KR20250027448A - Method for manufacturing multifunctional 3D implant material containing extracellular matrix through spheroid decellularization process - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포구상체 탈세포화 공정을 통한 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재의 제조 방법 및 상기 방법으로 수득되는 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재에 관한 것으로, 세포구상체 내부에 기능성을 가지고 있는 마이크로 전달체를 함입하여 탈세포화 용액이 세포구상체 내부에도 효과적으로 투과할 수 있게 하였고, 생체적합성 고분자로 격자 구조의 3차원 지지체를 제조함으로써 기능성 줄기세포구상체를 상기 지지체에 균일하게 배치 및 배양할 수 있어 다양한 종류의 생체활성물질을 전달할 수 있고 균일하게 물질을 전달할 수 있으며, 혈관화된 조직과 같이 한 가지 이상의 복합 조직체 재생을 유도하는 것에 적합하고 높은 물성이 필요한 골/연골 조직까지도 목표로 할 수 있다는 장점이 있다.The present invention relates to a method for manufacturing a multifunctional three-dimensional graft material containing an extracellular matrix through a cell spheroid decellularization process, and to an extracellular matrix-containing multifunctional three-dimensional graft material obtained by the method. The method comprises incorporating a microcarrier having functionality into the inside of the cell spheroid so that a decellularization solution can effectively penetrate the inside of the cell spheroid, and manufacturing a three-dimensional support with a lattice structure using a biocompatible polymer so that functional stem cell spheroids can be uniformly arranged and cultured on the support, thereby enabling the delivery of various types of bioactive substances and the uniform delivery of substances. The method is suitable for inducing the regeneration of one or more complex tissues, such as vascularized tissues, and has the advantage of being able to target even bone/cartilage tissues requiring high physical properties.
Description
본 발명은 세포구상체 탈세포화 공정을 통한 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재의 제조 방법 및 상기 방법으로 수득되는 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing an extracellular matrix-containing multifunctional three-dimensional transplant material through a cell spheroid decellularization process and an extracellular matrix-containing multifunctional three-dimensional transplant material obtained by the method.
"Cheng-En Chiang (2021), Bioactive Decellularized Extracellular Matrix Derived from 3D Stem Cell Spheroids under Macromolecular Crowding Serves as a Scaffold for Tissue Engineering, Advanced Healthcare Materials, 10(11), 2100024" 문헌은 3차원 배양 형태인 세포구상체(spheroid)를 탈세포화 공정을 통해 세포외기질(ECM: extracellular matrix) 성분만을 전달하는 기술을 기재하고 있다. 이는 중간엽 줄기세포로부터 생성되는 혈관 형성 관련 성장 인자를 통해 탈세포화를 진행한 세포외기질로 조직 재생 촉진 및 혈관 형성을 유도하는 이식재료로 활용된다. 이러한 세포구상체의 탈세포화는 세포외기질에 포함되어 있는 다양한 종류의 생체활성물질을 하나의 이식재료로 전달할 수 있는 장점이 있다.The literature "Cheng-En Chiang (2021), Bioactive Decellularized Extracellular Matrix Derived from 3D Stem Cell Spheroids under Macromolecular Crowding Serves as a Scaffold for Tissue Engineering, Advanced Healthcare Materials, 10(11), 2100024" describes a technology to deliver only extracellular matrix (ECM) components through a decellularization process using spheroids, a three-dimensional culture form. This is an extracellular matrix that has undergone decellularization using growth factors related to angiogenesis produced from mesenchymal stem cells, and is utilized as a transplant material that promotes tissue regeneration and induces angiogenesis. This decellularization of cell spheroids has the advantage of being able to deliver various types of bioactive substances contained in the extracellular matrix as a single transplant material.
탈세포화를 통해 세포 성분은 제거하고 생체활성물질만 전달할 수 있으나, 사용하는 세포의 종류에만 의존하게 되어 전달하고자 하는 생체활성물질의 다양성이 낮고, 세포구상체의 최심부에서는 탈세포화 공정이 제대로 일어나지 못하여 여전히 세포성분들이 많이 남아 있는데 이러한 세포성분들은 이식한 부위에서 공간을 차지하게 되면서 이식 주변 조직이 쉽게 침투할 수 없게 되고, 따라서 주변 조직과 이식한 세포가 효과적인 융합을 할 수 없게 된다. 또한 세포구상체를 탈세포화하게 되면 세포성분이 빠져나가면서 내부에 다공성 구조가 형성되는데, 이로 인해 물성이 감소하여 골/연골 조직과 같은 높은 물성의 조직 재생에 적용하기에는 어려움이 있다.Decellularization can remove cellular components and deliver only bioactive substances, but it depends only on the type of cells used, so the diversity of bioactive substances to be delivered is low. In addition, the decellularization process does not occur properly in the deepest part of the cell spheroid, so many cellular components still remain. These cellular components occupy space in the transplanted area, making it difficult for the surrounding tissues to easily penetrate, and therefore preventing effective fusion between the surrounding tissues and the transplanted cells. In addition, when the cell spheroid is decellularized, the cellular components escape and a porous structure is formed inside, which reduces the physical properties, making it difficult to apply it to the regeneration of high-property tissues such as bone/cartilage tissues.
한편, "Lei Chen (2019), 3D printing of a lithium-calcium-silicate crystal bioscaffold with dual bioactivities for osteochondral interface reconstruction, Biomaterials, 196, 138-150" 문헌은 지지체 표면 코팅을 통한 조직 재생 기술로 의사체액(SBF: simulated body fluid) 용액으로 지지체 표면을 미네랄 코팅하는 기술을 기재하고 있다. 또한 "O.Evrova (2017), In vitro and in vivo effects of PDGF-BB delivery strategies on tendon healing: A Review, European Cells and Materials, 34, 15-39" 문헌은 고분자 기반 지지체 표면에 헤파린(heparin)과 펩타이드 결합을 활용하여 생체활성물질(성장인자, 단백질 등)을 고정(immobilization)시켜 전달하는 기술을 기재하고 있다.Meanwhile, the literature "Lei Chen (2019), 3D printing of a lithium-calcium-silicate crystal bioscaffold with dual bioactivities for osteochondral interface reconstruction, Biomaterials, 196, 138-150" describes a technology to mineral-coat the surface of a scaffold with a simulated body fluid (SBF) solution as a tissue regeneration technology through scaffold surface coating. In addition, the literature "O.Evrova (2017), In vitro and in vivo effects of PDGF-BB delivery strategies on tendon healing: A Review, European Cells and Materials, 34, 15-39" describes a technology to deliver bioactive substances (growth factors, proteins, etc.) by immobilizing them on the surface of a polymer-based scaffold using heparin and peptide bonds.
그러나 다양한 생체활성물질을 표면에 코팅하여 전달할 수 있지만, 결국 하나의 지지체를 활용해서 전달할 수 있는 물질의 종류에는 한계가 있으며, 생체활성물질을 지지체 표면에 균일하게 코팅하기 어렵고, 불균일하게 코팅이 진행되면 원하는 수준의 조직재생을 유도하기 어렵다.However, although various bioactive substances can be delivered by coating them on the surface, there is a limit to the types of substances that can be delivered using a single support, and it is difficult to uniformly coat the bioactive substances on the surface of the support, and if the coating is uneven, it is difficult to induce the desired level of tissue regeneration.
이와 같이, 기존의 세포구상체의 탈세포화 공정 및 지지체 표면 코팅 기술은 각각의 한계점이 있어 이를 극복한 새로운 이식재의 제조 방법에 대한 업계의 요구가 있다.As such, the existing cell spheroid decellularization process and support surface coating technology each have limitations, and there is a demand in the industry for a new method of manufacturing a transplant material that overcomes these limitations.
본 발명은 세포구상체 탈세포화 공정을 통한 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide a method for manufacturing a multifunctional three-dimensional transplant material containing an extracellular matrix through a cell spheroid decellularization process.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득되는 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재를 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, the present invention aims to provide a multifunctional three-dimensional transplant material containing an extracellular matrix obtained by the above method.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 세포구상체의 탈세포화 효율이 떨어지고 물성이 낮아 목표로 할 수 있는 조직에 한계가 있다는 점을 극복하고자 내부에 기능성을 가지고 있는 마이크로 전달체를 함입하여 탈세포화 용액이 세포구상체 내부에도 효과적으로 투과할 수 있게 하였고, 제작한 기능성 줄기세포구상체를 3차원 지지체에 배치를 하여 높은 물성이 필요한 골/연골 조직에서도 이식재로 사용될 수 있도록 하였다.In order to solve the above problems, the inventors of the present invention have overcome the limitations in the target tissue due to the low decellularization efficiency and poor physical properties of cell spheroids by incorporating micro-carriers having functionality inside them so that the decellularization solution can effectively penetrate the inside of the cell spheroids, and have arranged the manufactured functional stem cell spheroids on a three-dimensional support so that they can be used as transplant materials in bone/cartilage tissues that require high physical properties.
또한 기존 지지체 표면 코팅기술을 통해 전달할 수 있는 생체활성물질의 종류에 한계가 있고 균일한 코팅이 어렵다는 한계점을 극복하기 위해 생체적합성 고분자로 격자 구조의 3차원 지지체를 형성하고 표면에 폴리도파민(PD: polydopamine) 등을 코팅하여 코팅된 3차원 지지체를 제조하였고 기능성 줄기세포구상체를 상기 지지체에 균일하게 배치 및 배양함으로써 다양한 종류의 생체활성물질을 전달할 수 있고 균일하게 물질을 전달할 수 있도록 하였다.In addition, in order to overcome the limitations of the existing support surface coating technology in terms of the types of bioactive substances that can be delivered and the difficulty of uniform coating, a three-dimensional support with a lattice structure was formed using a biocompatible polymer, and polydopamine (PD) or the like was coated on the surface to manufacture a coated three-dimensional support. In addition, functional stem cell spheroids were uniformly arranged and cultured on the support, thereby enabling the delivery of various types of bioactive substances and uniform delivery of the substances.
따라서 본 발명의 일 측면은 하기 단계를 포함하는 세포외기질(ECM: extracellular matrix)을 함유하는 다기능성 3차원 이식재의 제조 방법을 제공한다: Therefore, one aspect of the present invention provides a method for producing a multifunctional three-dimensional graft material containing an extracellular matrix (ECM), comprising the following steps:
a) 생체활성물질을 코팅한 마이크로 전달체와 인간 유래 줄기세포(stem cell)를 융합하여 기능성 줄기세포구상체(stem cell spheroid)를 제조하는 단계;a) A step of manufacturing a functional stem cell spheroid by fusing a microcarrier coated with a bioactive substance and human-derived stem cells;
b) 생체적합성 고분자로 격자 구조의 3차원 지지체를 제조하는 단계;b) a step of manufacturing a three-dimensional support with a lattice structure using a biocompatible polymer;
c) 단계 a)의 기능성 줄기세포구상체를 단계 b)의 3차원 지지체의 각 칸에 배치한 후 배양함으로써 줄기세포구상체와 3차원 지지체가 융합된 3차원 조직체를 수득하는 단계; 및c) a step of arranging the functional stem cell spheroids of step a) in each cell of the three-dimensional support of step b) and then culturing them to obtain a three-dimensional tissue in which the stem cell spheroids and the three-dimensional support are fused; and
d) 단계 c)로부터 수득한 3차원 조직체를 탈세포화시키는 단계.d) A step of decellularizing the three-dimensional tissue obtained from step c).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 생체활성물질은 미네랄, 폴리페놀, 성장인자, 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the bioactive substance of step a) may be at least one selected from the group consisting of minerals, polyphenols, growth factors, and proteins.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 마이크로 전달체는 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA: poly(lactide-co-glycolide)) 또는 폴리카프로락톤(PCL: polycaprolactone)를 기반으로 하는 마이크로 전달체일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the microcarrier of step a) may be a microcarrier based on poly(L-lactide) (PLLA), polylactide-co-glycolide (PLGA: poly(lactide-co-glycolide)) or polycaprolactone (PCL: polycaprolactone).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 줄기세포는 인간 지방 유래 줄기세포(hADSC: human adipose-derived stem cell), 골수 유래 줄기세포 (BMSC: bone marrow-derived stem cell), 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포 (UCMSC: umbilical cord-derived mesenchymal stem cell) 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the stem cell of step a) may be a human adipose-derived stem cell (hADSC), a bone marrow-derived stem cell (BMSC), or an umbilical cord-derived mesenchymal stem cell (UCMSC).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)의 생체적합성 고분자는 폴리카프로락톤[poly(caprolactone)], 폴리글리콜산[poly(glycolic acid)], 폴리락트산[poly(lactic acid)], 폴리 락타이드 글라이콜라이드 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)] 및 폴리에틸린글리콜[poly(ethylene glycol)]로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biocompatible polymer of step b) may be at least one selected from the group consisting of polycaprolactone, polyglycolic acid, polylactic acid, polylactide-co-glycolide copolymer, and poly(ethylene glycol).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)의 격자 구조의 3차원 지지체의 형성은 3차원 프린팅을 기반으로 수행될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the formation of the three-dimensional support of the lattice structure of step b) can be performed based on three-dimensional printing.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)의 격자 구조의 3차원 지지체는 한 변의 길이가 5 mm인 정사각형에 높이가 1 mm인 10개의 계층을 중첩시켜서 제작한 3차원 지지체일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the three-dimensional support of the lattice structure of step b) may be a three-dimensional support manufactured by overlapping 10 layers each having a height of 1 mm and a square having a side length of 5 mm.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)에서 격자 구조의 3차원 지지체의 표면에 폴리도파민(PD: polydopamine), 폴리페놀 및 미네랄로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 코팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the step b) may further include a step of coating at least one selected from the group consisting of polydopamine (PD), polyphenol, and minerals on the surface of the three-dimensional support having a lattice structure.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 c)의 배양은 5 내지 20일 동안 수행될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the culturing in step c) can be performed for 5 to 20 days.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 c)의 배양에 의해 줄기세포구상체로부터 기능성을 지닌 세포들이 3차원 지지체 전역을 메우게 되어 3차원 조직체가 형성될 수 있다.In one embodiment of the present invention, by culturing in step c), functional cells from the stem cell spheroids can fill the entire three-dimensional support, thereby forming a three-dimensional tissue body.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 d)의 탈세포화는 Triton X-100을 사용하여 수행되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the decellularization in step d) may be performed using Triton X-100.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 d)의 탈세포화를 통해 상기 3차원 조직체는 세포 성분이 제거되고 세포외기질만 남게 될 수 있다.In one embodiment of the present invention, through the decellularization of step d), the cellular components of the three-dimensional tissue can be removed, leaving only the extracellular matrix.
본 발명의 다른 측면은 상기 제조 방법에 의해 수득되는 세포외기질을 함유하는 다기능성 3차원 이식재를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a multifunctional three-dimensional graft material containing an extracellular matrix obtained by the above manufacturing method.
본 발명에 따른 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재의 제조 방법은 세포구상체 내부에 기능성을 가지고 있는 마이크로 전달체를 함입하여 탈세포화 용액이 세포구상체 내부에도 효과적으로 투과할 수 있게 하였고, 제작한 기능성 줄기세포구상체를 3차원 지지체에 배치하여 높은 물성이 필요한 골/연골 조직까지도 목표로 할 수 있다는 장점이 있다.The method for manufacturing a multifunctional three-dimensional transplant material containing an extracellular matrix according to the present invention has the advantage of enabling a decellularization solution to effectively penetrate the inside of the cell spheroid by incorporating a microcarrier having functionality into the inside of the cell spheroid, and of allowing the manufactured functional stem cell spheroid to be placed on a three-dimensional support so as to target even bone/cartilage tissues requiring high physical properties.
또한 생체적합성 고분자로 격자 구조의 3차원 지지체를 형성하고 표면에 폴리도파민 등을 코팅하여 코팅된 3차원 지지체를 제조함으로써 기능성 줄기세포구상체를 상기 지지체에 균일하게 배치 및 배양할 수 있어 다양한 종류의 생체활성물질을 전달할 수 있고 균일하게 물질을 전달할 수 있다는 특징이 있어서 혈관화된 조직과 같이 한 가지 이상의 복합 조직체 재생을 유도하는 것에 적합하다는 장점이 있다.In addition, by forming a three-dimensional support with a lattice structure using a biocompatible polymer and coating the surface with polydopamine or the like, a coated three-dimensional support can be manufactured, thereby enabling uniform placement and culture of functional stem cell spheroids on the support, and thus various types of bioactive substances can be delivered, and since it has the characteristic of being able to deliver substances uniformly, it has the advantage of being suitable for inducing the regeneration of one or more complex tissues, such as vascularized tissues.
본 발명에 따른 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재는 복잡한 인체 조직의 구조, 기능 및 환경을 모사하고 실용적인 전달방식으로 의료용 조직공학적 치료 시스템 및 인공조직 이식재료로의 응용이 가능하며, 실제 조직을 모사하는 환경에서의 복합적인 생체활성물질을 전달하는 시스템을 제작하여 종래 기술에서 적은 양과 종류의 생체활성물질을 전달했던 한계를 극복하였고, 이를 통해 생체 외 3차원적 조직 환경 제작, 세포의 상호작용 연구 모델, 손상된 거대 조직에 대한 의료용 이식재료 등으로의 응용이 가능할 것으로 전망된다.The multifunctional three-dimensional graft material containing an extracellular matrix according to the present invention can be applied as a medical tissue engineering treatment system and an artificial tissue graft material by simulating the structure, function and environment of complex human tissues and providing a practical delivery method, and by producing a system for delivering complex bioactive substances in an environment simulating actual tissues, the present invention overcomes the limitations of the prior art in delivering small amounts and types of bioactive substances, and is expected to be applied to the production of an in vitro three-dimensional tissue environment, a model for studying cell interactions, and medical graft materials for damaged large tissues.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 폴리카프로락톤(PCL: polycaprolactone) 고분자로 제작한 3차원 지지체의 구조를 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명에 따라 배양된 3차원 조직체(기능성 줄기세포구상체 + 3차원 지지체)의 탈세포화 공정을 보여주는 계략도이다.
도 3은 미네랄 코팅된 마이크로 전달체(MF)와 미네랄이 코팅되지 않은 마이크로 전달체(EF)의 표면 분석 결과(A, B) 및 미네랄 이온(칼슘 이온)의 정량 분석 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 4는 각 종류의 세포구상체에 대하여 세포의 생존율 및 크기 보존, 검출되는 단백질의 양에 대한 비교 결과를 나타낸 것이다. S: 마이크로 전달체 없이 세포로만 구성된 줄기세포구상체, ES: 미네랄 코팅되지 않은 전달체가 함입된 줄기세포구상체, MS: 미네랄 코팅된 전달체가 함입된 줄기세포구상체.
도 5는 각 종류의 세포구상체에 대하여 세포외기질 단백질의 생성되는 양에 대한 정성 및 정량적 비교 분석 결과를 나타낸 것이다. S: 마이크로 전달체 없이 세포로만 구성된 줄기세포구상체, ES: 미네랄 코팅되지 않은 전달체가 함입된 줄기세포구상체, MS: 미네랄 코팅된 전달체가 함입된 줄기세포구상체.
도 6은 탈세포화 공정 후 잔존하는 세포성분인 DNA의 양과 보존되는 단백질의 양에 대한 평가 결과를 나타낸 것이다. dC-S: 탈세포화를 진행한 S, dC-ES: 탈세포화를 진행한 ES, dC-MS: 탈세포화를 진행한 MS.
도 7은 탈세포화 후 조직체 내에 보존된 세포외기질 단백질의 정성 및 정량 분석 결과를 나타낸 것이다. dC-S: 탈세포화를 진행한 S, dC-ES: 탈세포화를 진행한 ES, dC-MS: 탈세포화를 진행한 MS.
도 8은 탈세포화된 다기능성 이식재에 함유되어 있는 골 재생, 혈관 형성 관련 생체활성물질의 종류 및 양에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다. dC-ES: 탈세포화를 진행한 ES, dC-MS: 탈세포화를 진행한 MS.
도 9는 이식재 위에 배양한 줄기세포의 골 분화 및 분비 물질에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다. dC-ES: 탈세포화를 진행한 ES, dC-MS: 탈세포화를 진행한 MS.
도 10은 이식재 위에 배양한 줄기세포의 혈관 형성 물질 분비 및 관련 인자에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다. dC-ES: 탈세포화를 진행한 ES, dC-MS: 탈세포화를 진행한 MS.
도 11은 탈세포화된 다기능성 이식재의 혈관화 골 조직 재생 능력 분석 및 평가 결과를 나타낸 것이다. Defect: 아무것도 없는 그룹, Chamber: 3차원 지지체만을 전달한 그룹, dC-ES: 탈세포화를 진행한 ES를 전달한 그룹, dC-MS: 탈세포화를 진행한 MS를 전달한 그룹.
도 12는 HNA 면역-항체 염색법을 통한 이식 재료와 조직의 융합 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다. C-MS: 탈세포화를 진행하지 않고 세포 이식을 진행한 그룹, dC-ES: 탈세포화를 진행한 ES를 전달한 그룹, dC-MS: 탈세포화를 진행한 MS를 전달한 그룹.FIG. 1 is a drawing showing the structure of a three-dimensional support made of polycaprolactone (PCL) polymer according to one embodiment of the present invention.
Figure 2 is a schematic diagram showing the decellularization process of a three-dimensional tissue (functional stem cell spheroid + three-dimensional support) cultured according to the present invention.
Figure 3 shows the results of surface analysis (A, B) and quantitative analysis of mineral ions (calcium ions) of a mineral-coated microcarrier (MF) and a non-mineral-coated microcarrier (EF) (C).
Figure 4 shows the comparative results of cell viability and size preservation, and the amount of protein detected for each type of cell spheroid. S: stem cell spheroid composed of cells only without microcarriers, ES: stem cell spheroid loaded with non-mineral-coated carriers, MS: stem cell spheroid loaded with mineral-coated carriers.
Figure 5 shows the results of qualitative and quantitative comparative analysis of the amount of extracellular matrix proteins produced for each type of cell spheroid. S: stem cell spheroid composed only of cells without microcarriers, ES: stem cell spheroid loaded with non-mineral-coated carriers, MS: stem cell spheroid loaded with mineral-coated carriers.
Figure 6 shows the results of evaluating the amount of DNA, a cellular component remaining after the decellularization process, and the amount of preserved protein. dC-S: S after decellularization, dC-ES: ES after decellularization, dC-MS: MS after decellularization.
Figure 7 shows the results of qualitative and quantitative analyses of extracellular matrix proteins preserved in tissues after decellularization. dC-S: S after decellularization, dC-ES: ES after decellularization, dC-MS: MS after decellularization.
Figure 8 shows the results of analysis on the types and amounts of bioactive substances related to bone regeneration and angiogenesis contained in decellularized multifunctional graft materials. dC-ES: ES that underwent decellularization, dC-MS: MS that underwent decellularization.
Figure 9 shows the results of analysis on bone differentiation and secreted substances of stem cells cultured on graft materials. dC-ES: ES that underwent decellularization, dC-MS: MS that underwent decellularization.
Figure 10 shows the results of analysis on the secretion of angiogenic substances and related factors of stem cells cultured on graft materials. dC-ES: ES that underwent decellularization, dC-MS: MS that underwent decellularization.
Figure 11 shows the results of analysis and evaluation of the vascularized bone tissue regeneration ability of decellularized multifunctional graft materials. Defect: group with nothing, Chamber: group delivered only 3D scaffold, dC-ES: group delivered ES that underwent decellularization, dC-MS: group delivered MS that underwent decellularization.
Figure 12 shows the results of analyzing the degree of fusion of transplant materials and tissues using HNA immuno-antibody staining. C-MS: group that underwent cell transplantation without decellularization, dC-ES: group that delivered ES that underwent decellularization, dC-MS: group that delivered MS that underwent decellularization.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 측면은 하기 단계를 포함하는 세포외기질을 함유하는 다기능성 3차원 이식재의 제조 방법을 제공한다: One aspect of the present invention provides a method for producing a multifunctional three-dimensional graft containing an extracellular matrix, comprising the following steps:
a) 생체활성물질을 코팅한 마이크로 전달체와 인간 유래 줄기세포를 융합하여 기능성 줄기세포구상체를 제조하는 단계;a) A step of manufacturing a functional stem cell spheroid by fusing a microcarrier coated with a bioactive substance and human-derived stem cells;
b) 생체적합성 고분자로 격자 구조의 3차원 지지체를 제조하는 단계;b) a step of manufacturing a three-dimensional support with a lattice structure using a biocompatible polymer;
c) 단계 a)의 기능성 줄기세포구상체를 단계 b)의 3차원 지지체의 각 칸에 배치한 후 배양함으로써 줄기세포구상체와 3차원 지지체가 융합된 3차원 조직체를 수득하는 단계; 및c) a step of arranging the functional stem cell spheroids of step a) in each cell of the three-dimensional support of step b) and then culturing them to obtain a three-dimensional tissue in which the stem cell spheroids and the three-dimensional support are fused; and
d) 단계 c)로부터 수득한 3차원 조직체를 탈세포화시키는 단계.d) A step of decellularizing the three-dimensional tissue obtained from step c).
본원에서 사용되는 용어 "세포외기질(ECM)"은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체로서, 섬유성 단백질, 프로테오글리칸과 같은 복합단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등 세포에 의해 합성되고 세포외에 분비 축적된 다양한 종류의 분자로 구성될 수 있다. 따라서 세포외기질은 세포의 유형 또는 세포의 분화 정도에 따라 그 성분이 달라질 수 있다.The term "extracellular matrix (ECM)" used herein refers to a complex aggregate of biopolymers that fills the space within or outside of a tissue, and may be composed of various types of molecules synthesized by cells and secreted and accumulated outside of the cells, such as fibrous proteins, complex proteins such as proteoglycans, and cell adhesion proteins such as fibronectin and laminin. Therefore, the composition of the extracellular matrix may vary depending on the type of cell or the degree of differentiation of the cell.
본원에서 사용되는 용어 "탈세포화(decellularization)"는 조직의 세포외기질(ECM)을 거주 세포로부터 분리하여 원래 조직의 ECM 스캐폴드를 남기기 위한 생물 의학 공학에서 사용되는 공정을 지칭하며, 상기 ECM 스캐폴드는 인공 장기 및 조직 재건에 사용될 수 있다. 즉, "탈세포화"는 세포 또는 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다.The term "decellularization" as used herein refers to a process used in biomedical engineering to separate the extracellular matrix (ECM) of a tissue from its resident cells, leaving an ECM scaffold of the original tissue, which can be used for artificial organs and tissue reconstruction. That is, "decellularization" means removing cellular components, such as the nucleus, cell membrane, nucleic acids, etc., from a cell or tissue, excluding the extracellular matrix.
본원에서 사용되는 용어 "탈세포화된 세포외기질(decellularized ECM)"은 조직 또는 세포로부터 핵, 세포막, 핵산과 같은 세포 성분이 제거되고 남은 세포외기질을 의미한다.The term "decellularized ECM" as used herein refers to the extracellular matrix remaining after cellular components such as the nucleus, cell membrane, and nucleic acids have been removed from a tissue or cell.
본원에서 사용되는 용어 "기능성 줄기세포구상체"는 마이크로 전달체가 함입된 줄기세포구상체를 의미한다.The term "functional stem cell spheroids" as used herein refers to stem cell spheroids loaded with microcarriers.
본원에서 사용되는 용어 "3차원 지지체"는 생체적합성 고분자로 제조한 격자 구조의 지지체를 의미한다.The term "three-dimensional scaffold" as used herein means a scaffold having a lattice structure manufactured from a biocompatible polymer.
본원에서 사용되는 용어 "3차원 조직체"는 기능성 줄기세포구상체를 3차원 지지체의 각 칸에 배치한 후 배양함으로써 수득되는 줄기세포구상체와 3차원 지지체가 융합된 물질을 의미한다. 상기 배양에 의해 줄기세포구상체로부터 기능성을 지닌 세포들이 3차원 지지체 전역을 메우게 되어 3차원 조직체가 형성될 수 있다.The term "three-dimensional tissue" used herein refers to a material in which stem cell spheroids and a three-dimensional support are fused, obtained by arranging functional stem cell spheroids in each cell of a three-dimensional support and then culturing them. Through the culturing, cells with functionality from the stem cell spheroids can fill the entire three-dimensional support, thereby forming a three-dimensional tissue.
본원에서 사용되는 용어 "다기능성 3차원 이식재"는 상기 3차원 조직체를 세제 용액에 넣어 탈세포화시킴으로써 수득되는 물질을 의미한다.The term "multifunctional three-dimensional graft material" as used herein refers to a material obtained by decellularizing the three-dimensional tissue structure by placing it in a detergent solution.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 a)의 생체활성물질은 미네랄, 폴리페놀, 성장인자 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 미네랄은 칼슘 이온, 인산 이온 등일 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리페놀은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: epigallocatechin gallate), 카테킨, 탄닌산, 플라보노이드 등일 수 있다. 구체적으로, 상기 성장인자는 혈소판-유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈관내피 성장인자, 표피성장인자, 인슐린-유사 성장인자 및 과립구 콜로니 자극인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질은 BMP-2(bone morphogenetic protein-2) 등 일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the bioactive substance of step a) may be at least one selected from the group consisting of minerals, polyphenols, growth factors, and proteins. Specifically, the mineral may be a calcium ion, a phosphate ion, etc. Specifically, the polyphenol may be epigallocatechin gallate (EGCG), catechin, tannic acid, flavonoid, etc. Specifically, the growth factor may be at least one selected from the group consisting of platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, and granulocyte colony stimulating factor. Specifically, the protein may be BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), etc.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 a)의 마이크로 전달체는 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA: poly(lactide-co-glycolide)) 또는 폴리카프로락톤(PCL: polycaprolactone)을 기반으로 하는 마이크로 전달체일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the microcarrier of step a) may be a microcarrier based on poly(L-lactide) (PLLA), polylactide-co-glycolide (PLGA: poly(lactide-co-glycolide)) or polycaprolactone (PCL: polycaprolactone).
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 a)의 줄기세포는 인간 지방 유래 줄기세포(hADSC: human adipose-derived stem cell), 골수 유래 줄기세포 (BMSC: bone marrow-derived stem cell), 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포 (UCMSC: umbilical cord-derived mesenchymal stem cell)일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the stem cells of step a) may be human adipose-derived stem cells (hADSC: human adipose-derived stem cells), bone marrow-derived stem cells (BMSC: bone marrow-derived stem cells), or umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC: umbilical cord-derived mesenchymal stem cells).
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 b)의 격자 구조의 3차원 지지체를 형성하는 생체적합성 고분자는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 항응혈성을 가지며, 세포에 대한 친화력을 가지는 고분자를 의미한다. 생체적합성 고분자는 당업계에 이미 공지되어 있거나 이를 변형한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들어 폴리카프로락톤[poly(caprolactone)], 폴리글리콜산[poly(glycolic acid)], 폴리락트산[poly(lactic acid)], 폴리 락타이드 글라이콜라이드 공중합체[poly(lactide-co-glycolide)], 폴리에틸린글리콜[poly(ethylene glycol)], 폴리오르소에스테르[poly(ortho ester)], 폴리카복시페녹시프로판세바신산{poly[(caboxyphenoxy)propanesebacic acid]}, 폴리알킬 시아노아크릴레이트[poly(alkylcyanoacrylate)], 데사미노티로실 옥틸 에스테르(desaminotyrosyl octyl ester), 폴리포스포에스테르(polyphosphoesters), 폴리에스터 아마이드(polyester amides), 폴리우레탄(polyurethanes) 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 생체적합성 고분자는 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리 락타이드 글라이콜라이드 공중합체 및 폴리에틸린글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the biocompatible polymer forming the three-dimensional support of the lattice structure of step b) means a polymer having tissue compatibility and anticoagulant properties that do not cause necrosis of tissue or blood or coagulation of blood when in contact with living tissue or blood, and having an affinity for cells. The biocompatible polymer may be one already known in the art or a modified version thereof, and may be selected from the group consisting of, for example, poly(caprolactone), poly(glycolic acid), poly(lactic acid), poly(lactide-co-glycolide), poly(ethylene glycol), poly(ortho ester), poly(carboxyphenoxy)propanesebacic acid, poly(alkylcyanoacrylate), desaminotyrosyl octyl ester, polyphosphoesters, polyester amides, polyurethanes, and chitosan. There may be one or more. Specifically, the biocompatible polymer may be one or more selected from the group consisting of polycaprolactone, polyglycolic acid, polylactic acid, polylactide glycolide copolymer, and polyethylene glycol.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 b)의 격자 구조의 3차원 지지체의 형성은 3차원 프린팅을 기반으로 수행될 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the formation of the three-dimensional support of the lattice structure in step b) can be performed based on three-dimensional printing.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 b)의 격자 구조의 3차원 지지체는 한 변의 길이가 5 mm인 정사각형에 높이가 1 mm인 10개의 계층을 중첩시켜서 제작한 3차원 지지체일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the three-dimensional support of the lattice structure of step b) may be a three-dimensional support manufactured by overlapping 10 layers each having a height of 1 mm on a square having a side length of 5 mm.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 b)에서 격자 구조의 3차원 지지체의 표면에 폴리도파민(PD: polydopamine), 폴리페놀 및 미네랄로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 코팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리페놀은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: epigallocatechin gallate), 카테킨, 탄닌산, 플라보노이드 등일 수 있다. 구체적으로, 상기 미네랄은 칼슘 이온, 인산 이온 등일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the step b) may further include a step of coating at least one selected from the group consisting of polydopamine (PD), polyphenol, and mineral on the surface of the three-dimensional support having a lattice structure. Specifically, the polyphenol may be epigallocatechin gallate (EGCG), catechin, tannic acid, flavonoid, or the like. Specifically, the mineral may be calcium ion, phosphate ion, or the like.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 c)의 배양은 5 내지 20일 동안 수행될 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the culturing in step c) can be performed for 5 to 20 days.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 c)의 배양에 의해 줄기세포구상체로부터 기능성을 지닌 세포들이 3차원 지지체 전역을 메우게 되어 3차원 조직체가 형성될 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, by culturing in step c), functional cells from the stem cell spheroid fill the entire three-dimensional support, thereby forming a three-dimensional tissue body.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 d)의 탈세포화 방법은 통상의 기술자에게 공지된 방법 또는 이의 적절한 변형에 의해 이루어질 수 있다. 상기 탈세포화 방법은 세포외기질을 제외한 나머지 세포 성분을 제거하기 위한 것으로, 물리적인 방법, 화학적인 방법 또는 이를 혼합한 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로 화학적인 방법을 사용할 수 있다. 상기 화학적인 방법은 탈세포화 용액에 배양된 세포를 일정시간 담그는 과정일 수 있다. 상기 탈세포화 용액은 산성용액, 염기성 용액, 비이온성 세척제(Non-ionic detergent) 또는 이온성 세척제 모두 가능하나, 구체적으로는 비이온성 세척제일 수 있다. 상기 비온성 세척제의 경우, 예를 들면 Triton X-100을 이용해서 세포막을 깨뜨려서 세포 내 성분을 제거할 수 있다. 또한, 상기 탈세포화 방법은 DNase 와 RNase를 사용하여 세포핵 성분을 제거하거나, 트립신을 이용하여 37℃ 및 pH 8.0 조건에서 EDTA와 함께 사용했을 때 세포를 깨고 세포 안의 내용물을 제거하는 방법일 수 있다. 일 실시예에서 인비트로에서 배양된 섬유아세포집단을 비이온성 계면활성제(Non-ionic detergent)인 Triton X-100을 이용해서 세포막을 깨뜨려서 세포 내 성분을 제거하였다. 상기 탈세포화된 세포외기질은 세포 집단으로부터 세포의 핵 및 세포막 등만을 제거하여, 세포외기질 성분의 전체를 활용할 수 있어, 세포가 성장 및 분화하기에 더욱 자연스러운 생체모방 미세환경을 제공할 수 있다. 따라서 일 구현예에서, 상기 단계 d)의 탈세포화는 Triton X-100을 사용하여 수행되는 것일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the decellularization method of step d) can be performed by a method known to those skilled in the art or an appropriate modification thereof. The decellularization method is intended to remove the remaining cell components except for the extracellular matrix, and a physical method, a chemical method, or a mixed method thereof can be used, and specifically, a chemical method can be used. The chemical method can be a process of soaking cultured cells in a decellularization solution for a certain period of time. The decellularization solution can be an acidic solution, an alkaline solution, a non-ionic detergent, or an ionic detergent, but specifically, it can be a non-ionic detergent. In the case of the non-ionic detergent, for example, Triton X-100 can be used to break the cell membrane and remove the intracellular components. In addition, the decellularization method can be a method of removing the cell nuclear components using DNase and RNase, or a method of breaking the cells and removing the contents inside the cells when trypsin is used together with EDTA at 37°C and pH 8.0. In one embodiment, the cell membrane of a fibroblast population cultured in vitro was broken using a non-ionic detergent, Triton X-100, to remove intracellular components. The decellularized extracellular matrix can utilize all of the extracellular matrix components by removing only the nucleus and cell membrane of the cells from the cell population, thereby providing a more natural biomimetic microenvironment for cell growth and differentiation. Therefore, in one embodiment, the decellularization of step d) may be performed using Triton X-100.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 d)의 탈세포화를 통해 상기 3차원 조직체는 세포 성분이 제거되고 세포외기질만 남게 될 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, through the decellularization of step d), the cellular components of the three-dimensional tissue can be removed, leaving only the extracellular matrix.
본 발명의 다른 측면은 상기 제조 방법에 의해 수득되는 세포외기질을 함유하는 다기능성 3차원 이식재를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a multifunctional three-dimensional graft material containing an extracellular matrix obtained by the above manufacturing method.
상기 다기능성 3차원 이식재는 골재생, 피부조직 재생, 신경재생, 간조직 재생, 근육재생, 심근재생을 위한 것일 수 있으며, 또한 구체적으로 혈관을 재생하기 위한 것일 수 있다.The above multifunctional three-dimensional graft material may be used for bone regeneration, skin tissue regeneration, nerve regeneration, liver tissue regeneration, muscle regeneration, myocardial regeneration, and may also be used specifically for blood vessel regeneration.
본 발명에 따른 세포외기질 함유 다기능성 3차원 이식재는 복잡한 인체 조직의 구조, 기능 및 환경을 모사하고 실용적인 전달방식으로 의료용 조직공학적 치료 시스템 및 인공조직 이식재료로의 응용이 가능하며, 실제 조직을 모사하는 환경에서의 복합적인 생체활성물질을 전달하는 시스템을 제작하여 종래 기술에서 적은 양과 종류의 생체활성물질을 전달했던 한계를 극복하였고, 이를 통해 생체 외 3차원적 조직 환경 제작, 세포의 상호작용 연구 모델, 손상된 거대 조직에 대한 의료용 이식재료 등으로의 응용이 가능할 것으로 전망된다.The multifunctional three-dimensional graft material containing an extracellular matrix according to the present invention can be applied as a medical tissue engineering treatment system and an artificial tissue graft material by simulating the structure, function and environment of complex human tissues and providing a practical delivery method, and by producing a system for delivering complex bioactive substances in an environment simulating actual tissues, the present invention overcomes the limitations of the prior art in delivering small amounts and types of bioactive substances, and is expected to be applied to the production of an in vitro three-dimensional tissue environment, a model for studying cell interactions, and medical graft materials for damaged large tissues.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are only intended to exemplify the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예Example
실시예Example 1: 1: 탈세포화된Decellularized 다기능성Versatility 이식재의Of the transplant material 제조 manufacturing
1.1. 1.1. polypoly (L-(L- lactidelactide ) () ( PLLAPLLA ) 기반 마이크로 전달체 제작 및 미네랄 코팅 (기능성 부여)) based micro-transporter fabrication and mineral coating (functionalization)
3% PLLA를 헥사플루오로이소프로판올(HFIP) 용매에 녹인 용액을 시간당 2 ml씩 1000 rpm으로 빠르게 회전하는 회전 기계에 전기방사를 진행하였고, (총 10 ml) 방사된 PLLA를 60 μm 간격으로 절단을 하고 아미노분해과정을 거쳐서 최종적으로 60 μm라는 일정한 길이를 가진 마이크로 전달체를 제작하였다.A solution containing 3% PLLA dissolved in hexafluoroisopropanol (HFIP) was electrospun at a high-speed rotating machine rotating at 1000 rpm at a rate of 2 ml per hour (total of 10 ml). The spun PLLA was cut into 60 μm intervals and subjected to an aminolysis process to produce microcarriers with a fixed length of 60 μm.
제작한 마이크로 전달체 3 mg을 10배로 농축된 모의체액(SBF; simulated body fluid)에 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG; epigallocatechin gallate)와 0.1 M 탄산수소나트륨을 함께 처리하여 37℃에서 1시간 동안 교반하고, 수산화나트륨으로 코팅된 마이크로 전달체를 안정화한 후 동결건조하여 사용하였다.3 mg of the fabricated microcarrier was treated with epigallocatechin gallate (EGCG) and 0.1 M sodium bicarbonate in a 10-fold concentrated simulated body fluid (SBF), stirred at 37°C for 1 hour, and the microcarrier coated with sodium hydroxide was stabilized, followed by lyophilization and use.
제작한 마이크로 전달체의 코팅 정도를 확인하기 위해 주사전자현미경(SEM)과 X선 광전자 분석법으로 표면 분석을 진행하였고, 칼슘 정량법을 통해 코팅된 미네랄의 주 성분인 칼슘 이온의 양을 분석하였다.To confirm the degree of coating of the fabricated microcarrier, surface analysis was performed using scanning electron microscopy (SEM) and X-ray photoelectron analysis, and the amount of calcium ions, the main component of the coated mineral, was analyzed using a calcium quantification method.
1.2. 1.2. 미네랄화Mineralization 마이크로 전달체의 기능성 검증Functional verification of microtransmitters
마이크로 전달체 10 μg과 인간 지방 유래 줄기세포(hADSC: human adipose-derived stem cell) 4 만개를 혼합하여 1200 rpm에서 5분간 원심분리를 수행하고, 1~2일의 안정화 과정을 거쳐 구 형태의 마이크로 전달체가 함입된 줄기세포구상체를 제작하였다.10 μg of microcarriers and 40,000 human adipose-derived stem cells (hADSC) were mixed, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and a stabilization process of 1 to 2 days was performed to produce stem cell spheroids loaded with spherical microcarriers.
제작한 줄기세포구상체의 골 분화를 분석하기 위해 1일차와 14일차 기준 칼슘 정량법을 통해 칼슘 이온의 양을 비교 분석하였고, 세포외기질의 대표적인 종류로 알려진 피브로넥틴(fibronectin)과 라미닌(laminin)이 얼마나 포함되어 있는지 면역-항체 염색법을 통해 분석을 진행하였다.To analyze the bone differentiation of the fabricated stem cell spheroids, the amount of calcium ions was compared and analyzed using a calcium quantification method on days 1 and 14, and the amount of fibronectin and laminin, known as representative types of extracellular matrix, was analyzed using an immuno-antibody staining method.
1.3. 1.3. 줄기세포구상체의Stem cell spheroids 지지체 배치 및 배양, 탈세포화 공정을 통한 Through support placement and culture, decellularization process 세포외기질Extracellular matrix 수득 및 분석Obtain and analyze
폴리카프로락톤(PCL: polycaprolactone) 기반으로 3차원 지지체를 제작하였으며, 구체적으로 한 변의 길이가 5 mm인 정사각형에 높이가 1 mm인, 10개의 계층을 중첩시켜서 3차원 프린팅 고분자 지지체를 제작하였다(도 1).A three-dimensional support was produced based on polycaprolactone (PCL), and specifically, a three-dimensional printing polymer support was produced by overlapping 10 layers of squares with a side length of 5 mm and a height of 1 mm (Fig. 1).
세포 응집 및 친화력을 증가시키기 위하여 지지체를 폴리도파민으로 코팅하였다. 코팅은 도파민 염산염(dopamine hydrochloride)이 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) 용액에 2 mg/ml의 농도로 녹여져 있는 용액을 사용하여 4시간 동안 진행하였다.To increase cell aggregation and affinity, the support was coated with polydopamine. The coating was performed for 4 hours using a solution containing dopamine hydrochloride dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) at a concentration of 2 mg/ml.
마이크로 전달체 함입된 세포구상체를 코팅된 지지체의 각 칸에 배치한 뒤, 배양액 중에서 14일 간 배양을 진행하였다. 배양한 3차원 조직체를 세제 용액으로 알려져 있는 0.5% Triton X-100 용액에 상온에서 하루 동안 넣어두고, 이후에 100 U/ml 농도의 DNase I 용액에 37℃에서 1 시간 동안 넣어두었다. 과정이 끝나면 간단한 세척과정을 통해 탈세포화된 다기능성 이식재를 수득하였다(도 2).After the cell spheroids loaded with microcarriers were placed in each cell of the coated support, they were cultured in a culture medium for 14 days. The cultured 3D tissues were placed in a 0.5% Triton X-100 solution, known as a detergent solution, at room temperature for one day, and then placed in a 100 U/ml DNase I solution at 37°C for 1 hour. After the process, a decellularized multifunctional graft was obtained through a simple washing process (Fig. 2).
탈세포화된 다기능성 이식재가 효과적으로 탈세포화 공정이 마무리된 것인지 확인하기 위해, DNA 정량법으로 세포성분의 제거 정도를 분석하였고, 단백질 정량법 (BCA)으로 단백질의 보존율을 분석하였으며, 남아있는 세포외기질 단백질이 얼마나 남아있는지 면역-항체 염색법으로 정성 분석을 진행하였다.To confirm whether the decellularized multifunctional graft material had effectively completed the decellularization process, the degree of cellular component removal was analyzed by DNA quantification, the protein preservation rate was analyzed by protein quantification (BCA), and a qualitative analysis was performed by immuno-antibody staining to determine how much extracellular matrix protein remained.
1.4. 1.4. 탈세포화된Decellularized 다기능성Versatility 이식재의Of the transplant material 구성 성분 분석Composition analysis
(1) 골 분화 관련(1) Related to bone differentiation
골 분화 발생 시 형성되는 미네랄의 성분 중 하나인 칼슘의 양을 Alizarin red S 염색법과 칼슘 정량법을 통해 분석을 진행하였고, 같은 이유로 콜라젠의 양을 Sirius red/Fast green 염색법과 관련 정량법을 통해 분석을 진행하였다. 또한, 골 분화가 발생했을 때 형성되는 대표적인 단백질의 종류들인 type 1 콜라겐, bone sialoprotein(BSP), periostin에 대하여 면역-항체 염색법으로 정성분석을 진행하였으며, 염색되는 정도를 정량화하여 비교분석도 같이 진행하였다.The amount of calcium, one of the mineral components formed during bone differentiation, was analyzed using Alizarin red S staining and a calcium quantitative method, and for the same reason, the amount of collagen was analyzed using Sirius red/Fast green staining and a related quantitative method. In addition, a qualitative analysis was performed on type 1 collagen, bone sialoprotein (BSP), and periostin, which are representative proteins formed during bone differentiation, using an immuno-antibody staining method, and a comparative analysis was also performed by quantifying the degree of staining.
(2) 혈관 형성 관련(2) Related to angiogenesis
혈관 형성과 관련되어 있는 대표적인 성장인자 2가지인 혈관내피세포성장인자(VEGF; vascular endothelial growth factor)와 혈소판유래성장인자(PDGF; platelet derived growth factor)를 면역-항체 염색법을 통해 정성적인 분석을 진행하였으며, 염색된 부분의 정도를 정량화하여 비교분석도 같이 진행하였다.Two representative growth factors related to angiogenesis, vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet derived growth factor (PDGF), were qualitatively analyzed using an immuno-antibody staining method, and the degree of staining was quantified and comparative analysis was also performed.
1.5. 1.5. 탈세포화된Decellularized 다기능성Versatility 이식재의Of the transplant material 기능성 평가Functional evaluation
(1) 골 분화 관련(1) Related to bone differentiation
탈세포화된 다기능성 이식재의 표면에 지방 유래 줄기 세포 2만개를 배양한 뒤, 14일 간의 배양 후 분석을 진행하였다. 골 재생을 촉진하는 단백질로 알려져 있는 BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)를 효소면역측정법(ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay)을 통해 분비되는 양을 분석하였고, 면역-항체 염색법으로 골 분화 인자로 알려져 있는 RUNX2(runt-related transcription factor 2)와 OPN(osteopontin)을 정성적으로 분석하였다. 또한 중합효소연쇄반응을 통해 다양한 종류의 골 분화 인자들을 7, 14, 21일차로 나누어서 분화 정도를 상대적인 정량으로 비교 분석하였다.After culturing 20,000 adipose-derived stem cells on the surface of decellularized multifunctional grafts, analysis was performed after 14 days of culture. Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), known as a protein that promotes bone regeneration, was analyzed in terms of the amount secreted using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and RUNX2 (runt-related transcription factor 2) and OPN (osteopontin), known as bone differentiation factors, were qualitatively analyzed using an immuno-antibody staining method. In addition, various types of bone differentiation factors were divided into 7, 14, and 21 days through polymerase chain reaction and the degree of differentiation was compared and analyzed in relative quantity.
(2) 혈관 형성 관련(2) Related to angiogenesis
탈세포화된 다기능성 이식재의 표면에 지방 유래 줄기 세포 2만개를 배양한 뒤, 21일 간의 배양 후 분석을 진행하였다. 혈관 형성을 촉진하는 성장 인자인 VEGF의 분비되는 정도를 효소면역측정법을 통해 정량분석을 진행하였으며, VEGF의 수용체가 얼마나 발현되었는지를 면역-항체 염색법으로 검증하였다. 또한, 중합효소연쇄반응을 통해 다양한 종류의 혈관 형성 관련 인자들을 21일차에 상대적인 정량으로 비교 분석하였다.After culturing 20,000 adipose-derived stem cells on the surface of decellularized multifunctional grafts, analysis was conducted after 21 days of culture. The secretion of VEGF, a growth factor that promotes angiogenesis, was quantitatively analyzed using enzyme-linked immunosorbent assay, and the expression of VEGF receptors was verified using immuno-antibody staining. In addition, various types of angiogenesis-related factors were comparatively quantitatively analyzed on day 21 through polymerase chain reaction.
1.6. 1.6. 탈세포화된Decellularized 다기능성Versatility 이식재의Of the transplant material 생체 내 In vivo 혈관화Vascularization 골 재생 및 조직 융합 효과 평가Evaluation of bone regeneration and tissue fusion effects
제작한 탈세포화된 다기능성 이식재를 전달할 목표체로 마우스 두개골 결손모델을 활용하였다. 수술을 통해서 마우스 두개골을 직경 4 mm 크기로 골 결함을 준 뒤, 제작한 재료를 이식하고 8주 뒤에 재수술을 통해 이식해준 부위의 두개골을 수득하여 마이크로 CT 분석으로 재생된 골 조직의 면적, 부피 등을 계산하여 분석을 진행하였다.A mouse calvarial defect model was used as the target for delivery of the decellularized multifunctional graft material. A bone defect with a diameter of 4 mm was created in the mouse calvarial region through surgery, and the material was transplanted. Eight weeks later, the skull of the transplanted area was obtained through a second surgery. The area and volume of the regenerated bone tissue were calculated and analyzed using micro-CT analysis.
또한, Goldner's trichrome 염색법을 통해 성숙한 골 조직의 비율도 분석하였고, 혈관 구조의 주 인자로 알려져 있는 α-SMA(smooth muscle actin)을 면역-항체 염색법으로 정성 분석 및 형성된 혈관의 수를 정량적으로 비교분석을 진행하였다. 또한, 이식한 동물 조직과의 융합 정도를 확인하기 위해 hADSC의 유래 종인 인간 유래 핵(HNA)을 면역-항체 염색법을 통해 분석하였다.In addition, the proportion of mature bone tissue was analyzed using Goldner's trichrome staining, and α-SMA (smooth muscle actin), known as a major factor in vascular structure, was qualitatively analyzed using immuno-antibody staining, and the number of formed blood vessels was quantitatively compared and analyzed. In addition, human-derived nuclei (HNA), the origin species of hADSCs, were analyzed using immuno-antibody staining to confirm the degree of fusion with the transplanted animal tissue.
실시예Example 2: 2: polypoly (L-(L- lactidelactide ) () ( PLLAPLLA ) 기반 마이크로 전달체 제작 및 미네랄 코팅) based micro-transporter fabrication and mineral coating
미네랄 코팅된 마이크로 전달체(MF)와 미네랄이 코팅되지 않은 마이크로 전달체(EF)의 표면을 분석하고, 미네랄 이온인 칼슘 이온의 양을 정량하여 코팅된 정도를 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.The surfaces of mineral-coated microcarriers (MF) and non-mineral-coated microcarriers (EF) were analyzed, and the amount of calcium ions, which are mineral ions, was quantified to analyze the degree of coating, and the results are shown in Fig. 3.
SEM을 통해 두 종류의 마이크로 전달체 표면을 비교해본 결과, MF의 표면에 알려진 미네랄 구조인 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)와 유사한 구조의 결정이 전달체 표면에 형성된 것을 확인하였고, 이 때문에 두께도 많이 두꺼워진 것을 확인하였다(도 3A).Comparing the surfaces of the two types of microcarriers using SEM, it was confirmed that crystals with a structure similar to hydroxyapatite, a known mineral structure on the surface of MF, were formed on the surface of the carrier, and it was confirmed that the thickness was also significantly increased due to this (Fig. 3A).
또한, X선 광전자 분광법 (XPS)을 통해서 표면 원소 분석을 진행한 결과, MF에서는 칼슘 원소의 최외곽 오비탈인 Ca2p의 결합에너지인 346.6 eV과 P2p의 결합에너지인 130.6 eV에서 강한 수준의 신호가 측정되었고, 이를 통해 표면에 미네랄의 주 성분인 칼슘 원소 및 인 원소가 코팅되어 있음을 확인하였다(도 3B).In addition, as a result of surface element analysis using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), strong signals were measured at 346.6 eV, which is the binding energy of Ca2p, the outermost orbital of calcium element, and 130.6 eV, which is the binding energy of P2p, in MF, confirming that calcium and phosphorus elements, which are the main components of minerals, were coated on the surface (Fig. 3B).
또한, 칼슘 정량법을 통해서 실제로 두 종류의 마이크로 전달체에 포함되어 있는 칼슘 이온의 양을 정량한 결과, MF가 1 μg당 0.16 ± 0.01 μg로 EF의 0.02 ± 0.03 μg 보다 월등하게 유의미한 수준으로 칼슘의 양이 검출됨으로써, 코팅이 효과적으로 되었음을 확인하였다(도 3C).In addition, the amount of calcium ions actually included in the two types of microcarriers was quantified using a calcium quantification method, and the amount of calcium detected was significantly higher at 0.16 ± 0.01 μg per μg of MF than 0.02 ± 0.03 μg per μg of EF, confirming that the coating was effective (Fig. 3C).
실시예Example 3: 3: 미네랄화Mineralization 마이크로 전달체의 기능성 검증Functional verification of microtransmitters
세포로만 이루어진 줄기세포구상체와 2 종류의 마이크로 전달체를 각각 함입한 줄기세포구상체에 대하여 크기 보존, 생체활성물질 및 단백질의 양 등에 대하여 분석을 진행하였다.We analyzed the size preservation, bioactive substances, and protein content of stem cell spheroids composed solely of cells and stem cell spheroids loaded with two types of microcarriers.
도 4A에 나타난 바와 같이, 마이크로 전달체 없이 세포로만 이루어진 줄기세포구상체(S)는 미네랄 코팅되지 않은 전달체가 함입된 줄기세포구상체(ES)나 미네랄 코팅된 전달체가 함입된 줄기세포구상체(MS)에 비해서 14일의 배양 후 크기적으로도 많이 줄어들고, 세포구상체의 내부에 죽은 세포의 양이 상대적으로 더 존재하는 것으로 관찰되었다. 또한, 헤마톡실린/에오신(hematoxylin & eosin, H&E) 염색법을 통해서 ES와 MS는 같은 양의 세포를 사용했음에도 내부에 비어보이는 공간이 S보다 더 존재하는 것으로 관찰되었으며, 이는 구상체 내부에도 공간이 형성되어 외부 용액이 세포구상체 내부로 잘 투과될 수 있다는 것을 의미한다.As shown in Fig. 4A, the stem cell spheroids (S) composed of only cells without microcarriers were observed to be significantly smaller in size after 14 days of culture and to have a relatively larger amount of dead cells inside the cell spheroids compared to the stem cell spheroids (ES) loaded with non-mineral-coated carriers or the stem cell spheroids (MS) loaded with mineral-coated carriers. In addition, through hematoxylin & eosin (H&E) staining, it was observed that ES and MS had more empty spaces inside than S even though the same amount of cells was used. This means that spaces are formed inside the spheroids so that external solutions can easily penetrate into the cell spheroids.
또한, 도 4B에 나타난 바와 같이, 배양 1일차와 14일차의 줄기세포구상체 크기를 비교해 보면, 이미지 상 보이는 줄기세포구상체의 면적이 S의 경우 1일차에 0.53 ± 0.04 mm2에서 14일차에 0.15 ± 0.01 mm2까지 크게 감소한 반면 마이크로 전달체가 함입되어 있는 ES, MS의 경우에는 각각 1일차에 0.52 ± 0.03, 0.65 ± 0.06 mm2에서 14일차에 0.21 ± 0.01, 0.35 ± 0.03 mm2정도로 상대적으로 크기 보존이 되고 있음을 통해 부피가 있는 조직 결손 모델에 대하여 이식재료로 활용하기 더 적합하다고 해석할 수 있다.In addition, as shown in Fig. 4B, when comparing the size of stem cell spheroids on days 1 and 14 of culture, the area of stem cell spheroids visible in the image significantly decreased from 0.53 ± 0.04 mm 2 on day 1 to 0.15 ± 0.01 mm 2 on day 14 in the case of S, whereas in the case of ES and MS containing microcarriers, the size was relatively preserved from 0.52 ± 0.03 and 0.65 ± 0.06 mm 2 on day 1 to 0.21 ± 0.01 and 0.35 ± 0.03 mm 2 on day 14, respectively. This can be interpreted as more suitable for use as a transplant material for a volumetric tissue defect model.
또한, 도 4C에 나타난 바와 같이, 14일의 배양 후 줄기세포구상체에 포함되어 있는 단백질을 정량한 결과, 하나의 줄기세포구상체 당 S는 1.67 ± 0.34 μg, ES는 2.28 ± 0.16 μg, MS는 2.57 ± 0.54 μg로 MS에서 가장 높은 양의 단백질이 생성되었음을 알 수 있었다. 이를 통해 전달체가 줄기세포구상체 내부에서 세포와의 상호작용을 통해서 세포의 성장을 촉진할 수 있고, 미네랄화된 전달체는 세포와의 상호작용을 통해서 생성하는 단백질의 양이 더 많이 나타날 수 있게 한다는 점을 알 수 있다.In addition, as shown in Fig. 4C, the results of quantifying the proteins contained in the stem cell spheroids after 14 days of culture showed that S, 2.28 ± 0.16 μg, and MS, 2.57 ± 0.54 μg per stem cell spheroid, showing that the highest amount of protein was produced in MS. This suggests that the delivery vehicle can promote cell growth through interaction with cells inside the stem cell spheroids, and that the mineralized delivery vehicle can produce a larger amount of protein through interaction with cells.
한편, 면역-항체 염색법을 활용하여 세포외기질 단백질의 대표적인 종류인 피브로넥틴(fibronectin)과 라미닌(laminin)을 염색한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 마이크로 전달체가 줄기세포구상체 내부에서 단백질들을 흡착시켜주는 기능을 하면서 S 보다는 ES와 MS에서 더 염색이 진하게 되었고, 코팅된 미네랄이 추가적으로 단백질 흡착을 유도할 수 있기 때문에 MS가 가장 진하게 염색이 된 것을 확인할 수 있었다. 또한 상대적인 값으로 정량화를 진행했을 때도 두 종류의 단백질 모두에서 ES는 S의 약 1.5배, MS는 S의 약 2배 이상 염색이 더 진하게 된 것을 통해 미네랄 코팅된 마이크로 전달체가 줄기세포구상체에 포함되어 있는 단백질의 양을 증가시킬 수 있음을 증명하였다(도 5).Meanwhile, as a result of staining fibronectin and laminin, which are representative types of extracellular matrix proteins, using an immuno-antibody staining method, as shown in Fig. 5, it was confirmed that the microcarriers functioned to adsorb proteins inside the stem cell spheroids, and that the staining was darker in ES and MS than in S, and that MS was stained the most darkly because the coated mineral could additionally induce protein adsorption. In addition, when quantification was performed with a relative value, it was proven that the mineral-coated microcarriers could increase the amount of proteins included in the stem cell spheroids, through the fact that ES was stained about 1.5 times more intensely than S and MS was stained about 2 times more intensely than S in both types of proteins (Fig. 5).
실시예Example 4: 4: 줄기세포구상체Stem cell spheroid 지지체 배치 및 배양, 탈세포화 공정을 통한 Through support placement and culture, decellularization process 세포외기질Extracellular matrix 수득 및 분석Obtain and analyze
3차원 구조의 지지체(도 1)에 각 종류의 줄기세포구상체를 배치한 뒤 7일간 배양 후 탈세포화를 진행했을 때, 탈세포화되는 정도를 정성적, 정량적으로 분석하고, 탈세포화가 진행된 후(dC)에 보존되는 단백질의 양도 분석하였다.After arranging each type of stem cell spheroid on a three-dimensional support (Fig. 1) and culturing for 7 days, decellularization was performed. The degree of decellularization was analyzed qualitatively and quantitatively, and the amount of protein preserved after decellularization (dC) was also analyzed.
도 6A에 나타난 바와 같이, SEM 이미지를 보면 마이크로 전달체가 함입되어 있는 dC-ES와 dC-MS에서는 탈세포화 후에 구멍이 형성되어 있는 것을 관찰할 수 있었으나, dC-S는 탈세포화를 하더라도 표면에 크게 다른 부분이 관찰되지 않았다.As shown in Fig. 6A, the SEM images showed that pores were formed after decellularization in dC-ES and dC-MS containing microcarriers, but no significant difference was observed on the surface of dC-S even after decellularization.
또한, 잔존하는 DNA의 양을 비율로 환산했을 때, 도 6B에 나타난 바와 같이, dC-S는 26.19 ± 0.16%, dC-ES와 dC-MS는 각 15.85 ± 0.36%, 13.39 ± 0.30%로 마이크로 전달체가 함입되어 있는 줄기세포구상체에서 더 많이 DNA 양이 감소한 것을 알 수 있었다. 탈세포화가 되었다는 것에 대한 기준을 잡을 때 보통 평균적으로 약 20% 미만의 DNA 잔존율을 나타낸다고 하는데, 이를 기준으로 삼는다면 마이크로 전달체가 함입되어 있던 dC-ES와 dC-MS에서 효과적인 탈세포화가 진행되었다고 할 수 있으며, 이는 마이크로 전달체로 인해 형성된 공간에 탈세포화 용액이 침투하여 더 향상된 탈세포화 효과를 내부까지 보였다고 할 수 있다.In addition, when the amount of residual DNA was converted into a ratio, as shown in Fig. 6B, dC-S was 26.19 ± 0.16%, dC-ES and dC-MS were 15.85 ± 0.36% and 13.39 ± 0.30%, respectively, indicating that the amount of DNA was reduced more in stem cell spheroids loaded with microcarriers. When setting the standard for decellularization, it is usually said that an average of less than 20% of DNA residual rate is shown, and if this is used as a standard, it can be said that effective decellularization was performed in dC-ES and dC-MS loaded with microcarriers, and this can be said to be because the decellularization solution penetrated into the space formed by the microcarriers and showed a more enhanced decellularization effect internally.
또한, 보존되어 있는 단백질을 정량한 결과, 도 6C에 나타난 바와 같이, dC-ES와 dC-MS에서 각 60.99 ± 4.37%, 57.90 ± 2.63%로 약 60% 정도의 보존율을 지니고 있는 반면 마이크로 전달체가 함입되어 있지 않은 dC-S의 경우 43.55 ± 0.89%로 탈세포화가 효과적이지 못했음에도 50%에 못 미치는 보존율을 보이고 있었다. 이를 통해서 마이크로 전달체가 줄기세포구상체 내부의 단백질들을 탈세포화 과정에서 떨어져나가지 않도록 잡아주는 역할을 했다고 해석할 수 있다.In addition, as a result of quantifying the preserved proteins, as shown in Fig. 6C, dC-ES and dC-MS had a preservation rate of approximately 60%, 60.99 ± 4.37% and 57.90 ± 2.63%, respectively, whereas dC-S without the microcarriers showed a preservation rate of less than 50%, 43.55 ± 0.89%, even though decellularization was not effective. This can be interpreted that the microcarriers played a role in holding the proteins inside the stem cell spheroids so that they did not fall off during the decellularization process.
또한, 세포외기질 단백질의 주요 구성 성분인 fibronectin과 laminin 모두 탈세포화 이후에 dC-MS에서 높은 수준의 보존 정도를 보이고 있으며(도 7), 이를 통해 마이크로 전달체와 미네랄이라는 생체활성물질의 코팅이 탈세포화 공정 중에도 단백질이 손실되지 않도록 잡아줄 수 있다고 할 수 있다.In addition, both fibronectin and laminin, which are major components of the extracellular matrix proteins, show a high degree of preservation in dC-MS after decellularization (Fig. 7), which suggests that the coating of bioactive substances such as microcarriers and minerals can prevent protein loss during the decellularization process.
다만, 도 7B에 나타난 바와 같이, dC-S가 dC-ES와 비슷하거나 오히려 많아 보이는 것은 처음부터 dC-S에서는 탈세포화 공정이 제대로 이루어지지 않았기 때문이다. 따라서 fibronectin, laminin 같은 일부 특정 단백질에 대해서는 처음부터 단백질의 손실이 많지 않았던 dC-S가 dC-ES와 값으로만 비교했을 때는 비슷하거나 오히려 많아보이는 결과가 나타날 수 있다.However, as shown in Fig. 7B, the reason why dC-S appears similar to or rather more than dC-ES is because the decellularization process was not properly performed in dC-S from the beginning. Therefore, for some specific proteins such as fibronectin and laminin, dC-S, which did not show much protein loss from the beginning, may show similar or rather more results than dC-ES when compared only by value.
그럼에도 dC-MS의 경우에는 처음부터 생성된 단백질의 양이 많았으므로(도 6C), 탈세포화 공정을 통해 손실이 일어나더라도 여전히 많은 양의 단백질이 보존된 것을 확이할 수 있다(도 7B).However, in the case of dC-MS, since the amount of protein produced from the beginning was large (Fig. 6C), it can be confirmed that a large amount of protein is still preserved even if loss occurs through the decellularization process (Fig. 7B).
실시예Example 5: 5: 탈세포화된Decellularized 다기능성Versatility 이식재의Of the transplant material 구성 성분 분석Composition analysis
(1) 골 분화 관련(1) Related to bone differentiation
골 분화와 관련되어 있는 콜라겐이 포함되어 있는 콜라겐성 단백질(collagenous protein)과 비-콜라겐성 단백질(non-collagenous protein)을 구분해서 염색하는 Sirius red/Fast green 염색 결과, 도 8A에 나타난 바와 같이, dC-MS에 더 많은 콜라겐성 단백질이 포함되어 있음을 알 수 있고, 콜라겐의 양도 dC-ES는 6.11 ± 0.06 μg, dC-MS는 7.13 ± 0.13 μg로 유의미한 수준으로 dC-MS에서 더 많은 양이 검출되었다.As shown in Fig. 8A, the Sirius red/Fast green staining results, which distinguish and stain collagenous proteins and non-collagenous proteins containing collagen associated with bone differentiation, showed that dC-MS contained more collagenous proteins, and the amount of collagen was also significantly higher in dC-MS (6.11 ± 0.06 μg in dC-ES and 7.13 ± 0.13 μg in dC-MS).
골 분화가 일어난 세포들에서 주로 발현되고, 골 분화에 직접적인 영향을 줄 수 있는 단백질인 collagen type I, bone sialoprotein, periostin을 면역항체염색법을 활용하여 정성적인 분석을 한 결과, 도 8B에 나타난 바와 같이, 염색되는 정도가 dC-MS에서 훨씬 강한 것을 통해 골 분화가 성공적으로 일어났으며 탈세포화 후에도 관련 단백질이 탈세포화된 다기능성 이식재 내에 잘 함유되어 있음을 확인하였다.As a result of qualitative analysis using immunohistochemistry for collagen type I, bone sialoprotein, and periostin, which are mainly expressed in cells where osteogenic differentiation has occurred and which can directly affect osteogenic differentiation, as shown in Fig. 8B, the degree of staining was much stronger in dC-MS, confirming that osteogenic differentiation occurred successfully and that the related proteins were well contained in the decellularized multifunctional graft material even after decellularization.
(2) 혈관 형성 관련(2) Related to angiogenesis
혈관 형성 및 조직의 재생과 관련이 있는 혈관내피세포성장인자(VEGF; vascular endothelial growth factor)와 혈소판유래성장인자(PDGF; platelet derived growth factor)를 면역항체염색법을 통해서 탈세포화 후에 남아있는지 확인한 결과, 지방유래줄기세포가 기본적으로 관련 인자를 방출할 수 있는 기능이 있기 때문에 dC-ES와 dC-MS 모두 관련 인자를 생성한 것을 확인하였고, 탈세포화 후에도 성장 인자와 같은 생체활성물질이 잔존할 수 있음이 확인되었다(도 8C).We confirmed that vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet derived growth factor (PDGF), which are related to blood vessel formation and tissue regeneration, remained after decellularization using an immunoassay. As a result, both dC-ES and dC-MS produced the related factors because adipose-derived stem cells have the fundamental function of releasing the related factors. It was also confirmed that bioactive substances such as growth factors can remain even after decellularization (Fig. 8C).
실시예Example 6: 6: 탈세포화된Decellularized 다기능성Versatility 이식재의Of the transplant material 다기능성Versatility 평가 evaluation
제작한 탈세포화된 다기능성 이식재의 기능성을 평가하기 위해 이식재 표면에 hADSC를 2만개 배양한 뒤, 골 분화를 확인하기 위해서 14일간 배양, 혈관 형성 관련해서는 21일간 배양한 뒤 분석을 진행하였다.To evaluate the functionality of the fabricated decellularized multifunctional graft, 20,000 hADSCs were cultured on the surface of the graft, and then cultured for 14 days to confirm osteogenic differentiation and for 21 days to examine angiogenesis, after which analysis was conducted.
(1) 골 분화 관련(1) Related to bone differentiation
ELISA를 활용해 BMP-2라는 골 분화 관련 단백질의 분비되는 양을 정량한 결과, dC-MS는 10.99 ± 1.05 ng/ml로 dC-ES가 8.02 ± 1.14 ng/ml인 것에 비교했을 때 통계적으로 유의미한 수준으로 dC-MS가 더 많이 분비한다는 결과를 도출하였다(도 9A). 면역-항체 분석법을 활용하여 골 분화 관련 대표적인 초기 인자 RUNX2와 후기 인자 OPN을 염색한 결과, dC-MS에서 이식재에 배양한 줄기세포에 균일하게 염색이 된 것을 확인하였다(도 9B). 중합효소연쇄반응으로 분석한 골 분화 관련 유전자 발현의 정도를 분석한 결과 dC-MS가 전반적으로 dC-ES보다 높은 발현 수준을 나타내는데, 초기 발현인자로 알려져 있는 RUNX2와 OSX는 약 13배, 11배 더 높고, 중기 발현인자인 OCN은 약 6배, 후기 말기 발현인자인 OPN, Col1a의 경우에는 약 9배, 14배 정도로 dC-MS가 더 높았다(도 9C). 이를 통해 dC-MS가 골 분화를 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다.As a result of quantifying the secreted amount of BMP-2, a protein related to bone differentiation, using ELISA, dC-MS secreted 10.99 ± 1.05 ng/ml, which was statistically significantly higher than dC-ES (8.02 ± 1.14 ng/ml) (Fig. 9A). As a result of staining RUNX2, a representative early factor related to bone differentiation, and OPN, a late factor, using an immuno-antibody analysis method, it was confirmed that the stem cells cultured on the graft were uniformly stained in dC-MS (Fig. 9B). The results of analyzing the degree of expression of genes related to bone differentiation by polymerase chain reaction showed that dC-MS showed higher expression levels overall than dC-ES. RUNX2 and OSX, known as early expression factors, were about 13- and 11-fold higher in dC-MS, OCN, an intermediate expression factor, was about 6-fold higher, and OPN and Col1a, late expression factors, were about 9- and 14-fold higher in dC-MS (Fig. 9C). This showed that dC-MS could effectively induce bone differentiation.
(2) 혈관 형성 관련(2) Related to blood vessel formation
혈관 형성을 유도할 수 있는 대표적인 성장 인자인 VEGF의 분비량을 분석했을 때, dC-ES는 5.36 ± 0.05 ng/ml, dC-MS는 7.93 ± 0.24 ng/ml로 통계적으로 유의미한 수준으로 dC-MS가 더 높은 것을 통해 dC-MS가 많은 양의 세포외기질 단백질 성분을 통해 줄기 세포의 혈관 형성 유도 인자 분비를 촉진한다고 할 수 있다(도 10A). VEGF를 수용할 수 있는 수용체의 발현 여부를 추가적으로 면역-항체 염색법으로 분석한 결과, dC-MS에서 dC-ES 보다 약 3배 이상 염색이 되었다(도 10B). 또한 중합효소연쇄반응을 통해 혈관 형성 유래 인자를 생성할 수 있는 관련 유전자들을 분석했을 때, 대부분의 유전자들에 대해서 dC-MS가 최소 2배 이상의 높은 발현을 나타내고 있었다(도 10C). 이를 통해 dC-MS는 골 분화뿐 아니라 혈관의 형성에도 높은 기여를 할 수 있음을 알 수 있고, 이를 통해 하나의 기능이 아닌 복합 조직 재생에 알맞은 다기능성 역할을 수행할 수 있다.When analyzing the secretion amount of VEGF, a representative growth factor that can induce angiogenesis, dC-ES showed 5.36 ± 0.05 ng/ml and dC-MS showed 7.93 ± 0.24 ng/ml, which was statistically significantly higher. This suggests that dC-MS promotes the secretion of angiogenesis-inducing factors in stem cells through a large amount of extracellular matrix protein components (Fig. 10A). When the expression of receptors that can accept VEGF was additionally analyzed using an immuno-antibody staining method, dC-MS showed about 3 times more staining than dC-ES (Fig. 10B). In addition, when analyzing related genes that can produce angiogenesis-induced factors through polymerase chain reaction, dC-MS showed at least 2 times higher expression for most genes (Fig. 10C). This suggests that dC-MS can contribute significantly to not only bone differentiation but also blood vessel formation, thereby enabling it to perform a multifunctional role suitable for complex tissue regeneration rather than a single function.
실시예Example 7: 7: 탈세포화된Decellularized 다기능성Versatility 이식재의Of the transplant material 생체 내 In vivo 혈관화Vascularization 골 재생 및 조직 융합 효과 평가Evaluation of bone regeneration and tissue fusion effects
이렇게 개발한 탈세포화된 다기능성 이식재를 마우스 두개골 결손 모델에 이식하여 8주 뒤에 재생된 골 조직과 혈관에 대한 분석을 정성, 정량적으로 진행하였으며, 주변 조직과 이식한 다기능성 3차원 지지체의 상호작용도 분석하였다.The decellularized multifunctional graft material developed in this way was transplanted into a mouse calvarial defect model, and the regenerated bone tissue and blood vessels were qualitatively and quantitatively analyzed 8 weeks later. The interaction between the surrounding tissue and the transplanted multifunctional 3D scaffold was also analyzed.
동물 모델에서 분석한 그룹은 아무것도 없는 그룹(Defect), 3차원 지지체만을 전달한 그룹(Chamber), 탈세포화를 진행하지 않고 세포 이식을 진행한 그룹(C-MS), dC-ES를 이식한 그룹(dC-ES) 및 dC-MS를 이식한 그룹(dC-MS)으로 구성되었다.The groups analyzed in the animal model were composed of a group with nothing (Defect), a group that only delivered a 3D support (Chamber), a group that underwent cell transplantation without decellularization (C-MS), a group that transplanted dC-ES (dC-ES), and a group that transplanted dC-MS (dC-MS).
마이크로 CT 분석 결과, 도 11A에 나타난 바와 같이, dC-MS를 이식한 그룹에서 가장 많은 면적의 골 조직 재생을 보이고 있었으며, 재생된 부피도 dC-MS에서 20.06 ± 1.11%로 dC-ES의 10.05 ± 0.92% 보다 약 2배 정도 더 높은 골조직 재생을 보이고 있었다.As shown in Fig. 11A, the micro-CT analysis results showed that the group implanted with dC-MS showed the largest area of bone tissue regeneration, and the regenerated volume was approximately 2 times higher in dC-MS (20.06 ± 1.11%) than in dC-ES (10.05 ± 0.92%).
또한, Goldner's trichrome을 통해 성숙한 골 조직의 재생 수준을 정성적으로 분석한 결과, 도 11B에 나타난 바와 같이, dC-ES를 이식한 그룹은 조직이 많이 재생이 되었으나, 붉은색의 미성숙 조직들이 많이 보이고, dC-MS를 이식한 그룹에서는 초록색의 성숙한 골 조직이 재생된 조직의 대부분을 구성하고 있는 것이 관찰되었다.In addition, as a result of qualitatively analyzing the level of regeneration of mature bone tissue using Goldner's trichrome, as shown in Fig. 11B, the group transplanted with dC-ES showed a lot of regeneration of tissue, but a lot of red immature tissue was observed, whereas in the group transplanted with dC-MS, green mature bone tissue was observed to make up most of the regenerated tissue.
재생된 조직에서 혈관 구조가 관찰되는지 분석한 결과, 도 11C에 나타난 바와 같이, 탈세포화된 세포외기질이 함유된 3차원 지지체 이식 그룹(dC-ES, dC-MS)에 대해서는 혈관 재생이 유의미하게 진행이 되었으며, 전역에 걸쳐서 균일하게 재생이 되었다. 그 중에서도, dC-MS에서는 이식한 모델 하나 당 평균 16 ± 1.41 개로 다른 그룹들에 비해 2배 이상 많은 양의 혈관이 재생된 것이 관찰되었다.As a result of analyzing whether vascular structures were observed in the regenerated tissue, as shown in Fig. 11C, vascular regeneration was significantly progressed and uniformly occurred throughout the 3D support transplantation group (dC-ES, dC-MS) containing decellularized extracellular matrix. Among them, in dC-MS, it was observed that an average of 16 ± 1.41 blood vessels were regenerated per transplanted model, which was more than twice as many as the other groups.
또한, 인간 유래 핵(HNA) 면역-항체 염색법을 통한 이식 재료와 조직의 융합 정도를 분석한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 탈세포화를 진행하지 않고 세포 이식을 진행한 C-MS와 탈세포화를 진행한 dC-MS를 비교해 봤을 때, dC-MS를 이식한 그룹에서는 주변 조직의 세포들이 이식한 부위 전역을 차지할 정도로 완전한 조직 융합이 일어난 것이 관찰되었다. 이와 반대로 C-MS의 경우에는 이식한 세포가 공간을 차지하고 있어서 동물 조직이 해당 공간에 침투하지 못해 조직의 융합이 제대로 이루어지지 않았다.In addition, as a result of analyzing the degree of fusion of the transplant material and tissue using human-derived nuclear (HNA) immuno-antibody staining, as shown in Fig. 12, when comparing C-MS, which underwent cell transplantation without decellularization, and dC-MS, which underwent decellularization, it was observed that in the group transplanted with dC-MS, complete tissue fusion occurred to the extent that cells from the surrounding tissue occupied the entire transplanted area. In contrast, in the case of C-MS, the transplanted cells occupied the space, so that the animal tissue could not penetrate the space, and thus tissue fusion did not occur properly.
이와 같이, 혈관화된 골 조직 재생과 완전한 조직 융합의 효과가 뛰어나다는 점을 통해 본 발명이 다기능성 3차원 이식재로의 활용이 가능하다는 것을 검증하였다.In this way, it was verified that the present invention can be utilized as a multifunctional three-dimensional graft material through the excellent effects of vascularized bone tissue regeneration and complete tissue fusion.
Claims (13)
b) 생체적합성 고분자로 격자 구조의 3차원 지지체를 제조하는 단계;
c) 단계 a)의 기능성 줄기세포구상체를 단계 b)의 3차원 지지체의 각 칸에 배치한 후 배양함으로써 줄기세포구상체와 3차원 지지체가 융합된 3차원 조직체를 수득하는 단계; 및
d) 단계 c)로부터 수득한 3차원 조직체를 탈세포화시키는 단계를 포함하는,
세포외기질(ECM: extracellular matrix)을 함유하는 다기능성 3차원 이식재의 제조 방법.a) A step of manufacturing a functional stem cell spheroid by fusing a microcarrier coated with a bioactive substance and human-derived stem cells;
b) a step of manufacturing a three-dimensional support with a lattice structure using a biocompatible polymer;
c) a step of arranging the functional stem cell spheroids of step a) in each cell of the three-dimensional support of step b) and then culturing them to obtain a three-dimensional tissue in which the stem cell spheroids and the three-dimensional support are fused; and
d) a step of decellularizing the three-dimensional tissue obtained from step c);
A method for manufacturing a multifunctional three-dimensional graft containing an extracellular matrix (ECM).
A multifunctional three-dimensional graft material containing an extracellular matrix obtained by a manufacturing method according to any one of claims 1 to 12.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Cheng-En Chiang (2021), Bioactive Decellularized Extracellular Matrix Derived from 3D Stem Cell Spheroids under Macromolecular Crowding Serves as a Scaffold for Tissue Engineering, Advanced Healthcare Materials, 10(11), 2100024 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20230818 |
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| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20230818 Comment text: Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application |