, 전사 개시 속도를 감소시키는 것들, 전사 신장 속도를 감소시키는 것들, 전사 가공성을 감소시키는 것들, 및 (예를 들어, 전사 활성화 인자의 결합을 차단함으로써) 전사 활성화를 길항하는 것들. 유전자 억제는, 예를 들어 활성화를 예방하는 것뿐만 아니라 기존 수준 미만으로 발현을 억제하는 것을 구성할 수 있다. 전사 억제는 유전자 전사의 가역적 및 비가역적 불활성화 둘 다를 포함하며; 후자는 표적 핵산의 후성적 변형으로부터 기인할 수 있다.
유전자를 억제하거나 침묵화시키는 능력을 가진 억제자 도메인 중에서, 크뤼펠-연관 박스(KRAB) 억제자 도메인은 가장 강력한 인간 게놈 시스템 중 하나이다(Alerasool, N., 등의 문헌[An efficient KRAB domain for CRISPRi applications. Nat. Methods 17:1093 (2020)]). KRAB 도메인은 약 400개의 인간 징크 핑거 단백질-기반 전사 인자에 존재하는데, 인간 징크 핑거 단백질-기반 전사 인자는 연결된 dCasX가 표적 핵산에 결합한 후, Trim28(Kap1 또는 Tif1-베타로도 알려짐)과 같은 그러나 이에 한정되지는 않는 추가의 억제자 도메인을 동원할 수 있고, 동원된 추가의 억제자 도메인은 유전자의 전사 억제를 유도하는 CBX5/HP1α 및 SETDB1과 같은 염색질 조절자와 함께 궁극적으로 단백질 복합체를 조립하지만, 이는 제한되고 일시적인 방식으로 이루어진다. 본 개시의 시스템에 사용하기에 적합한 KRAB 도메인의 대표적인 비제한적인 예는 ZIM3(서열번호 128) 및 ZNF10(서열번호 129)을 포함한다. 본 개시는 본원에 기술된 억제자 융합 단백질에 통합될 때 ZIM3 및 ZNF10과 비교해 활성을 향상시키는 것으로 확인된, 인간 및 비인간 공급원 유래의 추가 억제자 도메인을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템의 사용에 의해 부여된 변형이 후성적이고, 따라서 PCSK9 유전자의 침묵화가 편집된 표적 핵산의 복제 이외의 메커니즘에 의해 유전될 수 있는 시스템을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “후성적 변형(epigenetic modification)”은 DNA 서열 자체의 변화(예: 치환, 결실, 또는 재배열)가 아닌 DNA 또는 DNA와 연관된 히스톤에 대한 변형을 의미하며, 여기서 변형은 시스템의 성분에 의한 직접 변형이거나, 하나 이상의 추가 세포 성분의 동원에 의해 간접적으로 이루어지되 DNA 표적 핵산 서열 자체는 서열을 변화시키도록 편집되지 않는 간접적 변형이다. 예를 들어, DNA 메틸전이효소 3A(DNMT3A)(또는 이의 촉매 도메인)는 DNA를 메틸화함으로써 DNA를 직접 변형시키는 반면, KRAB는 강력한 전사 억제제로서 작용하는 KAP-1/TIF1β 공동억제제 복합체를 동원하고, DNA 메틸화 및 억제성 염색질의 형성과 연관된 인자, 예컨대 이종염색질 단백질 1(HP1), 히스톤 탈아세틸화효소, 및 히스톤 메틸전이효소를 추가로 동원할 수 있다(Ying, Y. 등의 문헌[The Kruppel-associated box repressor domain induces reversible and irreversible regulation of endogenous mouse genes by mediating different chromatin states. Nucleic Acids Res. 43(3): 1549 (2015)]). 또한, 촉매적으로 비활성인 DNMT3L 보조인자는 DNA 복제 후에 세포의 내인성 DNMT1과 함께 유전성 메틸화 패턴을 확립하는 데 도움을 준다. DNMT3A의 ATRX-DNMT3-DNMT3L 도메인(ADD)은 다음 2가지 주요 기능을 갖는 것으로 알려져 있다: 1) 메틸전이효소 자가-억제 도메인의 역할을 함으로써 DNMT3A의 촉매 활성을 알로스테릭하게 조절함, 및 2) 리신(K)4에서 메틸화되지 않은 히스톤 H3 꼬리와 특이적으로 상호작용하여, K4에서 메틸화되지 않은 염색질 H3 꼬리에 결합된 DNA의 우선적인 메틸화를 유도함(Zhang, Y. 등의 문헌[Chromatin methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3a/3L is guided by interaction of the ADD domain with the histone H3 tail. Nucleic Acids Research 38:4246 (2010)]).
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질(또는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA)은 각각이 상이한 제1, 제2, 제3, 및 제4 억제자 도메인에 연결된 DNA 결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 결합 단백질은 표적 핵산에 결합할 수 있지만 이를 절단하지는 않는 TALE이다. 일부 구현예에서, DNA 결합 단백질은 표적 핵산에 결합할 수 있지만 이를 절단하지는 않는 징크 핑거 단백질이다. 일부 구현예에서, DNA 결합 단백질은 표적 핵산에 결합할 수 있지만 이를 절단하지는 않는 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질이다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질(또는 억제자를 암호화하는 mRNA)은 촉매적으로 사멸한 CasX 서열, 제1 억제자 도메인(본원에서 “RD1”로서 지칭됨), 제2 도메인으로서의 DNMT3A 촉매 도메인(본원에서 “DNMT3A”로서 지칭됨), 제3 도메인으로서의 DNMT3L 상호작용 도메인(본원에서 “DNMT3L”로서 지칭됨), 및 제4 도메인으로서의 ATRX-DNMT3-DNMT3L 도메인(본원에서 “ADD”로서 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, ADD는 DNMT3A의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 제1 및 제2 NLS 및 본원에 기술된 하나 이상의 링커 펩티드를 포함하고, 융합 단백질은 표적 핵산에 결합하는 시스템의 gRNA와 RNP를 형성할 수 있다.
전술한 도메인이 억제자 융합 단백질 내에서 dCasX에 비해 선택 배향에 있도록 구성된 경우, 이들 도메인을 사용하면, 이들 도메인이 PCSK9 유전자의 정의된 영역에 상보적인 표적화 서열을 갖는 gRNA와 복합체를 형성할 때, PCSK9 표적 핵산의 현저한 후성적 변형을 초래한다는 것; 및 억제자 도메인의 조합이 동기적으로 작용하여, 표적화된 유전자의 전사 침묵화에 부가적 또는 상승적 영향(구성에 따라 다름)을 미친다는 것이 발견되었다. 전술한 것의 일 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 dCasX는 서열번호 4~29으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 제1 억제자 도메인(RD1)은 서열번호 128~1726으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 RD1은 서열번호 130~224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 제1 억제자 도메인(RD1)은 서열번호 130~138로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 RD1은 서열번호 135로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 RD1은 서열번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 제2 억제자 도메인은 서열번호 126의 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNMT3A이다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 제3 억제자 도메인은 서열번호 127의 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNMT3L이다. 전술한 것의 또 다른 구현예에서, 억제자 융합 단백질의 제4 억제자 도메인은 서열번호 125의 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 ADD이다. 놀라운 발견에서, RD1, DNMT3A, 및 DNMT3L을 포함하는 억제자 융합 단백질에 ADD를 첨가하면 ADD가 결여된 억제자 융합 단백질과 비교하여 표적 핵산의 장기 억제 및/또는 후성적 변형뿐만 아니라 억제의 특이성이 크게 향상되거나 증가하는 것으로 밝혀졌다. ADD를 포함하는 억제자 융합 단백질의 개선된 억제 및 특이성에 대한 예시적인 데이터는 실시예에 제시되어 있다. ADD를 포함하는 억제자 융합 단백질의 예시적인 구성은 도 2에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 4의 서열 또는 이와 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 dCasX에 작동 가능하게 연결된 제1, 제2, 제3, 및 제4 억제자 도메인을 포함하는 억제자 융합 단백질을 제공하며, 여기서 RD1은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모티프를 포함하거나: a) PX 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 EX 7 (서열 중 X1은 A, D, E, 또는 N이고, X2는 L 또는 V이고, X3은 I 또는 V이고, X4는 S, T, 또는 F이고, X5는 H, K, L, Q, R, 또는 W이고, X6은 L 또는 M이고, X7은 G, K, Q, 또는 R임); b) X1X2X3X4GX5X6X7X8X9 (서열 중 X1은 L 또는 V이고, X2는 A, G, L, T, 또는 V이고, X3은 A, F, 또는 S이고, X4는 L 또는 V이고, X5는 C, F, H, I, L, 또는 Y이고, X6은 A, C, P, Q, 또는 S이고, X7는 A, F, G, I, S, 또는 V이고, X8은 A, P, S, 또는 T이고, X9는 K 또는 R임); c) QX1X2LYRX3VMX4 (서열번호 1727) (서열 중 X1은 K 또는 R이고, X2는 A, D, E, G, N, S, 또는 T이고, X3은 D, E, 또는 S이고, X4는 L 또는 R임); d) X1X2X3FX4DVX5X6X7FX8X9X10X11 (서열번호 1728) (서열 중 X1은 A, L, P, 또는 S이고, X2는 L 또는 V이고, X3은 S 또는 T이고, X4는 A, E, G, K, 또는 R이고, X5는 A 또는 T이고, X6은 I 또는 V이고, X7은 D, E, N, 또는 Y이고, X8은 S 또는 T이고, X9는 E, P, Q, R, 또는 W이고, X10은 E 또는 N이고, X11은 E 또는 Q임); e) X1X2X3PX4X5X6X7X8X9X10 (서열 중 X1은 E, G, 또는 R이고, X2는 E 또는 K이고, X3은 A, D, 또는 E이고, X4는 C 또는 W이고, X5는 I, K, L, M, T, 또는 V이고, X6은 I, L, P, 또는 V이고, X7은 D, E, K, 또는 V이고, X8은 E, G, K, P, 또는 R이고, X9는 A, D, R, G, K, Q, 또는 V이고, X10은 D, E, G, I, L, R, S, 또는 V임); f) LYX1X2VMX3EX4X5X6X7X8X9X10 (서열번호 1729) (서열 중 X1은 K 또는 R이고, X2는 D 또는 E이고, X3은 L, Q, 또는 R이고, X4는 N 또는 T이고, X5는 F 또는 Y이고, X6은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고, X7은 H, L, 또는 N이고, X8은 L 또는 V이고, X9는 A, G, I, L, T, 또는 V이고, X10은 A, F, 또는 S임); g) FX1DVX2X3X4FX5X6X7EWX8 (서열번호 1730) (서열 중 X1은 A, E, G, K, 또는 R이고, X2는 A, S, 또는 T이고, X3은 I 또는 V이고, X4는 D, E, N, 또는 Y이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 E, L, P, Q, R, 또는 W이고, X7은 D 또는 E이고, X8은 A, E, G, Q, 또는 R임); h) X1PX2X3X4X5 X6LEX7X8X9X10X11X12 (서열 중 X1은 K 또는 R이고, X2는 A, D, E, 또는 N이고, X3은 I, L, M, 또는 V이고, X4는 I 또는 V이고, X5는 F, S, 또는 T이고, X6은 H, K, L, Q, R, 또는 W이고, X7은 K, Q, 또는 R이고, X8은 E, G, 또는 R이고, X9는 D, E, 또는 K이고, X10은 A, D, 또는 E이고, X11은 L 또는 P이고, X12는 C 또는 W임); 및 i) X1LX2X3X4QX5X6 (서열 중 X1은 C, H, L, Q, 또는 W이고, X2는 D, G, N, R, 또는 S이고, X3은 L, P, S, 또는 T이고, X4는 A, S, 또는 T이고, X5는 K 또는 R이고, X6은 A, D, E, K, N, S, 또는 T임); 제1 및 제2 모티프를 포함하되, 제1 아미노산 서열 모티프는 다음을 포함하고: a) LYX1X2VMX3EX4X5X6X7X8X9X10 (서열번호 1729) (서열 중 (i) X1은 K 또는 R이고, (ii) X2는 D 또는 E이고, (iii) X3은 L, Q, 또는 R이고, (iv) X4는 N 또는 T이고, (v) X5는 F 또는 Y이고, (vi) X6은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고, (vii) X7은 H, L, 또는 N이고, (viii) X8은 L 또는 V이고, (ix) X9는 A, G, I, L, T, 또는 V이고, (x) X10은 A, F, 또는 S임); b) 제2 아미노산 서열 모티프는 다음을 포함하거나: FX1DVX2X3X4FX5X6X7EWX8 (서열번호 1730) (서열 중 (i) X1은 A, E, G, K, 또는 R이고, (ii) X2는 A, S, 또는 T이고, (iii) X3은 I 또는 V이고, (iv) X4는 D, E, N, 또는 Y이고, (iv) X5는 S 또는 T이고, (v) X6은 E, L, P, Q, R, 또는 W이고, (vi) X7은 D 또는 E이고, (vii) X8은 A, E, G, Q, 또는 R임); 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함하고: a) DVAVYFSPEEWGCL (서열번호 2945); b) X1X2X3QX4X5LY (서열 중 (i) X1은 A, D, G, N, R, 또는 S이고, (ii) X2는 P, S, 또는 T이고, (iii) X3은 A, S, 또는 T이고, (iv) X4는 K 또는 R이고, (v) X5는 A, D, K, N, S, 또는 T임); c) X1KPX2X3X4X5X6 (서열 중 (i) X1은 A, P, 또는 S이고, (ii) X2는 A, D, 또는 E이고, (iii) X3은 L, M, 또는 V이고, (iv) X4는 I 또는 V이고, (v) X5는 F, S, 또는 T이고, (vi) X6은 H, K, L, Q, R, 또는 W임); d) LEX1X2X3X4X5X6 (서열 중 (i) X1은 E, K, Q, 또는 R이고, (ii) X2는 E, G, 또는 R이고, (iii) X3은 A, D, E, 또는 K이고, (iv) X4는 A, D, 또는 E이고, (v) X5는 L 또는 P이고, (vi) X6은 C 또는 W임); 및 e) X1VMLEX2YX3X4X5X6SX7X8X9 (서열번호 2946) (서열 중 (i) X1은 D 또는 E이고, (ii) X2는 N 또는 T이고, (iii) X3은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고, (iv) X4는 H 또는 N이고, (v) X5는 L, M, 또는 V이고, (vi) X6은 A, L, 또는 V이고, (vii) X7은 L 또는 V이고, (ix) X8은 A, G, 또는 V이고, (x) X9는 C, F, 또는 L임), 제2 억제자 도메인은 서열번호 126 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열 변이체의 서열을 포함하는 DNMT3A 서열이고, 제3 억제자는 서열번호 127 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열 변이체의 서열을 포함하는 DNMT3L이고, 제4 억제자는 서열번호 125 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열 변이체의 서열을 포함하는 ADD이고, 융합 단백질은 본원에 기술된 하나 이상의 링커 펩티드를 포함하고, 융합 단백질은 표적 핵산에 결합하는 시스템의 gRNA와 RNP를 형성할 수 있다. 전술한 것들의 일부 구현예에서, RD1은 서열번호 130~1726으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 제2 억제자 도메인은 서열번호 126 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열 변이체의 서열을 포함하는 DNMT3A 서열이고, 제3 억제자는 서열번호 127 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열 변이체의 서열을 포함하는 DNMT3L이고, 제4 억제자는 서열번호 125 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열 변이체의 서열을 포함하는 ADD이고, 융합 단백질은 본원에 기술된 하나 이상의 링커 펩티드를 포함하고, 융합 단백질은 표적 핵산에 결합하는 시스템의 gRNA와 RNP를 형성할 수 있다. 전술한 것들의 다른 구현예에서, 제1 RD1은 서열번호 130~224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것들의 다른 구현예에서, 제1 RD1은 서열번호 130~138로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것들의 다른 구현예에서, 제1 RD1은 서열번호 135의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것들의 다른 구현예에서, 제1 RD1은 서열번호 131의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 30~97로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 제1 및 제2 NLS, 및 표 5에 제시된 것과 같이 서열번호 98~124로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 하나 이상의 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 단락의 전술한 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 유전자 표적 핵산에 결합할 수 있는 시스템의 gRNA와 RNP 복합체를 형성할 수 있다.
당업자는, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 전술한 모티프를 포함하는 RD1 단백질도 RD1 도메인으로서 기능할 수 있고, 본 개시의 범위 내에 포함되는 것으로서 예상된다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 RD1, ADD, DNMT3A, DNMT3L, 및 DNA-결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 RD1, ADD, DNMT3A, DNMT3L, 및 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 RD1, ADD, DNMT3A, DNMT3L, 및 dCasX를 포함한다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 ADD, DNMT3A, DNMT3L, RD1, 및 DNA-결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 ADD, DNMT3A, DNMT3L, RD1, 및 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 ADD, DNMT3A, DNMT3L, RD1, 및 dCasX를 포함한다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L-dCasX-RD1-NLS, NLS-dCasX-RD1-NLS- ADD-DNMT3A-DNMT3L, NLS- dCasX- ADD-DNMT3A- DNMT3L- RD1-NLS), NLS-RD-ADD-DNMT3A-DNMT3L- dCasX-NLS, 또는 NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L-RD1-dCasX- NLS의 구성을 갖는다. 전술한 것들 중 어느 하나에서, 링커 펩티드는 ADD, DNMT3A, DNMT3L, RD1, 또는 dCasX 도메인 중 하나 이상의 사이에 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 구성 1(NLS-ADD-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커1-링커3A-dCasX-링커3B-RD1-NLS), 구성 2(NLS-링커3A-dCasX-링커3B-RD1-NLS-링커1-ADD-DNMT3A-링커2-DNMT3L), 구성 3(NLS-링커3A-dCasX-링커1-ADD-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커3B-RD1-NLS), 구성 4(NLS-RD1-링커3A-ADD-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커1-dCasX-링커3B-NLS), 또는 구성 5(NLS-ADD-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커3A-RD1-링커1-dCasX-링커3B-NLS)의 구성을 갖는다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 구성 1'(NLS-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커1-링커3A-dCasX-링커3B-RD1-NLS), 구성 2'(NLS-링커3A-dCasX-링커3B-RD1-NLS-링커1-DNMT3A-링커2-DNMT3L), 구성 3'(NLS-링커3A-dCasX-링커1-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커3B-RD1-NLS), 구성 4'(NLS-RD1-링커3A-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커1-dCasX-링커3B-NLS), 또는 구성 5'(NLS-DNMT3A-링커2-DNMT3L-링커3A-RD1-링커1-dCasX-링커3B-NLS)의 구성을 갖는다. 당업자는 구성 1'~5'이 ADD 도메인이 없는 구성 1~5에 상응한다는 것을 이해할 것이다. 시스템의 일부 구현예에서, 시스템의 융합 단백질 성분은 도 1 또는 도 2에 개략적으로 도시된 것과 같이 구성된다. 구성 1~5 또는 1'~5'의 전술한 구현예에서, NLS는 서열번호 30~97로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 링커 서열은 표 5에 제시된 바와 같이 서열번호 98~124로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 서열번호 120~123으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 링커 1은 서열번호 123의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 2는 서열번호 122의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 3A 및/또는 링커 3B는 서열번호 120의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 4는 서열번호 121의 서열을 포함한다.
| 아미노산 서열* | 서열번호 |
| (G)n | 98 |
| (GS)n | 99 |
| (GSGGS)n | 100 |
| (GGSGGS)n | 101 |
| (GGGS)n | 102 |
| GGSG | 103 |
| GGSGG | 104 |
| GSGSG | 105 |
| GSGGG | 106 |
| GGGSG | 107 |
| GSSSG | 108 |
| GPGP | 109 |
| PPAPPA | 110 |
| PPPG | 111 |
| PPPGPPP | 112 |
| PPP(GGGS)n | 113 |
| (GGGS)nPPP | 114 |
| AEAAAKEAAAKEAAAKA | 115 |
| VPPPGGGSGGGSGGGS | 116 |
| TGGGPGGGAAAGSGS | 117 |
| GGGSGGGSGGGSPPP | 118 |
| TPPKTKRKVEFE | 119 |
| GGSGGGS | 120 |
| GSGSGGG | 121 |
| SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH | 122 |
| GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE | 123 |
| GGSGGG | 124 |
| * n은 1 내지 5임 | |
억제자 융합 단백질 및 이를 포함하는 시스템의 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 DNA 결합 단백질, 전술한 것과 같은 구성 1, 구성 2, 구성 3, 구성 4, 구성 5, 구성 1', 구성 2', 구성 3', 구성 4', 및 구성 5'으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성으로서 구성된 제1, 제2, 제3, 및 제4 억제자 도메인을 포함하며, 억제자 융합 단백질 및 PCSK9 표적 핵산에 상보적인 표적화 서열을 가진 gRNA로 이루어진 RNP가 세포 내에서 결합한 후, 표적 핵산은 후성적으로 변형되고 PCSK9 유전자의 전사가 억제된다. 일부 구현예에서, PCSK9 유전자의 전사는, 세포 기반 검정을 포함하는 시험관 내 검정에서 검정했을 때, 미치료 세포 또는 비표적화 서열을 포함하는 비슷한 시스템으로 치료한 세포와 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 99%만큼 억제된다. 가장 바람직하게는, PCSK9 유전자 억제는 유전자 산물이 검출되지 않도록 유전자 발현을 완전히 억제하는 것이다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에 의해 표적화된 세포 집단의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 그 이상의 PCSK9 유전자의 전사가 억제된다.
일부 구현예에서, PCSK9 유전자의 전사 억제는, 세포 기반 검정을 포함하여 시험관 내 검정에서 검정할 때, 적어도 약 8시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 7일, 적어도 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 조성물이 치료적 유효 투여량으로서 투여될 때, 대상체의 표적화된 세포에서 PCSK9 유전자의 전사 억제는 적어도 약 7일, 적어도 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월 동안 지속되며, 여기서 대상체는 마우스, 랫트, 돼지, 비-인간 영장류, 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 억제자 융합 단백질 구성 4 및 5 또는 4' 및 5'이 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에서 사용될 때, 이들 구성은 구성 1과 비교하여 시험관 내 검정에서 더 적은 표적 외 메틸화 또는 표적 외 활성을 초래한다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질 구성 4 및 5 또는 4' 또는 5'이 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에서 사용될 때, 이들 구성의 사용은 세포에서 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 0.5% 미만, 또는 0.1% 미만의 표적 외 메틸화 또는 표적 외 활성을 초래한다.
a.
LTRP 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 DNA 결합 단백질(예: dCasX) 및 연결된 억제자 도메인 융합 단백질(억제자 융합 단백질)을 암호화하는 서열을 포함하는 전령 RNA(mRNA) 조성물에 관한 것이다. mRNA 조성물은 본 개시의 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템, 및 특정 전달 제형, 예를 들어 지질 나노입자(LNP)와 같은 입자에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 변형되지 않은 mRNA에 의해 암호화된 억제자 융합 단백질에 비해 억제자 융합 단백질의 발현 개선, 면역원성 감소, 안정성 증가, 및 제조 가능성 향상 중 하나 이상을 초래하도록 설계되었다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 유전성 억제를 초래하도록 설계되며, 여기서 PCKS9 유전자의 억제는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 이상의 세포 분열 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 PCSK9 유전자의 전사 억제를 초래하며, 전사 억제는 시험관 내 검정에서 검정할 때, 적어도 약 8시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 7일, 적어도 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월 동안 지속된다. 본 개시는 또한, 조성물을 설계하는 데 사용되는 방법, 및 조성물을 전달하기 위한 제형을 제공한다.
mRNA 서열에 대한 변형은 mRNA 안정성, 단백질 번역 및 발현 수준, 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있으므로, mRNA 기반 전달의 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 관심 단백질을 암호화하는 mRNA를 전달할 때, mRNA로 전사되는 DNA 템플릿과 대조적으로, 코딩 서열 및 비번역 영역(UTR)의 최적화하는 것이 특히 중요할 수 있다. DNA 템플릿은 수명이 길고, 복제할 수 있고, 생애 동안 많은 RNA 전사체를 생산할 수 있다. DNA 템플릿의 경우, 전사 효율 및 전구-mRNA 처리가 단백질 발현 수준의 주요 결정인자이다. 대조적으로, mRNA는 일반적으로 수 시간 정도의 훨씬 짧은 반감기를 갖는데, 이는 mRNA가 세포질에서 분해에 취약하고, 스스로 더 많은 카피를 생산할 수 없기 때문이다. 이와 같이, mRNA 안정성 및 번역 효율은 mRNA 기반 전달을 위한 단백질 발현 수준의 결정인자이므로, mRNA 안정성 및 번역 효율을 좌우하는 UTR 및 코딩 서열의 특정 서열을 향상시켜 mRNA 기반 전달의 효능을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 내에 dCasX 515(서열번호 6) 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 통합하기 위해 이를 암호화하는 mRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 내에 dCasX 812(서열번호 29) 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 통합하기 위해 이를 암호화하는 mRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 내에 dCasX 491(서열번호 4) 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 통합하기 위해 이를 암호화하는 mRNA 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 내에 dCasX 676(서열번호 28) 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 통합하기 위해 이를 암호화하는 mRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 3122의 서열을 포함하는 dCasX 491을 포함하는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 제공한다.
다양한 자연 발생 또는 변형된 뉴클레오시드가 본 개시에 따른 mRNA를 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예: 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예: 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오드우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피린-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 슈도우리딘(예: N-1-메틸-슈도우리딘), 2-티오우리딘, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예를 들어, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예: 2′-플루오로리보오스, 리보오스, 2′-데옥시리보오스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형된 인산염 기(예: 포스포로티오에이트 및 5′-N-포스포라미다이트 연결)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 비표준 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어 5-메틸-시티딘(“5 mC”), 슈도우리딘(“ψU”), 및/또는 2-티오-우리딘(“2sU”)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 mRNA의 우리딘 잔기 중 하나 이상은 N1-메틸-슈도우리딘으로 치환된다. 이러한 잔기 및 이러한 잔기를 mRNA 내에 통합하는 것에 대한 논의에 대해서는 예를 들어 미국 특허 제8,278,036호 또는 WO2011012316을 참조한다. 일부 구현예에서, CasX 515를 암호화하는 mRNA는 서열에서 하나 이상의 또는 모든 우리딘을 치환하는 N1-메틸-슈도우리딘 뉴클레오시드를 갖는다. 일부 구현예에서, CasX 812를 암호화하는 mRNA는 서열에서 하나 이상의 또는 모든 우리딘을 치환하는 N1-메틸-슈도우리딘 뉴클레오시드를 갖는다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 서열은 5' UTR 및 3' UTR 서열을 포함한다. 당업자는 적절한 UTR 서열을 선택할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 서열번호 3189, 3205~3209, 또는 3278의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 서열번호 3200~3204 또는 3274의 서열을 포함한다.
V.
시스템의 가이드 핵산
또 다른 양태에서, 본 개시는 PCSK9 유전자의 표적 핵산 서열에 상보적인 (따라서 이와 혼성화될 수 있는) 스캐폴드 및 연결된 표적화 서열을 포함하고, 진핵 세포에서 PCSK9 표적 핵산의 전사를 억제하는 데 유용한 가이드 리보핵산(gRNA)에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “gRNA”는 자연 발생 분자 및 gRNA 변이체를 포괄하며, gRNA 변이체에는 상이한 gRNA로부터의 도메인을 포함하는 키메라 gRNA 변이체가 포함된다. 본 개시의 gRNA는 세포의 표적 핵산에 상보적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 dCasX 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 하나 이상의 gRNA를 포함하는 시스템을 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템으로서 제공하며, 상기 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템은 형질감염된 세포에서 발현된 dCasX 단백질이 gRNA와 리보핵산단백질(RNP) 복합체를 형성하도록 설계된다. RNP는 전사 억제를 위해 세포의 표적 핵산 서열 내의 특정 위치를 표적화하고 이에 결합한다. gRNA는 표적 핵산의 서열의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적화 서열(또는 “스페이서”)을 포함함으로써 RNP 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 시스템의 억제자 융합 단백질은 표적 서열의 결합 및 억제와 같은 부위 특이적 활성을 제공하고, RNP에서 gRNA와 결합함으로써 표적 핵산 서열 내의 표적 부위로 안내된다(예를 들어, 표적 부위에서 안정화됨).
PCSK9 표적 핵산의 억제 및/또는 후성적 변형에 사용하기 위한 gRNA 및 mRNA와 gRNA의 제형에 대한 구현예가 아래에 기술되어 있다.
a.
기준 gRNA 및 gRNA 변이체
본원에서 사용되는 바와 같이, “기준 gRNA”는 자연 발생 gRNA의 야생형 서열을 포함하는 CRISPR 가이드 리보핵산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 gRNA 스캐폴드는 하나 이상의 돌연변이 유발 방법, 예컨대 참조로서 본원에 통합된 WO2022120095A1 and WO2020247882A1에 기술된 돌연변이 유발 방법을 거쳐, 변형된 gRNA 스캐폴드에 비해 향상된 또는 다양한 특성을 갖는 하나 이상의 gRNA 변이체를 생성할 수 있으며, 여기에는 심층 돌연변이 진화(DME), 심층 돌연변이 스캐닝(DMS), 오류 유발 PCR, 카세트 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발, 시차를 둔 연장 PCR, 유전자 셔플링, 도메인 스와핑, 또는 화학적 변형이 포함될 수 있다. gRNA 변이체가 유래된 gRNA 스캐폴드의 활성을 gRNA 변이체의 활성을 비교하는 벤치마크로서 사용하여 gRNA 스캐폴드의 기능 또는 다른 특성에 있어서의 개선을 측정할 수 있다.
표 6은 기준 gRNA tracr의 서열 및 스캐폴드 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는, gRNA가 표 6의 서열번호 1731~1743 중 어느 하나의 기준 gRNA 서열에 비해 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 갖는 서열을 포함하는 스캐폴드를 갖는, gRNA 서열을 제공한다.
| 서열번호 | 뉴클레오티드 서열 |
| 1731 | ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAACCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG |
| 1732 | UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG |
| 1733 | ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA |
| 1734 | ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG |
| 1735 | UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA |
| 1736 | UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGG |
| 1737 | GUUUACACACUCCCUCUCAUAGGGU |
| 1738 | GUUUACACACUCCCUCUCAUGAGGU |
| 1739 | UUUUACAUACCCCCUCUCAUGGGAU |
| 1740 | GUUUACACACUCCCUCUCAUGGGGG |
| 1741 | CCAGCGACUAUGUCGUAUGG |
| 1742 | GCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGC |
| 1743 | GGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGA |
b.
gRNA 도메인 및 이의 기능
본 개시의 gRNA는 다음 2개의 분절을 포함한다: 표적화 서열; 및 단백질 결합 분절. gRNA의 표적화 분절은 표적 핵산 서열(예를 들어 이중 가닥 표적 DNA, 표적 ssRNA, 표적 ssDNA 등의 가닥) 내의 특이적 서열(표적 부위)에 상보적인 (따라서 이와 혼성화되는) 뉴클레오티드 서열(스페이서, 표적화 인자, 또는 표적화 서열로서 상호 교환적으로 지칭됨)을 포함하며, 이에 대해서는 보다 상세하게 후술된다. gRNA의 표적화 서열은, 본 개시의 맥락에서 코딩 서열, 코딩 서열의 보체, 비코딩 서열, 및 액세서리 요소를 포함하는 표적 핵산 서열에 결합할 수 있다. gRNA의 단백질 결합 분절(또는 “활성화 요소” 또는 “단백질 결합 서열”)은 복합체로서 CasX 단백질과 상호작용하여(예를 들어 이에 결합하여) RNP를 형성한다(보다 상세하게 후술됨). 본원에서 사용되는 바와 같이, “스캐폴드”는 표적화 서열을 제외한, 여러 영역으로 이루어진 가이드의 모든 부분을 지칭하며, 이에 대해서는 보다 상세하게 후술한다. CasX gRNA(야생형 및 이의 변이체 둘 다)의 특성 및 특징은 본원에 참조로서 통합된 WO2020247882A1, US20220220508A1, 및 WO2022120095A1에 기술되어 있다.
기준 gRNA의 경우, gRNA는 이중 가이드 RNA(dgRNA)로서 자연 발생하며, 여기서 표적화 인자 및 활성화 인자 부분은 이중체 형성 분절을 각각 갖고, 이들 인자는 서로에 대해 상보성을 갖고 서로 혼성화되어 이중 가닥 이중체(gRNA의 경우 dsRNA 이중체)를 형성한다. 용어 “표적화 인자(targeter)” 또는 “표적화 인자 RNA”는 CasX 이중 가이드 RNA의 (및, “활성화 인자” 및 “표적화 인자”가 예를 들어 개재 뉴클레오티드에 의해 함께 연결되는 경우, CasX 단일 가이드 RNA의) crRNA-유사 분자(crRNA:“CRISPR RNA”)를 지칭하도록 본원에서 사용된다. crRNA는 tracrRNA로 어닐링된 다음 표적화 서열의 뉴클레오티드로 어닐링되는 5' 영역을 갖는다. 본 개시의 시스템에 사용하기 위한 gRNA의 경우, 스캐폴드는 활성화 인자 및 표적화 인자 부분이 (서로 혼성화되기보다는) 서로 공유 연결되고 단일 분자를 포함하도록 설계되며, 이는 “단일 분자 gRNA”, “단일 가이드 RNA”, “단일 분자 가이드 RNA”, “단 분자 가이드 RNA”, 또는 “sgRNA”로서 지칭될 수 있다. 시스템에 사용하기 위한 본 개시의 gRNA 변이체는 모두 단일 분자 버전이다.
종합적으로, 본 개시의 조립된 gRNA는 다음의 구별되는 구조화된 영역, 또는 도메인을 포함한다: RNA 삼중체, 스캐폴드 줄기 루프, 연장된 줄기 루브, 유사매듭, 및 본 개시의 구현예에서 표적 핵산에 특이적이고 gRNA의 3' 단부에 위치하는 표적화 서열. RNA 삼중체, 스캐폴드 줄기 루프, 유사매듭, 및 연장된 줄기 루프는, 해당 삼중체의 부분을 함께 가교하는 비구조화 삼중체 루프와 함께, gRNA의 “스캐폴드”로서 지칭된다. 일부 경우에, 스캐폴드 줄기는 버블을 추가로 포함한다. 다른 경우에, 스캐폴드는 삼중체 루프 영역을 추가로 포함한다. 또 다른 경우에, 스캐폴드는 5' 구조화되지 않은 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에 사용하기 위한 본 개시의 gRNA 스캐폴드는 CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG(서열번호 1822)의 서열 또는 이와 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 불일치를 갖는 서열을 갖는 스캐폴드 줄기 루프를 포함한다.
구조화된 도메인 각각은 가이드의 전체적인 RNA 접힘을 확립하고 가이드의 기능, 특히 dCasX 단백질과 적절히 복합체를 형성하는 능력을 유지하는 데 중요하다. 예를 들어, 가이드 스캐폴드 줄기는 dCasX 단백질의 나선형 I 도메인과 상호작용하는 한편, 삼중체, 삼중체 루프, 및 유사매듭 줄기 내의 잔기는 dCasX 단백질의 OBD와 상호작용한다. 종합하자면, 이러한 상호작용들은 가이드가 dCasX에 결합하여 이와 함께 안정성을 유지하는 RNP를 형성하는 능력을 부여하는 한 편, 스페이서(또는 표적화 서열)는 DNA의 특정 서열에 결합하기 위한 RNP의 특이성을 유도하고 이를 정의한다.
dCasX 단백질에 의한 표적 핵산 서열(예를 들어 게놈 DNA)의 부위 특이적 결합은 gRNA의 표적화 서열과 표적 핵산 서열 사이의 염기쌍 상보성에 의해 결정된 하나 이상의 위치(예를 들어 표적 핵산의 서열)에서 발생할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 개시의 gRNA는 ATC, CTC, GTC, 또는 TTC와 같은 TC 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 모티프 또는 PAM 서열에 상보적인 서열에 인접한 표적 핵산에 대해 서열 상보성을 갖고, 따라서 이와 혼성화될 수 있다. 가이드 서열의 표적화 서열이 표적 핵산 서열의 서열과 혼성화되기 때문에, PAM 서열의 위치가 고려되는 한, 표적화 서열은 특정 표적 핵산 서열과 혼성화되도록 사용자에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열의 설계를 위해, 표적 핵산은 표적화 서열의 5'에 위치한 PAM 서열을 포함하며, PAM은 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 표적화 서열에 상보적인 표적 핵산의 제1 뉴클레오티드로부터 분리된다. 일부 구현예에서, PAM은 표적 영역의 표적화되지 않은 가닥, 즉 표적 핵산에 상보적인 가닥 상에 위치한다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적화 서열은 ATC PAM 서열로부터 하나의 뉴클레오티드만큼 이격된 표적 핵산 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적화 서열은 CTC PAM 서열로부터 하나의 뉴클레오티드만큼 이격된 표적 핵산 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적화 서열은 GTC PAM 서열로부터 하나의 뉴클레오티드만큼 이격된 표적 핵산 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적화 서열은 TTC PAM 서열로부터 하나의 뉴클레오티드만큼 이격된 표적 핵산 서열에 상보적이다. gRNA의 표적화 서열을 선택함으로써, 표적 핵산 서열 또는 표적 핵산 내의 특정 위치를 브라케팅(bracketing)하는 서열의 정의된 영역은 본원에 기술된 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템을 사용하여 억제될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적화 서열은 15 내지 20개의 연속 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 15, 16, 17, 18, 19, 및 20개의 연속 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 20개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 19개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 18개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 17개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 16개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 15개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진다. gRNA의 표적화 서열을 선택함으로써, 표적 핵산 서열의 정의된 영역은 본원에 기술된 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템을 사용하여 억제 및/또는 후성적으로 변형될 수 있다.
본 개시의 유전자 억제 시스템은 PCSK9 유전자의 임의의 영역 또는 이에 근접한 영역, 또는 전사를 억제하기 위한 PCSK9 유전자의 영역을 표적화하도록 설계될 수 있다. 유전자 전체를 억제할 때, 전사 시작 부위(TSS)를 포함하거나 이에 근접한 서열에 상보적인 표적화 서열을 갖는 가이드를 설계하는 것이 본 개시에 의해 고려된다. TSS 선택은 프로모터 서열 및 개시 기질 농도에 따라 프로모터 영역 내의 상이한 위치에서 발생한다. 코어 프로모터는 전사 기계를 위한 결합 플랫폼의 역할을 하고, Pol II 및 이의 연관된 일반 전사 인자(GTF)를 포함한다(Haberle, V. 등의 문헌[Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation (Nat Rev Mol Cell Biol. 19(10):621 (2018)]). TSS 선택에 있어서의 가변성으로 인해 DNA ‘스크런칭' 및 ‘반-스크런칭'을 포함시킬 것이 제안되었는데, 이의 특징은 (i) RNA 중합효소 선단 에지를 DNA에 대해 정방향 및 역방향으로 이동시키되, 후단 에지는 이동시키지 않음, 및 (ii) 전사 버블의 팽창 및 수축이다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자 내 전사 시작 부위(TSS)의 1 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 TSS로부터 상류 20 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 500 bps, 1 kb, 또는 1.5 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 TSS로부터 하류 20 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 500 bp, 1 kb, 또는 1.5 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 TSS로부터 상류 1.5 kb 내지 하류 1.5 kb 이내, 상류 500 bps 내지 하류 500 bp 이내, 상류 300 bps 내지 하류 300 bp 이내, 또는 상류 100 bps 내지 하류 100 bp 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 인핸서로부터 20 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 500 bps, 1 kb, 또는 1.5 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 5' 비번역 영역으로부터 3' 방향으로 1 kb 이내에 있다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은, 인트론(존재하는 경우)을 포함하여, PCSK9 유전자의 개방 해독 프레임 내에 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 엑손에 특이적이도록 설계된다. 특정 구현예에서, 본 개시의 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 엑손 1에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 인트론에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 인트론-엑손 접합부에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 조절 요소에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 유전자간 영역의 서열에 상보적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 엑손, 인트론, 및/또는 조절 요소의 접합부에 특이적이다. 표적화 서열이 조절 요소에 특이적인 이들 경우에, 이러한 조절 요소는 프로모터 영역, 인핸서 영역, 유전자간 영역, 5' 비번역 영역(5' UTR), 3' 비번역 영역(3' UTR), 보존된 요소, 및 cis-조절 요소를 포함하는 영역을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 프로모터 영역은 암호화 서열의 개시점의 5 kb 이내에 있는 뉴클레오티드를 포함하도록 의도되거나, 유전자 인핸서 요소 또는 보존된 요소의 경우, PCSK9 유전자의 암호화 서열로부터 수천 bp, 수십만 bp, 또는 심지어 수백만 bp 떨어져 있을 수 있다. 전술한 바와 같이, 표적은, PCSK9 유전자 산물이 세포에서 발현되지 않거나 더 낮은 수준으로 발현되도록 표적의 암호화 PCSK9 유전자가 억제되도록 의도되는 것들이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 시스템의 RNP가 표적 핵산의 결합 위치에 결합한 후, 상기 시스템은 RNP의 결합 위치에 대해 5'에 있는 PCSK9 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 RNP가 표적 핵산의 결합 위치에 결합한 후, 상기 시스템은 RNP의 결합 위치에 대해 3'에 있는 PCSK9 유전자의 전사를 억제할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 핵산은 표적화 서열의 5'에 위치한 PAM 서열을 포함하며, PAM은 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 표적화 서열의 제1 뉴클레오티드로부터 분리된다. 일부 구현예에서, PAM은 표적 영역의 표적화되지 않은 가닥, 즉 표적 핵산에 상보적인 가닥 상에 위치한다. 야생형 PCSK9 핵산에 대한 표적화 서열의 대표적인이지만 비제한적인 예는 서열번호 1824~2944로서 제시되고, 아래에 표 7로서 표시되어 있는데, 이는 본 개시의 gRNA 스캐폴드; 예를 들어 gRNA 174, 235, 316, 또는 이의 화학적으로 변형된 버전에 연결하기 위한 PCSK9 표적 핵산에 대한 표적화 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 TTC이다. 일부 구현예에서, TTC PAM에 대한 표적화 서열은 서열번호 1824~2944, 또는 서열번호 1824~2944와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TTC PAM에 대한 표적화 서열은 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에 사용하기 위한 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~2545로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에 사용하기 위한 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1834로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 2009로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 2341로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1841로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1842로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1844로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1845로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 2672로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1884로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1851로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1849로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1852로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1853으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1855로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1856으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1857로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1858로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1859로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1860으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1862로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1863으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1867로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1869로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1870으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1872로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1875로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 1830으로 이루어진다. 전술한 것 중 어느 하나에서, 표적화 서열의 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드가 표적화 서열의 3' 단부로부터 제거될 수 있다.
| 서열번호 | PAM 서열 |
| 1824-2944 | TTC |
| 서열번호 | PAM 서열 |
| 1824-1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714 | TTC |
c.
gRNA 변형
또 다른 양태에서, 본 개시는 gRNA가 유래된 기준 gRNA에 비해 변형을 포함하는 gRNA(본원에서는 gRNA 변이체로서 지칭되기도 함)에 관한 것이다. gRNA는 본 개시의 시스템에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 변이체는 기준 gRNA 서열에 비해, 기준 gRNA의 특성을 개선하는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실, 또는 스와핑되거나 치환된 도메인을 포함한다. 변형을 위한 예시적인 영역 및 스와핑된 영역 또는 도메인은 RNA 삼중체, 유사매듭(pseudoknot), 스캐폴드 줄기 루프, 및 연장된 줄기 루프를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA 변이체는 상이한 gRNA로부터의 적어도 제1 스와핑된 영역을 포함함으로써, 키메라 gRNA를 생성한다. 이러한 키메라 gRNA의 대표적인 예는 gRNA 스캐폴드 235의 연장된 줄기 루프가 gRNA 스캐폴드 174의 연장된 줄기 루프로 치환된 가이드 316(서열번호 1746)이며, 여기서 생성된 316 변이체는 억제자 융합 단백질과 함께 RNP를 형성하는 능력을 보유하고, 유사한 조건 하에서 시험관 내 또는 생체 내 검정에서 평가했을 때, 부모 235와 비교하여 개선된 특성을 나타낸다.
gRNA 스캐폴드 변이체를 해당 변이체가 유래된 gRNA 스캐폴드와 비교할 때, 억제자 융합 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 리보핵단백질 홀로 RNP 복합체를 표적 핵산에 안내할 수 있는 기능적 특성을 유지하면서 하나 이상의 개선된 기능, 특성을 갖거나 하나 이상의 새로운 기능을 추가하는 모든 gRNA가 본 개시의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, gRNA는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 개선된 특징을 갖는다: 유사매듭 줄기 안정성 증가, 삼중체 영역 안정성 증가, 스캐폴드 줄기 안정성 증가, 줄기 안정성 연장, 표적 외 접힘 중간체 감소, 억제자 융합 단백질에 대한 결합 친화도 증가, 및 억제자 융합 단백질과 복합체를 형성할 때 억제 활성 증가, 또는 이들의 임의의 조합. 전술한 것 중 일부 경우에, 개선된 특징은 실시예의 검정을 포함하여, 시험관 내 검정에서 평가된다. 전술한 것 중 다른 경우에, 개선된 특징은 생체 내에서 평가된다.
표 9는 gRNA를 생성하기 위한 예시적인 gRNA 변이체 스캐폴드 서열을 제공한다. gRNA는 본 개시의 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 변이체 스캐폴드는 표 9에 열거된 서열 중 어느 하나, 또는 이와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 gRNA 변이체는 본 개시의 dCasX와 RNP를 형성하는 능력을 보유한다. 다른 구현예에서, gRNA 변이체 스캐폴드는 표 9에 열거된 서열 중 어느 하나를 포함하며, 여기서 gRNA 변이체는 본 개시의 억제자 융합 단백질과 RNP를 형성하는 능력을 보유한다. 벡터가 gRNA에 대한 DNA 암호화 서열을 포함하는 이들 구현예에서, 티민(T) 염기가 본원에 기술된 gRNA 서열 구현예 중 어느 하나의 우라실(U) 염기로 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 화학적으로 변형된 표 9의 gRNA 변이체를 제공하며, 이에 대해서는 후술한다.
| 서열번호 | 스캐폴드 변이체 ID | 뉴클레오티드 서열 |
| 1744 | 174 | ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAG |
| 1745 | 235 | ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAG |
| 1746 | 316 | ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAG |
본 개시의 gRNA에 사용하고, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에 사용하기 위해 고려되는 추가의 gRNA 스캐폴드 변이체는 서열번호 1747~1821로 이루어진 군으로부터 선택된다.
d.
gRNA 스캐폴드 316
가이드 스캐폴드는 재조합 합성 또는 고상 RNA 합성을 포함하여 여러 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 스캐폴드의 길이는 고상 RNA 합성을 사용할 때 제조 능력에 영향을 미칠 수 있는데, 길이가 길수록 제조 비용이 증가하고, 순도 및 수율이 감소하며, 및 합성 실패율이 증가한다. 지질 나노입자(LNP) 제형과 같은 입자 제형에 사용하기 위해서는, 상업적 개발에 필요한 양을 생성하기 위한 스캐폴드의 고상 RNA 합성이 바람직하다. 이전 실험들에서 gRNA 스캐폴드 235가 gRNA 스캐폴드 174에 비해 향상된 특성을 갖는 것으로 식별되었지만, 이를 LNP 제형에 사용하는 것은 이의 증가된 길이(뉴클레오티드 길이)로 인한 합성 제조 제약으로 인해 문제가 되었다. 따라서, 대안적인 서열을 구하였다. 일부 구현예에서, 본 개시는 gRNA 변이체 스캐폴드가 유래된 gRNA 스캐폴드와 비교해 개선된 제조 가능성을 갖는 gRNA 변이체 스캐폴드를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는, gRNA 스캐폴드 및 연결된 표적화 서열이 약 115개 뉴클레오티드 미만, 약 110개 뉴클레오티드 미만, 또는 약 100개 뉴클레오티드 미만인 서열을 갖는 gRNA를 제공한다.
일부 구현예에서, U11, U24, A29, 및 A87로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 스캐폴드 174(서열번호 1744) 서열을 변형시킨 gRNA 스캐폴드를 설계하였다. 일부 구현예에서, gRNA는, 서열번호 49739의 연장된 줄기 루프 서열을 포함하고 U11, U24, A29, 및 A87로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 서열번호 1744의 서열 또는 이와 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전술한 것의 일 구현예에서, 돌연변이는 U11C, U24C, A29C, 및 A87G로 이루어지며, 이들은 서열번호 1746의 서열을 생성한다.
또 다른 구현예에서, 스캐폴드 174의 연장된 줄기 루프가 235 스캐폴드의 연장된 줄기 루프로 치환되는 도메인 스와핑에 의해 스캐폴드 235 서열을 변형하여, 99개의 뉴클레오티드의 gRNA 스캐폴드 235와 비교해 89개의 뉴클레오티드를 갖는 키메라 gRNA 스캐폴드 316(서열번호 1746)을 생성하는, 316 gRNA 스캐폴드를 설계하였다. 생성된 316 스캐폴드는 연장된 줄기 루프가 CpG 모티프를 함유하지 않는다는 점에서 추가적인 이점을 가졌고; 면역 반응을 유도할 가능성을 감소시키는 향상된 특성을 가졌다. 일부 구현예에서, 316 스캐폴드의 더 짧은 서열 길이는 정확하고 완전한 서열로 가이드를 합성적으로 생성하는 능력뿐만 아니라 LNP에 성공적으로 통합되는 향상된 능력에 있어서 더 높은 충실도의 개선을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 화학적으로 변형된 gRNA 316 변이체를 제공하며, 이에 대해서는 후술한다.
e.
화학적으로 변형된 gRNA
일부 구현예에서, gRNA는 하나 이상의 화학적 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드에 2'O-메틸기를 첨가하는 것이다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 서열의 2개 이상의 뉴클레오시드 사이의 포스포로티오에이트 결합을 치환하는 것이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드의 5' 단부의 처음 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오시드(즉, gRNA 174, 235, 및 316의 경우 A, C, 및 U)는 2'O-메틸기의 첨가에 의해 변형되고, 변형된 뉴클레오시드 각각은 포스포로티오에이트 결합에 의해 인접한 뉴클레오시드에 연결된다. 유사하게, 스캐폴드의 3' 단부에 연결된 표적화 서열의 3' 단부의 마지막 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드는 유사하게 변형된다. 전술한 것들의 일부 구현예에서, 본 개시는 표 25에 제시된 것과 같은 서열번호 2948~2956, 2958~2966, 및 2968~2976의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 화학적 변형을 갖는 gRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 화학적 변형을 갖는 gRNA는 서열번호 2948~2956, 2958~2966, 및 2968~2976의 스캐폴드, 즉 서열 중에 미정의(undefined) 뉴클레오티드로서 표시된 스페이서가 없는 서열번호 2948~2956, 2958~2966, 및 2968~2976의 서열을 포함한다. 당업자는 전술한 것 중에서 20개의 3' 말단 미정의 서열이 비표적화 서열을 나타내고, PCSK9 유전자의 표적 핵산에 상보적인 임의의 적절한 표적화 서열; 예를 들어 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 서열로 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 서열번호 2968을 포함한다. gRNA 변이체 174, 235, 및 316의 개략적인 구조는 도 19a~19c에 각각 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 화학적 변형을 갖는 gRNA는 화학적 변형을 갖지 않는 gRNA와 비교해 개선된 안정성을 나타낸다.
f.
억제자 융합 단백질과 복합체 형성하기
표적 세포에서 시스템의 성분의 전달 또는 발현 후, gRNA 변이체는 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질과 RNP로서 복합체를 형성하여 PCSK9 유전자의 표적 핵산에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 변이체는 기준 gRNA 또는 기준 gRNA가 유래된 또 다른 gRNA 변이체와 비교했을 때 억제자 융합 단백질과 RNP 복합체를 형성하는 개선된 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 리보핵산단백질 복합체 형성이 개선되면 기능적 RNP가 조립되는 효율이 개선될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 변이체 및 이의 표적화 서열을 포함하는 RNP의 90% 초과, 93% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과는 표적 핵산의 유전자 억제에 적합하다.
VI.
폴리뉴클레오티드 및 벡터
또 다른 양태에서, 본 개시는 PCSK9 유전자의 억제 및 후성적 변형에 유용한 억제자 융합 단백질 및 (일부 구현예에서) gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시의 억제자 융합 단백질 또는 상기 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA는 당업계에 공지된 바와 같은 통상적인 방법을 사용하여 시험관 내 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들어 Applied Biosystems, Inc., Beckman 등에 의한 자동화된 합성기가 이용 가능하다. 합성기를 사용함으로써, 자연 발생 아미노산 또는 뉴클레오티드(경우에 따라)는 비천연 아미노산 또는 뉴클레오티드로 치환될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방식은 편의성, 경제성, 요구되는 순도 등에 의해 결정될 것이다. gRNA 또한 합성적으로, 예를 들어 당업계에 공지된 T7 RNA 중합효소 시스템을 사용함으로써 생산될 수 있다.
억제자 융합 단백질 및/또는 gRNA는 당업계에 공지된 표준 재조합 기술을 사용하여 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 억제자 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합적으로 생산하고, 숙주 세포에 적절한 발현 벡터내로 암호화 유전자를 통합함으로써 제조될 수도 있다. 암호화된 억제자 융합 단백질 및/또는 gRNA의 생산을 위해, 상기 방법은 암호화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및 생성된 억제자 또는 gRNA가 형질전환된 세포에서 발현되거나 전사되도록 하는 조건 또는 이를 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 생산된 암호화된 억제자 융합 단백질 및/또는 gRNA는 본원에 기술된 방법에 의해 또는 당업계에 공지된 표준 정제 방법에 의해 또는 실시예에 기술된 바와 같이 회수된다. 분자 생물학에서의 표준 재조합 기술이 본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터를 제조하는 데 사용된다.
본 개시의 억제자 융합 단백질 및/또는 gRNA는 통상적인 재조합 합성 방법에 따라 단리되고 정제될 수도 있다. 용해물은 발현 숙주로 제조될 수 있고, 용해물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 대부분의 경우, 사용되는 조성물은 생성물의 제조 방법 및 이의 정제와 관련된 오염물과 관련하여, 50 중량% 이상, 보다 일반적으로는 75 중량% 이상, 바람직하게는 95 중량% 이상, 및 치료 목적을 위해서는 일반적으로는 99.5 중량% 이상의 원하는 생성물을 포함할 것이다. 일반적으로, 백분율은 총 단백질을 기준으로 한다. 따라서, 일부 경우에, 본 개시의 억제자 융합 단백질 또는 gRNA는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 순수하다(예를 들어 오염물 또는 다른 거대분자 등이 없음).
또한, 본 개시는 본원에 기술된 억제자 융합 단백질 및, 일부 경우에, gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 경우에, 벡터는 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템의 CasX 및 gRNA 성분의 발현 및 회수에 사용된다. 다른 경우에, 벡터는 보다 상세하게 후술되는 바와 같이, 표적 핵산의 억제 및/또는 후성적 변형을 위해 암호화 폴리뉴클레오티드를 표적 세포에 전달하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질 및 gRNA를 암호화하는 서열은 동일한 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질 및 gRNA를 암호화하는 서열은 상이한 벡터 상의 서열에 의해 암호화된다. 적절한 벡터는, 예를 들어 본원에 참조로서 통합된 WO2022120095A1 및 WO2020247882A1에 기술되어 있다. WO2022120095A1 및 WO2020247882A1에 기술된 바와 같이, 사용된 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적절한 전사 및 번역 조절 요소 중 어느 하나가 발현 벡터에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는, 표 20에 제시된 것과 같은 서열번호 3131~3132의 억제자 융합 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질 또는 이와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 gRNA 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 1744~1746 및 2947~2976의 스캐폴드 서열, 또는 이와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 발현된 gRNA 변이체는 억제자 융합 단백질과 RNP를 형성하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 1824~2944의 표적화 서열, 또는 이와 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714의 표적화 서열, 또는 이와 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 억제자 융합 단백질 또는 gRNA 및 이들의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생산하는 방법뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 전사된 단백질 또는 RNA를 발현하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 방법은 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 억제자 융합 단백질 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생산하는 단계 및 암호화 유전자를 발현 벡터 내에 통합하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 PCSK9 표적 핵산의 억제 및/또는 후성적 변형을 위해 세포를 형질도입하도록 설계된다. 이러한 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 단순 포진 바이러스(HSV) 벡터, 플라스미드, 미니서클(minicircle), 나노플라스미드, DNA 벡터, 및 RNA 벡터를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 발현 벡터는 무세포 시스템에서 또는 숙주 세포에서 억제자 융합 단백질, 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA, 또는 gRNA를 생산하도록 설계된다. 숙주 세포에서 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 암호화된 억제자 융합 단백질 또는 gRNA를 생산하기 위해, 상기 방법은 암호화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및 형질전환된 세포에서 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 생성된 억제자 융합 단백질 또는 gRNA가 발현되거나 전사되도록 하는 조건 또는 이를 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하여 억제자 융합 단백질 또는 gRNA를 생산하는 단계를 포함하되, 생산된 억제자 융합 단백질 및/또는 gRNA는 본원에 (예를 들어 아래 실시예에) 기술된 방법에 의해 또는 당업계에 공지된 표준 정제 방법에 의해 회수된다. 분자 생물학에서의 표준 재조합 기술이 본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터를 제조하는 데 사용된다.
본 개시에 따르면, 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 억제자 융합 단백질 또는 gRNA를 암호화하는 핵산 서열은 적절한 숙주 세포에서의 발현을 유도하는 재조합 DNA 분자를 생성하는 데 사용된다. 여러 클로닝 전략이 본 개시를 수행하는 데 적합하며, 이들 중 다수는 본 개시의 조성물 또는 이의 보체에 대한 유전자 코딩을 포함하는 작제물을 생성하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 클로닝 전략은 조성물의 발현의 위해 숙주 세포를 형질전?l시키는 데 사용되는 억제자 융합 단백질 또는 gRNA를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 암호화하는 유전자를 생성하는 데 사용된다.
하나의 접근법에서, 억제자 융합 단백질 또는 gRNA를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 작제물이 먼저 제조된다. 이러한 작제물의 제조를 위한 예시적인 방법은 실시예에 기술되어 있다. 그런 다음, 작제물은 억제자 융합 단백질, 또는 gRNA의 경우에 단백질 작제물의 발현 및 회수를 위해 원핵 또는 진핵 숙주 세포와 같은 숙주 세포를 형질전환시키는 데 적합한 발현 벡터를 생성하는 데 사용된다. 원하는 경우, 숙주 세포는 대장균이다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 진핵 숙주 세포는 다음으로부터 선택될 수 있다: 새끼 햄스터 신장 섬유아세포(BHK), 인간 배아 신장 293(HEK293), 인간 배아 신장 293T(HEK293T), NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포, 하이브리도마 세포, NIH3T3 세포, SV40 유전 물질을 기원으로 하는 CV-1(유인원)(COS), HeLa, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), 효모 세포, 또는 재조합 산물의 생산에 적합한 당업계에 공지된 다른 진핵 세포. 발현 벡터의 생성, 숙주 세포의 형질전환, 및 억제자 융합 단배길 또는 gRNA의 발현 및 회수를 위한 예시적인 방법은 실시예에 기술되어 있다.
억제자 융합 단백질 또는 gRNA 작제물을 암호화하는 유전자는, 본 실시예에 보다 상세히 기술된 방법을 포함하여, 제한 효소 매개 클로닝, PCR 및 중첩 연장과 같은 효소 프로세스와 조합된 합성에 의한 하나 이상의 단계, 또는 완전히 합성되는 하나 이상의 단계에서 제조될 수 있다. 본원에 개시된 방법은, 예를 들어 다양한 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 원하는 서열의 유전자로 결찰시키는 데 사용될 수 있다. 폴리펩티드 조성물을 암호화하는 유전자는 유전자 합성의 표준 기술을 사용하여 올리고뉴클레오티드로부터 조립된다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 이러한 유형의 최적화는, 동일한 단백질을 암호화하면서 의도된 숙주 유기체 또는 세포의 코돈 선호도를 모방하기 위한 암호화 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 수반할 수 있다. 따라서, 코돈은 변경될 수 있지만, 암호화된 단백질은 변하지 않는다. 예를 들어, 억제자 융합 단백질의 의도된 표적 세포가 인간 세포인 경우, 인간 코돈 최적화된 억제자 융합 단백질-암호화 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 의도된 숙주 세포가 마우스 세포인 경우, 마우스 코돈 최적화된 억제자 융합 단백질-암호화 뉴클레오티드 서열이 생성될 수 있다. 유전자 설계는 코돈 사용 및 억제자 융합 단백질 또는 gRNA의 생산에 사용되는 숙주 세포에 적합한 아미노산 조성을 최적화하는 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시의 하나의 방법에서, 전술한 바와 같이, 작제물의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리가 생성되고 이어서 조립이 수행된다. 그런 다음, 본원에 기술된 바와 같이, 생성된 유전자를 조립하고, 조립된 유전자를 사용해 숙주 세포를 형질전환시키고, 억제자 융합 단백질 또는 gRNA 조성물을 생산하고 회수하여 억제자 융합 단백질 또는 gRNA 조성물의 특성을 평가하거나, PCSK9 표적 핵산을 변형시키는 데 사용한다.
일부 구현예에서, gRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 조절 요소, 예를 들어 프로모터와 같은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 조절 요소, 예를 들어 프로모터와 같은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 조절 가능한 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 세포 유형 특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 전사 조절 요소(예를 들어 프로모터)는 표적화된 세포 유형 또는 표적화된 세포 집단에서 기능한다. 예를 들어, 일부 경우에, 전사 조절 요소는 진핵 세포, 예를 들어 간세포 또는 간 동양 내피 세포에서 기능성일 수 있다.
본 개시의 억제자 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 Pol II 프로모터의 비제한적인 예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: EF-1알파, EF-1알파 코어 프로모터, Jens Tornoe(JeT), 거대세포바이러스(CMV) 유래 프로모터, CMV 초기(CMVIE), CMV 인핸서, 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제, 초기 및 후기 원숭이 바이러스 40(SV40), SV40 인핸서, 레트로바이러스의 긴 말단 반복(LTR), 마우스 메탈로티오네인-I, 아데노바이러스 메이저 후기 프로모터(Ad MLP), CMV 프로모터 전장 프로모터, 최소 CMV 프로모터, 닭 β-액틴 프로모터(CBA), CBA 하이브리드(CBh), 거대세포바이러스 인핸서(CB7)를 갖는 닭 β-액틴 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터 및 토끼 베타-글로빈 스플라이스 수용체 부위 융합(CAG), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, HIV-Ltr 프로모터, hPGK 프로모터, HSV TK 프로모터, 7SK 프로모터, 미니-TK 프로모터, 뉴런-특이적 발현을 부여하는 인간 시냅신 I(SYN) 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 슈퍼 코어 프로모터 1(SCP1), 뉴런에서의 선택적 발현을 위한 Mecp2 프로모터, 최소 IL-2 프로모터, 라우스 육종 바이러스 인핸서/프로모터(단일), 비장 초점 형성 바이러스 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, TBG 프로모터, 인간 티록신-결합 글로불린 유전자 유래의 프로모터(간 특이적), PGK 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), UCOE 프로모터(HNRPA2B1-CBX3의 프로모터), 합성 CAG 프로모터, 히스톤 H2 프로모터, 히스톤 H3 프로모터, U1a1 소핵 RNA 프로모터(226 nt), U1a1 소핵 RNA 프로모터(226 nt), U1b2 소핵 RNA 프로모터(246 nt) 26, GUSB 프로모터, CBh 프로모터, 로돕신(Rho) 프로모터, 침묵화-유발 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) 프로모터, 인간 H1 프로모터(H1), POL1 프로모터, TTR 최소 인핸서/프로모터, b-키네신 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 인간 진핵생물 개시 인자 4A(EIF4A1) 프로모터, ROSA26 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, tRNA 프로모터, 및 전술한 것의 절단된 버전 및 서열 변이체. 특정 구현예에서, Pol II 프로모터는 EF-1알파이며, 여기서 프로모터는 형질감염 효율, CRISPR 뉴클레아제의 이식유전자 전사 또는 발현, 발현-양성 클론의 비율, 및 장기 배양물에서 에피솜 벡터의 복제 수를 향상시킨다.
본 개시의 gRNA 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 Pol III 프로모터의 비제한적인 예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: U6, 미니 U6, U6 절단된 프로모터, 7SK, 및 H1 변이체, BiH1(양방향 H1 프로모터), BiU6, Bi7SK, BiH1(양방향 U6, 7SK, 및 H1 프로모터), 고릴라 U6, 붉은털원숭이 U6, 인간 7SK, 인간 H1 프로모터, 및 이들의 절단된 버전 및 서열 변이체. 전술한 구현예에서, pol III 프로모터는 gRNA의 전사를 향상시킨다. 특정 구현예에서, Pol III 프로모터는 U6이고, 여기서 프로모터는 gRNA의 발현을 향상시킨다. 또 다른 특정 구현예에서, 향성 인자를 암호화하는 유전자에 연결된 프로모터는 CMV 프로모터이다. 이러한 프로모터의 사용에 대한 실험적 세부 사항 및 데이터는 실시예에 제공되어 있다.
적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 발현을 조절하는 것과 관련이 있으므로 충분히 당업자의 수준 내에 있다. 발현 벡터는 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 함유할 수도 있다. 발현 벡터는 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수도 있다. 발현 벡터는, 단백질 태그(예를 들어 6xHis 태그, 헤마글루티닌 태그, 형광 단백질 등)를 암호화하고 억제자 융합 단백질에 융합되어 정제 또는 검출에 사용되는 키메라 단백질을 생성하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
본 개시의 재조합 발현 벡터는 본 개시의 단백질 및 gRNA의 강력한 발현을 용이하게 하는 요소를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 폴리아데닐화(폴리(A)) 신호, 인트론 서열 또는 전사 후 조절 요소, 예컨대 우드척 간염 전사 후 조절 요소(WPRE) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예시적인 폴리(A) 서열은 hGH 폴리(A) 신호(짧음), HSV TK 폴리(A) 신호, 합성 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리(A) 신호, β-글로빈 폴리(A) 신호 등(예를 들어 서열번호 3459)을 포함한다. 당업자는 본원에 기술된 재조합 발현 벡터에 포함시키기에 적합한 요소를 선택할 수 있을 것이다.
억제자 융합 단백질 또는 gRNA 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 개별적으로 클로닝될 수 있다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은, 예를 들어 PCSK9 유전자의 발현 억제 및/또는 후성적 변형을 위한 발현을 조절하는 것에 관한 것이므로, 충분히 당업자의 수준 내에 있다. 발현 벡터는 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 함유할 수도 있다. 발현 벡터는 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수도 있다.
핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내에 삽입된다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적절한 벡터의 제작은 당업자에게 공지된 표준 결찰 기술을 사용한다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 관련 과학 및 특허 문헌에 상세히 기술되어 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용 가능하다. 벡터는, 예를 들어, 재조합 DNA 절차를 편리하게 수행할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지의 형태일 수 있고, 벡터의 선택은 종종 벡터가 도입될 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 염색체외 엔티티로서 존재하고 이의 복제가 염색체 복제와 독립적인 벡터, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 대안적으로, 벡터는, 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포 게놈에 통합되고, 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 적절한 숙주 세포 내로 도입된 후, 억제자 융합 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 핵산 또는 단백질 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 억제자 융합 단백질의 전사된 mRNA의 존재는 CasX 폴리뉴클레오티드의 임의의 영역에 상보적인 프로브를 사용해 통상적인 혼성화 검정(예: 노던 블롯 분석), 증폭 절차(예: RT-PCR), SAGE(미국 특허 제5,695,937호), 및 어레이 기반 기술(예를 들어, 미국 특허 제5,405,783호, 제5,412,087호, 및 제5,445,934호 참조)에 의해 검출 및/또는 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질 유전자의 전사, 및 생성된 암호화 mRNA의 발현 및 회수를 위한 벡터가 생성된다. 일부 구현예에서, mRNA는 PCR 산물 또는 선형화된 플라스미드 DNA 템플릿 및 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관 내 전사(IVT)에 의해 생성되며, 여기서 플라스미드는 T7 프로모터를 함유한다. PCR 산물을 사용하는 경우, 후보 mRNA를 암호화하는 DNA 서열은 T7 프로모터를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝될 것이며, 여기서 플라스미드 DNA 템플릿은 선형화된 다음 mRNA의 발현을 위한 IVT 반응을 수행하는 데 사용될 것이다. 이러한 벡터의 생성 및 mRNA의 생산 및 회수를 위한 예시적인 방법은 아래의 실시예에 제공된다.
VII.
억제자 융합 단백질의 전달을 위한 입자
또 다른 양태에서, 본 개시는 PCSK9 유전자의 변형을 위해 세포 또는 대상체에게 억제자 융합 단백질을 전달하기 위한 입자 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 입자 조성물은 PCSK9 유전자의 억제를 위해, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템(예를 들어, 억제자 융합 단백질이 dCasX와 같은 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질을 포함하는 경우)을 세포 또는 대상체에게 전달한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 dCasX 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 gRNA 변이체를 캡슐화하는 합성 나노입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 생분해성 중합체 나노입자(PNP)의 생성을 위한 물질은 폴리락티드, 폴리 (락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(에틸 시아노아크릴레이트), 폴리(부틸 시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸 시아노아크릴레이트), 및 폴리(이소헥실 시아노아크릴레이트), 폴리글루탐산(PGA), 폴리 (ε-카프로락톤)(PCL), 사이클로덱스트린, 및 천연 중합체(키토산의 경우)를 포함하며, 알부민, 젤라틴, 및 알긴산염이 PNP의 합성에 가장 많이 사용되는 중합체이다(Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 3:16023; doi:10.1038 (2016)). 일부 구현예에서, 본 개시는 dCasX 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질 및 gRNA 변이체의 전달을 위한 바이러스 유사 입자를 제공한다(본원에 참조로서 통합된 WO2021113772A1 참조). 다른 구현예에서, 본 개시는 gRNA 변이체 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 dCasX 단백질을 포함하는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 제공한다.
a.
지질 나노입자(LNP)
또 다른 양태에서, 본 개시는 PCSK9 유전자의 전사 억제를 위해 본 개시의 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템을 세포에 또는 대상체에게 전달하기 위한 지질 나노입자(LNP)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 조직 또는 기관(예: 간) 특이적이고, 우수한 생체적합성을 가지며, 높은 효율로 시스템을 전달할 수 있으므로, PCSK9 유전자의 억제에 유용하게 사용될 수 있다.
고유 형태일 때, 핵산 중합체는 생물학적 유체에서 불안정하고, 표적 세포의 세포질 내로 침투할 수 없으므로, 전달 시스템이 필요하다. 지질 나노입자(LNP)는 핵산을 보호하고 핵산을 조직 및 세포에 전달하는 것 모두에 유용한 것으로 입증되었다. 또한, CRISPR 뉴클레아제를 암호화하기 위해 LNP에 mRNA를 사용하면 DNA 벡터와 비교하여 바람직하지 않은 게놈이 통합될 가능성을 없앨 수 있다. 또한, mRNA는 세포질 구획에서 기능을 발휘하기 때문에 핵 내로 진입할 필요가 없으므로, 유사분열 및 비유사분열 세포 모두에서 단백질로 효율적으로 번역된다. 전달 플랫폼으로서의 LNP는 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 및 gRNA 둘 다를 단일 LNP 입자로 공동 제형화할 수 있는 추가적인 이점을 제공한다.
따라서, 다양한 구현예에서, 본 개시는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 핵산과 같은 캡슐화되거나 결합된(예를 들어, 복합체화된) 치료제를 세포로 전달하는 것을 포함하여, 다양한 목적으로 사용될 수 있는 지질 나노입자 및 조성물을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 상기 질환 또는 장애는 LNP를 제조하기 위한 조성물에 사용된 지질 성분 중 하나 이상 간의 다양한 물리적, 화학적, 또는 정전기적 상호작용을 통해 복합체화된 적절한 치료제를 캡슐화하거나 이와 결합된 지질 나노입자와 대상체를 접촉시킴으로써 치료되거나 예방된다. 일부 구현예에서, 적절한 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템을 포함한다.
소정의 구현예에서, 지질 나노입자는, 예를 들어, 본 개시의 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA, 및 서열번호 1744~1746 및 2947~2976의 서열을 포함하는 본 개시의 gRNA 변이체를 포함하는 핵산의 전달에 유용하다. 일부 구현예에서, 본 개시는 gRNA, 및 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA가 단일 LNP 입자에 혼입되는 LNP를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 개시는 gRNA 및 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA가 별도의 LNP 집단에 혼입되는 LNP를 제공하며, 이들은 투여를 위해 다양한 비율로 함께 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 LNP에 통합하기 위한 mRNA는 본원에 기술된 억제자 융합 단백질 중 어느 하나를 암호화한다. 일부 구현예에서, LNP에 사용하기 위한 gRNA는 서열번호 1744~1746 및 2947~2976의 서열을 포함한다.
본 개시의 소정의 구현예의 지질 나노입자 및 시스템은 본원에 기술된 하나 이상의 신규한 이온화 가능한 양이온성 지질 또는 영구적으로 하전된 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자와 세포를 접촉시킴으로써 시험관 내 및 생체 내 모두에서 원하는 단백질의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 원하는 단백질(예를 들어, CasX 단백질을 암호화하는 전령 RNA)을 생산하도록 발현되는 핵산을 캡슐화하거나 이와 결합된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 및 시스템은 본원에 기술된 하나 이상의 신규한 이온화 가능한 지질/양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자와 세포를 접촉시킴으로써 시험관 내 및 생체 내 모두에서 PCKS9 표적 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 표적 유전자 발현을 감소시키는 CasX:gRNA 시스템의 핵산을 캡슐화하거나 이와 결합된다. 본 개시의 구현예의 지질 나노입자 및 시스템은 상이한 핵산(예: mRNA, gRNA, siRNA, saRNA, mcDNA, 및 플라스미드 DNA)의 공동 전달을 위해 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수도 있으며, 예컨대 상이한 핵산(예: 적절한 유전자 변형 효소를 암호화하는 mRNA 및 표적 핵산을 표적화하기 위한 gRNA)의 공동 국소화를 필요로 하는 효과를 제공하는 데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 LNP 및 LNP 조성물은 적어도 하나의 양이온성 지질, 적어도 하나의 접합된 지질, 적어도 하나의 스테로이드 또는 이의 유도체, 적어도 하나의 헬퍼 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 대안적으로, 본 개시의 지질 조성물은, 예를 들어 혈장 단백질의 특이적 흡수를 감소시키고 나노입자 위에 수화 층을 형성함으로써, 생물학적 환경에서 콜로이드 안정성을 개선하는 이온화 가능한 양이온성 지질, 헬퍼 지질(일반적으로 인지질), 콜레스테롤, 및 폴리에틸렌 글리콜-지질 접합체(PEG-지질)와 같은 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다. 이러한 지질 조성물은 50:10:37~39:1~3 또는 20~50:8~65:15~70:1~3.0의 IL:HL:스테롤:PEG-지질의 일반적인 몰비로 제형화될 수 있으며, LNP 내의 전통적인 4-성분 시스템에 성분 중 하나 이상을 포함시키거나 이로부터 배제하고 개별 특성을 조정하기 위한 변경이 이루어진다.
본 개시의 LNP 및 LNP 조성물은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 본 개시의 시스템의 캡슐화된 페이로드를 보호하고 이를 조직 및 세포에 전달하도록 구성된다. 본 개시의 LNP 및 LNP 조성물의 다양한 구현예가 본원에 추가로 상세히 기술된다.
양이온성 지질
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 및 LNP 조성물은 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다. 용어 “양이온성 지질”은 순 양전하를 갖는 지질 종을 지칭한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 이온화 가능한 지질의 선택된 pH<pKa에서 순 양전하를 갖는 이온화 가능한 양이온성 지질이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은, LNP 및 LNP 조성물이 각 지질의 pKa 미만인 비교적 낮은 pH에서 페이로드의 효율적인 캡슐화를 달성하도록 약 7 미만의 pKa를 갖는다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 약 5 내지 약 8, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 6 내지 약 7, 또는 약 6.5 내지 약 7의 pKa를 갖는다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 양이온성 지질의 pKa 미만인 pH에서 양성자화될 수 있고, pKa를 초과하는 pH에서 실질적으로 중성일 수 있다. LNP 및 LNP 조성물은 생체 내에서 표적 기관(예: 간, 폐, 심장, 비장뿐만 아니라 종양) 및/또는 표적 세포(간세포, LSEC, 심장 세포, 암세포 등)에 안전하게 전달될 수 있고, 세포내 섭취 동안, pH가 이온화 가능한 지질 pKa 미만으로 떨어질 때 양전하를 나타내어 엔도솜 막의 음이온성 지질과의 정전기적 상호작용을 통해 캡슐화된 페이로드를 방출한다.
영구 양이온성 지질을 사용하는 LNP의 초기 제형은 LNP가 생체 내에서 독성으로 입증된 양성 표면 전하를 갖게 하였을 뿐만 아니라 식세포에 의해 신속하게 제거되었다. 3차 아민, 특히 pKa < 7인 3차 아민을 갖는 이온화 가능한 양이온성 지질로 변화시킴으로써, LNP는 mRNA의 인산염 백본의 음전하와 정전기적으로 상호작용함으로써 낮은 pH에서 핵산 중합체의 효율적인 캡슐화를 달성하고, 생리학적 pH 값에서도 시스템이 대부분 중성을 띄게 되므로, 영구적으로 하전된 양이온성 지질과 관련된 문제를 완화시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “이온화 가능한 지질”은 쉽게 양성자화될 수 있는 아민 함유 지질을 의미하며, 예를 들어 이는 주변 pH에 따라 전하 상태가 변하는 지질일 수 있다. 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(양으로 하전)될 수 있고, pKa를 초과하는 pH에서 실질적으로 중성일 수 있다. 일 예에서, LNP는 양성자화된 이온화 가능한 지질 및/또는 중화를 나타내는 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 5 내지 8, 5.5 내지 7.5, 6 내지 7, 또는 6.5 내지 7의 pKa를 갖는다. LNP의 pKa는 LNP의 생체 내 안정성에 중요하고 표적 세포 또는 기관에서 LNP의 핵산 페이로드를 방출하는 데 중요하다. 일부 구현예에서, 전술한 pKa 범위를 갖는 LNP는 생체 내에서 표적 기관(예를 들어 간, 폐, 심장, 비장뿐만 아니라 종양) 및/또는 표적 세포(간세포, LSEC, 심장 세포, 암세포 등)에 안전하게 전달될 수 있고, 엔도솜 내부에서, 양전하를 나타내어 엔도솜 막의 음이온성 지질과의 정전기적 상호작용을 통해 캡슐화된 페이로드를 방출한다.
이온화 가능한 지질은 일반적으로 지질과 유사한 특성을 갖는 이온화 가능한 화합물이며, 핵산(예를 들어 본 개시의 mRNA)과의 정전기적 상호작용을 통해, LNP 내에 핵산 페이로드를 높은 효율로 캡슐화하는 역할을 할 수 있다.
이온화 가능한 지질에 포함된 아민 및 꼬리 기의 유형에 따라, LNP의 (i) 핵산 캡슐화 효율, (ii) PDI(다분산성 지수), 및/또는 (iii) 기관(예를 들어 간세포 또는 간에 있는 간 동모양 혈관 내피 세포)을 구성하는 조직 및/또는 세포에 대한 핵산 전달 효율은 상이할 수 있다. 소정의 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질이고, 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol% 내지 약 66 mol%를 포함한다.
아민을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP는 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: (1) 높은 효율로 핵산을 캡슐화하는 능력; (2) 제조된 입자의 균일한 크기(또는 낮은 PDI 값을 가짐); 및/또는 (3) 간, 폐, 심장, 비장, 골수와 같은 기관뿐만 아니라 종양, 및/또는 이러한 기관을 구성하는 세포(예를 들어 간세포, LSEC, 심장 세포, 암세포 등)에 대한 탁월한 핵산 전달 효율.
특정 구현예에서, 양이온성 지질 형태는 정전기 상호작용을 통해 핵산 캡슐화에 중요한 역할을 하고 엔도솜 막을 파괴함으로써 세포내 방출에서도 중요한 역할을 한다. 핵산 페이로드는 양으로 하전된 양이온성 지질과 형성하는 이온성 상호작용에 의해 LNP 내에 캡슐화된다. 본 개시의 LNP에 사용되는 이온화 가능한 양이온성 지질 성분의 비제한적인 예는 DLin-MC3-DMA (헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노)부타노에이트), DLin- KC2-DMA (2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란), 및 TNT (1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온) 및 TT (N1,N3,N5-트리스(2-아미노에틸)벤젠-1,3,5-트리카르복스아미드)로부터 선택된다. 본 개시의 LNP에 사용된 헬퍼 지질의 비제한적인 예는 다음으로부터 선택된다: DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), POPC(2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 및 DOPE(1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) DOPG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 스핑고지질, 및 세라미드. 콜레스테롤 및 PEG-DMG ((R)-2,3-비스(옥타데실옥시)프로필-1-(메톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000) 카르바메이트), PEG-DSG (1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 2000), 또는 DSPE-PEG2k (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000])는 LNP의 안정성, 순환, 및 크기를 위해 본 개시의 LNP에 사용되는 성분이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 내의 양이온성 지질은 3차 아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 3차 아민은 에테르 결합을 통해 3차 아민의 N에 연결된 알킬 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬 사슬은 0 내지 3개의 이중 결합을 갖는 C12-C30 알킬 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬 사슬은 C16-C22 알킬 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬 사슬은 C18 알킬 사슬을 포함한다. 다수의 양이온성 지질 및 관련 유사체는 미국 특허 공개 제20060083780호, 제20060240554호, 제20110117125호, 제20190336608호, 제20190381180호, 및 제20200121809호; 미국 특허 제5,208,036호; 제5,264,618호; 제5,279,833호; 제5,283,185호; 제5,753,613호; 제5,785,992호; 제9,738,593호; 제10,106,490호; 제10,166,298호; 제10,221,127호; 및 제11,219,634호; 및 PCT 공개 제WO 96/10390호에 기술되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 내의 이온화 가능한 양이온성 지질은, 예를 들어 하나 이상의 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함할 수 있으며, 여기서 이온화 가능한 양이온성 지질은 디알킬 지질이다. 다른 구현예에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 테트라알킬 지질이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 중 양이온성 지질은 다음으로부터 선택된다: 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), 2,2-디리놀레일-5-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥산(DLin-K6-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-메틸피페라지노-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-MPZ), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레일옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라진)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA), 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DSDMA), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 3-(N-(N′,N′-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스페르민(DOGS), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판(CLinDMA), 2-[5′-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3′-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2′-옥타데카디엔옥시)프로판(CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N′-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(DOcarbDAP), 1,2-N,N′-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(DLincarbDAP), 및 전술한 것들의 임의의 조합.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 내의 양이온성 지질은 다음으로부터 선택된다: 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA), (2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란) (DLin- KC2-DMA), 및 (1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온) (TNT), N1,N3,N5-트리스(2-아미노에틸)벤젠-1,3,5-트리카르복스아미드 (TT), 및 전술한 것들의 임의의 조합.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 내의 N/P 비율(양이온성 지질/이온화 가능한 지질로부터의 질소 및 핵산으로부터의 인산염)은 약 3:1 내지 7:1, 또는 약 4:1 내지 6:1의 범위이거나, 3:1이거나, 4:1이거나, 5:1이거나, 6:1이거나, 7:1이거나, 8:1이거나, 9:1이다.
접합된 지질
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 및 LNP 조성물은 적어도 하나의 접합된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체, 폴리아미드(ATTA)-지질 접합체, 양이온성-중합체-지질 접합체(CPL), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 접합된 지질은 본 개시의 LNP이 응집되는 것을 억제할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 접합된 지질은 PEG화된 지질을 포함한다. 용어 “폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체”, “PEG화된 지질”, “지질-PEG 접합체”, “지질-PEG”, “PEG-지질”, “PEG-지질”, 또는 “지질-PEG”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 친수성 중합체인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체에 부착된 지질을 지칭한다. PEG화된 지질은 LNP 및 LNP 조성물의 안정성에 기여하고 LNP의 응집을 감소시킨다. 다른 구현예에서, LNP의 지질은 세포 표면 수용체를 표적화하는 데 사용되는 펩티드 변형된 PEG 지질, 예를 들어 DSPE-PEG-RGD, DSPE-PEG-트랜스페린, DSPE-PEG-콜레스테롤을 포함한다.
PEG-지질은 표면 지질을 형성할 수 있으므로, LNP의 크기는 코어(이온화 가능한 양이온성) 지질에 대한 표면(PEG) 지질의 비율을 변화시킴으로써 쉽게 변화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 PEG-지질은 크기, 안정성, 및 순환 시간과 같은 입자 특성을 변형시키기 위해 약 1 내지 5 mol%로 변화될 수 있다.
지질-PEG 접합체는 LNP 내에 있는 나노입자의 혈청에서 입자 안정성에 기여하고, 나노입자들 간의 응집을 방지하는 역할을 한다. 또한, 지질-PEG 접합체는 핵산의 생체 내 전달 동안 핵산, 예컨대 본 개시의 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA, 또는 본 개시의 gRNA를 분해 효소로부터 보호할 수 있고, 생체 내에서 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있고, 나노입자에 캡슐화되어 전달된 핵산의 반감기를 증가시킬 수 있다. PEG-지질 접합체의 예는 PEG-DAG 접합체, PEG-DAA 접합체, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, PEG-지질 접합체는 PEG-디아실글리세롤 (PEG-DAG) 접합체, PEG-디알킬옥시프로필 (PEG-DAA) 접합체, PEG-인지질 접합체, PEG-세라미드 (PEG-Cer) 접합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 PEG화된 지질은 다음으로부터 선택된다: PEG-세라미드, PEG-디아실글리세롤, PEG-디알킬옥시프로필, PEG-디알콕시프로필카르바메이트, PEG-포스파티딜에탄올아민, PEG-인지질, PEG-숙신산염 디아실글리세롤, 및 전술한 것들의 임의의 조합.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 PEG화된 지질은 PEG-디알킬옥시프로필이다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질은 다음으로부터 선택된다: PEG-디데실옥시프로필(C10), PEG-디라우릴옥시프로필(C12), PEG-디미리스틸옥시프로필(C14), PEG-디팔미트일옥시프로필(C16), PEG-디스테아릴옥시프로필(C18), 및 전술한 것들의 임의의 조합.
다른 구현예에서, 본 개시의 LNP의 지질-PEG 접합체는 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질에 결합된 PEG (PEG-PE), 세라미드에 접합된 PEG(PEG-CER, 세라미드-PEG 접합체, 세라미드-PEG, 콜레스테롤 또는 이의 유도체에 접합된 PEG, PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE(DSPE-PEG), 및 이들의 혼합물, 예를 들어 C16-PEG2000 세라미드 (N-팔미토일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]}), DMG-PEG 2000, 14:0 PEG2000 PE일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 PEG화된 지질은 다음으로부터 선택된다: 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤, 4-O-(2′,3′-디(테트라데칸오일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG), ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데칸옥시)프로필)카르바메이트, 2,3-디(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카르바메이트, 및 전술한 것들의 임의의 조합.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 PEG화된 지질은 다음으로부터 선택된다: mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-카르보모일글리세리드(PEG-C-DOMG), 1-[8′-(1,2-디미리스토일-3-프로판옥시)-카르복스아미도-3′,6′-디옥사옥타닐]카르바모일-w-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)(2 KPEG-DMG), 및 전술한 것들의 임의의 조합.
일부 구현예에서, PEG는 PEG화된 지질의 지질에 직접 부착된다. 다른 구현예에서, PEG는 에스테르-무함유 링커 모이어티 또는 에스테르-함유 링커 모이어티로부터 선택된 링커 모이어티에 의해 PGE화된 지질의 지질에 부착된다. 에스테르-무함유 링커 모이어티의 비제한적인 예는 아미도 (-C(O)NH-), 아미노 (-NR-), 카르보닐 (-C(O)-), 카르바메이트 (-NHC(O)O-), 우레아 (-NHC(O)NH-), 이황화물 (-S-S-), 에테르 (-O-), 숙신일 (-(O)CCH2CH2C(O)-), 숙신아미딜 (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 이황화물, 및 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 링커는 카르바메이트 링커 모이어티 및 아미도 링커 모이어티를 함유할 수 있다. 에스테르 함유 링커 모이어티의 비제한적인 예는 탄산염 (-OC(O)O-), 숙신오일, 인산염 에스테르 (-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 본 개시의 LNP의 PGE화된 지질의 PEG 모이어티는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤 범위의 평균 분자량을 가질 수 있다. 소정의 구현예에서, PEG 모이어티는 약 750 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,000 달톤 내지 약 4,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 또는 약 1750 달톤 내지 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 접합된 지질(예: PEG화된 지질)은 LNP 및/또는 LNP 조성물에 존재하는 총 지질의 약 1 mol% 내지 약 60 mol%, 약 2 mol% 내지 약 50 mol%, 약 5 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 5 mol% 내지 약 20 mol%를 포함한다. 소정의 구현예에서, 접합된 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol% 내지 약 3 mol%를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 개시의 LNP의 접합된 지질(예: PEG화된 지질)은 LNP 및/또는 LNP 조성물에 존재하는 총 지질의 적어도 약 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 mol%, 또는 전술한 것의 임의의 중간 범위를 포함한다.
본 개시의 LNP의 지질-PEG 접합체 내의 지질의 경우, 폴리에틸렌글리콜에 결합할 수 있는 임의의 지질이 제한 없이 사용될 수 있고, LNP의 다른 요소인 인지질 및/또는 콜레스테롤이 사용될 수도 있다. 일부 구현예에서, 지질-PEG 접합체 내의 지질은 세라미드, 디미리스토일글리세롤 (DMG), 숙신오일-디아실글리세롤 (s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 또는 콜레스테롤일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 개시의 LNP의 지질-PEG 접합체에서, PEG는 지질에 직접 접합되거나 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 지질에 PEG를 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있고, 예를 들어 에스테르-무함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티를 포함한다. 에스테르-무함유 링커 모이어티는 아미도 (-C(O)NH-), 아미노 (-NR-), 카르보닐 (-C(O)-), 카르바메이트 (-NHC(O)O-), 우레아 (-NHC(O)NH-), 이황화물 (-S-S-), 에테르 (-O-), 숙신일 (-(O)CCH2CH2C(O)-), 숙신아미딜 (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 이황화물뿐만 아니라 이들의 조합(예를 들어 카르바메이트 링커 모이어티 및 아미노 링커 모이어티 둘 다를 함유하는 링커)도 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 에스테르 함유 링커 모이어티는, 예를 들어 탄산염 (-OC(O)O-), 숙신오일, 인산염 에스테르 (-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
스테로이드
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 및 LNP 조성물은 적어도 하나의 스테로이드 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 및 LNP 조성물은 다음으로부터 선택된 콜레스테롤 유도체를 포함한다: 콜레스탄올, 콜레스탄온, 콜레스테논, 코프로스탄올, 콜레스테릴-2′-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4′-하이드록시부틸 에테르, 및 전술한 것들의 임의의 조합.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 스테로이드(예: 콜레스테롤)는 LNP 및/또는 LNP 조성물에 존재하는 총 지질의 약 1 mol% 내지 약 65 mol%, 약 2 mol% 내지 약 50 mol%, 약 5 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 5 mol% 내지 약 20 mol%를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시의 LNP의 스테로이드(예: 콜레스테롤)은 LNP 및/또는 LNP 조성물에 존재하는 총 지질의 적어도 약 12, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 mol%, 또는 전술한 것의 임의의 중간 범위를 포함한다.
헬퍼 지질/헬퍼 지질 또는 구조적 지질
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 및 LNP 조성물은 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 음이온성 지질, 중성 지질, 또는 둘 다로부터 선택된 비-양이온성 지질이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 적어도 하나의 인지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 인지질은 음이온성 인지질, 중성 인지질, 또는 둘 다로부터 선택된다. LNP 및 LNP 조성물의 요소의 인지질은, LNP에서 양이온성 지질과 핵산의 상호작용에 의해 형성된 LNP의 코어를 덮어 보호하는 역할을 하며, 표적 세포의 인지질 이중층에 결합함으로써 핵산의 세포내 전달 동안 세포막 투과 및 엔도솜 탈출을 용이하게 할 수 있다. 세포에 대한 LNP의 융합을 촉진할 수 있는 인지질은 아래에 기술된 군으로부터 선택된 인지질 중 어느 하나를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, LNP 및 LNP 조성물은 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 인지질을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: 디팔미토일-포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 디올레오일-포스파티딜콜린 (DOPC), 디올레오일-포스파티딜글리세롤 (DOPG), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜글리세롤 (POPG), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디팔미토일-포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민 (DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 에그(egg) 포스파티딜콜린 (EPC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 및 전술한 것들의 임의의 조합. 일 예에서, DOPE를 포함하는 LNP는 mRNA 전달에 효과적일 수 있다(우수한 약물 전달 효능).
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP의 헬퍼 지질(예: 인지질)은 LNP 및/또는 LNP 조성물에 존재하는 총 지질의 약 1 mol% 내지 약 60 mol%, 약 2 mol% 내지 약 50 mol%, 약 5 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 5 mol% 내지 약 20 mol%를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시의 LNP의 헬퍼 지질(예: 인지질)은 LNP 및/또는 LNP 조성물에 존재하는 총 지질의 적어도 약 1 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 mol%, 또는 전술한 것의 임의의 중간 범위를 포함한다.
LNP 및/또는 LNP 조성물에 존재하는 총 지질은 지질을 개별적으로 포함하거나 양이온성 지질 또는 이온화 가능한 양이온성 지질, 접합된 지질(예: PGE화된 지질), 펩티드 접합된 PEG 지질, 스테로이드(예: 콜레스테롤), 펩티드 접합된-구조적 지질 (예: DSPE-cRGD), 및 구조적 지질(예: 인지질)과의 조합으로 포함함으로써, 1개의 성분을 함유하는 LNP 조성물 내지 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 성분에 한정되지 않는 다수의 성분을 LNP 제형 내에 함유하는 LNP 제형을 생성한다.
LNP 및/또는 LNP 조성물은 총 지질(또는 이의 일부)을 유기 용매(예: 에탄올)에 용해시킨 다음, 산성 완충액(예: pH 1.0~6.5)에 용해된 페이로드(예: 시스템의 핵산)와 마이크로믹서를 통해 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 pH에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 양으로 하전되고, 음으로 하전된 핵산 중합체와 상호작용한다. 그런 다음, 핵산을 함유하는 생성된 나노구조는 중성 완충액에 대해 투석될 때 중성 LNP로 변환되는데, 여기에는 LNP를 생리학적으로 관련된 완충액으로 교환하는 동안 유기 용매(예: 에탄올)를 제거하는 것도 포함한다. 이렇게 형성된 LNP 및/또는 LNP 조성물은, 전통적인 이중층 리포좀 구조와는 대조적으로, 이온화 가능한 양이온성 지질이 캡슐화된 페이로드 주위에서 역위 미셀로 구성되는, 구별되는 전자가 조밀한 나노구조 코어를 갖는다. 또 다른 구현예에서, LNP는 전자가 조밀하지 않은 지질 코어를 따라 수성 포켓 내에 핵산이 존재하는 수포 모양의 구조(bleb-like structure)를 형성할 수 있다.
b.
지질 나노입자 특성
LNP 및/또는 LNP 조성물은 총 지질(또는 이의 일부)을 유기 용매(예: 에탄올)에 용해시킨 다음, 산성 완충액(예: pH 1.0~6.5)에 용해된 페이로드(예: 시스템의 핵산)와 마이크로믹서를 통해 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 pH에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 양으로 하전되고, 음으로 하전된 핵산 중합체와 상호작용한다. 그런 다음, 핵산을 함유하는 생성된 나노구조는 중성 완충액에 대해 투석될 때 중성 LNP로 변환되는데, 여기에는 LNP를 생리학적으로 관련된 완충액으로 교환하는 동안 유기 용매(예: 에탄올)를 제거하는 것도 포함한다. 이렇게 형성된 LNP 및/또는 LNP 조성물은, 전통적인 이중층 리포좀 구조와는 대조적으로, 이온화 가능한 양이온성 지질이 캡슐화된 페이로드 주위에서 역위 미셀로 구성되는, 구별되는 전자가 조밀한 나노구조 코어를 갖는다. 또 다른 구현예에서, LNP는 전자가 조밀하지 않은 지질 코어를 따라 수성 포켓 내에 핵산이 존재하는 수포 모양의 구조(bleb-like structure)를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 및/또는 LNP 조성물은 양이온성 지질:헬퍼 지질(예: 인지질):스테로이드(예: 콜레스테롤):접합 지질(예: PEG화된 지질)을 20~50:10~30:30~60:0.5~5의 몰비, 25~45:10~25:40~50:0.5~3의 몰비, 25~45:10~20:40~55:0.5~3의 몰비, 또는 25~45:10~20:40~55:1.0~1.5의 몰비로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 및/또는 LNP 조성물은 약 1 내지 약 100의 총 지질:페이로드 비율(질량/질량)을 갖는다. 일부 구현예에서, 총 지질:페이로드 비율은 약 1 내지 약 50, 약 2 내지 약 25, 약 3 내지 약 20, 약 4 내지 약 15, 또는 약 5 내지 약 10이다. 일부 구현예에서, 총 지질:페이로드 비율는 약 5 내지 약 15, 예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 전술한 것들의 임의의 중간 범위이다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 5:1 내지 약 15:1의 총 지질:핵산 질량 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP에 포함된 양이온성 지질과 핵산의 중량비는 1 내지 20:1, 1 내지 15:1, 1 내지 10:1, 5 내지 20:1, 5 내지 15:1, 5 내지 10:1, 7.5 내지 20:1, 7.5 내지 15:1, 또는 7.5 내지 10:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 20 내지 50 중량%의 양이온성 지질, 10 내지 30 중량%의 인지질, 20 내지 60 중량%(또는 30 내지 60 중량%)의 콜레스테롤, 및 0.1 내지 10 중량%(또는 0.25 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%)의 지질-PEG 접합체를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP는 총 나노입자 중량을 기준으로 20 내지 50 중량%의 양이온성 지질, 10 내지 60 중량%의 인지질, 20 내지 60 중량%(또는 20 내지 60 중량%)의 콜레스테롤, 및 0.1 내지 10 중량%(또는 0.25 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%)의 지질-PEG 접합체를 포함할 수 있다. 추가의 대안으로서, LNP는 총 나노입자 중량을 기준으로 25 내지 50 중량%의 양이온성 지질, 10 내지 20 중량%의 인지질, 35 내지 55 중량%의 콜레스테롤, 및 0.1 내지 10 중량%(또는 0.25 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%)의 지질-PEG 접합체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP는 약 20 내지 200 nm, 20 내지 180 nm, 20 내지 170 nm, 20 내지 150 nm, 20 내지 120 nm, 20 내지 100 nm, 20 내지 90 nm, 30 내지 200 nm, 30 내지 180 nm, 30 내지 170 nm, 30 내지 150 nm, 30 내지 120 nm, 30 내지 100 nm, 30 내지 90 nm, 40 내지 200 nm, 40 내지 180 nm, 40 내지 170 nm, 40 내지 150 nm, 40 내지 120 nm, 40 내지 100 nm, 40 내지 90 nm, 40 내지 80 nm, 40 내지 70 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 180 nm, 50 내지 170 nm, 50 내지 150 nm, 50 내지 120 nm, 50 내지 100 nm, 50 내지 90 nm, 60 내지 200 nm, 60 내지 180 nm, 60 내지 170 nm, 60 내지 150 nm, 60 내지 120 nm, 60 내지 100 nm, 60 내지 90 nm, 70 내지 200 nm, 70 내지 180 nm, 70 내지 170 nm, 70 내지 150 nm, 70 내지 120 nm, 70 내지 100 nm, 70 내지 90 nm, 80 내지 200 nm, 80 내지 180 nm, 80 내지 170 nm, 80 내지 150 nm, 80 내지 120 nm, 80 내지 100 nm, 80 내지 90 nm, 90 내지 200 nm, 90 내지 180 nm, 90 내지 170 nm, 90 내지 150 nm, 90 내지 120 nm, 또는 90 내지 100 nm, 또는 전술한 것 중 어느 하나의 중간 범위의 평균 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 LNP 및/또는 LNP 조성물은 산성 pH에서 양전하를 가지며, 페이로드(예: 치료제)의 음전하에 의해 생성된 정전기적 상호작용을 통해 페이로드(예: 치료제)를 캡슐화할 수 있다. 용어 “캡슐화(encapsulation)”는 지질의 혼합물이 생리학적 조건에서 페이로드(예: 치료제)를 둘러싸고 포매하여 LNP를 형성하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 “캡슐화 효율”은 LNP에 의해 캡슐화된 페이로드(예: 치료제)의 양의 백분율이다. 이는 LNP의 파괴 전에 벌크 상태인 페이로드(예: 치료제)를, 1~2% Triton X-100과 같은 계면활성제 계열 시약을 사용하여 LNP의 파괴한 후 벌크 상태에서 측정한 페이로드(예: 치료제)의 총량으로 나눈 척도이다. LNP 및/또는 LNP 조성물의 캡슐화 효율은 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, LNP 및/또는 LNP 조성물의 캡슐화 효율은 약 80% 내지 99%, 약 85% 내지 98%, 약 88% 내지 95%, 약 90% 내지 95%이거나, 페이로드(예: 시스템의 핵산)는 LNP 조성물의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화되어 효소 분해로부터 보호될 수 있다. 일부 구현예에서, 페이로드(예: 치료제)는 LNP 및/또는 LNP 조성물을 37℃에서 뉴클레아제에 노출시킨 후 적어도 약 20, 30, 45, 또는 60분 동안 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36시간 동안 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 페이로드(예: 시스템의 핵산)는 LNP 및/또는 LNP 조성물의 지질 부분과 복합체를 형성한다. 본 개시의 LNP 및/또는 LNP 조성물은 인간과 같은 포유동물에게 비독성이다.
용어 “완전히 캡슐화된”은 LNP 및/또는 LNP 조성물 중의 페이로드(예: 시스템의 핵산)가 유리 DNA, RNA, 또는 단백질을 유의하게 분해하는 조건에 노출된 후 유의하게 분해되지 않음을 나타낸다. 완전히 캡슐화된 시스템에서, LNP 및/또는 LNP 조성물 중 페이로드(예: 시스템의 핵산)의 약 25% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만이, 캡슐화되지 않은 페이로드를 100% 분해하게 될 조건에 의해 분해된다. “완전히 캡슐화된”은 또한, LNP 및/또는 LNP 조성물이 혈청 안정성이고, 생체 내 투여 후 혈청 단백질에 노출된 직후 이들의 성분 부분으로 분해되지 않으며, 화물(cargo)이 엔도솜이 빠져나와 세포의 세포질 내로 방출될 때까지 화물을 보호한다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에서, 페이로드(예: 치료제)가 그 안에 캡슐화된 LNP 및/또는 LNP 조성물의 양은 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, %, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 전술한 것들의 임의의 중간 범위이다.
일부 구현예에서, LNP 및/또는 LNP 조성물 내에 캡슐화된 페이로드(예: 치료제)의 양은 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, %, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 전술한 것들의 임의의 중간 범위이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 핵산(예컨대 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA) 및/또는 gRNA는, 핵산이 지질 나노입자 내에 캡슐화될 수 있도록 지질 용액과 혼합되는 용액으로 제공될 수 있다. 적합한 핵산 용액은 캡슐화될 핵산을 다양한 농도로 함유하는 임의의 수용액일 수 있다. 예를 들어, 적합한 핵산 용액은 약 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.25 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1.75 mg/ml, 또는 2.0 mg/ml 이상의 농도로 핵산(들)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하고, 적합한 mRNA 용액은 약 0.01~2.0 mg/ml, 0.01~1.5 mg/ml, 0.01~1.25 mg/ml, 0.01~1.0 mg/ml, 0.01~0.9 mg/ml, 0.01~0.8 mg/ml, 0.01~0.7 mg/ml, 0.01~0.6 mg/ml, 0.01~0.5 mg/ml, 0.01~0.4 mg/ml, 0.01~0.3 mg/ml, 0.01~0.2 mg/ml, 0.01~0.1 mg/ml, 0.05~1.0 mg/ml, 0.05~0.9 mg/ml, 0.05~0.8 mg/ml, 0.05~0.7 mg/ml, 0.05~0.6 mg/ml, 0.05~0.5 mg/ml, 0.05~0.4 mg/ml, 0.05~0.3 mg/ml, 0.05~0.2 mg/ml, 0.05~0.1 mg/ml, 0.1~1.0 mg/ml, 0.2~0.9 mg/ml, 0.3~0.8 mg/ml, 0.4~0.7 mg/ml, 또는 0.5~0.6 mg/ml 범위의 농도로 mRNA를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 mRNA 용액은 최대 약 5.0 mg/ml, 4.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, 2.0 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.9 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.01 mg/ml, 또는 0.05 mg/ml의 농도로 mRNA를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 gRNA 용액은 최대 약 5.0 mg/ml, 4.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, 2.0 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.9 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.01 mg/ml, 또는 0.05 mg/ml의 농도로 gRNA를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, LNP는 간 조직, 간세포, 및/또는 LSEC(간 동양 내피 세포) 내로 쉽게 도입되도록 20nm 내지 200nm, 20nm 내지 180nm, 20nm 내지 170nm, 20nm 내지 150nm, 20nm 내지 120nm, 20nm 내지 100nm, 20nm 내지 90nm, 30nm 내지 200nm, 30 내지 180nm, 30nm 내지 170nm, 30nm 내지 150nm, 30nm 내지 120nm, 30nm 내지 100nm, 30nm 내지 90nm, 40nm 내지 200nm, 40 내지 180nm, 40nm 내지 170nm, 40nm 내지 150nm, 40nm 내지 120nm, 40nm 내지 100nm, 40nm 내지 90nm, 40nm 내지 80nm, 40nm 내지 70nm, 50nm 내지 200nm, 50 내지 180nm, 50nm 내지 170nm, 50nm 내지 150nm, 50nm 내지 120nm, 50nm 내지 100nm, 50nm 내지 90nm, 60nm 내지 200nm, 60 내지 180nm, 60nm 내지 170nm, 60nm 내지 150nm, 60nm 내지 120nm, 60nm 내지 100nm, 60nm 내지 90nm, 70nm 내지 200nm, 70 내지 180nm, 70nm 내지 170nm, 70nm 내지 150nm, 70nm 내지 120nm, 70nm 내지 100nm, 70nm 내지 90nm, 80nm 내지 200nm, 80 내지 180nm, 80nm 내지 170nm, 80nm 내지 150nm, 80nm 내지 120nm, 80nm 내지 100nm, 80nm 내지 90nm, 90nm 내지 200nm, 90 내지 180nm, 90nm 내지 170nm, 90nm 내지 150nm, 90nm 내지 120nm, 또는 90nm 내지 100nm의 평균 직경을 가질 수 있다. LNP는 간, 폐, 심장, 비장을 포함하지만 이에 한정되지 않는 기관 또는 조직 뿐만 아니라 종양 내로 쉽게 도입되도록 크기를 가질 수 있다. LNP의 크기가 상기 범위보다 작은 경우, LNP의 표면적이 과도하게 증가하므로 안정성을 유지하기 어려울 수 있고, 따라서 표적 조직으로의 전달 및/또는 약물 효과가 감소될 수 있다. LNP는 간 조직을 특이적으로 표적화할 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, LNP가 치료제를 전달하는 데 사용될 수 있는 하나의 메커니즘은 천연 지단백질의 대사 거동을 모방하는 것을 통해 이루어지므로, LNP는 간에 의해 수행되는 지질 대사 프로세스를 통해 대상체에게 유용하게 전달될 수 있는 것으로 여겨진다. 치료제가 간세포 및/또는 LSEC(간 동모양 혈관 내피 세포)에 전달되는 동안, 동모양 내강으로부터 간세포 및 LSEC로 이어지는 개구(fenestrae)의 직경은 포유동물에서는 약 140 nm이고 인간에서는 약 100 nm이므로, 치료제를 전달하기 위한 LNP 조성물로서 LNP가 상기 범위의 직경을 갖는 LNP 조성물은 상기 범위를 벗어난 직경을 갖는 LNP와 비교하여 간세포 및 LSEC에 대해 탁월한 전달 효율을 가질 수 있다.
일 예에 따르면, LNP 조성물의 LNP는 이온화 가능한 양이온성 지질:인지질:콜레스테롤:지질-PEG 접합체를 전술한 범위 내에서 포함하거나, 20~50:10~30:30~60:0.5~5의 몰비, 25~45:10~25:40~50:0.5~3의 몰비, 25~45:10~20:40~55:0.5~3의 몰비, 또는 25~45:10~20:40~55:1.0~1.5의 몰비로 포함할 수 있다. 상기 범위의 몰비로 성분을 포함하는 LNP는 표적 기관의 세포에 특이적인 치료제의 탁월한 전달 효율을 가질 수 있다.
소정의 양태에서, LNP는 5 내지 8, 5.5 내지 7.5, 6 내지 7, 또는 6.5 내지 7의 pKa를 나타냄으로써 산성 pH 조건 하에 양전하를 나타내며, 치료제, 예컨대 음전하를 나타내는 핵산과의 정전기적 상호작용을 통해 핵산과 복합체를 쉽게 형성함으로써 높은 효율로 핵산을 캡슐화할 수 있다. 이러한 경우, LNP는 치료제(예: 핵산)의 세포내 또는 생체내 전달을 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본원에서, “캡슐화(encapsulate 또는 encapsulation)”는 지질 외피 내부에 치료제를 효율적으로 통합하는 것, 즉 입자 표면으로 치료제를 둘러싸고 및/또는 다양한 지질로 만들어진 입자 내부에 치료제를 포매시키는 것을 지칭하며, 여기서의 지질은 지질을 둘러산 용매의 극성이 증가될 때 자가-조립되는 지질이다. 캡슐화 효율은, LNP의 파괴 후 측정한 LNP 제형의 주어진 부피 당 측정된 총 치료제 함량 대비 LNP에 캡슐화된 치료제의 함량을 의미한다.
LNP 중 조성물의 핵산의 캡슐화는 조성물 중 LNP의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 또는 95% 또는 그 이상이 핵산을 캡슐화하는 것일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 중 조성물의 핵산의 캡슐화는 조성물 중 LNP의 80% 내지 99%, 80% 내지 97%, 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 87% 내지 95%, 90% 내지 95%, 91% 이상 내지 95% 이하, 91% 이상 내지 94% 이하, 91% 초과 내지 95% 이하, 92% 내지 99%, 92% 내지 97%, 또는 92% 내지 95%가 핵산을 캡슐화하도록 하는 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 억제제 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및/또는 gRNA는 LNP에 완전히 캡슐화된다.
LNP에 의해 핵산이 전달되는 표적 기관은 간, 폐, 심장, 비장뿐만 아니라 종양도 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일 예에 따른 LNP는 간 조직 특이적이고, 우수한 생체적합성을 가지며, 조성물의 핵산을 높은 효율로 전달할 수 있으므로, 지질 나노입자 매개 유전자 요법과 같은 관련 기술 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 일 예에 따라 LNP에 의해 핵산이 전달되는 표적 세포는 생체 내 간세포 및/또는 LSEC일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 개시는 구현예의 핵산을 생체 외 세포에 전달하도록 제형화된 LNP를 제공한다.
본 개시는 본원에 기술된 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및/또는 gRNA 변이체와 같은 핵산을 포함하는 복수의 LNP, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
소정의 구현예에서, 핵산(들)을 포함하는 LNP는 전자가 조밀한 코어를 갖는다.
본 개시는 다음을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP를 제공한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및/또는 본원에 기술된 gRNA 변이체; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 20 몰% 내지 약 60 몰%를 포함하는 하나 이상의 양이온성 지질 또는 이온화 가능한 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 13 몰% 내지 약 49.5 몰%를 포함하는 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%를 포함하고, LNP의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합된 지질. 다른 구현예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP를 제공한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA, 및/또는 본원에 기술된 gRNA 변이체; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 22 몰% 내지 약 85 몰%를 포함하는 하나 이상의 양이온성 지질 또는 이온화 가능한 양이온성 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 10 몰% 내지 약 70 몰%를 포함하는 하나 이상의 비양이온성/인지질; (d) 15 몰% 내지 약 50 몰%의 스테롤, 및 (d) 입자 중 1 몰% 내지 약 5 몰%의 지질-PEG 또는 지질-PEG-펩티드. 소정의 구현예에서, 억제자 융합 단백질 mRNA 및 gRNA는 동일한 핵산-지질 입자에 존재하거나, 상이한 핵산-지질 입자에 존재할 수 있다.
본 개시는 다음을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP를 제공한다: (a) 본원에 기술된 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 52 몰% 내지 약 62 몰%를 포함하는 양이온성 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 36 몰% 내지 약 47 몰%를 포함하는 인지질 및 콜레스테롤 또는 이들의 유도체의 혼합물; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 1 몰% 내지 약 2 몰%를 포함하는 PEG-지질 접합체. 특정 구현예에서, 제형은 약 1.4 몰%의 PEG-지질 접합체(예: PEG2000-C-DMA), 약 57.1 몰%의 양이온성 지질(예: DLin-K-C2-DMA) 또는 이의 염, 약 7.1 몰%의 DPPC (또는 DSPC), 및 약 34.3 몰%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)을 포함하는 4성분 시스템이다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP는 다음을 포함한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및/또는 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 46.5 몰% 내지 약 66.5 몰%를 포함하는 양이온성 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 31.5 몰% 내지 약 42.5 몰%를 포함하는 콜레스테롤 또는 이의 유도체; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 1 몰% 내지 약 2 몰%를 포함하는 PEG-지질 접합체. 특정 구현예에서, 제형은 인지질이 없고 약 1.5 몰%의 PEG-지질 접합체(예: PEG2000-C-DMA), 약 61.5 몰%의 양이온성 지질(예: DLin-K-C2-DMA) 또는 이의 염, 및 약 36.9 몰%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)을 포함하는 3성분 시스템이다.
추가의 제형은 PCT 공개 번호 WO 09/127060 및 미국 특허 공개 번호 US 2011/0071208 A1 및 US 2011/0076335 A1에 기술되어 있으며, 그 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP는 다음을 포함한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 2 몰% 내지 약 50 몰%를 포함하는 하나 이상의 양이온성 지질 또는 이온화 가능한 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%를 포함하는 하나 이상의 비-양이온성 지질 또는 이온화 가능한 지질; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 20 몰%를 포함하고, 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합된 지질.
다른 구현예에서, 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP는 다음을 포함한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 30 몰% 내지 약 50 몰%를 포함하는 양이온성 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 47 몰% 내지 약 69 몰%를 포함하는 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 1 몰% 내지 약 3 몰%를 포함하는 PEG-지질 접합체. 특정 구현예에서, 제형은 약 2 몰%의 PEG-지질 접합체(예: PEG2000-C-DMA), 약 40 몰%의 양이온성 지질(예: DLin-K-C2-DMA) 또는 이의 염, 약 10 몰%의 DPPC (또는 DSPC), 및 약 48 몰%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)을 포함하는 4성분 시스템이다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP는 다음을 포함한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 65 몰%를 포함하는 하나 이상의 양이온성 지질 또는 이온화 가능한 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 25 몰% 내지 약 45 몰%를 포함하는 하나 이상의 비-양이온성 지질 또는 이온화 가능한 지질; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%를 포함하고, 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 접합된 지질.
다른 구현예에서, 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP는 다음을 포함한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 60 몰%를 포함하는 양이온성 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 35 몰% 내지 약 45 몰%를 포함하는 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%를 포함하는 PEG-지질 접합체.
소정의 구현예에서, 제형 내의 비-양이온성 지질 혼합물은 다음을 포함한다: (i) LNP에 존재하는 총 지질의 약 10 몰% 내지 약 70 몰%의 인지질; 및 (ii) LNP에 존재하는 총 지질의 약 15 몰% 내지 약 50 몰%의 콜레스테롤 또는 이의 유도체; 및 1~5% 지질-PEG 또는 지질-PEG-펩티드. 특정 구현예에서, 제형은 약 7 몰%의 PEG-지질 접합체(예: PEG750-C-DMA), 약 54 몰%의 양이온성 지질(예: DLin-K-C2-DMA) 또는 이의 염, 약 7 몰%의 DPPC (또는 DSPC), 및 약 32 몰%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)을 포함하는 4성분 시스템이다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP는 다음을 포함한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및/또는 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 55 몰% 내지 약 65 몰%를 포함하는 양이온성 지질 또는 이의 염; (c) LNP에 존재하는 총 지질의 약 30 몰% 내지 약 40 몰%를 포함하는 콜레스테롤 또는 이의 유도체; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 10 몰%를 포함하는 PEG-지질 접합체. 특정 구현예에서, 제형은 인지질을 함유하지 않고 약 7 몰%의 PEG-지질 접합체(예를 들어 PEG750-C-DMA), 약 58 몰%의 양이온성 지질(예를 들어 DLin-K-C2-DMA) 또는 이의 염, 및 약 35 몰%의 콜레스테롤(또는 이의 유도체)을 포함하는 3성분 시스템이다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 핵산을 포함하는 LNP는 다음을 포함한다: (a) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및/또는 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA; (b) LNP에 존재하는 총 지질의 약 48 몰% 내지 약 62 몰%를 포함하는 양이온성 지질 또는 이의 염; (c) 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물로서, 인지질은 LNP에 존재하는 총 지질의 약 7 몰% 내지 약 17 몰%를 포함하고, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 LNP에 존재하는 총 지질의 약 25 몰% 내지 약 40 몰%를 포함하는, 혼합물; 및 (d) LNP에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 3.0 몰%를 포함하는 PEG-지질 접합체.
VIII.
PCSK9 표적 핵산의 억제를 위한 시스템 및 방법
또 다른 양태에서, 본 개시는, 세포 집단에서 PCSK9 유전자의 표적 핵산을 억제하는 데 사용하기 위한 시스템으로서, 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질, 및 하나 이상의 gRNA(억제자 융합 단백질:gRNA 시스템)를 포함하는 시스템을 제공한다. 본원에 제공된 시스템은 치료제로서의 응용, 진단제로서의 응용, 및 연구용 응용을 포함하여, 다양한 응용 분야에 유용하다. 본 개시의 방법을 실시하여 PCSK9 유전자를 억제하거나 침묵화시키기 위해, 프로그래밍 가능한 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 시스템의 프로그래밍 가능한 성질은 PCSK9 유전자 표적 핵산에서 하나 이상의 소정의 관심 영역에서 원하는 효과를 달성하기 위한 정확한 표적화를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 돌연변이, 예를 들어 고콜레스테롤혈증 또는 가족성 또는 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증을 초래하는 우성 돌연변이를 포함하는 대상체에서 PCSK9 단백질의 발현을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, PCSK9 유전자에서의 돌연변이로 기인하지 않는 높은 수치의 콜레스테롤을 가진 대상체에서 PCSK9 단백질의 발현을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서, 대상체의 진핵 세포에서 PCSK9 유전자의 표적 핵산의 전사를 억제하거나 침묵화시키는 방법에 사용하기 위해 특이적으로 설계된 시스템을 제공한다. 일반적으로, 유전자의 임의의 부분은 본원에 제공된 프로그램 가능한 시스템 및 방법을 사용하여 표적화될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시는 세포 집단에서 PCSK9 유전자의 표적 핵산 서열을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 i) 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA를 포함하는 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템; ii) 억제자 융합 단백질 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA를 암호화하는 핵산; iii) 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 및 단순 포진 바이러스(HSV) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위의 핵산을 포함하는 벡터, (iv), 상기; v) gRNA 및 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 LNP 또는 합성 나노입자; 또는 vi) (i) 내지 (v) 중 2개 이상의 조합을 세포 집단의 세포 각각에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA에 의해 표적화된 세포의 표적 핵산 서열의 전사는 억제자 융합 단백질에 의해 억제된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포를 구현예의 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템과 접촉시키는 것은 집단의 하나 이상의 세포의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 그 이상의 PCSK9 표적 핵산의 억제를 초래한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포 집단 내의 PCSK9 유전자는, PCSK9 단백질의 발현이 PCSK9 유전자가 표적화되지 않은 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 감소되도록 억제되거나 침묵화된다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 PCSK9 유전자의 전사 억제는, 시험관 내 검정에서 검정할 때, 적어도 약 8시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 7일, 적어도 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 PCSK9 유전자의 전사의 억제는 유전성이며, 여기서 PCKS9 유전자의 억제는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 이상의 세포 분열 동안 지속된다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 세포의 억제는 시험관 내에서 발생한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포의 억제는 생체 외에서 발생한다. 일부 구현예에서, 억제는 세포를 대상체에게 도입하기 전에 시험관 내에서 세포 내부에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 세포는 자가 세포이거나 대상체에 대해 동종이계(allogenic)이다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포의 억제는 본원에 개시된 구현예 중 어느 하나의 억제자 융합 단백질을 투여한 대상체의 생체 내에서 발생한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 진핵 세포는 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 영장류 세포, 및 비인간 영장류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 진핵 세포는 인간 세포이다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 생식 세포, 섬유아세포, 희소돌기아교세포, 교세포, 조혈 줄기 세포, 뉴런 전구 세포, 뉴런, 성상세포, 근육 세포, 골 세포, 간세포, 췌장 세포, 망막 세포, 암세포, T-세포, B-세포, NK 세포, 태아 심근세포, 근섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 자가이식된 확장 심근세포, 지방세포, 전능성 세포, 다능성 세포, 혈액 줄기 세포, 근아세포, 골수 세포, 중간엽 세포, 실질 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중피 세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 조혈 줄기 세포, 골수 유래 전구 세포, 심근 세포, 골격 세포, 태아 세포, 미분화 세포, 다능성 전구 세포, 단능성 전구 세포, 단핵구, 심장 근아세포, 골격 근아세포, 대식세포, 모세관 내피 세포, 이종 세포, 동종 세포, 또는 출생 후 줄기 세포이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 세포 집단에서 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템에 의한 PCSK9 유전자 억제를 역전시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 억제는 세포 집단 내로 DNMT의 억제제를 도입함으로써 역전될 수 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 억제는 DNMT의 시티딘 유사체 억제제의 사용에 의해 역전될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제는 아자시티딘, 데시타빈, 클로파라빈, 및 제불라린으로 이루어진 군으로부터 선택된 억제제의 사용에 의해 역전될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제는 0.1 μM 내지 40 μM의 농도 또는 임의의 중간 농도에서 억제제의 사용에 의해 역전될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 개시의 시스템으로 치료한 대상체에게 DNMT 억제제의 치료적 유효 투여량을 투여함으로써, 시스템에 의한 PCSK9의 억제를 역전시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템은 표 20에 제시된 것과 같은 서열번호 3131~3132의 서열 또는 이와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는 억제자 융합 단백질; 서열번호 1744~1746 또는 2947~2976의 서열, 또는 이와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는 gRNA 스캐폴드를 포함하고, gRNA는 서열번호 1824~2944의 표적화 서열, 또는 이와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하고 15 내지 20개의 아미노산을 갖는 서열을 포함한다. 시스템의 일부 구현예에서, gRNA는 표 7에 제시된 것과 같은 서열번호 1824~2944의 표적화 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 시스템의 억제자 융합 단백질은 서열번호 3131~3132로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, gRNA 스캐폴드는 서열번호 1744~1746 및 2947~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~2545의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 서열번호 3131~3132의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, gRNA 스캐폴드는 서열번호 1744~1746 및 2947~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, gRNA의 표적화 서열은 표 8에 제시된 것과 같은, 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시스템이 LNP 내에 제형화되는 특정 구현예에서, 억제자 융합 단백질은 서열번호 3131~3132로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, mRNA에 의해 암호화되고, gRNA 스캐폴드는 서열번호 1746의 서열을 포함하고, gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 시스템은 서열번호 3105, 3109, 및 3115~3128로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 또는 이와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 하나 이상의 서열을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 서열번호 3105, 3109, 및 3115~3128로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 mRNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 시스템은 서열번호 3105, 3109, 및 3115~3128로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 mRNA 서열, 서열번호 2948~2956, 2958~2966, 및 2968~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 gRNA를 캡슐화하는 LNP로 제형화되고, gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열의 우리딘 뉴클레오시드의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 100%가 N1-메틸슈도우리딘으로 치환되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 5' 비번역 영역(UTR) 및 3' 비번역 영역(UTR)을 추가로 포함한다.
상기 방법의 일 구현예에서, 시스템은 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 본원에 개시된 구현예 중 어느 하나의 gRNA 변이체를 포함하는 LNP를 사용하여 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, LNP는 서열번호 3105, 3109, 및 3115~3128의 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 전술한 것의 일부 구현예에서, LNP는 PCSK9 표적 핵산에 상보적인 표적화 서열을 갖는 본 개시의 gRNA 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하되, mRNA는 서열번호 3129~3130으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 gRNA 변이체 스캐폴드 174(서열번호 1744)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 gRNA 변이체 스캐폴드 235(서열번호 1745)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 gRNA 변이체 스캐폴드 316(서열번호 1746)을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 서열번호 2968~2976의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열에 제시된 변형을 포함하여, 화학적 변형을 갖는 gRNA 변이체 스캐폴드 316을 포함한다. 특정 구현예에서, LNP는 dCasX 491(서열번호 4)을 포함하는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA, 및 서열번호 2968~2976 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 화학적 변형을 갖는 gRNA 변이체 316을, 화학적으로 변형된 서열번호 1824~2944의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 연결된 표적화 서열과 함께 포함한다. 특정 구현예에서, LNP는 dCasX 491(서열번호 4)를 포함하는 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA, 및 서열번호 2968의 서열을 포함하는 화학적 변형을 갖는 gRNA 변이체 스캐폴드 316을, 화학적으로 변형된 서열번호 1824~2944의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 연결된 표적화 서열과 함께 포함한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 변형될 세포는 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 및 비인간 영장류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 방법의 다른 구현예에서, 변형될 세포는 인간 세포이다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포 집단의 전사 억제는 대상체의 신체 내에서 이루어지며, 여기서 대상체는 설치류, 마우스, 랫트, 비인간 영장류, 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 변형된 세포는 간세포이거나, 장, 신장, 중추신경계의 세포, 평활근 세포, 대식세포, 또는 내피와 같은 동맥 벽의 세포이다.
LNP는 정맥내, 동맥내, 문맥내 주사, 복강내, 근육내, 뇌실내, 방광내, 경막내, 두개내, 요추내, 안구내, 피하, 및 경구 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
PCSK9 유전자를 억제하는 방법의 일부 구현예에서, 본 개시의 유전자 억제 시스템은 PCSK9 유전자의 임의의 영역 또는 이에 근접한 영역, 또는 전사를 억제하기 위한 PCSK9 유전자의 영역을 표적화하도록 설계될 수 있다. 유전자 전체를 억제할 때, 전사 시작 부위(TSS)를 포함하거나 이에 근접한 서열에 상보적인 표적화 서열을 갖는 가이드를 설계하는 것이 본 개시에 의해 고려된다. TSS 선택은 프로모터 서열 및 개시 기질 농도에 따라 프로모터 영역 내의 상이한 위치에서 발생한다. 코어 프로모터는 전사 기계를 위한 결합 플랫폼의 역할을 하고, Pol II 및 이의 연관된 일반 전사 인자(GTF)를 포함한다(Haberle, V. 등의 문헌[Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation (Nat Rev Mol Cell Biol. 19(10):621 (2018)]). TSS 선택에 있어서의 가변성으로 인해 DNA ‘스크런칭' 및 ‘반-스크런칭'을 포함시킬 것이 제안되었는데, 이의 특징은 (i) RNA 중합효소 선단 에지를 DNA에 대해 정방향 및 역방향으로 이동시키되, 후단 에지는 이동시키지 않음, 및 (ii) 전사 버블의 팽창 및 수축이다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 전사 시작 부위(TSS)로부터 1 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 TSS로부터 상류로 20 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 500 bps, 또는 1 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 TSS로부터 하류로 20 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 500 bps 또는 1 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 TSS로부터 상류로 500 bp 내지 하류로 500 bp, 또는 상류로 300 bp 내지 하류로 300 bp 이내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 인핸서로부터 20 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 500 bps, 또는 1 kb 이내에 있다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은 PCSK9 유전자의 5' 비번역 영역으로부터 3' 방향으로 1 kb 이내에 있다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 RNP에 의해 결합된 표적 핵산 서열은, 인트론(존재하는 경우)을 포함하여, PCSK9 유전자의 개방 해독 프레임 내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 엑손에 특이적이도록 설계된다. 특정 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 엑손 1에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 인트론에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 인트론-엑손 접합부에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 조절 요소에 특이적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 유전자간 영역의 서열에 상보적이도록 설계된다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 엑손, 인트론, 및/또는 조절 요소의 접합부에 특이적이다. 표적화 서열이 조절 요소에 특이적인 이들 경우에, 이러한 조절 요소는 프로모터 영역, 인핸서 영역, 유전자간 영역, 5' 비번역 영역(5' UTR), 3' 비번역 영역(3' UTR), 보존된 요소, 및 시스-조절 요소를 포함하는 영역을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 인핸서로부터 1 kb 이내에 있는 유전자 표적 핵산 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 gRNA의 표적화 서열은 PCSK9 유전자의 3' 비번역 영역 내에 있는 유전자 표적 핵산 서열에 상보적이다. 프로모터 영역은 암호화 서열의 개시점의 5 kb 이내에 있는 뉴클레오티드를 포함하도록 의도되거나, 유전자 인핸서 요소 또는 보존된 요소의 경우, PCSK9 유전자의 암호화 서열로부터 수천 bp, 수십만 bp, 또는 심지어 수백만 bp 떨어져 있을 수 있다. 전술한 것들에서, 표적은, PCSK9 유전자 산물이 세포에서 발현되지 않거나 더 낮은 수준으로 발현되도록 암호화 PCSK9 유전자가 억제 및/또는 후성적으로 변형되도록 의도되는 것들이다. 일부 구현예에서, 상기 시스템의 RNP가 표적 핵산의 결합 위치에 결합한 후, 상기 시스템은 RNP의 결합 위치에 대해 5'에 있는 PCSK9 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 시스템의 RNP가 표적 핵산의 결합 위치에 결합한 후, 상기 시스템은 RNP의 결합 위치에 대해 3'에 있는 PCSK9 유전자의 전사를 억제할 수 있다.
본원에 기술된 시스템 및 방법은 질환과 연관된 다양한 세포, 예를 들어, PCSK9 유전자가 억제되거나 침묵화되는 간, 장, 신장, 중추신경계의 세포, 평활근 세포, 대식세포, 또는 동맥 벽의 세포에 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 접근법은 다음과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 PCSK9-관련 장애를 가진 대상체에게 적용되도록 사용될 수 있다: 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH), 고콜레스테롤혈증, 총 콜레스테롤 수치 상승, 고지혈증, 저밀도 지단백질(LDL) 수치 상승, LDL-콜레스테롤 수치 상승, 고밀도 지단백질 수치 감소, 간 지방증, 관상 동맥 심장 질환, 허혈, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 혈전증, 2형 당뇨병, 혈압 상승, 죽상경화증, 비만, 알츠하이머병, 신경퇴행, 노인성 황반 변성(AMD), 또는 이들의 조합.
IX.
치료 방법
본 개시는 다음을 포함하되 이에 한정되지 않는 PCSK9-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 제공한다: 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH), 고콜레스테롤혈증, 총 콜레스테롤 수치 상승, 저밀도 지단백질(LDL) 수치 상승, 고밀도 지단백질 수치 감소, 간 지방증, 죽상경화성 심혈관 질환, 및 관상 동맥 심장 질환, 허혈, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 혈전증, 2형 당뇨병, 혈압 상승, 비만, 알츠하이머병, 신경퇴행, 노인성 황반 변성(AMD), 또는 이들의 조합. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 본 개시의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계에 의해 대상체의 PCSK9-관련 질환 또는 장애를 예방, 치료, 및/또는 완화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, PCSK9-관련 질환은 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH), 고콜레스테롤혈증, 총 콜레스테롤 수치 상승, 고지혈증, 저밀도 지단백질(LDL) 수치 상승, LDL-콜레스테롤 수치 상승, 고밀도 지단백질 수치 감소, 간 지방증, 관상 동맥 심장 질환, 허혈, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 혈전증, 2형 당뇨병, 혈압 상승, 죽상경화증, 비만, 대동맥 협착증, PCSK9 수치 상승, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함한다.
일부 경우에, 본 개시의 방법에 의해 치료될 대상체의 PCSK9 유전자는 야생형임에도 불구하고, 대상체는 고콜레스테롤혈증, 총 콜레스테롤 수치 상승, 고지혈증, 저밀도 지단백질(LDL) 수치 상승, LDL-콜레스테롤 수치 상승, 고밀도 지단백질 수치 감소, 간 지방증, 관상 동맥 심장 질환, 허혈, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 혈전증, 2형 당뇨병, 혈압 상승, 죽상경화증, 비만, 대동맥 협착증, PCSK9 수치 상승, 또는 이들의 조합을 갖는다. 일부 경우에, 본 개시의 방법은 본 개시의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계에 의해 대상체의 PCSK9-관련 질환 또는 장애를 예방, 치료, 및/또는 완화시킬 수 있다.
일부 경우에, 대상체의 PCSK9 유전자의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다는 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, PCSK9-관련 질환 또는 장애 돌연변이는, 서열번호 1823의 서열에 비해 S127R, D129G, F216L, D374H, 및 D374Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 기능 획득 돌연변이이다. 다른 경우에, PCSK9-관련 장애 돌연변이는, 서열번호 1823의 서열에 비해 R46L, G106R, Y142X, N157K, R237W, 및 C679X로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 기능 상실 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 PCSK9 또는 관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 대상체의 세포에서 PCSK9 유전자를 억제하거나 침묵화시키는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 i) 억제자 융합 단백질 및 gRNA를 포함하는 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템; ii) 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 억제자 융합 단백질 및 gRNA를 암호화하는 핵산; iii) 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA 및 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 LNP 또는 합성 나노입자; 또는 iv) (i) 내지 (iii) 중 둘 이상의 조합의 치료적 유효 투여량과 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA에 의해 표적화된 세포의 표적 핵산 서열은 억제자 융합 단백질에 의해 억제되거나 침묵화된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 세포를 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템과 접촉시키는 것은 표적화된 기관의 하나 이상의 세포의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 그 이상의 PCSK9 표적 핵산의 억제를 초래한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 표적화된 기관의 세포 내 PCSK9 유전자는, PCSK9 단백질의 발현이 미치료 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 감소되도록 억제된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 표적화된 기관의 세포를 억제자 융합 단백질:gRNA 시스템과 접촉시키는 것은 세포에서 PCSK9 표적 핵산의 유전성 억제를 초래한다. 치료된 대상체의 세포는 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 영장류 세포, 및 비인간 영장류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 진핵 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료된 대상체의 진핵 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 LDL의 생산에 관여하는 세포이며, 여기에는 간세포, 또는 장, 신장, 중추신경계의 세포, 평활근 세포, 대식세포, 망막 세포, 또는 내피와 같은 동맥 벽의 세포가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 눈 세포(eye cell)이다. 대상체에서 PCSK9-관련 장애를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 마우스, 랫트, 돼지, 비인간 영장류, 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PCSK9-관련 질환 또는 장애를 가진 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한 시스템을 설계하기 위해 다수의 치료 전략이 사용되어 왔다. 일부 구현예에서, 본 발명은 PCSK9 관련 질환 또는 장애를 가진 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효 투여량을 사용하여 1회 이상 연속 투여하는 것을 포함하는 치료 요법에 따라 억제자 융합 단백질:gRNA 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료 요법의 일부 구현예에서, 조성물의 치료적 유효 투여량은 단일 투여량으로서 투여된다. 치료 요법의 다른 구현예에서, 치료적 유효 투여량은 적어도 2주, 또는 적어도 1개월, 또는 적어도 2개월, 또는 적어도 3개월, 또는 적어도 4개월, 또는 적어도 5개월, 또는 적어도 6개월의 기간에 걸쳐 2회 이상의 투여량으로 대상체에게 투여된다. 치료 요법의 일부 구현예에서, 유효 투여량은 정맥내, 문맥내 정맥 주사, 복강내, 근육내, 피하, 안구내, 및 경구 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 PCSK9 관련 질환 또는 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 억제자 융합 단백질 및 본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 gRNA로 이루어진 시스템을 제공하며, 여기서 조성물의 치료적 유효 투여량이 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 표 20에 제시된 것과 같은 서열번호 3131~3132, 또는 이와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열의 억제자 융합 단백질; 표 9에 제시된 것과 같은 서열번호 1744~1746 또는 2947~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는 gRNA 스캐폴드를 포함하고, gRNA는 표 9에 제시된 것과 같은 1744~1746 및 서열번호 2947~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하고, gRNA는 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열로서, 15 내지 20개의 아미노산을 갖는 표적화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 서열, 또는 이와 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 LNP 제형으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 PCSK9 관련 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 의약을 제조하는 데 사용하기 위한 억제자 융합 단백질 및 gRNA의 조성물을 제공하며, 여기서 PCSK9의 억제는 질환의 완화 또는 질환 또는 장애와 연관된 증상 또는 임상 소견의 예방을 초래한다.
일부 구현예에서, PCSK9 관련 질환 또는 장애를 가진 대상체에게 억제자 융합 단백질:gRNA 요법의 치료적 유효량을 투여하여 PCSK9의 발현을 억제하거나 침묵화시키는 것은, 대상체가 여전히 기저 질환에 걸린 상태일 수 있음에도 불구하고 대상체에서 개선이 관찰되도록 기저 PCSK9 관련 장애 또는 장애를 예방 또는 완화를 초래한다. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 요법은 다음을 포함하는 LNP를 포함한다: gRNA 및 본원에 개시된 억제자 융합 단백질 및 가이드 리보핵산을 암호화하는 mRNA. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 요법의 치료적 유효량의 투여는 다음을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 임상적으로 관련 있는 평가변수의 개선을 초래한다: LDL-콜레스테롤의 베이스라인 대비 변화율, 플라크 죽종 부피의 감소, 관상 동맥 플라크의 감소, 죽상경화성 심혈관 질환(ASCVD)의 감소, 심혈관 사망, 비치명적 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 비치명적 뇌졸중, 관상 동맥 혈관 재형성, 불안정 협심증, 또는 시력. 일부 구현예에서, 억제자 융합 단백질:gRNA 요법의 치료적 유효량의 투여는 적어도 2개의 임상적으로 관련 있는 평가변수의 개선을 초래한다. 일부 구현예에서, 대상체는 마우스, 랫트, 돼지, 개, 비인간 영장류, 및 인간으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, 상기 치료 방법은 LDL 수준을 낮추는 데 효과적인 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 제제는 스타틴, 니아신, 피브레이트, 또는 항-PCSK9 항체 약물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
치료의 효과를 결정하는 분석을 위해 치료된 대상체로부터 체액 또는 조직과 같은 샘플을 수득하는 방법, 및 분석을 가능하게 하는 샘플의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. RNA 및 단백질 수준을 분석하는 방법은 위에서 논의되었고 당업자에게 잘 알려져 있다. 치료의 효과는 당업계에 공지된 일상적인 임상 방법에 의해, 본 개시의 하나 이상의 화합물과 접촉된 동물로부터 수집한 전술한 체액, 조직, 또는 기관에서 PCSK9 유전자 발현과 연관된 바이오마커를 측정함으로써 평가될 수도 있다. PCSK9 장애의 바이오마커는 PCSK9 수준, 저밀도 지단백질(LDL-콜레스테롤), 아포지질단백질 B, 비-HDL 콜레스테롤, 중성지방 및 지단백질 a, 가용성 CD40 리간드, 오스테오폰틴(OPN), 오스테오프로테게린(OPG), 기질 금속단백분해효소(MMP), 및 골수과산화효소(MPOP)를 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 여기서 마커의 농도는 생리학적으로 정상인 것으로 알려진 농도와 비교되거나 PCSK9 장애를 갖지 않은 대상체에서의 농도와 비교된다.
PCSK9의 돌연변이체 형태를 발현하는 여러 마우스 모델이 존재하며, 치료 방법을 평가하기에 적합하다. PCSK9 관련 장애의 유전자 이식 마우스 모델은 hPCSK9를 갖는 녹인 마우스 모델을 포함한다(Carr eras, A.의 문헌[In vivo genome and base editing of a human PCSK9 knock-in hypercholesterolemic mouse model. MC Biology 17:4 (2019)]; Herbert B. 등의 문헌[Increased secretion of lipoproteins in transgenic mice expressing human D374Y PCSK9 under physiological genetic control. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30(7):1333 (2010)]).
일부 구현예에서, 대상체에서 PCSK9 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 간 LDL 수용체(LDLR) 발현을 증가시키는 치료제로 대상체를 전치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 단클론 항체, 핵산계 제제, 또는 소분자와 같은 PCSK9 억제제이다. 예시적인 치료제는 에볼로쿠맙(evolocumab), 인클리시란(inclisiran), 알리로쿠맙(alirocumab), 및 MK-0616을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이론 또는 메커니즘에 구속되고자 하는 것은 아니지만, PCSK9의 억제제를 이용한 전치료는 간 LDL 수용체(LDLR) 발현의 증가를 초래할 수 있고, 이는 궁극적으로 대상체에게 후속 투여되는 CasX:gRNA 조성물을 포함하는 LNP의 흡수를 용이하게 할 수 있는 것으로 여겨진다. LNP의 간 세포 흡수를 증가시킴으로써, PCSK9 관련 장애의 개선이 달성되도록 PCSK9 유전자의 편집이 향상될 것으로 예상된다.
X.
약학적 조성물, 키트, 및 제조 물품
일부 구현예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다: i) 억제자 융합 단백질 및 PCSK9 유전자에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 본 개시의 gRNA; ii) (i)의 억제자 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산; iii) gRNA 및 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA를 하나 이상의 약학적으로 적합한 부형제와 함께 포함하는 포함하는 LNP 또는 합성 나노입자. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 정맥내, 문맥내 정맥 주사, 복강내, 근육내, 피하, 안구내, 및 경구 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로에 맞게 제형화된다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 액체 형태 또는 동결 형태이다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 단일 주사용으로 사전 충진식 주사기에 담긴다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 고형분 형태이고, 예를 들어 약학적 조성물은 동결건조된다.
다른 구현예에서, 다음을 포함하는 키트가 제공된다: 억제자 융합 단백질; PCSK9 유전자에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 1개의 또는 복수의 CasX gRNA; 및 적절한 용기(예: 튜브, 바이알, 또는 플레이트).
다른 구현예에서, 다음을 포함하는 키트가 제공된다: 억제자 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 및 PCSK9 유전자에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 1개의 또는 복수의 CasX gRNA이 캡슐화된 LNP 조성물; 및 적절한 용기(예: 튜브, 바이알, 또는 플레이트). 예시적인 구현예에서, 본 개시의 키트는 본원에 개시된 억제자 융합 단백질 중 어느 하나 및 서열번호 1744~1746 및 2947~2976 중 어느 하나의 gRNA 스캐폴드를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 벡터를 포함하되, gRNA는 표 7에 제시된 것과 같은 서열번호 1744~1746 및 2947~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 스캐폴드 서열, 및 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA 스캐폴드는 표 7에 제시된 것과 같은 서열번호 2948~2956, 2958~2966, 및 2968~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 및 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA 스캐폴드는 서열번호 2948~2956, 2958~2966, 및 2968~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 및 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 다음을 포함하는 키트가 본원에 제공된다: 본원에 개시된 억제자 융합 단백질 중 어느 하나, 및 표 9에 제시된 것과 같은 1744~1746으로 이루어진 군으로부터 선택된 스캐폴드 서열을 포함하는 gRNA 변이체를 포함하는, 억제자 융합 단백질 및 gRNA 억제자 쌍; 및 표 7에 제시된 것과 같은 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 서열. 일부 구현예에서, 유전자 억제 쌍의 gRNA는 표 7에 제시된 것과 같은 서열번호 2947~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 스캐폴드 서열 및 서열번호 1824~2944 중 어느 하나의 표적화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 억제 쌍의 gRNA는 서열번호 2948~2956, 2958~2966, 및 2968~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 스캐폴드 서열, 및 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 완충액, 뉴클레아제 억제제, 프로테아제 억제제, 리포솜, 치료제, 표지, 표지 시각화 시약, 사용 지침, 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 유전자 억제 적용을 위한 적절한 대조군 조성물, 및 사용 지침을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본 개시의 억제자 융합 단백질 및 본 개시의 CasX gRNA를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터를 포함한다.
다음의 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어떤 방식으로도 본 개시의 임의의 양태를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 인간 세포에서
PCSK9
를 억제하기 위한 억제자 융합 단백질의 용도
염색질 리모델링 인자 및 DNA 메틸전이효소를 CasX에 융합하여 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것은 특정 질환 및 장애와 연관된 단백질의 발현을 감소시키기 위한 통상적인 유전자 편집에 대한 대안적인 접근법이다. 영구 게놈 편집을 사용하지 않고 PCSK9 수준을 감소시키기 위해 실험을 수행하여, HepG2 세포에서 장기 억제자 단백질(LTRP, 본원에서 억제자 융합 단백질로서 상호 교환적으로 지칭됨)을 일시적으로 발현시켰다.
물질 및 방법:
스페이서(표적화 서열로도 지칭됨) 설계: TTC PAM 서열의 가용성에 기초하여 PCSK9 프로모터로부터 상류로 1KB에서 PCSK9 엑손 1까지의 스페이서를 수동으로 선택하였다. 인트론 1, 엑손 5, 및 인트론 5에 있는 스페이서는 인간 간에서 저메틸화된 것으로 식별된 영역에서 TTC PAM의 가용성에 기초하여 선택하였다.
(도 1에 도시된 바와 같은) #1 구성을 갖는 LTRP 단백질을 암호화하는 서열, 가이드 스캐폴드 변이체 174, 및 표 10에 열거된 PCSK9-표적화 스페이서를 포함하는 렌티바이러스 플라스미드 작제물을 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다. 클로닝되고 서열 검증된 작제물을 미디프렙(midi-prep)으로 정제하고 품질 평가를 실시한 후 HepG2 세포에 형질감염시켰다. 플라스미드 작제물을 제조사의 지침에 따라 Viafect 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시켰다.
10% FBS 및 1% Pen/Strep이 보충된 DMEM F/12 배지에서 HepG2를 성장시키고, 성장 단계에서 유지시켰다.
Zymo Quick-RNA 키트를 사용하여 mRNA를 단리하고, 제조사의 지침에 따라 Thermo High-Capacity RNA-to-cDNA™ 키트를 사용하여 역전사를 수행하였다.
분비된 PCSK9 및 인간 혈청 알부민 수준을 PerkinElmer/Cisbio cat#63ADK050PEH 및 HSA ELISA: Perkin Elmer/Cisbio cat#6FHSAPEG를 통해 각각 평가하였다.
| 스페이서 ID | PAM | 스페이서 DNA 서열 | 서열번호 | 스페이서 RNA 서열 | 서열번호 |
표적화
영역 |
| 6.1 | TTC | GAGGAGGACGGCCTGGCCGA | 2977 | GAGGAGGACGGCCUGGCCGA | 1834 | 엑손 1 |
| 6.4 | TTC | GCCAGGCCGTCCTCCTCGGA | 2978 | GCCAGGCCGUCCUCCUCGGA | 1836 | 엑손 1 |
| 6.5 | TTC | GTGCTCGGGTGCTTCGGCCA | 2979 | GUGCUCGGGUGCUUCGGCCA | 1837 | 엑손 1 |
| 6.112 | TTC | CTTGGCAGTTGAGCACGCGC | 2980 | CUUGGCAGUUGAGCACGCGC | 2223 | 엑손 5 |
| 6.117 | TTC | ACTTTGTTTGCAAAGACCTC | 2981 | ACUUUGUUUGCAAAGACCUC | 1838 | 프로모터 |
| 6.118 | TTC | GAGTGAAATGGCCTGCTCTG | 2982 | GAGUGAAAUGGCCUGCUCUG | 1839 | 프로모터 |
| 6.119 | TTC | GAGCAGGCCATTTCACTCGG | 2983 | GAGCAGGCCAUUUCACUCGG | 1840 | 프로모터 |
| 6.120 | TTC | CTCGGAATCTGCTGTGCATC | 2984 | CUCGGAAUCUGCUGUGCAUC | 1841 | 프로모터 |
| 6.121 | TTC | GGAAGGGCTGTCGATACTGG | 2985 | GGAAGGGCUGUCGAUACUGG | 1842 | 프로모터 |
| 6.122 | TTC | CCTTTGTTTCTTCCCAGTAT | 2986 | CCUUUGUUUCUUCCCAGUAU | 1883 | 프로모터 |
| 6.123 | TTC | TCCCAGTATCGACAGCCCTT | 2987 | UCCCAGUAUCGACAGCCCUU | 1843 | 프로모터 |
| 6.124 | TTC | CAGTATCGACAGCCCTTCCA | 2988 | CAGUAUCGACAGCCCUUCCA | 1844 | 프로모터 |
| 6.125 | TTC | AGAAAGAGCAAGCCTCATGT | 2989 | AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU | 1845 | 프로모터 |
| 6.126 | TTC | CCTTTTCATCCTCCTGCCTG | 2990 | CCUUUUCAUCCUCCUGCCUG | 2672 | 프로모터 |
| 6.127 | TTC | TCCTCCTGCCTGGTACACAA | 2991 | UCCUCCUGCCUGGUACACAA | 1884 | 프로모터 |
| 6.128 | TTC | AGAAATCAACTGGACAAGCA | 2992 | AGAAAUCAACUGGACAAGCA | 1846 | 프로모터 |
| 6.129 | TTC | TTTTACACACCATGTTCAAG | 2993 | UUUUACACACCAUGUUCAAG | 2675 | 프로모터 |
| 6.130 | TTC | ATTTGCAAAGATTCCTTTTA | 2994 | AUUUGCAAAGAUUCCUUUUA | 2677 | 프로모터 |
| 6.131 | TTC | TGAACATGGTGTGTAAAAGG | 2995 | UGAACAUGGUGUGUAAAAGG | 1847 | 프로모터 |
| 6.132 | TTC | AGAAGATTCAATTTGCAAAG | 2996 | AGAAGAUUCAAUUUGCAAAG | 1848 | 프로모터 |
| 6.133 | TTC | ATGGTAGGCACAAGCTCAGC | 2997 | AUGGUAGGCACAAGCUCAGC | 1849 | 프로모터 |
| 6.134 | TTC | GAATTCTATGGTAGGCACAA | 2998 | GAAUUCUAUGGUAGGCACAA | 1850 | 프로모터 |
| 6.135 | TTC | GGAAAGCTGAGCTTGTGCCT | 2999 | GGAAAGCUGAGCUUGUGCCU | 1851 | 프로모터 |
| 6.136 | TTC | GGTTTTAAGTTTGCAAAGAC | 3000 | GGUUUUAAGUUUGCAAAGAC | 2683 | 프로모터 |
| 6.137 | TTC | GAATGTACCTATATGACGTC | 3001 | GAAUGUACCUAUAUGACGUC | 1885 | 프로모터 |
| 6.138 | TTC | AGGGATTTATACTACAAAGA | 3002 | AGGGAUUUAUACUACAAAGA | 1852 | 프로모터 |
| 6.139 | TTC | AGGAGCAGCTAGTTGGTAAG | 3003 | AGGAGCAGCUAGUUGGUAAG | 1853 | 프로모터 |
| 6.140 | TTC | AAACTTAGCCTGGACCCCCT | 3004 | AAACUUAGCCUGGACCCCCU | 1854 | 프로모터 |
| 6.141 | TTC | ACTGGCCTTAACCTGGCAGC | 3005 | ACUGGCCUUAACCUGGCAGC | 1855 | 프로모터 |
| 6.142 | TTC | TTCCACTGGCCTTAACCTGG | 3006 | UUCCACUGGCCUUAACCUGG | 1856 | 프로모터 |
| 6.143 | TTC | GAATCAATCCTACTGTGGAC | 3007 | GAAUCAAUCCUACUGUGGAC | 1857 | 프로모터 |
| 6.144 | TTC | GTGGGCAGCGAGGAGTCCAC | 3008 | GUGGGCAGCGAGGAGUCCAC | 1858 | 프로모터 |
| 6.145 | TTC | TGGGTCCACCTTGTCTCCTG | 3009 | UGGGUCCACCUUGUCUCCUG | 1859 | 프로모터 |
| 6.146 | TTC | GAAGTCTCACTGGTCAGCAG | 3010 | GAAGUCUCACUGGUCAGCAG | 1860 | 프로모터 |
| 6.147 | TTC | GTGTTTCCTGGGTCCACCTT | 3011 | GUGUUUCCUGGGUCCACCUU | 1861 | 프로모터 |
| 6.148 | TTC | GCCGGGCCCACCTTTTCAGT | 3012 | GCCGGGCCCACCUUUUCAGU | 2694 | 프로모터 |
| 6.149 | TTC | AGCCCAGTTAGGATTTGGGA | 3013 | AGCCCAGUUAGGAUUUGGGA | 1862 | 프로모터 |
| 6.150 | TTC | TCCCTCTGCGCGTAATCTGA | 3014 | UCCCUCUGCGCGUAAUCUGA | 1863 | 프로모터 |
| 6.151 | TTC | CTCTGCGCGTAATCTGACGC | 3015 | CUCUGCGCGUAAUCUGACGC | 1864 | 프로모터 |
| 6.152 | TTC | GCCTCGCCCTCCCCAAACAG | 3016 | GCCUCGCCCUCCCCAAACAG | 1865 | 프로모터 |
| 6.153 | TTC | GTTAATGTTTAATCAGATAG | 3017 | GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG | 1866 | 프로모터 |
| 6.154 | TTC | AGGGTGTGGGTGCTTGACGC | 3018 | AGGGUGUGGGUGCUUGACGC | 1867 | 프로모터 |
| 6.155 | TTC | GCAGCGACGTCGAGGCGCTC | 3019 | GCAGCGACGUCGAGGCGCUC | 1868 | 엑손 1 |
| 6.156 | TTC | GTTCAGGGTCTGAGCCTGGA | 3020 | GUUCAGGGUCUGAGCCUGGA | 2702 | 엑손 1 |
| 6.157 | TTC | GGGTCTGAGCCTGGAGGAGT | 3021 | GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU | 1869 | 엑손 1 |
| 6.158 | TTC | GGAGCAGGGCGCGTGAAGGG | 3022 | GGAGCAGGGCGCGUGAAGGG | 1870 | 엑손 1 |
| 6.159 | TTC | GCGCGCCCCTTCACGCGCCC | 3023 | GCGCGCCCCUUCACGCGCCC | 1871 | 엑손 1 |
| 6.160 | TTC | CGCGCCCTGCTCCTGAACTT | 3024 | CGCGCCCUGCUCCUGAACUU | 1872 | 엑손 1 |
| 6.161 | TTC | GCTCCTGCACAGTCCTCCCC | 3025 | GCUCCUGCACAGUCCUCCCC | 1873 | 엑손 1 |
| 6.167 | TTC | CACTGAATAGCGCAGCCGCA | 3026 | CACUGAAUAGCGCAGCCGCA | 1874 | 인트론 1 |
| 6.168 | TTC | GTGGGAAGGTTCGCGGGGTT | 3027 | GUGGGAAGGUUCGCGGGGUU | 1875 | 인트론 1 |
| 6.169 | TTC | CGGGGTTGGGAGACCCGGAG | 3028 | CGGGGUUGGGAGACCCGGAG | 1876 | 인트론 1 |
| 6.170 | TTC | TCGGCCTCCGGGTCTCCCAA | 3029 | UCGGCCUCCGGGUCUCCCAA | 1877 | 인트론 1 |
| 6.171 | TTC | CAGTACGTTCCAGGCATTCA | 3030 | CAGUACGUUCCAGGCAUUCA | 1878 | 인트론 1 |
| 6.172 | TTC | GCTGAAACAGATGGAATACT | 3031 | GCUGAAACAGAUGGAAUACU | 1879 | 인트론 1 |
| 6.173 | TTC | ATCTGTTTCAGCCGAAGAAA | 3032 | AUCUGUUUCAGCCGAAGAAA | 1922 | 인트론 1 |
| 6.174 | TTC | TTTCTTCGGCTGAAACAGAT | 3033 | UUUCUUCGGCUGAAACAGAU | 1923 | 인트론 1 |
| 6.175 | TTC | GCCGAAGAAAAGAACCAGCT | 3034 | GCCGAAGAAAAGAACCAGCU | 1924 | 인트론 1 |
| 6.176 | TTC | CGAGGCCCATTGGCGTCCTT | 3035 | CGAGGCCCAUUGGCGUCCUU | 1926 | 인트론 1 |
| 6.177 | TTC | TCTCACTAGCTGTGGTGCTT | 3036 | UCUCACUAGCUGUGGUGCUU | 1934 | 인트론 1 |
| 6.178 | TTC | GTTGACCATGAGTGAACTTA | 3037 | GUUGACCAUGAGUGAACUUA | 1938 | 인트론 1 |
| 6.179 | TTC | CTGGCTCTGCGGCAGAGGCT | 3038 | CUGGCUCUGCGGCAGAGGCU | 2225 | 인트론 5 |
| 6.180 | TTC | TCTGCACTCGTGGCCACTGG | 3039 | UCUGCACUCGUGGCCACUGG | 2226 | 인트론 5 |
| 6.181 | TTC | TCATCTGCACTCGTGGCCAC | 3040 | UCAUCUGCACUCGUGGCCAC | 2228 | 인트론 5 |
| 6.182 | TTC | AGACTGTGACTACATTTAGT | 3041 | AGACUGUGACUACAUUUAGU | 2235 | 인트론 5 |
| 6.183 | TTC | TCAACTATTTAGCAGCTACG | 3042 | UCAACUAUUUAGCAGCUACG | 2240 | 인트론 5 |
| 6.184 | TTC | CAGCGAGTTCCCCAGCTTGA | 3043 | CAGCGAGUUCCCCAGCUUGA | 2242 | 인트론 5 |
| 6.185 | TTC | GCCCTGAGACTTTCCTACAG | 3044 | GCCCUGAGACUUUCCUACAG | 2246 | 인트론 5 |
| 6.186 | TTC | GCCCCATCAGGTGACCCCTT | 3045 | GCCCCAUCAGGUGACCCCUU | 2248 | 인트론 5 |
| 6.187 | TTC | GGAACTGACCTGACTGAGCC | 3046 | GGAACUGACCUGACUGAGCC | 2249 | 인트론 5 |
결과:
HepG2 세포를 표 10에 열거된 표적화 스페이서가 포함된 구성 #1의 LTRP 융합 단백질로 일시적으로 형질감염시키고, 이어서 푸로마이신으로 선택하였다. 푸로마이신-내성 세포를 배양물에서 증식시켰다. 4주의 배양 후, 배지를 수집하여 분비된 PCSK9 수준을 측정하고, mRNA를 분석하였다. 분비된 PCSK9 수준을 분비된 인간 혈청 알부민에 대해 정규화하여 상이한 웰에서 세포 수의 차이에 대해 조절하였다. 그 결과는 도 3에 점 도표로서 제시되어 있다. 비표적화(NT) 대조군과 비교하여, 작제물의 약 60%는 PCSK9 mRNA 및 단백질 수준의 감소를 나타낸 반면, 작제물의 약 20%는 PCSK9를 50% 초과만큼 억제하였다.
실시예 2: LTRP 융합 단백질의 사용이 마우스 Hepa 1~6 세포에서 내인성
PCSK9
유전자좌의 침묵화를 유도할 수 있음의 입증
표적화 gRNA로 공동 형질감염된 mRNA로서 전달될 때, 마우스 Hepa 1~6 간 세포에서 LTRP 융합 단백질이 내인성 PCSK9 유전자좌의 지속적인 억제를 유도하는 능력을 입증하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
실험 #1: mRNA로서 전달될 때 Hepa1~6 세포에서 dXR1 대 LTRP #1
dXR1 및 LTRP #1 mRNA의 생성:
dXR1, ZIM3-KRAB 도메인에 융합된 dCasX 또는 ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP #1(도 1의 구성 #1)(이하 각각 dXR1 및 LTRP1-ZIM3으로서 알려짐)을 암호화하는 mRNA을 자체적으로 또는 제3자를 통해 시험관 내 전사(IVT)에 의해 생성하였다. 간략하게, 5' UTR 영역, SV40 NLS가 측면에 위치하고 ZIM3-KRAB 도메인을 보유하는 dXR1 또는 LTRP1-ZIM3, 및 3' UTR 영역을 암호화하는 작제물을 생성하고, T7 프로모터 및 80-뉴클레오티드 폴리(A) 꼬리를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이들 작제물은 2x FLAG 서열도 함유하였다. 공개적으로 이용 가능한 다양한 코돈 최적화 도구를 사용하고 필요에 따라 GC 함량과 같은 파라미터를 조정하는 것에 추가하여, 코돈 이용 테이블을 사용하여, dXR1 및 LTRP1-ZIM3 분자를 암호화하는 서열을 코돈 최적화하였다. 자체적으로 시험관 내 전사(IVT)하는 경우, 생성된 플라스미드를 CleanCap® AG 및 N1-메틸-슈도피리딘을 이용해 수행되는 IVT 반응에 사용하기 전에 선형화하였다. 그런 다음, IVT 반응물을 DNase로 분해하고 온-컬럼 올리고 dT로 정제하였다. 실험 #1의 경우, dXR1 및 LTRP1-ZIM3 분자를 암호화하는 DNA 서열은 표 11에 열거되어 있다. dXR1 및 LTRP1-ZIM3 mRNA를 암호화하는 상응하는 mRNA 서열은 표 12에 열거되어 있다. dXR1 및 LTRP1-ZIM3의 단백질 서열은 표 13에 나타나 있다.
| dXR 또는 LTRP ID | 성분 |
DNA 서열 또는
서열번호 |
| dXR1 (코돈 최적화됨) | 5'UTR | 3047 |
| 시작 코돈 + NLS + 링커 | 3048 | |
| dCasX491 | 3049 | |
| 링커 + 완충 서열 | 3050 | |
| ZIM3-KRAB | 3051 | |
| 완충 서열 + NLS | 3052 | |
| 태그 | 3053 | |
| 종결 코돈 + 완충 서열 | 3054 | |
| 3' UTR | 3055 | |
| 완충 서열 | TCTAG | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3057 | |
| LTRP #1 (코돈 최적화됨) | 5' UTR | 3047 |
| 시작 코돈 + NLS + 완충 서열 + 링커 | 3058 | |
| 시작 코돈 + DNMT3A 촉매 도메인 | 3059 | |
| 링커 | 3060 | |
| DNMT3L 상호작용 도메인 | 3061 | |
| 링커 | 3062 | |
| dCasX491 | 3049 | |
| 링커 | 3050 | |
| ZIM3-KRAB | 3051 | |
| 완충 서열 + NLS | 3052 | |
| 태그 | 3053 | |
| 종결 코돈 + 완충 서열 | 3054 | |
| 3' UTR | 3055 | |
| 완충 서열 | TCTAG | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3057 | |
| *성분은 작제물 내에서 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있음 | ||
| dXR 또는 LTRP ID | 아미노산 서열 서열번호 |
| dXR1 | 3065 |
| LTRP #1 | 3066 |
gRNA의 합성:
실험 #1에서, gRNA 스캐폴드 174를 사용하여 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 gRNA를 설계하고 (아래 실시예 7에 기술된 것과 같은) v1 변형 프로파일을 사용해 화학적으로 합성하였다. 스페이서를 PCSK9 프로모터에 근접하게 설계하였다. PCSK9 표적화 스페이서 및 생성된 화학적으로 변형된 gRNA의 서열은 표 14에 열거되어 있다.
| 본 실시예에 사용된 PCSK9 유전자좌 및 화학적으로 변형된 gRNA를 표적화하는 스페이서의 서열. 화학적 변형: * = 포스포로티오에이트 결합; m = 2'OMe 변형. | |||||
| gRNA ID (스캐폴드-변이체 스페이서) | 표적 | 표적화 스페이서 서열(RNA) | 서열번호 | 전체 gRNA 서열(RNA) | 서열번호 |
| 174-6.7 | 인간 PCSK9 | UCCUGGCUUCCUGGUGAAGA | 2008 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3074 |
| 174-27.1 | 마우스 PCSK9 | GCCUCGCCCUCCCCAGACAG | 3067 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGCCUCGCCCUCCCCAGAmC*mA*mG | 3075 |
| 174-27.88 | 마우스 PCSK9 | CGCUACCUGCCUAAACUUUG | 3068 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCGCUACCUGCCUAAACUmU*mU*mG | 3076 |
| 174-27.92 | 마우스 PCSK9 | CCCUCCAACAAUAUUAACUA | 3069 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCCCUCCAACAAUAUUAAmC*mU*mA | 3077 |
| 174-27.93 | 마우스 PCSK9 | GGGGUCUCCCAGCCACCCCU | 3070 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGGGUCUCCCAGCCACCmC*mC*mU | 3078 |
| 174-27.94 | 마우스 PCSK9 | CCCCUCUUAAUCCCCACUCC | 3071 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCCCCUCUUAAUCCCCACmU*mC*mC | 3079 |
| 174-27.100 | 마우스 PCSK9 | CUCUCUCUUUCUGAGGCUAG | 3072 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGCUCUCUCUUUCUGAGGCmU*mA*mG | 3080 |
| 174-27.103 | 마우스 PCSK9 | UAAUCUCCAUCCUCGUCCUG | 3073 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUAAUCUCCAUCCUCGUCmC*mU*mG | 3081 |
mRNA 및 gRNA의 Hepa1-6 세포 내로의 형질감염 및 세포내 PCSK9 염색:
NATE™ 억제제로 치료한 시딩된 Hepa1-6 세포에 dXR1 또는 LTRP1-ZIM3을 암호화하는 300 ng의 mRNA(표 12) 및 150 ng의 PCSK9-표적화 gRNA(표 14)를 리포펙션하였다. 인간 PCSK9 유전자에 상보적인 비표적화 서열에 추가하여, 마우스 PCSK9 유전자좌의 프로모터 영역에 걸쳐 있는 7개의 상이한 gRNA를 시험하였다(표 14). 형질감염 후 6, 13, 및 25일차에 세포를 수확하고, 세포내 유세포 계측 염색 프로토콜을 사용하여 PCSK9 단백질의 세포내 수준을 측정하였다. 간략하게, 4% 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 PBS에 고정시키고, 투과화시키고, 마우스 항-PCSK9 일차 항체(R&D Systems)를 사용하여 염색한 다음, 형광 염소 항-마우스 IgG 이차 항체(Thermo Fisher)로 염색하였다. Attune™ NxT 유세포 분석기를 사용하여 형광 수준을 측정하고, FlowJo™ 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 비표적화 gRNA를 음성 대조군으로 사용하여 세포 집단을 게이팅하였다.
실험 #2: mRNA로서 전달될 때 Hepa1~6 세포에서의 LTRP #1대 LTRP #5
mRNA의 생성:
ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP #1 또는 LTRP #5(도 1의 구성 #5)(이하 각각 LTRP1-ZIM3 또는 LTRP5-ZIM3으로 알려짐; 구성은 도 1에 도시되어 있음)를 암호화하는 mRNA를 플라스미드 기반 PCR 템플릿을 사용하여 자체적으로 IVT에 의해 생성하였다. 간략하게, T7 프로모터를 함유하는 정방향 프라이머 및 120-뉴클레오티드 폴리(A) 꼬리를 암호화하는 역방향 프라이머를 갖는 NLS가 측면에 위치하고, ZIM3-KRAB 도메인을 보유하는 LTRP #1 또는 LTRP #5를 암호화하는 플라스미드를 이용해 PCR을 수행하였다. 이들 작제물은 2x FLAG 서열도 함유하였다. 이들 분자를 암호화하는 DNA 서열은 표 15에 열거되어 있다. 생성된 PCR 템플릿을, CleanCap® AG 및 N1-메틸-슈도피리딘을 이용해 수행한 IVT 반응에 사용하였다. 그런 다음, IVT 반응물을 DNase로 분해하고 온-컬럼 올리고 dT로 정제하였다. LTRP mRNA를 암호화하는 전장 RNA 서열은 표 16에 열거되어 있다.
실험 대조군으로서, 촉매적으로 활성인 CasX 491을 암호화하는 mRNA도 기술된 바와 같은 PCR 템플릿을 사용하여 IVT에 의해 유사하게 생성하였다. LTRP1-ZIM3 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L(ZNF10-KRAB 도메인 및 DNMT3A/L 도메인 둘 다에 융합된 촉매적으로 사멸한 Cas9)을 암호화하는 mRNA의 생성은 실험 #1에 대해 전술한 것과 같이 제3자가 IVT에 의해 수행하였다.
| 본 실시예의 실험 #2에서 평가된 LTRP1-ZIM3 및 LTRP5-ZIM3 mRNA 분자의 암호화 서열* | ||
| LTRP ID | 성분 |
DNA 서열
서열번호 |
| LTRP #1 - ZIM3-KRAB | 5'UTR | 3082 |
| 시작 코돈 + NLS + 링커 | 3083 | |
| 시작 코돈 + DNMT3A 촉매 도메인 | 3084 | |
| 링커 | 3085 | |
| DNMT3L 상호작용 도메인 | 3086 | |
| 링커 | 3087 | |
| 링커 + 완충액 | 3088 | |
| dCasX491 | 3089 | |
| 링커 + 완충액 | 3090 | |
| ZIM3-KRAB | 3091 | |
| 완충액 + NLS | 3092 | |
| 태그 | 3093 | |
| 완충액 | 3094 | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3095 | |
| LTRP #5 - ZIM3-KRAB | 5' UTR | 3082 |
| 시작 코돈 + NLS + 완충액 | 3096 | |
| 시작 코돈 + DNMT3A 촉매 도메인 | 3084 | |
| 링커 | 3085 | |
| DNMT3L 상호작용 도메인 | 3086 | |
| 링커 | 3097 | |
| ZIM3-KRAB | 3091 | |
| 링커 | 3087 | |
| dCasX491 | 3089 | |
| 링커 + 완충액 | 3090 | |
| NLS | 3098 | |
| 태그 | 3093 | |
| 완충액 | 3094 | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3095 | |
| *성분은 작제물 내에서 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있음 | ||
실험 #2의 경우, PCSK9-표적화 gRNA의 합성을 실험 #1에 대해 전술한 바와 같이 수행하였고, 표적화 스페이서의 서열은 표 14에 열거되어 있다. dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L과 쌍을 형성하기 위한 표적화 스페이서는 다음과 같았다: 1) 7.148 (비표적화 대조군으로서의 B2M; CGCGAGCACAGCUAAGGCCA; 서열번호 3101), 27.126 (PCSK9; CACGCCACCCCGAGCCCCAU; 서열번호 3102), 및 27.128 (PCSK9; CAGCCUGCGCGUCCACGUGA; 서열번호 3103).
mRNA 및 gRNA의 Hepa1-6 세포 내로의 형질감염 및 세포내 PCSK9 염색:
NATE™ 억제제로 치료한 시딩된 Hepa1~6 세포에 LTRP1-ZIM3, LTRP5-ZIM3, 촉매적으로 활성인 CasX 491, 또는 dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L을 암호화하는 300 ng의 mRNA 및 150 ng의 PCSK9-표적화 gRNA를 리포펙션하였다(표 14). 형질감염 후 7, 14, 21, 36, 및 71일차에 실험 #1에 대해 전술한 바와 같은 세포내 염색 프로토콜을 사용하여 PCSK9 단백질의 세포내 수준을 측정하였다.
결과:
실험 #1에서, dXR1 또는 LTRP1-ZIM3을 암호화하는 mRNA를 PCSK9-표적화 gRNA와 함께 마우스 Hepa1~6 세포 내로 공동 형질감염시켜 마우스 PCSK9 유전자좌를 침묵화함으로써 PCSK9 녹다운을 유도하는 이들의 능력을 평가하였다. 생성된 PCSK9 녹다운의 정량화는 도 4~6에 도시되어 있다. 데이터는, 6일차에, 마우스 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 7개의 gRNA를 LTRP1-ZIM3 mRNA와 함께 사용한 결과 이중 6개가 세포내 PCSK9의 >50%를 녹다운시켰고, 선도 스페이서 27.94는 >80% 억제 수준을 달성하였음을 입증한다(도 4). 6일차에 dXR1 mRNA를 사용했을 때에도 유사한 경향이 관찰되었지만, 스페이서 27.92 및 27.100과 같은 특정 스페이서와 쌍을 형성했을 때의 억제 정도는 더 적었다(도 4). 결과는 또한, LTRP1-ZIM3 mRNA를 사용했을 때 적어도 25일 동안 PCSK9 유전자좌의 억제가 지속되었으며, 상위 2개의 스페이서 27.94 및 27.88을 사용했을 때 PCSK9를 침묵화하는 데 있어서 가장 강력한 영속성이 나타남을 입증한다(도 6). 그러나, 6일차에 관찰된 dXR1에 의해 매개된 PCSK9 억제는 13일차에 비표적화 대조군(스페이서 6.7)을 사용했을 때 검출된 것과 유사한 수준의 PCSK9로 복귀하였는데; 이러한 일시적인 억제는 PCSK9 유전자를 표적화하여 검정한 모든 gRNA에 대해 두드러졌다(도 5).
실험 #2에서, LTRP1-ZIM3 똔 ㄴLTRP5-ZIM3, dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L, 또는 촉매적으로 활성인 CasX 491을 암호화하는 mRNA를 PCSK9-표적화 gRNA와 함께 마우스 Hepa1~6 세포 내로 공동 형질감염시켜 마우스 PCSK9 유전자좌를 침묵화함으로써 PCSK9 녹다운을 유도하는 이들의 능력을 평가하였다. 생성된 PCSK9 억제의 정량화는 도 7~8에 도시되어 있다. 데이터는, IVT에 의해 생성된 LTRP1-ZIM3 또는 LTRP5-ZIM3 mRNA의 전달이 상위 스페이서 27.94를 갖는 표적화 gRNA와 쌍을 형성할 때 유사한 수준의 지속적인 PCSK9 녹다운을 야기한 반면(71일차까지 약 40% 녹다운), 대안적인 스페이서 27.88의 사용은 71일차까지 지속적인 PCSK9 녹다운의 효과를 나타내지 않았음(약 12%)을 입증한다(도 7). 또한, LTRP1-ZIM3 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L을 암호화하는 제3자 생성 mRNA는 다양한 스페이서를 함유하는 gRNA와 쌍을 형성했을 때 유사한 수준의 지속적인 PCSK9 녹다운을 야기하였고, 스페이서 27.94를 사용했을 때에는 가장 높은 수준의 PCSK9 억제를 야기하였다(도 8).
이들 실험은 상이한 구성을 갖는 LTRP 분자가 마우스 간 세포주에서 내인성 유전자좌의 유전성 침묵화를 유도할 수 있음을 입증한다. 한편, 예상대로, dXR 작제물의 사용한 결과 초기 시점에 표적 유전자좌가 효율적으로 억제되었지만, 이들의 사용이 침묵화를 지속시키지는 않는다. 이들 소견은 또한, (상이한 구성의) dXR 및 LTRP 분자가 mRNA로서 전달될 수 있고, 표적화 gRNA와 함께 세포에 공동 형질감염될 수 있음을 보여주는데, 이는 전달된 페이로도의 일시적인 성질이 침묵화를 유도하기에 여전히 충분함을 나타낸다.
실시예 3: LTRP5-ADD 분자와 쌍을 형성할 때, 인간 간세포에서
PCSK9
유전자좌의 억제를 달성하는 데 있어서 스페이서의 평가
TTC 인식 모티프를 갖는 다수의 스페이서가 ADD 도메인을 함유하는 구성 #5(LTRP5; 도 2에 도시됨)에서 LTRP 분자와 쌍을 형성할 때, 인간 세포에서 치료적으로 관련된 내인성 유전자좌의 지속적인 억제를 유도할 수 있음을 입증하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 인간 Huh7 세포에서 초기 개념 증명 실험을 수행하여 비인간 영장류(NHP) 게놈에 대한 서열 보존을 나타내는 스페이서의 하위 집합을 평가하여 향후 생체 내 NHP 연구에서 시험하기 위한 선도 스페이서를 식별하였다.
물질 및 방법:
ADD 도메인을 함유하는 LTRP5 분자를 사용한 실험적 시험을 위한 PCSK9 표적화 스페이서의 연산 선택:
인간 PCSK9 유전자좌 전체에 걸쳐 잠재적 LTRP-특이적 스페이서를 결정하기 위해, 전사 시작 부위(TSS)로부터 상류로 5KB에서 시작하여 전사 종결 부위로부터 하류로 5KB까지를 표적 검색 영역으로 정의하였다. 스페이서를 TTC PAM의 가용성에 기초하여 결정하였고; 결과적으로, 표적 PCSK9 유전자좌 전체에 걸쳐 총 1,121개의 TTC 스페이서를 식별하였다. 그런 다음, 이들 스페이서의 위치에 기초하여 주요 게놈 특징부를 중첩시킴으로써, 즉 추정 스페이서가 프로모터 영역 내에서 엑손, 인트론, 또는 후보 시스-조절 요소(cCRE)를 표적화했는지 및/또는 공통 유전자 변이 부위(예: SNP)와 중첩되었는지 여부를 결정함으로써, 이들 스페이서에 기능적으로 주석을 달았다. 실험 스크리닝을 위한 스페이서의 초기 군의 범위를 좁히고 결정하기 위해, 추출된 스페이서에 일련의 필터링 기준을 적용하였다. 먼저, 표적 부위와 최대 하나의 염기쌍 불일치를 함유하는 표적 외 부위를 갖는 스페이서를 제거함으로써 비특이적 스페이서를 제외시켰다. 또한, 다음 모노뉴클레오티드 반복을 함유하는 스페이서를 제외시켰다: 길이가 4개의 염기쌍(bp)을 초과하는 티민 뉴클레오티드 반복, 또는 길이가 5 bp를 초과하는 아데닌, 구아닌, 또는 시토신 뉴클레오티드 반복. 다음으로, 이 여과된 세트로부터, 스페이서의 마지막 4개의 뉴클레오티드에서 불일치를 함유하는 둘 이상의 표적 외 부위를 갖는 스페이서를 제외시켰다. 마지막으로, TSS로부터 상류로 >2 KB 및 전사 종결 부위로부터 하류로 >2 KB를 표적화한 스페이서를 제외시켰다. 이를 통해 722개의 여과된 TTC 스페이서 세트(서열번호 1824~2545)를 생성하였다. 이러한 722개의 여과된 스페이서 세트로부터, TSS의 근위에 있는 (TSS로부터 상류 및 하류로 1100 bp 이내에 있는) 스페이서를 실험적 평가를 위해 선택하여, 67개의 TTC 스페이서를 식별하였다. 임계 윈도우인 1100 bp를 지나서 위치된 2개의 추가 스페이서, TG-06-354 및 TG-06-352도 선택하여 포함시켰다. 생성된 69개의 TTC 스페이서의 서열은 표 17에 나타나 있다.
| 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 69개의 TTC 스페이서의 RNA 서열. 굵은 글씨체의 스페이서는 인간 및 비인간 영장류 게놈 사이에서 서열 컨센서스를 갖는 스페이서였고, 본 실시예에서 평가하였다. | ||
| 스페이서 ID | 스페이서 RNA 서열 | 서열번호 |
| TG-06-342 | AAUUACAGGCAACAGGAAGG | 1824 |
| TG-06-343 | CCCCAUGUAAGAGAGGAAGU | 1825 |
| TG-06-344 | CAGUUUCUGCCUCGCCGCGG | 1826 |
| TG-06-345 | GCCUCGCCGCGGCACAGGUG | 1827 |
| TG-06-346 | CCCACCUGUGCCGCGGCGAG | 1828 |
| TG-06-347 | CUCCUUCACCCACCUGUGCC | 1829 |
| TG-06-348 | AGGCAUUCACUCCUUCACCC | 1830 |
| TG-06-349 | CUGUGCCUGGUGCAGUUCCC | 1831 |
| TG-06-350 | GUGUCAUAAAGAAAUUGCCU | 1832 |
| TG-06-351 | UUAUGACACAGAACUCAUGC | 1833 |
| TG-06-001 | GAGGAGGACGGCCUGGCCGA | 1834 |
| TG-06-002 | ACCGCUGCGCCAAGGUGCGG | 1835 |
| TG-06-004 | GCCAGGCCGUCCUCCUCGGA | 1836 |
| TG-06-005 | GUGCUCGGGUGCUUCGGCCA | 1837 |
| TG-06-117 | ACUUUGUUUGCAAAGACCUC | 1838 |
| TG-06-118 | GAGUGAAAUGGCCUGCUCUG | 1839 |
| TG-06-119 | GAGCAGGCCAUUUCACUCGG | 1840 |
| TG-06-120 | CUCGGAAUCUGCUGUGCAUC | 1841 |
| TG-06-121 | GGAAGGGCUGUCGAUACUGG | 1842 |
| TG-06-123 | UCCCAGUAUCGACAGCCCUU | 1843 |
| TG-06-124 | CAGUAUCGACAGCCCUUCCA | 1844 |
| TG-06-125 | AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU | 1845 |
| TG-06-128 | AGAAAUCAACUGGACAAGCA | 1846 |
| TG-06-131 | UGAACAUGGUGUGUAAAAGG | 1847 |
| TG-06-132 | AGAAGAUUCAAUUUGCAAAG | 1848 |
| TG-06-133 | AUGGUAGGCACAAGCUCAGC | 1849 |
| TG-06-134 | GAAUUCUAUGGUAGGCACAA | 1850 |
| TG-06-135 | GGAAAGCUGAGCUUGUGCCU | 1851 |
| TG-06-138 | AGGGAUUUAUACUACAAAGA | 1852 |
| TG-06-139 | AGGAGCAGCUAGUUGGUAAG | 1853 |
| TG-06-140 | AAACUUAGCCUGGACCCCCU | 1854 |
| TG-06-141 | ACUGGCCUUAACCUGGCAGC | 1855 |
| TG-06-142 | UUCCACUGGCCUUAACCUGG | 1856 |
| TG-06-143 | GAAUCAAUCCUACUGUGGAC | 1857 |
| TG-06-144 | GUGGGCAGCGAGGAGUCCAC | 1858 |
| TG-06-145 | UGGGUCCACCUUGUCUCCUG | 1859 |
| TG-06-146 | GAAGUCUCACUGGUCAGCAG | 1860 |
| TG-06-147 | GUGUUUCCUGGGUCCACCUU | 1861 |
| TG-06-149 | AGCCCAGUUAGGAUUUGGGA | 1862 |
| TG-06-150 | UCCCUCUGCGCGUAAUCUGA | 1863 |
| TG-06-151 | CUCUGCGCGUAAUCUGACGC | 1864 |
| TG-06-152 | GCCUCGCCCUCCCCAAACAG | 1865 |
| TG-06-153 | GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG | 1866 |
| TG-06-154 | AGGGUGUGGGUGCUUGACGC | 1867 |
| TG-06-155 | GCAGCGACGUCGAGGCGCUC | 1868 |
| TG-06-157 | GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU | 1869 |
| TG-06-158 | GGAGCAGGGCGCGUGAAGGG | 1870 |
| TG-06-159 | GCGCGCCCCUUCACGCGCCC | 1871 |
| TG-06-160 | CGCGCCCUGCUCCUGAACUU | 1872 |
| TG-06-161 | GCUCCUGCACAGUCCUCCCC | 1873 |
| TG-06-167 | CACUGAAUAGCGCAGCCGCA | 1874 |
| TG-06-168 | GUGGGAAGGUUCGCGGGGUU | 1875 |
| TG-06-169 | CGGGGUUGGGAGACCCGGAG | 1876 |
| TG-06-170 | UCGGCCUCCGGGUCUCCCAA | 1877 |
| TG-06-171 | CAGUACGUUCCAGGCAUUCA | 1878 |
| TG-06-172 | GCUGAAACAGAUGGAAUACU | 1879 |
| TG-06-249 | AAACCAAAUCGGAACCCACU | 1880 |
| HS-6-147 | UGUUGCCUGUAAUUGGAAUU | 1881 |
| HS-6-149 | CCUUCCUGUUGCCUGUAAUU | 1882 |
| TG-06-122 | CCUUUGUUUCUUCCCAGUAU | 1883 |
| TG-06-127 | UCCUCCUGCCUGGUACACAA | 1884 |
| TG-06-137 | GAAUGUACCUAUAUGACGUC | 1885 |
| TG-06-188 | CCCCGGCCUCCCAUCCCUAC | 1886 |
| TG-06-243 | CUUGGCACGAUCUUGGGGAC | 1887 |
| TG-06-250 | GAUUUGGUUUGGAAAACAUG | 1888 |
| TG-06-251 | CUCCAGGCCCUCCACCCUCC | 1889 |
| HS-6-159 | CACCCCGCCCCUGUCUCGGG | 1890 |
| TG-06-354 | CCCCUGCCCCUUCAGCUGGU | 1925 |
| TG-06-352 | UCCCUCACCAAUUACCCCUC | 1910 |
참고로, 이들 실시예 전체에 걸쳐 스페이서 명명법의 경우, 대시 기호(-)와 마침표(.)가 상호 교환적으로 사용된다. 따라서, 스페이서 “06-146”은 스페이서 “6.146”과 동일하다.
비인간 영장류 게놈과의 서열 보존을 갖는 선택 PCSK9 표적화 스페이서에 대한 PCSK9 분비 수준의 평가:
식별된 69개의 TTC 스페이서 중, 인간 및 비인간 영장류 게놈 간의 서열 보존을 나타낸 15개의 스페이서(표 17에 굵은 글씨체로 표시된 스페이서)를 먼저 시험하여 PCSK9 분비 수준에 이들이 미치는 효과를 평가하였다.
다음 분자를 암호화하는 mRNA를 실시예 2에 기술된 것과 유사한 방법에 따라 IVT에 의해 생성하였다: 1) 촉매적으로 활성인 CasX 676(실시예 5에 기술된 바와 같음), 2) dXR1(실시예 2에 기술된 바와 같음), 및 3) LTRP5-ADD-ZIM3(실시예 4에 기술된 바와 같음). CasX 676에 대한 DNA 및 mRNA 서열은 표 21 및 22에 나타나 있고; dXR1에 대한 DNA 및 mRNA 서열은 표 11 및 12에 나타나 있고; LTRP5-ADD-ZIM3에 대한 DNA 및 mRNA 서열은 표 18 및 19에 나타나 있다.
gRNA 스캐폴드 316을 사용하여 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 NHP-보존된 스페이서(표 17에 굵은 글씨체로 표시된 스페이서)를 함유하는 gRNA를 설계하고 화학적으로 합성하였다. 또한, B2M-표적화 gRNA를 비표적화 대조군으로서 사용한 반면, 스페이서 TG-06-138(스페이서 6.138; 서열번호 1852로도 알려짐)을 사용하여 dXR1과 쌍을 형성하고, 스페이서 TG-06-001(스페이서 6.1; 서열번호 1834로도 알려짐)을 사용하여 CasX 676과 쌍을 형성하였다. 아래의 실시예 5에 기술된 PCSK9 유전자좌의 지속적인 억제에 있어서 입증된 효능을 감안하여, NHP-보존된 스페이서가 아닌 스페이서 TG-06-157(스페이서 6.157; 서열번호 1869로도 알려짐)을, 양성 대조군으로서 포함시켰다.
PCSK9 분비를 평가하기 위해, 시딩된 Huh7 세포를 촉매적으로 활성인 CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA, 및 B2M 또는 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 및 스캐폴드 316을 갖는 gRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 6, 18, 36, 및 87일차에 배지 상청액을 수확하여 PCSK9 분비 수준을 ELISA에 의해 평가하였다. PCSK9 분비 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 추가의 대조군으로서, 미치료, 미노출 세포를 함유하는 웰로부터 수확한 배지 상청액에서도 PCSK9 분비를 측정하였다.
결과:
촉매적으로 활성인 CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA와 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 NHP-보존된 gRNA로 형질감염시킨 Huh7 세포에 대해 정규화된 PCSK9 분비 수준을 4개의 시점에 정량화한 것이 도 9에 도시되어 있다. 데이터는, 대조군 조건, 즉 미노출 미치료 세포, dXR1로 치료한 세포, (B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.37을 사용하는) 비표적화 대조군으로 치료한 세포와 비교했을 때, 가장 NHP-보존된 스페이스와 LTRP5-ADD-ZIM3을 사용했을 때 전사 후 36일차까지 억제가 지속되었음을 보여준다. 구체적으로, CasX 676과 쌍을 형성한 스페이서 6.1을 사용했을 때 관찰된 PCSK9 분비 수준과 비교하면, LTRP5-ADD-ZIM3과 쌍을 형성한 TSS-인접 스페이서 TG-06-147, TG-06-167, TG-06-133, TG-06-146, 및 TG-06-154를 사용했을 때 36일차까지 유사한 억제 수준이 지속되거나 더 감소하였다(도 9). 흥미롭게도, 본원에서 “TSS-인접”으로서 명명된 1100 bp 임계 윈도우를 벗어난 위치에 있는 TG-06-352를 사용했을 때도 36일차까지 효과적인 억제가 나타났다(도 9). 실시예 5에서 관찰된 소견과 유사하게, 스페이서 6.157를 갖는 LTRP5-ADD-ZIM3으로 치료한 경우에는 분비된 PCSK9 수준이 지속적으로 억제된 반면, dXR1 및 스페이서 6.138으로 치료한 경우에는 억제가 일시적이었다. 또한, B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.37을 갖는 3개의 mRNA 분자 중 어느 하나를 사용한 치료는 PCSK9 분비에 영향을 미치지 않았다(도 9). 그러나, 형질감염 후 87일차까지는, LTRP5-ADD-ZIM3과 쌍을 형성한 스페이서 TG-06-157, TG-06-154, TG-06-167, 및 TG-06-243를 사용한 경우에만 CasX 676과 쌍을 형성한 스페이서 6.1을 사용한 경우와 비교했을 때 유사한 억제 수준이 지속되거나 더 감소하였다(도 9).
이들 결과는 ADD 도메인을 갖는 LTRP 분자를 암호화하는 mRNA를 적절한 PCSK9-표적화 gRNA와 함께 전달하는 것이 인간 세포에서 내인성 표적 유전자좌를 지속적으로 억제할 수 있음을 입증한다. 또한, 이들 실험을 통해, 비인간 영장류 종과의 컨센서스 서열을 갖는 여러 개의 인간 스페이서가 치료적으로 관련된 유전자좌를 표적화함으로써 강력한 표현형 효과를 달성하였음을 밝혀냈는데, 이는 비인간 영장류 모델을 사용하는 전임상 효능 연구에서 이들 선택 스페이서의 잠재적 사용을 뒷받침한다.
실시예 4: LTRP 분자에 ADD 도메인을 포함시키는 것이 마우스 Hepa1~6 세포에서 내인성 유전자좌의 억제를 향상시킨다는 것의 입증
표적화 gRNA로 공동 형질감염된 mRNA로서 LTRP이 전달될 때, ADD 도메인을 LTRP 분자 내에 통합하는 것이 마우스 Hepa 1~6 간 세포에서 내인성 유전자좌의 지속적인 억제를 유도하는 LTRP의 능력을 향상시킨다는 것을 입증하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
LTRP #5 mRNA의 생성:
LTRP #5 분자의 2개의 변이체를 암호화하는 mRNA를 시험관 내 전사(IVT)에 의해 생성하였다: 1) ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP #5 분자(이하 LTRP5-ZIM3으로서 알려짐) 및 2) DNMT3A-ADD 도메인을 함유하는 LTRP5-ZIM3(이하 LTRP5-ADD-ZIM3으로서 알려짐). 간략하게, 5' UTR 영역, SV40 NLS가 측면에 위치한 LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3, 및 3' UTR 영역을 암호화하는 작제물을 생성하고, T7 프로모터 및 79-뉴클레오티드 폴리(A) 꼬리를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하였다. 공개적으로 이용 가능한 다양한 코돈 최적화 도구를 사용하고 필요에 따라 GC 함량과 같은 파라미터를 조정하는 것에 추가하여, 코돈 이용 테이블을 사용하여, LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 분자를 암호화하는 서열을 코돈 최적화하였다. LTRP5-ZIM3 및 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA를 암호화하는 DNA 서열은 표 18에 열거되어 있다. 상응하는 mRNA 서열 및 단백질 서열은 표 19 및 표 20에 각각 열거되어 있다.
| 본 실시예에서 평가된 LTRP5-ZIM3 및 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA 분자의 암호화 DNA 및 RNA 서열*. | |||
| LTRP 분자 | 성분 | DNA 서열 또는 서열번호 | RNA 서열 또는 서열번호 |
| LTRP5-ZIM3 | 5'UTR | 3047 | 3115 |
| 시작 코돈 + NLS + 링커 | 3104 | 3116 | |
| 시작 코돈 + DNMT3A 촉매 도메인 | 3059 | 3117 | |
| 링커 | 3060 | 3118 | |
| DNMT3L 상호작용 도메인 | 3061 | 3119 | |
| 링커 | 3105 | 3105 | |
| ZIM3-KRAB | 3051 | 3120 | |
| 링커 | 3106 | 3121 | |
| dCasX491 | 3049 | 3122 | |
| 완충 + 링커 | 3107 | 3123 | |
| NLS + 종결 코돈 + 완충 서열 | 3108 | 3124 | |
| 3' UTR | 3055 | 3125 | |
| 완충 서열 | TCTAG | UCUAG | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3109 | 3109 | |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | 5' UTR | 3047 | 3115 |
| 시작 코돈 + NLS + 링커 | 3104 | 3116 | |
| 시작 코돈 + DNMT3A ADD 도메인 | 3111 | 3127 | |
| DNMT3A 촉매 도메인 | 3112 | 3128 | |
| 링커 | 3060 | 3118 | |
| DNMT3L 상호작용 도메인 | 3061 | 3119 | |
| 링커 | 3105 | 3105 | |
| ZIM3-KRAB | 3051 | 3120 | |
| 링커 | 3106 | 3121 | |
| dCasX491 | 3049 | 3122 | |
| 완충 + 링커 | 3107 | 3123 | |
| NLS + 종결 코돈 + 완충 서열 | 3108 | 3124 | |
| 3' UTR | 3055 | 3125 | |
| 완충 서열 | 3056 | 3126 | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3109 | 3109 | |
| *성분은 작제물 내에서 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있음 | |||
| 본 실시예에서 평가된 LTRP5-ZIM3 및 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA 분자의 전장 단백질 서열 | |
| LTRP 분자 | 아미노산 서열번호 |
| LTRP5-ZIM3 | 3131 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | 3132 |
gRNA의 합성:
gRNA 스캐폴드 316을 사용하여 마우스 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 2개의 gRNA를 설계하고 화학적으로 합성하였다. PCSK9-표적화 스페이서 27.88 및 27.94(서열은 표 14에 열거됨)를 본 실시예에서 평가하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 스페이서 27.88의 사용은 스페이서 27.94의 사용보다 PCSK9 녹다운을 달성하는 데 덜 효과적이었다.
실시예 2에 기술된 바와 같이, Hepa1~6 세포 내로 mRNA 및 gRNA를 형질감염시키고 및 세포내 PCSK9 염색을 수행하였다. 간략하게, Hepa1~6 세포가 시딩된 각각의 웰을 LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 300 ng의 mRNA 및 스페이서 27.88 또는 27.94를 갖는 150 ng의 PCSK9-표적화 gRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 최대 53일차까지 다양한 시점에, 실시예 2에 전술한 것과 같은 세포내 염색 프로토콜을 사용하여 PCSK9 단백질의 세포내 수준을 측정하였다. 비표적화 gRNA를 실험 대조군으로서 사용하였다.
결과:
ADD 도메인을 LTRP 분자 내에 통합하는 것이 활성에 미치는 효과, 즉 시험관 내에서 내인성 유전자좌의 보다 지속적인 억제를 유도하는 효과를 결정하기 위해, LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA를 PCSK9-표적화 gRNA와 함께 Hepa1~6 세포 내로 공동 형질감염시켰다. 생성된 PCSK9 녹다운의 정량화는 도 10a~10b에 도시되어 있다. 데이터는, LTRP5-ZIM3보다는 LTRP5-ADD-ZIM3으로 세포를 치료했을 때 PCSK9 녹다운 달성이 현저하게 개선되었고, 이러한 개선은 더 약한 스페이서 27.88을 함유하는 PCSK9-표적화 gRNA를 사용할 때 더 두드러졌음을 입증한다. 실시예 2에서 논의된 데이터를 추가로 뒷받침하는 것은, LTRP5-ZIM3 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 분자와 쌍을 형성할 때, 스페이서 27.94을 사용하는 것이 스페이서 27.88을 사용하는 것보다 53일차까지 더 지속적인 억제를 초래하였다는 것이다(도 10b). 예상대로, 비표적화 스페이서의 사용은 PCSK9 녹다운을 초래하지 않았다.
이들 실험은, ADD 도메인을 갖는 LTRP 작제물의 사용이 ADD 도메인을 갖지 않는 작제물과 비교하여 세포에서 내인성 유전자좌의 지속적인 억제를 증가시킬 수 있음을 입증한다. 또한, 이들 소견은 ADD 도메인을 갖는 LTRP 분자가 표적화 gRNA로 공동 형질감염된 mRNA로서 세포에 전달되어 효과적인 침묵화를 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 5: ADD 도메인을 함유하는 LTRP를 암호화하는 mRNA가 다수의 인간 세포주에서 내인성 유전자좌의 억제를 유도할 수 있음을 입증
ADD 도메인을 함유하는 LTRP를 암호화하는 mRNA가 표적화 gRNA로 공동 형질감염된 mRNA로서 전달될 때, 다양한 인간 세포주에서 내인성 표적 유전자좌의 장기 억제를 유도할 수 있음을 입증하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법
mRNA의 생성:
다음 분자를 암호화하는 mRNA를 실시예 2에 기술된 것과 유사한 방법에 따라 IVT에 의해 생성하였다: 1) 촉매적으로 활성인 CasX 676, 2) dXR1(실시예 2에 기술된 바와 같음), 및 3) LTRP5-ADD-ZIM3(실시예 4에 기술된 바와 같음). 공개적으로 이용 가능한 다양한 코돈 최적화 도구를 사용하고 GC 함량과 같은 파라미터를 조정하는 것에 추가하여, 코돈 이용 테이블을 사용하여, 이들 분자를 암호화하는 서열을 코돈 최적화하였다. 촉매적으로 활성인 CasX 676을 암호화하는 DNA 및 mRNA 서열은 표 21 및 표 22에 각각 나타나 있다. dXR1을 암호화하는 DNA 및 mRNA 서열은 표 11 및 표 12에 각각 나타나 있다. LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 DNA 및 mRNA 서열은 표 18 및 표 19에 각각 나타나 있다.
| CasX mRNA ID | 성분 (ID) | 설명 | DNA 서열 또는 서열번호 |
| CasX 676 mRNA | 5'UTR | TriLink | 3047 |
| 시작 코돈 + c-MYC NLS | 3133 | ||
| CasX 676 | 3134 | ||
| c-MYC NLS + 종결 코돈 | 3135 | ||
| 3' UTR | 마우스 HBA | 3055 | |
| XbaI 제한 부위 (부분) | TCTAG | ||
| 폴리(A) 꼬리 | 3057 | ||
| *성분은 작제물 내에서 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있음 | |||
gRNA의 합성:
gRNA 스캐폴드 316을 사용하여 인간 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 gRNA를 설계하고 화학적으로 합성하였다. 또한, B2M-표적화 gRNA를 실험 대조군으로서 사용하였다. 표 23에 열거된 바와 같이 본 실시예에서 평가된 표적화 스페이서의 서열.
| 스페이서 ID | 표적 | 표적화 스페이서 서열(RNA) | 서열번호 |
| 7.37 | 인간 B2M | GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG | 3137 |
| 6.1 | 인간 PCSK9 | GAGGAGGACGGCCUGGCCGA | 1834 |
| 6.125 | 인간 PCSK9 | AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU | 1845 |
| 6.138 | 인간 PCSK9 | AGGGAUUUAUACUACAAAGA | 1852 |
| 6.153 | 인간 PCSK9 | GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG | 1866 |
| 6.157 | 인간 PCSK9 | GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU | 1869 |
| 6.172 | 인간 PCSK9 | GCUGAAACAGAUGGAAUACU | 1879 |
| 6.181 | 인간 PCSK9 | UCAUCUGCACUCGUGGCCAC | 2228 |
HepG2 세포, Hep3B 세포, 및 Huh7 세포 내로 mRNA 및 gRNA의 형질감염, 및 PCSK9 분비를 평가하기 위한 ELISA:
다음 3개의 인간 간세포암 세포주를 본 실험에 사용하였다: HepG2 세포, Hep3B 세포, 및 Huh7 세포. 각 세포주의 세포를 약 15,000개씩 각 웰에 시딩하고; 다음 날, 시딩된 세포를 촉매적으로 활성인 CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA, 및 스캐폴드 316을 갖고 B2M 또는 PCSK9 유전자좌를 표적으로 하는 스페이서를 갖는 gRNA로 형질감염시켰다(특정 스페이서 및 서열은 표 23 참조). 형질감염 후 4일차에 배지 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 PCSK9 분비 수준을 평가하고, PCSK9 분비 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하고 도 11a~11c에 도시하였다. 치료한 Huh7 세포를 계속 배양하고, 형질감염 후 14 및 27일차에 배지 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 PCSK9 분비를 측정하였다. 추가의 실험 대조군으로서, 미치료, 미노출 세포를 함유하는 웰로부터 수확한 배지 상청액에서도 PCSK9 분비를 측정하였다.
결과:
HepG2 세포, Hep3B 세포, 및 Huh7 세포를 촉매적으로 활성인 CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA, 및 B2M 또는 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서를 갖는 gRNA로 형질감염시키고, 분비된 PCSK9 수준을 측정하였다. 형질감염 후 4일차에 각 조건에 대해 정규화된 PCSK9 분비 수준을 정량화한 것이 도 11a~11c에 도시되어 있다. 데이터는, CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3에 의한 PCSK9 분비의 가장 효율적인 녹다운이 Huh7 세포에서 관찰된 반면, HepG2 세포는 분비된 PCSK9 수준의 녹다운을 그리 효율적으로 나타내지 않았음을 입증한다(도 11a~11c). 한 편, Hep3B 세포는 전반적으로 낮은 PCSK9 분비 수준을 나타냈는데, 이는 사용된 세포주 중, Hep3B 세포주가 PCSK9 억제를 유도하고 입증하기 위한 치료에 가장 덜 순응함을 나타낸다(도 11a~11c).
치료된 Huh7 세포의 배양을 형질감염 후 27일차까지 계속하였고, PCSK9 분비는 14일차 및 27일차에 측정하였다. 도 12의 막대 도표는 4일차, 14일차, 및 27일차 시점에 PCSK9 억제의 정량화 결과를 보여주는 것으로서, 4일차 시점에 미노출 대조군에 대해 검출된 수준 대비 PCSK9 녹다운으로서 표시되어 있다. 데이터는, 스페이서 6.138 및 6.157을 갖는 gRNA와 함께 LTRP5-ADD-ZIM3으로 Huh7 세포를 치료한 결과 PCSK9 분비가 가장 효과적으로 억제되었고, 이러한 억제는 형질감염 후 27일차까지 지속되었음을 입증한다(도 12). 유사하게, 스페이서 6.1을 갖는 촉매적으로 활성인 CasX 676으로 Huh7 세포를 치료했을 때 지속적인 녹다운이 관찰되었다. dXR1 및 스페이서 6.138로 치료한 경우 4일차에 최초로 강력한 억제가 나타났지만, PCSK9 분비 수준이 형질감염 후 14일차 및 27일차에 베이스라인 수준으로 복귀함에 따라 이러한 억제 효과는 일시적이었다(도 12). 예상대로, B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.37을 갖는 3개의 mRNA 분자 중 어느 하나로 치료하는 것은, 본 시간 경과 실험 동안 PCSK9 분비 수준에 영향을 미치지 않았다.
이들 실험은, ADD 도메인을 갖는 LTRP 분자를 적절한 표적화 스페이서와 함께 사용하는 것이 다양한 인간 세포주에서 내인성 표적 유전자좌의 장기 침묵을 초래할 수 있음을 입증한다. 이들 소견은, ADD 도메인을 갖는 LTRP 분자가 mRNA로서 표적화 gRNA와 함께 세포에 공동 전달되어 억제를 유도할 수 있다는 것도 보여준다.
실시예 6: 소정의
PCSK9
표적화 스페이서의 사용이 원하지 않는 세포내 PCSK9 보유를 초래할 수 있음을 입증
결과적으로, 적절하게 접힐 수 없는 분비 단백질은 프로테아좀 분해를 위해 마지막으로 표적화되도록 소포체(ER) 내에 유지된다. 그러나, ER 내의 과도한 단백질 축적은 ER 스트레스를 야기할 수 있다. PCSK9는 먼저 치모겐(pro-PCSK9으로서 알려짐)으로서 합성되고, 이는 ER에서 성숙되는 동안 자가촉매적 절단을 거쳐 비활성 분비 단백질(성숙한 또는 가공된 PCSK9로도 알려짐)이 된다. 또한, 고콜레스테롤혈증을 유발하는 PCSK9 유전자에서의 특정 기능 획득 돌연변이는 ER에서 세포내 PCSK9 유지와 관련이 있는 것으로 나타났는데(Benjannet S 등의 문헌[NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. J. Biol. Chem. 279:48865-48875 (2004)]; Park SW 등의 문헌[Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. J. Biol. Chem. 279:50630-50638 (2004)]; Uribe KB 등의 문헌[A Systematic Approach to Assess the Activity and Classification of PCSK9 Variants. Int. J. Mol. Sci. 22:13602 (2021)]), 이는 PCSK9 유전자좌의 특정 영역을 표적화하는 것이 원하지 않는 세포내 유지를 야기할 수 있음을 나타낸다. 그 결과, 특정 PCSK9-표적화 스페이서의 사용이 세포내 PCSK9 수준의 원치 않는 증가를 초래할 수 있고, 이는 비정상적인 ER 스트레스와 같은 예상치 못한 결과를 야기할 수 있음을 입증하는 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
CasX 676 mRNA #2(아래 표 28에 열거된 서열)의 시험관 내 전사를 아래 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 스캐폴드 316 및 PCSK9-표적화 스페이서를 사용하여 가이드 RNA를 v1 변형 프로파일로 합성하였다(실시예 7에서 논의된 것과 같음). 스페이서 6.1, 6.8, 6.86, 6.114, 6.197, 및 6.203(표 24에 열거된 서열)을 세포내 PCSK9 유지에 대해 평가하였다.
| 스페이서 ID | 스페이서 DNA 서열 | 서열번호 | 스페이서 RNA 서열 | 서열번호 |
| 6.1 | GAGGAGGACGGCCTGGCCGA | 2977 | GAGGAGGACGGCCUGGCCGA | 1834 |
| 6.8 | TGGCTTCCTGGTGAAGATGA | 3139 | UGGCUUCCUGGUGAAGAUGA | 2009 |
| 6.86 | TGGTGAAGATGAGTGGCGAC | 3464 | UGGUGAAGAUGAGUGGCGAC | 3466 |
| 6.114 | TCCCAGGCCTGGAGTTTATT | 3141 | UCCCAGGCCUGGAGUUUAUU | 2291 |
| 6.197 | AGGTCATCACAGTTGGGGCC | 3465 | AGGUCAUCACAGUUGGGGCC | 3467 |
| 6.203 | CCAGGAGTGGGAAGCGGCGG | 3144 | CCAGGAGUGGGAAGCGGCGG | 2341 |
형질감염을 통한 CasX mRNA 및 gRNA의 시험관 내 전달:
특정 PCSK9 표적화 스페이서의 사용이 잠재적 세포내 PCSK9 유지를 초래할 것인지 여부를 결정하기 위해, 96-웰 플레이트에 웰 당 약 50,000개의 HepG2 세포를 시딩하였다. 리포펙타민을 사용하여 PCSK9 표적화 gRNA로 CasX 676 mRNA #2를 HepG2 세포 내로 형질감염시켰다. 배지 변경 후, 형질감염 후 2일차에 다음을 수확하였다: 1) 분비된 PCSK9 단백질 수준을 ELISA에 의해 측정하기 위한 배지 상청액; 및 2) 세포내 PCSK9 수준을 평가하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석을 위한 형질감염된 세포. 웨스턴 블롯팅 분석을 위해 수확된 세포를 대상으로 전체 세포 용해물 추출을 수행하였다. 간략하게, 추출된 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분해하고, 이어서 면역블로팅을 수행하여 pro-PCSK9 및 가공된 PCSK9의 수준을 분석하고, 이를 밀도계에 의해 정량화하였다. 배지 상청액 중 분비된 PCSK9 수준을 제조사의 지침에 따라 BioLegend® ELISA MAX™ 키트를 사용하여 분석하였다. 미노출, 미치료 세포, 및 CasX 676 mRNA #2로만 형질감염시킨 세포는 2개의 실험 대조군의 역할을 하였다.
결과:
CasX 676 mRNA #2 및 PCSK9-표적화 gRNA로 HepG2 세포를 형질감염시킨 후, 배지 상청액에서 분비된 PCSK9 수준을 ELISA에 의해 정량화하였고, 그 결과는 도 13에 도시되어 있다. 데이터는, HepG2s 세포를 CasX 676 mRNA 및 PCSK9-표적화 gRNA로 형질감염시킨 결과 분비된 PCSK9 수준이 다양한 정도로 감소되었음을 입증한다. 시험된 스페이서 중, 스페이서 6.1, 6.8, 6.86, 및 6.203의 사용은 CasX 676 mRNA만으로 형질감염시킨 세포와 비교하여 분비된 수준의 거의 50% 감소시켰다(도 13).
형질감염된 HepG2 세포에서도 PCSK9의 세포내 수준을 평가하였다. 도 14는 형질감염된 HepG2 세포에서 총 단백질 로딩 대조군과 함께 PCSK9 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석이고, 도 15는 미노출 조건 대비 총 PCSK9 수준에 대해 정규화된 pro-PCSK9, 가공된 PCSK9, 및 총 PCSK9 단백질 수준에 대한 밀도계 정량화를 도시한 막대 도표이다. 데이터는, 평가된 PCSK9-표적화 스페이서 중, 스페이서 6.1을 사용한 경우만 pro-PCSK9 수준을 실질적으로 증가시키지 않았고, 따라서 스페이서 6.1의 사용이 세포내 단백질 수준을 증가시키지 않았음을 나타낸다(도 14~15). 스페이서 6.203의 사용도 세포내 단백질 수준을 눈에 띄게 증가시키지 않았지만, 이를 사용한 결과 가공된 PCSK9 수준이 증가하였으며(도 14~15), 이는 미노출 또는 CasX mRNA 단독 대조군과 비교했을 때 분비된 PCSK9 수준을 감소시키는 효과의 소견(도 13)과 모순되는 것으로 보인다. 스페이서 6.203의 사용에 의해 관찰된 이러한 명백한 모순된 효과는, 가공된 PCSK9의 유지가 스페이서 6.203의 사용에 의해 PCSK9 분비가 감소되는 메커니즘에 관여할 수 있음을 나타낸다.
결과는, 비록 특정 PCSK9-표적화 스페이서의 사용이 분비된 PCSK9 수준을 감소시킬 수 있지만, 이들 외견상 효과적인 스페이서 중 일부가 세포내 단백질 유지 증가와 같은 잠재적으로 원하지 않는 특성을 나타낼 가능성이 있음을 입증한다. 따라서, 이들 실험의 소견은 치료적 사용을 위한 효과적인 표적화 스페이서를 식별하기 위한 잠재적 안전성 기준으로서 증가된 세포내 단백질 유지를 평가하는 것의 사용을 나타낸다.
실시예 7: 시험관 내 및 생체 내에서 CasX mRNA와 함께 전달될 때 편집을 개선하는 변형된 gRNA의 설계 및 평가
새로운 gRNA 변이체 서열을 식별하고, 이들 gRNA 변이체의 화학적 변형이 CasX mRNA와 함께 시험관 내에서 전달될 때 CasX:gRNA 시스템의 편집 효율을 향상시킨다는 것을 입증하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
gRNA의 합성:
본 실시예에서 시험된 모든 gRNA는 화학적으로 합성되었고 gRNA 스캐폴드 174, 235, 및 316으로부터 유래되었다. gRNA 스캐폴드 174, 235, 및 316의 서열 및 이들의 화학적 변형 프로파일은 표 25에 열거되어 있다. PCSK9, B2M, 또는 ROSA26을 표적화하는 스페이서를 포함하여, 생성된 gRNA의 서열, 및 본 실시예에서 검정된 이들의 화학적 변형 프로파일은 표 26에 열거되어 있다. gRNA 스캐폴드 변이체 174, 235, 및 316의 구조의 개략도가 도 19a~19c에 각각 도시되어 있고, gRNA 변이체의 화학적 변형 부위는 도 16a, 16b, 18, 24, 및 25에 각각 개략적으로 도시되어 있다.
| 화학적 변형 프로파일이 상이한(버전 번호로 표시됨) gRNA 스캐폴드의 서열 (서열 중 “NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN”은 스페이서 자리 표시자임). 화학적 변형: * = 포스포로티오에이트 결합; m = 2'OMe 변형. | ||
| gRNA 스캐폴드 (버전) | gRNA 서열 | 서열번호 |
| 174 (v0) | ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | 2947 |
| 174 (v1) | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2948 |
| 174 (v2) | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU | 2949 |
| 174 (v3) | mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmUmUmAmUmCmUmGmAmUUACUUUGmAmGmAmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUmCmAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2950 |
| 174 (v4) | mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUUUmAmUmCmUmGmAmUUACUUUGmAmGmAmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2951 |
| 174 (v5) | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2952 |
| 174 (v6) | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2953 |
| 174 (v7) | mA*mC*mU*GGmCGmCmUUUUAmUmCUGAUUACUUUGmAmGAGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2954 |
| 174 (v8) | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2955 |
| 174 (v9) | mA*mC*mU*GGmCmGCmUUUUAmUmCUGAUUACUUUGmAmGAGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2956 |
| 235 (v0) | ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | 2957 |
| 235 (v1) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2958 |
| 235 (v2) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU | 2959 |
| 235 (v3) | mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2960 |
| 235 (v4) | mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2961 |
| 235 (v5) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2962 |
| 235 (v6) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN | 2963 |
| 235 (v7) | mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2964 |
| 235 (v8) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2965 |
| 235 (v9) | mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2966 |
| 316 (v0) | ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | 2967 |
| 316 (v1) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2968 |
| 316 (v2) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU | 2969 |
| 316 (v3) | mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUmCmAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2970 |
| 316 (v4) | mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2971 |
| 316 (v5) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2972 |
| 316 (v6) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2973 |
| 316 (v7) | mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2974 |
| 316 (v8) | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2975 |
| 316 (v9) | mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN | 2976 |
| 본 실시예에서 검정된 화학적 변형 프로파일이 상이한(버전 번호로 표시됨) gRNA의 서열. 화학적 변형: * = 포스포로티오에이트 결합; m = 2'OMe 변형. | |||
| gRNA ID (스캐폴드 변이체-스페이서) |
표적 | gRNA 서열 | 서열번호 |
| 174-6.7 (v0) |
인간 PCSK9 |
ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA | 3145 |
| 174-6.7 (v1) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3074 |
| 174-6.8 (v0) |
인간 PCSK9 |
ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA | 3146 |
| 174-6.8 (v1) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA | 3147 |
| 174-7.9 (v0) |
인간 B2M |
ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGUGUAGUACAAGAGAUAGAA | 3148 |
| 174-7.9 (v1) |
인간 B2M |
mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGUGUAGUACAAGAGAUAmG*mA*mA | 3149 |
| 316-6.7 (v0) |
인간 PCSK9 |
ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA | 3150 |
| 316-6.7 (v1') |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3151 |
| 316-6.8 (v0) |
인간 PCSK9 |
ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA | 3152 |
| 316-6.8 (v1') |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA | 3153 |
| 316-7.9 (v0) |
인간 B2M |
ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGUGUAGUACAAGAGAUAGAA | 3154 |
| 316-7.9 (v1') |
인간 B2M |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGUGUAGUACAAGAGAUAmG*mA*mA | 3155 |
| 174-7.37 (v0) |
인간 B2M |
ACUGGCGCUUUUAUCUgAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAgUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGCCGAGAUGUCUCGCUC | 3156 |
| 174-7.37 (v1*) |
인간 B2M |
mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUgAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAgUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGCCGAGAUGUCUCG*mC*mU*mC | 3157 |
| 235-6.7 (v0) |
인간 PCSK9 |
ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA | 3158 |
| 235-6.7 (v1) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3159 |
| 235-6.7 (v2) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGAU*mU*mU*mU | 3160 |
| 235-6.7 (v3) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3161 |
| 235-6.7 (v4) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3162 |
| 235-6.7 (v5) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3163 |
| 235-6.7 (v6) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA | 3164 |
| 235-6.8 (v0) |
인간 PCSK9 |
ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA | 3165 |
| 235-6.8 (v1) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA | 3166 |
| 235-6.8 (v2) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA*mU*mU*mU | 3167 |
| 235-6.8 (v3) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA | 3168 |
| 235-6.8 (v4) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA | 3169 |
| 235-6.8 (v5) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA | 3170 |
| 235-6.8 (v6) |
인간 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA | 3171 |
| 316-27.107 (v0) |
마우스 PCSK9 |
ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAGAUG | 3172 |
| 316-27.107 (v1) | 마우스 PCSK9 | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG | 3173 |
| 316-27.107 (v7) |
마우스 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG | 3174 |
| 316-27.107 (v8) |
마우스 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG | 3175 |
| 316-27.107 (v9*) |
마우스 PCSK9 |
mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAA*mG*mA*mU*mG | 3176 |
| 174-35.2 (v0) | ROSA26 | ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU | 3177 |
| 174-35.2 (v2) | ROSA26 | mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU*mU*mU*mU | 3178 |
| 316-35.2 (v0) | ROSA26 | ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU | 3179 |
| 316-35.2 (v1) | ROSA26 | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGU*mC*mU*mU | 3180 |
| 316-35.2 (v5) | ROSA26 | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGU*mC*mU*mU | 3181 |
참고: v1' 설계로 주석이 달린 gRNA는 gRNA의 3' 단부에서 하나 더 적은 포스포로티오에이트 결합을 함유한다. v1*로 주석이 달린 gRNA는 gRNA의 3' 단부에서 하나의 추가 포스포로티오에이트 결합을 함유한다. v9*로 주석이 달린 gRNA는 gRNA의 3' 단부에서 하나의 추가 포스포로티오에이트 결합을 함유한다.
gRNA 활성의 생화학적 특성 분석:
5' 단부에서 형광 모이어티를 갖는 표적 DNA 올리고뉴클레오티드를 상업적으로 구매하였다(표 27에 열거된 서열). 이중-가닥 DNA(dsDNA) 표적은, 올리고를 1x 절단 완충액(20 mM 트리스 HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 5% 글리세롤, 10 mM MgCl2)에서 1:1 비율로 혼합한 다음, 95℃로 10분 동안 가열한 다음, 용액을 실온으로 냉각시켜서 형성하였다. CasX 리보뉴클레오단백질(RNP)을 1x 절단 완충액에서 CasX 491, 및 표시된 gRNA가 1.2배 과량으로 존재하는 1 μM의 최종 농도의 표시된 gRNA로 재구성하였다. RNP를 37℃에서 10분 동안 형성시켰다.
gRNA 스캐폴드에 대한 다양한 구조적 및 화학적 변형이 CasX 491 RNP의 절단 속도에 미치는 효과를 결정하였다. 절단 반응물은 200 nM의 최종 RNP 농도 및 10 nM의 최종 목표 농도로 제조하였고, 반응은 16℃에서 수행하되 표지된 표적 DNA 기질을 첨가함으로써 개시하였다(표 27). 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 및 10분에 반응물 분획을 분취하고, 동일한 부피의 95% 포름아미드를 20 mM EDTA와 함께 첨가하여 퀀칭시켰다. 샘플을 95℃에서 10분 동안 변성시키고 10% 우레아-PAGE 겔 상에서 분해하였다. 겔을 Typhoon™ 레이저-스캐너 플랫폼 상에서 이미지화하고 ImageQuant™ TL 8.2 이미지 분석 소프트웨어(Cytiva™)를 사용하여 정량화하였다. 비표적 가닥 절단의 겉보기 1차 속도 상수(kcleave)를 각각의 CasX:gRNA에 대해 결정하였다.
각 gRNA에 의해 형성된 유능한 분획을 결정하기 위해, 100 nM의 최종 RNP 농도 및 100 nM의 최종 목표 농도로 절단 반응물을 제조하였다. 37℃에서 반응을 수행하되, 표지된 표적 기질을 첨가하여 반응을 개시하였다(표 27). 0.5, 1, 2, 5, 10, 및 30분에 분획을 분취하고, 동일한 부피의 95% 포름아미드를 25 mM EDTA와 함께 첨가하여 퀀칭시켰다. 샘플을 95℃에서 10분 동안 가열하여 변성시키고 10% 우레아-PAGE 겔 상에서 분해하였다. 전술한 바와 같이 겔을 이미지화하고 정량화하였다. 화학량론적 양 미만의 효소는 기간이 연장되더라도 화학양론적 양을 초과하는 표적 기질을 절단할 수 없을 것이고, 대신에 존재하는 효소의 양으로 눈금이 매겨진 평탄 구간에 접근하게 된다는 관찰에 의해 나타난 것과 같이, CasX는 검정된 조건 하에서 단일 전환(single-turnover) 효소로서 작용하는 것으로 가정하였다. 따라서, 등몰량의 RNP에 의해 긴 시간에 걸쳐 절단된 표적 기질의 분획은 적절하게 형성되고 절단을 위해 활성인 RNP의 분획을 나타낼 것이다. 절단 반응은 이러한 농도 방식 하에서 단상성으로부터 명백하게 벗어나기 때문에, 절단 트레이스(cleavage traces)에 이상성 속도 모델을 피팅하였다. 각 피팅의 평탄부를 결정하고 각 RNP에 대한 활성 분획으로서 표 30에 보고하였다.
| gRNA 활성의 생화학적 특성 분석에 사용된 형광 모이어티를 5' 단부에 갖는 표적 DNA 기질 올리고뉴클레오티드의 서열. /700/ = IRDye700; /800/ = IRDye800 | |
| DNA 기질 | 서열 |
| 6.7/6.8 표적 상단 가닥 (서열번호 3182) |
/700/catgtcttccatggccttcttcctggcttcctggtgaagatgagtggcgacctgctggag |
| 6.7/6.8 표적 하단 가닥 (서열번호 3183) |
/800/ctccagcaggtcgccactcatcttcaccaggaagccaggaagaaggccatggaagacatg |
CasX mRNA의 시험관 내 전사:
시험관 내 전사에 사용된 CasX 491을 암호화하는 DNA 템플릿(암호화 서열은 표 28 참조)을 T7 프로모터를 함유하는 정방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 생성한 다음, 적절한 크기의 DNA를 아가로오스 겔 추출하였다. 제조사의 권장 프로토콜에 따라 이를 약간 수정하여 수행된 각각의 시험관 내 전사 반응에 25 ng/μL의 템플릿 DNA의 최종 농도를 사용하였다. 시험관 내 전사물 인큐베이션을 CleanCap® AG 및 N1-메틸-슈도우리딘으로 37℃에서 2~3시간 동안 수행한 후, Zymo RNA 미니프렙 키트를 사용하여 템플릿 DNA의 DNAse 분해 및 컬럼 기반 정제를 수행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 대장균 폴리A 중합효소를 사용하여 폴리(A) 꼬리를 첨가하고, 이어서 전술한 바와 같이 컬럼 기반 정제를 수행하였다. 폴리(A) 꼬리가 첨가된 시험관 내 전사된 RNA를 RNAse가 없는 물에서 용리시키고, Agilent TapeStation 상에서 무결성에 대해 분석하고, 급속 냉동시킴 후 -80℃에서 보관하였다.
| CasX 491 mRNA ID | 성분 (ID) |
DNA 서열 또는
서열번호: |
| CasX 491 mRNA #1 | 5'UTR | 3082 |
| 시작 코돈 + c-MYC NLS + 링커 | 3184 | |
| CasX 491 | 3185 | |
| 링커 + c-MYC NLS | 3186 | |
| P2A mScarlet + 종결 코돈 | 3187 | |
| CasX 676 mRNA #2 | 5'UTR | 3047 |
| 시작 코돈 + c-MYC NLS | 3133 | |
| CasX 676 | 3134 | |
| c-MYC NLS + 종결 코돈 | 3135 | |
| 3'UTR | 3055 | |
| XbaI 제한 부위 (부분) | TCTAG | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3057 | |
| *성분은 작제물 내에서 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있음 | ||
형질감염을 통한 gRNA 및 CasX mRNA의 시험관 내 전달:
PCSK9 유전자좌에서의 편집 및 분비된 PCSK9 수준에 미치는 최종 효과를, 스캐폴드 변이체 316을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA가 사용된 조건과 비교하여, 스캐폴드 변이체 174를 갖는 PCSK9-표적화 gRNA와 공동 전달된 CasX 491 mRNA를 사용하는 조건에 대해 평가하였다. P2A 및 mScarlet 형광 단백질을 갖는 CasX 491을 코딩하는 100 ng의 시험관 내 전사된 mRNA를 리포펙타민을 사용해 gRNA 174-6.7, 174-6.8, 316-6.7, 및 316-6.8의 버전 1(v1)과 함께 HepG2 세포 내로 형질감염시켰다(표 26 참조). 배지 변경 후, 형질감염 후 28시간차에 다음을 수확하였다: 1) PCSK9 유전자좌에서 NGS(차세대 시퀀싱)에 의한 편집 평가를 위해 형질감염된 세포를 수확함; 및 2) 분비된 PCSK9 단백질 수준을 ELISA에 의해 측정하기 위해 배지 상청액을 수확함. NGS에 의한 편집 분석을 위해, PCSK9 유전자좌를 표적화하는 프라이머 세트로 200 ng의 추출된 gDNA로부터 표적 앰플리콘을 증폭시키고, NGS에 의해 처리하였다(아래에 기술됨). 배지 상청액 중 분비된 PCSK9 수준도, CISBio의 형광 공명 에너지 전달 기반 면역검정을 제조사의 지침에 따라 사용하여 분석하였다. 여기서, 내인성 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 유전자좌를 표적화한 스페이서 7.37(v0; 표 26 참조)을 갖는 스캐폴드 174를 사용하는 gRNA는 비표적화(NT) 대조군의 역할을 하였다. 이들 결과는 도 20에 도시되어 있다.
B2M-표적화 gRNA의 버전 0(v0) 및 버전 1(v1)의 편집 효능을 비교하기 위해, 약 6E4개의 HepG2 간세포를 96-웰 플레이트의 웰마다 시딩하였다. 24시간 후, 시딩된 세포를 CasX 491을 코딩하는 100 ng의 시험관 내 전사된 mRNA 및 스캐폴드 변이체 174 및 스페이서 7.37을 함유하는 B2M-표적화 gRNA의 v0 또는 v1의 상이한 투여량(1, 5, 또는 50 ng)으로 리포펙타민을 사용해 공동 형질감염시켰다(표 26 참조). 형질감염 후 6일차에, B2M-의존적 HLA 단백질의 면역염색을 통한 B2M 단백질 발현 분석을 위해 세포를 수확한 다음, Attune™ NxT 유세포 분석기를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 이들 결과는 도 17에 도시되어 있다.
화학적으로 변형된 PCSK9-표적화 gRNA의 V1 내지 v6 변이체(표 26)를 편집 효능에 미치는 이들의 효과 및 분비된 PCSK9 수준에 미치는 최종 효과에 대해 시험관 내에서 평가하였다. 간략하게, CasX 변이체 491 및 P2A 및 mScarlet 형광 단백질을 코딩하는 코딩하는 100 ng의 시험관 내 전사된 mRNA를 리포펙타민을 사용하여 50 ng의 표시된 화학적으로 변형된 gRNA로 HepG2 세포 내로 형질감염시켰다. 배지 변경 후, 형질감염 후 28시간차에 다음을 수확하였다: 1) PCSK9 유전자좌에서 전술한 바와 같이 NGS에 의한 편집 평가하기 위한 형질감염된 세포; 및 2) 분비된 PCSK9 단백질 수준을 전술한 바와 같이 ELISA에 의해 측정하기 위해 배지 상청액. 여기서, B2M-표적화 gRNA를 비표적화 대조군으로서 사용하였다. 이들 결과는 표 31에 나타나 있다.
NGS 처리 및 분석:
제조상의 지침에 따라, Zymo Quick-DNA Miniprep Plus 키트를 사용하여, 수확된 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. 약 50 내지 200 ng의 추출된 gDNA로부터의 관심 영역을 인간 PCSK9 유전자를 표적화하는 프라이머 세트로 증폭하여 표적 앰플리콘을 형성하였다. 이들 유전자-특이적 프라이머는 Illumina 판독 1 및 2 서열을 도입하기 위한 추가 서열을 5' 단부에 함유하였다. 또한, 이들은 고유 분자 식별자(UMI)로서 기능하는 16-뉴클레오티드 무작위 서열을 함유하였다. 앰플리콘의 품질 및 정량화는, 단편 분석기 DNA 분석 키트(Fragment Analyzer DNA Analyzer kit, Agilent, dsDNA 35-1500 bp)를 사용하여 평가하였다. 제조사의 지침에 따라 Illumina MiSeq™ 상에서 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 원시 fastq 시퀀싱 파일을 품질 및 어댑터 서열에 대해 트리밍하고 리드 1 및 리드 2를 단일 삽입 서열로 병합함으로써 처리한 다음; 삽입 서열을 CRISPResso2(v 2.0.29) 프로그램에 의해 분석하였다. 스페이서의 3' 단부 주위의 윈도우에서 변형된 리드의 백분율을 결정하였다. CasX 분자의 활성을 각각에 대한 윈도우 내의 어느 곳에서라도 삽입, 치환, 및/또는 결실을 함유하는 리드의 총 백분율로서 정량화하였다.
지질 나노입자(LNP)의 제형:
CasX mRNA 및 gRNA는 제조사의 지침에 따라 Precision NanoSystems Inc.(PNI) Ignite™ Benchtop System을 이용해 GenVoy-ILM™ 지질을 사용하여 LNP 내로 캡슐화하였다. GenVoy-ILM™ 지질은 PNI에 의해 제조된, 50:10:37.5:2.5 mol%의 이온화 가능한 지질:DSPC:콜레스테롤:안정화제로 이루어진 독점적 조성물이다.
간략하게, LNP를 제형화하기 위해, 동일한 질량비의 CasX mRNA 및 gRNA를 pH 4.0의 PNI 제형 완충액에서 희석하였다. GenVoy-ILM™ 지질을 무수 에탄올에서 1:1로 희석하였다. mRNA/gRNA 공동 제형은 소정의 N/P 비를 사용하여 수행하였다. RNA 및 지질은 PNI Ignite™ Benchtop System 상에서 소정의 유속 비(RNA:Genvoy-ILM™)로 PNI 층류 카트리지를 통과시켰다. 제형화 후, LNP를 pH 7.4의 PBS에서 희석하여 에탄올 농도를 감소시키고 pH를 증가시켰는데, 이는 입자의 안정성을 증가시킨다. mRNA/sgRNA-LNP의 완충액 교환은 10k Slide-A-Lyzer™ 투석 카세트(Thermo Scientific™)를 사용하여 4℃에서 pH 7.4의 PBS 내로 밤새 투석함으로써 달성하였다. 투석 후, mRNA/gRNA-LNP를 100 kDa Amicon®-Ultra 원심분리 필터(Millipore)를 사용하여 > 0.5 mg/mL로 농축시킨 다음, 멸균여과하였다. 제형화된 LNP를 Stunner(Unchained Labs)를 이용해 분석하여 이들의 직경 및 다분산 지수(PDI)를 결정하였다. 캡슐화 효율 및 RNA 농도는 Invitrogen의 Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 검정 키트를 사용하여 RiboGreen™ 검정에 의해 결정하였다. LNP는 본원에 기술된 것과 같은 다양한 실험에 사용하여 CasX mRNA 및 gRNA를 표적 세포 및 조직에 전달하였다.
시험관 내에서 CasX mRNA를 캡슐화하고 gRNA를 표적화하는 LNP의 전달:
10% FBS 및 1% PenStrep을 함유하는 DMEM/F-12 배지에서 배양한 약 50,000개의 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에서 웰마다 시딩하였다. 다음 날, 시딩된 세포를, 250 ng에서 시작하여 2배 연속 희석물로 제조한 다양한 농도의 6개의 LNP로 처리하였다. 이들 LNP를 제형화하여 CasX 491 mRNA 및 스캐폴드 변이체 174 또는 316을 스페이서 7.9(v1; 표 26 참조)와 함께 포함하는 B2M-표적화 gRNA를 캡슐화하였다. LNP 처리 후 24시간차에 배지를 변경하고, 6일 동안 세포를 추가로 배양한 후 수확하여, NGS에 의한 B2M 유전좌에서의 편집 평가를 위해 gDNA를 추출하고 HLA 면역 염색을 통해 B2M 단백질 발현을 분석한 후, Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 유세포 분석하였다. 간략하게, 편집 평가를 위해, 인간 B2M 유전자좌를 표적화하는 프라이머로 200 ng의 추출된 gDNA로부터 앰플리콘을 증폭시키고, 실시예 7에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 NGS에 의해 처리하였다. 이들 검정의 결과는 도 21a 및 21b에 도시되어 있다.
약 20,000개의 마우스 Hepa1~6 간세포를 96-웰 플레이트에 웰마다 시딩하였다. 다음 날, 시딩된 세포를, 1000 ng에서 시작하여 8개의 2배 연속 희석물로 제조한 다양한 농도의 LNP로 처리하였다. 이들 LNP를 제형화하여 CasX 676 mRNA #2(표 28 참조) 및 스페이서 35.2(v1 또는 5; 표 26 참조)를 갖는 스캐폴드 변이체 316이 통합된 ROSA26-표적화 gRNA를 캡슐화하였다. LNP로 처리한 후 24시간차에 배지를 변경하고, 세포를 7일 동안 추가로 배양한 후, NGS에 의한 ROSA26 유전자좌에서의 편집 평가를 위해 gDNA를 추출하였다. 간략하게, 마우스 ROSA26 유전자좌를 표적화하는 프라이머 세트로 추출된 gDNA로부터 앰플리콘을 증폭시키고 실시예 7에서 기술한 것과 유사한 방법을 사용해 NGS에 의해 처리하였다. 본 실험의 결과는 도 22a에 도시되어 있다.
생체 내에서 CasX mRNA를 캡슐화하고 gRNA를 표적화하는 LNP의 전달:
스캐폴드 316의 v1 및 v5를 사용하는 효과를 생체 내에서 평가하기 위해, CasX 676 mRNA #2(표 28 참조) 및 스페이서 35.2(v1 또는 v5; 표 26 참조)를 갖는 스캐폴드 316을 사용하는 ROSA26-표적화 gRNA를 mRNA:gRNA에 대한 1:1 질량비를 사용하여 동일한 LNP 내에 캡슐화하였다. 제형화된 LNP를 생체 내 주사를 위해 PBS로 완충액 교환하였다. 간략하게, LNP를 4주령 C57BL/6 마우스에게 역-안와동을 통해 정맥내 투여하였다. 주사 후 5분 동안 마우스를 관찰하여 마취로부터 회복을 확인한 후, 홈 케이지에 넣었다. 미노출, 미주사 동물은 실험 대조군의 역할을 하였다. 투여 후 6일차에, 마우스를 안락사시키고, Zymo Research Quick DNA/RNA Miniprep 키트를 제조사의 지침에 따라 사용하여 gDNA 추출을 위해 간 조직을 채취하였다. 그런 다음, 마우스 ROSA26 유전자좌를 표적화하는 프라이머 세트로 추출된 gDNA로부터 표적 앰플리콘을 증폭시키고, NGS에 의한 편집 평가를 위해 실시예 7에 기술된 것과 유사항 방법을 사용해 처리하였다. 본 실험의 결과는 도 22b에 도시되어 있다.
스캐폴드 316의 v7, v8, 및 v9를 사용하는 것이 PCSK9 유전자좌에서 편집에 미치는 효과를 생체 내에서 비교하기 위해, CasX 676 mRNA #1(서열에 대해서는 표 29 참조) 및 스페이서 27.107(v1, v7, v8, 또는 v9; 표 26 참조)을 갖는 스캐폴드 316을 사용하는 PCSK9-표적화 gRNA를 각 gRNA별로 mRNA:gRNA에 대한 1:1 질량비를 사용하여 동일한 LNP 내에 캡슐화하였다. 전술한 바와 같이, LNP를 6주령 C57BL/6 마우스에게 역-안와 투여하고, 주사 후 7일차에 마우스를 안락사시키고, NGS에 의한 PCSK9 유전자좌에서의 편집 평가를 위한 gDNA 추출을 위해 간 조직을 채취하였다. 본 실험의 결과는 도 23에 도시되어 있다.
| CasX ID | 성분 (ID) | 설명 | 서열번호 |
| CasX 676 mRNA #1 | 5'UTR | hHBA | 3188 |
| 시작 코돈 + c-MYC NLS | 3133 | ||
| CasX 676 | 3134 | ||
| c-MYC NLS + 종결 코돈 | 3135 | ||
| 3' UTR | hHBA | 3189 | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3057 | ||
| *성분은 작제물 내에서 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있음 | |||
결과:
다양한 화학적 변형이 gRNA 활성에 미치는 효과 평가:
Cas9를 포함하는 여러 연구는, gRNA의 화학적 변형이 Cas9 mRNA와 함께 전달될 때 편집 활성을 유의하게 개선시켰음을 입증하였다. Cas9 mRNA 및 gRNA를 표적 세포 내로 전달한 후, 보호되지 않은 gRNA는 mRNA 번역 과정 동안 분해되기 쉽다. 2'O-메틸(2'Ome) 기 및 포스포로티오에이트 결합과 같은 화학적 변형의 첨가는 세포 Rnase에 대한 gRNA의 감수성을 감소시킬 수 있지만, gRNA의 접힘 및 CRISPR-Cas 단백질과의 상호작용을 방해할 가능성도 갖는다. CasX와 Cas9 간의 구조적 유사성뿐만 아니라 이들 각각의 gRNA의 구조적 유사성도 결여되어 있음을 감안하여, 반드시 적절한 화학적 변형 프로파일을 새롭게 설계하고 검증해야 한다. 참조로서, 델타프로테오박테리아 유래의 야생형 CasX의 공개된 구조(PDB 코드 6NY1, 6NY2, 및 6NY3)를 사용하여, 변형에 잠재적으로 순응하는 것으로 나타난 잔기를 선택하였다. 그러나, 공개된 구조는 본원에 제시된 조작된 변이체에 대한 근거로서 사용된 종과 구별되는 야생형 CasX 동원체(ortholog) 및 gRNA의 구조였을 뿐 아니라, 단백질 측쇄와 RNA 백본 간의 상호작용을 자신 있게 결정하기 위한 해상도도 부족하였다. 이러한 제한으로 인해 어떤 뉴클레오티드가 안전하게 변형될 수 있는지 결정하는 데 상당한 모호성이 발생하였다. 결과적으로, 화학적 변형의 6개의 프로파일(버전으로 표시됨)을 초기 시험을 위해 설계하였으며, 이들 6개의 프로파일은 도 16a 및 16b에 도시되어 있다. v1 프로파일은 간단한 단부가 보호된 구조로서 설계되었으며, 여기서 처음과 마지막 3개의 뉴클레오티드는 2'Ome 및 포스포로티오에이트 결합으로 변형되었다. v2 프로파일에서, 3'UUU 꼬리를 추가하여 세포 전사 시스템에 사용된 종결 서열을 모방하고, 변형된 뉴클레오티드는 표적 인식에 관여하는 스페이서의 영역 외부로 이동시켰다. v3 프로파일은 v1에서와 같은 단부 보호를 포함하였을 뿐만 아니라, 구조 분석에 기초하여 잠재적으로 변형 가능한 것으로 식별된 모든 뉴클레오티드에 2'Ome 변형을 추가하였다. v4 프로파일은 v3에 기초하여 모델링하였지만, 삼중체 영역 내의 모든 변형이 제거하였는데, 이 구조가 RNA 나선형 구조 및 백본 가요성의 임의의 교란에 더 민감할 것으로 예측되었기 때문이다. v5 프로파일은 스캐폴드 줄기 및 연장된 줄기 영역에서 화학적 변형을 유지한 반면, v6 프로파일은 연장된 줄기에서만 변형을 보유하였다. 연장된 줄기는 RNP 내의 용매에 완전히 노출되게 되고 다른 헤어핀 구조에 의한 교체에 순응할 수 있는 영역이므로, 화학적 변형에 상대적으로 민감하지 않을 것으로 추정된다.
먼저, 최소 변형된 v1 gRNA를 변형되지 않은 gRNA(v0)에 대해 평가하여, gRNA가 CasX mRNA와 함께 표적 세포에 공동 전달될 때, 이러한 화학적 변형이 편집에 미치는 잠재적 이점을 결정하였다. 스페이서 7.37을 갖는 변형된(v1) 및 변형되지 않은(v0) B2M-표적화 gRNA를 CasX mRNA와 함께 HepG2 세포 내로 공동 형질감염시키고, 유세포 계측법으로 검출했을 때 B2M-의존적 HLA 복합체의 표면 제시의 상실에 의해 B2M 유전자좌에서의 편집을 측정하였다(도 17). 데이터는, v1 gRNA의 사용이 다양한 투여량에 걸쳐 v0 gRNA에서 관찰된 수준에 비해 B2M 발현을 실질적으로 더 큰 상실을 초래하여, gRNA의 단부 변형이 CasX mRNA 및 gRNA의 전달 후 CasX 매개 편집 활성 증가가 확인되었음을 보여준다.
스캐폴드 변이체 235 및 스페이서 6.7 및 6.8을 사용하는 PCSK9-표적화 gRNA를 사용하여 더 넓은 세트의 gRNA 화학적 변형 프로파일을 평가하여 추가의 화학적 변형이 활성 RNP의 형성을 뒷받침할 수 있는지 여부를 결정하였다. 전술한 시험관 내 절단 검정을 수행하여 다양한 화학적 변형 프로파일을 보유하는 이들 조작된 gRNA에 대한 kcleave 및 분획 유능성을 결정하였다. 이들 시험관 내 절단 검정의 결과는 표 30에 나타나 있다. 데이터는, v3 프로파일을 갖는 gRNA가 활성을 나타내지 않았음을 입증하는데, 이는 일부 화학적 변형의 추가가 RNP 형성 또는 활성을 상당히 방해하였음을 나타낸다. v4 화학적 변형의 추가는 과량의 RNP 조건에서 합리적인 절단 속도를 초래하였지만, 매우 낮은 분획 유능성을 나타냈다. v3 및 v4 변형 간의 차이를 통해 삼중체 영역에서의 변형이 임의의 활성 RNP의 형성을 방지하였음을 확인하였는데, 이는 gRNA가 적절히 접힐 수 없기 때문이거나 gRNA-단백질 상호작용의 파괴로 인한 것이었다. v4 변형의 첨부에 기인한 분획 유능성의 감소는 gRNA가 CasX 단백질과 성공적으로 조립되어 절단-유능성 RNP를 형성할 수 있었지만, gRNA의 대부분이 잘못 접혔다는 것, 또는 첨부된 화학적 변형이 CasX 단백질에 대한 gRNA의 친화도를 감소시키고 RNP 형성의 효율을 방해하였음을 시사한다. v5 또는 v6 프로파일의 적용한 결과, v1 및 v2 변형을 사용한 반응에 대해 수득된 것과 유사하지만 이보다는 약간 낮은 유능한 분획이 생성되었다. kcleave 값은 v5 및 v6 gRNA에서 비교적 일관되었지만, v5 및 v6 gRNA 둘 다는 v1 및 v2 gRNA에 대한 kcleave 값의 거의 절반을 달성하였다. v6 gRNA에 대한 kcleave 값 감소는, 변형된 연장된 줄기에서 gRNA와 CasX 단백질 간에 예상되는 상호작용의 결여를 감안했을 때 특히 놀라웠다. 그러나, v5 및 v6 gRNA 둘 다에 대해, 2'Ome 변형에 기인하는 gRNA의 감소된 가요성이 효율적인 절단에 필요한 RNP의 구조적 변화를 억제하였거나, CasX 단백질 상호작용에 관여하는 헤어핀의 변형된 초기 염기쌍이 2'Ome 기를 포함함으로써 부정적인 영향을 받았을 가능성이 있다.
| 스캐폴드 235를 사용하고 버전 번호로 표시된 화학적 변형 프로파일을 보유하는 다양한 PCSK9 -표적화 gRNA를 갖는 CasX RNP에 대해 평가된 절단 활성의 파라미터. | ||
| gRNA (스캐폴드 변이체-스페이서, 버전 번호) |
k cleave (분 -1 ) | 분획 능력 |
| 235-6.7, v1 | 0.901 | 0.398 |
| 235-6.8, v1 | 1.36 | 0.398 |
| 235-6.7, v2 | 0.454 | 0.386 |
| 235-6.8, v2 | 2.03 | 0.361 |
| 235-6.7, v3 | 0 | 0 |
| 235-6.8, v3 | 0 | 0 |
| 235-6.7, v4 | 0.434 | 0.031 |
| 235-6.8, v4 | 0.257 | 0.005 |
| 235-6.7, v5 | 0.506 | 0.313 |
| 235-6.8, v5 | 0.680 | 0.388 |
| 235-6.7, v6 | 0.462 | 0.346 |
| 235-6.8, v6 | 0.715 | 0.325 |
이어서, 스캐폴드 235에 기초하여 화학적으로 변형된 PCSK9-표적화 gRNA를 세포 기반 검정에서 편집에 대해 평가하였다. CasX mRNA 및 화학적으로 변형된 PCSK9-표적화 gRNA를 리포펙타민을 사용하여 HepG2 세포 내로 공동 형질감염시켰다. 편집 수준은 NGS에 의한 PCSK9 유전자좌에서의 인델률 및 ELISA에 의한 분비된 PCSK9 수준에 의해 측정하였고, 데이터는 표 31에 나타나 있다. 데이터는, v3 및 v4 gRNA의 사용이 PCSK9 유전자좌에서 편집 활성을 최소화하였음을 입증하며, 이는 표 30에 표시된 생화학적 시험관 내 절단 검정의 결과와 일치한다. 한편, v5 및 v6 gRNA을 사용한 결과, 인델률 및 PCSK9 분비에 의해 측정된 편집 수준은 v1 및 v2 gRNA의 사용으로 달성된 수준보다 약간 더 낮았다(표 31). 구체적으로, 결과는, 단부 변형을 보유한 v1 및 v2 gRNA을 사용한 결과 PCSK9 유전자좌에서 약 80~85%가 편집되었음을 보여주는데, 이는 gRNA 단부에 화학적 변형을 추가하는 것이 CasX로 효율적인 편집을 달성하기에 충분함을 나타낸다. 데이터는 v5 및 v6 gRNA의 사용이 시험관 내에서 효율적인 편집을 초래하였음을 입증하지만, gRNA의 단일 투여량을 형질감염시킨 본 실험에서는 v1 gRNA의 사용으로 포화 수준에 근접한 편집이 관찰되었다. 결과적으로, 가이드 제한 조건 하에, 단일 투여량의 사용은 화학적 변형이 편집에 미치는 효과를 명확하게 평가하는 것을 어렵게 하였다. 따라서, 프로파일 v1 및 v5를 추가 시험을 위해 선택하였는데, 이는 v1이 가장 단순한 변형 프로파일을 함유하고 있고, v5는 이의 적용이 시험관 내에서 강력한 활성을 입증한 가장 많이 변형된 프로파일이기 때문이다(표 30 및 표 31).
| 스캐폴드 235 및 스페이서 6.7 또는 6.8을 사용하여 화학적으로 변형된 다양한 PCSK9-표적화 gRNA 및 CasX 491 mRNA로 공동 형질감염시킨 HepG2 세포에서, NGS에 의해 검출한 PCSK9 유전자좌에서의 인델률 및 ELISA에 의해 검출된 분비된 PCSK9 수준에 의해 측정한 편집 수준. | ||||
| 실험 조건 | Indel 률(편집 분획) | 분비된 PCSK9 (ng/mL) | ||
| 평균 | 표준 편차 | 평균 | 표준 편차 | |
| CasX mRNA 단독 | 0.0021 | 0.003 | 52 | 14 |
| 235-6.7, v1 | 0.83 | 0.0058 | 18 | 5.7 |
| 235-6.7, v2 | 0.79 | 0.0071 | 21 | 4 |
| 235-6.7, v3 | 0.024 | 0.02 | 48 | 19 |
| 235-6.7, v4 | 0.12 | 0.006 | 34 | 5.5 |
| 235-6.7, v5 | 0.73 | 0.023 | 21 | 9 |
| 235-6.7, v6 | 0.75 | 0.0069 | 22 | 8.8 |
| 235-6.8, v1 | 0.85 | 0.017 | 16 | 4.4 |
| 235-6.8, v2 | 0.83 | 0.0028 | 20 | 1.5 |
| 235-6.8, v3 | 0.023 | 0.0027 | 39 | 2.7 |
| 235-6.8, v4 | 0.088 | 0.0086 | 42 | 10 |
| 235-6.8, v5 | 0.77 | 0.017 | 19 | 1.6 |
| 235-6.8, v6 | 0.78 | 0.014 | 24 | 6.9 |
| 비표적화 대조군 | 0.0019 | 0.0026 | 42 | 12 |
v1 및 v5 프로파일을 또 다른 세포 기반 검정에서 추가로 시험하여 편집 효율에 미치는 이들의 효과를 평가하였다. LNP를 제형화하여 CasX 676 mRNA #2 및 새롭게 설계된 gRNA 스캐폴드 316(다음 하위 섹션에서 추가로 기술됨)을 사용하는 v1 및 v5 화학적으로 변형된 ROSA26-표적화 gRNA를 공동 캡슐화하였다. “v5” 프로파일은 316 스캐폴드에 적용하기 위해 약간 변형되었다. 연장된 줄기 바로 5'에 있는 비-염기-쌍 영역에서 있는 3개의 2' Ome 변형을 제거하여 2개의 줄기루프 영역에 대한 변형을 제한하였다. Hepa1~6 간세포를 다양한 투여량의 생성된 LNP로 치료하고, 치료 후 8일차에 수확하여, NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정된, ROSA26 유전자좌에서의 편집을 평가하였다(도 22a). 데이터는 v5 ROSA26-표적화 gRNA를 전달하는 LNP로 치료하는 것이 v1 대응물로 달성된 수준과 비교하여 투여량 범위에 걸쳐 현저하게 더 낮은 편집 수준을 초래하였음을 입증한다(도 22a). 표 31에서 관찰된 것 대비, 도 22a에서 v5 gRNA의 사용으로 관찰된 비교 활성에 있어서의 차이에 대해서는 몇 가지 가능한 설명이 있다. 먼저 가장 가능성이 높은 설명은, 표 31에 나타난 편집을 달성하는 데 사용된 단일 투여량이 너무 높아 v5 gRNA와 v1 gRNA의 사용 간의 활성 차이를 정확하게 측정할 수 없었다는 것이다. 316의 v5 버전에서 줄기루프 모티프 외부에 있는 변형을 제거한 것이 가이드 활성에 부정적인 영향을 미쳤을 수도 있다. 이들 변형이 줄기루프 변형에 의해 부여된 활성 비용을 상회하는 안정성 이익을 제공할 가능성이 있지만, 변형 수준의 증가가 지금까지 활성을 감소시켰음을 고려할 때 가능성이 없어 보인다. 가능한 마지막 설명은, v5 프로파일에 있어서의 변형이 변형된 뉴클레오티드 백본과 LNP의 이온화 가능한 지질 간의 차등 상호작용을 통해 LNP 제형 또는 이의 거동에 부정적인 영향을 미쳤을 수 있고, 이는 잠재적으로 덜 효율적인 gRNA 캡슐화 또는 내재화 후 덜 효율적인 gRNA 방출을 초래할 수 있다는 것이다.
CasX mRNA #2 및 스캐폴드 316에 기초한 v1 및 v5를 화학적으로 변형된 ROSA26-표적화 gRNA를 공동 캡슐화하는 LNP를 생체 내에서 추가로 시험하였다. 도 22b는 편집 검정의 결과를 ROSA26 유전자좌에서의 인델률로서 측정된 편집 백분율로서 보여준다. 데이터는 생체 내 LNP 전달의 보다 유관한 시험 조건 하에서, v5 gRNA의 사용이 v1 gRNA의 사용으로 달성한 것에 비해 약 5배 더 낮은 편집을 초래하였음을 입증한다. 이들 소견은 표 30에서 v5 gRNA에 대해 생화학적으로 관찰된 절단 속도 감소를 뒷받침하는데, 이는 v5 변형이 CasX 활성의 일부 양태를 방해했음을 나타낸다. v5 및 v6 프로파일에서 검출된 활성의 일관된 감소를 고려하면(표 30), 편집의 감소는 연장된 줄기 영역의 변형에 기인할 수 있다. 비록 gRNA의 연장된 줄기가 CasX 단백질과 최소한의 상호작용을 갖지만, 제1 염기쌍에서 2'Ome 기의 추가가 CasX 단백질-gRNA 상호작용을 파괴하였거나, 연장된 줄기가 유사매듭 및 삼중체 영역과 만나는 복잡한 RNA 접힘을 파괴했을 가능성이 있다. 보다 구체적으로, 2'Ome 기를 포함시키는 것은 gRNA 연장된 줄기의 기저 염기쌍 및 CasX 단백질의 잔기 R49, K50, 및 K51에 악영향을 미쳤을 수 있다. 마지막으로, CasX의 구조 연구는 효율적인 DNA 절단을 위해 gRNA의 가요성이 필요함을 시사하였다(Liu J, 등의 문헌[CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature 566:218-223 (2019)]; Tsuchida CA 등의 문헌[Chimeric CRISPR-CasX enzymes and guide RNAs for improved genome editing activity. Mol Cell 82(6): 1199-1209 (2022)]). 따라서, 연장된 줄기 전체에 걸쳐 2'Ome 기의 추가가 더 강성인 A-형 나선형 구조를 강제하고, 효율적인 절단을 위해 gRNA에 필요한 가요성을 방해했을 수 있다. 또한, v5 및 v6 프로파일에서 스캐폴드 줄기의 추가 변형이 활성에 해로울 가능성이 있는데, 이는 v5 및 v6 프로파일 간의 제한된 비교를 고려할 때 현재로서는 명확하지 않다.
RNP 절단 활성에 미칠 부작용을 완화하면서 gRNA 안정성을 향상시키는 것을 목표로 추가의 변형 프로파일을 설계하였다. 평가 중인 조작된 CasX 변이체와 더 높은 상동성을 갖는 부유균문(Planctomycetes) 유래의 야생형 CasX의 최근에 공개된 구조(PDB 코드 7WAY, 7WAZ, 7WB0, 7WB1)를 사용하여, gRNA에 대한 추가적인 화학적 변형 프로파일을 설계하였고, 이는 도 18에 도시되어 있다. 이들 프로파일은 2'Ome 기 및 포스포로티오에이트 결합을 새롭게 설계된 gRNA 스캐폴드 변이체에 첨가하는 것을 도시하는데, 이는 다음 하위 섹션에 기술되어 있다. 이들 새로운 gRNA 화학적 변형 프로파일은, 표 31에서 관찰된 충분한 편집 활성을 입증하는 초기 데이터에 기초하여, 연장된 줄기 및 스캐폴드 줄기 영역에 대한 변형이 활성에 부정적인 영향을 미치지 않을 것임을 시사한 v5 gRNA를 사용하여 설계하였다. v7 프로파일은, 이러한 변형을 추가함으로써 v3 프로파일에서 이전에 관찰된 극적인 부정적 효과를 감안하여, 삼중체 영역을 배제한 gRNA 구조 전체에 걸쳐 변형될 가능성이 있는 잔기에 2'Ome를 포함하도록 설계되었다. 도 18에 도시된 바와 같이, 보다 보존적 프로파일 v8 및 v9도 설계하였다. v8 작제물의 경우, 유사매듭 및 삼중체 루프 영역에서 변형을 제거하였지만, 5' 및 3' 말단을 비롯하여 스캐폴드 줄기, 연장된 줄기, 및 이들의 측부에 위치하는 단일 가닥 영역에서는 유지하였다. v9 프로파일의 경우, 줄기 루프의 측면에 위치하는 단일 가닥 영역에서 변형을 제거하였지만, 유사매듭, 삼중체 루프, 및 5' 및 3' 말단을 비롯하여 줄기 루프 자체에서는 유지하였다. 새롭게 설계된 gRNA 스캐폴드 변이체 316의 추가적인 화학적 변형 프로파일 v7, v8, 및 v9(아래에서 추가로 논의됨)를 PCSK9 유전자좌에서 생체 내 평가하였다. 검출된 NGS로서의 인델률로서 측정된 PCSK9 유전자좌에서의 편집 백분율로서 정량화한 생체 내 편집 검정의 결과는 도 23에 도시되어 있다. 전반적으로 낮은 편집 효율이 검출되었다는 사실에도 불구하고, 데이터는 v7, v8, 및 v9 gRNA의 사용이 v1 gRNA의 사용으로 달성된 인델률에 비해 PCSK9 유전자좌에서 더 낮은 편집 수준을 초래하였음을 입증한다(도 23). v5 gRNA로 달성된 열등한 편집 활성을 보여주는 도 22a~22b에서의 소견을 감안하면, v7, v8, 및 v9 프로파일이 비교적 낮은 편집 활성을 유사하게 나타냈다는 것이 놀라운 일은 아니다. 도 18에 도시된 바와 같이, v7, v8, 및 v9 프로파일은 연장된 줄기 영역 전체에 걸쳐 변형을 포함하는데, 이는 RNP 활성을 방해했을 수 있다.
시험관 내 절단 검정을 사용하여 gRNA 스캐폴드 변이체 174와 316 비교하기:
이전의 연구는 다수의 전달 조건에 걸쳐 gRNA 스캐폴드 변이체 235를 최고 성능의 스캐폴드 변이체로서 확립하였다. 그러나, 스캐폴드 174(20 bp 스페이서를 사용할 때 109 bp)를 포함하는 gRNA에 비해 더 긴 길이의 스캐폴드 235(20 bp 스페이서를 사용할 때 119 bp)는 고상 RNA 합성의 어려움을 증가시켰는데, 이는 제조 비용 증가, 순도 및 수율 감소, 및 합성 실패율 증가를 초래할 것이다. 이러한 문제를 해결하되 스캐폴드 변이체 235를 사용했을 때의 개선된 활성은 유지시키기 위해, 주로 스캐폴드 235 서열을 기준으로 하되, 스캐폴드 235의 연장된 줄기루프는 더 짧은 스캐폴드 174의 연장된 줄기루프로 교체된 키메라 gRNA 스캐폴드를 설계하였다(도 19a~19c). 생성된 키메라 스캐폴드(스캐폴드 316으로 명명함)를 스캐폴드 174 및 PCSK9-표적화 스페이서 6.7 및 6.8, 및 v1 화학적 변형 프로파일을 보유하는 B2M-표적화 스페이서 7.9와 병렬로 합성하였으며, 모든 gRNA의 처음 및 마지막 3개의 뉴클레오티드 상에 2'OMe 및 포스포로티오에이트 결합을 포함시켰다(표 26 참조). 변이체 174가 변이체 316과 길이가 동일하고 이전에 최고의 특성을 가진 스캐폴드였기 때문에, 변이체 235보다는 변이체 174를 비교자로서 선택하였다.
스캐폴드 174 및 316 및 스페이서 6.7 및 6.8을 갖는 gRNA에 대해 시험관 내 절단 활성을 평가하였다. 절단 검정은 일치하는 dsDNA 표적에 비해 20배 과량의 RNP로 수행하였다. 4개의 가이드 모두에 대해 절단 속도를 정량화하였고, 그 결과를 표 32에 나타냈다. 데이터는, 스페이서 6.7의 맥락에서, 스캐폴드 174 또는 316의 사용은 유사한 절단 속도를 초래하였고, 스캐폴드 316은 스캐폴드 174로 달성된 것보다 약간 더 빠른 절단을 초래하였음을 입증한다. 스페이서 6.8의 맥락에서, 절단 활성의 차이는 더욱 두드러졌다: 스캐폴드 316을 사용하는 CasX RNP는 스캐폴드 174를 사용하는 CasX RNP보다 거의 2배 빠르게 DNA를 절단할 수 있었다(표 32).
절단에 대해 활성인 예상 RNP의 분획을 평가하기 위해 더 긴 시간 과정에 걸쳐 등몰량의 RNP 및 DNA 표적을 사용해 검정을 수행하였다. CasX RNP는 시험된 기간에 걸쳐 본질적으로 단일 전환이고, 사용된 농도는 DNA-결합 반응의 KD보다 실질적으로 더 높을 것으로 예상되므로, 절단된 DNA의 양은 활성 RNP의 양과 근사할 것이다. 스페이서 6.7 또는 6.8 중 어느 하나에 대해, 스캐폴드 316을 포함하는 CasX RNP의 활성 분획은 스캐폴드 174를 사용하는 CasX RNP보다 25~30% 더 높았다(표 32). 이들 데이터는 스캐폴드 316을 사용하는 gRNA의 더 높은 분획이 CasX 단백질과 결합하기 위해 적절히 접혔거나, 스캐폴드 316을 사용하는 gRNA가 CasX 단백질과 더 강하게 결합할 수 있음을 시사한다. 스캐폴드 174와 비교하여, 스캐폴드 316은 적절한 gRNA 접힘에 필요한 유사매듭 및 삼중체 구조를 안정화시킬 것으로 예상되는 돌연변이를 보유한다. 특히, gRNA 구조의 어느 곳에서나 발견되는 단순한 헤어핀보다 잘못 접힐 가능성이 더 높은 이들 모티프의 증가된 안정성으로 인해 활성 형태로 접히는 gRNA의 분획이 약간 더 많아질 수 있다.
| 버전 1(v1) 화학적 변형 프로파일을 갖는 스캐폴드 변이체 174 또는 316을 함유하는 gRNA를 갖는 CasX RNP에 대해 평가된 절단 활성의 파라미터. | ||
| gRNA (스캐폴드 변이체-스페이서) |
k cleave (분 -1 ) | 분획 능력 |
| 174-6.7, v1 | 0.236 | 0.194 |
| 174-6.8, v1 | 0.142 | 0.165 |
| 316-6.7, v1 | 0.264 | 0.244 |
| 316-6.8, v1 | 0.272 | 0.213 |
세포 기반 검정에서 gRNA 스캐폴드 변이체 174 및 316의 비교:
변이체 316과 비교하여 gRNA 스캐폴드 변이체 174를 사용하는 편집 평가를 세포 기반 검정에서 수행하였다. CasX 491 mRNA 및 스페이서 6.7 및 6.8을 사용하는 PCSK9-표적화 gRNA의 버전 1(v1)을 HepG2 세포에 리포펙션하였다. 형질감염 후 28시간 차에 치료된 세포를 수확하고, NGS에 의해 PCSK9 유전자좌에서의 편집 수준을 분석하고 ELISA에 의해 분비된 PCSK9 수준을 분석하였고, 데이터는 도 20에 제공되어 있다. 데이터는, 시험된 PCSK9-표적화 gRNA 중 어느 하나의 사용이, B2M-표적화 gRNA를 사용하는 비표적화 대조군과 비교하여 PCSK9 유전자좌에서 효율적인 편집을 초래하고 PCSK9 분비를 실질적으로 감소시켰음을 입증한다. 결과는 또한, 스캐폴드 316의 사용이 스캐폴드 174의 사용으로 관찰된 것보다 PCSK9 유전자좌에서 보다 효과적인 편집을 초래하였음을 보여준다(스캐폴드 174에 비해 스캐폴드 316으로 달성된 편집 속도가 약 10% 포인트 증가함). 이러한 소견은, 스캐폴드 316의 사용이 스캐폴드 174의 사용으로 달성된 것과 비교하여 PCSK9 분비의 보다 효과적인 감소를 초래하였다는 ELISA 결과에 의해 추가로 뒷받침된다.
스캐폴드 변이체 174 및 316을 편집 검정에서도 평가하였는데, 여기서는 CasX 491 mRNA 및 어느 하나의 스캐폴드 변이체를 보유한 B2M-표적화 gRNA를 공동으로 캡슐화하도록 LNP를 제형화하였다. HepG2 세포를 다양한 투여량의 생성된 LNP로 치료하고, 치료 후 7일차에 수확하여, NGS에 의해 검출된 인델률로서 측정된 B2M 유전자좌에서의 편집을 평가하고(도 21a) 유세포 계측법에 의해 검출했을 때, B2M-의존적 HLA 복합체의 표면 제시의 상실로서 측정된 B2M 유전자좌에서의 편집을 평가하였다(도 21b). 두 검정의 결과는, 스캐폴드 316을 사용하는 B2M-표적화 gRNA를 전달하기 위해 LNP로 치료하는 것이 스캐폴드 174를 사용하는 gRNA를 전달하는 LNP와 비교하여, 각각의 투여량에서 B2M 유전자좌에서 더 높은 편집 효능을 초래하였음을 입증한다(도 21a 및 21b). 구체적으로, 250 ng의 최고 투여량에서, 스캐폴드 316의 사용은 스캐폴드 174를 사용하여 달성된 수준보다 거의 2배 더 높은 편집 수준을 초래하였다. 시험관 내 절단 검정에서 관찰된 활성의 비교적 중간 정도의 차이와 비교하여, 스캐폴드 174에 비해 스캐폴드 316을 사용할 때 편집 효능에 있어서의 이러한 실질적인 증가는 LNP 제형화 동안 gRNA 구조 및 접힘의 불안정화에 기인한 것일 수 있다. LNP 제형화 동안 낮은 pH 조건 및 양이온성 지질의 결합은 gRNA 구조의 일부에 악영향을 미치고 풀림(unfolding)을 초래할 수 있다. 결과적으로, gRNA가 전달된 후 세포질에서 신속하게 재접힘되어, CasX 단백질에 결합하여 RNP를 형성함과 동시에 Rnase 분해를 회피하는 것이 필요할 것이다. 스캐폴드 174와 비교하여 스캐폴드 316에서의 안정성 증가 돌연변이는 LNP 전달 후 세포질에서 적절한 gRNA 재접힘을 뒷받침하는 데 실질적인 이점을 제공할 수 있는 반면, 생화학적 실험에 앞서 gRNA에 대해 수행된 의도적인 접힘 프로토콜은 이들 돌연변이의 영향을 감소시켰을 가능성이 있다.
실시예 8: 조작된 CasX mRNA의 UTR 서열을 변경하는 것이 CasX 매개 편집에 영향을 미칠 수 있음의 입증
5' 및 3' UTR은 mRNA의 효율적인 번역에 필수적이고 요구된다. 여기서, CasX mRNA의 5' 및 3' UTR 서열을 변경하는 것이, CasX mRNA 및 표적화 gRNA가 형질감염을 통해 시험관 내에서 전달될 때, 표적 유전자좌에서 CasX 매개 편집에 영향을 미친다는 것을 입증하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
CasX mRNA의 IVT:
CasX 676 mRNA를 IVT에 의해 생성하였다. 간략하게, 5' UTR 영역, c-MYC NLS가 측면에 위치하는 코돈 최적화된 CasX 676, 및 3' UTR 영역을 암호화하는 작제물을 T7 프로모터 및 80-뉴클레오티드 폴리(A) 꼬리를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 CleanCap® AG 및 N1-메틸-슈도피리딘을 이용해 수행되는 IVT 반응에 사용하기 전에 선형화하였다. 5' 캡의 경우, CleanCap® AG는 m7G(5')ppp(5')mAG 구조를 함유하며, 구조 중 “m7G”는 N7-메틸구아노신을 나타내고, “mA”는 2'O-메틸아데노신을 나타내고, (5')ppp(5')는 5'에서 5' 방향으로의 삼인산 브릿지를 나타낸다. CleanCap® AG 다음에 추가의 구아닌 뉴클레오티드를 통합함으로써 전사 개시를 향상시켜, m7G(5')ppp(5')mAGG를 완전한 5' 캡 구조로서 통합하였다. 하기 실시예 9에서 논의된 바와 같이, 우리딘 리보뉴클레오시드를 N1-메틸-슈도우리딘으로 치환하는 것은 mRNA 성능을 개선하고 mRNA 면역원성을 감소시킨다.
이어서, IVT 반응물을 Dnase로 분해하여 템플릿 DNA를 제거하고 올리고-dT 컬럼을 사용하여 정제하였다. 본 실시예에서, 시험관 내 평가를 위해 CasX 676 mRNA의 2개의 구성을 생성하였다. 2개의 CasX mRNA 구성의 암호화 서열은 표 33에 상세히 기술되어 있다. 화학적 변형을 갖는 CasX mRNA를 암호화하는 전장 RNA 서열은 표 34에 열거되어 있다.
| CasX mRNA ID | 성분 (ID) | 설명 | DNA 서열 또는 서열번호: |
| CasX 676 mRNA #1 | 5'UTR | 인간 HBA | 3188 |
| 시작 코돈 + c-MYC NLS | 3133 | ||
| CasX 676 | 3134 | ||
| c-MYC NLS + 종결 코돈 | 3135 | ||
| 3' UTR | 인간 HBA | 3189 | |
| 폴리(A) 꼬리 | 3057 | ||
| CasX 676 mRNA #2 | 5'UTR | 합성(TriLink) | 3047 |
| 시작 코돈 + c-MYC NLS | 3133 | ||
| CasX 676 | 3134 | ||
| c-MYC NLS + 종결 코돈 | 3135 | ||
| 3' UTR | 마우스 HBA | 3055 | |
| XbaI 제한 부위 (부분) | TCTAG | ||
| 폴리(A) 꼬리 | 3057 |
gRNA의 합성:
본 실시예에서, 마우스 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 gRNA를 v1 변형 프로파일을 갖는 gRNA 스캐폴드 174를 사용해 설계하고(실시예 7 참조), 화학적으로 합성하였다. PCSK9-표적화 스페이서의 서열은 표 35에 열거되어 있다.
| 스페이서 ID | 표적 | RNA 서열 | 서열번호 |
| 27.103 | 마우스 PCSK9 | UAAUCUCCAUCCUCGUCCUG | 3073 |
| 27.105 | 마우스 PCSK9 | CCAAGAAGCCAGGGAAGAGG | 3192 |
| 27.106 | 마우스 PCSK9 | ACAUAUCUUUUAUGACCUCU | 3193 |
| 27.107 | 마우스 PCSK9 | CUGGCUUCUUGGUGAAGAUG | 3194 |
| 27.108 | 마우스 PCSK9 | UGGUGAAGAUGAGCAGUGAC | 3195 |
| 27.116 | 마우스 PCSK9 | GCCGUUGCUCCAAGGUAUGG | 3196 |
| 27.117 | 마우스 PCSK9 | UUCUUGGGGAUCAGGAGGCC | 3197 |
시험관 내에서 마우스 Hepa1-6 세포 내로 CasX mRNA 및 gRNA의 형질감염:
마우스 PCSK9 유전자좌에서의 편집은 시험관 내 전사된 CasX mRNA(CasX mRNA #1 또는 CasX mRNA #2; 표 33 참조) 및 PCSK9를 표적화하는 합성된 gRNA를 형질감염에 의해 Hepa1-6 세포 내로 전달함으로써 평가하였다. 간략하게, 20,000개의 Hepa1~6 세포가 담긴 각각의 웰을 CasX 676을 코딩하는 시험관 내 전사된 mRNA 및 PCSK9-표적화 gRNA로 리포펙션하였다. 배지 변경 후, 형질감염 후 20시간차에 형질감염된 세포를 수확하여 실시예 4에 전술한 바와 같이 PCSK9 유전자좌에서의 편집을 NGS에 의해 평가하였다. 실험 대조군으로서, gRNA가 없는 CasX mRNA #1 및 CasX mRNA #2의 개별 형질감염을 수행하였다.
결과:
마우스 PCSK9 유전자좌에서의 CasX-매개 편집을 사용하여 상이한 5' 및 3' UTR을 조작된 CasX mRNA에 통합하는 것의 효과를 평가하였다. 도 26의 도표는 CasX 676 mRNA #1 또는 CasX 676 mRNA #2 및 표시된 PCSK9-표적화 gRNA로 형질감염시킨 마우스 Hepa1~6 세포의 PCSK9 유전자좌에서 인델률로서 측정된 편집 백분율을 정량화한 것을 보여준다. 데이터는, 본 실험에서 시험된 모든 표적화 스페이서의 경우, CasX mRNA #2가 마우스 PCSK9 유전자좌에서 CasX mRNA #1에 의해 달성된 편집 수준과 비교하여 더 높은 편집 수준을 일관되게 나타냈다는 것을 입증한다. 구체적으로, 가장 높은 편집 속도는 스페이서 27.116으로 달성한 것으로서, CasX mRNA #2의 사용은 CasX mRNA #1에 의한 약 20% 편집 수준과 비교하여 약 35% 편집 효율을 초래하였다(도 26).
결과는 CasX mRNA의 5' UTR 및 3' UTR 서열을 변경하는 것이 세포 기반 검정에서 표적 유전자좌에서 CasX의 편집 활성에 영향을 미칠 수 있음을 입증한다.
실시예 9: 코돈 최적화된 CasX mRNA의 설계 및 시험관 내에서 표적화 gRNA와 함께 전달했을 때의 편집 효율에 대한 평가
mRNA 서열 및 연관 변형은 mRNA 기반 전달의 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 5' 캡 구조를 암호화하는 것들을 포함하여, 변형된 뉴클레오티드는 mRNA 안정성, 번역성, 및 면역원성의 중요한 결정인자이다. 여기서, 설계되고 시험된 모든 CasX mRNA에 대해, “Cap 1” 구조를 사용하였는데, 이는 2'Ome 변형을 갖는 개시 뉴클레오티드에 대한 5'-5' 삼인산염 연결에 5' m7G를 포함한 것이다. 2'Ome 변형이 없는 “Cap 0” 구조와 유사하게, 이러한 구조는 효율적인 번역을 촉진하며, “Cap 0” 구조와 비교하여 면역원성을 감소시킨다. 또한, 변형된 핵염기의 사용은 mRNA의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 여기서, 모든 시험관 내 전사 반응에 대해 N1-메틸-슈도우리딘이 우리딘 리보뉴클레오시드를 치환하는 데 사용되었는데, 이는 공개된 연구를 통해 N1-메틸-슈도우리딘이 mRNA 성능을 실질적으로 향상시키고 mRNA 면역원성을 감소시킨다는 것을 입증하였기 때문이다. 변형은, 시험관 내 전사된 mRNA의 흔한 오염물이면서 이중가닥 RNA에 대한 일차 세포질 센서인 RIG-I의 활성화를 잠재적으로 회피함으로써 생체 내에서 면역원성을 감소시키고 번역 속도를 증가시킬 것으로 예상된다.
폴리(A) 꼬리의 최적화도 탐색될 것이다. 폴리(A) 꼬리는 번역 및 mRNA 안정성에 필요하며, 꼬리가 길수록 mRNA 반감기가 길어진다. 폴리아데닐화는 폴리(A) 중합효소로 전사 후 수행될 수 있지만, 이는 꼬리 길이를 가변시키고 mRNA 생산 공정에 단계를 추가한다. mRNA 생산은 런오프(run-off) 전사가 가능하도록 IIS형 제한 부위로 종결되는 템플릿 80A-꼬리를 함유하는 플라스미드를 사용해 수행하였는데, 이는 템플릿 120A-꼬리를 함유하는 플라스미드를 포함하는 작제물은 대장균의 전파 동안에 불안정하고, 꼬리 길이가 상당히 줄어든 클론을 생성하는 경우가 종종 있기 때문이다. 공개된 연구를 통해 유사한 작제물이 대장균에서 서브클로닝되고 증폭되는 동안 더 안정하였고 포유류 세포에서와 동등한 활성을 갖는 mRNA를 생성하였다는 것이 입증되었으므로, 2개의 60A 신장부 사이에 있는 SphI 제한 부위를 갖는 대체 플라스미드도 클로닝하였다. 이러한 대체 버전을 시험관 내 편집 검정을 사용하여 다양한 CasX mRNA 및 gRNA 투여량에 걸쳐 활성에 대해 비교하여 편집 활성에 이들이 궁극적으로 미치는 효과를 결정할 것이다. 본원에 기술된 폴리(A) 꼬리의 서열은 표 36에 열거되어 있다.
CasX 단백질 코딩 서열에 사용된 코돈뿐만 아니라 5' 및 3' UTR을 암호화하는 서열도 효과적인 번역에 중요하다. 높은 mRNA 안정성을 갖는 것으로 이전에 특성화된 유전자(예를 들어, α-글로빈 단백질, β-글로빈 단백질을 암호화하는 것들)뿐만 아니라, 간에서 특히 잘 발현될 것으로 예상되거나 이전에 입증된 유전자(즉, 다음 단백질을 암호화하는 유전자: 알부민, 보체 3, 및 시토크롬 P450 2E1)에 기초하여 주석이 달린 인간 유전자 전사체로부터 UTR을 선택하였다. 이들 다양한 유전자로부터의 5' 및 3' UTR의 서열은 표 36에 열거되어 있다. 3' UTR의 경우, 연속된 개별 3' UTR들도 시험하였다. 이들 작제물을 T7 프로모터, CasX 변이체 515 또는 676, 및 폴리(A) 꼬리를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하였다. 개별 5' 및 3' UTR의 효과를 단리하기 위해, 각각의 UTR을 3' 또는 5' α-글로빈 UTR을 각각 함유하는 작제물 내로 클로닝하였다. IVT를 수행하고 폴리(dT) 비드에 결합시켜 전장 전사체를 포획함으로써 정제할 것이다. 먼저, 생성된 mRNA를 다양한 투여량을 사용하는 B2M-표적화 gRNA와 함께 HepG2 세포 내로 공동 형질감염시켜 평가할 것이다. 편집 효율은 실시예 7에 기술된 바와 같이 HLA-면역 염색 및 유세포 계측법에 의해 결정될 것이다. 최고 성능의 개별 UTR을 다양한 구성으로 조합하고, LNP로 제형화하고, 일차 인간 간세포 및 마우스에서 시험할 것이다.
대안적인 코돈 최적화도 탐색 중이다. 다른 전달 방식에 사용된 CasX 코돈 최적화에 추가하여, 리보솜 단백질 코돈 사용에 기초하여 코돈 사용 테이블을 구축하고 CasX 코돈 사용을 재조정하여 일치시킴으로써 새로운 버전을 설계하였다. 번역 속도에 대한 잠재적 개선에 추가하여, 이는 면역원성을 감소시킬 수 있는 우라실 염기를 효과적으로 고갈시키기도 한다. 이러한 코돈 최적화는 mRNA의 생산에도 사용되었다. 추가적인 코돈 사용은 이용 가능한 다양한 코돈 최적화 도구를 사용하고, 다양한 GC 함량 수준을 달성하기 위해 필요에 따라 설정을 조정함으로써 설계되어 왔다. 이들 코돈 최적화는 전술한 바와 같이 UTR을 시험하는 데 사용되는 유사한 실험 설계 하에서 시험될 것이고, 선도 코돈 최적화된 CasX 후보를 선도 UTR 후보와 조합하여 추가 검증을 위한 새로운 선도 CasX를 생성하게 된다.
| 설명 | 암호화 서열 | 서열번호 |
| 폴리(A) 꼬리 | ||
| A80 | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | 3057 |
| A120 | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | 3198 |
| A60SphIA60 | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | 3199 |
| 5' UTR | ||
| α-글로빈 | ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC | 3200 |
| β-글로빈 | ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACA | 3201 |
| 알부민 | CTAGCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTT | 3202 |
| 시토크롬 P450 2E1 (CYP2E1) |
CTCCCGGGCTGGCAGCAGGGCCCCAGC | 3203 |
| 보체 3 (C3) | ACTCCTCCCCATCCTCTCCCTCTGTCCCTCTGTCCCTCTGACCCTGCACTGTCCC | 3204 |
| 3' UTR | ||
| α-글로빈 | GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA | 3189 |
| 알부민 | CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGTACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTGTTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACTCTTCTAAGTTATGGATTATAAACATTCAAAATAATATTTTGACATTATGATAATTCTGAATAAAAGAACAAAAACCA | 3205 |
| 알부민(절단됨) | GCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTAGATCT | 3206 |
| β-글로빈 | GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA | 3207 |
| α-글로빈 + β-글로빈 | GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA | 3208 |
| β-글로빈 + α-글로빈 | GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA | 3209 |
실시예 10: 시험관 내에서 LNP를 통해 LTRP mRNA 및 표적화 gRNA를 전달하여 표적 유전자좌의 억제를 달성하는 것을 입증하는 개념 증명 실험
LTRP mRNA 및 PCSK9-표적화 gRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)의 전달이 세포 기반 검정에서 표적 PCSK9 유전자좌의 지속적인 억제를 유도할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 촉매적으로 활성인 CasX 515를 암호화하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP를 제형화하고 비교를 위해 포함시켰다.
물질 및 방법:
mRNA의 생성:
다음 분자를 암호화하는 mRNA를 실시예 2에 기술된 것과 유사한 방법에 따라 IVT에 의해 생성하였다: 1) 촉매적으로 활성인 CasX 515, 및 2) LTRP5-ADD-ZIM3(실시예 4에 기술된 바와 같음). 간략하게, CasX 515의 생성을 위해, 합성 5' UTR 영역, c-MYC NLS가 측면에 위치하는 코돈 최적화된 CasX 515, 및 마우스 헤모글로빈 알파(mHBA)로부터 유래된 3' UTR을 암호화하는 작제물을 T7 프로모터 및 79-뉴클레오티드 폴리(A) 꼬리를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 IVT 반응에 사용하기 전에 선형화하였으며, 이는 실시예 2에 유사하게 기술된 바와 같이 수행하였다. 촉매적으로 활성인 CasX 515를 암호화하는 DNA 및 mRNA 서열은 표 37 및 표 38에 각각 나타나 있다. LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 DNA 및 mRNA 서열은 표 18 및 표 19에 각각 나타나 있다.
| CasX mRNA ID | 성분 (ID) | 설명 | DNA 서열 또는 서열번호 |
| CasX 515 mRNA | 5'UTR | 합성(TriLink) | 3274 |
| 시작 코돈 + c-MYC NLS | 3275 | ||
| CasX 515 | 3276 | ||
| c-MYC NLS + 종결 코돈 | 3277 | ||
| 3' UTR | 마우스 HBA | 3278 | |
| XbaI 제한 부위 (부분) | TCTAG | ||
| 폴리(A) 꼬리 | 3279 | ||
| *성분은 작제물 내에서 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있음 | |||
gRNA의 합성:
PCSK9-표적화 gRNA를 gRNA 스캐폴드 316 및 스페이서 6.1(서열은 표 24에 열거되어 있음)을 사용하여 설계하고 화학적으로 합성하였다. (상기 실시예 7에 기술된 바와 같은) v1 변형 프로파일을 갖는 PCSK9-표적화 gRNA의 서열은 표 39에 열거되어 있다. gRNA 스캐폴드 변이체 316의 ‘v1' 프로파일에 대한 화학적 변형 부위의 개략도가 도 24에 도시되어 있다.
| gRNA ID (스캐폴드 변이체-스페이서) | 표적 | gRNA 서열 | 서열번호 |
| 316-6.1 (v1) | 인간 PCSK9 | mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGAGGAGGACGGCCUGGC*mC*mG*mA | 3447 |
아래 실시예 11에 기술된 방법을 사용하여, 표 40에 열거된 것과 같은 LNP 지질로 LNP 제형을 생성하였다.
LTRP 또는 CasX mRNA 및 표적화 gRNA를 캡슐화하는 LNP를 일차 시노몰구스 마카크(CM) 간세포 내로 전달하기:
2개의 상이한 공여자(생성물 번호: M003055-P; BioIVT)로부터 유래된 일차 CM 간세포의 2개의 로트(BJE 및 VDU로 명명됨)를 사용하여, LNP에 의해 전달될 때 PCSK9 유전자좌에서 LTRP 매개 억제 또는 CasX 매개 편집을 평가하였다. 각 로트별로, Williams' E 완전 배지에서 배양된 약 50,000개의 세포를 96-웰 플레이트의 웰마다 시딩하였다. 다음 날, 시딩된 세포를, 1,200 ng/100 μL에서 시작하여 6개의 3배 연속 희석물로 제조한 다양한 농도의 LNP로 처리하였다. 이들 LNP를 제형화하여 CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 mRNA 및 스캐폴드 변이체 316을 스페이서 6.1(v1; 표 39 참조)과 함께 포함하는 PCSK9-표적화 gRNA를 캡슐화하였다. 본 실시예에서 시험된 LNP 제형은 표 40에 나타나 있다. LNP 치료 후 1일차에 배지를 변경하고, 세포를 며칠 동안 추가로 배양하고, 배지 상청액을 수확하여 4일차 및 11일차 시점에 PCSK9 분비 수준을 측정하였다. 간략하게, 제조사의 지침에 따라 BioLegend® ELISA MAX™ 키트를 사용하여 PCSK9 분비 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. PCSK9 분비 수준을 정량화의 정확성을 보장하기 위해, 재조합 CM PCSK9 단백질(Acro Biosystems의 시노몰구스 PCSK9 단백질)을 기준으로서 사용하여 표준 곡선을 작제하였다. 4일차에 미치료 일차 CM 간세포(각 로트 별로)에 대해서도 베이스라인 PCSK9 분비 수준(ng/mL)을 정량화하였다.
| LNP 지질 | 캡슐화된 mRNA | 캡슐화된 gRNA |
| GenVoy-ILM™ | CasX 515 | 스페이서 6.1을 갖는 gRNA 스캐폴드 316(v1) |
| MC3 | ||
| MC3 | LTRP5-ADD-ZIM3 | |
| ALC-0315 | ||
| SM-102 |
결과:
CasX 515 또는 LTRP5-ADD-ZIM3 및 스페이서 6.1을 사용하는 PCSK9-표적화 gRNA를 공동 캡슐화한 5개의 상이한 LNP의 상이한 투여량으로 2개 로트의 일차 CM 간세포를 치료하였다. 치료 후 4일차 및 11일차에 배지 상청액을 수확하여 PCSK9 분비에 미치는 효과를 평가하였다(도 61~64). 도 61~64의 결과는 LTRP5-ADD-ZIM3 또는 CasX mRNA 및 표적화 gRNA가 다양한 LNP 내에 공동 캡슐화될 수 있고, 표적 세포에 전달되었고, 표적 세포에서 분비된 PCSK9 수준을 감소시켰음을 입증한다. 분비된 PCSK9 수준의 투여량 의존적 감소는 치료 후 4일차에 일차 CM 간세포의 2개 로트 모두에서 모든 제형화된 LNP에 대해 관찰되었다(도 61~62). 치료 후 11일차까지, 분비된 PCSK9 수준의 투여량 의존적 감소가 2개 로트 모두에서 모든 제형화된 LNP에 대해 관찰되었는데, (LTRP5-ADD-ZIM3 및 표적화 gRNA를 캡슐화하는) MC3은 예외였다(도 63~64). 분비된 PCSK9 수준을 더 긴 시점에 조사하여 각각의 LNP 제형이 PCSK9 분비 감소에 미치는 효과를 추가로 결정할 것이다.
본 실험의 결과는, LTRP mRNA뿐만 아니라 CasX mRNA, 및 표적화 gRNA가 표적 세포에 전달될 LNP 내에 공동으로 캡슐화되어 표적 내인성 유전자좌의 침묵화를 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 11: dXR 또는 LTRP mRNA 및 gRNA 페이로드를 표적 세포 및 조직에 전달하기 위한 지질 나노입자(LNP)의 제형
실시예 10에 기술된 바와 같이, 표적 세포 및 조직에 전달하기 위해 dXR 또는 LTRP mRNA 및 gRNA를 LNP 내로 캡슐화하는 실험을 수행하였다. 다음 실시예는 다양한 LNP 지질로 LNP를 제형화하는 데 사용되는 방법을 제공한다.
GenVoy-ILM™-기반 LNP를 사용한 실험의 경우:
dXR 또는 LTRP mRNA 및 gRNA를 Precision NanoSystems Inc.(PNI) Ignite™ Benchtop System을 제조사의 지침에 따라 사용하여 GenVoy-ILM™ 지질을 사용한 LNP 내에 캡슐화하였다. GenVoy-ILM™ 지질은 50:10:37.5:2.5 mol%의 이온화 가능한 지질:DSPC:콜레스테롤:안정화제로 이루어진 조성물이다. 간략하게, LNP를 제형화하기 위해, 동일한 질량비의 dXR 또는 LTRP mRNA 및 gRNA를 pH 4.0의 PNI 제형 완충액에서 희석하였다. GenVoy-ILM™ 지질을 무수 에탄올에서 1:1로 희석하였다. mRNA/gRNA 공동 제형은 소정의 N/P 비를 사용하여 생성하였다. RNA 및 지질을 PNI Ignite™ Benchtop System 상에서 소정의 유속 비로 PNI 층류 카트리지를 통과시켰다. 제형화 후, LNP를 pH 7.4의 PBS에서 희석하여 에탄올 농도를 감소시키고 pH를 증가시켰는데, 이는 입자의 안정성을 증가시킬 것이다. mRNA/sgRNA-LNP의 완충액 교환은 10k Slide-A-Lyzer™ 투석 카세트(Thermo Scientific™)를 사용하여 4℃에서 pH 7.4의 PBS 내로 밤새 투석함으로써 달성하였다. 투석 후, mRNA/gRNA-LNP를 100 kDa Amicon®-Ultra 원심분리 필터(Millipore)를 사용하여 > 0.5 mg/mL로 농축시킨 다음, 여과 멸균하였다. 제형화된 LNP를 Stunner(Unchained Labs)를 이용해 분석하여 이들의 직경 및 다분산 지수(PDI)를 결정하였다. 캡슐화 효율 및 RNA 농도는 Invitrogen의 Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 검정 키트를 사용하여 RiboGreen™ 검정에 의해 결정하였다.
ALC-0315 (6-((2-헥실데카노일)옥시)-N-(6-((2-헥실데카노일)옥시)헥실)-N-(4-하이드록시부틸)헥산-1-아미늄), SM-102 (8-[(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노]-옥탄산, 1-옥틸노닐 에스테르), 및 MC3 (DLin-MC3-DMA)-기반 LNP를 사용한 실험의 경우:
맞춤형 T-믹서 마이크로 혼합 장치를 사용하여 20 mL/분의 유속 및 3:1의 수성상 대 유기상의 혼합 비율로 혼합한 ALC-0315, SM-102, 또는 MC3-기반 지질 혼합물을 사용하여 dXR 또는 LTRP mRNA 및 gRNA를 LNP 내에 캡슐화하였다. 3개의 지질 혼합물 모두에 대해, 조성은 다음과 같았다: 이온화 가능한 지질:DSPC:콜레스테롤:DMG-PEG2000의 몰% 50:10:38.5:1.5 간략하게, LNP를 제형화하기 위해, 동일한 질량비의 dXR 또는 LTRP mRNA 및 gRNA를 pH 4.0의 25 mM 아세트산나트륨에서 희석하였다. 지질 혼합물은 무수 에탄올 중 10 mM 농도로 제조하였다. 소정의 N/P 비율을 사용하여 mRNA/gRNA 공동 제형을 생성하였다. RNA 및 지질을 주사기 펌프 주입기를 사용하여 소정의 유속 비율로 맞춤형 T-믹서 장치를 통과시켰다. 제형화 후, LNP를 pH 7.4의 PBS 내로 투석하여 에탄올 농도를 감소시키고 pH를 증가시켰는데, 이는 입자의 안정성을 증가시킨다. mRNA/sgRNA-LNP의 완충액 교환은 10k Slide-A-Lyzer™ 투석 또는 카세트(Thermo Scientific™) 또는 12~14 kDa 투석 튜빙(Repligen)을 사용하여 4℃에서 pH 7.4의 PBS 내로 밤새 투석함으로써 달성하였다. 투석 후, mRNA/gRNA-LNP를 30~100 kDa Amicon®-초원심분리 필터(Millipore)를 사용하여 > 0.2 mg/mL로 농축시킨 다음, Acrodisc PES 멤브레인 필터를 사용해 멸균 여과하였다. 제형화된 LNP를 Malvern Zetasizer를 이용해 분석하여 이들의 직경 및 다분산 지수(PDI)를 결정하였다. 캡슐화 효율 및 RNA 농도는 Invitrogen의 Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 검정 키트를 사용하여 RiboGreen™ 검정에 의해 결정하였다.
전술한 GenVoy-ILM™, ALC-0315, SM-102, 및 MC3 LNP를 다양한 실험에서 사용하여 XR 또는 LTRP mRNA 및 gRNA를 표적 세포에 전달하였고, 표적 조직에 전달하는 데 추가로 사용할 수 있다.
실시예 12: 가이드 RNA 스캐폴드를 암호화하는 DNA의 CpG 고갈은 시험관 내에서 CasX 매개 편집을 개선한다
비메틸화 CpG 모티프와 같은 병원균-연관 분자 패턴(PAMP)은 미생물 부류 내에 보존된 소분자 모티프이다. 이들은 진핵생물에서 톨-유사 수용체(TLR) 및 다른 패턴 인식 수용체에 의해 인식되고 종종 비특이적 면역 활성화를 유도한다. 유전자 요법의 맥락에서, PAMP를 함유하는 치료제는 종종 내약성이 양호하지 않으며, 강력한 면역 반응이 유발되면 환자로부터 신속하게 제거되어, 궁극적으로 치료 효율을 감소시킨다. CpG 모티프는 디뉴클레오티드 CG를 함유하는 짧은 단일 가닥 DNA 서열이다. 이들 CpG 모티프가 메틸화되지 않을 경우, 이들은 PAMP로서 작용하여 면역 반응을 자극한다. 본 실시예에서, CasX 변이체 491, 가이드 스캐폴드 변이체 235, 및 내인성 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.37을 암호화하는 AAV 작제물의 맥락에서 가이드 스캐폴드 코딩 서열에서 CpG 모티프를 고갈시키고, 가이드 스캐폴드에서의 CpG 고갈이 시험관 내에서 B2M 유전자좌의 편집에 미치는 효과를 시험하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
CpG-고갈된 가이드 스캐폴드의 설계:
스캐폴드 면역원성을 감소시키면서 편집 활성을 보존하기 위한 의도로 베이스 gRNA 스캐폴드 변이체(gRNA 스캐폴드 235) 내의 천연 CpG 모티프를 대체하도록 뉴클레오티드 치환을 합리적으로 설계하었다. 면역원성을 충분히 감소시키기 위해서는 가능한 한 많은 CpG-모티프가 스캐폴드 코딩 서열로부터 제거되어야 한다고 여겨졌다. 스캐폴드 235는 총 8개의 CpG 요소를 함유하며; 이 중 6개는 염기쌍을 이루고 이중 가닥 이차 구조의 상보적 가닥을 형성할 것으로 예측된다(도 27a 참조). 따라서, 3개의 쌍을 형성하는 6개의 염기쌍 CpG를 함께 돌연변이시켜 중요한 이차 구조를 유지하였다. 이를 통해, CpG-제거에 대해 독립적으로 간주될 독립적인 CpG-함유 영역의 수를 5개(3개의 쌍 및 2개의 단일 CpG)로 감소시켰다. 구체적으로, 돌연변이는 도 27b에 도시되고 이하에서 상세히 설명되는 바와 같이, (1) 유사매듭 줄기, (2) 스캐폴드 줄기, (3) 연장된 줄기 버블, (4) 연장된 스텝, (5) 연장된 줄기 루프로 설계되었다.
유사매듭 줄기(영역 1)에서, CpG 쌍을 GpC로 뒤집어 베이스 조성물 및 서열의 변경을 최소화하였다. 개별 염기쌍을 대체하는 것과 관련된 이전의 실험에 기초하여, 해당 돌연변이는 가이드 RNA 스캐폴드의 구조 및 기능에 해로울 가능성이 없는 것으로 예상되었다.
유사하게, 스캐폴드 줄기(영역 2)에서, CpG 쌍을 GpC로 뒤집어 베이스 조성물 및 서열의 변경을 최소화하였다. 개별 염기 또는 염기쌍을 돌연변이시키는 이전 실험에서, 해당 영역에서의 강력한 서열 보존이 관찰되었기 때문에, 이러한 돌연변이는 가이드 RNA 스캐폴드의 구조 및 기능에 해로울 가능성이 있는 것으로 예상되었다. 이러한 강력한 서열 보존은 CasX 단백질과의 상호작용뿐만 아니라 유사매듭 영역과 삼중 구조 요소의 형성에 중요한 스캐폴드 줄기 루프로 인한 것일 수 있다.
연장된 줄기 버블(영역 3)에서, 단일 CpG를 3개의 전략 중 하나로 제거하였다. 먼저, CG->C 돌연변이시켜 버블을 결실시켰다. 두 번째로, 버블을 분해하여 CG->CT 돌연변이시킴으로써 이상적인 염기쌍을 복원하였다. 세 번째로, 전체 연장된 줄기 루프를 스캐폴드174의 연장된 줄기 루프로 교체하였다. 연장된 줄기 루프를 그 자체로서 스캐폴드 174의 줄기 루프 루프로 대체하는 것은 이전에 효율적으로 편집하는 것으로 나타난 스캐폴드 316을 재현한다는 점에 유의한다. 스캐폴드174의 연장된 줄기 루프에는 CpG 모티프가 존재하지 않는다. 따라서, 연장된 줄기 루프의 스캐폴드174의 줄기 루프로의 교체는 또한 연장된 줄기(영역 4)에서 CpG 모티프를 제거한다. 연장된 줄기의 작은 변화에 대한 상대적인 견고성을 나타내는 이전 실험에 기초하여, 연장된 줄기 버블의 돌연변이는 가이드 RNA 스캐폴드의 구조와 기능에 어느 정도 해로울 가능성이 있을 것으로 예상되었다.
연장된 줄기(영역 4)에서, CpG 쌍은 추가 CpG 모티프를 생성하지 않고는 GpC로 뒤집을 수 없었다. 따라서, CpG를 GG 및 상보성 CC 모티프로 변경하였다. 영역 3과 유사하게, 연장된 줄기의 작은 변화에 대한 상대적인 견고성에 기초하여, 해당 돌연변이는 가이드 RNA 스캐폴드의 구조 및 기능에 해로울 가능성이 없을 것으로 예상되었다.
마지막으로, 연장된 줄기 루프(영역 5)를 줄기 루프의 안정성을 조사하는 이전 실험에 기초하여 설계된 세 가지 방법 중 하나로 돌연변이시켰다. 특히, 줄기 루프의 여러 가지 변형은 이전에 유사한 안정성 수준을 갖는 것으로 나타났으며, 줄기 루프의 이들 변형 중 일부는 CpG를 함유하지 않는 것으로 나타났다. 이들 결과에 기초하여, 루프를 CUUG 서열을 갖는 새로운 루프로 우선적으로 교체하였다. 두번째로, 루프를 GAAA 서열을 갖는 새로운 루프로 교체하였다. GAAA 루프 교체는 해당 루프에 인접한 신규 CpG를 생성하기 때문에, 이를 상보성 가닥 상의 C->G 염기 스왑 및 상응하는 G->C 염기 스왑과 조합하여, 궁극적으로 CUUCGG->GGAAAC 교환을 생성하였다. 세번째로, CpG 모티프를 차단함으로써 루프의 크기를 4 내지 5 염기 크기로 증가시키도록 A를 삽입하여 루프를 돌연변이시켰다. 연장된 줄기 루프의 무작위 돌연변이는 이차 구조 안정성 및 이에 따른 편집에 유해한 효과를 가질 가능성이 있을 것으로 예상되었다. 그러나, 이전에 확인된 서열을 고려하면, 해당 대체와 관련된 위험도는 낮을 것으로 여겨졌다.
CpG 수준이 감소된 DNA에 의해 암호화된 가이드 RNA 스캐폴드를 생성하기 위해, 전술한 돌연변이를 다양한 구성으로 조합하였다. 아래 표 41은 사용된 돌연변이의 조합을 요약한 것이다. 표 41에서, 도 27b에 도표화된 바와 같이, 0은 주어진 영역에 돌연변이가 도입되지 않았음을 나타내고, 1, 2, 또는 3은 해당 영역에 돌연변이가 도입되었음을 나타내며, n/a는 해당 없음을 나타낸다. 구체적으로, 영역 1, 유사매듭 줄기의 경우, 1은 CG->GC 돌연변이가 도입되었음을 나타낸다. 영역 2, 스캐폴드 줄기의 경우, 1은 CG->GC 돌연변이가 도입되었음을 나타낸다. 영역 3, 연장된 줄기 버블의 경우, 1은 버블을 형성하는 G 및 A 염기의 결실에 의해 버블이 제거되었음을 나타내고, 2는 버블이 A 및 U 염기 사이의 염기쌍 형성을 허용하는 CG->CU 돌연변이에 의해 분해되었음을 나타내고, 3은 연장된 줄기 루프가 가이드 스캐폴드 174로부터의 연장된 스텝 루프로 대체되었음을 나타낸다. 영역 4, 스캐폴드 줄기의 경우, 1은 CG->GC 돌연변이가 도입되었음을 나타낸다. 영역 5, 연장된 줄기 루프의 경우, 1은 루프가 UUCG->CUUG로 대체되었음을 나타내고, 2는 루프가 루프에 인접한 염기쌍과 함께 CUUCGG->GGAAAC로 대체되었음을 나타내며, 3은 A가 C와 G 사이에 삽입되었음을 나타낸다.
| 스캐폴드 ID | 영역 1 (유사매듭 줄기) | 영역 2 (스캐폴드 줄기) | 영역 3 (연장된 줄기 버블) | 영역 4 (연장된 줄기) | 영역 5 (연장된 줄기 루프) |
| 320 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 321 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| 322 | 1 | 0 | 2 | 1 | 0 |
| 323 | 1 | 0 | 3 | n/a | 0 |
| 324 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| 325 | 1 | 0 | 2 | 1 | 1 |
| 326 | 1 | 0 | 3 | n/a | 1 |
| 327 | 1 | 0 | 1 | 1 | 2 |
| 328 | 1 | 0 | 2 | 1 | 2 |
| 329 | 1 | 0 | 3 | n/a | 2 |
| 330 | 1 | 0 | 1 | 1 | 3 |
| 331 | 1 | 0 | 2 | 1 | 3 |
| 332 | 1 | 0 | 3 | n/a | 3 |
| 334 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 |
| 335 | 1 | 1 | 3 | n/a | 1 |
| 336 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 |
| 337 | 1 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 338 | 1 | 1 | 3 | n/a | 2 |
| 339 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| 340 | 1 | 1 | 2 | 1 | 3 |
| 341 | 1 | 1 | 3 | n/a | 3 |
| 235 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
아래 표 42는 설계된 CpG-감소 또는 고갈된 가이드 스캐폴드를 암호화하는 DNA 서열을 열거한다.
| 스캐폴드 ID | 서열번호 |
| 320 | 3210 |
| 321 | 3211 |
| 322 | 3212 |
| 323 | 3213 |
| 324 | 3214 |
| 325 | 3215 |
| 326 | 3216 |
| 327 | 3217 |
| 328 | 3218 |
| 329 | 3219 |
| 330 | 3220 |
| 331 | 3221 |
| 332 | 3222 |
| 333 | 3223 |
| 334 | 3224 |
| 335 | 3225 |
| 336 | 3226 |
| 337 | 3227 |
| 338 | 3228 |
| 339 | 3229 |
| 340 | 3230 |
| 341 | 3231 |
CpG-고갈된 AAV 플라스미드의 생성:
CpG-감소 또는 고갈된 gRNA 스캐폴드를, AAV2 ITR을 제외하고, 그렇지 않을 경우 CpG-고갈된 AAV 벡터의 맥락에서 시험하였다. 구체적으로, AAV 성분에서 천연 CpG 모티프를 치환하기 위한 뉴클레오티드 치환은 다음의 요소에 대한 관련 종으로부터의 상동성 뉴클레오티드 서열에 기초하여 인 실리코로 설계되었다: 쥣과 U1a snRNA(소형 핵 RNA) 유전자 프로모터, bGHpA(소 성장 호르몬 폴리아데닐화) 서열, 및 인간 U6 프로모터. CasX 491에 대한 코딩 서열을 CpG 고갈에 대해 코돈 최적화시켰다. 생성된 모든 서열(표 42 및 43)은, 기존의 베이스 AAV 플라스미드(작제물 ID 183)의 상응하는 요소를 개별적으로 대체하도록 클로닝 및 등온 조립을 위한 적절한 돌출부를 갖는 유전자 단편으로서 주문하였다. 내인성 B2M 유전자를 표적화하는 스페이서 7.37(GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG; 서열번호 3137)을 본 실시예에서 논의된 실험에 사용하였다. 실험이 처음으로 수행된 경우(“N=1”), 비표적화 스페이서 0.0을 갖는 샘플을 대조군(CGAGACGUAAUUACGUCUCG, 서열번호 3232; 도 28 참조)으로서 포함시켰다.
생성된 AAV 작제물을 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다. 클로닝되고 서열 검증된 플라스미드 작제물을 후속적인 뉴클레오펙션 및 AAV 벡터 생산을 위해 중간-제조하였다. gRNA를 암호화하는 서열(표 41)을 제외하고, AAV 작제물의 추가 성분의 서열은 표 43에 열거되어 있다.
| 요소 |
DNA 서열
서열번호 |
| AAV2 5' ITR | 3233 |
| CpG-고갈된 U1a 프로모터 | 3234 |
| CpG-고갈된 cMycNLS-CasX491-cMycNLS | 3235 |
| CpG-고갈된 bGH-폴리A 서열 | 3236 |
| CpG-고갈된 U6 프로모터 | 3237 |
| 상기 표 42의 sgRNA 서열을 참조한다. | |
| AAV2 3' ITR | 3238 |
AAV 생산:
FreeStyle 293 배지에 유지된 현탁액-적응 HEK293T 세포를 형질감염 당일에 1.5E6 세포/mL로 20-30 mL의 배지에 시딩하였다. ITR 반복이 측면에 위치한 이식유전자를 갖는 엔도톡신-무함유 pAAV 플라스미드를 무혈청 Opti-MEM 배지에서 PEI Max(Polysciences)를 사용하여 복제를 위한 아데노바이러스 헬퍼 유전자 및 AAV rep/cap 게놈을 공급하는 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 3일 후, 배양물을 원심분리하여 세포 펠릿으로부터 상청액을 분리하고, AAV 입자를 수집하고, 농축시키고, 표준 절차에 따라 여과하였다.
바이러스 게놈(vg) 역가를 결정하기 위해, 미정제 용해물 바이러스로부터의 1 μL를 DNase 및 ProtK로 분해한 다음, 정량적 PCR을 수행하였다. 5 μL의 분해된 바이러스를, IDT 프라임타임 마스터 혼합물 및 AAV2-ITR에 위치된 62 bp-단편을 증폭시키도록 설계된 프라이머 세트 및 6'FAM/Zen/IBFQ 프로브(IDT)로 이루어진 25 μL qPCR 반응에 사용하였다. AAV ITR 플라스미드를 바이러스 샘플의 역가(vg/mL)를 계산하기 위한 기준 표준으로서 사용하였다.
시험관 내에서 유도된 뉴런의 AAV 형질도입:
형질도입 24시간 전, 웰 당 50,000개의 유도된 뉴런을 매트리겔-코팅된 96-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 그런 다음, 다양한 버전의 가이드 스캐폴드를 갖는 CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV를 뉴런 도말 배지에서 희석하고 세포에 첨가하였다. 실험이 처음으로 수행된 경우(“N=1”), 세포를 4e3 바이러스 게놈(vg)/세포의 감염 다중도(MOI)로 형질도입하였다(도 28 참조). 도말 후 7일차에, 신선한 공급 배지에서 희석된 바이러스로 유도된 뉴런을 형질도입하였다. 형질도입 후 8일차에, 용해 완충액을 사용하여 세포를 들어 올리고, 실험 조건 당 4-웰 복제물을 풀링하고, 게놈 DNA(gDNA)를 수확하고, 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 B2M 유전자좌에서 편집 분석을 위해 제조하였다. 두 번째로 실험을 수행한 경우(“N=2”), 세포를 3e3 vg/세포, 1e3 vg/세포, 또는 3e2 vg/세포의 MOI로 형질도입하였다(도 29, 도 30, 및 도 31 참조). 도말 후 7일차에, 신선한 공급 배지에서 희석된 바이러스로 유도된 뉴런을 형질도입하였다. 형질도입 후 7일차에, 용해 완충액을 사용하여 세포를 들어 올리고, 실험 조건 당 2-웰 복제물을 풀링하고, gDNA를 수확하고, NGS를 사용하여 B2M 유전자좌에서 편집 분석을 위해 제조하였다. AAV로 형질도입되지 않은 샘플을 대조군으로서 포함시켰다.
NGS 처리 및 분석:
제조사의 지침에 따라, Zymo Quick-DNA Miniprep Plus 키트를 사용하여, 수확된 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. 200 ng의 추출된 gDNA로부터의 관심 영역을 인간 B2M 유전자에 특이적인 프라이머 세트로 증폭시켜 표적 앰플리콘을 형성하였다. 이들 유전자 특이적 프라이머는 5' 단부에서 Illumina 어댑터 및 16-뉴클레오티드 고유 분자 식별자를 도입하기 위한 추가 서열을 함유하였다. 증폭된 DNA 산물을 Ampure XP DNA 세정 키트로 정제하였다. 앰플리콘의 품질 및 정량화는 단편 분석기 DNA 분석 키트(Fragment Analyzer DNA Analysis kit, Agilent, dsDNA 35~1500 bp)를 사용하여 평가하였다. 제조사의 지침에 따라, Illumina Miseq 상에서 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 시퀀싱으로부터의 원시 fastq 파일을 품질 관리하고 cutadapt v2.1, flash2 v2.2.00, 및 CRISPResso2 v2.0.29를 사용하여 처리하였다. 스페이서의 3' 단부 주위의 윈도우(스페이서의 3' 단부로부터 -3 bp가 중심이 되는 30 bp 윈도우)에서, 기준 서열 대비 삽입 또는 결실(indel) 함유에 대해 각 서열을 정량화하였다. CasX 활성을, 각 샘플별 이러한 윈도우 내의 어느 곳에서라도 삽입, 치환, 및/또는 결실을 함유하는 리드의 총 백분율로서 정량화하였다.
결과:
가이드 스캐폴드를 코딩하는 DNA 서열의 CpG 함량을 감소시키기 위해 돌연변이를 가이드 스캐폴드 235에 도입하였다. 놀랍게도, 스캐폴드 235와 비교하여, CpG-감소된 및 CpG-고갈된 스캐폴드 변이체 모두는 유도된 뉴런에서 더 높은 수준의 편집을 생성하였다. 이는 실험을 독립적으로 2회 반복한 경우에도 마찬가지였고(도 28에 나타낸 실험을 처음 반복한 결과, 및 도 29~31에 나타낸 실험을 두 번째 반복한 결과), 여러 MOI에 걸쳐서도 마찬가지였다(도 30~31). CpG 함량을 감소시키는 목표는 단순히 편집 활성을 보존하면서 면역원성을 감소시키는 것이었기 때문에, 향상된 편집 수준은 놀라운 것이었다. 대신, 돌연변이는 편집 활성을 단순히 보존하기보다는 강화시켰다.
특히, 스캐폴드 320은 스캐폴드 235에 비해 상당한 효능의 증가를 나타냈다. 스캐폴드 320은 스캐폴드의 2개의 영역, 즉 유사매듭 줄기 및 연장된 줄기(영역 1 및 4)에 대한 돌연변이를 포함한다. 또한, 돌연변이의 일부 조합은 스캐폴드 320보다 더 열등한 편집을 생성하였다. 그러나, 심지어 스캐폴드 331 및 334와 같이, 스캐폴드 320보다 더 열등하게 수행된 CpG-감소 스캐폴드 또한 스캐폴드 235와 유사하거나 이보다 더 양호하게 수행되었다.
이러한 결과에 기초하여, 이론에 구속되고자 함이 없이, 많은 CpG-감소 및 CpG-고갈 스캐폴드에서 관찰된 효능의 증강은 모든 CpG-감소 스캐폴드(즉, 영역 1 및/또는 4)에 존재하는 돌연변이 중 하나에 의해 야기될 가능성이 있는 것으로 여겨진다. 영역 4에 대한 돌연변이는 연장된 줄기 루프 대체(즉, 영역 3에 대한 제3 돌연변이)를 갖는 스캐폴드에 존재하지 않으며, 이들 스캐폴드는 320에서처럼 235 대비 유사한 효능 개선을 나타내기 때문에, 유익한 효과는 시험된 스캐폴드 모두에 존재하는 영역 1(유사매듭 줄기)에서의 돌연변이에 의해 야기될 가능성이 있는 것으로 여겨진다. 유사매듭 줄기(영역 1) 및 연장된 줄기(영역 4)에서의 개별 돌연변이의 효과를 별도로 시험하기 위한 추가 실험을 수행할 것이다.
또한, 도 28에 제시된 바와 같은 N=1 데이터는 영역 2(스카폴드 줄기)에서 돌연변이를 갖는 모든 신규 스캐폴드가 해당 돌연변이가 없는 각각의 카운터파트보다 약간 낮은 수준으로 편집되었음을 나타낸다. 이는 스캐폴드 줄기에서 이러한 위치를 돌연변이시키는 것이 편집 효능에 작은 유해한 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 이는 추가 실험에서 조사될 것이다.
본원에 기술된 결과는 가이드 RNA 스캐폴드를 암호화하는 DNA의 CpG 함량을 감소시키는 돌연변이를 도입하는 것이 가이드 스캐폴드 235에 비해 유전자 편집을 개선하였음을 입증한다.
실시예 13:
B2M
유전자좌의 지속적인 침묵화를 유도하기 위한, DNMT3A 및 DNMT3L로부터의 추가 도메인과 융합된 촉매적으로 사멸한 CasX 억제 시스템의 용도
전사 억제자 도메인, DNMT3A로부터의 촉매 도메인, 및 DNMT3L로부터의 상호작용 도메인으로 구성된 3개의 억제자 도메인을 갖고, 촉매적으로 사멸한 CasX (dCasX) 491에 융합된 합리적으로 설계된 LTRP 작제물이 시험관 내에서 내인성 B2M 유전자좌의 지속적인 장기 억제를 유도하는지 여부를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 또한, dCasX에 비해 다양하게 배치된 후성적 도메인을 함유하는 LTRP 분자의 다수의 구성을 설계하여, 이들의 배열이 B2M 유전자좌의 침묵화 지속 기간뿐만 아니라 이들의 표적 메틸화 활성의 특이성에 어떻게 영향을 미칠 것인지를 평가하였다.
물질 및 방법:
LTRP 작제물의 생성 및 렌티바이러스 플라스미드 클로닝:
LTRP 분자를 코딩하는 렌티바이러스 플라스미드 작제물을 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 제작하였다. 이들 작제물은 촉매적으로 비활성인 CasX 단백질 491(dCasX491), ZNF10 또는 ZIM3의 KRAB 도메인, 및 DNMT3A(D3A) 및 DNMT3L(D3L)의 촉매 도메인 및 상호작용 도메인을 각각 암호화하는 서열로 구성되었다. 간략하게, 작제물을 올리고뉴클레오티드로서 배열하고, 중첩 연장 PCR에 이어서 등온 조립에 의해 조립하였다. 이들 주요 LTRP 요소의 아미노산 서열은 표 44에 제공되어 있다. 생성된 플라스미드는 LTRP 분자를 생성하기 위해 다양한 구성으로 위치된 작제물을 함유하였다. LTRP 분자에 대한 단백질 서열은 표 45에 열거되어 있고, LTRP 구성은 도 1에 도시되어 있다. LTRP 분자를 암호화하는 서열은 2x FLAG 태그를 또한 함유하였다. 플라스미드는 내인성 B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 또는 비표적화 대조군(스페이서 서열은 표 46에 열거되어 있음)을 갖는 gRNA 스캐폴드 변이체 174를 암호화하는 서열을 또한 보유하였다. 이들 작제물을 렌티바이러스 플라스미드 상의 P2A-퓨로마이신 요소의 상류에 모두 클로닝하였다. 클로닝되고 서열 검증된 작제물을 미디프렙으로 정제하고 품질 평가를 실시한 후 HEK293T 세포에 형질감염시켰다.
| LTRP ID | 서열번호 |
| 1.A | 3242 |
| 1.B | 3243 |
| 2.A | 3244 |
| 2.B | 3245 |
| 3.A | 3246 |
| 3.B | 3247 |
| 4.A | 3248 |
| 4.B | 3249 |
| 5.A | 3250 |
| 5.B | 3251 |
| 스페이서 ID | 표적 유전자 | PAM | 서열 | 서열번호 |
| 7.37 | B2M | TTC | GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG | 3137 |
| 7.148 | B2M | NGG | CGCGAGCACAGCUAAGGCCA | 3101 |
| 0.0 | 비표적 | N/A | CGAGACGUAAUUACGUCUCG | 3232 |
HEK293T 세포의 형질감염:
HEK293T 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 30,000개의 세포 밀도로 시딩하였다. 다음 날, 리포펙타민을 사용하여 100 ng의 LTRP 변이체 플라스미드로 각각의 웰을 일시적으로 형질감염시켰는데, 각 플라스미드는 상이하게 구성된 LTRP 단백질을 암호화하는 작제물을 함유하였고(도 1), 여기서 gRNA는 비표적화 스페이서 0.0 또는 B2M 유전자좌에 대한 표적화 스페이서 7.37을 가졌다. 구체적으로, 하나의 실험의 경우, LTRP 단백질 #1~3을 암호화하는 플라스미드로 HEK293T 세포를 형질감염시키고, 두 번째 실험에서는, LTRP 단백질 #1, 4, 및 5를 암호화하는 플라스미드로 세포를 리포펙션하였다. 두 실험 모두에서, LTRP 분자는 ZNF10 또는 ZIM3 중 어느 하나의 KRAB 도메인을 보유하였다. 실험 대조군은 dCasX491(ZNF10 억제자 도메인이 있거나 없음), 촉매적으로 활성인 CasX 491, 및 ZNF10-KRAB 도메인 및 DNMT3A /L 도메인 둘 다에 융합되고 동일한 B2M-표적화 또는 비-표적화 gRNA를 각각 갖는 촉매적으로 비활성인 Cas9를 포함하였다. 각각의 작제물을 3회 시험하였다. 형질감염 후 24시간차에, 세포를 1 μg/mL 퓨로마이신으로 2일 동안 선택하였다. 형질감염 후 6일차에 시작하여, 세포를 수확하고, HLA 면역염색을 통해 B2M 단백질 발현을 분석함으로써 2~3일마다 억제 분석을 수행한 다음 유세포 계측을 수행하였다. B2M 발현은 세포 표면 상에서 발현된 B2M-의존적 HLA 단백질을 검출하는 항체를 사용해 결정하였다. HLA+ 세포는 Attune™ NxT 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다. 또한, 별도의 실험에서, 중아황산염 시퀀싱을 위한 게놈 DNA(gDNA)를 추출하기 위해, 리포펙션 후 5일차에, LTRP 변이체 플라스미드 및 B2M-표적화 gRNA 또는 비-표적화 gRNA로 일시적으로 형질감염시킨 HEK293T 세포를 5일차에 수확하였다.
표적 유전자좌에서의 표적 외 메틸화 수준에 의해 측정된 LTRP 특이성을 평가하기 위한 중아황산염 시퀀싱:
B2M 유전자좌에서의 표적 외 메틸화 수준을 결정하기 위해, Zymo Quick-DNA Miniprep Plus 키트를 제조사의 지침에 따라 사용하여 gDNA를 수확된 세포로부터 추출하였다. 그런 다음, EZ DNA Methylation™ 키트(Zymo)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 추출된 gDNA를 대상으로 중아황산염 변환을 수행하여, 메틸화되지 않은 모든 시토신을 우라실로 변환시켰다. 이어서, 생성된 중아황산염-처리된 DNA를 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용해 시퀀싱하여 B2M 및 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 메틸화 수준을 결정하였다.
NGS 처리 및 분석:
중아황산염-변환된 관심 표적 위치(인간 B2M 및 VEGFA 유전자좌)에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 PCR을 통해 100 ng 중아황산염-처리된 DNA로부터 표적 앰플리콘을 증폭시켰다. 이들 유전자 특이적 프라이머는 5' 단부에서 Illumina™ 어댑터를 도입하기 위한 추가 서열을 함유하였다. 증폭된 DNA 산물을 Cytiva Sera-Mag Select DNA 세정 키트로 정제하였다. 앰플리콘의 품질 및 정량화는 단편 분석기 DNA 분석 키트(Fragment Analyzer DNA Analysis kit, Agilent, dsDNA 35~1500 bp)를 사용하여 평가하였다. 제조사의 지침에 따라 Illumina™ Miseq™ 상에서 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 시퀀싱으로부터의 원시 fastq 파일을 Bismark의 Bisulfite Read Mapper 및 Methylation caller를 사용하여 처리하였다. 중아황산염-처리된 DNA의 PCR 증폭은 모든 우라실 뉴클레오티드를 티민으로 변환시키고, PCR 산물의 시퀀싱은 각각의 LTRP 분자에 의해 매개된 B2M 및 VEGFA 유전자좌에서의 잠재적 표적 표적 외 메틸화 수준의 판독으로서 시토신-티민 변환 속도를 결정할 것이다.
결과:
상이하게 구성된 LTRP 단백질을 암호화하는 LTRP 변이체 플라스미드(도 1)를 HEK293T 세포 내로 일시적으로 형질감염시켜, 합리적으로 설계된 LTRP 분자가 시험관 내에서 표적 B2M 유전자좌의 유전자 발현을 유전적으로 침묵화시킬 수 있는지 여부를 결정하였다. 도 32a 및 32b는 ZNF10로부터의 KRAB 도메인(도 32a) 또는 ZNF10로부터의 KRAB 도메인(도 32b)을 각각 보유한 LTRP 단백질 #1~3에 의해 매개된 B2M 단백질 억제를 평가하는 시간 경과 실험의 결과를 도시한다. 표 47은 형질감염 후 50일차에 각 조건에 대해 HLA-음성(고갈된 B2M 발현을 나타냄)을 특징으로 하는 세포의 평균 백분율을 보여준다. 결과는, 억제 효능이 KRAB 도메인 및 LTRP 구성의 선택에 따라 다양하였지만, B2M 유전자좌를 표적화하는 gRNA를 갖는 모든 LTRP 분자가 시험관 내에서 50일 동안 지속적인 B2M 억제를 나타낼 수 있었음을 보여준다. 예를 들어, LTRP 단백질은 ZNF10-KRAB를 보유하는 것보다 ZIM3-KRAB 도메인을 보유할 때 더 효과적인 억제인자가 되었고, 이러한 효과는 LTRP #2의 경우에 가장 두드러지게 관찰되었다(도 32a를 도 32b와 비교함). 또한, DNMT3A/L 도메인을 dCasX491의 N-말단에 위치시킨 결과(LTRP #1), dCasX491의 C-말단에서 DNMT3A/L 도메인을 갖는 LTRP(LTRP #2 및 #3)에 의해 매개된 효과와 비교해 B2M 억제의 침묵화가 더 안정되었다(도 32a 및 32b). 이들 결과는 또한, 두 가지 유형의 억제자 도메인(즉, LTRP #2의 경우 dCasX491-KRAB-DNMT3A/L 대 LTRP #3의 경우 dCasX491-DNMT3A/L-KRAB)의 상대적 위치설정이, 두 구성 모두가(LTRP #2 및 #3) dCasX491의 C-말단 융합임에도 불구하고, LTRP 분자의 전체 효능에 영향을 미칠 수 있음을 또한 보여주었다(도 32a 및 32b).
제2 시간 경과 실험에서, LTRP 단백질 #1, #4, 및 #5에 대해 지속적인 B2M 억제를 평가하였는데, 여기서 LTRP #4 및 #5의 경우 DNMT3A/L 및 KRAB 도메인 둘 다를 dCasX491의 N-말단에 위치시켰다(도 1). 표 48은 리포펙션 후 73일차에, 각 조건별 HLA-음성 세포의 평균 백분율을 보여준다. 제1 시간 과정에서 유사하게 나타났듯이, B2M-표적화 gRNA를 갖는 모든 LTRP 조건은 B2M 유전자좌의 지속적인 침묵화를 유지하였다(도 32a 및 32b; 표 48). 실제로, 이 실험의 결과는, 시험관 내에서 73일 동안, LTRP #5가 LTRP #1 또는 LTRP #4에 의해 달성된 것과 비교하여 가장 높은 수준의 B2M 억제를 달성하고 유지할 수 있음을 입증한다(도 33a 및 33b). 또한, ZIM3-KRAB를 함유하는 LTRP #4도 이의 LTRP #1 상대물을 능가하는 것으로 나타났다(도 33b). 위에서 논의된 시간 경과 실험 모두의 경우, CasX 491 매개 편집은 B2M 발현을 지속적으로 침묵화시킨 반면, KRAB 도메인만을 dCasx491에 융합시킨 XR 작제물(dCasX491-ZNF10)은 B2M을 일시적으로만 녹다운하였다.
| 형질감염 후 50일차에 정량화한, CasX 및 Cas9 분자 및 LTRP 작제물 #1~3에 의해 매개된 B2M 억제 수준 | |||
| 분자 | 스페이서 |
HLA-
음성 세포 백분율 (%) (평균) |
표준 편차 |
| CasX 491 | 0.0 | 0.29 | 0.09 |
| dCasX491 | 0.0 | N/A | N/A |
| dCasX491-ZNF10 | 0.0 | 0.40 | 0.18 |
| dCas9-ZNF10-D3A/L | 0.0 | 1.05 | 0.63 |
| LTRP1-ZNF10 | 0.0 | 0.99 | 0.35 |
| LTRP2-ZNF10 | 0.0 | 0.61 | 0.11 |
| LTRP3-ZNF10 | 0.0 | 0.79 | 0.29 |
| LTRP1-ZIM3 | 0.0 | 0.99 | 0.22 |
| LTRP2-ZIM3 | 0.0 | 0.78 | 0.27 |
| LTRP3-ZIM3 | 0.0 | 0.71 | 0.53 |
| CasX 491 | 7.37 | 76.57 | 11.03 |
| dCasX491 | 7.37 | 0.49 | 0.10 |
| dCasX491-ZNF10 | 7.148 | 0.89 | 0.19 |
| dCas9-ZNF10-D3A/L | 7.148 | 57.30 | 17.36 |
| LTRP1-ZNF10 (LTRP #1.B) |
7.37 | 69.97 | 7.89 |
| LTRP2-ZNF10 (LTRP #2.B) |
7.37 | 36.87 | 8.31 |
| LTRP3-ZNF10 (LTRP #3.B) |
7.37 | 17.07 | 3.50 |
| LTRP1-ZIM3 (LTRP #1.A) |
7.37 | 73.70 | 9.28 |
| LTRP2-ZIM3 (LTRP #2.A) |
7.37 | 58.83 | 0.87 |
| LTRP3-ZIM3 (LTRP #3.A) |
7.37 | 17.50 | 4.30 |
| 형질감염 후 73일차에 정량화한, CasX 및 Cas9 분자 및 LTRP 작제물 #1, #4, 및 #5에 의해 매개된 B2M 억제 수준. | |||
| 분자 | 스페이서 |
HLA-
음성 세포 백분율 (%) (평균) |
표준 편차 |
| CasX 491 | 0.0 | 0.71 | 0.05 |
| dCasX491 | 0.0 | N/A | N/A |
| dCasX491-ZNF10 | 0.0 | 0.76 | 0.12 |
| dCas9-ZNF10-D3A/L | 0.0 | 0.83 | 0.08 |
| LTRP1-ZNF10 | 0.0 | 1.04 | 0.44 |
| LTRP4-ZNF10 | 0.0 | 1.17 | 0.52 |
| LTRP5-ZNF10 | 0.0 | 1.94 | 1.27 |
| LTRP1-ZIM3 | 0.0 | 1.83 | 0.76 |
| LTRP4-ZIM3 | 0.0 | N/A | N/A |
| LTRP5-ZIM3 | 0.0 | 1.15 | 0.26 |
| CasX 491 | 7.37 | 73.30 | 8.43 |
| dCasX491 | 7.37 | 0.83 | 0.16 |
| dCasX491-ZNF10 | 7.148 | 1.37 | 0.37 |
| dCas9-ZNF10-D3A/L | 7.148 | 68.97 | 5.21 |
| LTRP1-ZNF10 (LTRP #1.B) |
7.37 | 48.27 | 3.66 |
| LTRP4-ZNF10 (LTRP #4.B) |
7.37 | 55.17 | 4.83 |
| LTRP5-ZNF10 (LTRP #5.B) |
7.37 | 60.77 | 8.12 |
| LTRP1-ZIM3 (LTRP #1.A) |
7.37 | 58.90 | 2.69 |
| LTRP4-ZIM3 (LTRP #4.A) |
7.37 | 69.00 | 6.58 |
| LTRP5-ZIM3 (LTRP #5.A) |
7.37 | 74.90 | 10.61 |
LTRP 분자 내의 DNMT3A/L 도메인에 의해 매개된 B2M 유전자좌에서의 오프-타깃 CpG 메틸화 정도를 평가하기 위해, ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP 단백질 #1~3으로 치료하고 리포펙션 후 5일차에 수확한 HEK293T 세포로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하여 중아황산염 시퀀싱을 수행하였다. 도 34는 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 것으로서, 구체적으로는, 특정 수준의 CpG 메틸화를 보유한 B2M 유전자좌의 전사 시작 부위 주위에 있는 다수의 CpG 부위의 분포를 각 실험 조건별로 보여준다. 결과는, LTRP #1이 가장 강한 표적 내 CpG-메틸화 활성을 나타냈지만(LTRP1-ZIM3 7.37), 가장 높은 수준의 표적 외 CpG 메틸화(LTRP1-ZIM3 NT)를 유도하였음을 보여주었다. LTRP #2 및 LTRP #3은 더 약한 표적 외 CpG-메틸화 활성을 나타냈지만, 비교적 더 낮은 표적 외 메틸화를 나타냈다(도 34). 도 35는 CasX 491 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/L에 대해 벤치마킹한 LTRP 단백질 #1~3에 대한 활성-특이성 프로파일을 맵핑한 산포도이며, 여기서 활성은 21일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율로서 측정하였고, 특이성은 5일차에 정량화한 B2M 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율로 표시하였다.
DNMT3A/L 도메인에 의해 매개된 표적 외 CpG 메틸화의 정도는, 이전에 도 34에서 사용된 것과 동일한 추출된 gDNA를 사용해 중아황산염 시퀀싱을 수행해 상이한 유전자좌, 즉 VEGFA에서의 CpG 메틸화 수준을 평가함으로써 추가로 평가하였다. 도 36의 바이올린 도표는 중아황산염 시퀀싱 결과를 도시한 것으로서, ZIM3-KRAB 도메인 및 B2M-표적화 gRNA를 함유하는 LTRP 단백질 #1~3으로 치료한 세포의 VEGFA 유전자좌에서 CpG 메틸화를 갖는 CpG 부위의 분포를 보여준다. 결과는 LTRP #1을 사용했을 때 표적 외 CpG 메틸화 수준이 가장 높았음을 추가로 입증하는데, 이는 앞서 도 34에 도시된 데이터를 뒷받침한다. 비교하면, LTRP #2 또는 LTRP #3을 사용했을 때 -3 유전자좌에서의 표적 외 메틸화가 실질적으로 더 낮았다(도 36).
LTRP 분자 #1, #4, 및 #5에 대한 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화의 정도도 분석하였다. 도 37a~37b의 바이올린 도표는 중아황산염 시퀀싱 결과를 도시한 것으로서, ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인 및 비표적화 gRNA(도 37b) 또는 B2M-표적화 gRNA(도 37a)를 함유하는 LTRP #1, 4, 및 5로 치료한 세포의 VEGFA 유전자좌에서 CpG 메틸화된 부위의 분포를 보여준다. 도 37b의 데이터는 LTRP4-ZNF10, LTRP5-ZFN10, 또는 LTRP5-ZIM3을 사용하는 것이 LTRP1-ZNF10 또는 LTRP1-ZIM3을 사용하는 것과 비교해 VEGFA 유전자좌에서 표적 외 CpG 메틸화를 현저히 낮추었음을 보여준다. 유사하게, 도 37a의 데이터는 LTRP #4 또는 LTRP #5를 KRAB 도메인 1중 어느 하나와 함께 사용하는 것이 LTRP1-ZNF10과 함께 사용하는 것에 비해 표적 외 CpG 메틸화 부위의 수준을 실질적으로 낮추었음을 보여준다. 도 37a 및 37b 모두에서 나타난 것과 같이, LTRP #1에 의해 입증된 비특이적 CpG 메틸화 수준은 dCas9-ZNF10-DNMT3A/L 벤치마크에 의해 달성된 것과 유사하다.
도 38은 CasX 491 및 dCas9-ZNF10-DNMT3A/L에 대해 벤치마킹한, ZNF10 또는 ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP 분자 #1~5에 대한 활성-특이성 프로파일을 맵핑한 산포도이며, 여기서 활성은 21일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율로서 측정하였고, 특이성은 5일차에 B2M 유전자좌에서 검출된 표적 외 CpG 메틸화 중앙값 백분율로 표시하였다. 데이터는 평가된 5개의 LTRP 분자 중, LTRP #5를 사용한 경우의 억제 활성이 가장 높았고, LTRP #4를 사용한 경우의 특이성 수준이 가장 강했음을 보여준다.
실험은 합리적으로 조작된 LTRP 분자가 내인성 B2M 유전자좌를 전사적으로 및 유전적으로 억제하여 표적 단백질을 지속적으로 고갈시킬 수 있었음을 입증한다. 결과는 또한, KRAB 도메인의 선택 및 DNMT3A/L 도메인의 위치 및 상대 구성이 표적 유전자좌를 지속적으로 침묵화시키는 데 있어서 LTRP 분자의 전체 효능 및 특이성에 영향을 미칠 수 있었음을 보여준다.
실시예 14: DNMT3A로부터의 ADD 도메인을 포함시키는 것이 LTRP 분자의 활성 및 특이성을 향상시킨다는 것의 입증
C-말단 메틸전이효소 도메인에 추가로, DNMT3A는 이의 기능 및 염색질로의 동원을 조절하는 다음 2개의 N-말단 도메인을 함유한다: ADD 도메인 및 PWWP 도메인. PWWP 도메인은 H3K36me3을 포함하여, 메틸화된 히스톤 꼬리와 상호작용하는 것으로 보고되었다. ADD 도메인은 다음 2개의 주요 기능을 갖는 것으로 알려져 있다: 1) 메틸전이효소 자가-억제 도메인으로서 작용함으로써 DNMT3A의 촉매 활성을 알로스테릭하게 조절함; 및 2) 메틸화되지 않은 H3K4(H3K4me0)를 인식함. ADD 도메인과 H3K4me0 마크의 상호작용은 DNMT3A의 촉매 부위를 밝혀내어, 활성 DNMT3A를 염색질에 동원하여 이들 부위에서 새로운 메틸화를 구현한다.
ADD 도메인의 이러한 기능을 감안하여, 실시예 13에서 전술한 LTRP #5 작제물에 ADD 도메인을 통합하는 것이 표적 유전자좌의 장기 억제를 개선하고 표적 외 메틸화를 감소시키는지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. ADD 도메인과 함께 PWWP 도메인을 통합하는 것이 LTRP 활성 및 특이성에 미치는 효과를 또한 평가하였다.
물질 및 방법:
LTRP 작제물의 생성 및 플라스미드 클로닝:
ZIM3-KRAB 도메인을 갖는 LTRP #5 작제물의 변이체(LTRP #5.A; LTRP #5 구성은 도 1 참조)를 암호화하는 플라스미드 작제물을 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 작제하였다. 생성된 작제물은 추가의 DNMT3A 도메인이 통합된 LTRP5-ZIM3의 다음 4가지 대안적인 변이체 중 하나를 암호화하는 서열로 구성되었다: 1) LTRP5-ZIM3 + ADD; 2) LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP; 3) LTRP5-ZIM3 + ADD (DNMT3A 촉매 도메인 없음); 및 4) LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP (DNMT3A 촉매 도메인 없음). LTRP5-ZIM3 분자 및 이의 변이체 내의 주요 요소의 서열은 표 49에 열거되어 있고, 각각의 LTRP5-ZIM3 및 이의 변이체에 대한 전장 단백질 서열은 표 50에 열거되어 있다. 도 45는 본 실시예에서 검정된 다양한 LTRP #5 구조를 도시한 개략도이다. LTRP 분자를 암호화하는 서열은 2x FLAG 태그를 또한 함유하였다. 플라스미드는 내인성 B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 또는 비표적화 대조군(스페이서 서열은 표 51에 열거되어 있음)을 갖는 gRNA 스캐폴드 변이체 174를 암호화하는 작제물을 또한 보유하였다.
| 성분 |
아미노산 서열
서열번호 |
| ZIM3 KRAB 도메인 | 3240 |
| DNMT3A 촉매 도메인(CD) | 126 |
| DNMT3L 상호작용 도메인 | 127 |
| dCasX491 | 4 |
| 링커 1 | 123 |
| 링커 2 | 122 |
| 링커 3A' | 124 |
| 링커 3B | 120 |
| 링커 4 | 121 |
| NLS A | 30 |
| NLS B | |
| DNMT3A ADD 도메인 | 125 |
| DNMT3A PWWP 도메인 | 3252 |
| DNMT3A PWWP 도메인과 ADD 도메인(endo) 사이의 내인성 서열 | 3253 |
| LTRP ID |
아미노산 서열
서열번호 |
| LTRP5-ZIM3 | 3131 |
| LTRP5-ZIM3 + ADD | 3132 |
| LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP | 3254 |
| LTRP5-ZIM3 + ADD - CD | 3255 |
| LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP - CD | 3256 |
| 스페이서 ID | 표적 유전자 | 서열 | 서열번호 |
| 0.0 | 비표적 | CGAGACGUAAUUACGUCUCG | 3232 |
| 7.37 | B2M | GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG | 3137 |
| 7.160 | B2M | UAAACAUCACGAGACUCUAA | 3113 |
| 7.165 | B2M | UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU | 3114 |
HEK293T 세포의 형질감염:
시딩된 HEK293T 세포를 LTRP5-ZIM3 또는 이의 대안적인 변이체 중 하나(도 45; 서열에 대해서는 표 50 참조)를 암호화하는 ELXR:gRNA 작제물을 각각 함유하는 100 ng의 LTRP5 변이체 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰으며, 여기서 gRNA는 비표적화 스페이서 0.0 또는 B2M-표적화 스페이서(스페이서 서열에 대해서는 표 51 참조)를 갖는다. 스페이서 7.160 및 7.165는 LTRP와 함께 사용될 때 B2M 유전자좌를 억제하는 것으로 나타났지만, ZIM3 KRAB 도메인에 융합된 dCasX로 이루어진 dXR과 함께 사용될 때는 그렇지 않다(데이터 미도시). 각각의 작제물을 3회 시험하였다. 형질감염 후 24시간차에, 세포를 1 μg/mL 퓨로마이신으로 3일 동안 선택하였다. 형질감염 후 5일차, 12일차, 21일차, 및 51일차에 억제 분석을 위해 세포를 수확하였다. 간략하게, 실시예 13에 기술된 바와 같이, HLA 면역 염색에 이어서 유세포 계측을 통해 B2M 단백질 발현을 분석하여 억제 분석을 수행하였다. 또한, LTRP5 변이체 플라스미드 및 B2M-표적화 gRNA 또는 비-표적화 gRNA로 일시적으로 형질감염시킨 HEK293T 세포를, VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 메틸화를 평가하기 위한 중아황산염 시퀀싱을 위한 gDNA를 추출하기 위해 형질감염 후 7일차에 수확하였는데, 상기 시퀀싱은 실시예 13에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과:
ADD 도메인을 PWWP 도메인과 함께 또는 PWWP 도메인 없이 LTRP5 분자에 통합하는 것이 표적 B2M 유전자좌의 장기 억제를 증가시키고 표적 외 메틸화를 감소시키는 데 미치는 효과를 평가하였다. LTRP5-ZIM3 분자의 변이체를 B2M-표적화 gRNA(스페이서 7.37 및 LTRP-특이적 스페이서 7.160 및 7.165 포함) 또는 비표적화 gRNA로 평가하였고, 그 결과는 도 39~42의 도표에 도시되어 있다. 도 39는 LTRP5-ZIM3, LTRP5-ZIM3 + ADD, 및 LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP와 쌍을 형성한 스페이서 7.37을 사용한 경우 억제 활성이 포화 수준에 도달하여, LTRP5 변이체 간의 활성 차이를 평가하는 것이 더 어려워짐을 보여준다. 그러나, LTRP5 변이체 간의 억제 활성에 있어서의 차이는 스페이서 7.160 및 7.165를 사용할 때 더 두드러졌다(도 40 및 41). 데이터는, ADD 도메인을 통합하는 것은, ADD 도메인이 다른 LTRP5-ZIM3 분자와 쌍을 형성했을 때 달성한 억제 수준과 비교해 2개의 LTRP 특이적 스페이서와 쌍을 형성했을 때 장기 억제를 유의하게 증가시켰음을 입증한다. 한편, ADD 및 PWWP 도메인 둘 다를 통합했을 때는, 특히 베이스라인 LTRP5-ZIM3 분자와 비교하여 B2M 유전자좌의 억제가 개선되지 않았다. 예상대로, DNMT3A 촉매 도메인이 없는 2개의 LTRP5 변이체가 나타낸 장기 억제는 좋지 않았다. 또한, 도 42에 도시된 결과는, 관찰된 HLA-음성 세포의 백분율이 더 낮은 것을 감안했을 때, ADD 도메인을 첨가하면 베이스라인 LTRP5-ZIM3 분자에 비해 특이성이 증가하는 것으로 나타났음을 나타낸다.
LTRP5 변이체에 의해 잠재적으로 매개되는 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화를 중아황산염 시퀀싱을 사용하여 평가하였다. 도 43은 중아황산염 시퀀싱의 결과를 도시한 것으로서, 구체적으로는 VEGFA 유전자좌 주위에서 CpG 메틸화의 백분율을 보여준다. 결과는 모든 B2M-표적화 gRNA뿐만 아니라 비표적화 gRNA의 경우에도, ADD 도메인을 LTRP5-ZIM3 분자에 통합했을 때 VEGFA 유전자좌에서 표적 외 메틸화 수준이 극적으로 감소하였음을 입증한다(도 43). 도 44는 본 실시예에서 조사된 LTRP5-ZIM3 변이체에 대한 활성-특이성 프로파일을 맵핑한 산포도이며, 여기서 활성은 스페이서 7.160과 쌍을 형성한 경우에, 21일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율로서 측정하였고, 특이성은 스페이서 7.160과 쌍을 형성한 경우에, 7일차에 정량화된 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화 백분율로서 표시하였다. 산포도는 ADD 도메인의 추가가 ADD 도메인이 없는 베이스라인 ELX5 분자에 비해 LTRP5 분자의 활성을 유의하게 증가시킨다는 것을 명확하게 보여준다(도 44).
실험은, DNMT3A ADD 도메인을 포함시키되 ADD 및 PWWP 도메인 둘 다를 포함시키지 않는 것이 LTRP 분자의 억제 활성 및 특이성을 개선하였음을 입증한다. 이러한 활성 및 특이성의 향상은 다수의 gRNA로 관찰되었는데, 이는 ADD 도메인을 LTRP에 통합하는 것의 유의함을 입증한다.
실시예 15: DNMT3A의 ADD 도메인을 LTRP에 포함시키는 것이 표적 내(on-target) 활성을 향상시키고 표적 외(off-target) 메틸화를 감소시킨다는 것의 입증
실시예 13에서 전술한 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 LTRP 분자에 ADD 도메인을 통합하는 것이 표적 유전자좌의 장기 억제와 표적 외 메틸화에 미치는 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
LTRP 작제물의 생성 및 플라스미드 클로닝:
ZNF10-KRAB 또는 ZIM3-KRAB 도메인 및 DNMT3A ADD 도메인을 갖는 구성 #1, #4, 및 #5를 갖는 LTRP 분자를 암호화하는 플라스미드 작제물은 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 구축하였다. 생성된 LTRP 분자의 서열은 표 52에 열거되어 있는데, 이는 특정 LTRP 분자에 대해 약칭된 작제물 명칭도 보여준다(예: LTRP #1.A, #1.B). 도 46은 LTRP 구성 #1, #4, 및 #5에 ADD 도메인이 통합된 LTRP 분자의 일반적인 구조를 도시한 개략도이다. LTRP 분자를 암호화하는 서열은 2x FLAG 태그를 또한 함유하였다. 플라스미드는 내인성 B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 또는 비표적화 대조군(스페이서 서열은 표 51에 열거되어 있음)을 갖는 gRNA 스캐폴드 174를 암호화하는 서열을 또한 보유하였다.
| LTRP # | 도메인 |
아미노산 서열
서열번호 |
| LTRP #1 | ZNF10-KRAB, DNMT3A ADD, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #1.D) |
3257 |
| ZIM3-KRAB, DNMT3A ADD, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #1.C) |
3258 | |
| ZNF10-KRAB, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #1.B) |
3259 | |
| ZIM3-KRAB, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #1.A) |
3066 | |
| LTRP #4 | ZNF10-KRAB, DNMT3A ADD, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #4.D) |
3260 |
| ZIM3-KRAB, DNMT3A ADD, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #4.C) |
3261 | |
| ZNF10-KRAB, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #4.B) |
3262 | |
| ZIM3-KRAB, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #4.A) |
3263 | |
| LTRP #5 | ZNF10-KRAB, DNMT3A ADD, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #5.D) |
3264 |
| ZIM3-KRAB, DNMT3A ADD, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #5.C) |
3132 | |
| ZNF10-KRAB, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #5.B) |
3265 |
|
| ZIM3-KRAB, DNMT3A CD, DNMT3L 상호작용 (LTRP #5.A) |
3131 |
HEK293T 세포의 형질감염:
시딩된 HEK293T 세포를, LTRP 분자(표 52; 도 46)를 암호화하는 LTRP:gRNA 작제물을 각각 함유하는 100 ng의 LTRP 변이체 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰으며, 여기서 gRNA는 비표적화 스페이서 0.0 또는 B2M-표적화 스페이서(표 51)를 갖는다. 각각의 작제물을 3회 시험하였다. 형질감염 후 24시간차에, 세포를 1 μg/mL 퓨로마이신으로 3일 동안 선택하였다. 형질감염 후 8일차, 13일차, 20일차, 및 27일차에 억제 분석을 위해 세포를 수확하였다. 간략하게, 실시예 13에 기술된 바와 같이, HLA 면역 염색에 이어서 유세포 계측을 통해 B2M 단백질 발현을 분석하여 억제 분석을 수행하였다. 추가로, 표적화되지 않은 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 메틸화를 평가하는 중아황산염 시퀀싱을 위한 gDNA 추출을 위해 형질감염 후 5일차에 세포를 또한 수확하였는데, 이는 실시예 13에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다.
결과:
ZNF10 또는 ZIM-KRAB를 갖고, 구성 #1, #4, 또는 #5를 갖는 LTRP 분자(도 2 참조) 내에 ADD 도메인을 통합하는 것이 B2M 유전자좌의 장기 억제 및 표적 외 메틸화에 미치는 효과를 평가하였다. LTRP 분자를 B2M-표적화 gRNA 또는 비-표적화 gRNA로 시험하였고, 그 결과는 도 47a~50b의 도표에 도시되어 있다. 데이터는, ADD 도메인을 LTRP 분자에 통합하면, 스페이서 7.160을 사용했을 때, ZIM3-KRAB를 함유하는 모든 LTRP 구성이 모든 시점에 걸쳐 B2M 억제를 명확하게 실질적으로 증가시켰(도 47a), 스페이서 7.165 및 7.37을 사용했을 때에도 유사한 결과가 관찰되었음을 입증한다(데이터 미도시). 도 47b는 ZNF10 또는 ZIM3-KRAB를 함유하는 LTRP #5가 스페이서 7.160을 갖는 gRNA와 쌍을 형성했을 때, 이를 사용한 후 B2M 억제 결과를 보여주며; 데이터는, ADD 도메인을 포함하는 것이 전체적으로 지속적인 B2M 억제를 증가시켰고, LTRP5-ZIM3 + ADD의 활성이 LTRP5-ZNF10 + ADD에 비해 더 높았음을 입증한다. LTRP #1 및 LTRP #4 및 다른 2개의 스페이서에 대해서도 유사한 시간 경과 결과가 관찰되었다(데이터 미도시). 도 47c는, ZIM3-KRAB를 함유하는 LTRP #5가 3개의 B2M-표적화 gRNA 중 어느 하나와 쌍을 형성했을 때, 이를 사용한 후의 B2M 억제 결과를 도시하며, 데이터는 ADD 도메인을 포함시킨 경우의 B2M 억제가 전반적으로 더 높았음을 입증한다. LTRP #1 및 LTRP #4에 대해서도 유사한 시간 경과 결과가 관찰되었다(데이터 미도시).
도 48a~48c는 시험된 모든 LTRP 구성 및 gRNA에 대해 27일차 시점의 B2M 억제 결과를 보여준다. 결과는, B2M 억제의 증가가 스페이서 7.37을 사용한 경우에 비해 준최적 스페이서 7.160 및 7.165을 사용했을 때 더 두드러짐을 보여준다. 또한, 분자의 N-말단에 DNMT3A 및 DNMT3L 도메인을 함유하는 LTRP #1 및 LTRP #5를 사용한 경우, DNMT3A ADD 도메인을 첨가한 후 B2M 억제가 가장 크게 증가하였다(도 48a~48c). KRAB 도메인의 3' 및 dCasX의 5'에서 DNMT3A /3L 도메인을 보유하는 LTRP #4를 사용한 경우에는 활성 증가가 더 낮았는데, 이는 ADD 도메인이 염색질과 적절히 상호작용하는 능력이 감소한 것에 기인하는 것일 수 있다.
LTRP 분자의 특이성은 중아황산염 시퀀싱을 사용하여 표적 외 유전자좌인 VEGFA 유전자에서 CpG 메틸화 수준을 프로파일링하여 결정하였으며, 데이터는 도 49a~52b에 도시되어 있다. 데이터는, DNMT3A ADD 도메인을 포함시킨 경우, 시험된 모든 조건에 걸쳐 VEGFA 유전자좌의 표적 외 메틸화가 실질적으로 감소하였음을 입증한다(도 49a~49c). 특히, ADD 도메인의 포함에 의해 매개된 특이성 증가는, 분자의 N-말단 말단에서 DNMT3A/3L 도메인을 보유한 LTRP #1 및 LTRP #5 구성 둘 다에서 가장 두드러졌다. 흥미롭게도, ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP 분자는 VEGFA 유전자좌의 더 강한 표적 외 메틸화를 초래하였다. 또한, ADD 도메인이 없이 LTRP #4 및 #5 구성을 사용했을 때에도 LTRP #1 구성을 사용한 것과 비교해 특이성이 더 높았다. LTRP1-ZIM3 및 LTRP4-ZIM3 구성과 비교하여, ADD 도메인을 LTRP5-ZIM3에 포함시킨 경우에 표적 외 메틸화가 가장 낮았다.
도 50a~52b는 다양한 LTRP 분자에 대한 활성-특이성 프로파일을 맵핑한 일련의 산포도이며, 여기서 활성은 27일차에 HLA-음성 세포의 평균 백분율로서 측정하였고, 특이성은 5일차에 VEGFA 유전자좌에서의 표적 외 CpG 메틸화의 백분율에 의해 결정하였다. 데이터는, ADD 도메인을 포함시킨 경우에, 시험된 3개의 B2M-표적화 스페이서 모두에 걸쳐, VEGFA 유전자좌에서의 온-타깃 B2M 억제가 증가하였고 표적 외 메틸화가 감소하였음을 입증한다. #1 및 #5 구성을 갖는 LTRP 분자는 시험된 각 스페이서에서 활성 및 특이성의 가장 큰 증가를 나타냈다.
본 실시예에서 논의된 실험의 결과는, DNMT3A ADD 도메인을 포함시키는 것이 초기 시점에 억제 강도 및 세포 분열 전반에 걸친 침묵화의 유전력 둘 다를 향상시킬 뿐만 아니라, LTRP 분자에서 DNMT3A 촉매 도메인에 의해 발생하는 표적 외 메틸화를 감소시킨다는 것을 데이터가 입증한다는 점에서 실시예 14의 결과를 뒷받침한다. 데이터는 또한, 상이한 LTRP 구성이 특이성에 있어서 고유한 차이를 가지며, 이는 보다 강력한 KRAB 도메인을 사용함으로써 악화될 수 있음을 확인시켜 준다. 이러한 특이성의 감소는 DNMT3A ADD 도메인을 포함시킴으로써 완화될 수 있으며, 이는 전반적으로 더 큰 온-타깃 억제로 이어질 수도 있다. 억제 활성의 증가는 H3K4me0을 인식하는 DNMT3A ADD 도메인의 기능 및 후속하는 염색질로의 동원에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. 특이성의 증가는 H3K4me0에 대한 결합이 없는 상태에서 DNMT3A의 촉매 도메인의 알로스테릭 억제를 유도하는 DNMT3A ADD 도메인의 기능을 통해 매개되는 것으로 여겨진다. 결과는 또한, 시험된 상이한 구성에서 ADD 도메인을 위치시키는 것이 LTRP 분자의 특이성 및 활성 모두를 가장 강하게 증가시키는 데 중요하다는 것을 강조한다.
실시예 16: 고처리량 스크리닝을 위한 HBEGF에 대한 dXR 유효성의 입증
포유류 세포에서 분자의 고처리량 스크리닝을 위해 dXR 작제물을 사용할 수 있는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
HEK293T 세포를 300,000 세포/웰로 6-웰 플레이트에 시딩하고, 다음 중 어느 하나를 암호화하는 1 μg의 플라스미드로 리포펙션하였다: CasX 분자(491); ZNF10-KRAB 억제자 도메인을 갖는 촉매적으로 사멸한 CasX 491(dXR); 및 HBEGF 유전자를 표적화하는 스페이서 또는 비표적화 스페이서를 갖는 가이드 스캐폴드 174(서열번호 1744). CasX-기반 분자 및 표시된 스페이서(표 53)를 갖는 gRNA의 5개의 조합을 5개의 별도 웰 내로 형질감염시켰다. HBEGF는 디프테리아 독소의 진입을 매개하는 수용체로서, 세포에 첨가되면 번역을 억제하고 세포 사멸을 초래한다. CasX 또는 dXR 분자 및 표적화 gRNA로 HBEGF 유전자를 표적화하는 것은 독소 진입을 막고 세포를 생존시킬 수 있는 반면, CasX 및 dXR 분자 및 비표적화 gRNA로 치료한 세포는 생존하지 못한다. 형질감염 후 1일차에, 각각의 형질감염된 웰 내의 세포를 96-웰 플레이트 내의 12개의 상이한 웰로 분할하고 퓨로마이신으로 선택하였다. 3일에 걸쳐, 세포를 6가지 상이한 농도의 디프테리아 독소(0, 0.2, 2, 20, 200, 및 2000 ng/mL)로 처리하고, 생물학적 복제를 수행하였다. 추가로 2일 후에, 세포를 신선한 배지로 분할하고, ImageXpress Pico Automated Cell Imaging System을 이용해 총 세포 계수를 측정하였다.
| 스페이서 ID | RNA 서열 | 서열번호 | 분자 |
| 34.19 | ACUGGGAGGCUCAGCCCAUG | 3266 | CasX |
| 34.21 | UGUUCUGUCUUGAACUAGCU | 3267 | CasX |
| 34.28 | UGAGUGUCUUGUCUUGCUCA | 3268 | dXR |
| 0.0 | CGAGACGUAAUUACGUCUCG | 3232 | CasX 및 dXR |
결과:
디프테리아 독소 검정의 결과는 도 53의 도표에 도시되어 있다. HBEGF 유전자의 dXR 매개 억제로 세포가 생존하였지만, 낮은 투여량의 독소(0.2~20 ng/mL)에서만 생존하였다. 그러나, 이러한 동일한 투여량은 비표적화 작제물로 치료한 대조군 세포에서 완전한 세포 사멸을 초래하였다. 고 투여량(> 20 ng/mL)의 독소는 dXR 및 대조군 샘플 모두에서 세포 사멸을 초래하였는데, 이는 dXR에 의해 허용되는 전사의 기저 수준이, 충분한 독소가 진입하여 세포 사멸을 촉발할 수 있음을 시사한다. 결과는 CasX-편집된 세포가 보호된 상태로 유지되었음을 보여주는데, 이는 유전자좌의 편집이 기능적 단백질의 완전한 상실을 초래하기 때문이다. 비표적화 대조군은 모든 투여량에서 사멸하였는데, 이는 HBEGF가 억제되거나 편집되지 않을 때의 독소의 효능을 입증한다.
결과는 dXR이 저 투여량의 독소에서 보호한다는 것을 보여주며, 이는 이러한 작제물이 0.2~20 ng/mL의 디프테리아 독소의 범위에서 스크리닝될 수 있음을 입증하며, dXR과 대조군 간의 가장 높은 배수 풍부도는 0.2 ng/mL에서 관찰되었다. CasX는 모든 투여량에서 보호하지만, dXR에 의한 억제는 여전히 표적의 낮은 기저 발현을 유도하고, 이는 독소의 투여량이 높을 때 세포의 독성으로 이어졌다.
실시예 17: 억제자 융합 단백질에 포함시키기 위한 개선된 억제자 도메인을 식별하기 위한 선택 계획의 개발 더 양호한 LTRP 융합 단백질 작제물을 개발하기 위해, 많은 비인간 종의 전사 효과기 도메인 라이브러리를 선택 검정에서 시험하였다. KRAB 도메인은 척추동물에서 가장 크고 가장 빠르게 진화된 도메인 중 하나이므로, 이전에 평가되지 않은 종의 억제자 도메인은 억제 강도 및 영구성을 개선할 것으로 예상하였다.
물질 및 방법:
후보 억제자 도메인의 식별:
Prosite 수탁 번호 ps50805(KRAB 도메인에 대한 수탁 번호)로 주석이 달린 모든 서열을 다운로드함으로써 KRAB 도메인의 동족체를 식별하였다. 모든 도메인을 100개의 아미노산만큼 연장시켜(주석이 중간에 중심을 두고) 잠재적인 주석이 없는 기능적 서열을 포함시켰다. 또한, 기술된 긴-판독 영장류 게놈 어셈블리의 최근에 완료된 정렬(Warren, WC 등의 문헌[Sequence diversity analyses of an improved rhesus macaque genome enhance its biomedical utility. Science 370, Issue 6523, eabc6617in (2020)]; Fiddes, IT 등의 문헌[Comparative Annotation Toolkit (CAT)-simultaneous clade and personal genome annotation. Genome Res. 28(7):1029 (2018)]; Mao, Y 등의 문헌[A high-quality bonobo genome refines the analysis of hominid evolution. Nature 594:77 (2021)])로부터의 고품질 영장류 주석 세트를 이용해 도메인 식별 도구인 HMMER을 실행하여, 이들 어셈블리에서 도메인을 식별하였는데, 이들 대부분은 UniProt에 존재하지 않았다. 159개의 상이한 유기체로부터 32,120개의 고유 서열이 검색하여 전사 억제에 있어서 이들의 효능에 대해 시험하였다. 또한, Tycko, J. 등의 연구에 기초하여 80개 잔기 길이의 580개의 무작위 아미노산 서열을 음성 대조군으로서 라이브러리에 포함시키고, 304개의 인간 KRAB 도메인을 포함시켰다 (Cell. 2020 Dec 23;183(7):2020-2035).
스크리닝 방법:
전술한 도메인을 DNA 올리고로서 합성하고, 증폭시키고, 스페이서 34.28를 갖는 가이드 스캐폴드 174(서열번호 1744)와 함께 dCasX491 C-말단 GS 링커 렌티바이러스 작제물 내로 클로닝하여, 상기 실시예 16에 기술된 바와 같이, HBEGF를 억제하고 디프테리아 독소 선택에 생존을 부여하였다. 각각의 도메인에 대해, C-말단 GS 링커를 동의어로 치환하여 NGS에 의해 구별될 수 있는 고유한 DNA 바코드를 생성하여, 각각의 풀링된 실험에서 내부 기술적 복제물을 평가할 수 있게 하였다. 이들 플라스미드를 사용하여 라이브러리의 렌티바이러스 작제물을 생성하였다.
HEK293T 세포를 형질도입하고, 1 μg/mL 퓨로마이신으로 처리하여 형질도입되지 않은 세포를 제거하고, 2 ng/mL 디프테리아 독소로 48시간 동안 선택하였다. 전술한 바와 같이 gDNA를 추출하고, 증폭하고, 시퀀싱하였다. 또한, 세포로부터 gDNA 샘플을 추출하고, 증폭하고, 시퀀싱한 후 디프테리아 독소를 이용해 대조군으로서 선택하였다. 디프테리아 독소 선택을 위해 2회의 독립적인 복제를 수행하였다.
B2M 억제 평가:
대표적인 도메인을 B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.15(GGAAUGCCCGCCAGCGCGAC; 서열번호 3110)를 갖는 가이드 스캐폴드 316(서열번호 1746)과 함께 dCasX491 C-말단 GS 링커 렌티바이러스 작제물 내로 클로닝하였다. 별도로, 대표적인 도메인을 B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.37(GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG; 서열번호 3137)을 갖는 가이드 스캐폴드 174(서열번호 1744)와 함께 dCasX491 C-말단 GS 링커 렌티바이러스 작제물 내로 클로닝하였다. 다양한 도메인을 갖는 dXR을 암호화하는 렌티바이러스 플라스미드 작제물을 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다. 이들 작제물은 dCasX491, 및 ZNF10, ZIM3으로부터의 KRAB 도메인, 또는 라이브러리에서 시험된 도메인 중 하나를 암호화하는 서열을 포함하였다. 클로닝되고 서열 검증된 작제물을 미디프렙으로 정제하고 품질 평가를 실시한 후 HEK293T 세포에 형질감염시켰다.
HEK293T 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 30,000개의 세포 밀도로 시딩하였다. 다음 날, 리포펙타민을 사용하여 상이한 도메인 및 B2M 유전자좌에 대한 표적화 스페이서를 갖는 gRNA를 포함하는 dXR 작제물을 각각 함유하는 100 ng의 dXR 플라스미드로 각각의 웰을 일시적으로 형질감염시켰다. 실험 대조군은, ZNF10 또는 ZIM3으로부터의 KRAB 도메인, 라이브러리에 있었지만 상위 95개 또는 1597개의 가장 효과적인 억제자 가운데는 없는 도메인, 또는 dCas9-ZNF10을 갖는 dXR 작제물을 각각의 상응하는 B2M-표적화 gRNA와 함께 포함하였다. 각각의 작제물을 3회 시험하였다. 형질감염 후 24시간차에, 세포를 1 μg/mL 퓨로마이신으로 2일 동안 선택하였다. 형질감염 후 7일 또는 10일차에, 세포를 수확하고, HLA 면역염색을 통해 B2M 단백질 발현을 분석함으로써 편집 억제 분석을 수행한 다음 유세포 계측을 수행하였다. B2M 발현은 세포 표면 상에서 발현된 B2M-의존적 HLA 단백질을 검출하는 항체를 사용해 결정하였다. HLA+ 세포는 Attune™ NxT 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다.
데이터 분석:
시험된 라이브러리에서 단백질 서열의 다양성을 이해하기 위해, 진화 규모 모델링(ESM) 변환기(ESM-1b)를 32,120개의 도메인 아미노산 서열의 초기 라이브러리에 적용하여 서열의 고차원 표현을 생성하였다(Rives, A. 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA. 2021 Apr 13;118(15)]). 다음으로, 균일 매니폴드 근사 및 투영(Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP)을 적용하여 데이터 세트를 서열 다양성의 2차원 표현으로 감소시켰다(McInnes, L., Healy, J.의 문헌[ArXiv e-prints 1802.03426, 2018]). 이러한 기술을 사용하여, 도메인 서열의 75개의 클러스터를 식별하였다.
STREME 알고리즘(Bailey, T.의 문헌[Bioinformatics. 2021 Mar 24;37(18):2834-2840])을 사용해 단백질 서열 모티프를 생성하여 강한 억제자가 풍부한 모티프를 식별하였다.
결과:
선택을 수행하여, 32,120개의 고유 서열의 라이브러리로부터 가장 강력한 전사 억제자인 도메인을 식별하였다. 선택 전과 후에 라이브러리에서 각 도메인의 풍부도에 있어서의 배수 변화를 각 바코드-도메인 쌍에 대해 계산하여, 2개의 독립적인 실험 복제물과 함께 각 도메인의 적합도에 대한 12개의 측정을 나타냈다.
도 54는 전체 라이브러리, 음성 대조군의 역할을 하는 무작위배열된 서열, Tycko 등에 의해 수행된 HT-동원 실험의 5일차에 log2(배수 변화)가 1보다 큰 것으로 나타난 KRAB 도메인의 양성 대조군 세트에 대한 log2(배수 변화) 값의 범위를 보여준다 (Cell. 2020 Dec 23;183(7):2020-2035). 도 54에 도시된 바와 같이, 디프테리아 독소 선택은 보다 강력한 전사 억제자인 도메인을 성공적으로 농축시켰다. 선택 후, 음성 대조군 서열을 라이브러리로부터 탈농축시켰다.
선택 후 라이브러리에서 재현 가능하게 농축된 도메인을 식별하기 위해, 0.01 미만의 p-값 임계치 및 2 초과의 log2(배수 변화) 임계치를 설정하였다. 1597개의 도메인이 이들 기준에 부합하였다. P-값은 순열 검정 및 다중 검정에 대한 거짓 발견율 조정을 사용하는 MAGeCK 알고리즘을 통해 계산하였다(Wei, L. 등의 문헌[Genome Biol. 2014;15(12):554]). 이들 상위 1597개의 억제자 도메인의 log2(배수 변화) 값은 도 54에 도시되어 있고, 아미노산 서열, p-값, 및 log2(배수 변화) 값은 아래 표 54에 제공되어 있다. 대조적으로, ZIM3의 log2(배수 변화)는 1.7787이었고, 표준 ZNF10의 log2(배수 변화)는 1.3637이었고, Tycko, J. 등의 문헌[Cell. 2020 Dec 23;183(7):2020-2035]에서 사용된 ZNF10 KRAB 도메인에 상응하는 대안적인 ZNF10의 log2(배수 변화)는 1.6182였다. 따라서, 1597개의 상위 억제자 도메인은 ZNF10 및 ZIM3보다 실질적으로 우월한 전사 억제자였다. 이들 상위 억제자 도메인 중 다수는, ZIM3 및 ZNF10과 비교했을 때 Trim28 단백질과의 상호작용을 안정화시킬 것으로 예측되는 잔기를 갖는 아미노산을 함유하였다(Stoll, G.A. 등의 문헌[bioRxiv 2022.03.17.484746]).
아미노산 서열 다양성의 범위를 유지하면서 억제자 도메인의 목록을 더 좁히기 위해, 표 54에 나타낸 바와 같이, 각 클러스터로부터 가장 효과적인 억제자 도메인을 선택함으로써 1597개 내에서 95개의 억제자 도메인의 세트를 선택하고, 1597개 중 상위 25개의 최상의 억제자도 선택하였다.
log2(배수 변화)가 가장 높은 억제자 도메인은 킹 코브라(Ophiophagus hannah)(도메인_26749; 서열번호 135)로부터 유래된 것이었다. 놀랍게도, 이 서열은 인간 KRAB 도메인으로부터 매우 벗어나 있어서(41%에 불과한 서열 동일성), 불량한 억제자 도메인의 서열 클러스터로 그룹화하였다.
선택에서 식별된 도메인이 독립적인 검정에서 전사 억제를 뒷받침한다는 것을 검증하기 위해, 상위 95개 및 1597개 억제자 도메인의 대표적인 구성원을 사용하여 dXR 작제물을 생성하고, B2M 유전자좌의 전사를 억제하는 이들의 능력을 시험하였다. 도 55에 도시된 바와 같이, 형질도입 후 7일차에, 시험된 대표적인 상위 95개 또는 1597개 억제자 도메인을 갖는 dXR 모두는, 하나를 제외하고, ZNF10 KRAB 도메인을 갖는 dXR이 억제한 것보다 더 큰 정도로 B2M을 억제하였다. 도 56에 도시된 바와 같이, 형질도입 후 10일차에, 시험된 대표적인 상위 95개 또는 1597개 억제자 도메인을 갖는 대부분의 dXR은 ZNF10 또는 ZIM3이 억제한 것보다 더 큰 정도로 B2M을 억제하였다. dXR에 의한 표적 유전자좌의 억제는 시간 경과에 따라 저하되는 경향이 있고, 형질도입 후 10일차에는 dXR 억제를 측정하기 위한 시점이 비교적 늦어지는 것으로 여겨진다. 따라서, 상위 95개 및 1597개에 속하는 억제자 도메인을 갖는 dXR 작제물 중 다수는, 형질도입 후 늦게는 10일차에, ZNF10 또는 ZIM3 유래의 KRAB 도메인을 갖는 dXR보다 더 큰 정도로 B2M을 억제할 수 있었다는 것이 특히 주목할 만하다.
식별된 억제자 도메인의 우월한 전사 억제 능력의 근거를 더 이해하기 위해, STREME 알고리즘을 사용해 상위 1597개 억제자 도메인으로부터 단백질 서열 모티프를 식별하였다. 구체적으로, 상위 1597개 억제자 도메인의 아미노산 서열을 p-값이 0.01 미만이고 log2(배수 변화) 값이 0 미만인 1506개 억제자 도메인의 음성 트레이닝 세트와 비교함으로써 5개의 모티프(모티프 1~5)를 생성하였다. 모티프 1~5의 로고는 도 57a, 57b, 57c, 57d, 및 57e에 제공되어 있다. 또한, 상위 1597개 억제자 도메인을 1597개의 억제자 도메인 서열로부터 유래된 셔플링된 서열과 비교함으로써 4개의 모티프(모티프 6~9)를 생성하였다. 모티프 6~9의 로고는 도 57f, 57g, 57h, 및 57i에 제공되어 있다.
아래 표 55는 STREME에 의해 계산했을 때, 9개의 모티프 각각에 대한 p-값, E-값(통계적 유의성의 척도), 및 상위 1597개 억제자 도메인에서 모티프가 일치하는 서열의 수 및 백분율을 제공한다. 표 56은 각 모티프의 서열을 제공한 것으로서, 모티프 내의 각 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 보여준다.
| 모티프 ID | P-값 | E-값 | 상위 1597개의 억제자 도메인에서 모티프가 일치하는 부위의 수 및 백분율 |
| 음성 훈련 세트 대비 생성된 모티프 | |||
| 1 | 3.7e-014 | 7.1e-013 | 1158 (72.5%) |
| 2 | 3.4e-012 | 6.4e-011 | 978 (61.2%) |
| 3 | 7.5e-010 | 1.4e-008 | 1017 (63.7%) |
| 4 | 7.0e-008 | 1.3e-006 | 987 (61.8%) |
| 5 | 1.7e-007 | 3.3e-006 | 678 (42.5%) |
| 셔플링된 서열 대비 생성된 모티프 | |||
| 6 | 1.2e-048 | 1.5e-047 | 1597 (100.0%) |
| 7 | 1.2e-048 | 1.5e-047 | 1597 (100.0%) |
| 8 | 1.3e-042 | 1.6e-041 | 1377 (86.2%) |
| 9 | 2.1e-040 | 2.7e-039 | 1483 (92.9%) |
특히, 모티프 6 및 7은 상위 1597개 억제자 도메인의 100%에 존재하였다. 모티프 6 내의 고도로 보존된 위치 중 다수(예를 들어 아미노산 잔기 L1, Y2, V5, M6, 및 E8)는 Trim28(Kap1로도 알려짐)과 계면을 형성하는 것으로 알려져 있는데, 이는 전사 억제 기계를 유전자좌에 동원하는 것을 담당한다. 유사하게, 모티프 7 내의 잔기(D3, V4, E11, E12)는 모두 Trim28 동원에 기여한다. 상위 억제가 도메인에서 농축된 것으로 식별된 많은 아미노산 잔기가 Trim28 동원을 강화하는 것으로 여겨진다. 특히, 이들 잔기 중 일부는 일반적으로 사용되는 KRAB 도메인에서 부재한다. 구체적으로, 모티프 6과 일치하는 ZNF10 내 부위에서, 제1 위치에 있는 잔기는 류신 대신에 발린이다. 모티프 7과 일치하는 ZIM3 내 부위에서, 위치 11에 있는 잔기는 글루탐산 대신에 글리신이다. 모든 KRAB 도메인에 존재하지는 않는 전술한 다른 모티프 중 다수는 KRAB 도메인에 대한 상동성을 갖는 억제자 도메인의 서열 클러스터에 특이적인 추가적이고 신규한 억제 메커니즘을 나타낼 수 있다.
종합하면, 본원에 기술된 실험은 dXR 분자의 맥락에서 전사 억제를 촉진하는 데 효과적인 일단의 비인간 전사 억제자 도메인을 식별하였다. 이들 도메인은 ZNF10 및 ZIM3보다 더 큰 정도로 전사를 억제하였다. 마지막으로, 가장 강한 전사 억제자인 도메인과 연관된 단백질 서열 모티프를 식별하였다.
실시예 18: 상위 95개의 KRAB 도메인의 구성원은 LTRP5 활성을 증가시킨다
실시예 17에 기술된 바와 같이, dXR 작제물의 맥락에서 억제를 향상시킨 비인간 억제자 도메인을 식별하였다. 여기서, 실시예 17에서 식별된 향상된 억제자 도메인도 LTRP5의 맥락에서 우월한 전사 억제자인지 여부를 시험하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
실시예 17에서 식별되었고 상위 95개의 억제자의 구성원인 것으로 결정된 대표적인 억제자 도메인(표 65)을 DNMT3A ADD 도메인이 없는 LTRP5 작제물 내로 클로닝하였다(도 1). SV40 NLS가 억제자 도메인의 하류에 존재하는 것을 제외하고는, 실시예 13에 기술된 바와 같이 LTRP5 작제물을 작제하였다(표 45). ZIM3 KRAB 도메인을 갖는 LTRP5 분자를 대조군으로서 사용하였다. 별도의 플라스미드를 사용하여 B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.165(UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU; 서열번호 3114)를 갖는 가이드 스캐폴드 316(서열번호 1746)을 암호화하였다. 추가 대조군은 ZIM3 KRAB 도메인을 포함하고 스캐폴드 316 및 스페이서 7.165를 갖는 gRNA를 포함하는 dXR 분자, 및 ZIM3 KRAB를 포함하고 비표적화 gRNA를 포함하는 LTRP5 및 dXR 분자를 포함하였다. 스페이서 7.165를 선택한 이유는, 스페이서 7.165가 비교적 비효율적인 스페이서로서 알려져 있고, 따라서 시험된 다양한 LTRP 분자 간의 차이를 구별하기 위한 검정의 동적 범위를 증가시키게 될 것이기 때문이다.
LTRP 작제물을 암호화하는 플라스미드 및 gRNA를 암호화하는 플라스미드 각각의 50 ng으로 세포를 형질감염시킨 것을 제외하고는, 실시예 14에 기술된 바와 같이 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 실시예 13에 기술된 바와 같이, HLA 면역염색을 통해 B2M 단백질 발현을 분석함으로써 억제 분석을 수행하고, 이어서 유세포 계측을 수행하였다. 95개의 상위 억제자 도메인 중 72개를 한 번의 실업에서 함께 평가하였는데, 여기서 B2M 발현은 형질감염 후 7, 14, 19, 및 26일차에 측정하였고, 데이터는 표 57~60에 나타나 있다. 두 번째 실험에서 평가된 나머지 24개의 억제 도메인의 경우, 형질감염 후 6, 13, 20, 및 27일차에 B2M 발현을 측정하였고, 데이터는 표 61~64에 나타나 있다. B2M-표적화 스페이서 7.37(서열번호 3137)과 쌍을 형성한 촉매적으로 활성인 CasX 491을 암호화하는 작제물도 대조군으로서 포함시켰다.
결과:
B2M 검정의 결과가 아래 표 57~64에 제공되어 있다.
표 57~64에 나타낸 바와 같이, 스페이서 7.165를 함유하는 gRNA와 쌍을 형성한 향상된 억제자 도메인을 함유하는 대부분의 LTRP5 작제물을 이용한 치료는 LTRP5-ZIM3 작제물을 사용하여 달성한 억제 수준에 비해 더 높은 수준의 B2M 억제를 초래하였다. 이들 실험으로부터의 데이터는 다음 기준을 사용하여 상위 9개의 후보 억제자 도메인을 식별하는 데 사용하였다. 먼저, B2M 녹다운에 의해 측정했을 때, 상기 실험에서의 4개의 시점 모두에 LTRP5-ZIM3 대조군에 의해 나타난 평균 억제 활성에 비해 적어도 20% 평균 억제 활성 증가가 입증된 3개의 억제자 도메인을 선택하였다. 더 많은 후보 억제자 도메인을 식별하기 위해, 적어도 2개의 시점에 LTRP5-ZIM3 대조군에 의해 나타난 것보다 적어도 20%의 평균 활성 증가를 나타낸 도메인(나중 시점에 우선순위를 부여함); 및 셋째, 75개의 클러스터(실시예 17에서 논의됨) 각각으로부터 아미노산 서열의 다양성을 유지하는 능력이 가장 뛰어난 도메인을 선택하고, 이전에 식별된 인간 억제자 도메인과의 서열 동일성이 >90%인 도메인을 제거하였다(Tycko, J. 등의 문헌[High-Throughput Discovery and Characterization of Human Transcriptional Effectors Cell. 183(7):2020-2035 (2020)]). 식별된 9개의 가장 효과적인 억제 도메인은 도메인_7694, 도메인_10123, 도메인_15507, 도메인_17905, 도메인_20505, 도메인_26749, 도메인_27604, 도메인_29304, 및 도메인_30173이었고, 이들의 서열은 표 65에 열거되어 있다.
따라서, 본원에 기술된 실험은 실시예 17에서 식별된 향상된 억제자 도메인이 LTRP 작제물의 맥락에서 전사 억제 수준을 개선하였음을 입증한다.
실시예 19: 향상된 억제자 도메인의 대안적인 컨센서스 단백질 서열 모티프의 식별
이전 실시예 17에서, 9개의 단백질 서열 모티프(도 57a~57i)를 다음의 방법을 사용하여 상위 1597개의 강화된 억제자 도메인에 대해 생성하였다: 1) 상위 1597개의 억제자 도메인의 아미노산 서열을 p-값이 0.01 미만이고 log2(배수 변화) 값이 0 미만인 1506개의 억제자 도메인의 음성 트레이닝 세트와 비교하는 방법; 및 2) 상위 1597개의 도메인의 아미노산 서열을 1597개의 서열로부터 유래된 셔플링된 서열과 비교하는 방법. 본 실시예에서, 상위 1597개의 억제자 도메인의 아미노산 서열을 인간 ZIM3(서열번호 128) 및 ZNF10 KRAB 도메인(서열번호 129)의 아미노산 서열을 함유하는 음성 트레이닝 세트와 비교함으로써 5개의 보다 대안적인 컨센서스 단백질 서열 모티프를 생성하였다. 이들 생성된 5개의 모티프의 로고는 도 58a~58e에 도시되어 있다. 아래 표 66은 STREME에 의해 계산했을 때, 상위 1597개 억제자 도메인에서 모티프가 일치하는 서열의 조정되지 않은 p-값과 수 및 백분율을 5개의 대안적인 모티프 각각에 대해 제공한다. 표 67은 각 모티프의 서열을 제공한 것으로서, 모티프 내의 각 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 보여준다.
| 대안적인 모티프 ID | 조정되지 않은 P-값 | 1597개의 향상된 도메인에서 모티프가 일치하는 부위의 수 및 백분율 |
| 1 | 1.7E-001 | 1432 (89.7%) |
| 2 | 2.1E-001 | 1236 (77.4%) |
| 3 | 2.7E-001 | 1058 (66.2%) |
| 4 | 4.2E-001 | 1554 (97.3%) |
| 5 | 4.3E-001 | 679 (42.5%) |
| 모티프 ID | 모티프 내 위치 | 모티프에서 5% 넘게 나타난 아미노산 잔기 |
| 1 | 1 | D |
| 2 | V | |
| 3 | A | |
| 4 | V | |
| 5 | Y | |
| 6 | F | |
| 7 | S | |
| 8 | P | |
| 9 | E | |
| 10 | E | |
| 11 | W | |
| 12 | G | |
| 13 | C | |
| 14 | L | |
| 2 | 1 | A, D, G, N, R, S |
| 2 | P, S, T | |
| 3 | A, S, T | |
| 4 | Q | |
| 5 | K, R | |
| 6 | A, D, K, N, S, T | |
| 7 | L | |
| 8 | Y | |
| 3 | 1 | A, P, S |
| 2 | K | |
| 3 | P | |
| 4 | A, D, E | |
| 5 | L, M, V | |
| 6 | I, V | |
| 7 | F, S, T | |
| 8 | H, K L, Q, R, W | |
| 4 | 1 | L |
| 2 | E | |
| 3 | E, K, Q, R | |
| 4 | E, G, R | |
| 5 | A, D, E, K | |
| 6 | A, D, E | |
| 7 | L, P | |
| 8 | C, W | |
| 5 | 1 | D, E |
| 2 | V | |
| 3 | M | |
| 4 | L | |
| 5 | E | |
| 6 | N, T | |
| 7 | Y | |
| 8 | A, E, G, Q, R, S | |
| 9 | H, N | |
| 10 | L, M, V | |
| 11 | A, L, V | |
| 12 | S | |
| 13 | L, V | |
| 14 | A, G, V | |
| 15 | C, F, L |
본 실시예에 기술된 바와 같이 사용된 방법은 실시예 17에서 가장 강한 전사 억제자로서 식별된 1597개의 억제자 도메인과 연관된 대안적인 모티프를 생성하였다. 특히, 대안적인 모티프 1, 2, 3, 및 5는 ZIM3 또는 ZNF10에서 발견되지 않았고, 대신에 1597개의 상위 억제자 도메인의 대부분에서 고유하게 발견되었다. 또한, 대안적인 모티프 1의 모든 아미노산 위치는 고도로 보존되는 것으로 나타났고 1597개 도메인의 거의 90%에서 발견되었으며; 이 서열은 전사 및 후성적 억제에 관여하는 Trim28 및 하류 인자의 동원을 매개하는 데 중요한 것으로 여겨진다. 식별된 다른 대안적인 컨센서스 모티프의 경우, 이들 모티프는 억제자 도메인의 특정 클러스터에 특이적인 추가적이고 신규한 억제 메커니즘을 나타낼 수 있다.
실시예 20: LTRP 분자에 의해 매개되는 표적 유전자좌의 침묵화는 DNMT1 억제제를 사용했을 때 가역적임을 입증
LTRP 분자에 의해 매개된 표적 유전자좌의 지속적인 억제가 가역적이어서, DNMT1 억제제로 치료했을 때 메틸 마크가 제거되어 표적 유전자의 발현이 재활성화된다는 것을 입증하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
실시예 13에 기술된 바와 같이 생성된, ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP #5, 및 CasX 변이체 491을 본 실험에 사용하였다. 스페이서 7.37(서열번호 3137)을 함유하는 스캐폴드 174를 갖는 B2M-표적화 gRNA 또는 스페이서 0.0(서열번호 3232)을 함유하는 비표적화 gRNA를 본 실험에 사용하였다.
HEK293T 세포의 형질감염:
HEK293T 세포를, CasX 491 또는 ZIM3-KRAB 도메인을 함유하는 LTRP #5 중 어느 하나를 암호화하고 B2M-표적화 gRNA 또는 비-표적화 gRNA를 갖는 작제물을 함유하는 100 ng의 플라스미드로 형질감염시키고 58일 동안 배양하였다. 이어서, 이들 형질감염시킨 HEK293T 세포를 96-웰 플레이트의 약 30,000개의 세포/웰로 재시딩하고, 0 μM 내지 20 μM 농도 범위의 DNMT1 억제제, 5-아자-2′-데옥시시티딘(5-azadC)으로 치료하였다. 5-azadC로 치료한 후 6일차에, 형질감염 후 5일차, 12일차, 및 21일차의 B2M 침묵화 분석을 위해 세포를 수확하였다. 간략하게, 실시예 13에 기술된 바와 같이, HLA 면역 염색에 이어서 유세포 계측을 통해 B2M 단백질 발현을 분석하여 억제 분석을 수행하였다. 각 실험 조건별로 5-azadC의 각 투여량별 치료는 3회 수행하였다.
결과:
도 59의 도표는 표시된 농도의 5-azadC로 치료한 형질감염된 HEK293T 세포 중 B2M 단백질을 발현한 세포의 백분율을 보여준다. 데이터는 B2M-표적화 gRNA를 가진 LTRP5-ZIM3을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 세포를 5-azadC로 치료했을 때 B2M 유전자가 재활성화되었음을 입증한다(도 59). 구체적으로, 0 μM 농도의 5-azadC로 치료한 세포의 25%가 B2M 발현을 나타낸 것과 비교해, 20 μM 농도의 5-azadC로 치료한 세포의 약 75%가 B2M 발현을 나타냈다(도 59). 또한, B2M-표적화 gRNA를 갖는 CasX 491을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 세포를 5-azadC로 치료했을 때는 B2M 유전자의 재활성화가 나타나지 않았다. 도 60은 5-azadC로 치료한 후의 B2M 억제 활성과 유전자 재활성화를 병치시킨 도표이다. 데이터는 B2M-표적화 gRNA를 갖는 CasX 491 또는 LTRP5-ZIM3으로 형질감염시킨 후의 B2M 억제를 보여주는데, 58일차까지 B2M 발현의 약 75%가 억제되지만, 5-azadC로 치료한 후 B2M 발현이 증가함을 보여준다(도 60). 예상대로, 비표적화 gRNA를 갖는 CasX 491 또는 LTRP5-ZIM3으로 형질감염시킨 세포를 5-azadC로 치료했을 때는 억제 또는 재활성화가 나타나지 않았다(도 59~60).
실험은 표적 유전자좌의 LTRP 매개 억제의 가역성을 입증한다. DNMT1 억제제를 사용하여 LTRP 분자에 의해 구현된 메틸 마크를 제거함으로써, 침묵화된 표적 유전자가 재활성화되어 표적 단백질의 발현을 유도하였다.
실시예 21: LTRP 융합 단백질의 예시적인 서열
표 68은 ADD 도메인(도 2)을 갖고 인간 ZIM3 또는 ZNF10 KRAB 도메인 또는 다음의 상위 9개의 가장 효과적인 억제자 도메인 중 하나를 갖는 구성 1, 4, 또는 5의 예시적인 LTRP 융합 단백질을 제공한다: 도메인_7694, 도메인_10123, 도메인_15507, 도메인_17905, 도메인_20505, 도메인_26749, 도메인_27604, 도메인_29304, 및 도메인_30173. 표 68에서, 성분은 N-말단에서 C-말단 방향으로 순서대로 열거되어 있다.
표 69는 LTRP 작제물의 성분의 예시적인 아미노산 서열을 제공한다. 표 69에서, 단백질 도메인은 출발 메티오닌 없이 도시되어 있다.
| 성분 | 아미노산 서열번호 |
| DNMT3A 촉매 도메인(CD) | 126 |
| DNMT3L 상호작용 도메인 | 127 |
| dCasX491 | 4 |
| 링커 1 (L1) | 123 |
| 링커 2 (L2) | 122 |
| 링커 3A (L3A) | 124 |
| 링커 3B (L3B) | 120 |
| NLS | 30 |
| DNMT3A ADD 도메인 | 125 |
실시예 22: 시험관 내에서 PCSK9 유전자좌를 억제하여 PCSK9 분비를 감소시키기 위해 LTRP 분자 및 PCSK9-표적화 gRNA를 사용하는 것의 게놈 수준의 전사체학적 효과에 대한 예비 평가
인간 세포에서 PCSK9 유전자좌를 억제하고 PCSK9 분비 수준을 감소시키기 위해 표적화 gRNA와 함께 LTRP 분자를 사용하는 것의 효과를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 게놈 수준의 전사체학적 효과를 평가하여 LTRP5-ADD-ZIM3 및 선택 PCSK9-표적화 스페이서로 세포를 치료하는 것의 표적 외 효과의 정도를 결정하였다.
물질 및 방법:
인간 Huh7 세포의 형질감염:
다음 분자를 암호화하는 mRNA를 실시예 2에 기술된 것과 유사한 방법을 사용해 IVT에 의해 생성하였다: 1) 촉매적으로 활성인 CasX 676(실시예 5에 기술된 바와 같음), 2) dXR1(실시예 2에 기술된 바와 같음), 및 3) LTRP5-ADD-ZIM3(실시예 2에 기술된 바와 같음). CasX 676에 대한 DNA 및 mRNA 서열은 표 21 및 22에 나타나 있고; dXR1에 대한 DNA 및 mRNA 서열은 표 11 및 12에 나타나 있고; LTRP5-ADD-ZIM3에 대한 DNA 및 mRNA 서열은 표 18 및 19에 나타나 있다.
PCSK9 유전자좌를 표적화하는 선택 NHP-보존된 스페이서를 함유하는 gRNA를 gRNA 스캐폴드 316을 사용해 설계하고 (아래 실시예 7에 기술된 것과 같은) v1 변형 프로파일을 사용해 화학적으로 합성하였다. 실시예 3에서 입증된 바와 같이 적어도 36일차까지 PCSK9 억제를 지속하는 효능을 고려하여 선택된 이들 NHP-보존된 스페이서는 TG-06-154, TG-06-167, TG-06-133, TG-06-146, 및 TG-06-352였고, TG-06-138(서열번호에 대해서는 표 17 참조)은 dXR1뿐만 아니라 LTRP5-ADD-ZIM3과도 쌍을 형성하도록 사용되었고, 스페이서 TG-06-001(스페이서 6.1로도 알려짐; 서열번호 1834)은 CasX 676과 쌍을 형성하도록 사용되었다. 비표적화 스페이서를 실험 대조군으로서 사용하였다.
시딩된 Huh7 세포를 촉매적으로 활성인 CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA, 및 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 및 스캐폴드 316을 갖는 gRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 6일 및 26일차에 세포를 수확하고, 이어서 용해시키고 DNA/RNA 쉴드(Zymo Research)에 보관하였다. 추가 대조군으로서, 미치료 미노출 세포도 수확하였다. 수집된 샘플을 Quick-DNA/RNA Miniprep Plus 키트(Zymo Research)를 사용하여 gDNA/RNA 추출하였다. RNA 샘플을 총 RNA 시퀀싱(RNA-seq)에 사용하였는데, 이는 제3자에 의해 수행되었다. 원시 FASTQ 파일을 수신하고 FASTQC로 처리하고, 어댑터를 Trim Galore를 사용해 트리밍하였다. 그런 다음, 전사체 발현을 Salmon을 사용하여 hg38 게놈에 대해 정량화하여 각 유전자에 대한 정규화된 계수(백만 개당 전사체, 또는 TPM)를 생성하였다. 차등 발현 분석은 DESeq2를 사용하여 수행하였다. 모든 샘플에서 계수가 10 미만인 유전자를 분석에서 생략하고, 모든 쌍별 비교(예를 들어, 2개의 개별 시점에 미치료 조건과 치료 조건 사이의 차등 유전자 발현 분석)를 |log2FC| > 2의 유의 임계값으로 수행하고, p-값 < 0.001을 조정하였다.
결과:
CasX 676, dXR1, 또는 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA 및 PCSK9 표적화 gRNA로 Huh7 세포를 형질감염시키고, 형질감염 후 6일차 및 26일차에 RNA-seq 분석을 위해 수확하였다. 정규화된 PCSK9 리드 카운트의 정량화를 각 실험 조건별로 결정하고, 각 실험 조건과 미치료 미노출 조건을 비교하는 정규화된 PCSK9 전사체 계수의 log2 배수 변화를 계산하였다(표 70). RNA-seq 분석은 스페이서 TG-06-154, TG-06-167, 및 TG-06-133이 LTRP5-ADD-ZIM3과 쌍을 형성할 때 이를 사용하는 것이, 26일차까지 PCSK9 발현을 지속 가능하게 억제함을 보여주었다(표 70). 또한, LTRP5-ADD-ZIM3과 함께 비표적화 스페이서를 사용하는 것은 PCSK9 발현을 감소시키는 것으로 나타났지만, 이러한 억제 수준은 스페이서 TG-06-154, TG-06-167, 및 TG-06-133으로 달성된 억제 수준에 비해 높지 않았다. 예상대로, 스페이서 TG-06-138을 dXR1과 함께 사용했을 때 PCSK9 유전자좌가 일시적으로 침묵화되었지만, 예상 외로 CasX 676과 쌍을 형성한 스페이서 6.1을 사용했을 때 PCSK9 하향 조절은 26일차까지 약화되었다(표 70).
| 분자 | 스페이서 | PCSK9 리드 카운트의 Log2FC - 6일차 | PCSK9 리드 카운트의 Log2FC - 26일차 |
| CasX 676 | NT | 0.022 | -0.001 |
| CasX 676 | 6.1 | -1.826 | -0.818 |
| dXR1 | NT | 0.016 | 0.068 |
| dXR1 | TG-06-138 | -4.291 | -0.266 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | NT | -0.700 | -1.094 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-138 | -4.254 | -1.861 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-154 | -5.202 | -4.283 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-167 | -3.404 | -2.856 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-133 | -3.342 | -2.773 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-146 | -3.709 | -1.755 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-352 | -3.330 | -1.981 |
치료 후 6일차 및 26일차에 검출된 상향조절된 유전자의 수와 하향조절된 유전자의 수를 결정하기 위해 각각의 실험 조건을 미치료 미노출 대조군과 비교함으로써 차등 유전자 발현 분석을 수행하였다. 차등 발현된 유전자의 정량화는 표 71에 나타나 있다. 비표적화 스페이서를 갖는 LTRP5-ADD-ZIM3, 스페이서 TG-06-154를 갖는 LTRP5-ADD-ZIM3, 및 스페이서 TG-06-133을 갖는 LTRP5-ADD-ZIM3에 대한 차등 유전자 발현 분석을 도시한 대표적인 화산 도표가 도 65a~65b, 66a~66b, 및 67a~67b에 각각 도시되어 있다. TG-06-154, TG-06-133, 및 TG-06-167은 26일차까지 PCSK9 발현을 억제하는 이들의 능력에 기초하여 선택되었다. 데이터는, 이들 3개의 PCSK9-표적화 스페이서를 LTRP5-ADD-ZIM3과 함께 평가했을 때, 스페이서 TG-06-133을 사용한 경우에 차등 조절된 표적 외 유전자의 수가 가장 낮았음을 입증한다. 한편, 스페이서 TG-06-154 또는 TG-06-167을 사용한 경우, 특히 형질감염 후 26일차 이후 시점에, 차등 조절된 표적 외 유전자의 수가 더 많았다(표 71). 또한, dXR1 및 스페이서 TG-06-138을 사용한 경우의 일시적인 억제는 26일차까지 전사체학적 변화가 아주 적었다.
| 분자 | 스페이서 | 차등 발현된 유전자 수(표적 외) - 6일차 | 차등 발현된 유전자 수(표적 외) - 26일차 | ||
| 하향조절됨 | 상향조절됨 | 하향조절됨 | 상향조절됨 | ||
| CasX 676 | NT | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CasX 676 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| dXR1 | NT | 0 | 0 | 0 | 0 |
| dXR1 | TG-06-138 | 3 | 14 | 0 | 1 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | NT | 0 | 0 | 9 | 35 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-138 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-154 | 2 | 0 | 6 | 10 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-167 | 2 | 0 | 18 | 21 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-133 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-146 | 1 | 7 | 0 | 0 |
| LTRP5-ADD-ZIM3 | TG-06-352 | 2 | 1 | 0 | 0 |
이들 실험은 LTRP 분자 및 PCSK9-표적화 gRNA를 사용하는 것이 인간 세포에서 PCSK9 유전자좌를 억제하는 데 미치는 게놈 수준의 전사체학적 효과에 대한 예비 분석을 보여준다. 이들 실험으로부터의 데이터는 이러한 게놈 수준의 전사체학적 효과를 분석하는 것이 PCSK9 유전자좌를 표적화하기 위한 후보 스페이서의 식별에 도움이 될 것임을 보여준다.
실시예 23: LTRP5-ADD 분자와 쌍을 형성할 때, 인간 간세포에서 달성하는 데 있어서
PCSK9
스페이서의 평가
ADD 도메인을 함유하는 구성 #5의 LTRP 분자(LTRP5; 도 2에 도시되어 있음)와 쌍을 형성할 때, TTC 인식 모티프를 갖는 PCSK9-표적화 스페이서를 전반적으로 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 간략하게, 인간 PCSK9 유전자좌의 지속적인 억제를 유도하여 PCSK9 분비를 실질적으로 감소시키는 스페이서를 평가하기 위한 시험관 내 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
실시예 3에 기술된 바와 같이 연산 스크리닝을 수행하여 후속 실험 평가를 위한 69개의 TTC 스페이서를 식별하였다. 이들 69개의 TTC 스페이서 중, 61개의 스페이서를 후속 방법에 기술된 바와 같이 세포 기반 검정을 사용하여 추가로 시험관 내 스크리닝하였다. 61개의 스페이서에 추가하여, 실시예 3에 기술된 것과 유사하지만 하나의 기준(>0.05의 마이너 대립유전자 빈도(MAF)를 갖는 SNP와 중첩된 TTC 스페이서는 제외함)을 추가한 방법을 사용하여, 독립적인 연산 스크리닝에서 4개의 스페이서를 추가로 식별하였다. 따라서, 총 65개의 스페이서를 대상으로 후속 방법에 기술된 세포 기반 검정을 사용하여 시험관 내 실험을 수행하였다. 본 실험에서 시험된 65개의 PCSK9-표적화 스페이서 중 61개는 표 72에 열거되어 있고, 상응하는 서열번호는 표 17에 열거되어 있다. 독립적으로 식별된 4개의 추가 스페이서는 표 73에 나타나 있다.
| 스페이서 ID | 스페이서 RNA 서열 | 서열번호 |
| TG-06-126 | CCUUUUCAUCCUCCUGCCUG | 2672 |
| TG-06-129 | UUUUACACACCAUGUUCAAG | 2675 |
| TG-06-148 | GCCGGGCCCACCUUUUCAGU | 2694 |
| TG-06-1046 | UCUCUUACAUGGGGGGAAAC | 2714 |
65개의 PCSK9-표적화 스페이서에 대한 PCSK9 분비 수준의 평가:
LTRP5-ADD-ZIM3 분자를 암호화하는 mRNA를 실시예 2에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 IVT에 의해 생성하였다. LTRP5-ADD-ZIM3에 대한 DNA 및 mRNA 서열은 표 18 및 표 19에 나타나 있다.
65개의 PCSK9-표적화 스페이서(표 72~73) 각각을 함유하는 gRNA를 gRNA 스캐폴드 316을 사용하여 설계하고, v1 변형 프로파일(실시예 7에 기술된 바와 같음)을 사용해 화학적으로 합성하였다. 또한, 비표적화 gRNA를 비표적화 대조군으로서 사용하였다.
PCSK9 분비를 평가하기 위해, 리포펙타민 3000을 사용해, 시딩된 Huh7 세포를 LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA, 및 PCSK9 유전자좌를 표적화하는 스페이서 및 스캐폴드 316을 갖는 gRNA로 형질감염시켰다. mRNA 대 gRNA의 질량비가 2:1인 2회 투여량의 총 RNA 투입물을 스크리닝에 사용하였다: 50 ng mRNA:25 ng gRNA 및 25 ng mRNA:12.5 ng gRNA. 형질감염 후 6일차에 배지 상청액을 수확하고 PCSK9 분비 수준을 ELISA에 의한 평가하였다(표 74). PCSK9 분비 수준을 총 세포 수에 대해 정규화하였다. 추가 대조군으로서의 PCSK9 분비를, mScarlet을 암호화하는 mRNA로 형질감염시킨 세포로부터 수확한 배지에서 측정하였다.
형질감염 후 13, 20, 및 27일차에 배지 상청액을 추가로 샘플링하고, PCSK9 분비 수준을 전술한 바와 같이 ELISA에 의해 측정한다.
결과:
LTRP5-ADD-ZIM3을 암호화하는 mRNA 및 PCSK9-표적화 gRNA로 형질감염시킨 Huh7 세포의 경우, 6일차 시점의 PCSK9 분비 수준은 표 74에 나타나 있다. 구체적으로, 표 74는 스페이서 각각을 갖는 gRNA 형질감염시킨 세포에서 분비된 PCSK9의 수준(ng/mL), 비표적화 gRNA로 형질감염시킨 대조군 대비 PCSK9 분비의 감소율, 및 PCSK9 전사 시작 부위(TSS)까지 각각의 표적화 서열의 거리(염기쌍 단위)를 제공한다. 각각의 스페이서에 대한 각각의 투여량에 따른 PCSK9 분비의 평균 감소율도 제공되어 있으며, 2개의 투여량을 평균화했을 때, PCSK9 분비를 50% 넘게 감소시킨 작제물 중의 스페이서는 표에서 굵은 글씨체로 표시되어 있다.
| 스페이서 ID | TSS까지의 거리 (bp) |
50 ng mRNA:
25 ng gRNA |
25 ng mRNA:
12.5 ng gRNA |
PCSK9 분비의 평균 감소율 | ||
|
분비된 PCSK9
(ng/mL) |
PCSK9 분비의 감소율 |
분비된 PCSK9
(ng/mL) |
PCSK9 분비의 감소율 | |||
| TG-06-342 | -1086 | 51.55 | 37.34 | 75.23 | 5.6 | 15.87 |
| TG-06-117 | -917 | 68.98 | 16.16 | 98.05 | 37.62 | 10.73 |
| TG-06-118 | -860 | 35.5 | 56.86 | 54.78 | 23.11 | 39.99 |
| TG-06-119 | -858 | 70.37 | 14.47 | 84.54 | 18.66 | 2.1 |
| TG-06-120 | -843 | 21.43 | 73.95 | 47.97 | 32.67 | 53.31 |
| TG-06-122 | -800 | 79.36 | 3.54 | 86.06 | 20.79 | 8.63 |
| TG-06-123 | -789 | 30.49 | 62.95 | 51.32 | 27.97 | 45.46 |
| TG-06-121 | -787 | 28.33 | 65.57 | 37.13 | 47.89 | 56.73 |
| TG-06-124 | -786 | 16.54 | 79.9 | 30.59 | 57.06 | 68.48 |
| TG-06-125 | -767 | 24.93 | 69.7 | 46.11 | 35.28 | 52.49 |
| TG-06-126 | -707 | 23.48 | 71.46 | 44.82 | 37.09 | 54.27 |
| TG-06-127 | -699 | 22.57 | 72.56 | 49.1 | 31.08 | 51.82 |
| TG-06-128 | -664 | 42.21 | 48.7 | 62.29 | 12.57 | 30.63 |
| TG-06-129 | -646 | 59.93 | 27.16 | 90.82 | 27.47 | 0.16 |
| TG-06-131 | -644 | 28.4 | 65.48 | 57.89 | 18.74 | 42.11 |
| TG-06-132 | -621 | 56.68 | 31.11 | 75.01 | 5.29 | 12.91 |
| TG-06-135 | -601 | 25.66 | 68.82 | 44.59 | 37.42 | 53.12 |
| TG-06-133 | -596 | 29.45 | 64.21 | 42.13 | 40.86 | 52.53 |
| TG-06-134 | -589 | 43.79 | 46.77 | 57.45 | 19.37 | 33.07 |
| TG-06-138 | -527 | 18.99 | 76.92 | 30.87 | 56.67 | 66.79 |
| TG-06-139 | -463 | 15.03 | 81.73 | 25.45 | 64.28 | 73.01 |
| TG-06-140 | -408 | 61.68 | 25.04 | 59.94 | 15.87 | 20.45 |
| TG-06-141 | -383 | 13.86 | 83.16 | 12.58 | 82.34 | 82.75 |
| TG-06-142 | -379 | 30.87 | 62.48 | 27.27 | 61.73 | 62.1 |
| TG-06-144 | -351 | 23.42 | 71.53 | 29 | 59.29 | 65.41 |
| TG-06-143 | -337 | 38.69 | 52.97 | 22.33 | 68.66 | 60.81 |
| TG-06-146 | -316 | 40.84 | 50.36 | 20.34 | 71.45 | 60.9 |
| TG-06-145 | -299 | 15.8 | 80.8 | 18.54 | 73.98 | 77.39 |
| TG-06-147 | -291 | 53.6 | 34.85 | 37.43 | 47.46 | 41.15 |
| TG-06-148 | -273 | 71.46 | 13.15 | 44.77 | 37.16 | 25.15 |
| TG-06-149 | -177 | 21.18 | 74.26 | 38.33 | 46.21 | 60.23 |
| TG-06-150 | -148 | 18.33 | 77.73 | 39.59 | 44.42 | 61.08 |
| TG-06-151 | -145 | 53.44 | 35.05 | 66.42 | 6.77 | 20.91 |
| TG-06-152 | -126 | 36.95 | 55.09 | 57.43 | 19.39 | 37.24 |
| TG-06-153 | -76 | 73.23 | 10.99 | 86.58 | 21.52 | 5.27 |
| TG-06-154 | -13 | 6.87 | 91.65 | 24.48 | 65.64 | 78.64 |
| TG-06-155 | 18 | 29.45 | 64.21 | 56.36 | 20.89 | 42.55 |
| TG-06-157 | 70 | 12.32 | 85.03 | 32.4 | 54.53 | 69.78 |
| TG-06-159 | 169 | 53.15 | 35.4 | 80.84 | 13.47 | 10.97 |
| TG-06-158 | 175 | 9.39 | 88.59 | 31.72 | 55.48 | 72.03 |
| TG-06-160 | 182 | 20.63 | 74.93 | 48.67 | 31.69 | 53.31 |
| TG-06-161 | 204 | 29.55 | 64.08 | 53.16 | 25.38 | 44.73 |
| TG-06-004 | 448 | 54.83 | 33.35 | 73.05 | 2.54 | 15.41 |
| TG-06-001 | 451 | 18.21 | 77.86 | 32.86 | 53.88 | 65.87 |
| TG-06-005 | 464 | 67.08 | 18.47 | 76.37 | 7.19 | 5.64 |
| TG-06-002 | 503 | 81.95 | 0.4 | 83.15 | 16.71 | 8.16 |
| TG-06-1046 | 592 | 78.9 | 4.1 | 76.27 | 7.05 | 1.48 |
| TG-06-343 | 598 | 62.8 | 23.67 | 75.55 | 6.04 | 8.82 |
| TG-06-167 | 751 | 39.55 | 51.93 | 66.61 | 6.51 | 29.22 |
| TG-06-168 | 768 | 19.1 | 76.78 | 50.96 | 28.47 | 52.62 |
| TG-06-169 | 781 | 66.39 | 19.3 | 62.55 | 12.2 | 15.75 |
| TG-06-170 | 786 | 64.19 | 21.98 | 72.96 | 2.41 | 9.79 |
| TG-06-344 | 851 | 82.29 | 0.01 | 76.43 | 7.28 | 3.64 |
| TG-06-345 | 859 | 81.22 | 1.28 | 85.68 | 20.26 | 9.49 |
| TG-06-346 | 861 | 77.02 | 6.39 | 81.63 | 14.58 | 4.09 |
| TG-06-347 | 869 | 26.55 | 67.73 | 51.83 | 27.24 | 47.49 |
| TG-06-348 | 878 | 23.14 | 71.88 | 35.55 | 50.1 | 60.99 |
| TG-06-171 | 889 | 52.41 | 36.3 | 55.95 | 21.46 | 28.88 |
| TG-06-349 | 908 | 91.34 | 11.02 | 87.55 | 22.89 | 16.95 |
| TG-06-249 | 949 | 87.36 | 6.18 | 82.36 | 15.61 | 10.89 |
| TG-06-250 | 959 | 86.92 | 5.64 | 80.42 | 12.87 | 9.26 |
| TG-06-251 | 985 | 36.8 | 55.28 | 44.62 | 37.37 | 46.32 |
| TG-06-350 | 1063 | 71.25 | 13.4 | 67.87 | 4.74 | 9.07 |
| TG-06-351 | 1074 | 56.34 | 31.52 | 62.93 | 11.67 | 21.6 |
| TG-06-172 | 1097 | 44.44 | 45.99 | 59.31 | 16.75 | 31.37 |
| 비표적화 | - | 82.28 | 0 | 71.24 | 0 | 0 |
| mScarlet mRNA | - | 84.85 | 3.12 | - | - | - |
| *데이터는 소숫점 2자리에 가장 가깝게 반올림하여 표시됨. | ||||||
표 74에 제시된 데이터는 시험된 스페이서의 대부분을 갖는 작제물이 형질감염 후 6일차에 분비된 PCSK9의 수준을 감소시켰음을 보여준다. 스페이서는 TSS로부터 상류로 1086개의 염기쌍 내지 하류로 1097개의 염기쌍 범위의 영역에서 PCSK9 유전자좌에 상보적이었고, 시험된 영역 전체에 걸쳐 효과적인 스페이서가 발견되었으며, 가장 효과적인 스페이서 중 다수는 TSS와 TSS로부터 상류로 대략 500개의 염기쌍 사이에서 군집화된다.
TG-06-141 스페이서를 갖는 작제물은 6일 시점에 전체적으로 가장 효과적이었으며, 분비된 PCSK9 수준을 평균 82.75% 감소시켰다. 스페이서 TG-06-154, TG-06-145, TG-06-139, TG-06-158, TG-06-157, TG-06-124, TG-06-138, TG-06-001, 및 TG-06-144를 갖는 작제물도 매우 효과적이었으며, 각각은 분비된 PCSK9 수준을 평균 65% 넘게 감소시켰다.
더 긴 기간에 걸쳐 PCSK9 억제 및 분비된 PCSK9 수준의 감소를 뒷받침하는 스페이서를 식별하기 위해 형질감염 후 13, 20, 및 27일차의 시점을 추가로 평가한다.
이들 결과는 ADD 도메인을 갖는 LTRP 분자를 암호화하는 mRNA를 적절한 표적화 gRNA와 함께 전달하는 것이 PCSK9 유전자좌를 억제하여 세포 기반 검정에서 PCSK9 분비를 감소시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 24: CpG-감소된 또는 고갈된 gRNA 스캐폴드를 사용하는 것이 CasX-매개 편집 활성에 미치는 효과에 대한 추가 평가
상기 실시예 12에서 논의된 바와 같이, 메틸화되지 않은 CpG 모티프는 원하지 않는 면역 활성화를 강력하게 유발하는 PAMP로서 작용한다. 따라서, 가이드 스캐폴드 변이체 235 및 316을 암호화하는 작제물을 포함하여, AAV 작제물에서 고유 CpG 모티프를 대체하기 위한 뉴클레오티드 치환을 설계하고 생성하였다. 여기서, 이들 생성된 CpG-감소된 또는 고갈된 gRNA 스캐폴드의 사용이 CasX-매개 편집 활성에 미치는 효과를 추가로 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
물질 및 방법:
CpG-감소된 또는 고갈된 스캐폴드 320~341를 후술하는 3개의 시험관 내 실험에서 평가하였으며; 스캐폴드 320~341의 서열은 표 42에 열거되어 있다. 또한, 2개의 새롭게 조작된 gRNA 스캐폴드인 스캐폴드 382 및 392(표 75에 열거된 서열)도 평가하였다. 벤치마크 비교로서, 스캐폴드 174, 235, 및 316(표 9 및 표 75에 열거된 서열)도 평가를 위해 포함시켰다.
| 스캐폴드 ID | DNA 서열 | DNA 서열번호: | RNA 서열 | RNA 서열번호 |
| 스캐폴드 382 | ACTGGCGCTTCTATCTGATTACTCTGAGCCGCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTCTTCGGAGGGAGCATCAGAG | 3448 | ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAG | 3451 |
| 스캐폴드 392 | ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCGCTTACGGACTTCGGTCCGTAAGAGGCATCAGAG | 3449 | ACUGGGCCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGGCCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAG | 3452 |
| 스캐폴드 174 | ACTGGCGCTTTTATCTGATTACTTTGAGAGCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTCTTCGGAGGGAGCATCAAAG | 3450 | ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAG | 1744 |
AAV 작제물을 실시예 12에 전술한 바와 같이 설계하고 생성하였다. CpG-감소된 또는 고갈된 gRNA 스캐폴드를 2개의 상이한 AAV 백본에서 시험하였다. 구체적으로, 후술하는 바와 같은 HEK293 세포의 리포펙션을 포함하는 실험을 위해, AAV2 ITR을 제외하고는 실시예 12에 전술한 바와 같이 CpG-고갈된 AAV2 벡터에서 스캐폴드 235 및 320~341을 시험하였다. 간략하게, 다음 요소의 CpG-고갈된 버전에 대해 암호화된 CpG-고갈된 AAV 백본 작제물: U1A 프로모터, CasX 491, bGH 폴리(A) 신호 서열, 및 U6 프로모터. 후술하는 바와 같이 인간 유도 뉴런(iN) 및 HEK293 세포의 AAV 형질도입을 포함하는 실험을 위해, 스캐폴드 174, 235, 316, 320~341, 382, 및 392(서열은 표 9, 42, 및 75 참조)를 CpG-고갈되지 않은 AAV 백본에서 시험하였다(서열은 표 76 참조). 또한, B2M 유전자좌를 표적화하는 스페이서 7.37을 HEK293 세포를 포함하는 아래에 기술된 2개의 실험에 사용하였다: 리포펙션 및 AAV 형질도입. AAVS1 유전자좌를 표적화하는 스페이서 31.63을 인간 iN을 포함하는 아래에 기술된 실험에 사용하였다. 아래 표 77은 CpG-고갈되지 않은 AAV 벡터의 맥락에서 시험된 AAV 작제물 및 이들 작제물을 평가한 실험 조건을 열거한다.
| 비-CpG-고갈된 AAV 벡터에서 시험된 AAV 작제물 및 스캐폴드 변이체의 목록(서열은 표 76 참조) 및 이들 작제물을 평가한 실험 조건 | |||
| AAV 작제물 ID | 스캐폴드 변이체 | 스페이서 | 실험 조건 |
| 262 | 235 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 263 | 328 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 264 | 329 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 265 | 382 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 266 | 174 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 267 | 335 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 268 | 325 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 269 | 330 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 270 | 327 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 271 | 334 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 272 | 339 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 273 | 337 | 31.63 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 274 | 235 | 비표적화 | iN에서의 AAV 형질도입 |
| 275 | 331 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 276 | 335 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 277 | 316 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 278 | 392 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 279 | 325 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 280 | 334 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 281 | 324 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 282 | 336 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 283 | 330 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 284 | 320 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 285 | 332 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 286 | 321 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 287 | 339 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 288 | 235 | 7.37 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
| 289 | 235 | 비표적화 | HEK293에서의 AAV 형질도입 |
실시예 12에 기술된 방법을 사용하여 AAV 생산을 수행하였다. 후술하는 바와 같은 HEK293 세포의 리포펙션을 포함하는 실험의 경우, AAV 적정을 실시예 12에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 후술하는 바와 같은 인간 iN 또는 HEK293 세포의 AAV 형질도입을 포함하는 2개의 실험의 경우, AAV 적정을 ddPCR에 의해 수행하였다.CpG-고갈된 또는 감소된 gRNA 스캐폴드를 사용하는 것이 편집 활성에 미치는 효과를 평가하는 세포 기반 검정:
하나의 실험에서, 형질감염 24시간 전에 웰 당 약 20,000개의 HEK293 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 그런 다음, 시딩된 세포를 다양한 버전의 가이드 스캐폴드(스캐폴드 320~341)를 함유하는 CpG-고갈된 AAV 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 5일차에, 세포를 수확하여 HLA 면역 염색을 통해 B2M 단백질 발현을 분석한 다음, 유세포 계측을 수행하였다. 스캐폴드 변이체 235를 갖는 CpG-고갈된 AAV 플라스미드는 실험 대조군의 역할을 하였다. mCherry 발현을 유발하는 CMV 프로모터를 갖는 AAV 플라스미드를 형질감염 대조군으로서 사용하였고, 약 41%의 형질감염률이 관찰되었다. 본 실험으로부터의 결과는 도 68에 도시되어 있다.
두 번째 실험에서, 형질도입 7일 전에 웰 당 약 20,000개의 유도된 뉴런(iN) 세포를 매트리겔-코팅된 96-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 다양한 버전의 가이드 스캐폴드를 함유하는, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID #262~274; 표 77 참조)를 뉴런 도말 배지에서 희석하고, 도말 후 7일차에 세포에 첨가하였다. 세포를 3개의 MOI(3E4, 1E4, 또는 3E3 vg/세포)로 형질도입하였다. 형질도입 후 7일차에, AAVS1 유전자좌에서 NGS를 사용해 편집을 분석하기 위해 세포를 gDNA 추출하였다. 본 실험으로부터의 결과는 도 69a~69c에 도시되어 있다.
세 번째 실험에서, 형질감염 24시간 전에 웰 당 약 10,000개의 HEK293 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 그런 다음, 다양한 버전의 가이드 스캐폴드를 함유하는, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV(AAV 작제물 ID #275-289; 표 77 참조)를 시딩된 세포에 형질도입하였다. 세포를 3개의 MOI(1E4, 3E3, 또는 1E3 vg/세포)로 형질도입하였다. 형질도입 후 5일차에, 세포를 수확하고, HLA 면역 염색을 통해 B2M 단백질 발현을 분석한 다음, 유세포 계측을 수행하였다. 본 실험으로부터의 결과는 도 70a~70c에 도시되어 있다.
결과:
CpG-감소된 또는 고갈된 gRNA 스캐폴드의 사용이 CasX-매개 편집 활성에 미치는 효과를 추가로 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험(N=1)에서, HEK293 세포에 다양한 버전의 gRNA 스캐폴드(스캐폴드 320~341, 서열은 표 42 참조)를 함유하는 CpG-고갈된 AAV 플라스미드를 리포펙션하였다. 이어서, B2M 단백질 발현을 분석하였고, 검정의 결과는 도 68에 도시되어 있다. 데이터는 스캐폴드 320~341의 사용이 표적 B2M 유전자좌에서의 편집 활성을 개선하지 않았음을 보여주는데, 이는 이들 스캐폴드의 사용이 스캐폴드 235를 함유하는 AAV 작제물을 사용할 때 달성된 수준에 비해 B2M-을 갖는 세포의 백분율이 더 낮았기 때문이다. 이들 결과는 실시예 12에 기술된 결과를 재현하지 않는다(도 28~31 참조).
두 번째 실험(N=1)에서, 다양한 버전의 가이드 스캐폴드를 함유하는, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV 입자(AAV 작제물 ID #262~274)를 인간 iN에 형질도입하였다. AAVS1 유전자좌에서의 편집을 분석하였고, 분석 결과는 도 69a~69c에 도시되어 있다. 데이터는, 시험된 스캐폴드 변이체 가운데, 스캐폴드 변이체 329 및 382의 사용이 스캐폴드 235의 사용과 비교했을 때 AAVS1 유전자좌에서의 편집을 개선하는 것으로 나타났고, 특히 1E4 및 3E3 vg/세포의 MOI에서의 편집을 개선하는 것으로 나타났음을 보여준다. 또한, 편집 활성에 미치는 효과는 투여량 의존적 방식으로 관찰되었다.
세 번째 실험(N=1)에서, 다양한 버전의 가이드 스캐폴드를 함유하는, CasX:gRNA 시스템을 발현하는 AAV 입자(AAV 작제물 ID #275~289)를 HEK293 세포에 형질도입하였다. 이어서, B2M 단백질 발현을 분석하였고, 검정의 결과는 도 70a~70c에 도시되어 있다. 데이터는, 시험된 스캐폴드 변이체 가운데, 스캐폴드 316, 392, 및 332의 사용이 스캐폴드 235의 사용과 비교했을 때 B2M 유전자좌에서의 편집을 전반적으로 개선하는 것으로 나타났음을 보여준다. 구체적으로, 1E4 및 3E3 vg/세포의 더 높은 MOI에서, 스캐폴드 316, 392, 및 332를 사용했을 때 약간 개선된 편집이 관찰되었고(도 70a~70b), 1E3 vg/세포의 더 낮은 MOI에서 더 강한 편집 개선이 관찰되었다(도 70c). 특히, 스캐폴드 332 및 392 둘 다는 유사매듭 줄기(영역 1; 도 27a~27b)에 CG > GC 돌연변이를 포함함으로써, 스캐폴드 235와 비교했을 때 CpG의 전체 수를 효과적으로 감소시켜, 편집 활성의 증가에 잠재적으로 기여한다. 또한, 스캐폴드 316 및 332 둘 다는 스캐폴드 235와 비교했을 때 절단된 연장된 줄기를 가짐으로써, 버블 및 CG 디뉴클레오티드를 감소시켜(영역 3; 도 27a~27b), 편집 활성의 관찰된 증가에도 잠재적으로 기여한다. 개별 CpG 돌연변이가 편집 효능에 미치는 효과의 복잡성을 밝히기 위해, 특히 더 낮은 MOI에서 추가 실험을 수행한다.
본원에 기술된 실험의 결과는 CpG 고갈 수준이 상이한 가이드 스캐폴드의 사용이 CasX:gRNA 시스템에 의해 매개되는 다양한 수준의 편집을 초래할 수 있고, 생성된 편집 수준은 전달 방법(예: 플라스미드 형질감염 대 AAV 형질도입)에 따라 달라질 수 있음을 입증한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (147)
- 억제자 융합 단백질 및 가이드 리보핵산(gRNA)을 포함하는 시스템으로서, 상기 억제자 융합 단백질은:
(a) 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질;
(b) 억제자 도메인(RD1);
(c) DNA 메틸전달효소(DNMT) 3A ATRX-DNMT3-DNMT3L 도메인(ADD);
(d) DNMT3A 촉매 도메인(DNMT3A); 및
(e) DNMT3L 상호작용 도메인(DNMT3L)을 포함하되;
상기 gRNA는 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9) 유전자 표적 핵산 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하고,
상기 억제자 융합 단백질은 상기 gRNA와 함께 리보핵단백질(RNP)를 형성할 수 있는, 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 RNP는 상기 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 결합할 수 있는, 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 RNP는 상기 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 결합한 후 상기 PCSK9 유전자의 전사를 억제할 수 있는, 시스템.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADD는 상기 DNMT3A의 N-말단에 융합되는, 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는, 시스템:
(a) RD1;
(b) ADD;
(c) DNMT3A;
(d) DNMT3L; 및
(e) 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는, 시스템:
(a) ADD;
(b) DNMT3A;
(c) DNMT3L;
(d) RD1; 및
(e) 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸헌 CRISPR 단백질은 촉매적으로 사멸한 클래스 1 CRISPR 단백질 또는 촉매적으로 사멸한 클래스 2 CRISPR 단백질인, 시스템.
- 제7항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 클래스 2 CRISPR 단백질은 촉매적으로 사멸한 II형 단백질, 촉매적으로 사멸한 V형 단백질, 또는 촉매적으로 사멸한 VI형 단백질인, 시스템.
- 제8항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 II형 단백질은 촉매적으로 사멸한 Cas9 단백질인, 시스템.
- 제8항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 V형 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템: 촉매적으로 사멸한 Cas12a(Cpf1), 촉매적으로 사멸한 Cas12b(C2c1), 촉매적으로 사멸한 Cas12c(C2c3), 촉매적으로 사멸한 Cas12d(CasY), 촉매적으로 사멸한 Cas12e(CasX), 촉매적으로 사멸한 Cas12f, 촉매적으로 사멸한 Cas12g, 촉매적으로 사멸한 Cas12h, 촉매적으로 사멸한 Cas12i, 촉매적으로 사멸한 Cas12j, 촉매적으로 사멸한 Cas12k, 촉매적으로 사멸한 Cas14, 및 촉매적으로 사멸한 CasΦ.
- 제10항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 V형 단백질은 촉매적으로 사멸한 CasX(dCasX)인, 시스템.
- 제11항에 있어서, 상기 dCasX는 서열번호 4~29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제11항에 있어서, 상기 dCasX는 서열번호 3281~3441 또는 3444~3446으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 RuvC 도메인의 절단 활성을 비활성화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 RuvC 도메인을 포함하는, 시스템.
- 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 서열번호 2의 서열에 상응하는 D659A, E756A, 및/또는 D922A 치환을 포함하는, 시스템.
- 제11항에 있어서, 상기 dCasX는 서열번호 4의 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함하는, 시스템:
(a) PX1X2X3X4X5X6EX7, 서열 중
i) X1은 A, D, E, 또는 N이고,
ii) X2는 L 또는 V이고,
iii) X3은 I 또는 V이고,
iv) X4는 S, T, 또는 F이고,
v) X5는 H, K, L, Q, R, 또는 W이고,
vi) X6은 L 또는 M이고,
vii) X7은 G, K, Q, 또는 R임;
(b) X1X2X3X4GX5X6X7X8X9, 서열 중
i) X1은 L 또는 V이고,
ii) X2는 A, G, L, T, 또는 V이고,
iii) X3은 A, F, 또는 S이고,
iv) X4는 L 또는 V이고,
v) X5는 C, F, H, I, L, 또는 Y이고,
vi) X6은 A, C, P, Q, 또는 S이고,
vii) X7은 A, F, G, I, S, 또는 V이고,
viii) X8은 A, P, S, 또는 T이고,
ix) X9는 K 또는 R임;
(c) QX1X2LYRX3VMX4 (서열번호 1727), 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 A, D, E, G, N, S, 또는 T이고,
iii) X3은 D, E, 또는 S이고,
iv) X4는 L 또는 R임;
(d) X1X2X3FX4DVX5X6X7FX8X9X10X11 (서열번호 1728), 서열 중
i) X1은 A, L, P, 또는 S이고,
ii) X2는 L 또는 V이고,
iii) X3은 S 또는 T이고,
iv) X4는 A, E, G, K, 또는 R이고,
v) X5는 A 또는 T이고,
vi) X6은 I 또는 V이고,
vii) X7은 D, E, N, 또는 Y이고,
viii) X8은 S 또는 T이고,
ix) X9는 E, P, Q, R, 또는 W이고,
x) X10은 E 또는 N이고,
xi) X11은 E 또는 Q임;
(e) X1X2X3PX4X5X6X7X8X9X10, 서열 중
i) X1은 E, G, 또는 R이고,
ii) X2는 E 또는 K이고,
iii) X3은 A, D, 또는 E이고,
iv) X4는 C 또는 W이고,
v) X5는 I, K, L, M, T, 또는 V이고,
vi) X6은 I, L, P, 또는 V이고,
vii) X7은 D, E, K, 또는 V이고,
viii) X8은 E, G, K, P, 또는 R이고,
ix) X9는 A, D, R, G, K, Q, 또는 V이고,
x) X10은 D, E, G, I, L, R, S, 또는 V임;
(f) LYX1X2VMX3EX4X5X6X7X8X9X10 (서열번호 1729), 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 D 또는 E이고,
iii) X3은 L, Q, 또는 R이고,
iv) X4는 N 또는 T이고,
v) X5는 F 또는 Y이고,
vi) X6은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고,
vii) X7은 H, L, 또는 N이고,
viii) X8은 L 또는 V이고,
ix) X9는 A, G, I, L, T, 또는 V이고,
x) X10은 A, F, 또는 S임;
(g) FX1DVX2X3X4FX5X6X7EWX8 (서열번호 1730), 서열 중
i) X1은 A, E, G, K, 또는 R이고,
ii) X2는 A, S, 또는 T이고,
iii) X3은 I 또는 V이고,
iv) X4는 D, E, N, 또는 Y이고,
v) X5는 S 또는 T이고,
vi) X6은 E, L, P, Q, R, 또는 W이고,
vii) X7은 D 또는 E이고,
viii) X8은 A, E, G, Q, 또는 R임;
(h) X1PX2X3X4X5 X6LEX7X8X9X10X11X12, 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 A, D, E, 또는 N이고,
iii) X3은 I, L, M, 또는 V이고,
iv) X4는 I 또는 V이고,
v) X5는 F, S, 또는 T이고,
vi) X6은 H, K, L, Q, R, 또는 W이고,
vii) X7은 K, Q, 또는 R이고,
viii) X8은 E, G, 또는 R이고,
ix) X9는 D, E, 또는 K이고,
x) X10은 A, D, 또는 E이고,
xi) X11은 L 또는 P이고,
xii) X12는 C 또는 W임; 및
(i) X1LX2X3X4QX5X6, 서열 중
i) X1은 C, H, L, Q, 또는 W이고,
ii) X2는 D, G, N, R, 또는 S이고,
iii) X3은 L, P, S, 또는 T이고,
iv) X4는 A, S, 또는 T이고,
v) X5는 K 또는 R이고,
vi) X6은 A, D, E, K, N, S, 또는 T임. - 제16항에 있어서, 상기 RD1은 제1 및 제2 아미노산 서열 모티프를 포함하되:
(a) 상기 제1 아미노산 서열 모티프는 LYX1X2VMX3EX4X5X6X7X8X9X10 (서열번호 1729)를 포함하고, 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 D 또는 E이고,
iii) X3은 L, Q, 또는 R이고,
iv) X4는 N 또는 T이고,
v) X5는 F 또는 Y이고,
vi) X6은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고,
vii) X7은 H, L, 또는 N이고,
viii) X8은 L 또는 V이고,
ix) X9는 A, G, I, L, T, 또는 V이고,
x) X10은 A, F, 또는 S이고; 및
(b) 상기 제2 아미노산 서열 모티프는 FX1DVX2X3X4FX5X6X7EWX8 (서열번호 1730)을 포함하고, 서열 중
i) X1은 A, E, G, K, 또는 R이고,
ii) X2는 A, S, 또는 T이고,
iii) X3은 I 또는 V이고,
iv) X4는 D, E, N, 또는 Y이고,
v) X5는 S 또는 T이고,
vi) X6은 E, L, P, Q, R, 또는 W이고,
vii) X7은 D 또는 E이고,
viii) X8은 A, E, G, Q, 또는 R인, 시스템. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함하는, 시스템:
(a) DVAVYFSPEEWGCL (서열번호 2945);
(b) X1X2X3QX4X5LY, 서열 중
i) X1은 A, D, G, N, R, 또는 S이고,
ii) X2는 P, S, 또는 T이고,
iii) X3은 A, S, 또는 T이고,
iv) X4는 K 또는 R이며,
v) X5는 A, D, K, N, S, 또는 T임;
(c) X1KPX2X3X4X5X6, 서열 중
i) X1은 A, P, 또는 S이고,
ii) X2는 A, D, 또는 E이고,
iii) X3은 L, M, 또는 V이고,
iv) X4는 I 또는 V이고,
v) X5는 F, S, 또는 T이며,
vi) X6은 H, K, L, Q, R, 또는 W임;
(d) LEX1X2X3X4X5X6, 서열 중
i) X1은 E, K, Q, 또는 R이고,
ii) X2는 E, G, 또는 R이고,
iii) X3은 A, D, E, 또는 K이고,
iv) X4는 A, D, 또는 E이고,
v) X5는 L 또는 P이며,
vi) X6은 C 또는 W임; 및
(e) X1VMLEX2YX3X4X5X6SX7X8X9 (서열번호 2946), 서열 중
i) X1은 D 또는 E이고,
ii) X2는 N 또는 T이고,
iii) X3은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고,
iv) X4는 H 또는 N이고,
v) X5는 L, M, 또는 V이고,
vi) X6은 A, L, 또는 V이고,
vii) X7은 L 또는 V이고,
viii) X8은 A, G, 또는 V이며,
ix) X9는 C, F, 또는 L임. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 130~1726으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 130~224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 130~138로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 135의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 131의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 크뤼펠-연관 박스(KRAB) 도메인을 포함하는, 시스템.
- 제24항에 있어서, 상기 KRAB 도메인은 ZIM3 KRAB 도메인 또는 ZNF10 KRAB 도메인인, 시스템.
- 제25항에 있어서, 상기 ZIM3 KRAB 도메인은 서열번호 128의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제25항에 있어서, 상기 ZNF10 KRAB 도메인은 서열번호 129의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADD는 서열번호 125의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNMT3A는 서열번호 126의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNMT3L은 서열번호 127의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제6항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 RD1은 서열번호 128, 129, 131, 및 135로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
(b) 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질은 dCasX인, 시스템. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 하나 이상의 링커 펩티드를 포함하는, 시스템.
- 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 링커 펩티드 중 적어도 하나는 서열번호 98~124로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 시스템.
- 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 링커 펩티드 중 적어도 하나는 서열번호 120 및 122~124로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS)를 포함하는, 시스템.
- 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 NLS 중 적어도 하나는 서열번호 30~97로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 시스템.
- 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 NLS 중 적어도 하나는 유인원 바이러스 40(SV40) NLS인, 시스템.
- 제37항에 있어서, 상기 SV40 NLS는 서열번호 30의 서열을 포함하는, 시스템.
- 제6항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는, 시스템:
(a) 제1 NLS;
(b) ADD;
(c) DNMT3A;
(d) 제1 펩티드 링커;
(e) DNMT3L;
(f) 제2 펩티드 링커;
(g) RD1;
(h) 제3 펩티드 링커;
(i) 촉매적으로 사멸한 CRISPR 단백질;
(j) 제4 펩티드 링커; 및
(k) 제2 NLS. - 제39항에 있어서, 상기 제1 링커는 서열번호 122의 서열을 포함하고, 상기 제2 및 제4 링커는 서열번호 124의 서열을 포함하고, 상기 제3 링커는 서열번호 123의 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열은:
(a) 상기 PCSK9 유전자 내의 전사 시작 부위(TSS)의 1 킬로염기(kb) 이내에;
(b) 상기 PCSK9 유전자의 인핸서의 1 kb 이내에;
(c) 상기 PCSK9 유전자의 3' 비번역 영역 내에;
(d) 상기 PCSK9 유전자의 3' 비번역 영역 내에; 또는
(e) 상기 PCSK9 유전자의 엑손 내에 있는, 시스템. - 제41항에 있어서, 상기 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열은 상기 PCSK9 유전자의 엑손 1 내에 있는, 시스템.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~2944로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~2944의 서열을 포함하되, 상기 서열의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드(들)가 제거된, 시스템.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA의 표적화 서열은 서열번호 1824~1890, 1910, 1925, 2672, 2675, 2694, 및 2714로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 단일 분자 gRNA(sgRNA)이고, CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG(서열번호 1822)의 서열, 또는 이와 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 불일치를 갖는 서열을 포함하는 스캐폴드 줄기 루프를 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 1744~1821로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 스캐폴드를 포함하는, 시스템.
- 제49항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 1744~1821로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 스캐폴드를 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 키메라 gRNA인, 시스템.
- 제51항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 1746, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 스캐폴드 서열을 포함하는, 시스템.
- 제52항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 1746을 포함하는 스캐폴드 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 화학적으로 변형된 것인, 시스템.
- 제54항에 있어서, 상기 gRNA에 대한 화학적 변형은 상기 gRNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 2'O-메틸기의 첨가를 포함하는, 시스템.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 gRNA에 대한 화학적 변형은 상기 gRNA의 2개 이상의 뉴클레오티드 간의 포스포로티오에이트 결합의 치환을 포함하는, 시스템.
- 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학적으로 변형된 gRNA는 서열번호 2968~2976으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제57항에 있어서, 상기 화학적으로 변형된 gRNA는 서열번호 2968의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 화학적으로 변형된 gRNA 서열은 상기 PCSK9 유전자의 표적 핵산에 상보적인 20개의 뉴클레오티드 표적화 서열의 상기 gRNA의 3' 말단에 있는 20개의 뉴클레오티드로의 치환을 갖는, 시스템.
- 다음을 포함하는 억제제 융합 단백질을 포함하는 시스템:
(a) PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질;
(b) DNA 메틸전달효소(DNMT) 3A ATRX-DNMT3-DNMT3L 도메인(ADD); 및
(c) DNMT3A 촉매 도메인(DNMT3A). - 제60항에 있어서, 상기 ADD는 상기 DNMT3A의 N-말단에 융합되는, 시스템.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 다음을 포함하는, 시스템:
(a) 억제자 도메인(RD1);
(b) DNMT3L 상호작용 도메인(DNMT3L); 및
(c) 하나 이상의 링커 펩티드. - 제62항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는, 시스템:
(a) RD1;
(b) ADD;
(c) DNMT3A;
(d) DNMT3L; 및
(e) DNA 결합 단백질. - 제62항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는, 시스템:
(a) ADD;
(b) DNMT3A;
(c) DNMT3L;
(d) RD1; 및
(e) DNA 결합 단백질. - 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 링커 서열은 서열번호 122~124로 이루어진 군으로부터 선택되고, RD1, ADD, DNMT3A, DNMT3L, 및 DNA 결합 단백질로부터 선택된 임의의 2개의 성분을 연결하는, 시스템.
- 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거(ZF) 도메인을 포함하는, 시스템.
- 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 전사-활성화 인자-유사 효과기(TALE) 도메인을 포함하는, 시스템.
- 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 촉매적으로 사멸한 클래스 1 CRISPR 단백질 또는 촉매적으로 사멸한 클래스 2 CRISPR 단백질을 포함하는, 시스템.
- 제68항에 있어서, 가이드 리보핵산(gRNA)을 포함하되, 상기 gRNA는 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는, 시스템.
- 제69항에 있어서, 상기 gRNA는 억제자 융합 단백질과 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성할 수 있는, 시스템.
- 제70항에 있어서, 상기 RNP는 상기 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 결합할 수 있는, 시스템.
- 제60항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질은 상기 PCSK9 유전자 표적 핵산 서열에 결합한 후 상기 PCSK9 유전자의 전사를 억제할 수 있는, 시스템.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 클래스 2 CRISPR 단백질은 촉매적으로 사멸한 클래스 2, II형 단백질, 촉매적으로 사멸한 클래스 2, V형 단백질, 또는 촉매적으로 사멸한 클래스 2, VI형 단백질인, 시스템.
- 제73항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 클래스 2, II형 단백질은 촉매적으로 사멸한 Cas9 단백질인, 시스템.
- 제73항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 클래스 2, V형 단백질은 촉매적으로 사멸한 Cas12a(Cpf1), 촉매적으로 사멸한 Cas12b(C2c1), 촉매적으로 사멸한 Cas12c(C2c3), 촉매적으로 사멸한 Cas12d(CasY), 촉매적으로 사멸한 Cas12e(CasX), 촉매적으로 사멸한 Cas12f, 촉매적으로 사멸한 Cas12g, 촉매적으로 사멸한 Cas12h, 촉매적으로 사멸한 Cas12i, 촉매적으로 사멸한 Cas12j, 촉매적으로 사멸한 Cas12k, 촉매적으로 사멸한 Cas14, 또는 촉매적으로 사멸한 CasΦ인, 시스템.
- 제73항에 있어서, 상기 촉매적으로 사멸한 클래스 2, V형 단백질은 촉매적으로 사멸한 CasX 변이체(dCasX)인, 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 dCasX는 서열번호 4~29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 상기 dCasX를 포함하는 억제자 융합 단백질은 gRNA와 RNP를 형성하는 능력을 유지하는, 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 dCasX는 서열번호 3281~3441 또는 3444~3446으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 RuvC 도메인의 절단 활성을 비활성화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 RuvC 도메인을 포함하는, 시스템.
- 제78항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 서열번호 2의 서열에 상응하는 D659A, E756A, 및/또는 D922A 치환을 포함하는, 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 dCasX는 서열번호 4의 서열을 포함하는, 시스템.
- 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함하는, 시스템:
(a) PX1X2X3X4X5X6EX7, 서열 중
i) X1은 A, D, E, 또는 N이고,
ii) X2는 L 또는 V이고,
iii) X3은 I 또는 V이고,
iv) X4는 S, T, 또는 F이고,
v) X5는 H, K, L, Q, R, 또는 W이고,
vi) X6은 L 또는 M이고,
vii) X7은 G, K, Q, 또는 R임;
(b) X1X2X3X4GX5X6X7X8X9, 서열 중
i) X1은 L 또는 V이고,
ii) X2는 A, G, L, T, 또는 V이고,
iii) X3은 A, F, 또는 S이고,
iv) X4는 L 또는 V이고,
v) X5는 C, F, H, I, L, 또는 Y이고,
vi) X6은 A, C, P, Q, 또는 S이고,
vii) X7은 A, F, G, I, S, 또는 V이고,
viii) X8은 A, P, S, 또는 T이고,
ix) X9는 K 또는 R임;
(c) QX1X2LYRX3VMX4 (서열번호 1727), 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 A, D, E, G, N, S, 또는 T이고,
iii) X3은 D, E, 또는 S이고,
iv) X4는 L 또는 R임;
(d) X1X2X3FX4DVX5X6X7FX8X9X10X11 (서열번호 1728), 서열 중
i) X1은 A, L, P, 또는 S이고,
ii) X2는 L 또는 V이고,
iii) X3은 S 또는 T이고,
iv) X4는 A, E, G, K, 또는 R이고,
v) X5는 A 또는 T이고,
vi) X6은 I 또는 V이고,
vii) X7은 D, E, N, 또는 Y이고,
viii) X8은 S 또는 T이고,
ix) X9는 E, P, Q, R, 또는 W이고,
x) X10은 E 또는 N이고,
xi) X11은 E 또는 Q임;
(e) X1X2X3PX4X5X6X7X8X9X10, 서열 중
i) X1은 E, G, 또는 R이고,
ii) X2는 E 또는 K이고,
iii) X3은 A, D, 또는 E이고,
iv) X4는 C 또는 W이고,
v) X5는 I, K, L, M, T, 또는 V이고,
vi) X6은 I, L, P, 또는 V이고,
vii) X7은 D, E, K, 또는 V이고,
viii) X8은 E, G, K, P, 또는 R이고,
ix) X9는 A, D, R, G, K, Q, 또는 V이고,
x) X10은 D, E, G, I, L, R, S, 또는 V임;
(f) LYX1X2VMX3EX4X5X6X7X8X9X10 (서열번호 1729), 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 D 또는 E이고,
iii) X3은 L, Q, 또는 R이고,
iv) X4는 N 또는 T이고,
v) X5는 F 또는 Y이고,
vi) X6은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고,
vii) X7은 H, L, 또는 N이고,
viii) X8은 L 또는 V이고,
ix) X9는 A, G, I, L, T, 또는 V이고,
x) X10은 A, F, 또는 S임;
(g) FX1DVX2X3X4FX5X6X7EWX8 (서열번호 1730), 서열 중
i) X1은 A, E, G, K, 또는 R이고,
ii) X2는 A, S, 또는 T이고,
iii) X3은 I 또는 V이고,
iv) X4는 D, E, N, 또는 Y이고,
v) X5는 S 또는 T이고,
vi) X6은 E, L, P, Q, R, 또는 W이고,
vii) X7은 D 또는 E이고,
viii) X8은 A, E, G, Q, 또는 R임;
(h) X1PX2X3X4X5 X6LEX7X8X9X10X11X12, 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 A, D, E, 또는 N이고,
iii) X3은 I, L, M, 또는 V이고,
iv) X4는 I 또는 V이고,
v) X5는 F, S, 또는 T이고,
vi) X6은 H, K, L, Q, R, 또는 W이고,
vii) X7은 K, Q, 또는 R이고,
viii) X8은 E, G, 또는 R이고,
ix) X9는 D, E, 또는 K이고,
x) X10은 A, D, 또는 E이고,
xi) X11은 L 또는 P이고,
xii) X12는 C 또는 W임; 및
(i) X1LX2X3X4QX5X6, 서열 중
i) X1은 C, H, L, Q, 또는 W이고,
ii) X2는 D, G, N, R, 또는 S이고,
iii) X3은 L, P, S, 또는 T이고,
iv) X4는 A, S, 또는 T이고,
v) X5는 K 또는 R이고,
vi) X6은 A, D, E, K, N, S, 또는 T임. - 제81항에 있어서, 상기 RD1은 제1 및 제2 아미노산 서열 모티프를 포함하되:
(a) 상기 제1 아미노산 서열 모티프는 LYX1X2VMX3EX4X5X6X7X8X9X10 (서열번호 1729)를 포함하고, 서열 중
i) X1은 K 또는 R이고,
ii) X2는 D 또는 E이고,
iii) X3은 L, Q, 또는 R이고,
iv) X4는 N 또는 T이고,
v) X5는 F 또는 Y이고,
vi) X6은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고,
vii) X7은 H, L, 또는 N이고,
viii) X8은 L 또는 V이고,
ix) X9는 A, G, I, L, T, 또는 V이고,
x) X10은 A, F, 또는 S이고;
(b) 상기 제2 아미노산 서열 모티프는 FX1DVX2X3X4FX5X6X7EWX8 (서열번호 1730)을 포함하고, 서열 중
i) X1은 A, E, G, K, 또는 R이고,
ii) X2는 A, S, 또는 T이고,
iii) X3은 I 또는 V이고,
iv) X4는 D, E, N, 또는 Y이고,
v) X5는 S 또는 T이고,
vi) X6은 E, L, P, Q, R, 또는 W이고,
vii) X7은 D 또는 E이고,
viii) X8은 A, E, G, Q, 또는 R인, 시스템. - 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함하는, 시스템:
(a) DVAVYFSPEEWGCL (서열번호 2945);
(b) X1X2X3QX4X5LY, 서열 중
i) X1은 A, D, G, N, R, 또는 S이고,
ii) X2는 P, S, 또는 T이고,
iii) X3은 A, S, 또는 T이고,
iv) X4는 K 또는 R이며,
v) X5는 A, D, K, N, S, 또는 T임;
(c) X1KPX2X3X4X5X6, 서열 중
i) X1은 A, P, 또는 S이고,
ii) X2는 A, D, 또는 E이고,
iii) X3은 L, M, 또는 V이고,
iv) X4는 I 또는 V이고,
v) X5는 F, S, 또는 T이며,
vi) X6은 H, K, L, Q, R, 또는 W임;
(d) LEX1X2X3X4X5X6, 서열 중
i) X1은 E, K, Q, 또는 R이고,
ii) X2는 E, G, 또는 R이고,
iii) X3은 A, D, E, 또는 K이고,
iv) X4는 A, D, 또는 E이고,
v) X5는 L 또는 P이며,
vi) X6은 C 또는 W임; 및
(e) X1VMLEX2YX3X4X5X6SX7X8X9 (서열번호 2946), 서열 중
i) X1은 D 또는 E이고,
ii) X2는 N 또는 T이고,
iii) X3은 A, E, G, Q, R, 또는 S이고,
iv) X4는 H 또는 N이고,
v) X5는 L, M, 또는 V이고,
vi) X6은 A, L, 또는 V이고,
vii) X7은 L 또는 V이고,
viii) X8은 A, G, 또는 V이며,
ix) X9는 C, F, 또는 L임. - 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 130~1726으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 130~224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 130~138로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 135의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RD1은 서열번호 131의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제60항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADD는 서열번호 125의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제60항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNMT3A는 서열번호 126의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제60항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNMT3L은 서열번호 127의 서열, 또는 이와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 gRNA를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 억제자 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제93항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질을 암호화하는 시퀀싱은 코돈 최적화된, 핵산.
- 제94항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질을 암호화하는 시퀀싱은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 핵산.
- 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 융합 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호 3105, 3116-3124, 및 3127~3128로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산.
- 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 전령 RNA(mRNA)인, 핵산.
- 제97항에 있어서, 상기 mRNA 서열의 우리딘 뉴클레오시드의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 100%가 N1-메틸슈도우리딘으로 치환되는, 핵산.
- 제97항 또는 제98항에 있어서, 5' 비번역 영역(UTR)을 포함하는, 핵산.
- 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 비번역 영역(UTR)을 포함하는, 핵산.
- 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 지질 나노입자(LNP).
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 gRNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP).
- 다음을 포함하는 지질 나노입자(LNP):
(a) 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 gRNA;
(b) 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항의 핵산; 또는
(c) (a) 및 (b)의 조합. - 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 이온화 가능한 지질, 헬퍼 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 지질, 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는, LNP.
- 제104항에 있어서, 상기 LNP는 이온화 가능한 지질, 헬퍼 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 지질, 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는, LNP.
- 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 5 내지 8의 pKa를 포함하는 양이온성 지질을 포함하는, LNP.
- 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제107항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 단순 포진 바이러스(HSV) 벡터, 플라스미드, 미니서클(minicircle), 나노플라스미드, DNA 벡터, 및 RNA 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
- 제107항 또는 제108항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제109항에 있어서, 상기 숙주 세포는 새끼 햄스터 신장 섬유아세포(BHK), 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포, 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포, 하이브리도마 세포, NIH3T3 세포, SV40 유전 물질(COS) 세포에서 기원하는 CV-1(유인원), HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
- 다음을 포함하는 약학적 조성물:
(a) 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 시스템;
(b) 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산;
(c) 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 LNP; 또는
(d) 제107항 또는 제108항의 벡터,
및 하나 이상의 약학적으로 적합한 부형제. - 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 복수의 지질 나노입자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
- 제112항에 있어서, 상기 복수의 지질 나노입자의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 200 nm인, 약학적 조성물.
- 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 문맥내 주사, 복강내, 근육내, 뇌실내, 방광내, 경막내, 두개내, 요추내, 안구내, 피하, 및 경구 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로에 맞게 제형화되는, 약학적 조성물.
- 세포 집단에서 PCSK9 유전자의 전사를 억제하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 시스템;
(b) 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산;
(c) 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 LNP;
(d) 제107항 또는 제108항의 벡터;
(e) 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항의 약학적 조성물; 또는
(f) (a) 내지 (d) 중 2개 이상의 조합을 상기 세포 집단 내로 도입하는 단계를 포함하되,
상기 PCSK9 유전자의 전사는 상기 억제자 융합 단백질에 의해 억제되는, 방법. - 제115항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 그 이상의 상기 PCSK9 유전자의 전사가 억제되는, 방법.
- 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 PCSK9 유전자의 전사는, 상기 PCSK9 유전자의 전사가 억제되지 않은 세포와 비교하여 PCSK9 단백질의 발현이 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 99%만큼 감소되도록, 상기 세포 집단에서 억제되는, 방법.
- 제115항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단의 PCSK9 유전자의 전사는, 상기 집단의 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%가 검출 가능한 수준의 PCSK9 단백질을 발현하지 않도록 억제되는, 방법.
- 제115항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단의 PCSK9 유전자의 전사 억제는 유전성인, 방법.
- 제119항에 있어서, 상기 PCKS9 유전자의 억제는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 또는 그 이상의 세포 분열 동안 지속되는, 방법.
- 제115항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단의 PCSK9 유전자의 전사 억제는, 시험관 내 검정에서 검정했을 때, 적어도 약 8시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 7일, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월 동안 지속되는, 방법.
- 제115항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
- 제122항에 있어서, 상기 진핵 세포는 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 및 비인간 영장류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제122항에 있어서, 상기 진핵 세포는 인간 세포인, 방법.
- 제115항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵 세포는 간세포, 장 세포, 신장 세포, 중추신경계 세포, 평활근 세포, 대식세포, 망막 세포, 및 동맥 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제115항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 생식 세포, 섬유아세포, 희소돌기아교세포, 교세포, 조혈 줄기 세포, 뉴런 전구 세포, 뉴런, 성상세포, 근육 세포, 골 세포, 간세포, 췌장 세포, 망막 세포, 암세포, T-세포, B-세포, NK 세포, 태아 심근세포, 근섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 자가이식된 확장 심근세포, 지방세포, 전능성 세포, 다능성 세포, 혈액 줄기 세포, 근아세포, 골수 세포, 중간엽 세포, 실질 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중피 세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 조혈 줄기 세포, 골수 유래 전구 세포, 심근 세포, 골격 세포, 태아 세포, 미분화 세포, 다능성 전구 세포, 단능성 전구 세포, 단핵구, 심장 근아세포, 골격 근아세포, 대식세포, 모세관 내피 세포, 이종 세포, 동종 세포, 및 출생 후 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제115항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단의 PCSK9 유전자의 전사 억제는 시험관 내 또는 생체 외에서 이루어지는, 방법.
- 제115항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단의 PCSK9 유전자의 전사 억제는 대상체의 생체 내에서 이루어지는, 방법.
- 제128항에 있어서, 상기 대상체는 설치류, 마우스, 랫트, 및 비인간 영장류로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제128항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
- 제115항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제는 1회 이상의 세포 분열을 거치는 동안 안정한, 방법.
- 제115항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제는 가역적인, 방법.
- 제132항에 있어서, 상기 억제는 DNA 메틸전이효소 억제제를 상기 세포 집단 내로 도입함으로써 가역적인, 방법.
- 제133항에 있어서, 상기 DNA 메틸전이효소 억제제는 시티딘 유사체인, 방법.
- 제133항 또는 제134항에 있어서, DNA 메틸전이효소 억제제는 아자시티딘, 데시타빈, 클로파라빈, 및 제불라린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- PCSK9 관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 시스템;
(b) 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산;
(c) 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 LNP;
(d) 제107항 또는 제108항의 벡터;
(e) 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항의 약학적 조성물; 또는
(f) (a) 내지 (d) 중 2개 이상의 조합의 치료적 유효 투여량을 상기 대상체의 세포와 접촉시키는 단계를 포함하되,
상기 PCSK9 유전자의 전사는 상기 접촉된 세포에서 상기 억제자 융합 단백질에 의해 억제되는, 방법. - 제136항에 있어서, 상기 세포는 상기 LNP의 치료적 유효 투여량과 접촉되는, 방법.
- 제137항에 있어서, 상기 LNP는 정맥내, 동맥내, 문맥내 주사, 복강내, 근육내, 뇌실내, 방광내, 경막내, 두개내, 요추내, 안구내, 피하, 및 경구 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로에 의해 투여되는, 방법.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 LDL 수용체(LDLR) 발현을 증가시키는 치료제로 전치료되는, 방법.
- 제139항에 있어서, 상기 치료제는 에볼로쿠맙, 인클리시란, 알리로쿠맙, 및 MK-0616으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제136항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PCSK9 관련 질환은 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH), 고콜레스테롤혈증, 총 콜레스테롤 수치 상승, 고지혈증, 저밀도 지단백질(LDL) 수치 상승, LDL-콜레스테롤 수치 상승, 고밀도 지단백질 수치 감소, 간 지방증, 관상 동맥 심장 질환, 허혈, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 혈전증, 2형 당뇨병, 혈압 상승, 죽상경화증, 비만, 대동맥 협착증, PCSK9 수치 상승, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제136항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 LDL-콜레스테롤의 베이스라인 대비 변화, 플라크 죽종 부피의 감소, 관상 동맥 플라크의 감소, 죽상 경화성 심혈관 질환(ASCVD)의 감소, 심혈관 사망, 비치명적 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 비치명적 뇌졸중, 관상 혈관재개통, 불안정 협심증, 및 시력으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 임상적으로 관련있는 평가변수를 개선하는, 방법.
- 제136항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 LDL-콜레스테롤의 베이스라인 대비 변화, 플라크 죽종 부피의 감소, 관상 동맥 플라크의 감소, 죽상 경화성 심혈관 질환(ASCVD)의 감소, 심혈관 사망, 비치명적 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 비치명적 뇌졸중, 관상 혈관재개통, 불안정 협심증, 및 시력으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 임상적으로 관련있는 평가변수를 개선하는, 방법.
- PCSK9 관련 질환의 치료를 위한 의약을 제조하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 시스템, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 LNP, 제107항 또는 제108항의 벡터, 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 이들의 조합.
- 세포 집단에서 PCSK9 표적 핵산 서열을 억제하거나 PCSK9 관련 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 시스템, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 LNP, 제107항 또는 제108항의 벡터, 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 이들의 조합.
- 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 시스템, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 LNP, 제107항 또는 제108항의 벡터, 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 이들의 조합, 및 적절한 용기를 포함하는 키트.
- 제146항에 있어서, 완충액, 부형체, 뉴클레아제 억제제, 프로테아제 억제제, 리포솜, 치료제, 표지, 표지 시각화 시약, 사용 지침, 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 포함하는, 키트.
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| PA0105 | International application |
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| PG1501 | Laying open of application |