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KR20250034101A - 계면활성제-단백질-d 및 tnfsf의 구성원을 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

계면활성제-단백질-d 및 tnfsf의 구성원을 포함하는 융합 단백질 Download PDF

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KR20250034101A
KR20250034101A KR1020257002620A KR20257002620A KR20250034101A KR 20250034101 A KR20250034101 A KR 20250034101A KR 1020257002620 A KR1020257002620 A KR 1020257002620A KR 20257002620 A KR20257002620 A KR 20257002620A KR 20250034101 A KR20250034101 A KR 20250034101A
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KR
South Korea
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virus
fusion protein
tnfsf
spd
seq
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Application number
KR1020257002620A
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English (en)
Inventor
장-밥티스트 마르샹
Original Assignee
트랜스진
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 면역학 및 종양학 분야에 속하며, 특히, 증식성 질환, 특히 암, 감염성 질환 및 TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애의 치료, 예방 또는 억제를 위한 것이다. 본 발명은 계면활성제 단백질-D (SPD)의 코일드-코일 도메인에 융합된 TNF-슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 신규 SPD-TNFSF 융합 단백질에 관한 것이다. 복수의 SPD-TNFSF 융합 단백질을 포함하는 삼량체성 또는 다량체성 융합 단백질이 또한 제공된다. 본 발명은 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA, 플라스미드 또는 바이러스로서의 발현 벡터, 및 그를 포함하는 세포 또는 제약 조성물을 또한 제공한다.

Description

계면활성제-단백질-D 및 TNFSF의 구성원을 포함하는 융합 단백질
본 발명은 일반적으로 면역학 및 종양학 분야에 관한 것이고, 더욱 구체적으로는 증식성 질환, 특히 암, 감염성 질환 및 TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애를 치료, 예방, 또는 억제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 실시양태는 계면활성제 단백질-D (SPD)의 코일드-코일 도메인에 융합된 TNF-슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 SPD-TNFSF 융합 단백질, 복수의 SPD-TNFSF 융합 단백질을 포함하는 삼량체성 또는 다량체성 융합 단백질을 포함한다. 실시양태는 하나 이상의 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 예컨대 mRNA, 플라스미드 및 바이러스를 또한 포함한다. SPD-TNFSF 융합 단백질, SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드 및 바이러스는 암 및 감염성 질환, 더욱 일반적으로는 증식성 질환 및 TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애를 치료하기 위한 제약 조성물 및 그의 용도에 적합하다.
암은 외부 요인 (예를 들어, 담배, 감염성 생물, 식습관, 화학물질, 및 방사선) 및 내부 요인 (예를 들어, 유전적 돌연변이, 호르몬, 면역 병태, 및 대사로부터 발생하는 돌연변이) 둘 다에 의해 야기된다. 매년, 전세계적으로 1200만명을 초과하는 대상체에서 암이 진단된다. 선진국에서, 대략 5명 중 1명이 암으로 사망할 것이다. 방대한 수의 화학요법제가 존재하지만, 이들은 종종 효과적이지 않고, 특히 기존 치료에 대해 저항성인 환자의 경우, 여전히 효과적이고 덜 독성인 요법에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 있다.
효과적인 T-세포 반응은 기능적이고 최적인 선천적 및 적응 면역을 필요로 하며, 이는 특히 가용성 자극 및 표면 링커/수용체 결합을 통한 상이한 세포 사이의 다중적인 특이적 상호작용에 의존적이다. 이러한 상황에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응이 항종양 면역에서 결정적인 역할을 한다 (Ara et al., 2018, ImmunoTargets and therapy, 7, 55-61). 3가지 신호가 핵심 파라미터로서 언급되었다. 첫 번째 신호는 항원-특이적 T-세포 수용체 (TCR)가 항원-제시 세포 (APC) 상의 펩티드-로딩된 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에 결합하는 것에 관련된다. 두 번째 신호는 Ag-특이적 T 세포-APC 상호작용의 결과로 일어나는 공동자극 분자, 즉 B7-1 (CD80)/B7-2 (CD86) 및 CD28의 동원 (예를 들어, T-세포 CD28/APC CD80)을 통해 생성된다. 시토카인 분비에 의해 유도되는 세 번째 신호는 반응하는 이펙터 CTL을 강화하고 변형시킨다.
공동자극 분자로서의 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리는 면역 조절 및 항종양 면역에서 결정적인 역할을 한다 (Vinay et al., 2009, Cell Biol Int.; 33(4):453-465). TNFSF 구성원은 T 세포 성형 성질을 통해 면역 반응을 매개하는 것에 대해 널리 공지되어 있다. 이전의 조사에서 하기의 TNFSF 구성원을 확인하는 것이 허용되었다: CD40L, 4-1-BBL, OX40L, CD70, TNF, GITRL, LIGHT, FASL, TWEAK, APRIL, RANKL, TRAIL, CD30L, NGF, Baff, LTβ, LTα, LTαβ2, TL1A, TLA, EDA.
항원-특이적 T 세포에 의한 효율적인 항원 인식은 특수 항원-제시 세포 (APC), 예컨대 B 세포 및 수지상 세포 (DC)의 존재 및 기능성에 결정적으로 좌우된다. 예를 들어, CD40은 대식세포, B 세포 및 DC를 포함하는 많은 세포 유형 상에서 발현되지만, 그의 리간드인 CD40L은 대부분 활성화된 CD4+ T 세포 상에서 발현된다. CD40L은 활성화된 B, T 및 NK세포의 표면 상에서 발현되지만, 지방 세포 및 호염기구 상에서 또한 발현된다 (Richards et al. Hum Vaccin Immunother. 2020;16(2):377-387). CD4+ T 세포 상에서 발현된 CD40L과 DC 상에서 발현된 CD40 사이의 직접적인 상호작용은 공동-자극 분자의 상향-조절에 의해 DC가 CD8 T 세포 반응을 프라이밍하도록 "허가"한다. 이같은 CD40L-CD40 상호작용은 CD40 보유 세포의 활성화에 이르며, 그 후 이는 시토카인/케모카인 (TNFα, IL6...)에 더하여 부착 (ICAM), 공동-자극 (CD80/CD86), 및 제시 MHC I 및 II 분자를 발현한다. 종양 미세환경에서, 부착 분자 및 시토카인/케모카인은 함께 작용하여 면역 세포의 침윤 및 활성화를 유도하며, 이는 궁극적으로 종양 세포를 파괴하고, 종양을 면역억제성에서 면역적격성 미세환경으로 기울게 한다 (Richards et al. Hum Vaccin Immunother. 2020;16(2):377-387). 유사하게, TNFSF 수용체 4-1-BB, OX40, GITR 및 CD27은 T 세포 상에서 발현되고, APC, 림프구, 및 선천 면역 세포 상에서 발현된 리간드에 의해 공동자극에 반응한다. 이러한 다양한 연구는 증식성 질환 예컨대 암 및 TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애 예컨대 감염성 질환을 치료하기 위해 TNFSF 리간드를 개발하는 것에 대한 관심을 강조하였다.
최근 몇년 동안, TNF 슈퍼패밀리 리간드가 백신 및 면역요법의 개발을 위한 매력적인 후보, 더욱 특히 예컨대 신규한 분자성 아주반트의 디자인을 위한 대안적인 접근법으로서 떠올랐다 (Gupta et al., 2013, Immunol Res., 57(1-3):303-10). 아주반트화는 특정 질환에 대해 보호할 수 있는 다수의 CD8 T 세포의 신속한 유도에 초점을 두면서 선천 및 적응 면역 반응의 강도, 품질, 및 기능성을 변화시킬 수 있다 (Lauterbach et al., 2013, Front Immunol., 27;4:251). 암 및 감염성 질환 예컨대 HIV/AIDS, 에볼라(Ebola) 및 마르부르크(Marburg) 출혈열, 말라리아 및 C형 간염에 대한 예방적 및 치료적 백신의 개발을 위한 강력한 항원-특이적 CD8T 세포 반응을 신속하게 유도하는 CD40L-아주반트화된 바이러스의 잠재력이 재조합 MVA-CD40L에서 이미 실연되었다 (Lauterbach et al., 2013, Front Immunol. 2013 Aug 27;4:251). 아데노바이러스를 CD40L로 아암화시키는 접근법이 종양 치료를 위한 이로운 면역학적 반응을 자극하기 위해 또한 개발되었다 (Pesonen et al., 2012, Cancer Res., 72(7)). 동일한 방식으로, 강건한 T-세포 반응을 제공함으로써, 재조합 4-1-BBL 아데노바이러스는 인간 기억 CD8 T 세포에 대한 유망한 아주반트이고, 항바이러스 치료 전략에서 이로울 것임을 시사한다 (Bukczynski et al., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A.;101(5):1291-1296).
통상의 기술자는 일반적으로 TNFSF 리간드는 반응 세포를 충분히 활성화하기 위해 동종-다량체화될 필요가 있다는 것을 또한 인지한다. 구조적으로 또한 잘 정의되어 있는 TNFSF 신호전달은 적절한 수용체 클러스터링 및 적어도 삼량체화를 필요로 한다. TNFSF 리간드는 자가-조립에 의해 삼량체성 단위로 존재하는 한편, 수용체는 일반적으로 세포 표면 상에서 분리된다 (Richards et al. 2020, Hum Vaccin Immunother., 16(2):377-387). 다량체성 TNFSF 리간드와 그의 상응하는 수용체 사이의 상호작용은 정확한 수용체 클러스터링에 이르고, 세포 내로의 신호 전송을 일으키기 위한 필요조건이다 (Kucka et al., 2020, Front Cell Dev Biol., 8:615141). 이전에 제시된 바와 같이, 고차수 올리고머성 TNFSF 리간드, 특히 십이량체성 TNFSF 리간드는 신호전달에서 단일한 삼량체성 TNFSF 리간드보다 더욱 효과적이다 (Haswell et al. 2001, Eur J Immunol., 31(10):3094-100).
면역 반응, 더욱 구체적으로는 종양 반응에서의 TNFSF 리간드의 결정적인 역할로 인해, 계면활성제-단백질 D 예컨대 콜렉틴 패밀리 구성원과의 융합과 같이, 그의 효능제 성질을 강화하기 위해 다양한 전략이 탐구되었다.
리간드의 결합력을 증가시키기 위한 TNF 시토카인 및 이량체화 또는 다량체화 도메인을 포함하는 최초의 재조합 융합 단백질이 특허 출원 WO01/49866에 의해 개시되었다. 그러나, TNF 단백질의 다량체화는 다량체화 도메인의 분자량으로 인해 다소 비효율적이었다. WO01/42298은 콜렉틴, 더욱 특히 신호 서열, 콜라겐 도메인 및 코일드-코일 넥 도메인을 포함하는 SPD와 함께 TNFSF, 더욱 특히 CD40L 및 RANKLE/TRANCE 구성원을 발현하도록 안정적인 생물활성 융합 단백질을 구축하는 방법을 개시한다. 생성된 융합 단백질의 대형 크기는 이를 종양 내로 확산될 가능성이 낮게 만듦으로써 그의 잠재적인 활성을 제한한다. 이러한 성질은 그의 소거를 방지하는데 특히 유용할 수 있지만, 이러한 융합 단백질은 CD40 효능제 활성이 제한된다.
WO2009/007120 또한 콜렉틴 삼량체화 도메인에 융합된 TNFSF 시토카인을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 이러한 융합 단백질이 다량체성 단백질을 형성할 수 있지만, 3개 초과의 단량체성 단위를 자가-조립할 수 없어서 삼량체성 형태를 형성하는 것이 제한되고, 따라서 그의 잠재적인 효능제 활성을 감소시킨다.
TNFSF 수용체는 정상 세포에서 편재성으로 발현되고, 그 결과 TNFSF 리간드는 결합 선택성이 없거나 제한될 뿐이고, 상당한 독성을 갖는다. TNFSF 리간드 축은 암 면역요법에서 여전히 큰 관심을 받지만, 전신 TNFSF 치료는 중증 용량-제한 독성과 연관되고, 최소의 임상 활성을 산출한다 (Bremer et al., 2013, ISRN Oncol.; 2013:371854). CD40 효능제의 최초의 임상 연구에서, 대다수의 환자가 발열, 경축 및 오한을 일으킨 시토카인 방출 증후군을 나타냈다 (Vonderheide et al., 2007, J Clin Oncol., 25(7):876-883). CD40 효능제로 간독성의 증거도 통상적으로 관찰된다 (Beatty et al., 2017,　Expert Rev Anticancer Ther.;17(2):175-186). 따라서, 종양 미세환경에서의 TNFSF-매개 T-세포 자극의 종양-제한 활성화 및 선택적 강화가 계속되고 있다.
기술적 과제
함께 또는 별개로 작용하여 암 발달을 개시하거나 촉진할 수 있는 다수의 인과적 요인으로 인해 암이 계속해서 수년 동안 심각한 세계적 건강 위협일 것임을 예상할 수 있다. 또한, 악성이고, 특히 전이성인 종양은 종종 통상적인 요법에 대해 저항성이어서, 일부 암의 상당한 이환율을 설명한다.
따라서, 암, 더욱 일반적으로는 증식성 질환 및 TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애의 예방 및 치료를 개선하기 위해, 더욱 효과적인 접근법을 개발하는 것이 중요하게 요구된다. TNFSF 시토카인의 다량체성 복합체는 재조합 단량체성 형태로부터 제조하기가 어려운 것으로 공지되어 있지만, 본 발명자들은 SPD-TNFSF 융합 단백질을 생성시켰으며, 이는 리간드의 수용체의 최적의 클러스터링에 의해, 그리고 세포 환경과 독립적으로 효율적인 다량체화 성질을 제공하고 리간드의 효능성 성질을 강화한다. 최적의 형식은 분자 크기가 비교적 작아서, 종양 내로의 그의 확산 및 신장 소거에 의한 그의 효율적인 제거를 허용한다. 이러한 비교적 작은 크기는 제한된 용량의 벡터 (예를 들어, 일부 바이러스)에 삽입하는 경우에 또한 유리하다. 실제로, 더 작은 치료제에 대해 더 큰 것보다 조직 분포 또는 암 침투가 더 양호하다는 것이 널리 공지되어 있다 (Li et al. MAbs. 2016;8(1):113-9). 관련 기술분야의 통상의 기술자 따라서 이같은 분자의 생체분포가 강화된다는 것을 잘 알 것이다.
전신 TNFSF 수용체 활성화의 제한된 결합 선택성 및 유해한 표적-이탈 독성으로 인해, 종양 세포 및 면역 세포 상에서의 바이러스 복제 및 TNFSF 자극의 가능한 상승작용성 작용에 의해 T 세포 반응을 개선하는 신규 표적화 SPD-TNFSF 융합 단백질을 개발하는 것이 또한 요구된다.
본 발명의 기타 및 추가 측면, 특색 및 장점이 본 발명의 현재 바람직한 실시양태의 하기 설명으로부터 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 개시 목적으로 제공된다.
도 1A 및 1B는 감염된/형질감염된 HeLa 세포에 의한 SPD-TNFSF 구축 (pTG19965, pTG19966, pTG19967, pTG19968, pTG19969)의 발현 수준을 제시한다. 상이한 SPD-TNFSF 분자를 함유하는 정화된 상청액을 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 상에 로딩하였다. 단백질을 PDVF 막으로 옮기고, 면역검출을 위해 HRP-접합된 항-FLAG-태그와 혼성화시켰다. 블롯 A: 상이한 SPD-CD40L 구축. 블롯 B: 상이한 부피로 로딩된 pTG19967 구축물. 화살촉은 삼량체보다 큰 올리고머를 지시한다.
도 2는 백시니아 바이러스로 감염된 후, SPD-TNFSF 구축 (pTG19965, pTG19966, pTG19967, pTG19968, pTG19969)을 코딩하고 pH5.R 프로모터 (즉 폭스바이러스 프로모터)의 제어 하에 있는 카세트를 보유하는 상이한 플라스미드로 형질감염된 HeLa 세포의 배양 배지의 CD40L 효능제 활성을 제시한다. CD40 유도성 프로모터의 제어 하에 리포터 효소 SEAP를 발현하도록 변형된 HEK 세포를 SPD-TNFSF 구축을 함유하는 정화된 상청액의 상이한 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 20-24시간 인큐베이션 후 배양 배지 내의 SEAP 효소 활성을 측정하였다. 음성 대조군은 비-감염된 세포 (언급된 배지) 또는 트랜스진이 없는 플라스미드 (pTG19333) 또는 비관련된 FLAG-태그부착된 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pTG19274)로 감염 및 형질감염된 세포였다. 결과는 SEAP 활성 대 1/배양 배지 희석률로서, 그리고 2회 측정의 평균 및 표준 편차로서 보고된다.
도 3은 백시니아 바이러스로 감염된 후, SPD-TNFSF 구축 (pTG19325, pTG19344, pTG19965, pTG19966, pTG19967, pTG19968, pTG19969)을 코딩하고 pH5.R 프로모터 (즉 폭스바이러스 프로모터)의 제어 하에 있는 카세트를 보유하는 상이한 플라스미드로 형질감염된 HeLa 세포의 배양 배지의 CD40 결합 활성을 제시한다. CD40-Fc를 96-웰 플레이트 상에 코팅하고, TNFSF 구축을 함유하는 정화된 상청액의 상이한 희석물을 적용하였다. 결합된 특이적 단백질을 비-차단 항-CD40L 모노클로날 항체에 이어서 HRP-접합된 항-IgG를 사용하여 검출하였다. 음성 대조군은 비관련된 FLAG-태그부착된 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pTG19274)로 감염 및 형질감염된 세포였다. 결과는 OD 450 nm 대 1/배양 배지 희석률로서, 그리고 2회 측정의 평균 및 표준 편차로서 또는 단일 측정으로서 보고된다.
도 4는 백시니아 바이러스로 감염된 후, SPD-TNFSF 구축 (pTG19965, pTG19966, pTG19968, pTG20038 내지 pTG20042)을 코딩하고 pH5.R 프로모터 (즉 폭스바이러스 프로모터)의 제어 하에 있는 카세트를 보유하는 상이한 플라스미드로 형질감염된 HeLa 세포의 배양 배지의 CD40 결합 활성을 제시한다. CD40-Fc를 96-웰 플레이트 상에 코팅하고, TNFSF 구축을 함유하는 정화된 상청액의 상이한 희석물을 적용하였다. 결합된 특이적 단백질을 비-차단 항-CD40L 모노클로날 항체에 이어서 HRP-접합된 항-IgG를 사용하여 검출하였다. 음성 대조군은 형질감염 없이 감염된 세포 (VVTG18058)였다. 결과는 OD 450 nm 대 1/배양 배지 희석률로서 보고된다.
도 5는 백시니아 바이러스로 감염된 후, SPD-TNFSF 구축 (pTG19965, pTG19966, pTG19968, pTG20038 내지 pTG20042)을 코딩하고 pH5.R 프로모터 (즉 폭스바이러스 프로모터)의 제어 하에 있는 카세트를 보유하는 상이한 플라스미드로 형질감염된 HeLa 세포의 배양 배지의 CD40L 효능제 활성을 제시한다. CD40 유도성 프로모터의 제어 하에 리포터 효소 SEAP를 발현하도록 변형된 HEK 세포를 SPD-TNFSF 구축을 함유하는 정화된 상청액의 상이한 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 20-24시간 인큐베이션 후 배양 배지 내의 SEAP 효소 활성을 측정하였다. 음성 대조군은 형질감염 없이 감염된 세포 (VVTG18058) 또는 비-감염된 세포 (언급된 배지)였다. 결과는 SEAP 활성 대 1/배양 배지 희석률로서 보고된다.
도 6은 도 4에 기술된 바와 같이 측정된 COPTG19967, COPTG19968, 및 COPTG19969로 감염된 HeLa 세포의 배양 배지의 CD40 결합 활성을 제시한다. 음성 대조군은 VVTG18058로 감염된 세포였다. 결과는 OD 450 nm 대 1/배양 배지 희석률로서 보고된다.
도 7은 도 3에 기술된 바와 같이 측정된 COPTG19967, COPTG19968, 및 COPTG19969로 감염된 HeLa 세포의 배양 배지의 CD40 효능제 활성을 제시한다. 음성 대조군은 VVTG18058로 감염된 세포 또는 비-감염된 세포의 배양 배지 (언급된 배지)였다. 결과는 SEAP 활성 대 1/배양 배지 희석률로서 보고된다.
도 8은 감염된/형질감염된 HeLa 세포에 의한 4-1BBL 구축 (4-1BBL 엑토도메인 단독을 코딩하는 pTG20032 및 본 발명에 따른 SPD-4-1BBL 융합 단백질을 코딩하는 pTG20033)의 발현 수준을 제시한다. 상이한 구축물을 함유하는 정화된 상청액을 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 상에 로딩하였다. 단백질을 PDVF 막으로 옮기고, 면역검출을 위해 HRP-접합된 항-FLAG-태그 모노클로날 항체와 혼성화시켰다. 음성 대조군은 비관련된 FLAG-태그부착된 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pTG19274)로 감염된 세포였다.
도 9는 프로메가(Promega) 4-1BB 리포터 세포를 사용함으로써 4-1BBL 구축 (4-1BBL 엑토도메인 단독을 코딩하는 pTG20032 및 본 발명에 따른 SPD-4-1BBL 융합 단백질을 코딩하는 pTG20033)로 감염된/형질감염된 HeLa 세포의 배양 배지의 4-1BB 효능제 활성을 제시한다. 음성 대조군은 비관련된 FLAG-태그부착된 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pTG19274)로 감염된 세포였다.
발명의 개요
본 발명은 N-말단 도메인, N-말단 도메인과 C-말단 위치 사이의 계면활성제 단백질-D (SPD)의 코일드-코일 넥 도메인, 및 C-말단 위치 내의 TNF-슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하거나 또는 그로 이루어진 SPD-TNFSF 융합 단백질에 관한 것이다.
한 실시양태에서, SPD-TNFSF 융합 단백질은 N-말단 도메인, N-말단 도메인과 C-말단 위치 사이의 계면활성제 단백질-D (SPD)의 코일드-코일 넥 도메인, 및 C-말단 위치 내의 TNF-슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 N-말단 도메인 및 SPD의 코일드-코일 넥 도메인은 사이의 아미노산 잔기 없이 직접적으로 융합된다. 한 실시양태에서, 상기 SPD-TNFSF 융합 단백질 내의 N-말단 도메인 및 SPD의 코일드-코일 넥 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 54의 서열로 이루어진다.
한 실시양태에서, SPD-TNFSF 융합 단백질은 N-말단 도메인과 SPD의 코일드-코일 넥 도메인 사이에 콜라겐 도메인을 추가로 포함한다. 상기 콜라겐 도메인은 1 내지 40개 (GXX) 반복물, 바람직하게는 3 내지 30개 (GXX) 반복물, 바람직하게는 6 내지 20개 (GXX) 반복물, 보다 바람직하게는 12개 (GXX) 반복물을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 X는 아미노산이고, G는 글리신 아미노산이다.
각각의 반복물에서 X는 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들어, 반복물이 GAA일 수 있거나 또는 반복물이 GTA일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로 또는 조합되어, SPD-TNFSF 융합 단백질은 코일드-코일 넥 도메인과 TNF-슈퍼패밀리 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 상기 링커는 글리신/세린 링커이고, 4-20개 아미노산, 바람직하게는 8-16개, 보다 바람직하게는 12개 아미노산의 길이를 갖는다.
TNFSF 리간드는 바람직하게는 CD40L, 4-1-BBL, OX40L, CD70, TNF, GITRL, LIGHT, FASL, TWEAK, APRIL, RANKL, TRAIL, CD30L, NGF, Baff, LTβ, LTα, LTαβ2, TL1A, TLA, EDA, 보다 바람직하게는 CD40L 또는 4-1-BBL로부터 선택된다.
N-말단 도메인은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖거나, 또는 는 100% 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, SPD-TNFSF 융합 단백질은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10 또는 서열식별번호: 11로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
추가로 본 발명은 3개의 SPD-TNFSF 융합 단백질을 포함하는 삼량체성 융합 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 복수의 삼량체성 융합 단백질을 포함하고 육량체, 십이량체, 십팔량체 또는 고차수 올리고머, 바람직하게는 육량체, 보다 바람직하게는 십이량체를 형성하는 다량체성 융합 단백질에 관한 것이다.
또한 본 발명은 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
추가로 본 발명은 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 예컨대 mRNA, 플라스미드 또는 바이러스에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 바이러스는 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 모르빌리바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 홍역 바이러스, 포말상 바이러스, 알파 바이러스, 렌티바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신드비스 바이러스, 랍도바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스, 파르보바이러스 또는 그의 키메라로 이루어진 군으로부터 선택된 종양용해성 바이러스이고, 폭스바이러스가 특히 바람직하다. 추가 실시양태에서, 상기 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스 속에 속하며, 바람직하게는 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스 바이러스 및 엑트로멜리아 바이러스 또는 그의 키메라로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 백시니아 바이러스, 특히 엘스트리, 와이어쓰, 코펜하겐, 리스터, 티안 티안 및 웨스턴 리저브 균주의 군으로부터 선택된 백시니아 바이러스가 특히 바람직하다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폭스바이러스는 점액종 바이러스, 토끼 섬유종 바이러스 및 다람쥐 섬유종 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 레포리폭스바이러스 속에 속하고, 점액종 바이러스가 특히 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 종양용해성 폭스바이러스는 J2R 바이러스 유전자에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 티미딘 키나제 (TK) 활성이 결손된 변형된 폭스바이러스이다. 대안적으로 또는 조합되어, 종양용해성 폭스바이러스는 바이러스 I4L 및/또는 F4L 유전자(들)에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되어 리보뉴클레오티드 리덕타제 (RR) 활성이 결손된다.
대안적으로 또는 조합되어, 변형된 폭스바이러스는 M2L 로커스에서 추가로 변형될 수 있어 (바이러스 m2 단백질의 발현 억제에 이르는 변형이 바람직함), m2 기능이 결손된 변형된 폭스바이러스 (m2-결손 폭스바이러스)가 초래된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 바이러스는 비-종양용해성 바이러스, 바람직하게는 가성우두 바이러스 (PCPV), 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주 (NYVAC), 돈두 바이러스 (SWPV), 계두 바이러스 (FPV) 또는 그의 키메라로 이루어진 군으로부터 선택된 폭스바이러스이다.
추가로 본 발명은 상기 바이러스를 생산하는 방법으로서, a) 생산자 세포를 제조하는 단계, b) 제조된 생산자 세포를 바이러스로 형질감염시키거나 또는 감염시키는 단계, c) 형질감염되거나 또는 감염된 생산자 세포를 바이러스 생산을 허용하도록 적합한 조건 하에 배양하는 단계, d) 생산된 바이러스를 상기 생산된 세포의 배양물로부터 회수하는 단계 및 임의적으로 e) 상기 회수된 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드 또는 바이러스를 포함하는 세포에 관한 것이다.
또한 본 발명은 의약에서, 바람직하게는 증식성 질환 예컨대 암 및 TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애 예컨대 감염성 질환, 염증성 질환, 대사 질환, 자가면역 질환, 퇴행성 질환, 아폽토시스-연관 질환 및 이식 거부, 보다 바람직하게는 증식성 질환의 치료에서, 보다 더 바람직하게는 암의 치료에서 사용하기 위한, SPD-TNFSF 융합 단백질, 삼량체성 융합 단백질, 다량체성 융합 단백질, 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드, 바이러스 또는 세포에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 암의 치료에서 사용하기에 효과적인 하나 이상의 화학요법 약물 또는 면역요법 약품과 조합된, SPD-TNFSF 융합 단백질, 삼량체성 융합 단백질, 다량체성 융합 단백질, 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드, 바이러스 또는 세포에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드, 바이러스 또는 세포 및 임의적으로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 또는 그로 이루어진 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 효과적인 화학요법 약물 또는 면역요법 약품을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 암의 치료에 사용된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구 경로를 통해, 보다 바람직하게는 정맥내, 피하 또는 근육내 경로를 통해, 보다 더 바람직하게는 정맥내 경로를 통해 투여된다.
또한 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 뉴클레오티드, mRNA, 플라스미드, 바이러스, 세포 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 SPD-TNFSF 융합 단백질, 및 바이러스의 게놈에 삽입된 하나 이상의 SPD-TNFSF 융합 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 분자(들)를 포함하는 바이러스에 관한 것이다.
정의
전체 출원에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수형 용어는, 맥락에서 명확하게 달리 지시되지 않는 한, "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상" 또는 "복수"의 언급된 성분 또는 단계를 의미한다는 의미로 사용된다. 예를 들어, 용어 "세포"는 그의 혼합물을 포함한 복수의 세포를 포함한다.
용어 "하나 이상"은 하나 또는 하나 초과의 수 (예를 들어 2, 3, 4, 5 등)를 지칭한다.
용어 "및/또는"은, 본원에서 사용된 어디서든, "및", "또는", 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소 모두 또는 그의 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약" 또는 "대략"은 소정의 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 생성물, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용된 경우에, 용어 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함한다"), "갖는" (및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 "가지다" 및 "갖는다"), "수반하는" (및 수반하는의 임의의 형태, 예컨대 "수반한다" 및 "수반하다") 또는 "함유하는" (및 함유하는의 임의의 형태, 예컨대 "함유한다" 및 "함유하다")는 개방형이고, 열거되지 않은 추가적인 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드는 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 일부일 수 있는 경우에 그 아미노산 서열을 "포함한다". 이같은 폴리펩티드는 수백개까지의 추가적인 아미노산 잔기를 가질 수 있다. "로 본질적으로 이루어진"은 임의의 본질적인 유의성을 갖는 다른 성분 또는 단계를 배제함을 의미한다. 따라서, 열거된 성분으로 본질적으로 이루어진 조성물은 미량의 오염물질 및 제약상 허용되는 담체를 배제하지 않을 것이다. 아미노산 서열에 최종적으로 소수일 뿐인 추가적인 아미노산 잔기가 존재하는 경우, 폴리펩티드는 이같은 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다". "이루어진"은 다른 성분 또는 단계의 미량을 초과하는 요소를 배제함을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드가 열거된 아미노산 서열 이외의 임의의 아미노산을 함유하지 않는 경우에 그 아미노산 서열로 "이루어진다".
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 결합된 적어도 9개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 천연 발생 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있으며, 이는 비-아미노산에 의해 개재될 수 있다. 일반적인 표시로서, 아미노산 중합체가 50개 초과의 아미노산 잔기이면, 이는 바람직하게는 "폴리펩티드" 또는 "단백질"로 지칭되는 반면, 50개 이하의 아미노산 길이이면, 이는 "펩티드"로 지칭된다,
본 발명의 맥락에서, 용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호교환가능하게 사용되고, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) (예를 들어 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드, 벡터, 바이러스 게놈, 단리된 DNA, 프로브, 프라이머 및 그의 임의의 혼합물) 또는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) (예를 들어 mRNA, 안티센스 RNA, siRNA) 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보뉴클레오티드의 임의의 길이의 중합체를 정의한다. 이는 단일 또는 이중-가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성, 변형된 또는 비변형된 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유사체" 또는 "변이체"는 천연 대응물에 대해 하나 이상의 변형(들)을 나타내는 분자 (폴리펩티드 또는 핵산)를 지칭한다. 하나 이상의 뉴클레오티드/아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하여 임의의 변형(들)이 구상될 수 있다. 천연 대응물의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98%의 동일성 정도를 보유하는 유사체가 바람직하다.
일반적인 방식으로, 용어 "동일성"은 2개의 폴리펩티드 또는 핵산 서열 사이의 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 상응을 지칭한다. 2개의 서열 사이의 동일성의 백분율은 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이고, 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 예를 들어 NCBI에서 입수가능한 Blast 프로그램 또는 문헌 [Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9]에서의 ALIGN과 같이, 아미노산 서열 사이의 동일성의 백분율을 결정하기 위해 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘이 관련 기술분야에서 입수가능하다. 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 프로그램 또한 특수 데이터 베이스에서 입수가능하다 (예를 들어 진뱅크(Genbank), 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램). 예시 목적으로, "적어도 80%의 동일성"은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 제거된 (즉, 천연적으로 회합되거나 또는 천연에서 발견되는 적어도 하나의 다른 성분(들)로부터 분리된) 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 등을 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 천연에서 그와 회합되는 서열로부터 분리될 때 (예를 들어, 게놈으로부터 해리될 때) 단리되지만, 이종 서열과 회합될 수 있다.
용어 "로부터 수득된", "유래하는" 또는 "유래하다"는 성분 (예를 들어 폴리펩티드, 핵산 분자)의 기원을 확인하도록 사용되지만, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 수단에 의한 것일 수 있는, 성분이 제조되는 방법을 제한하도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 조직, 기관 또는 단리된 세포에서의 특정한 구성에 관하여 어떠한 제한도 없이 광범위하게 이해되어야 한다. 이같은 세포는 독특한 유형의 세포, 또는 상이한 유형의 세포 예컨대 배양된 세포주, 1차 세포 및 분열 세포의 군일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "숙주 세포"는 원핵생물 세포, 저급 진핵생물 세포 예컨대 효모, 및 다른 진핵생물 세포 예컨대 곤충 세포, 식물 및 포유동물 (예를 들어 인간 또는 비-인간) 세포 뿐만 아니라 본 발명에서 사용하기 위한 바이러스 (종양용해성 또는 비-종양용해성 바이러스) 및/또는 융합 단백질을 생산할 수 있는 세포를 포함한다. 이러한 용어는 본원에 기술된 벡터의 수용자일 수 있거나 이러한 수용자인 세포 뿐만 아니라 이같은 세포의 자손을 또한 포함한다.
용어 "바이러스", "바이러스 입자", "바이러스 벡터" 및 "비리온"은 상호교환가능하게 사용되고, 야생형 바이러스 게놈의 적어도 하나의 요소를 포함하는 비히클을 의미하는 것으로 광범위하게 이해되어야 하며, 바이러스 입자 내로 또는 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. 바이러스 입자가 핵산 (즉, 바이러스 게놈)을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있지만, 바이러스가 바이러스 입자 (또는 비리온) 내로 패키징된 DNA 또는 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 감염성 (즉, 숙주 세포 또는 대상체를 감염시킬 수 있고 이에 진입할 수 있음)인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 바이러스는 DNA 게놈, 가장 바람직하게는 이중-가닥 DNA 게놈을 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, "바이러스"는 야생형 바이러스 및 조작된 (변형된) 바이러스를 포함한다. 변형(들)은 내인성 바이러스 유전자 (예를 들어 코딩 및/또는 조절 서열) 내에 및/또는 유전자간 영역 내에 있을 수 있다. 또한, 변형(들)은 침묵성이거나 또는 그렇지 않을 수 있다 (예를 들어, 변형된 바이러스 유전자 생성물을 초래함). 변형(들)은 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방식으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 포괄되는 변형은, 예를 들어, 이같은 변형이 없는 바이러스에 비교하여 바이러스의 발병력, 독성, 병원성 또는 복제에 영향을 미치지만, 적어도 허용성인 세포의 감염 및 생산을 완전히 손상시키지 않는다.
용어 "종양용해성 바이러스"는 천연 발생이거나, 조작되거나 또는 다른 방식으로 변형된 임의의 바이러스를 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양용해성 바이러스"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 분열 세포의 성장을 늦추고/거나 이를 용해시키는 것을 목표로 분열 세포 (예를 들어, 증식성 세포 예컨대 암 세포)에서 선택적으로 복제될 수 있으면서, 비-분열 세포 (예를 들어, 1차 세포)에서는 복제를 나타내지 않거나 최소의 복제를 나타내는 바이러스를 지칭한다. 전형적으로, 종양용해성 바이러스는 바이러스 입자 (또는 비리온) 내로 패키징된 바이러스 게놈을 함유하고, 감염성이다 (즉, 숙주 세포 또는 대상체를 감염시킬 수 있고, 숙주 세포 또는 대상체 내로 진입할 수 있음). 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 용어는 DNA 또는 RNA 벡터 (해당 바이러스에 좌우됨) 뿐만 아니라 그의 생성된 바이러스 입자를 포괄한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라", "바이러스 키메라" 또는 "바이러스의 키메라"는 여러 별개의 바이러스 균주 사이의 상동 재조합에 의해 수득된 바이러스를 지칭한다. 상이한 폭스바이러스로부터의 게놈을 혼합함으로써 수득된 여러 키메라가 기술되어 있고, 통상의 기술자에게 입수가능하다 (예컨대 ORF 및 가성우두 바이러스로부터 수득된 CF189 키메라 (Choi et al., Novel chimeric parapoxvirus CF189 as an oncolytic immunotherapy in triple-negative breast cancer. Surgery Volume 163, Issue 2,　February 2018, Pages 336-342); VV, 우두, 및 토끼 두창의 다중 균주로부터 수득된 CF33 키메라 (Chaurasiya, S. et al., 2020, Cancer Gene Ther　27,　125-135)).
용어 "비-종양용해성 바이러스"는 종양용해성 바이러스로 정의되지 않는 임의의 바이러스를 포괄한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료" (및 치료의 임의의 형태 예컨대 "치료하는", "치료하다")는 최종적으로 통상적인 치료 양식과 회합된, 예방 (예를 들어, 치료될 병리학적 병태에 걸릴 위험에 있는 대상체에서의 예방적 수단) 및/또는 요법 (예를 들어, 병리학적 병태에 걸린 것으로 진단된 대상체에서)을 포괄한다. 치료의 결과는 표적화된 병리학적 병태의 진행을 늦추거나, 치유하거나, 호전시키거나, 또는 제어하는 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기술된 바와 같은 그의 조합물의 투여 후, 대상체가 그의 임상 상태의 관찰가능한 개선을 나타낸다면, 대상체가 암에 대해 성공적으로 치료된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "투여하는" (또는 투여의 임의의 형태 예컨대 "투여된")은 대상체에게 치료제 예컨대 본원에 기술된 바이러스를 전달하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "증식성 질환"은 암 및 일부 심혈관 질환 (혈관벽의 평활근 세포의 증식으로부터 초래되는 재협착 등)을 포함하는, 제어되지 않은 세포 성장 및 확산으로부터 초래되는 임의의 질환 또는 병태를 포괄한다. 용어 "암"은 "종양", "악성종양", "신생물" 등의 용어 중 임의의 것과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 이러한 용어는 임의의 유형의 조직, 기관 또는 세포, 임의의 단계의 악성 종양 (예를 들어, 병변전부터 IV기까지)를 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "TNF 시토카인 기능장애와 연관된 장애"는 TNF 신호전달 기능장애를 초래하는 임의의 질환, 장애 또는 병태를 포괄한다.
일반적으로 용어 "대상체"는 임의의 본 발명의 생성물 및 방법이 필요하거나 이로울 수 있는 생물을 지칭한다. 전형적으로, 생물은 포유동물, 특히 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 및 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물이다. 바람직하게는, 대상체는 증식성 질환 예컨대 암 또는 TNF 시토카인 기능장애와 연관된 장애에 걸린 것으로 진단되었거나 이에 걸릴 위험에 있는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 생물을 지칭할 때 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 남성 및 여성을 포괄한다. 치료될 대상체는 신생아, 유아, 청소년, 성인 또는 노인일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조합" 또는 "회합"은 다양한 성분 (예를 들어, 융합 단백질 또는 바이러스 및 항암 요법에 효과적인 하나 이상의 물질)의 임의의 가능한 배열을 지칭한다. 이같은 배열은 상기 성분의 혼합물 뿐만 아니라 동반 또는 순차적 투여를 위한 분리된 조합물을 포함한다. 본 발명은 동일한 몰 농도의 각각의 성분을 포함하는 조합물 뿐만 아니라 매우 상이한 농도의 조합물을 포괄한다. 조합물의 각각의 성분의 최적의 농도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "화학요법 약물" 또는 "면역요법 약품"은 대상체에게 적절하게 전달되었을 때, 특이적 또는 비-특이적, 체액성 또는 세포성이든 아니든, 면역 반응을 유도하거나 활성화시킬 것으로 예상되는 하나 이상의 항원(들)을 포함하는 약품을 지칭한다.
SPD-TNFSF 융합 단백질
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 2개 이상의 폴리펩티드의 단일 단백질 쇄에서의 공유결합 연결을 지칭하며, 이는 유전적 수단에 의해, 즉, 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편 각각을 코딩하는 핵산 분자를 인-프레임으로 융합함으로써 수행된다. "인-프레임으로 융합되는"은 융합된 코딩 서열의 발현으로 원래의 폴리펩티드 각각으로부터 유래된 기능적 성질을 갖는 단일 폴리펩티드가 초래된다는 것을 의미한다. 융합은 직접적 (즉, 사이에 추가적인 아미노산 잔기가 없음) 또는 간접적 (예를 들어, 융합된 폴리펩티드 사이의 링커를 통함)일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "SPD" 또는 "계면활성제-단백질 D"는 천연 계면활성제-단백질 D 또는 그의 유도체의 기능적 단편을 지칭한다. SPD는 바람직하게는 포유동물 기원 예컨대 인간, 마우스, 토끼, 비-인간 영장류 또는 돼지 기원, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 영장류 기원, 보다 바람직하게는 인간 기원의 것이다.
본 발명의 맥락에서, SPD-TNFSF 융합 단백질은 계면활성제-단백질 D (SPD) 및 TNFSF 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인의 융합을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 본 발명에서, SPD는 N-말단 도메인 및 코일드-코일 넥 도메인을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 한 실시양태에서, N-말단 도메인 및 코일드-코일 넥 도메인은 사이에 아미노산 잔기 없이 직접적으로 융합된다. 한 실시양태에서, 상기 SPD-TNFSF 융합 단백질 내의 N-말단 도메인 및 SPD의 코일드-코일 넥 도메인은 서열식별번호: 54의 서열로 이루어진다.
본 발명의 N-말단 도메인은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열, 특히 천연 인간 SPD (서열식별번호: 22)의 아미노산 21-45와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 100%의 동일성을 갖는다.
본 발명의 코일드-코일 넥 도메인은 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열, 특히 천연 인간 SPD (서열식별번호: 22)의 아미노산 223-252와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
TNFSF 리간드는 CD40L, 4-1-BBL, OX40L, CD70, TNF, GITRL, LIGHT, FASL, TWEAK, APRIL, RANKL, TRAIL, CD30L, NGF, Baff, LTβ, LTα, LTαβ2, TL1A, TLA, EDA 또는 그의 수용체 결합을 비제한적으로 포함하는 TNF 슈퍼패밀리 구성원으로부터 선택될 수 있다. TNFSF 리간드는 바람직하게는 포유동물 기원 예컨대 인간, 마우스, 토끼, 비-인간 영장류 또는 돼지 기원, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 영장류 기원, 보다 바람직하게는 인간 기원의 것이다.
바람직한 실시양태에서, TNFSF의 구성원 또는 그의 수용체 결합 도메인은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00001
CD40L, 4-1BBL, Baff, APRIL, EDA, GITRL, OX40L, CD70, TL1A, LIGHT, LTαβ2, RANKL, TWEAK, FASL, TRAIL, TNF 및 LTα 또는 그의 수용체 결합 도메인;
Figure pct00002
카테고리 II TNFSF 구성원, 바람직하게는 CD40L, 4-1BBL, Baff, APRIL, EDA, OX40L, CD70, TWEAK, FASL, TRAIL, 및 TNF 또는 그의 수용체 결합 도메인;
Figure pct00003
면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원, 바람직하게는 CD40L, 4-1BBL, GITRL, OX40L, CD70, TL1A 또는 그의 수용체 결합 도메인;
Figure pct00004
면역 세포 활성화에서 수반되는 카테고리 II TNFSF 구성원, 바람직하게는 CD40L, 4-1BBL, OX40L, CD70 또는 그의 수용체 결합 도메인; 또는
Figure pct00005
CD40L, 4-1BBL 또는 그의 수용체 결합 도메인.
가장 바람직하게는, TNFSF의 구성원 또는 그의 수용체 결합 도메인은 CD40L 또는 그의 수용체 결합 도메인으로부터 선택된다.
TNFSF 구성원
TNFSF는 림프 조직 발달을 구성하고, 림프구 활성화를 공동-자극하며, 림프구 생존 및 기능을 증가시키거나 세포 사멸을 유도할 수 있는 다수의 구조적으로 관련된 구성원 (리간드로도 지칭됨)을 포함하며, 이는 모두 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 (TNFRSF)를 형성하는 이들의 동족 수용체(들)에 결합하는 것을 통해서이다.
TNFRSF는 TNFSF의 가용성 리간드 삼량체에 의해 활성화되는 이들의 능력에 따라, 2개의 별개의 카테고리로 나뉠 수 있다 (Kucka K, 2021, Front Cell Dev Biol. 11;8:615141).
TNFRSF의 카테고리 I 수용체는 가용성 리간드 삼량체에 의해 강건하게 활성화되고, BaffR (리간드 = Baff), DR3 (리간드 = TL1A), GITR (리간드 = GITRL), LTβR (리간드 = LTαβ2 또는 LIGHT), TNFR1 (리간드 = TNF 또는 LTα)을 포함한다.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체는 고친화력 결합에도 불구하고 가용성 리간드 삼량체에 의해 적절하게 활성화되지 못하고, CD40L, 4-1BBL, Baff, APRIL, EDA, OX40L, CD70, TWEAK, FASL, TRAIL, 및 TNF를 포함한다.
가용성 TNFL에 대한 카테고리 II TNFR의 제한된 반응성은 2개 이상의 가용성 리간드 삼량체의 물리적 연결에 의해, 또는, 대안적으로, 가용성 리간드 분자를 세포 포면 또는 세포외 기질에 고정함으로써 극복될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 카테고리 II TNFR에 결합하는 TNFSF의 구성원이 바람직한데, 그러면 본 발명에 따른 융합 단백질의 능력이 진정으로 조건부이고, 그러면 그의 동족 TNFR의 활성화가 PD-L1 양성 종양 세포의 종양 미세환경 내의 존재에 좌우되기 때문이다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질 내에 포함된 TNFSF의 구성원은 카테고리 II TNFSF 구성원으로부터 선택되고, 바람직하게는 CD40L, 4-1BBL, Baff, APRIL, EDA, OX40L, CD70, TWEAK, FASL, TRAIL, 및 TNF 또는 그의 수용체 결합 도메인으로부터 선택된다.
TNFSF 구성원은 그의 공지된 기능에 따라 분류될 수도 있다. 본 발명의 맥락에서, 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원이 바람직하게는 본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있다. 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원은 CD40L, 4-1BBL, GITRL, OX40L, CD70, TL1A 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함한다 (Croft M. et al., 2017, Nat Rev Rheumatol.;13(4):217-233).
"CD40L", "CD40 리간드", "CD40LG", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 5", "TNFSF5", 및 "CD154"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 동종삼량체로 조립되고 그의 수용체 CD40과 트랜스로 상호작용할 때 적응 면역 반응의 개시에서 중심적인 역할을 하는 TNFSF의 구성원을 지칭한다. CD40L-CD40 상호작용은 CD40 보유 세포의 활성화에 이르며, 그 후 이는 시토카인/케모카인 (TNFα, IL6...)에 더하여 부착 (ICAM), 공동-자극 (CD80/CD86), 및 MHC I 및 II 분자를 발현한다. 종양 미세환경에서, 부착 분자 및 시토카인/케모카인은 함께 작용하여 면역 세포의 침윤 및 활성화를 유도하며, 이는 궁극적으로 종양 세포를 파괴하고, 종양을 면역억제성에서 면역적격성 미세환경으로 기울게 한다 (Richards et al., 2020, Hum Vaccin Immunother. 16(2):377-387). 따라서 CD40L은 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원이다.
TNF로서, CD40L은 동종삼량체로 조립되고, 그의 수용체 CD40과 그의 세포외 부분을 통해 트랜스로 상호작용한다. CD40은 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
면역 세포 활성화에서 수반되고 TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 것 둘 다인 TNFSF의 구성원이면서, CD40L은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 특히 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 CD40L 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 CD40L이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 CD40L은 엔트레즈(Entrez) 유전자 ID 959에 상응하고, 인간 CD40L의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NP_000065.1 (2022년 1월 17일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"4-1BBL", "4-1BB 리간드", "CD137L", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 9", 및 "TNFSF9"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, T 림프구에서의 공동자극 수용체 분자인 TNFRSF9/4-1BB에 대한 리간드로서 작용하는 막횡단 시토카인을 지칭한다. 이러한 시토카인 및 그의 수용체는 항원 제시 프로세스 및 세포독성 T 세포의 생성에서 수반된다. 따라서 4-1BBL은 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원이다.
그의 수용체 4-1BB는 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
면역 세포 활성화에서 수반되고 TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 것 둘 다인 TNFSF의 구성원이면서, 4-1BBL은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 특히 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 4-1BBL 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 4-1BBL이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 4-1BBL은 엔트레즈 유전자 ID 8744에 상응하고, 인간 4-1BBL의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_003802.1 (2022년 2월 27일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"OX40L", "OX40 리간드", "CD252", "CD134L", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 4", 및 "TNFSF4"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 분명 가장 중요하게는 항원-제시 세포 (APC) 상에서이지만 여러 세포 유형에서 발현되는 유도성 분자를 지칭한다. OX40L은 그의 수용체 OX40을 통해 신호전달을 촉발하여, 이펙터 T 세포의 확장 및 축적 및 그의 시토카인 생산을 포함하는 광범위한 활성을 초래할 수 있다. 따라서 OX40L은 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원이다.
그의 수용체 OX40은 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
면역 세포 활성화에서 수반되고 TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 것 둘 다인 TNFSF의 구성원이면서, OX40L은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 특히 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 OX40L 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 OX40L이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 OX40L은 엔트레즈 유전자 ID 7292에 상응하고, 인간 OX40L의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_003317.1 (2022년 3월 16일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"CD70", "CD27L", "CD27LG", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 7", 및 "TNFSF7"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, OX40, GITR 및 DR3으로 보이는 것과 유사하게, 그의 수용체 CD27과의 상호작용을 통해 T 세포에 신호를 제공하여 그의 축적 및 반응성을 제어할 수 있는 분자를 지칭한다. 따라서, CD70은 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원이다.
그의 수용체 CD27은 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
면역 세포 활성화에서 수반되고 TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 것 둘 다인 TNFSF의 구성원이면서, CD70은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 특히 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 CD70 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 CD70이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 CD70은 엔트레즈 유전자 ID 970에 상응하고, 인간 CD70의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_001317261.1 (2022년 1월 9일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"Baff", "B 세포 활성화 인자", "CD257", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 13b", "TNFSF13B", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 20", 및 "TNFSF20"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 배타적이지는 않지만 주로 B 세포 활성을 제어하는 분자를 지칭한다.
이는 TNFRSF의 2개의 수용체에 결합한다: BaffR 및 TACI. BaffR은 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이지만, TACI는 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체 (TACI)에 결합하는 TNFSF의 구성원이면서, Baff는 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 Baff 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 Baff가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 Baff는 엔트레즈 유전자 ID 10673에 상응하고, 인간 Baff의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_006564.1 (2022년 2월 20일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"APRIL", "CD256", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 13", 및 "TNFSF13"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, B 세포 발달에 중요한 것으로 확인된 리간드를 지칭한다.
이는 TNFRSF의 2개의 수용체에 결합한다: 둘 다 TNFRSF의 카테고리 II 수용체인 BCMA 및 TACI.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 TNFSF의 구성원이면서, APRIL은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 APRIL 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 APRIL이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 APRIL은 엔트레즈 유전자 ID 8741에 상응하고, 인간 APRIL의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_003799.1 (2022년 1월 23일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"EDA-A1","EDA-A2", "EDA", "엑토디스플라신 A", 및 "종양 괴사 인자 리간드 7C"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 외배엽 기관의 발생 동안 세포-세포 신호전달에서 수반되는 단백질을 지칭한다.
그의 수용체 EDAR은 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 TNFSF의 구성원이면서, EDA는 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 EDA 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 EDA가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 EDA는 엔트레즈 유전자 ID 1896에 상응하고, 인간 EDA의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_001390.1 (2022년 2월 13일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"GITRL", "글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체-관련 리간드", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 18", 및 "TNFSF18"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 전문 APC, 및 내피 세포와 같은 기타 세포 유형에서 발현되는 유도성 분자를 지칭한다. 그의 수용체인 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체-관련 단백질 (GITR, 일명 TNFRSF18)은 T 세포, 수지상 세포 및 B 세포 활성화를 자극할 수 있다. 따라서 GITRL은 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원이다.
그의 수용체 GITR은 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이다.
면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF의 구성원이면서, GITRL은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 GITRL 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 GITRL이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 GITRL은 엔트레즈 유전자 ID 8995에 상응하고, 인간 GITRL의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_005083.3 (2022년 2월 20일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"TL1A", "VEGI", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 15", 및 "TNFSF15"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, APC 예컨대 수지상 세포 및 대식세포, 뿐만 아니라 내피 세포에서 유도될 수 있는 단백질을 지칭한다. T 세포에 의해 발현되는 자극성 수용체인 그의 수용체 "사멸 수용체 3" ("DR3", 일명 "TNFRSF25")에 결합하는 것은 이펙터 T 세포 축적 및/또는 반응성을 조절할 수 있다. 따라서 TL1A는 면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF 구성원이다. 이러한 시토카인은 또한 내피 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었고, 따라서 혈관형성 억제제로서 기능할 수 있다.
그의 수용체 DR3은 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이다.
면역 세포 활성화에서 수반되는 TNFSF의 구성원이면서, TL1A는 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 TL1A 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 TL1A가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 TL1A는 엔트레즈 유전자 ID 9966에 상응하고, 인간 TL1A의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_005109.2 (2022년 2월 27일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"LIGHT", "CD258", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14", 및 "TNFSF14"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, TNFRSF의 2개의 수용체에 결합하는 단백질을 지칭한다: 헤르페스 바이러스 진입 매개체 (HVEM, 일명 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 14 (TNFRSF14)) 및 림포톡신-β 수용체 (LTβR). LIGHT-HVEM 상호작용이 LIGHT의 면역-자극 성질의 대부분을 담당한다. 림프구, NK 세포, 평활근, 및 상피 상에서 발현되어, HVEM은 활성화, 증식 및 생존에 이르는 중요한 T 세포 공동자극제로서의 역할을 한다. 항-종양 면역 지원의 맥락에서, LIGHT-LTβR 신호전달은 면역 반응에 대한 암 세포의 감수성에 영향을 미치는 것, 무질서한 종양 혈관을 복구하는 기능을 하는 것에서 이펙터 세포의 종양으로의 세포 수송 및 그의 종양 내로의 침윤을 지원하는 것까지 걸쳐지는 광범위한 역할을 갖는다 (Skeate Joseph G. et al. TNFSF14: LIGHTing the Way for Effective Cancer Immunotherapy. TNFSF14: LIGHTing the Way for Effective Cancer Immunotherapy. May 2020. Vol. 11. Article 922).
LTβR은 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이다. HVEM은 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 LIGHT 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 LIGHT가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 LIGHT는 엔트레즈 유전자 ID 8740에 상응하고, 인간 LIGHT의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_003798.2 (2022년 2월 20일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"RANKL", "RANK 리간드", "핵 인자-κB의 수용체 활성화제 리간드", "CD254", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 11", 및 "TNFSF11"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 파골세포 분화 및 활성화에 대한 핵심 인자로서 기능하는 오스테오프로테게린에 대한 리간드를 지칭한다. 이러한 단백질은 수지상 세포 생존 인자인 것으로, 그리고 T 세포-의존적 면역 반응의 조절에서 수반되는 것으로 또한 나타났다.
그의 수용체 RANK (또는 "핵 인자-κB 의 수용체 활성화제)는 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 RANKL 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 RANKL이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 RANKL은 엔트레즈 유전자 ID 8600에 상응하고, 인간 RANKL의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_003692.1 (2022년 2월 27일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"TWEAK", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 12", 및 "TNFSF12"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, TNF와 중첩되는 신호전달 기능을 갖지만 훨씬 더 넓은 조직 분포를 나타내는 시토카인을 지칭한다. 이는 막-결합형 및 분비 형태 둘 다로 존재하고, 세포-유형 특이적 방식으로 세포 사멸의 다중 경로를 통해 아폽토시스를 유도할 수 있다. 이는 또한 내피 세포의 증식 및 이동을 촉진하는 것으로 확인되었고, 따라서 혈관형성의 조절인자로서 작용한다.
그의 수용체 FN14 (TWEAKR로도 지칭됨)는 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 TNFSF의 구성원이면서, TWEAK는 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 TWEAK 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 TWEAK가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 TWEAK는 엔트레즈 유전자 ID 8742에 상응하고, 인간 TWEAK의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_003800.1 (2022년 2월 20일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"FASL", "FAS 리간드", "FASLG", "CD178", "CD95 리간드", "CD95L", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 6", 및 "TNFSF6"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 그의 수용체 FAS에 결합함으로써 촉발되는 아폽토시스의 유도가 주요 기능인 막횡단 단백질을 지칭한다. FAS/FASLG 신호전달 경로는 T 세포의 활성화-유도된 세포 사멸 (AICD) 및 세포독성 T 림프구 유도 세포 사멸을 포함하여 면역 체계 조절에 필수적이다.
FAS는 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 TNFSF의 구성원이면서, FASL은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 FASL 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 FASL이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 FASL은 엔트레즈 유전자 ID 356에 상응하고, 인간 FASL의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_000630.1 (2022년 2월 27일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"TRAIL", "CD253", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 10", 및 "TNFSF10"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 형질전환된 세포 및 종양 세포에서 아폽토시스를 우선적으로 유도하지만, 대부분의 정상 조직에서 유의한 수준으로 발현됨에도 불구하고 정상 세포를 사멸시키는 것으로는 보이지 않는 단백질을 지칭한다. TRAIL은 TNFRSF10A/TRAILR1, TNFRSF10B/TRAILR2, TNFRSF10C/TRAILR3, TNFRSF10D/TRAILR4를 포함하는 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 여러 구성원에 결합하고, 가능하게는 TNFRSF11B/OPG에도 결합한다. 아폽토시스를 유도할 수 없는 미끼 수용체 TNFRSF10C/TRAILR3, TNFRSF10D/TRAILR4, 및 TNFRSF11B/OPG에 결합하는 것에 의해 TRAIL의 활성이 조정될 수 있다. TRAIL이 그의 수용체에 결합하는 것은 MAPK8/JNK, 카스파제 8, 및 카스파제 3의 활성화를 촉발하는 것으로 나타났다.
TRAILR1 및 TRAILR2 둘 다 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 TNFSF의 구성원이면서, TRAIL은 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 TRAIL 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 TRAIL이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 TRAIL은 엔트레즈 유전자 ID 8743에 상응하고, 인간 TRAIL의 가장 긴 이소형의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_003801.1 (2022년 3월 17일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"TNF", "종양 괴사 인자", "TNFA", "TNFα", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 2", 및 "TNFSF2"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 세포 증식, 분화, 아폽토시스, 지질 대사 및 응고를 포함하는 광범위한 생물학적 프로세스의 조절에서 수반되는 다기능적 염증유발성 시토카인을 지칭한다.
TNF는 TNFRSF의 2개의 수용체에 결합한다: TNFR1 (일명 "TNFRSF1A") 및 TNFR2 (일명 "TNFRSF1B" 또는 "TNFBR"). TNFR1은 TNFRSF의 카테고리 I 수용체인 한편, TNFR2는 TNFRSF의 카테고리 II 수용체이다.
TNFRSF의 카테고리 II 수용체에 결합하는 TNFSF의 구성원이면서, TNF는 본 발명에 따른 융합 단백질에 대한 바람직한 TNFSF 구성원이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 TNF 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 TNF가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 TNF는 엔트레즈 유전자 ID 7124에 상응하고, 인간 TNF의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_000585.2 (2022년 3월 17일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"CD30L", "CD153", "TNFSF8", 및 "종양-괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 8"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 비-병리학적 병태에서 활성화된 T- 및 B-세포의 하위집단에서의 제한된 발현을 나타내고 증식/아폽토시스 및 항체 반응을 조절하는 단백질을 지칭한다.
그의 수용체 TNFRSF8 (종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 8 또는 CD30으로도 지칭됨)은 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 CD30L 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 CD30L이 바람직하게 사용될 것이다. 인간 CD30L은 엔트레즈 유전자 ID 943에 상응하고, 인간 CD30L의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 AH005843.2 (2016년 6월 10일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"LTα", "림포톡신 알파", "TNFB", "TNFβ", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 1", 및 "TNFSF1"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 고도로 유도성이고, 분비되며, 림포톡신-알파를 세포 표면에 고정하는 림포톡신-베타와 이종삼량체를 형성하는, 림프구에 의해 생산되는 시토카인을 지칭한다. 이러한 단백질은 다양한 염증성, 면역자극성 및 항바이러스성 반응을 또한 매개하고, 발생 동안 2차 림프 기관의 형성에서 수반되며, 아폽토시스에서 역할을 한다.
LTα는 TNFR1 (일명 "TNFRSF1A")에 결합하며, 이는 TNFRSF의 카테고리 I 수용체이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 LTα 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 LTα가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 LTα는 엔트레즈 유전자 ID 4049에 상응하고, 인간 LTα의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_001153212.1 (2022년 3월 10일 버전) 하에 확인할 수 있다.
"LTβ", "림포톡신 베타", "TNFC", "종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 3", 및 "TNFSF3"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 이종삼량체 형성을 통해 림포톡신-알파를 세포 표면에 고정하는 단백질을 지칭한다. 림프구 표면 상에서의 우세한 형태는 림포톡신-알파 1/베타 2 복합체 ("LTαβ2", 예를 들어 1개의 알파 분자/2개의 베타 분자로도 지칭됨)이고, 이러한 복합체는 TNFRSF의 카테고리 I 수용체인 림포톡신-베타 수용체 (LTβR"로도 지칭됨)에 대한 주요 리간드이다. 소수의 복합체는 림포톡신-알파 2/베타 1이다. LTB는 염증성 반응 시스템의 유도제이고, 림프 조직의 정상적인 발생에서 수반된다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 포함될 수 있는 특정한 LTβ 단백질은 바람직하게는 융합 단백질이 치료적 용도에 의도되는 종과 동일한 종으로부터 선택된다. 특히, 인간에서의 의도된 사용의 경우, 인간 LTβ가 바람직하게 사용될 것이다. 인간 LTβ는 엔트레즈 유전자 ID 4050에 상응하고, 인간 LTβ의 완전한 아미노산 서열을 진뱅크 수탁 번호 NP_002332.1 (2021년 2월 20일 버전) 하에 확인할 수 있다.
TNFSF 구성원의 기능적 단편 또는 변이체
본 발명에 따른 SPD-TNFSF 융합 단백질이 TNFSF의 전체 야생형 구성원을 포함할 수 있는 한편, 이는 또한 대안적으로 그의 기능적 단편 또는 그의 기능적 유도체를 포함할 수 있다.
TNFSF의 구성원의 "기능적 단편"은 하나 이상의 삽입, 결실, 말단절단 및/또는 치환이 있고, TNFSF의 전체 구성원의 기능, 즉 삼량체화하고 그의 TNFRSF 수용체(들)에 결합하여 활성화시키는 능력을 보유하는 단편 (즉, TNFSF의 전체 구성원의 아미노산 서열의 일부분)을 의미한다.
특히, TNFSF 구성원은 막횡단 단백질로서 존재하지만, 그의 막횡단 및 세포내 영역은 삼량체화 및 그의 TNFRSF 수용체(들)에 결합하여 활성화시키는 것에 필요하지 않다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 SPD-TNFSF 융합 단백질에 포함된 TNFSF 구성원 단편은 TNFSF 구성원의 세포외 단편, 즉, TNFSF 구성원의 막횡단 및 세포내 부분이 결여된 단편이다. 단편이 삼량체화하고 그의 TNFRSF 수용체(들)에 결합하여 활성화시키는 그의 능력을 보유하는 한, 세포외 도메인 전체 또는 그의 일부분이 세포외 단편에 포함될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 융합 단백질의 TNFSF 리간드 또는 그의 수용체 결합은 인간 CD40L (서열식별번호: 24), 특히 인간 CD40L의 아미노산 119-261 (서열식별번호: 25)로부터 선택된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질의 TNFSF 리간드 또는 그의 수용체 결합은 뮤린 CD40L (서열식별번호: 26), 특히 뮤린 CD40L의 아미노산 115-260 (서열식별번호: 27)으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 융합 단백질의 TNFSF 리간드 또는 그의 수용체 결합은 인간 4-1-BBL (서열식별번호: 28), 특히 인간 4-1-BBL의 아미노산 80-254 (서열식별번호: 29)로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 융합 단백질의 TNFSF 리간드 또는 그의 수용체 결합은 뮤린 4-1-BBL (서열식별번호: 30), 특히 뮤린 4-1-BBL의 아미노산 139-309 (서열식별번호: 31)로부터 선택된다.
한 실시양태에서, SPD-TNFSF 융합 단백질은 콜라겐 도메인을 포함한다. 전형적으로, 콜라겐 도메인은 1 내지 40개 (GXX) 반복물, 바람직하게는 3 내지 30개 (GXX) 반복물, 바람직하게는 6개 내지 20개 (GXX) 반복물, 보다 바람직하게는 12개 (GXX) 반복물을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 X는 아미노산이고, G는 글리신 아미노산이며, 각각의 반복물에서 각각의 X는 동일하거나 상이할 수 있다. 콜라겐 도메인은 N-말단 도메인과 SPD의 코일드-코일 넥 도메인 사이에 위치할 수 있다. 적합한 콜라겐 도메인의 예가 하기 표 1에서 제시된다:
Figure pct00006
표 1. 콜라겐 도메인 및 상응하는 (GXX) 반복물의 수. "6-N-Gly"는 고려되는 콜라겐 도메인이 N-글리코실화 부위 없이 6개 (GXX) 반복물을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "6+N-Gly"는 고려되는 콜라겐 도메인이 N-글리코실화 부위를 포함하는 6개 (GXX) 반복물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "12" 또는 "12bis"는 고려되는 콜라겐 도메인이 12개 (GXX) 반복물을 포함하는 것으로 이해되어야 하지만, "12" 및 "12bis"는 상이한 서열을 나타낸다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 SPD-TNFSF 융합 단백질은 추가적으로 코일드-코일 넥 도메인과 TNFSF 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인 사이에 위치하는 링커를 포함할 수 있다. 전형적으로, 링커는 아미노산 잔기 예컨대 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 알라닌 (Ala 또는 A) 및/또는 프롤린 (Pro 또는 P)의 짧은 신장물로 구성된다. 상기 링커는 바람직하게는 글리신/세린 링커이고, 즉, 글리신 및 세린 아미노산으로 본질적으로 구성된다. 상기 링커는 바람직하게는 4-20개 아미노산, 특히 4, 8, 12, 16 또는 20개 아미노산 (예를 들어, GGGS, GSGSG, 또는 SGSGS의 1, 2 3 또는 4회 반복, 또는 GSGSGSGSGS의 1 또는 2회 반복)의 길이를 갖는다. 보다 바람직하게는, 링커의 길이는 8 내지 16개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 12개 아미노산이다. 지침용으로, 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 적합한 링커는 서열식별번호: 38 (GGGSGGGSGGGS)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 2개의 융합 파트너 사이의 펩티드 링커의 크기 및 서열을 최적화하는 것은 통상의 기술자의 역량에 속한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 SPD-TNFSF 융합 단백질은 각각 코일드-코일 넥 도메인의 N-말단 및 C-말단에 위치하는 콜라겐 도메인 및 링커를 포함한다. 적합한 SPD-TNFSF 융합 단백질은 서열식별번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, SPD-TNFSF 융합 단백질의 발현, 수송 및 생물학적 활성을 용이하게 하도록 추가적인 조절 요소를 포함하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, SPD-TNFSF 융합 단백질은 단백질의 발현 수준, 분비, 용해도 또는 기타 성질에 영향을 미치도록 SPD-TNFSF 융합 단백질의 N-말단에 신호 펩티드를 추가적으로 포함할 수 있다. 적절한 신호 펩티드는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이는 세포성 또는 바이러스성 폴리펩티드 예컨대 면역글로불린, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인슐린, 광견병 당단백질, HIV 바이러스 외피 당단백질 또는 홍역 바이러스 F 단백질의 것으로부터 수득될 수 있거나, 또는 합성일 수 있다 (예를 들어 W02008/138649 참조). 지침용으로, 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 적합한 신호 펩티드는 서열식별번호: 39 (MLLFLLSALVLLTQPLGYLE), 서열식별번호: 40 (MGLGLQWVFFVALLKGVHC) 또는 서열식별번호: 41 (MGWSCIILFLVATATGVHS)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 세포의 적합한 막 (예를 들어 형질막)에 TNFSF 융합 단백질을 고정하는 것을 용이하게 하도록 막횡단 도메인을 추가하는 것을 또한 구상할 수 있다. 막횡단 도메인은 전형적으로 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 삽입된다. 다양한 막횡단 도메인이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 WO99/03885 참조).
본 발명의 맥락에서, SPD-TNFSF 융합 단백질은 SPD-TNFSF 단백질 또는 이같은 융합 단백질을 발현하는 감염된 숙주 세포의 후속 발현, 수송 또는 정제를 위해 태그 펩티드 (전형적으로, 입수가능한 항혈청 또는 화합물에 의해 인식될 수 있는 짧은 펩티드 서열)를 또한 추가적으로 포함할 수 있다. 태그 펩티드는 항-태그 항체를 사용하는 면역검출에 의해 검출될 수 있다. PK 태그, FLAG (DYKDDDK, 서열식별번호: 42, GDYKDDDK, 서열식별번호: 43, GSDYKDDDDK, 서열식별번호: 44 또는 HHHHHHDYKDDDDKLVPRGS, 서열식별번호: 45), MYC 태그 (QKLISEEDL, 서열식별번호: 46), HIS 태그 (일반적으로, 4 내지 10개 히스티딘 잔기의 신장물), HA 태그 (YPYDVPDYA; 서열식별번호: 47), HSV 태그 (QPELAPEDPED; 서열식별번호: 48), VSV 태그 (YTDIEMNRLGK; 서열식별번호: 49) 및 e-태그 (US 6,686,152)를 비제한적으로 포함하는 다양한 태그 펩티드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 지침용으로, 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 적합한 태그 펩티드는 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44 또는 서열식별번호: 45에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 여러 태그가 사용될 때, 태그 펩티드(들)는 독립적으로 단백질의 N-말단에 또는 대안적으로 그의 C-말단에, 또는 대안적으로 내부에, 또는 이러한 위치 중 임의의 것에 위치할 수 있다. 신호 펩티드가 융합 단백질의 N-말단에 이미 존재하는 경우, 태그 펩티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 융합 단백질의 C-말단에 삽입될 수 있다.
또 다른 예로서, SPD-TNFSF 융합 단백질의 생물학적 활성을 증가시키도록 글리코실화가 변경될 수 있다. 이같은 변형은, 예를 들어, 글리코실화 부위(들) 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "올리고머성" 또는 "다량체성"은 적어도 2개의 단량체성 단위가 복합체를 형성하는 능력을 지칭한다. 회합은 특이적일 수 있거나 (결합을 유지하기 위해 결합 부위에서의 2개의 파트너의 아미노산 잔기 사이의 구조적 상보성, 및 정전기력, 수소 결합, 소수성 힘 및/또는 반데르발스 힘 중 하나 이상의 유형(들)이 필요함), 또는 비-특이적일 수 있다 (상기 언급된 힘 중 하나 이상의 유형(들)을 통한 상호작용이지만, 구조적 상보성이 결여됨). 바람직하게는 SPD-TNFSF 융합 단백질의 올리고머는 올리고머화된 단백질 사이에 디술피드 결합(들) (즉, 분자간 디술피드 결합)이 형성될 수 있도록 올리고머를 형성하는 각각의 폴리펩티드 상의 하나 이상의 시스테인 (Cys) 잔기를 수반하는 하나 이상의 분자간 디술피드 결합에 의해 형성된다. 바람직하게는, 올리고머는 적어도 2개의 SPD-TNFSF 융합 단백질 (이량체), 3개의 SPD-TNFSF 융합 단백질 (삼량체), 6개의 SPD-TNFSF 융합 단백질 또는 2개의 SPD-TNFSF 융합 단백질 삼량체 (육량체), 12개의 SPD-TNFSF 융합 단백질 (십이량체), 18개의 SPD-TNFSF 융합 단백질 (십팔량체) 또는 엄밀하게 18개 초과의 SPD-TNFSF 융합 단백질 (고차수 올리고머) 사이에 형성된다.
융합 단백질은 단량체성 단백질 또는 다량체성 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 동일하거나 상이할 수 있는 삼량체성 SPD-TNFSF 융합 단백질에서 자가-조립된 3개의 SPD-TNFSF 융합 단백질로 이루어진 다량체성 형태로 존재한다. 바람직하게는, 다량체성 형태는 4개의 동일한 삼량체성 형태의 조립으로 이루어진 십이량체성 형태이다.
종양용해성 바이러스
본 발명의 종양용해성 바이러스는 현재 확인된 바이러스의 임의의 구성원으로부터 수득될 수 있고, 단, 비-분열 세포에 비교하여 분열 세포에서 선택적으로 복제되고 이를 사멸시키는 경향에 의해 종양용해성이다. 이는 천연적으로 종양용해성인 천연 바이러스일 수 있거나, 또는 종양 선택성 및/또는 분열 세포에서의 우선적인 복제를 증가시키도록 하나 이상의 바이러스 유전자, 예컨대 DNA 복제, 핵산 대사, 숙주 향성, 표면 부착, 발병력, 용해 및 확산에서 수반되는 것들을 변형시킴으로써 조작될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Kirn et al., 2001, Nat. Med. 7: 781]; [Wong et al., 2010, Viruses 2: 78-106] 참조). 또한 하나 이상의 바이러스 유전자(들)를 이벤트 또는 조직-특이적 조절 요소 (예를 들어 프로모터)의 제어 하에 놓는 것을 구상할 수 있다.
예시적인 종양용해성 바이러스는 비제한적으로 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 모르빌리바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신드비스 바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV), 홍역 바이러스, 포말상 바이러스, 알파 바이러스, 렌티바이러스, 랍도바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스, 파르보바이러스 또는 그의 키메라를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 레오바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 레오라이신(Reolysin) (온코리틱스 바이오테크( Oncolytics Biotech)에 의해 개발 중임; NCT01166542)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 세네카 밸리 바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 NTX-010 (Rudin et al., 2011, Clin. Cancer. Res. 17(4): 888-95)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로부터 수득된다. 대표적인 예가 문헌 (예를 들어 문헌 [Stojdl et al., 2000, Nat. Med. 6(7): 821-5]; [Stojdl et al., 2003, Cancer Cell 4(4): 263-75])에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 비제한적으로 73-T PV701 및 HDV-HUJ 균주 뿐만 아니라 문헌 (예를 들어 문헌 [Phuangsab et al., 2001, Cancer Lett. 172(1): 27-36]; [Lorence et al., 2007, Curr. Cancer Drug Targets 7(2): 157-67]; [Freeman et al., 2006, Mol. Ther. 13(1): 221-8])에 기술된 것들을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 헤르페스 바이러스로부터 수득된다. 헤르페스비리다에(Herpesviridae)는 모두 통상적인 구조를 공유하고, 지질 이중층 막에 싸여진 20면체 캡시드 내에 캡시드화된 100-200개의 유전자를 코딩하는 비교적 큰 선형 이중-가닥 DNA 게놈으로 구성된 DNA 바이러스의 대형 과이다. 종양용해성 헤르페스 바이러스가 상이한 HSV 유형으로부터 유래될 수 있지만, HSV1 및 HSV2가 특히 바람직하다. 헤르페스 바이러스는 종양에서의 바이러스 복제를 제한하거나 비-분열 세포에서의 그의 세포독성을 감소시키도록 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산 대사에서 수반되는 임의의 바이러스 유전자, 예컨대 티미딘 키나제 (Martuza et al., 1991, Science 252: 854-6), 리보뉴클레오티드 리덕타제 (RR) (Boviatsis et al., Gene Ther. 1: 323-31; Mineta et al., 1994, Cancer Res. 54: 3363-66), 또는 우라실-N-글리코실라제 (Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4963-72)를 코딩하는 유전자가 불활성화될 수 있다. 또 다른 측면은 발병력 인자를 코딩하는 유전자 예컨대 ICP34.5 유전자의 기능에서의 결손이 있는 바이러스 돌연변이체를 수반한다 (Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-5). 종양용해성 헤르페스 바이러스의 대표적인 예는 NV1020 (예를 들어 문헌 [Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28]) 및 T-VEC (Andtbacka et al., 2013, J. Clin. Oncol. 31, abstract number LBA9008)를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 파라믹소비리다에 과로부터 수득될 수 있는 모르빌리바이러스로부터 수득되고, 홍역 바이러스가 특히 바람직하다. 종양용해성 홍역 바이러스의 대표적인 예는 비제한적으로 MV-Edm (McDonald et al., 2006; Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84) 및 HMWMAA (Kaufmann et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133(4): 1034-42)를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스로부터 수득된다. 종양용해성 아데노바이러스를 조작하는 방법이 관련 기술분야에서 입수가능하다. 유리한 전략은 바이러스 프로모터를 종양-선택적 프로모터로 교체하는 것 또는 E1 아데노바이러스 유전자 생성물(들)을 종양 세포에서 변경되는 p53 또는 망막모세포종 (Rb) 단백질과의 결합 기능을 불활성화시키도록 변형하는 것을 포함한다. 천연 상황에서, 아데노바이러스 E1B55kDa 유전자는 또 다른 아데노바이러스 생성물과 협력하여 p53 (p53은 암 세포에서 빈번하게 탈조절됨)을 불활성화시키고, 따라서 아폽토시스를 방지한다. 종양용해성 아데노바이러스의 대표적인 예는 ONYX-015 (예를 들어 문헌 [Khuri et al., 2000, Nat. Med 6(8): 879-85]), 및 온코린(Oncorine)으로도 명명된 H101 (Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12): 1666-70)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 등을 비제한적으로 포함하는 아데노-연관 바이러스 혈청형, 또는 캡시드 단백질 서열이 AAV-2 또는 캡시드 단백질 서열과 실질적으로 상동성인 임의의 다른 바이러스 또는 혈청형으로부터 수득된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리다에 과에 속하는 바이러스를 지칭하며, 코르도폭스비리다에 아과, 보다 바람직하게는 오르토폭스바이러스 속에 속하는 폭스바이러스 또는 그의 키메라가 특히 바람직하다. 다양한 폭스바이러스의 게놈, 예를 들어, 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스 바이러스 및 엑트로멜리아(Ectromelia) 바이러스 게놈의 서열이 관련 기술분야 및 특수 데이터베이스 예컨대 진뱅크 (각각 수탁 번호 NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105)에서 입수가능하다.
유리하게는, 종양용해성 폭스바이러스는 우두 바이러스이고, 임의의 우두 균주, 예를 들어, CPXV_GER1980_EP4 (진뱅크 HQ420895), CPXV_GER2002_MKY (진뱅크 HQ420898), CPXV_GER1991_3 (진뱅크 DQ 437593), CPXV_FRA2001_A CY (진뱅크 HQ420894), CPXV_GR1990_2 (진뱅크 HQ420896), CPXV_UK2000_K2984 (진뱅크 HQ420900), CPXV_BR (진뱅크 AF482758.2 또는 NC 003663) 및 CPXV_NOR1994-MAN (진뱅크 HQ420899), CPXV_GER1998_2 (진뱅크 HQ420897), CPXV_GRI (진뱅크 X94355), CPXV_FIN2000_MAN (진뱅크 HQ420893) 및 CPXV_AUS1999_867 (진뱅크 HQ407377)로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 종양용해성 폭스바이러스는 종양용해성 백시니아 바이러스이다. 백시니아 바이러스는 바이러스가 숙주 세포 기구로부터 독립적으로 복제할 수 있게 하는 수많은 바이러스 효소 및 인자를 코딩하는 200 kb 이중-가닥 DNA 게놈을 특징으로 하는 폭스바이러스 과의 구성원이다. 대부분의 백시니아 바이러스 입자는 단일 지질 외피와 함께 세포내이고 (세포내 성숙 비리온에 대해 IMV), 용해될 때까지 감염된 세포의 시토졸에서 유지된다. 다른 감염성 형태는 감염된 세포를 용해하지 않으면서 이로부터 출아하는 이중 외피보유 입자 (세포외 외피보유 비리온에 대해 EEV)이다.
임의의 백시니아 바이러스 균주로부터 유래될 수 있지만, 엘스트리, 와이어쓰, 코펜하겐, 리스터, 티안 티안 및 웨스턴 리저브 균주가 특히 바람직하다. 본원에서 사용된 유전자 명명법은 코펜하겐 백시니아 균주의 것이다. 달리 지시되지 않는 한, 이는 본원에서 다른 폭스비리다에의 상동 유전자에 대해 또한 사용된다. 그러나, 유전자 명명법이 폭스 균주에 따라 상이할 수 있지만, 코펜하겐과 다른 백시니아 균주 사이의 상응성이 일반적으로 문헌에서 입수가능하다.
한 실시양태에서, 폭스바이러스는 코르도폭스비리다에 아과, 보다 바람직하게는 레포리폭스바이러스 속에 속하며, 점액종 바이러스, 토끼 섬유종 바이러스 또는 다람쥐 섬유종 바이러스가 바람직하고, 보다 바람직하게는 점액종 바이러스 (게놈 서열이 수탁 번호 NP_051868.1 하에 진뱅크에 개시되어 있음)이다.
바람직하게는, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 바이러스 유전자(들)에 대해 변경함으로써 변형된다. 바람직하게는 상기 변형(들)은 정상적인 조건 하에 비변형된 유전자에 의해 생산되는 단백질의 활성을 보장할 수 없는 결손 단백질의 합성 (또는 합성 결여)에 이른다. 변형은 바이러스 유전자 또는 그의 조절 요소 내의 하나 이상의 뉴클레오티드(들) (인접하거나 또는 그렇지 않음)의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포괄한다. 변형(들)은 통상적인 재조합 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방식으로 이루어질 수 있다. 예시적인 변형이 문헌에 기술되어 있고, DNA 대사, 숙주 발병력, IFN 경로에서 수반되는 바이러스 유전자를 변경시키는 것들 등이 특히 바람직하다 (예를 들어, 문헌 [Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5): 595-608] 참조).
보다 바람직하게는, 본 발명의 종양용해성 폭스바이러스는 티미딘 키나제-코딩 유전자 (로커스 J2R)를 변경시킴으로써 변형된다. TK 효소는 데옥시리보뉴클레오티드의 합성에서 수반된다. TK는 정상 세포에서 바이러스 복제에 필요한데, 정상 세포는 일반적으로 뉴클레오티드 농도가 낮기 때문인 반면, 고농도의 뉴클레오티드를 함유하는 분열 세포에서는 필수적이지 않다.
대안적으로 또는 조합되어, 본 발명의 종양용해성 폭스바이러스는 리보뉴클레오티드 리덕타제 (RR)를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 둘 다의 유전자를 변경시킴으로써 변형된다. 천연 상황에서, 이러한 효소는 DNA 생합성에서 결정적인 단계를 나타내는, 리보뉴클레오티드의 데옥시리보뉴클레오티드로의 환원을 촉매한다. 이 바이러스 효소는 포유동물 효소와 서브유닛 구조가 유사하여, 각각 I4L 및 F4L 로커스에 의해 코딩되는 R1 및 R2로 디자인된 2개의 이종 서브유닛으로 구성된다. I4L 및 F4L 유전자에 대한 서열 및 다양한 폭스바이러스의 게놈 내에서의 그의 위치가 공공 데이터베이스에서, 예를 들어 수탁 번호 DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M-35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 및 NC_008291을 통해 입수가능하다. 본 발명의 맥락에서, I4L 유전자 (R1 대형 서브유닛을 코딩함) 또는 F4L 유전자 (R2 소형 서브유닛을 코딩함) 또는 둘 다가 불활성화될 수 있다.
대안적으로 또는 조합되어, 종양용해성 폭스바이러스가 M2L 로커스에서 추가로 변형되어 (바이러스 m2 단백질의 발현 억제에 이르는 변형이 바람직함), m2 기능이 결손된 변형된 폭스바이러스 (m2-결손 폭스바이러스)가 초래될 수 있다.
한 실시양태에서, 종양용해성 폭스바이러스가 M2L 로커스 및 J2R 로커스에서 추가로 변형되어 (바이러스 tk 단백질의 발현 억제를 초래하는 변형이 바람직함), m2 및 tk 기능 둘 다가 결손된 종양용해성 폭스바이러스 (m2- tk- 폭스바이러스)가 초래된다. 상기 M2L 로커스 및/또는 J2R 로커스의 부분적 결실 또는 완전 결실 뿐만 아니라 M2L 로커스 및/또는 J2R 로커스 내의 외래 핵산의 삽입이 m2 및 tk 기능을 불활성화시키도록 본 발명의 맥락에서 구상된다.
대안적으로 또는 조합되어, 종양용해성 폭스바이러스가 M2L 로커스 및 I4L 및/또는 F4L 로커스에서 추가로 변형되어 (바이러스 리보뉴클레오티드 리덕타제 (rr) 단백질의 발현 억제에 이르는 변형이 바람직함), m2 및 rr 기능 둘 다가 결손된 종양용해성 폭스바이러스 (m2 및 rr-결손 폭스바이러스)가 초래될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예를 들어 I4L 및/또는 F4L 로커스의 부분적 또는 완전 결실에 의해, 폭스바이러스가 I4L 유전자 (r1 대형 서브유닛을 코딩함) 또는 F4L 유전자 (r2 소형 서브유닛을 코딩함) 또는 둘 다에서 변형되어, rr-결손 폭스바이러스가 제공될 수 있다.
M2L 로커스, J2R 로커스, 및 I4L 및/또는 F4L 로커스에서 변형된 종양용해성 폭스바이러스 (M2L, J2R 및 I4L 로커스; M2L, J2R 및 F4L 로커스 또는 M2L, J2R, I4L 및 F4L 로커스에서의 변형이 있는 삼중 결손 바이러스)가 또한 제공되어, m2, tk 및 rr 활성이 결손된 종양용해성 폭스바이러스가 초래된다 (m2-, tk- rr- 폭스바이러스).
대안적으로 또는 조합되어, 바이러스 종양-특이성을 추가로 증가시키기 위해 다른 전략이 또한 추구될 수 있다. 적합한 변형의 대표적인 예는 바이러스 게놈으로부터의 VGF-코딩 유전자의 파괴를 포함한다. VGF (VV 성장 인자)는 세포 감염 후 초기에 발현되는 분비형 단백질이고, 그의 기능이 정상 세포에서의 바이러스 확산에 중요한 것으로 보인다. 또 다른 예는 헤마글루티닌을 코딩하는 A56R 유전자의 파괴이며, 이는 궁극적으로는 tk 결실과 조합된다 (Zhang et al., 2007, Cancer Res. 67: 10038-46). 인터페론 조정 유전자(들) (예를 들어 B8R 또는 B18R 유전자) 또는 카스파제-1 억제제 B13R 유전자의 파괴 또한 유리할 수 있다. 또 다른 적합한 변형은 DNA 복제의 정확성을 유지하는 것과 티미딜레이트 신타제에 의해 TMP를 생산하도록 전구체를 제공하는 것 둘 다에서 수반되는 바이러스 dUTPase를 코딩하는 F2L 유전자의 파괴를 포함한다 (Broyles et al., 1993, Virol. 195: 863-5). 백시니아 바이러스 F2L 유전자의 서열은 수탁 번호 M25392를 통해 진뱅크에서 입수가능하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 J2R 유전자에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 TK 활성이 결손된 백시니아 바이러스이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 바이러스 게놈이 보유하는 J2R 유전자 및 I4L 및/또는 F4L 유전자(들) 둘 다에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 TK 및 RR 활성 둘 다가 결손된 백시니아 바이러스이다 (예를 들어 WO2009/065546 및 문헌 [Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1361-71]에 기술된 바와 같음). 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 J2R 유전자, I4L 및/또는 F4L 유전자(들) 및 M2L 유전자 둘 다에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 TK, RR 및 m2 활성이 결손된 백시니아 바이러스이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 F2L 유전자에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 dUTPase가 결손된 백시니아 바이러스이고 (예를 들어 WO2009/065547에 기술된 바와 같음), 이는 궁극적으로 TK 및 RR 활성 중 적어도 하나 또는 둘 다의 파괴와 조합된다 (F2L; F2L 및 J2R 유전자; F2L 및 I4L; 또는 F2L, J2R 및 I4L에서의 불활성화 돌연변이가 있는 바이러스를 초래함).
비-종양용해성 바이러스
한 실시양태에서, 본 발명의 비-종양용해성 바이러스는 폭스바이러스이다. 예시적인 비-종양용해성 바이러스인 폭스바이러스는 비제한적으로 가성우두 바이러스 (PCPV), 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주 (NYVAC), 돈두 바이러스 (SWPV), 계두 바이러스 (FPV) 또는 그의 키메라를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 비-종양용해성 폭스바이러스는 가성우두 바이러스 (PCPV)로부터 수득된다. 본원에서 사용하기 위한 적합한 PCPV 균주의 대표적인 예는, 비제한적으로, YG2828 (진뱅크 수탁 번호 LC2301 19), F07.801 R (진뱅크 수탁 번호 JF773693), F10.3081 C (진뱅크 수탁 번호 JF773695), F07.798R (진뱅크 수탁 번호 JF773692), F99.177C (진뱅크 수탁 번호 AY453678), IT1303/05 (진뱅크 수탁 번호 JF800906), F00.120R (진뱅크 수탁 번호 GQ329669; Tikkanen et al., 2004, J. Gen. Virol. 85: 1413-8) 및 TJS (VR634로도 칭해짐; 진뱅크 수탁 번호 GQ329670; Friedman-Kien et al., 1963, Science 140: 1335-6; 수탁 번호 VR634 하에 ATCC에서 입수가능)를 포함한다. 이같은 균주는, 예를 들어, ITR 길이, 예상 유전자의 수 및/또는 G C 풍부 함량의 측면에서, 서로 형상적, 구조적 및/또는 유전적 차이를 가질 수 있다 (예를 들어 문헌 [Hautaniemi et al., 2010, J. Gen. Virol.91 : 1560-76] 참조). 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PCPV 바이러스는 ATCC 참조 번호 ATCC VR-634™ 하에 확인되는 바와 같은 야생형 TJS 균주로부터 또는 동일하거나 유사한 명칭의 바이러스 균주 또는 그의 기능적 단편 및 변이체로부터 수득된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 비-종양용해성 폭스바이러스는 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주 (NYVAC) (문헌 [Tartaglia et al., 1992, Virol. 188(l):217-32], US5,494,807)로부터 수득된다. 예시 목적으로, NYVAC는 바이러스 게놈으로부터의 18개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 정확한 결실에 의해 코펜하겐 백신 균주의 플라크-클로닝된 단리물로부터 유래된 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 비-종양용해성 폭스바이러스는 고도로 약독화된 표현형으로 인해, 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)로부터 수득된다 (Mayr et al., 1975, Infection 3: 6-14; Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-51). MVA 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 바이러스 단백질의 아미노 서열이 관련 기술분야에서, 예를 들어 문헌 [Antoine et al. (1998, Virol, 244 : 365-96)] 및 진뱅크 (수탁 번호 U94848)로부터 입수가능하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 비-종양용해성 폭스바이러스는 돈두 바이러스 (SWPV)로부터 수득된다. SWPV 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 아미노 서열이 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Alfonso et al. (2002, Virol, 76(2):783-90)] 및 진뱅크 수탁물 (NC_003389.1 및 MW036632)에서 입수가능하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 비-종양용해성 폭스바이러스는 계두 바이러스 (FPV)로부터 수득된다. 계두 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열이 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Alfonso et al. (2000, Virol., 74(8): 3815-383)] 및 진뱅크 수탁물 (AF198100)에서 입수가능하다.
바이러스 게놈 내로 삽입된 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(들)의 발현.
관련 기술분야에서 접근가능한 서열 데이터 및 본원에서 제공되는 정보를 사용하여 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어 PCR 증폭, cDNA 클로닝, 화학적 합성)에 의해 SPD-TNFSF-코딩 핵산 분자(들)를 쉽게 수득할 수 있다. 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 유사체 및 단편이 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, SPD-TNFSF를 코딩하는 핵산 분자(들)를 독립적으로 바이러스 게놈의 임의의 위치에 삽입할 수 있고, 비-필수 로커스가 특히 바람직하다. 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory)]에 기술된 바와 같이, 일상적인 분자 생물학에 의해 바이러스 내로의 삽입을 수행할 수 있다. 각각 문헌 [Chartier et al. (1996, J. Virol. 70: 4805-10)] 및 [Paul et al. (2002, Cancer gene Ther. 9: 470-7)]에 기술된 바와 같이 상동 재조합을 통해 아데노바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터 내로의 삽입을 수행할 수 있다. 예를 들어, TK, RR 및 F2L 유전자 뿐만 아니라 유전자간 영역이 종양용해성 백시니아 바이러스에서의 삽입에 특히 적절하고, E3 및 E4 영역이 종양용해성 아데노바이러스에서의 삽입에 적절하다.
추가적으로, 특정한 숙주 세포 또는 대상체에서의 고수준 발현을 제공하기 위해 코딩 뉴클레오티드 서열이 최적화될 수 있다. 실제로, 생물의 코돈 용법 패턴은 고도로 비-무작위성이고, 상이한 숙주 사이에서 코돈 사용이 현저하게 상이할 수 있다는 것이 관찰되었다. 예를 들어, 치료 유전자가 박테리아 또는 하등 진핵생물 기원으로부터일 수 있고, 따라서 코돈 용법 패턴이 고등 진핵생물 세포 (예를 들어 인간)에서의 효율적인 발현에 부적절할 수 있다. 전형적으로, 관심 숙주 생물에서 드물게 사용되는 코돈에 상응하는 하나 이상의 "천연" (예를 들어 박테리아 또는 효모) 코돈을 더욱 빈번하게 사용되는 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈으로 교체함으로써 코돈 최적화가 수행된다. 부분적인 교체로도 발현 증가가 달성될 수 있기 때문에, 드물게 사용되는 코돈에 상응하는 모든 천연 코돈을 교체할 필요는 없다.
코돈 용법 최적화에 추가로, 뉴클레오티드 서열(들)의 추가적인 변형을 통해 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현이 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, 희귀한 비-최적 코돈의 클러스터링이 집중된 영역에 존재하는 것을 방지하고/거나 발현 수준에 음성적으로 영향을 미칠 것으로 예상되는 "음성" 서열 요소를 억제하거나 변형시키도록 다양한 변형이 구상될 수 있다. 이같은 음성 서열 요소는, 비제한적으로, 매우 높은 (>80%) 또는 매우 낮은 (<30%) GC 함량을 갖는 영역; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 신장물; 불안정한 동향 또는 역전 반복 서열; R A 2차 구조; 및/또는 내부의 암호성 조절 요소 예컨대 내부 TATA-박스, 카이-부위, 리보솜 진입 부위, 및/또는 스플라이싱 도너/어셉터 부위를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 바이러스의 게놈에 삽입된 상기 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(들) 각각은 숙주 세포 또는 대상체에서의 그의 발현을 위한 적합한 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 핵산(들) 또는 그의 유도체 (즉 mRNA)의 복제, 중복, 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 수송을 포함하여, 소정의 숙주 세포 또는 대상체에서의 코딩 핵산 분자(들)의 발현을 허용하거나, 이에 기여하거나 또는 이를 조정하는 임의의 요소를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 요소가 그의 의도된 목적을 위해 협동하여 기능하도록 배열된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 허용성 숙주 세포에서의 핵산 분자의 전사 개시부터 종결인자까지의 전사를 실행시키면, 프로모터는 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 조절 서열의 선택이 핵산 분자 자체, 핵산 분자가 삽입될 바이러스, 숙주 세포 또는 대상체, 원하는 발현 수준 등과 같은 요인에 좌우될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 프로모터가 특히 중요하다. 본 발명의 맥락에서, 이는 구성적이어서 다수의 숙주 세포 유형에서 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있거나, 또는 특정 숙주 세포에 대해 특이적일 수 있거나 (예를 들어, 간-특이적 조절 서열), 또는 특이적 이벤트 또는 외인성 요인에 반응하여 (예를 들어, 온도, 영양소 첨가물, 호르몬 등에 의해) 또는 바이러스 주기의 단계 (예를 들어, 후기 또는 초기)에 따라 조절될 수 있다. 바이러스 생산을 최적화하고 발현된 폴리펩티드(들)의 잠재적인 독성을 피하기 위해, 특이적 이벤트 또는 외인성 요인에 반응하여 생산 단계 동안 억제되는 프로모터를 사용할 수도 있다.
포유동물 세포에서의 구성적 발현에 적합한 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터 (US 5,168,062), RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터 (Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)-1의 티미딘 키나제 (TK) 프로모터 및 T7 중합효소 프로모터 (WO98/10088)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 백시니아 바이러스 프로모터가 폭스바이러스에서의 발현에 특히 적합화된다. 대표적인 예는 백시니아 p7.5K, pH5R, p11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), pSE, pTK, p28, p11, pB2R, pF17R, pA14L, pSE/L, pA35R 및 pK1L 프로모터, 뿐만 아니라 합성 프로모터 예컨대 문헌 [Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23: 1094-7]; [Hammond et al., 1997, J. Virol Methods 66: 135-8]; 및 [Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8]에 기술된 것들 뿐만 아니라 초기/후기 키메라 프로모터를 비제한적으로 포함한다. 종양용해성 홍역 바이러스에 적합한 프로모터는, 비제한적으로, 홍역 전사 단위의 발현을 지시하는 임의의 프로모터를 포함한다 (Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271). 발현을 위한 적절한 프로모터를 시험관 내에서 (예를 들어, 적합한 배양 세포주에서) 또는 생체 내에서 (예를 들어 적합한 동물 모델에서 또는 대상체에서) 테스트할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 바이러스 게놈 내로 삽입된 핵산 분자(들)의 발현을 제어하는 조절 요소가 전사의 올바른 개시, 조절 및/또는 종결 (예를 들어, 폴리A 전사 종결 서열), mRNA 수송 (예를 들어, 핵 국소화 신호 서열), 프로세싱 (예를 들어, 스플라이싱 신호), 및 안정성 (예를 들어, 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열), 번역 (예를 들어, 개시인자 Met, 3부분 리더 서열, IRES 리보솜 결합 부위, 신호 펩티드 등)을 위해 추가적인 요소를 추가로 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
적절한 경우, 본 발명의 바이러스의 바이러스 게놈 내로 삽입된 유전자 (즉 SPD-TNFSF 융합 단백질) 중 적어도 하나의 발현, 수송 및 생물학적 활성을 용이하게 하기 위한 추가적인 조절 요소를 포함하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 추구될 수 있는 접근법은 본 발명의 바이러스에 의해 코딩되는 유전자 생성물을 외부 작용제 예컨대 세포독성제 및/또는 표지제에 커플링시키는 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성제"는 세포에 직접적으로 독성이어서 그의 재생 또는 성장을 방지하는 화합물 예컨대 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편)를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "표지제"는 검출가능한 화합물을 지칭한다. 표지제는 자체적으로 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는, 효소 표지의 경우에는, 검출가능한 기질 화합물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 커플링은 유전자 생성물 (SPD-TNFSF)과 외부 작용제 사이의 유전적 융합에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 TK 및 RR 활성 둘 다가 결손된 백시니아 바이러스 (바람직하게는 코펜하겐 균주로부터의 것)이고 (예를 들어, 바이러스 J2R 및 I4L 유전자 둘 다에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래됨), 그의 게놈 내에 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 삽입된다. 바람직하게는, 요소는 각각 pH5R 프로모터의 전사 제어 하에 놓인다. 바람직하게는, SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바이러스 게놈의 J2R (TK) 로커스 내에 삽입된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 TK, RR 및 M2L 활성이 결손된 백시니아 바이러스 (바람직하게는 코펜하겐 균주로부터의 것)이고 (예를 들어, 바이러스 J2R, I4L 및 M2L 유전자에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래됨), 그의 게놈 내에 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 삽입된다. 바람직하게는, 요소는 각각 pH5R 프로모터의 전사 제어 하에 놓인다. 바람직하게는, SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바이러스 게놈의 J2R (TK) 로커스 내에 삽입된다.
대안적으로, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 TK 활성이 결손된 백시니아 바이러스 (바람직하게는 와이어쓰 균주로부터의 것)이고 (바이러스 J2R 유전자에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래됨), 그의 게놈 내에 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 삽입된다.
추가적인 치료용 폴리펩티드/유전자
본 발명에 따른 바이러스가 (상기 정의된 바와 같은) 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질만 코딩할 수 있지만, 이는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 또 다른 핵산 분자를 추가로 코딩할 수도 있다.
관심 폴리펩티드를 코딩하는 상기 또 다른 핵산 분자는 바람직하게는 외래 핵산 (재조합 유전자, 트랜스진 또는 핵산으로도 지칭됨).
본 발명의 맥락에서, 바이러스 게놈 내에 삽입된 "외래 핵산"은 천연 발생 바이러스 게놈에서 발견되지 않거나 또는 이에 의해 발현되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 외래 핵산은 재조합 바이러스가 도입되는 대상체에 대해 동종성 또는 이종성일 수 있다. 더욱 구체적으로, 이는 인간 기원일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다 (예를 들어, 박테리아, 효모 또는 폭스바이러스를 제외한 바이러스 기원). 유리하게는, 상기 재조합 핵산은 폴리펩티드를 코딩하거나, 또는 이환 세포에 존재하는 상보적 세포 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, miRNA)에 상기 질환에서 수반되는 유전자를 억제하는 것을 목표로 적어도 부분적으로 (혼성화에 의해) 결합할 수 있는 핵산 서열이다. 이같은 재조합 핵산은 천연 유전자 또는 그의 일부분(들) (예를 들어 cDNA), 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 부가에 의해 수득된 그의 임의의 변이체일 수 있다.
유리한 실시양태에서, 상기 관심 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드이다. 따라서, 이러한 유리한 실시양태에서, 본 발명에 따른 바이러스 (상기 정의된 바와 같음)는 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 그의 게놈 내에 삽입된 또 다른 핵산 분자를 추가로 포함한다.
"치료용 폴리펩티드"는 치료 또는 예방될 병리학적 병태의 과정 또는 증상에 대한 이로운 효과에 이르는, 대상체에게 적절하게 투여되었을 때 치료적 또는 예방적 관심 대상인 폴리펩티드를 의미한다.
바람직하게는 치료용 폴리펩티드는 면역조정 폴리펩티드 (바람직하게는 면역자극성 폴리펩티드), 항원성 폴리펩티드, 자살 유전자 생성물, 항체, 항체의 기능적 유도체, 항체의 기능적 단편, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 면역자극성 폴리펩티드이고, 바람직하게는 시토카인, 예컨대 인터류킨, 케모카인, 인터페론, 종양 괴사 인자, 콜로니-자극 인자; APC-노출된 단백질; 자극성 면역 체크포인트의 효능제; 억제성 면역 체크포인트의 길항제; 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다
면역조정 폴리펩티드
용어 "면역조정 폴리펩티드"는 직접적으로 또는 간접적으로 면역 반응을 조정하는 것에서 수반될 수 있는 신호전달 경로의 성분을 표적화하는 폴리펩티드를 지칭한다. 면역 반응의 "조정"은 면역 체계의 세포 또는 이같은 세포 (예를 들어, T 세포)의 활성에서의 임의의 변경을 지칭한다. 이같은 조정은 다양한 세포 유형의 수의 증가 또는 감소, 이러한 세포의 활성의 증가 또는 감소, 또는 면역 체계에서 발생할 수 있는 임의의 다른 변화에 의해 구현될 수 있는 면역 체계의 자극 또는 억제를 포함한다. 바람직하게는, 이같은 폴리펩티드는 억제 경로를 적어도 부분적으로 하향-조절할 수 있고/있거나 (길항제), 자극 경로, 특히 항원 제시 세포 (APC) 또는 암 세포와 이펙터 T 세포 사이에 존재하는 면역 경로를 적어도 부분적으로 상향-조절할 수 있다 (효능제).
본 발명에 따른 벡터에 의해 발현될 수 있는 면역조정 폴리펩티드는 항원-특이적 세포의 클론 선택, T 세포 활성화, 증식, 항원 및 염증 부위로의 수송, 직접적인 이펙터 기능의 실행 및 시토카인 및 막 리간드를 통한 신호전달을 포함하는 T 세포-매개 면역의 임의의 단계에서 작용할 수 있다. 각각의 이러한 단계는 마지막으로 반응을 조율하는 자극 및 억제 신호를 균형잡히게 함으로써 조절된다.
적합한 면역조정 폴리펩티드 및 이들을 사용하는 방법이 문헌에 기술되어 있다. 예시적인 면역조정 폴리펩티드는, 비제한적으로, 하기를 포함한다:
Figure pct00007
시토카인, 예컨대 인터류킨, 케모카인, 인터페론, 종양 괴사 인자, 콜로니-자극 인자;
Figure pct00008
APC-노출된 단백질;
Figure pct00009
자극성 면역 체크포인트의 효능제;
Figure pct00010
PD-L1과 상이한 억제성 면역 체크포인트의 길항제; 및
Figure pct00011
그의 임의의 조합
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 벡터에 의해 발현될 면역조정 폴리펩티드는 시토카인이고, 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다;
Figure pct00012
인터류킨 (예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-36), IFNa, IFNg 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF);
Figure pct00013
케모카인 (예를 들어, MIPIα, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21),
Figure pct00014
인터페론 (예를 들어 IFNα, IFNγ),
Figure pct00015
종양 괴사 인자 (예를 들어 TNFα), 및
Figure pct00016
콜로니-자극 인자 (예를 들어 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)).
면역자극 폴리펩티드가 시토카인인 경우, 이는 바람직하게는 인터류킨 또는 콜로니-자극 인자이고, GM-CSF가 특히 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 벡터에 의해 발현될 면역조정 폴리펩티드는 자극성 면역 체크포인트의 효능제 또는 억제성 면역 체크포인트의 길항제이다.
용어 "면역 체크포인트"는 정상적인 생리 조건 하에 제어되지 않은 면역 반응을 방지하는데 결정적이고, 따라서 자가-내성 및/또는 조직 보호의 유지에 결정적인 면역 경로에서 직접적으로 또는 간접적으로 수반되는 단백질을 지칭한다. 면역 체크포인트는 2개의 별개의 카테고리로 분류될 수 있다: 각각 자극성 및 억제성 면역 체크포인트. "자극성 면역 체크포인트"는 면역 반응의 상향-조절에서 수반되는 면역 체크포인트를 지칭하는 한편, "억제성 면역 체크포인트"는 면역 반응의 하향-조절에서 수반된다.
자극성 면역 체크포인트는 CD28, ICOS, CD137 (4-1BB), OX40, CD70, CD40, 및 GITR을 포함하고, 자극성 면역 체크포인트의 효능제는 바람직하게는 인간 ICOSL, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40L, GITRL, 및 인간 ICOS (예를 들어 WO2018/187613), CD137 (4-1BB) (예를 들어 WO2005/035584 ), OX40 (예를 들어 US 7,291,331 및 WO03/106498), CD70 (예를 들어 WO2012/004367), CD40 (예를 들어 WO2017/184619), 또는 GITR (예를 들어 WO2017/068186)에 대한 효능제 항체로부터 선택된다. 자극성 면역 체크포인트의 일부 효능제는 TNFSF 구성원이기 때문에, 자극성 면역 체크포인트의 이같은 효능제가 본 발명에 따른 벡터에 의해 추가로 코딩되는 경우, 이는 바람직하게는 본 발명에 따른 융합 단백질의 TNFSF의 구성원 또는 그의 수용체 결합 도메인과 상이하다.
억제성 면역 체크포인트는 PD-1, SIRPa, CD47, PD-L2, LAG3, Tim3, BTLA, 및 CTLA4를 포함하고, 억제성 면역 체크포인트의 길항제는 바람직하게는 인간의 길항제 항체로부터 선택된다:
Figure pct00017
PD-1 (예를 들어, WO2004/004771; WO2004/056875; WO2006/121168; WO2008/156712; WO2009/014708; WO2009/114335; WO2013/043569; 및 WO2014/047350에 기술된 것들, 특히 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 세미플리맙),
Figure pct00018
SIRPa (예를 들어 WO2019/023347),
Figure pct00019
CD47 (예를 들어 WO2020/019135),
Figure pct00020
PD-L2 (예를 들어 WO2019/158645),
Figure pct00021
LAG3 (예를 들어 WO2018/071500),
Figure pct00022
Tim3 (예를 들어 WO2020/093023),
Figure pct00023
BTLA (예를 들어 WO2010/106051), 및
Figure pct00024
CTLA4 (예를 들어, 특히 US 8,491,895, WO2000/037504, WO2007/113648, WO2012/122444 및 WO2016/196237에 기술된 것들, 특히 브리스톨 마이어 스큅(Bristol Myer Squibb)에서 여보이(Yervoy)®로 판매하는 이필리무맙 (예를 들어, US 6,984,720; US 8,017,114 참조), MK-1308 (머크(Merck)), AGEN-1884 (아게누스 인크.(Agenus Inc.); WO2016/196237) 및 트레멜리무맙 (아스트라제네카(AstraZeneca); US 7,109,003 및 US 8,143,379) 및 단일쇄 항-CTLA4 항체 (예를 들어 WO97/20574 및 WO2007/123737 참조).
항원성 폴리펩티드
용어 "항원성"은 항원성으로 적격한 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 바이러스 (본원에서 기술된 바와 같음)가 도입된 대상체에서 측정가능한 면역 반응을 유도하거나 자극하는 능력을 지칭한다. 상기 바이러스에 의해 발현된 항원성 폴리펩티드에 대한 자극되거나 유도된 면역 반응은 체액성 및/또는 세포성 (예를 들어, 이펙터 면역 세포의 활성화에서 수반되는 항체, 시토카인 및/또는 케모카인의 생산)일 수 있다. 자극되거나 유도된 면역 반응은 일반적으로 투여된 대상체에서 보호 효과에 기여한다. 생체 내에서 (동물 또는 인간 대상체) 또는 시험관 내에서 (예를 들어 생물학적 샘플에서) 폴리펩티드의 항원성 성질을 평가하기 위해 다양한 직접적 또는 간접적 생물학적 검정법이 관련 기술분야에서 입수가능하다. 예를 들어, 특정 항원이 선천 면역을 자극하는 능력이, 예를 들어, NK/NKT-세포 (예를 들어 활성화의 대표성 및 수준), 뿐만 아니라 IFN-관련 시토카인 및/또는 케모카인 생산 케스케이드, TLR (톨(Toll)-유사 수용체)의 활성화 및 기타 선천 면역 마커의 측정에 의해 수행될 수 있다 (Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5(1), e8761; Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469; Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 2964-2968). 특정 항원이 세포-매개 면역 반응을 자극하는 능력이, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 일상적인 생물검정법을 사용한 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 유래된 것들을 포함하는 활성화된 T 세포에 의해 생산된 시토카인(들)의 정량 (예를 들어, ELISpot, 멀티파라미터 유동 세포측정법, ICS (세포내 시토카인 염색), 복합 기술 또는 ELISA를 사용한 시토카인 프로파일 분석에 의한 T 세포의 특성화 및/또는 정량)에 의해, T 세포의 증식 능력의 결정 (예를 들어, [3H] 티미딘 혼입 검정법에 의한 T 세포 증식 검정법)에 의해, 감작 대상체에서 항원-특이적 T 림프구에 대한 세포독성 능력을 검정함으로써, 또는 유동 세포측정법 및 적절한 동물 모델의 면역화에 의해 림프구 하위집단을 확인함으로써 수행될 수 있다.
항원성 폴리펩티드라는 용어는 천연 항원 뿐만 아니라 그의 단편 (예를 들어 에피토프, 면역원성 도메인 등) 및 변이체를 포괄하고, 단 이같은 단편 또는 변이체는 면역 반응의 표적일 수 있는 것으로 생각된다. 본원에서 사용하기 위한 바람직한 항원성 폴리펩티드는 종양-연관 항원이다. 특정한 병리학적 병태를 치료하는데 적절한 하나 이상의 항원성 폴리펩티드를 선택하는 것은 통상의 기술자의 범주 내에 속한다.
한 실시양태에서, 변형된 재조합 바이러스에 의해 코딩되는 항원성 폴리펩티드(들)는 암에 대한 마커와 연관되고/거나 암에 대한 마커로서의 역할을 하는 암 항원(들) (종양-연관 항원 또는 TAA로도 칭해짐)이다. 암 항원은 다양한 카테고리의 폴리펩티드, 예를 들어, 건강한 세포에서는 일반적으로 침묵성인 (즉, 발현되지 않는) 것들, 낮은 수준으로만 또는 특정 분화 단계에서만 발현되는 것들, 및 일시적으로 발현되는 것들 예컨대 배아 및 태아 항원 뿐만 아니라 세포 유전자의 돌연변이, 예컨대 종양유전자 (예를 들어, 활성화된 ras 종양유전자), 프로토-종양유전자 (예를 들어 ErbB 패밀리)로부터 초래되는 것들, 또는 염색체 전위로부터 초래되는 단백질을 포괄한다.
수많은 종양-연관 항원이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 종양 항원은, 특히, 결장직장 연관 항원 (CRC), 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원 (PSA), BAGE, GAGE 또는 MAGE 항원 패밀리, p53, 뮤신 항원 (예를 들어 MUC1), HER2/neu, p21ras, hTERT, Hsp70, iNOS, 티로신 키나제, 메조텔린, c-erbB-2, 알파 태아단백질, AM-1, 및 그의 임의의 면역원성 에피토프 또는 변이체를 비제한적으로 포함한다.
종양-연관 항원은 암 세포에서 발암 프로세스 동안 발생하고 상응하는 야생형 항원과 관련하여 아미노산 잔기(들)의 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 네오-에피토프/항원을 또한 포괄할 수 있다. 전형적으로, 이는 환자로부터 수득된 암 세포 또는 조직에서 발견되지만, 환자 또는 건강한 개인으로부터 수득된 정상 세포 또는 조직의 샘플에서는 발견되지 않는다.
종양-연관 항원은 대상체 (특히 만성적으로 감염된 대상체)에서 악성 병태를 유도할 수 있는 병원성 생물 예컨대 RNA 및 DNA 종양 바이러스 (예를 들어 인간 유두종 바이러스 (HPV), C형 간염 바이러스 (HCV), B형 간염 바이러스 (HBV), 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 등) 및 박테리아 (예를 들어 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pilori))에 의해 코딩되는 항원을 또한 포괄할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 바이러스에 의해 코딩되는 항원성 폴리펩티드(들)는 인간 또는 동물 대상체에게 전달되는 경우, 감염성 질환에 대해 치료적으로 또는 예방적으로 보호하는 것을 목표로 하는 백신 항원(들)이다. 수많은 백신 항원이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 백신 항원은 세포성 항원, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 항원을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 세포성 항원은 뮤신 1 (MUC1) 당단백질을 포함한다. 바이러스 항원은, 예를 들어, A형, B형, C형, D형 및 E형 간염 바이러스, 면역결핍 바이러스 (예를 들어 HIV), 헤르페스 바이러스, 시토메갈로바이러스, 수두 대상포진, 유두종 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라-인플루엔자 바이러스, 콕사키 바이러스, 피코르나 바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리노바이러스, 풍진 바이러스, 파포바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스 및 광견병 바이러스로부터의 항원을 포함한다. HIV 항원의 일부 비제한적인 예는 gp120, gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef tat, nef를 포함한다. 인간 헤르페스 바이러스 항원의 일부 비제한적인 예는 HSV1 또는 HSV2로부터의 gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE 또는 gD 또는 극초기 단백질 예컨대 ICP27, ICP47, ICP4, ICP36을 포함한다. 시토메갈로바이러스 항원의 일부 비제한적인 예는 gB를 포함한다. 엡 스타인 바 바이러스 (EBV)로부터 유래된 것의 일부 비제한적인 예는 gp350을 포함한다. 수두 대상포진 바이러스 항원의 일부 비제한적인 예는 gp1, 11, 111 및 IE63을 포함한다. C형 간염 바이러스 항원의 일부 비제한적인 예는 env E1 또는 E2 단백질, 코어 단백질, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7을 포함한다. 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원의 일부 비제한적인 예는 L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7을 포함한다. 기타 바이러스 병원체, 예컨대 호흡기 세포융합 바이러스 (예를 들어 F 및 G 단백질), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 플라비바이러스 (예를 들어 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 및 인플루엔자 바이러스 세포 (예를 들어 HA, NP, NA, 또는 M 단백질)로부터 유래된 항원 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 박테리아 항원은, 예를 들어, 마이코박테리아 유발 TB, 나병, 페렴구균, 호기성 그람 음성 바실루스, 마이코플라즈마, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 살모넬라에, 클라미디아에, 나이세리아에 등으로부터의 항원을 포함한다. 기생충 항원성 폴리펩티드는, 예를 들어, 말라리아, 리슈만편모충증, 파동편모충증, 톡소포자충증, 주혈흡충증 및 사상충증으로부터의 항원을 포함한다.
항체 및 그의 항원-결합 단편 또는 유도체
항-신생물성 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 특히 세포 표면 수용체의 조절에 영향을 미치는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 예컨대 항-HER2 항체 (예를 들어 트라스투주맙), 항-EGFR 항체 (예를 들어 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙), 항-VEGF 항체 (예를 들어 베바시주맙 및 라니비주맙) 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체를 포함하여, 치료 활성이 있는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체가 추가로 본 발명의 바이러스에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "항체" ("Ab")는 가장 넓은 의미로 사용되고, 바람직하게는 상기의 "일반적 정의" 섹션에서 정의된 바와 같다.
항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이고, 바람직하게는 인간화 또는 키메라 항체이다.
Fab, Fab', F(ab')2, dAb, Fd, Fv, scFv, ds-scFv 및 디아바디를 포함하여 항원-결합 단편의 대표적인 예가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 특히 유용한 항체 단편은 단일 단백질 쇄가 제조되도록 함께, 궁극적으로는 링커로 융합된 Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH을 포함하는 단일쇄 항체 (scFv)이다.
SPD-TNFSF 융합 단백질의 생산
한 실시양태에서, 바이러스는 본 발명의 맥락에서 자신이 코딩하는 하나 이상의 SPD-TNFSF 융합 단백질을 재조합 수단에 의해 생산하기 위해 사용될 수도 있다. 이는 유리하게는 숙주 세포에서 SPD-TNFSF 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 유지, 증식 또는 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 추가적인 요소(들)를 포함할 수 있다. 이같은 추가적인 요소는 (예를 들어, 세포 영양요구성의 보상에 의해 또는 항생제 저항성에 의해) 생산자 숙주 세포의 확인 및 단리를 용이하게 하기 위한 마커 유전자(들)를 포함한다. 적합한 마커 유전자는, 비제한적으로, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 디히드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); 제오마이신에 대한 저항성을 부여하는 zeo, 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 kana; 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147)를 포함한다. 기능적 TK가 결여된 재조합 바이러스 (예를 들어 SPD-TNFSF 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 J2R (TK) 로커스 내로 삽입하는 것으로부터 초래됨)를 브로모데옥시우리딘 (BrdU)을 함유하는 배지로 선택할 수 있다. 실제로, TK- 바이러스는 BrdU 약물에 불감성인 반면, TK+ 바이러스에서는 이 약물이 DNA 합성을 방해한다. 또한 리포터 발광 또는 비색 시스템에 의존할 수 있으며, 이는 예를 들어 GFP (녹색 형광 단백질), 루시페라제 및 베타-갈락토시다제를 기반으로 한다.
SPD-TNFSF 융합 단백질을 재조합으로 생산하는 방법은 관련 기술분야에서 통상적이다. 전형적으로, 이같은 방법은 (a) 본원에 기술된 바이러스를 적합한 생산자 세포 내로 도입하여, 형질감염되거나 또는 감염된 생산자 세포를 생산하는 단계, (b) 상기 형질감염되거나 또는 감염된 생산자 세포를 그의 성장에 적합한 조건 하에 시험관 내에서 배양하는 단계, (c) 하나 이상의 SPD-TNFSF 융합 단백질(들)을 세포 배양물로부터 회수하는 단계, 및 (d) 임의적으로, 회수된 SPD-TNFSF 융합 단백질(들)을 정제하는 단계를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 생산자 세포는 바람직하게는 인간 또는 비-인간 진핵생물 세포이다. 바람직한 생산자 세포는 비제한적으로 햄스터 세포주 예컨대 BHK-21 (ATCC CCL-10), CV-1 (아프리카 원숭이 신장 세포주), COS (예를 들어 COS-7) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 마우스 NIH/3T3 세포, 마우스 NSO 골수종 세포, 인간 세포주 예컨대 HeLa (ATCC-CRM-CCL-2™ 또는 ATCC-CCL-2.2™), 베로(Vero) 세포, HEK293 세포 (Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72), HER96 및 PERC.6 세포 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17), 조류 세포 (예를 들어, 본원에 기술되고 WO2005/042728, WO2006/108846, WO2008/129058, WO2010/130756, WO2012/001075 등에 기술된 바와 같은 닭, 오리 세포) 뿐만 아니라 수정란으로부터 수득된 닭 배아로부터 제조된 1차 닭 배아 섬유모세포 (CEF)를 포함한다.
통상적인 발효 생물반응기, 플라스크 및 페트리접시에서 생산자 세포를 배양할 수 있다. 배양은 소정의 숙주 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 본원에서는 진핵생물 세포에서 단백질을 생산하기 위해 공지된 다양한 방법을 상세하게 기술하려는 시도가 이루어지지 않을 것이다. SPD-TNFSF 융합 단백질의 생산은 세포내일 수 있거나 또는 바람직하게는 생산자 세포 외부로 (예를 들어 배양 배지 내에) 분비될 수 있다.
바이러스는 본 발명에 따라 사용되기 전에 적어도 부분적으로 단리될 수 있다. 정화, 효소 처리 (예를 들어 벤조나제, 프로테아제), 크로마토그래피 및 여과 단계를 포함하여 다양한 정제 단계가 구상될 수 있다. 적절한 방법이 관련 기술분야에 기술되어 있다 (예를 들어 WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764).
그 후, SPD-TNFSF 융합 단백질을 널리 공지된 정제 방법에 의해 정제할 수 있다. 특정한 단백질을 정제하기 위해 사용된 조건 및 기술은 발현 조건, 순전하, 분자량, 소수성, 친수성과 같은 요인에 좌우될 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 또한, 정제 수준은 의도되는 용도에 좌우될 것이다. 필요하다면, 특히 SPD-TNFSF 융합 단백질이 생산자 세포 외부로 분비되지 않거나 또는 완전히 분비되지 않는 경우, 이를 동결 해동, 초음파처리, 기계적 파괴, 용해제 사용 등을 포함하는 표준 용해 절차에 의해 회수할 수 있다. 분비된다면, 이를 배양 배지로부터 직접적으로 회수할 수 있다. 정화 (예를 들어 황산암모늄 침전, 산 추출), 효소 처리 (예를 들어 벤조나제, 프로테아제), 크로마토그래피 (예를 들어 역상, 크기 배제, 이온 교환, 친화성, 포스포셀룰로스, 소수성-상호작용 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 등) 및 여과 단계를 비제한적으로 포함하여, 다양한 정제 단계가 구상될 수 있다. 적절한 방법이 관련 기술분야에 기술되어 있다 (예를 들어 WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764). 바람직하게는, 본 발명의 바이러스로부터 재조합으로 생산된 SPD-TNFSF 융합 단백질은 다른 세포 물질이 실질적으로 없다는 점에서 적어도 부분적으로 정제된다. 추가로, 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 조건에 따라 SPD-TNFSF 융합 단백질이 제형화될 수 있다 (예를 들어 WO2009/073569).
치료 용도
본 발명은 임의적으로 제약상 허용되는 비히클과 함께, 치료적 유효량의 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 이같은 조성물은 1회 또는 수회로 동일하거나 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다.
"치료적 유효량"은 하나 이상의 이로운 결과를 일으키는데 충분한 SPD-TNFSF 융합 단백질 또는 바이러스의 양에 상응한다. 이같은 치료적 유효량은 다양한 파라미터, 특히 투여 양식; 질환 상태; 대상체의 연령 및 체중; 대상체가 치료에 반응하는 능력; 동반 치료의 종류; 치료 빈도; 및/또는 예방 또는 요법에 대한 필요성의 함수로서 변할 수 있다. 예방적 용도가 관련되는 경우, 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스 또는 조성물은, 특히 위험에 있는 대상체에서, 병리학적 병태 (예를 들어 증식성 질환 예컨대 암)의 발병 및/또는 확립 및/또는 재발을 방지하거나 지연시키는데 충분한 용량으로 투여된다. "치료적" 용도를 위해, 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스 또는 조성물은, 궁극적으로는 하나 이상의 통상적인 치료 양식과 회합되어, 질환을 치료하는 것을 목표로 병리학적 병태 (예를 들어 증식성 질환 예컨대 암 또는 TNF 시토카인 기능장애와 연관된 장애)에 걸린 것으로 진단된 대상체에게 투여된다. 특히, 치료적 유효량은 기준선 상태에 비해 또는 치료되지 않은 경우의 예상 상태에 비해 임상 상태의 관찰가능한 개선, 예를 들어 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행 또는 중증도의 지연 또는 감속, 질환 상태의 호전 또는 완화, 생존 연장, 표준 치료에 대한 더 양호한 반응, 삶의 질 개선, 사망률 감소, 종양 수의 감소, 종양 크기의 감소, 전이 수 또는 정도의 감소, 관해 길이의 증가 등을 야기하는데 필요한 양일 수 있다. 치료적 유효량은 효과적인 비-특이적 (선천적) 및/또는 특이적 면역 반응 예컨대 종양 면역 반응의 발달을 야기하는데 필요한 양일 수도 있다. 전형적으로, 면역 반응, 특히 T 세포 반응의 발달을 시험관 내에서, 적합한 동물 모델에서, 또는 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 실험실에서 일상적으로 사용되는 기술 (예를 들어 유동 세포측정법, 조직학)을 사용하여 종양 감시를 수행할 수 있다. 치료된 대상체에 존재하는 항-종양 반응에서 수반되는 상이한 면역 세포 집단, 예컨대 세포독성 T 세포, 활성화된 세포독성 T 세포, 천연 킬러 세포 및 활성화된 천연 킬러 세포를 확인하도록 다양한 입수가능한 항체를 사용할 수도 있다. 의사 또는 기타 숙련된 의료진이 전형적으로 사용하는 임의의 관련된 임상 측정에 의해 임상 상태의 개선을 쉽게 평가할 수 있다.
용어 "제약상 허용되는 비히클"은 포유동물, 특히 인간 대상체에서의 투여와 상용성인 임의의 모든 담체, 용매, 희석제, 부형제, 아주반트, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 흡수제 등을 포함하도록 의도된다.
SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스 또는 그의 조성물은 인간 또는 동물 용도에 적절한 용매 또는 희석제에 놓일 수 있다. 용매 또는 희석제는 바람직하게는 등장성이거나, 저장성이거나 또는 약하게 고장성이고, 이온 강도가 비교적 낮다. 대표적인 예는 멸균수, 생리식염수 (예를 들어 염화나트륨), 링거액, 글루코스, 트레할로스 또는 사카로스 용액, 행크 용액, 및 기타 수성 생리학적 평형 염 용액을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins]의 최신판 참조).
한 실시양태에서, SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스 또는 그의 조성물은 인간 용도를 위해 적합하게 완충된다. 적합한 완충제는 생리학적이거나 또는 약간 염기성인 pH (예를 들어, 대략 pH 7 내지 대략 pH 9)를 유지할 수 있는 포스페이트 완충제 (예를 들어 PBS), 비카르보네이트 완충제 및/또는 Tris 완충제를 비제한적으로 포함한다.
SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스 또는 그의 조성물은 예를 들어 오스몰농도, 점도, 투명도, 색상, 무균성, 안정성, 제형의 용해 속도를 포함하는 바람직한 제약 또는 또는 약역학 성질을 제공하고, 인간 또는 동물 대상체 내로의 방출 또는 흡수를 변형시키거나 유지시키고, 혈액 장벽을 가로지르는 운반 또는 특정 기관에서의 침투를 촉진하기 위한 다른 제약상 허용되는 부형제를 또한 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 바이러스 조성물은 알룸, 미네랄 오일 에멀션 예컨대 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 (IFA), 리포폴리사카라이드 또는 그의 유도체 (Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419), 사포닌 예컨대 QS21 (Sumino et al., 1998, J. Virol. 72: 4931; WO98/56415), 이미다조퀴놀린 화합물 예컨대 이미퀴모드(Imiquimod) (Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43:S6), S-27609 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324) 및 관련 화합물 예컨대 WO2007/147529에 기술된 것들, 시토신 포스페이트 구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드 예컨대 CpG (Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358) 및 양이온성 펩티드 예컨대 IC-31 (Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 822: 263-70)을 비제한적으로 포함하여, 투여 시, 예를 들어 톨-유사 수용체 (TLR) 예컨대 TLR-7, TLR-8 및 TLR-9를 통해, 면역 (특히 T 세포-매개 면역)을 자극할 수 있거나 또는 종양 세포의 감염을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 아주반트(들)를 또한 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스 또는 조성물은, 특히 냉동 (예를 들어 -70℃, -20℃), 냉장 (예를 들어 4℃) 또는 주위 온도에서 제작하고 장기 보관 (즉, 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 2년 동안)하는 조건 하에서, 그의 안정성을 개선하는 것을 목표로 제형화될 수 있다. 다양한 바이러스 제형이 냉동된 액체 형태 또는 동결건조 형태로 관련 기술분야에서 입수가능하다 (예를 들어 WO98/02522, WO01/66137, WO03/053463, WO2007/056847 및 WO2008/114021, WO2016087457 등). 진공 건조 및 냉동-건조를 수반하는 프로세스에 의해 고체 (예를 들어 건조 분말화되거나 동결건조됨) 조성물을 수득할 수 있다 (예를 들어 WO2014/053571 참조). 예시 목적을 위해, NaCl 및/또는 당을 포함하는 완충된 제형이 바이러스의 보존에 특히 적합화된다 (예를 들어 S01 완충제: 342.3 g/L 사카로스, 10 mM Tris, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 54 mg/L, 트윈(Tween) 80; ARME 완충제: 20 mM Tris, 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤 (w/v), pH 8.0; S520 완충제: 100 g/L 사카로스, 30 mM Tris, pH 7.6; S08 완충제: 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 50 g/L 사카로스, 10 mM 글루탐산나트륨, pH 8.0).
특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 조성물은 생체 내에서 올바른 분포 또는 지연 방출을 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 이는 리포솜 내에 제형화될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이같은 제형의 제조를 위한 다수의 방법이, 예를 들어, 문헌 [J. R. Robinson, "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]에 기술되어 있다.
SPD-TNFSF 융합 단백질의 적절한 투여량이 다양한 파라미터의 함수로서 개조될 수 있고, 관련 상황의 견지에서 의사에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. SPD-TNFSF 융합 단백질에 대한 적합한 투여량은 단백질의 투여 경로 및 사용된 정량 기술에 따라 0.001 내지 대략 100 mg/kg에 이른다. 일반적인 지침으로서, 샘플 내에 존재하는 SPD-TNFSF 융합 단백질의 양을 일상적인 적정 기술, 예를 들어 UV 흡광도 또는 ELISA에 의해 결정할 수 있다.
바이러스의 적절한 투여량이 다양한 파라미터의 함수로서 개조될 수 있고, 관련 상황의 견지에서 의사에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 바이러스에 대한 적합한 투여량은 바이러스 및 사용된 정량 기술에 따라 대략 104 내지 대략 1013 vp (바이러스 입자), iu (감염 단위) 또는 pfu (플라크-형성 단위)에 이른다. 일반적인 지침으로서, 대략 104 내지 대략 1013 pfu, 바람직하게는 대략 106 pfu 내지 대략 1011 pfu, 보다 바람직하게는 대략 107 pfu 내지 대략 5x109 pfu의 백시니아 바이러스 용량이 적합하고, 특히 인간 용도의 경우 대략 108 pfu 내지 대략 109 pfu의 용량이 특히 바람직하다. 샘플 내에 존재하는 바이러스의 양을 일상적인 적정 기술에 의해, 예를 들어, 허용성 세포 (예를 들어 BHK-21 또는 CEF)를 사용하여 허용성 세포의 감염 후에 플라크의 수를 카운팅함으로써, 면역염색 (예를 들어, 항-바이러스 항체를 사용함; Caroll et al., 1997, Virology 238: 198-211)에 의해, A260 흡광도 (vp 역가)를 측정함으로써, 또는 정량적 면역형광 (iu 역가)에 의해 결정할 수 있다.
투여
본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스 또는 조성물은 단일 용량 (예를 들어 볼루스 주사) 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 다중 투여의 경우, 이는 동일하거나 상이한 경로에 의해 수행될 수 있고, 동일 부위 또는 대안적 부위에서 일어날 수 있다. 휴식 기간 후에 반복되는 순차적 투여 사이클을 통해 진행될 수도 있다. 각각의 투여 사이의 간격은 수시간 내지 1년 (예를 들어 24h, 48h, 72h, 매주, 2주마다, 매달 또는 매년)일 수 있다. 간격은 불규칙적일 수도 있다 (예를 들어, 종양 진행 후). 용량은 상기 기술된 범위 내에서 각각의 투여에 대해 다를 수 있다.
비경구, 국소 또는 점막 경로를 포함하여, 임의의 통상적인 투여 경로가 본 발명의 맥락에서 적용가능하다. 비경구 경로는 주사 또는 주입으로서의 투여에 의도된다. 통상적인 비경구 주사 유형은 정맥내 (정맥 내로), 동맥내 (동맥 내로), 피내 (진피 내로), 피하 (피부 아래로), 근육내 (근육 내로) 및 종양내 (종양 내로 또는 종양 가까이에)이다. 주입은 전형적으로 정맥내 경로에 의해 제공된다. 점막 투여는 비제한적으로 경구/소화기, 비강내, 기관내, 폐내, 질내 또는 직장내 경로를 포함한다. 경피 수단 (예를 들어 패치 등)을 사용하여 국소 투여 또한 수행될 수 있다. 투여는 통상적인 주사기 및 바늘 (예를 들어 쿼드라퓨즈(Quadrafuse) 주사 바늘) 또는 대상체에서 활성 작용제(들)의 전달을 용이하게 하거나 개선할 수 있는 관련 기술분야에서 입수가능한 임의의 화합물 또는 디바이스를 사용할 수 있다. 바이러스에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내 및 종양내 경로를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 바이러스는 107 내지 5×109 pfu 범위 내의 용량으로 1회 또는 수 회 (예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 등) 투여될 수 있다. 각각의 투여 사이의 시간 간격은 대략 1일 내지 대략 8주, 유리하게는 대략 2일 내지 대략 6주, 바람직하게는 대략 3일 내지 대략 4주, 보다 더 바람직하게는 대략 1주 내지 대략 3주 (예를 들어, 2주마다)로 다를 수 있다. 바람직한 치료 체계는 대략 1 또는 2주 간격의 108 또는 109 pfu의 종양용해성 백시니아 바이러스의 2 내지 5회 (예를 들어 3회)의 정맥내 또는 종양내 투여를 수반한다.
또한 본 발명은 증식성 질환 예컨대 암 또는 TNF 시토카인 기능장애와 연관된 장애 예컨대 감염성 질환, 염증성 질환, 대사 질환, 자가면역 질환, 퇴행성 질환, 아폽토시스-연관 질환 및 이식 거부를 치료하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 또한 본 발명은 증식성 질환 예컨대 암의 치료 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 또한 본 발명은 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 또한 본 발명은 종양 세포에 대한 면역 반응을 강화하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 바이러스의 투여는 면역 반응을 유발하고/거나, 자극하고/거나, 다시 지향시킨다. 특히, 투여는, 예를 들어 상기 바이러스에 대해 또는 궁극적으로는 바이러스 게놈 내에 삽입된 SPD-TNFSF 핵산 분자(들)에 의해 코딩되는 생성물 (존재하는 경우)에 대해, 치료된 숙주에서 보호성 T 또는 B 세포 반응을 유도한다. 보호성 T 반응은 CD4+ 또는 CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+ 둘 다의 세포에 의해 매개될 수 있다. 면역화된 동물 또는 대상체로부터 수집된 임의의 샘플 (예를 들어 혈액, 기관, 종양 등)로부터 B 세포 반응을 ELISA로 측정할 수 있고 T 세포 반응을 통상적인 ELISpot, ICS 검정법으로 평가할 수 있다.
한 실시양태에서, 종양용해성 바이러스의 투여는 종양 내의 이펙터 세포, 특히 이펙터 T 림프구의 활성을 강화하고/거나 적어도 부분적인 Treg 고갈을 촉진하는 것을 목표로 종양 미세환경을 변화시키는 것을 또한 허용한다. 예를 들어 통상적인 면역염색 검정법에 의해 종양 침윤 세포를 쉽게 확인할 수 있다.
용어 "치료적 유효량"과 관련하여 상기 기술된 바와 같이 더 높은 치료 효능이 입증될 수 있고, 더 긴 생존이 특히 바람직하다.
본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스, 조성물 또는 방법을 사용하여 치료될 수 있는 장애의 예는 하기를 비제한적으로 포함한다:
√ 증식성 질환
o 암, 예를 들어, 골암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 식도암, 구인두암, 폐암, 두경부암, 피부암, 흑색종, 자궁암, 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 직장암, 항문 부위의 암, 전립선암, 림프종, 내분비계의 암, 갑상선암, 연부조직 육종, 만성 또는 급성 백혈병, 방광암, 신장암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 신경아교종, 교모세포종 등. 본 발명의 SPD-TNFSF 융합 단백질 또는 바이러스를 사용하여 치료될 수 있는 바람직한 암은 전형적으로 면역요법에 대해 반응성인 암을 포함한다. 치료를 위한 바람직한 암의 비제한적인 예는 흑색종 (예를 들어 전이성 악성 흑색종), 신장암 (예를 들어 투명 세포 암종), 전립선암 (예를 들어 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 결장직장암, 폐암 (예를 들어 비-소세포 폐암) 및 간암 (예를 들어 간암종)을 포함한다.
o 심혈관 질환, 예를 들어 재협착
√ TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애:
o 감염성 질환, 예를 들어 HIV 감염, 특히 만성 바이러스 질환, 예컨대 A, B 또는 C형 간염, 헤르페스, 결핵, 엡스타인-바 바이러스, 시토메갈로바이러스, 존 커닝햄 바이러스 및 인간 유두종 바이러스, 황열, 뎅기, 플라비바이러스, 인플루엔자 바이러스, 출혈성 감염성 질환 (마르부르크 또는 에볼라 바이러스), 및 중증 급성 호흡 증후군 (SARS), 박테리아성 감염성 질환, 예컨대 리지오넬라병 (리지오넬라), 성 매개 질환 (예를 들어 클라미디아 또는 임질), 위 궤양 (헬리코박터), 콜레라 (비브리오), 디프테리아, 이. 콜라이, 스타필로코쿠스, 살모넬라 또는 스트렙토코쿠스에 의한 감염 (파상풍); 원충 병원체에 의한 감염 예컨대 말라리아, 수면병, 리슈마니아증; 톡소플라스마증, 즉 플라스모디움(Plasmodium), 트리파노소마(Trypanosoma), 리슈마니아(Leishmania) 및 톡소플라스마(Toxoplasma)에 의한 감염; 또는 예를 들어 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 야기되는 진균 감염;
o 염증성 질환, 예를 들어 셀리악병, 혈관염, 루푸스, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 과민성 장 질환, 아테롬성동맥경화증, 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 결장염, 만성 활성 간염, 피부염 및 건선;
o 대사 질환, 예를 들어 당뇨병, 시스틴증, 이상지질혈증, 갑상선항진증, 갑상선저하증, 고지질혈증, 저지질혈증, 갈락토스혈증, 비만, 고셰병 및 페닐케톤뇨증;
o 자가면역 질환, 예를 들어 전신 홍반 루프스, 류머티스성 관절염 및 쇼그렌 증후군
퇴행성 질환, 예를 들어 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅턴병, 황반 변성, 다발성 경화증, 근육 디스트로피, 니만-픽병, 뉴런 세로이드 리포푸신증, 골다공증
o 아폽토시스-연관 질환
o 이식 거부
본 발명에 따른 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스, 조성물 또는 방법은 항암 요법에서 효과적인 하나 이상의 물질 또는 요법과 회합될 수 있고, 본 발명은 대상체에게 추가적인 암 요법을 전달하는 단계를 포함하는 방법에 또한 관련된다. 본 발명의 맥락에서, 상기 추가적인 암 요법은 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 그의 조합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 항암 요법에서 효과적인 하나 이상의 물질의 투여를 포함한다. 본 발명에 따른 SPD-TNFSF 융합 단백질, 바이러스, 조성물 또는 방법과 회합되어 또는 조합되어 사용될 수 있는 항암 요법에서 효과적인 제약 물질 중에서, 하기의 것들이 더욱 구체적으로 언급될 수 있다:
√ 알킬화제, 예를 들어 미토마이신 C, 시클로포스파미드, 부술판, 이포스파미드, 이소스파미드, 멜팔란, 헥사메틸멜라민, 티오테파, 클로람부실 또는 다카르바진;
√ 항대사물질, 예를 들어 젬시타빈, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 2-플루오로데옥시 시티딘, 메토트렉세이트, 이다트렉세이트, 토무덱스 또는 트리메트렉세이트;
√ 토포아이소머라제 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 테니포시드 또는 미톡산트론;
√ 토포아이소머라제 I 억제제, 예를 들어 이리노테칸 (CPT-11), 7-에틸-10-히드록시-캄프토테신 (SN-38) 또는 토포테칸;
√ 항유사분열 약물, 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈;
√ 백금 유도체, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 스피로플라티넘 또는 카르보플라티넘;
√ 티로신 키나제 수용체의 억제제 예컨대 수니티닙 (화이자(Pfizer)) 및 소라페닙 (바이엘(Bayer));
√ 항-신생물성 항체, 특히 세포 표면 수용체의 조절에 영향을 미치는 항체 예컨대 트라스투주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 베바시주맙 및 라니비주맙;
√ EGFR (표피 성장 인자 수용체) 억제제 예컨대 제피티닙, 에를로티닙 및 라파티닙; 및
√ 면역조정제, 예를 들어 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터류킨 (특히 IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12) 또는 종양 괴사 인자;
본 발명에 따른 SPD-TNFSF 융합 단백질, 발현 벡터, 조성물 또는 방법은 방사선요법과 회합되어 사용될 수도 있다.
본 발명은 각각의 투여될 바이러스 용량에 대한 상이한 용기 (예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 임의적으로, 키트는 활성 작용제의 투여를 수행하기 위한 디바이스를 포함할 수 있다. 키트는 키트 내의 조성물 또는 개별적인 성분 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 포장 삽입물도 포함할 수 있다.
물질 및 방법
관련 기술분야의 통상의 기술자는 대체물, 변이체, 부가, 결실, 변형 및 치환을 포함하는, 본원에 기술된 특정한 방법 및 시약에 대한 수많은 등가물을 일상적일 뿐인 실험을 사용하여 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이같은 등가물은 본 발명의 범주 내인 것으로 간주되고, 하기 청구범위에 의해 포괄된다.
바이러스 및 플라스미드
VVTG18058 (빈 VACV, VACV 대조군, 또는 비아암화된 대조군 VACV)은 J2R 및 I4L 유전자가 결실된 백시니아 바이러스 (코펜하겐 균주)이다. VVTG18058은 비아암화된 대조군 바이러스로서 사용되었다. VVTG18058은 닭 배아 섬유모세포 (CEF)에서 생산되었다. 베로 세포 상에서 플라크 검정법으로 적정이 수행되었다.
플라스미드 pTG19274는 비관련된 FLAG-태그부착된 분자를 코딩하는 플라스미드이다. 플라스미드 pTG19274는 음성 대조군으로서 사용된다.
플라스미드 pTG19333은 트랜스진이 없는 플라스미드이다. 플라스미드 pTG19333은 음성 대조군으로서 사용된다.
플라스미드 pTG19325는 융합 단백질 SPD (M1-G257, P35247 넘버링)-CD40L (P29965 넘버링으로부터의 H47 내지 L261) 구축물 (서열식별번호: 50)을 코딩하는 플라스미드이다.
플라스미드 pTG19344는 이종 신호 펩티드에 이어지는 CD40L 세포외 도메인으로 이루어진 가용성 CD40L (G116 내지 L261) (서열식별번호: 51)을 코딩하는 플라스미드이다.
플라스미드 pTG19965는 인간 SPD (A21 내지 G257)-CD40L (N119 내지 L261) 상류의 이종 신호 펩티드를 코딩하는 플라스미드이다. 이러한 구축 (서열식별번호: 52)은 이종 신호 펩티드, 더 짧은 형태의 CD40L, 및 C-말단의 FLAG 태그를 함유한다.
플라스미드 pTG20032는 이종 신호 펩티드에 이어지는 4-1-BBL 세포외 도메인으로 이루어진 4-1-BBL (D80 내지 E254) 엑토도메인 (서열식별번호: 53)을 코딩하는 플라스미드이다.
본 발명에 따른 상이한 SPD-TNFSF 구축을 보유하는 전달 플라스미드가 하기 표 2에서 기술된다.
Figure pct00026
표 2. 본 발명에 따른 SPD-TNFSF 구축물의 디자인 및 상응하는 플라스미드. ([N-말단]은 서열식별번호: 1에 의해, [코일드-코일 넥 도메인]은 서열식별번호: 23에 의해, [CD40L]은 서열식별번호: 24에 의해, [4-1BBL]은 서열식별번호: 28에 의해 정의되고, 콜라겐 도메인은 표 1에 따라 정의됨).
COPTG19967은 pTG19967의 발현 서열이 그의 J2R 로커스 내에 삽입된 이중 결실 (tk- 및 rr-)의 재조합 코펜하겐 백시니아 바이러스이다.
COPTG19968은 pTG19968의 발현 서열이 그의 J2R 로커스 내에 삽입된 이중 결실 (tk- 및 rr-)의 재조합 코펜하겐 백시니아 바이러스이다.
COPTG19969는 pTG19969의 발현 서열이 그의 J2R 로커스 내에 삽입된 이중 결실 (tk- 및 rr-)의 재조합 코펜하겐 백시니아 바이러스이다.
감염/형질감염 실험
재조합 단백질의 발현 방법은 감염/형질감염 방법이다. 이같은 방법은 세포, 예를 들어 HeLa 세포를 백시니아 바이러스 (폭스바이러스)로 감염시키고, 상기 세포를 폭스바이러스 프로모터의 조절 제어 하의 관심 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시키는 것으로 이루어진다. 이같은 방법은 세포 내에서의 코딩된 관심 유전자의 발현을 허용한다. 추가 분석을 위해 발현 생성물이 상청액 내에서 회수될 수 있다.
VACV (백시니아 바이러스) 게놈 내에 벡터화될 가장 효과적인 SPD-TNFSF 구축을 선택하는 것을 목표로 HeLa 세포에서의 공동-감염/형질감염이 수행되었다.
간략하게, 감염 2일 전에, 세포를 6-웰 플레이트에서 4E+05개 세포/웰/3 mL의 완전 배지 (DMEM 4 깁코(Gibco) ref. 41966-029; 글루타민 2 mM; 젠타마이신 40 μg/mL; 10% 소 태아 혈청 (FBS))로 시딩하였다.
감염 전에, 배양 배지를 제거하고, MOI 1에 상응하는 PBS+ (PBS + 1 % 양이온) 내의 400 μL의 백시니아 바이러스 제제 (VVTG18058)로 교체하였다. 30분 후, 실온 (RT)에서, 바이러스 접종원을 제거하고, FBS가 없는 1.2 mL의 완전 배지로 교체하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 공급사의 프로토콜에 따라 각각의 웰에 4.5 μL의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로젠(Invitrogen), 11668-027)과 함께 제형화된 1 μg의 플라스미드 DNA를 첨가함으로써 형질감염이 수행되었다. pTG19274 (비관련된 FLAG-태그부착된 분자를 코딩함)가 음성 대조군으로서 사용되었다. 감염/형질감염을 삼중으로 수행하였다. 플레이트를 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배양 상청액을 수집하고, 원심분리하고, 0.1 μm 필터에서 여과하여, 모든 바이러스 입자 및 세포 잔해물을 제거하였다. 정화된 상청액을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
재조합 바이러스를 사용한 발현 실험
감염 전날 HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 1.5E+06개 세포/웰/2 mL의 완전 배지 (DMEM 4 깁코 ref. 41966-029; 글루타민 2 mM; 젠타마이신 40 μg/mL; 10% FBS)로 시딩하였다. 세포를 MOI 0.1로 하기 바이러스 중 하나로 감염시켰다: COPTG19968, COPTG19967, COPTG19969 또는 VVTG18058. 30분의 인큐베이션 후, 배양 배지를 폐기하고, 2 mL의 DMEM; 글루타민 2 mM; 젠타마이신 40 μg/mL로 교체하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2로 48시간 동안 인큐베이션한 후, 배양 상청액을 회수하고, 상기 기술된 바와 같이 처리하였다.
CD40L 및 4-1BBL 이뮤노블롯
감염/형질감염으로부터의 25 μL의 샘플 (정화된 상청액)을 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 (환원) 또는 함유하지 않는 (비-환원) 램리(Laemmli) 완충제 (바이오래드(Biorad), 161-0747)로 처리하였다. 환원 조건의 경우, 샘플을 3분 동안 95℃에서 가열하였다. 그 후, 샘플을 폴리-아크릴아미드 겔 (TGX 4-15% 스테인 프리(Stain Free), 바이오래드) 상에 로딩하고, Tris 글리신 SDS 완충제 (바이오래드 161-0772)에서 이동을 수행하였다. 미디 프로그램 고분자량(Midi Program High Molecular weight) 상에 설정된 트랜스블롯 터보 시스템(Transblot Turbo System) (바이오래드)을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 후, 아이바인드 플렉스 웨스턴 시스템(Ibind Flex Western System) (인비트로젠 참조번호 SLF2000)을 사용하여 블롯을 2 μg/mL의 항-FLAG-HRP 접합 항체 (시그마(Sigma) A8592)와 함께 인큐베이션하였다. 양성 대조군은 FLAG-태그부착된 재조합 단백질을 코딩하는 비관련된 플라스미드 (pTG19274)로의 감염/형질감염으로부터의 배양 배지였다. 블롯을 HRP 기질과 함께 인큐베이션하고 (아머샴 ECL 프라임(Amersham ECL Prime) 웨스턴 블롯팅 검출), 케미독(Chemidoc) 기구로 발광을 기록하였다.
CD40 ELISA
CD40-Fc를 50 mM 카르보네이트 완충제 pH 9.6 내의 0.5 μg/mL로 메디소프(Medisorp) (눈크(Nunc)) 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 감염/형질감염 실험의 정화된 상청액을 10배 희석하고, ELISA 플레이트의 첫번째 웰에 첨가하고, 추가로 플레이트 상에서 직접적으로 ELISA 포화 완충제에서 2배 연속 희석하였다. 결합된 CD40L을 포화 완충제에서 1000배 희석된 비-경쟁적 항-인간 CD40L (MCA1561 바이오래드)을 첨가함으로써 검출하였다. 그 후, 2000배 희석된 항-마우스 면역글로불린-HRP 접합 항체 (다코(Dako) P0447)를 각각의 웰에 첨가하였다. 마지막으로, HRP 기질 (3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘) TMB를 각각의 웰에 첨가하고, TECAN 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm 흡광도를 측정하고, 광학 밀도 (OD) 450 nm 대 1/배양 상청액 희석률을 그래프패드(GraphPad) 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.
CD40 효능제 활성
HEK-블루 CD40L 세포 (인비보젠(Invivogen): hkb-cd40)는 CD40 유도성 프로모터의 전사 제어 하에 인간 CD40 및 리포터 효소 (분비형 배아 알칼리성 포스파타제: SEAP) 둘 다를 발현하도록 형질전환된 재조합 세포이다. CD40의 활성화 시, SEAP가 생산되고, 공급사의 권고사항에 따라 배양 배지에서 그의 효소 활성을 측정한다. SEAP 활성은 CD40 효능제 활성에 비례한다.
공급사의 설명서에 따라 측정을 수행하였다. 간략하게, 90 μL 내의 50,000개의 HEK-블루 CD40L 세포를 96-웰 플레이트에 분배하고, 상기 기술된 감염/형질감염에 의해 생성된 정화된 상청액의 연속 희석물 20 μL와 함께 인큐베이션하였다. 37℃ 및 5% CO2에서의 24시간의 인큐베이션 후, 40 μL의 배양 배지를 160 μL의 SEAP 기질 (인비보젠: hb-det2)과 함께 옮기고, 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 nm에서의 흡광도를 측정하고, 광학 밀도 대 1/상청액 희석률을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.
4-1BB 효능제 활성
공급사의 설명서에 따라 4-1BB 바이오어세이 프로메가 키트 (JA2351)를 사용하였다. 간략하게, 25 μL의 이펙터 세포/웰을 25 μL 배지와 혼합하였다. 그 후, 정화된 상청액의 연속 희석물 25 μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 세포를 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 75 μL/웰의 재구성된 바이오-글로(Bio-Glo) (프로메가, G7941)를 첨가하고, 베르톨드(Berthold) 판독기 및 마이크로윈(MikroWin) 2000 소프트웨어를 사용하여 발광을 기록하였다. 발광 대 1/상청액 희석률을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하고, 4-파라미터 로지스틱 곡선 분석을 수행하였다.
벡터화 및 바이러스 생산
상기 기술된 감염/형질감염 실험에서 사용된 것과 동일한 플라스미드를 사용하여 재조합 바이러스가 생성되었다. 간략하게, 닭 배아 섬유모세포 (CEF)를 J2R (TK) 로커스에서 GFP를 코딩하고 I4L (RR) 유전자가 결실된 모체 바이러스로 감염시켰다. 감염된 세포를 재조합 상해물 (상류 및 하류 J2R (TK) 로커스의 DNA 서열 호모로그)이 플랭킹된 발현 카세트를 보유하는 전달 플라스미드로 형질감염시켰다. "백색" (즉 GFP 음성) 용해 플라크를 채집함으로써 쌍안 현미경 하에 재조합 바이러스가 선택된다. PCR 증폭에 이어지는 DNA 시퀀싱에 의해 발현 카세트를 점검하였다.
생체내 실험의 경우, F500에서 배양된 CEF (MOI 0.05, 72시간)에서 재조합 바이러스가 생산되었다. 바이러스를 함유하는 세포 현탁액을 인-라인 챔버가 장착된 균질화 혼합기를 사용하여 균질화하였다. 그 후, 대형 세포 잔해물을 5 μm 세공 크기의 필터를 사용하여 심층 여과에 의해 제거하였다. 이어서, 정화된 바이러스 현탁액을 농축하고, 접선 유동 여과 및 0.2 μm 세공 크기의 중공 섬유 미세여과 필터를 사용하여 제형 완충제 (사카로스 50 g/L, NaCl 50 mM, Tris 10 mM, 글루탐산나트륨10 mM, pH 8)로 투석여과하였다. 정제된 바이러스를 분취하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 / 결과
신규 구축물의 발현
상기 기술된 바와 같은 상이한 SPD-TNFSF 구축을 보유하는 전달 플라스미드 (pTG19965, pTG19966, pTG19967, pTG19968, pTG19969)로 HeLa 세포를 감염시키고 형질감염시켰다. 배양 상청액 내의 재조합 SPD-TNFSF 단백질의 발현을 검출을 위해 항-FLAG 태그를 사용하여 이뮤노블롯에 의해 평가하였다. 도 1A 및 1B는 모든 SPD-TNFSF 융합 단백질이 환원 조건에서 예상된 단량체 크기로 발현되었고, 비-환원 조건에서는 상이한 정도의 올리고머화를 나타냈음을 제시한다. 디술피드 결합에 의해 고정되지 않은 올리고머는 전기영동의 변성 조건에서 단량체로서 이동한다는 것을 주지한다.
본 발명에 따른 융합 단백질이 기존의 융합 단백질에 비교하여 분자 크기가 더 작다는 것 또한 특정한 이점이다.
Figure pct00027
표 3. 본 발명에 따른 SPD-TNFSF 구축물의 분자 크기
흥미롭게, pTG19967에 의해 코딩되는 구축물은 또한 비-환원 조건에서 명확한 올리고머화를 나타냈고, 삼량체가 주요 밴드 (~75 kDa)였지만, 육량체 (~150 kDa) 및 그 초과의 올리고머 또한 명확하게 가시적이였다.
융합 단백질이 종래 기술의 개시내용에 비교하여 삼량체성 형태에 제한되지는 않으면서 다량체성 형태를 형성할 수 있다는 것 또한 특히 흥미롭다.
상이한 SPD-TNFSF 구축의 CD40 효능제 활성
각각의 구축의 CD40 효능제 활성을 HEK 블루 CD40L 세포에서 평가하고, pTG19344 (가용성 형태의 CD40L 세포외 도메인) 및 pTG19325에 의해 코딩되는 단백질에 비교하였다. pTG19325 및 pTG19344에 의해 코딩되는 구축물에 대비하여 pTG19965에 의해 코딩되는 구축물의 약간의 개선이 관찰되었으며, 이는 펩티드 신호의 변화 및/또는 CD40L 도메인의 단축이 분자의 발현 수준 및/또는 효능제 활성에 대한 효과가 있었음을 지시한다. 코일드-코일 넥 도메인과 CD40L 사이의 (GGGS)×3 링커의 부가와 함께 (pTG19967에 의해 코딩되는 구축물) 또는 이러한 부가 없이 (pTG19966에 의해 코딩되는 구축물), 콜라겐 도메인의 완전한 결실에 의해 이러한 이점이 고도로 증폭되었다. SPD 전장 버전의 59개 (GXX) 반복물 (즉, pTG19965에 의해 코딩되는 구축물)에서 12개 (GXX) 반복물 (즉, pTG19968, pTG19969에 의해 코딩되는 구축물)로의 콜라겐 도메인의 축소에서 모든 다른 구축물에 비해 최상의 CD40 효능제 활성이 실연되었다. 이들 결과는 융합의 최상의 CD40 효능제 효과를 얻기 위한 콜라겐 도메인의 최적의 크기가 있다는 것을 지시한다. pTG19968 및 pTG19969에 의해 코딩되는 구축물의 콜라겐 모이어티는 올리고머 조립 및/또는 구조에, 따라서 재조합 분자의 CD40 효능제 활성에 약간의 영향을 미칠 수 있는 N-글리코실화 부위를 함유한다. 본 결과는 N-글리코실화의 유의하지 않은 효과를 지시한다.
CD40에 대한 결합
고정된 재조합 인간 CD40으로의 ELISA 검정법을 설정하여 모든 SPD-TNFSF 구축물의 CD40 결합 능력을 조사하였다. 이러한 검정법에서, 비-경쟁적 항-CD40L을 사용하여 ELISA 플레이트 상에서의 CD40L/CD40 복합체의 형성을 검출하였다. 이러한 검정법에서, pTG19965 및 pTG19325에 의해 코딩되는 구축물의 감염/형질감염으로부터 생성된 정화된 상청액은 1/10 희석에서 동일한 약간의 CD40 결합 활성을 가졌다. 변형된 SPD 콜라겐 도메인을 갖는 구축물은 CD40 효능제 검정법에서 관찰된 것과 동일한 순위로 명확한 CD40 개선을 실연하였다 (즉, pTG19968>pTG19969>pTG19967>pTG19966에 의해 코딩된 구축물). 이들 결과는 콜라겐 구축물에서 관찰된 더 양호한 CD40 효능제 활성이, 적어도 부분적으로, CD40에 대한 더 양호한 결합에 기인할 수 있다는 것을 지시한다.
콜라겐 도메인의 효과
본 발명에 따라, 테스트된 12개 (GXX) 반복물 근처의 다른 수의 (GXX) 반복물이 평가되었다. 따라서, i) 원래의 12개 (GXX) 반복물을 각각 6개 (GXX) 반복물을 함유하는 2개의 구축으로 단축하고 (N-글리코실화 부위의 존재 (pTG20038에 의해 코딩되는 구축물) 및 부재 (pTG20038에 의해 코딩되는 구축물)), ii) SPD 콜라겐 도메인 내로 또 다른 위치에서 N-글리코실화가 결여된 또 다른 12개 (GXX) 반복물을 선택하고 (pTG20041에 의해 코딩되는 구축물), iii) (GXX) 반복물의 수를 19개 (pTG20040에 의해 코딩되는 구축물) 및 30개 (pTG20042에 의해 코딩되는 구축물)로 증가시킴으로써, 상이한 길이 또는 성질의 콜라겐 (GXX) 반복물을 테스트하였다.
모든 이러한 구축물이 상기 기술된 감염/형질감염 방법에 의해, 그리고 기준물로서의 pTG19968, pTG19966 및 pTG19965에 의해 코딩되는 구축물과 병행으로 발현되었다. 수득된 배양 배지를 ELISA (도 4)에 의해, 그리고 CD40 효능제 검정법 (도 5)에서 CD40 결합에 대해 테스트하였다.
ELISA (도 4) 및 CD40 효능제 검정법 (도 5)에 의한 CD40 결합 둘 다에서, 구축물이 pTG19968에 의해 코딩되는 구축물과 최상으로 등가였음이 실연된다. N-글리코실화 부위가 있거나 또는 없는, 6개 (GXX) 반복물을 갖는 2개의 구축이 pTG19968에 의해 코딩되는 구축물보다 생물학적 활성에 대해 약간 덜 강력하였다. 12개 (GXX) 반복물 (pTG19968에 의해 코딩되는 구축물의 것과 상이함) 및 19개 (GXX) 반복물을 갖는 2개의 구축은 pTG19968에 의해 코딩되는 구축물보다 생물학적 활성에 대해 명확하게 덜 강력하였다. 마지막으로, 30개 (GXX) 반복물을 갖는 구축은 구축물의 생물학적 활성에 대해 덜 강력하였고, 생물학적 활성에 대해 pTG19966에 의해 코딩되는 구축물과 등가였다.
종합적으로, 이러한 결과는 일부 대안적인 구축물 (예를 들어, pTG19969, pTG19967 pTG20038, pTG20039에 의해 코딩되는 구축물)이 거의 등가인 것으로 간주될 수 있지만, pTG19968에 의해 코딩되는 구축물이 테스트된 것들 중에서 최상의 구축물임을 실연한다.
pTG19968, pTG19969 및 pTG19967의 벡터화
구축 선집 (즉, pTG19968, pTG19969, 및 pTG19967에 의해 코딩되는 구축물)을 상동 재조합에 의해 J2R (TK) 로커스에서 백시니아 바이러스 게놈에 삽입하였다. 재조합 바이러스를 사용하여 HeLa 세포를 감염시키고, 감염 48시간 후에 수득된 배양 배지를 ELISA (도 6)에 의해, 그리고 CD40 효능제 검정법 (도 7)에서 CD40 결합에 대해 테스트하였다. CD40 결합에 대한 EC50이 COPTG19968 및 COPTG19969에 대해 그의 감염/형질감염 대응물에 비교하여 약 10배 (도 5, 도 7)만큼 증가하였다 (즉, 더 낮은 결합).
곡선 형상이 COPTG19968 및 COPTG19969에 대한 정확한 EC50을 계산하도록 허용하지도 않았음을 주지한다. 그러나, COPTG19967은 COPTG19968 및 COPTG19969의 것보다 훨씬 더 양호한 약간의 CD40 효능제 활성을 산출하였다. 백시니아 바이러스에서 벡터화된 SPD-TNFSF 구축물 중에서, COPTG19967에 의해 코딩되는 것이 최상의 CD40 효능제 활성을 산출한다.
SPD-TNFSF 구축의 4-1-BBL 발현 및 4-1-BB 효능제 활성
SPD-TNFSF 융합 단백질의 잠재력이 TNFSF의 또 다른 구성원으로서의 4-1BBL로 확장되었다. CD40L 엑토도메인이 감염/형질감염 설정에서 최상의 효능제 활성을 갖는 융합물로서의 pTG19968에 의해 코딩되는 구축물에서 4-1BBL 중 하나에 의해 교체되어, pTG20033에 의해 코딩되는 구축물이 생성되었다. 또한 4-1BBL 엑토도메인 단독을 동일한 백본 플라스미드 내로 클로닝하여, 추가로 기준물로서 사용되는 구축물 pTG20032가 생성되었다. 2개의 4-1BBL 분자인 pTG20032에 의해 코딩되는 4-1BBL 엑토도메인 단독 또는 12개 (GXX) 반복물을 갖는 변형된 SPD에 융합된 4-1BBL 엑토도메인 (pTG20033에 의해 코딩되는 구축물)이 감염된/형질감염된 세포에 의해 동일한 수준으로 발현되었다 (도 8). 또한, 비-환원 조건에서 관찰된 올리고머화 패턴이 12개 (GXX) 반복물을 갖는 변형된 SPD-구축물 둘 다 (즉 CD40L 및 4-1BBL 융합물)에 대해 유사하였다. 활성 획득이 등가의 CD40L 구축물에 대해 관찰된 것보다 적었지만, 12개 (GXX) 반복물을 갖는 변형된 SPD-4-1BBL 구축물의 4-1BB 효능제 활성이 4-1BBL 단독보다 명확하게 우수하였다 (도 9).
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
서열목록 전자파일 첨부

Claims (36)

  1. 하기를 포함하는 SPD-TNFSF 융합 단백질:
    - N-말단 도메인
    - N-말단 도메인과 C-말단 위치 사이의 계면활성제 단백질-D (SPD)의 코일드-코일 넥 도메인, 및
    - C-말단 위치 내의 TNF-슈퍼패밀리 (TNFSF) 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 N-말단 도메인과 SPD의 코일드-코일 넥 도메인 사이에 콜라겐 도메인을 추가로 포함하는 것인 SPD-TNFSF 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐 도메인이 1 내지 40개 (GXX) 반복물, 바람직하게는 3 내지 30개 (GXX) 반복물, 바람직하게는 6 내지 20개 (GXX) 반복물, 보다 바람직하게는 12개 (GXX) 반복물을 포함하고, 여기서 X는 아미노산이고, G는 글리신 아미노산인 SPD-TNFSF 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 코일드-코일 넥 도메인과 TNF-슈퍼패밀리 리간드 또는 그의 수용체 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함하는 것인 SPD-TNFSF 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 링커가 글리신/세린 링커이고, 4-20개 아미노산, 바람직하게는 8-16개, 보다 바람직하게는 12개 아미노산의 길이를 갖는 것인 SPD-TNFSF 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF-슈퍼패밀리 리간드가 CD40L, 4-1-BBL, CD70, OX40L, TNF, GITRL, LIGHT, FASL, TWEAK, APRIL, RANKL, TRAIL, CD30L, NGF, Baff, LTβ, LTα, LTαβ2, TL1A, TLA, EDA, 보다 바람직하게는 CD40L 또는 4-1-BBL로부터 선택된 것인 SPD-TNFSF 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 도메인이 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 것인 SPD-TNFSF 융합 단백질.　
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 SPD-TNFSF 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 3개의 융합 단백질을 포함하는 삼량체성 융합 단백질.　
  10. 제9항에 따른 복수의 삼량체성 융합 단백질을 포함하는 다량체성 융합 단백질로서, 육량체, 십이량체, 십팔량체 또는 고차수 올리고머, 바람직하게는 육량체, 보다 바람직하게는 십이량체를 형성하는 다량체성 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 융합 단백질을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열.
  12. 제11항에 있어서, 상기 서열이 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 단리된 뉴클레오티드 서열.
  13. 제11항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA.
  14. 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드.
  15. 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스.
  16. 제15항에 있어서, 상기 바이러스가 종양용해성 또는 비-종양용해성 바이러스인 바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 모르빌리바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 홍역 바이러스, 포말상 바이러스, 알파 바이러스, 렌티바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신드비스 바이러스, 랍도바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스, 파르보바이러스 또는 그의 키메라로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 바이러스.
  18. 제17항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 폭스바이러스이고, 오르토폭스바이러스 속에 속하며, 바람직하게는 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스 바이러스 및 엑트로멜리아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 바이러스.
  19. 제18항에 있어서, 상기 종양용해성 폭스바이러스가 백시니아 바이러스, 특히 엘스트리, 와이어쓰, 코펜하겐, 리스터, 티안 티안 및 웨스턴 리저브 균주의 군으로부터 선택된 백시니아 바이러스인 바이러스.
  20. 제17항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 폭스바이러스이고, 레포리폭스바이러스 속에 속하며, 바람직하게는 점액종 바이러스, 토끼 섬유종 바이러스 및 다람쥐 섬유종 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 바람직하게는 점액종 바이러스인 바이러스.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양용해성 폭스바이러스가 J2R 바이러스 유전자에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 티미딘 키나제 (TK) 활성이 결손된 바이러스인 바이러스.
  22. 제21항에 있어서, 상기 종양용해성 폭스바이러스가 바이러스 I4L 및/또는 F4L 유전자(들)에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 리보뉴클레오티드 리덕타제 (RR) 활성이 결손된 바이러스인 바이러스.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 종양용해성 폭스바이러스가 M2L 바이러스 유전자에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는 m2 기능이 결손된 바이러스인 바이러스.
  24. 제16항에 있어서, 상기 비-종양용해성 바이러스가 폭스바이러스인 바이러스.
  25. 제24항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 가성우두 바이러스 (PCPV), 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주 (NYVAC), 돈두 바이러스 (SWPV), 계두 바이러스 (FPV) 또는 그의 키메라로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 바이러스.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항의 바이러스를 생산하는 방법으로서, a) 생산자 세포를 제조하는 단계, b) 제조된 생산자 세포를 바이러스로 형질감염시키거나 또는 감염시키는 단계, c) 형질감염되거나 또는 감염된 생산자 세포를 바이러스 생산을 허용하도록 적합한 조건 하에 배양하는 단계, d) 생산된 바이러스를 상기 생산자 세포의 배양물로부터 회수하는 단계 및 임의적으로 e) 상기 회수된 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 제13항에 정의된 바와 같은 mRNA, 또는 제14항에 정의된 바와 같은 플라스미드, 또는 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따라 정의된 바와 같은 바이러스를 포함하는 세포.
  28. 제1항 내지 제25항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에서 사용하기 위한, SPD-TNFSF 융합 단백질, 삼량체성 융합 단백질, 다량체성 융합 단백질, 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드, 바이러스 또는 세포.
  29. 제1항 내지 제25항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 질환 예컨대 암 및 TNF 시토카인의 기능장애와 연관된 장애 예컨대 감염성 질환, 염증성 질환, 대사 질환, 자가면역 질환, 퇴행성 질환, 아폽토시스-연관 질환 및 이식 거부의 치료에서 사용하기 위한, SPD-TNFSF 융합 단백질, 삼량체성 융합 단백질, 다량체성 융합 단백질, 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드, 바이러스 또는 세포.
  30. 제1항 내지 제25항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한, SPD-TNFSF 융합 단백질, 삼량체성 융합 단백질, 다량체성 융합 단백질, 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드, 바이러스 또는 세포.
  31. 제1항 내지 제25항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기에 효과적인 하나 이상의 화학요법 약물 또는 면역요법 약품과 조합된, SPD-TNFSF 융합 단백질, 삼량체성 융합 단백질, 다량체성 융합 단백질, 뉴클레오티드 서열, mRNA, 플라스미드, 바이러스, 또는 세포.
  32. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 SPD-TNFSF 융합 단백질, 제9항에 따른 삼량체성 융합 단백질, 제10항에 따른 다량체성 융합 단백질, 제11항 또는 제12항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제13항에 따른 mRNA, 제14항에 따른 플라스미드, 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 또는 제27항에 따른 세포 및 임의적으로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 또는 그로 이루어진 제약 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제약 조성물이 하나 이상의 효과적인 화학요법 약물 또는 면역요법 약품을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약 조성물이 비경구 경로를 통해, 보다 바람직하게는 정맥내, 피하 또는 근육내 경로를 통해, 보다 더 바람직하게는 정맥내 경로를 통해 투여되는 것인 제약 조성물.
  36. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 융합 단백질, 제9항에 따른 삼량체성 융합 단백질, 제10항에 따른 다량체성 융합 단백질, 제11항 또는 제12항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제13항에 따른 mRNA, 제14항에 따른 플라스미드, 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 또는 제27항에 따른 세포, 또는 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
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Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
WO1992015672A1 (en) 1991-03-07 1992-09-17 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
FR2751343B1 (fr) 1996-07-16 1998-12-18 Transgene Sa Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament
AU722624B2 (en) 1996-09-06 2000-08-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
EP0988053A1 (en) 1997-06-11 2000-03-29 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
FR2766091A1 (fr) 1997-07-18 1999-01-22 Transgene Sa Composition antitumorale a base de polypeptide immunogene de localisation cellulaire modifiee
US7300774B1 (en) 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
DK1141028T3 (da) 1998-12-23 2010-05-25 Pfizer Humane monoklonale antistoffer til CTLA-4
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
EP2420247A1 (en) 2000-03-07 2012-02-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Adenovirus formulations
ES2247414T3 (es) 2001-12-10 2006-03-01 Bavarian Nordic A/S Composiciones que contienen poxvirus y procedimiento para su preparacion.
NZ536746A (en) 2002-06-13 2007-02-23 Crucell Holland Bv An agonistic antibody or fragment thereof that immunospecifically binds and stimulates the human OX40-receptor
US7595048B2 (en) 2002-07-03 2009-09-29 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Method for treatment of cancer by inhibiting the immunosuppressive signal induced by PD-1
US7291331B1 (en) 2002-09-11 2007-11-06 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods of treating OX40 medicated recall immune responses
US7488802B2 (en) 2002-12-23 2009-02-10 Wyeth Antibodies against PD-1
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
FR2884255B1 (fr) 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
CN109485727A (zh) 2005-05-09 2019-03-19 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
JP5138601B2 (ja) 2005-11-21 2013-02-06 サノフィ パストゥール リミテッド 組換えウイルス安定化製剤
CA2646671A1 (en) 2006-03-30 2007-11-01 University Of California Methods and compositions for localized secretion of anti-ctla-4 antibodies
EP2007423A2 (en) 2006-04-05 2008-12-31 Pfizer Products Incorporated Ctla4 antibody combination therapy
DK2029756T3 (en) 2006-06-20 2017-02-13 Transgene Sa PROCEDURE FOR PREPARING POXVIRA AND POXVIRUS COMPOSITIONS
CA2656266C (en) 2006-06-20 2012-07-31 Transgene S.A. Recombinant viral vaccine
GB0705245D0 (en) 2007-03-19 2007-04-25 Stabilitech Ltd Stable biological products
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
EP2152862A1 (en) 2007-05-14 2010-02-17 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
TW200844230A (en) 2007-05-15 2008-11-16 Transgene Sa Signaling peptides
CN104945508B (zh) 2007-06-18 2019-02-22 默沙东有限责任公司 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体
US8357531B2 (en) 2007-07-03 2013-01-22 Transgene S.A. Immortalized avian cell lines
ES2567704T3 (es) 2007-07-10 2016-04-26 Apogenix Gmbh Proteínas de fusión de colectina de la superfamilia de TNF
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
WO2009065546A1 (en) 2007-11-19 2009-05-28 Transgene Sa Poxviral oncolytic vectors
CN101868546B (zh) 2007-11-19 2013-06-05 特朗斯吉有限公司 痘病毒溶瘤载体
US8420081B2 (en) 2007-11-30 2013-04-16 Abbvie, Inc. Antibody formulations and methods of making same
AU2009214768B2 (en) 2008-02-12 2015-01-22 Sanofi Pasteur Limited Methods using ion exchange and gel filtration chromatography for poxvirus purification
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
EP3002296B1 (en) 2009-03-17 2020-04-29 Université d'Aix-Marseille Btla antibodies and uses thereof
BRPI1007743A2 (pt) 2009-05-12 2017-09-19 Transgene Sa Linhagens de célula aviária imortalizada, usos de uma linhagem de célula aviária imortalizada, métodos para a produção de vírus e métodos para a produção de proteína
WO2012004367A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 N.V. Organon Agonistic antibody to cd27
JP6322413B2 (ja) 2011-03-10 2018-05-09 プロヴェクタス ファーマテック，インク． 改善されたがん治療のための局所および全身性免疫修飾療法の組み合わせ
US9719105B2 (en) 2011-08-05 2017-08-01 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for production of vaccinia virus
AU2013201121A1 (en) 2011-09-20 2013-04-04 Vical Incorporated Synergistic anti-tumor efficacy using alloantigen combination immunotherapy
WO2014047350A1 (en) 2012-09-20 2014-03-27 Morningside Technology Ventures Ltd. Oncolytic virus encoding pd-1 binding agents and uses of the same
TWI690322B (zh) 2012-10-02 2020-04-11 法商傳斯堅公司 含病毒的調配物及其使用
EP2970427B1 (en) * 2013-03-15 2019-12-25 Stone, Geoffrey W. Composition comprised of antigen linked to a tnf superfamily ligand
ES2753364T3 (es) 2014-12-01 2020-04-08 Transgene Sa Formulaciones líquidas estables de virus vaccinia
RS60792B1 (sr) 2015-05-29 2020-10-30 Agenus Inc Anti-ctla-4 antitela i postupci za njihovu primenu
EP3365371A1 (en) 2015-10-22 2018-08-29 Ablynx NV Gitr agonists
SG11201808821WA (en) 2016-04-18 2018-11-29 Celldex Therapeutics Inc Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof
CN117586403A (zh) 2016-10-11 2024-02-23 艾吉纳斯公司 抗lag-3抗体及其使用方法
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CN111448210B (zh) 2017-07-26 2024-05-14 四十七公司 抗SIRP-α抗体及相关方法
CN111757894B (zh) 2018-02-14 2025-02-25 Abba疗法股份公司 抗人类pd-l2抗体
WO2020019135A1 (zh) 2018-07-23 2020-01-30 中国科学院微生物研究所 一种抗cd47抗体及其应用
CN113272017A (zh) 2018-11-01 2021-08-17 默克专利有限公司 抗tim-3抗体
MX2023015106A (es) * 2021-06-17 2024-01-22 Kalivir Immunotherapeutics Inc Proteinas de fusion tnfsf-l y usos de las mismas.

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